DD203746A5 - Verfahren zur herstellung eines expressionsplasmids - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines Expressionsplasmids fuer die Expression eines heterologen Gens. Das erfindungsgemaesze Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dasz in Phase die folgenden Elemente gleichzeitig verknuepft werden: a) ein erstes lineares doppelstraengiges DNA-Fragment, das ein Replikon enthaelt und ein Gen, das eine selektierbare Eigenschaft exprimiert, wenn es unter die Steuerung eines bakteriellen Promoters gestellt wird, wobei das Fragment keinen derartigen Promoter aufweist, b) ein zweites lineares doppelstraengiges DNA-Fragment, das das genannte heterologe Gen aufweist, c) ein drittes doppelstraengiges DNA-Fragment, das einen bakteriellen Promoter aufweist, wobei die verknuepfbaren Enden der genannten Fragmente so gestaltet sind, dasz nach dem Verknuepfen zum Bilden eines sich replizierenden Plasmids sowohl das Gen fuer die selektierbare Eigenschaft als auch das heterologe Gen unter die Steuerung des Promoters kommen, wodurch die Verwendung der selektierbaren Eigenschaft bei der Selektion von transformierten Bakterienkolonien moeglich ist, welche zur Expression der heterologen Gene faehig sind.
Description
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Verfahren zur Herstellung eines Expressionsplasmids
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Expressionsplasmids für die Expression eines heterogenen Gens·
Mt dein Aufkommen der DHA-Rekombinations-Technologie ist die kontrollierte bakterielle Produktion einer enormen Vielfalt nützlicher Polypeptide möglich geworden. Man hat bereits Bakterien in der Hand, die durch diese Technologie verändert wurden, um die Produktion derartiger Polypeptid-Produkte zu ermöglichen, wie z. B· Soinatostatin (K. Itakura et al., Science 193, 1056 (1977), die jeweils einzelnen A- und B-Ketten des menschlichen Insulins (D. V. Goeddel, et al., Proc. Hat 1I Acad. Sei., USA 76, 106 (1979)) und menschliches Wachstumshormon (D. V, Goeddel, et al., Nature 281, 544 (1979)). Kürzlich wurde die DHA-Rekorabinations-Technik dazu verwendet, um die bakterielle Herstellung von Thymosin <XJ zu ermöglichen, einer immunverstärkenden Substanz, die in der Thymusdrüse gebildet wird (US-Patentanmeldung von Roberto Crea und Ronald Wetzel vom 28. Februar 1980, übertragen auf die Anmelderin der vorliegenden Anmeldung). Die Möglichkeiten dieser Technologie sind derartig durchschlagend, daß so gut wie jedes nützliche Polypeptid bakteriell hergestellt werden kann und die kontrol-
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lierte Herstellung von Hormonen, Enzymen, Antikörpern und Impfstoffen gegen eine große Vielfalt von Krankheiten in Reichweite gebracht wird* Die zitierten Veröffentlichungen, die im Detail die oben genannten repräsentativen Beispiele beschreiben, sowie weitere, im folgenden genannte Veröffentlichungen, welche den Hintergrund der Erfindung bilden, sind durch Verweis in die Offenbarung mit einbezogen.
Das Arbeitspferd der DHA-Rekombinations-Technologie ist das Plasmid, ein nichtchromosomaler Ring doppelsträngiger DlA, der in Bakterien gefunden wird und oft in vielfacher Kopie pro Bakterienzelle vorliegt. Die DITA des Plasmids enthält eine Information, die benötigt wird, um das Plasmid in Tochterzellen zu reproduzieren (d, h, ein "Replikon") und normalerweise ein oder mehr Selektions-Charakteristika, wie z. B, Resistenz gegen Antibiotika, die es erlauben, diejenigen Clone der Wirtszelle, die das interessierende Plasmid enthalten, zu erkennen und bevorzugt in selektivem Medium wachsen zu lassen. Der Uutzen der bakteriellen Plasmide liegt in der Tatsache, daß sie durch die eine oder andere Restriktionsendonuklease oder "Restriktionsenzym" spezifisch geschnitten werden können, von denen jedes eine andere Stelle auf der Plasmid-DIA erkennt, Danach können heterologe Gene oder Genfragmente in das Plasmid eingefügt werden, wobei entweder die Enden der Schnittstellen oder unmittelbar an die Schnittstellen angefügte Enden miteinander verbunden werden. Im folgenden wird der Terminus "heterolog" für ein Gen verwendet, das normalerweise nicht in E.coli gefunden wird oder eine Polypeptidsequenz, die normalerweise nicht durch
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E. coil hergestellt wird. Der Terminus "homolog" wird für ein Gen oder Polypeptid verwendet, das in Wildtyp E.coli hergestellt wird. Die DM-Rekombination wird außerhalb der Bakterie durchgeführt. Das resultierende "rekombinante" Plasmid kann durch ein Verfahren, das als Transformation bekannt ist, in Bakterien eingeführt werden, und man erhält große Mengen des rekombinanten Plasmids, das das heterologe Gen enthält, indem man die Transformanten wachsen läßt. Wenn das Gen im Hinblick auf Bereiche des Plasmids, die die Transkription und Translation der codierten DNA-Information regeln, richtig eingefügt ist, kann der resultierende Expressionsvektor dazu verwendet werden, tatsächlich die Polypeptidsequenz zu produzieren, für die das inserierte Gen codiert, ein Prozeß,- der Expression genannt wird.
Die Expression wird in einer Gegend initiiert, die als Promoter bekannt ist, der von der RIA-Polymerase erkannt wird und an den diese bindet. In einigen Fällen, v/ie z. B. beim trp-Operon, das im nachfolgenden noch ausführlich diskutiert werden wird, werden Promoterregionen von "Operator"-Regionen überlappt, wodurch ein kombinierter Promoter-Operator gebildet wird. Operatoren sind DITA-Sequenzen, die von sogenannten Repressorproteinen erkannt werden, die dazu dienen, die Häufigkeit der Initiation der Transkription an einem speziellen Promoter zu regulieren. Die Polymerese arbeitet sich an der DHA entlang, v/ob ei sie die in dem codierenden Strang enthaltene Information vom 5'- zum 3'-Ende in Hessenger-RBA (mRUA) transkribiert, die ihrerseits wieder in ein Polypeptid translatiert wird, das die Aminosäuresequenz aufweist, für die die DlA codiert.
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Jede Aminosäure wird durch ein einziges Hukleotidtriplet oder "Godon" codiert, das innerhalb eines "Strukturgens" liegt, wie man es für die vorliegenden Zwecke nennen mag, d· h# in dem Teil, der für die Aminosäuresequenz des exprimierten Produkts codiert, Nach dem Binden an den Promoter transkribiert die RITA-Polymerase vorerst lukleotide, die für eine Ribosomen-Bindestelle codieren, sodann ein Initiations- oder "Start"-Signal (normalerweise ATG, das in der resultierenden mRNA zu AUG wird) und schließlich die üukleotidcodons innerhalb des Strukturgens selbst. Sogenannte Stop-Codons werden am Ende des Strukturgens transkribiert, wonach die Polymerase eine zusätzliche Sequenz von mRHA bilden kann, die, aufgrund der Anwesenheit des Stopsignals, von den Eibosomen nicht mehr translatiert wird. Ribosomen binden an die auf der mHEA zur Verfügung gestellten Bindestelle, bei Bakterien normalerweise wenn die mEEA gebildet wird, und stellen selbst das codierte Polypeptid her, wobei sie am Translations-Startsignal beginnen und an dem oben erwähnten Stopsignal enden. Das gewünschte Produkt wird hergestellt, wenn die Sequenzen, die für die Ribosomen-Bindestelle codieren, im Hinblick auf das AUG-Initiatorcodon richtig liegen und wenn alle übrigen Codons dem Initiatorcodon in Phase folgen. Das resultierende Produkt kann erhalten werden, indem man die Wirtszelle lysiert und das Produkt durch geeignete Reinigungsschritte von anderen bakteriellen Proteinen trennt,
Die durch die Anwendung der DIA-Rekombinations-Technik exprimierten Polypeptide können vollkommen heterolog sein, wie im Falle der direkten Expression des menschlichen T/achstumshormons, können aber auch andererseits
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ein heterologes Polypeptid enthalten, aas zumindest mit einem Teil der Aminosäuresequenz eines homologen Peptids verbunden ist, wie im Pail der Herstellung von Zwischenprodukten für Somatostatin und die Bestandteile des menschlichen Insulins· Im letzteren Pail enthält beispielsweise das angefügte homologe Polypeptid einen Teil der Aminosäuresequenz für ß-Galactosidase. In diesen Fällen ist das angestrebte bioaktive Produkt durch das angefügte homologe Polypeptid so lange bioinaktiv, bis dieses durch extrazelluläre Maßnahmen abgeschnitten wird. Die ebengenannten "Fusionsproteine" können so hergestellt werden, daß ein hochspezifisches Schneiden des Vorläuferproteins von dem angestrebten Produkt ermöglicht ist, beispielsweise durch die Einwirkung von Bromcyan auf Methionin oder aber durch enzymetisehes Schneiden, siehe auch GB-PS Ur. 2 007 676 A.
Wenn die DHA-Rekombinations-Technologie ihr Versprechen voll halten soll, müssen Systeme erdacht werden, die die Expression der Geninsertionen optimieren, so daß das angestrebte Polypeptid-Produkt in großen Mengen erhalten werden kann. Die ß-Lactamase- und Lactose-Promoter-Operator-Systeme, die in der Vergangenheit üblicherweise verwendet wurden, haben, obwohl sie gut zu verwenden sind, vom Standpunkt der Menge her die Kapazität der Technologie nicht voll ausgenutzt. Ss besteht ein Bedürfnis für einen bakteriellen Expressionsvektor, der fähig ist, das gewünschte-Polypeptid-Produkt in größerer Menge kontrolliert zu exprimieren.
Trytophan ist eine Aminosäure, die von Bakterien als Bestandteil eines homologen Polypeptids verwendet wird und in einem Biosyntheseweg hergestellt wird, der folgende Schritte enthält:
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Chorisminsäure —*· Anthranilsäure —·» Phosphoribosylanthranilsäure —»- CDRP (Snol-i-(o-Garbozyphenylamino)-1-aesosy-D-Ribulose-5-Phosphat) ——» Indol-3-Glycerinphosphat und letztlich Tryptophan selbst. Die enzymatisehen Reaktionen dieses Synthesewegs werden durch Produkte des Tryptophan- oder "trp"-Operons katalysiert, einem polycistronischen DHA-Segment, das unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operator-Systems transkribiert wird· Die resultierende polycistronische mRlTA codiert die sogenannte trp-Pührer- (im folgenden "Leader"- genannte) Sequenz und dann, der Reihe nach, die Polypeptide, genannt trpE, trpD, trpC, trpB und trpA. Diese Polypeptide katalysieren und kontrollieren auf verschiedene Weise einzelne Schritte des Synthesewegs, ausgehend von der Chorisminsäure bis zum Tryptophan,
Im Wildtyp E.coli ist das Tryptophan-Operon unter der Kontrolle mindestens dreier, deutlich zu unterscheidender Arten. Im ersten Fall, einer Promoter-Operator-Repression, handelt das Tryptophan als Corepressor und bindet an seinen Aporepressor, um einen aktiven Repressorkomplex zu bilden, der seinerseits an den Operator bindet, wodurch das Tryptophan seinen eigenen Syntheseweg vollkommen verschließt. Zweitens bindet Tryptophan in einem Prozeß von Rückkopplungshemmung an einen Komplex der trpE- und trpD-Polypeptide und verhindert dadurch deren Beteiligung an dem Syntheseweg, Letztlich wird eine Kontrolle ausgeübt durch einen Prozeß, der als "Attenuierung" bekannt ist. Dieser Vorgang läuft unter der Kontrolle einer "Attenuator-Region" des Gens ab, einer Region, die innerhalb der trp-Leader-Sequenz liegt. Die Attenuierung ist ein Vorgang,der phänotypisch als eine Art Verdünnung des Tryptophans in der Zelle- in
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Erscheinung tritt (siehe dazu allgemein G. P. Hiozzari et al·, J. Bacteriology 133, 1457 (1978); The Operon 2Ö3-302, Cold Spring Harbor Laboratory (1978), Miller und Reznikoff, eds.; P. Lee et al·, Proc NatTl Acad Sei, USA 74, 4365 (1977) und K. Bertrand et al., J. Mol. Biol. 103, 319 (1976)). Das Ausmaß der Attenuierung scheint durch die intrazelluläre Konzentration des Tryptophans geregelt zu werden, und in Wildtyp S.coli beendet der Attenuator die Expression in ungefähr neun von zehn Pällen, möglicherweise durch die Bildung einer Sekundärstruktur, eines "Terminationsrings1' in der ilfflA, welcher der BITA-Polymerase dazu veranlaßt,., sich verfrüht von der DNA zu lösen.
Andere Autoren haben das trp-Operon dazu verwendet, um bis zu einem gewissen Grad heterologe Polypeptide zu exprimieren. Mit diesen Arbeiten hat man sich versuchsweise mit Problemen der Repression und Attenuierung befaßt, wobei Indolacrylsäure zugegeben wird, ein Induktor und Analogon, das mit Tryptophan um das trp-Repressor-'Molekül konkurriert, wobei durch kompetitive Hemmung auf Derepression abgezielt wurde. Gleichzeitig verringert der Induktor durch Hemmung der enzymatisehen Umwandlung von Indol zu Tryptophan die Attenuierung und bewirkt dadurch, daß der Zelle Tryptophan entzogen wird. Als Ergebnis davon lesen mehr Polymerasen erfolgreich über den Attenuator hinweg. Vom Standpunkt der vollständig durchgehenden Translation und der angestrebten großen Mengen erscheint dieser Versuch jedoch problematisch, da die Tryptophan-enthaltenden Proteinsequenzen während der Synthese infolge des Mangels von nutzbarem Tryptophan vorzeitig beendet werden. Tatsächlich ist bei diesem Versuch eine wirkungsvolle Unterstützung der Attenuierung vollständig von einer strengen Tryptophan-Aushungerung abhängig.
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Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Herstellung eines Expressionsplasmids für die Expression eines heterologen Gens.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Systeme aufzufinden, die die Expression der Geninsertionen optimieren, so daß das gewünschte Polypeρtid-Produkt in großen Mengen erhalten werden kann, und insbesondere einen bakteriellen Expressionsvektor aufzufinden, der fähig ist, das gewünschte Polypeptid-Produkt in größerer Menge kontrolliert zu exprinieren.
Es wird ein Polypeptid-Produkt durch die Expression in Bakterien eines für dieses codierenden Gens in der Weise hergestellt, daß
a) eine bakterielle Kultur geschaffen wird, die mit einem sich replizierenden, von einem Plasmid abgeleiteten Expressionsvektor transformiert wurde, welcher eine Sequenz doppe1strängiger DlTA enthält, die in Phase von einem ersten 5'-Ende bis zu einem zweiten 3'-Ende ihres codierenden Strangs die folgenden Elemente aufweist :
(i) ein bakterielles trp-Promoter-Operator-System
(ii) Hukleotide, die für eine Ribosomen-Bindestelle für die Translation des Elements (iv) codieren
(iii) Hukleotide, die für ein Translations-Startsignal für die Translation des Elements (iv) codieren
(iv) ein Strukturgen, das für die Aminosäuresequenz eines heterologen Polypeptids codiert
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wobei die genannte Sequenz weder irgendeine trp-Attenuierungs-Pähigkeit noch. Sukleotide aufweist, die für die trpE-Ribosomen-Bindestelle codieren
b) die transformierte Bakterienkultur in ein Fermentationsgefäß überführt und diese Kultur bis zu einer vorgegebenen Dichte in einem geeigneten ÜTährmedium gezüchtet wird, welches zusätzliches Tryptophan enthält, und zwar in ausreichender Menge, um das genannte Promoter-Operator-System zu reprimieren
c) den genannten Bakterien das zusätzliche Tryptophan entzogen wird, um das genannte System zu dereprimieren und die Expression des Produkts, für welches das genannte Strukturgen codiert, anlaufen zu lassen,
Das erfindungsgemäße Verfahren kann dabei in der Weise durchgeführt werden, daß das durch das genannte Strukturgen ezprimierte Polypeptid vollständig heterolog ist; "das exprimierte Polypeptid ein Fusionsprotein ist, das ein heterologes Polypeptid und mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz eines homologen Polypeptide aufweist; der genannte Teil ein Teil der Aminosäuresequenz eines Enzyms ist, das am Biosyntheseweg von der Chorisminsäure zum Tryptophan beteiligt ist;
das heterologe Polypeptid ein bioaktives'Polypeptid und . das angefügte homologe Polypeptid ein spezifisch spaltbares bioinaktivierendes Polypeptid ist; das homologe Polypeptid das trpE-Polypeptid ist und die genannte Ribosomen-Bindestelle diejenige für das trp-Leader-Polypeptid ist oder daß das homologe Polypeptid das trpD-Polypeptid ist.
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Es ist besonders vorteilhaft, wenn das Fusionsprotein ein heterologes und ein homologes Polypeptid enthält, wobei das homologe Polypeptid selbst eine Fusion darstellt, und zwar aus etwa den ersten sechs Aminosäuren des trp-Leader-Polypeptids und der Aminosäuresequenz, die durch mindestens etwa dem distalen Drittel des trpE-Polypeptidgens codiert wird.
Der Tryptophan-Entzug wird dadurch bewirkt, daß die Zugabe des zusätzlichen Tryptophans beendet und das Fermentationsmedium, in dem die Bakterienkultur zuerst gewachsen ist, verdünnt wird.
In dem Verfahren wird als Wirtsbakterium E.coli angewendet.
Beschrieben wird weiterhin ein von einem Plasmid abgeleiteter Expressionsvektor zum Herstellen eines heterologen Polypeptid-Produkts in E.coli-Bakterien, Der Vektor enthält eine Sequenz doppelsträngiger DHA, die in Phase von einem ersten 5'-Ende bis zu einem zweiten 3'-Ende ihres codierenden Strangs die folgenden Elemente aufweist:
a) ein bakterielles trp-Promoter-Operator-System
b) Sukleotide, die für eine Ribosomen-Bindestelle für die Translation des Elements (iv) codieren
c) Hukleotide, die für ein Translations-Startsignal für die Translation des Elements (iv) codieren
d) ein Strukturgen, das für die Aminosäuresequenz eines heterologen Polypeptide codiert
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wobei die genannte Sequenz weder irgendeine trp-Attenuierungs-Fähigkeit noch. Nucleotide aufweist, die für die trpE-Ribosomen-Bindestelle codieren.
Dabei ist das durch das genannte Strukturgen exprimierte Polypeptid vollständig heterolog oder das exprimierte Polypeptid ist ein Fusionsprotein, das ein heterologes Polypeptid und mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz eines homologen Polypeptide aufweist, wobei der genannte Teil ein Teil der Aminosäuresequenz eines Enzyms ist, das am Biosyntheseweg von der Chorisminsäure zum Tryptophan beteiligt ist.
Weiterhin ist es möglich, daß das heterologe Polypeptid ein bioaktives Polypeptid und das angefügte homologe Polypeptid ein spezifisch spaltbares bioinaktivierendes Polypeptid ist.
Insbesondere ist der Vektor derart zusammengesetzt, daß das homologe Polypeptid das trpE-Polypeptid ist und die genannte Ribosomen-Bindestelle diejenige für das trp-Leader-Polypeptid ist;
das homologe Polypeptid das trpD-Polypeptid ist; das Fusionsprotein ein heterologes und ein homologes Polypeptid enthält, wobei das homologe Polypeptid selbst eine Fusion darstellt, und zwar aus etwa den ersten sechs Aminosäuren des trp-Leader-Polypeptids und der Aminosäuresequenz, die durch mindestens etwa dem distalen Drittel des trpE-Polypeptidgens codiert wird.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Schaffung eines Expressionsplasmids für die Expression eines heterologen Gens,, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß in Phase die folgenden Elemente gleichzeitig verknüpft werden:
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a) ein erstes lineares doppelsträngiges DHA-Fragment, das ein Replikon enthält und ein Gen, das eine selektierbare Eigenschaft exprimiert, wenn es unter die Steuerung eines bakteriellen Promoters gestellt wird, wobei das Fragment keinen derartigen Promoter aufweist -
b) ein zweites lineares doppelsträngiges DSA-Fragment, das das genannte heterologe Gen aufweist
c) ein drittes doppelsträngiges DBA-Fragment, das einen bakteriellen Promoter aufweist
wobei die verknüpfbaren Enden der genannten Fragmente so gestaltet sind, daß nach dem Iferknüpfen zum Bilden eines sich replizierenden Plasmids sowohl das Gen für die selektierbare Eigenschaft als auch das heterologe Gen unter die Steuerung des Promoters kommen, wodurch die Verwendung der selektierbaren Eigenschaft bei der Selektion von transformierten Bakterienkolonien möglich ist, welche zur Expression der heterologen Gene fähig sind.
Die selektierbare Eigenschaft kann eine Antibiotikumresistenz sein.
Die selektierbare Eigenschaft kann eine Tetracyclin-Resistenz sein und der bakterielle Promoter der trp— Promoter.
Das Verfahren wird in vorteilhafter Weise so ausgeführt, daß die Verknüpfung ebenso ein Operon für die Expression von Ampicillin-Resistens wiederherstellt.
Beschrieben wird weiterhin ein Verfahren zum Schneiden doppelsträngiger DITA. Es ist dadurch gekennzeichnet, daß
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- 13 zum Schneiden an jeder beliebigen Stelle
a) die doppelsträngige DFA in einem die zu schneidende Stelle umgebenden Bereich in einzelsträngige DITA umgewandelt wird
b) an die in Schritt a) gebildete Einzelstrangregion ein komplementäres Primerstück von einzelsträngiger DIiA hybridisiert wird, wobei das 5'-Ende des Primers gegenüber demjenigen liukleotid liegt, das an die beabsichtigte Schnittstelle angrenzt
c) derjenige Teil des zweiten, in Schritt a) eliminierten Strangs wiederhergestellt wird, der in 3'-Richtung des Primers liegt,und zwar durch eine Reaktion mit DUA-Polymerase in Anwesenheit von Adenin-, Thymin-, Guanin- und Cytosin-enthaltenden Desoxynukleotidtriphosphaten
d) das verbleibende DÜTA-Sinzelstrangstück, das über die beabsichtigte Schnittstelle vorsteht, verdaut wird,
Dabei werden die Schritte c) und d) gleichzeitig durchgeführt durch Reaktion mit einer DEA-Polymerase, die in 5' * 3'-Richtung polymerisiert, die Exonukleasewirkung in 3' —*" 5'-Richtung aufweist, jedoch keine Nukleasewirkung in 5' *· 3'-Richtung zeigt.
Vorteilhaft ist die Polymerase, die Klenow-Polymerase I ist.
Das Verfahren ist besonders vorteilhaft, wenn das heterologe Polypeptid ein wiedergewinnbares Polypeptid ist, das aus einer Gruppe von Polypeptiden ausgewählt wird, die menschliches Wachstumshormon, menschliches
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Proinsulin, Somatostatin, Thymosin CXJ], die A-Kette des menschlichen Insulins sowie die B-Kette des menschlichen Insulins enthält.
Ebenso ist der Vektor besonders vorteilhaft, wenn er ein heterogenes Polypeptid der oben beschriebenen Art enthält.
Mt der vorliegenden Erfindung werden für das Herstellen von heterologen Polypeptid-Produkten in Bakterien neue, von Plasmiden abgeleitete Expressionsvektoren zur Verfü- gung gestellt. Die Vektoren haben eine Sequenz von doppelsträngiger DNA, die in Phase von einem ersten 5f- zu einem zweiten 3'-Ende des codierenden Stranges folgende Bestandteile enthält: einen trp-Promoter-Operator, ITukleotide, die für die trp-Leader-Ribosomen-Bindestelle codieren und ITukleotide, die für die Translationsinitiation zur Expression eines Strukturgens codieren, welches für die Aminosäuresequenz eines heterologen Polypeptids codiert. Diese beschriebene DHA-Sequenz enthält weder eine trp-Attenuator-Region noch lukleotide, die für die trpE-Ribosomen-Bindestelle codieren. Stattdessen wird die trp-Leader-Ribosomen-Bindestelle wirkungsvoll dazu verwendet, die Expression von Information zu bewirken, die durch inserierte Gene codiert wird.
Mit einem einen trp-Promoter-Operator enthaltenden erfindungsgemäßen Plasmid, das keinen Attenuator aufweist, werden Zellen transformiert und in Gegenwart von zugegebenem Tryptophan kultiviert. Mit der Verwendung von Tryptophan-reichem Medium steht ausreichend Tryptophan zur Verfugung, um im wesentlichen vollständig den trp-Promoter-Operator durch trp/Repressorinteraktionen zu reprimieren, so daß das Zellwachstum, ungehemmt durch vorzeitige Expression großer Mengen von heterologen Polypeptiden, fort-
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schreiten kann, wobei dieses Polypeptid durch eine Insertion codiert wird, die ansonsten unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operator-Systems steht. Sobald einerseits die Kultur der Rekombinanten zu einer Dichte angewachsen ist, die für eine industrielle Herstellung des Polypeptide geeignet ist und andererseits das von außen zugeführte Tryptophan entfernt wurde, läßt man die Zellen lediglich mit dem Tryptophan wachsen, das sie selbst produzieren. Das Ergebnis ist eine schwache Tryptophanlimitierung, wodurch folglich der Syntheseweg dereprimiert wird und eine überaus wirksame Expression der heterologen Insertion auftritt, unbehindert durch Attenuierung, da die Attenuator-Region aus dem System entfernt wurde. Auf diese Weise wird den Zellen niemals ernstlich Tryptophan entzogen, und alle Proteine, ob sie Tryptophan enthalten oder nicht, können in einem ausreichenden Umfang produziert werden.
Es werden Mittel zur Verfugung gestellt, um doppelsträngige DHA an jeder beleibigen gewünschten Stelle zu schneiden, auch wenn eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym fehlt, eine Technik, die unter anderem für das Herstellen eines trp-Operons brauchbar ist, welches Attenuator-Deletionen aufweist, die sich von denjenigen unterscheiden, die man früher durch Selektion von Mutanten erhalten hat.
Schließlich werden eine Vielzahl von brauchbaren Zwischenprodukten und Endprodukten zur Verfügung gestellt, einschließlich spezifisch spaltbarer, heterolog-homologer Fusionsproteine, die unter Expressionsbedingungen gegen Abbau stabil sind.
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Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert. In der beiliegenden Zeichnung zeigen
Fig. 1 das Schema einer bevorzugten Ausführung der BiI- und dung eines Plasmids, das fähig ist, heterologe Pig. 2: Gene als Fusionen mit einem Teil des trpD-Polypeptids zu exprimieren, von dem sie später abgespalten werden können
Fig. 3: das Ergebnis einer Polyacrylamid-Ge1-Trennung von Zellprotein, das homologCtrpD')-heterologe (Somatostatin oder Thymosin £(1) Fusionsproteine enthält
Fig, 4, aufeinanderfolgende Stufen in einem bevorzugten Fig. 5 Schema für die Herstellung eines Plasmids, das und fähig ist, direkt unter der Kontrolle eines trp-Fig. 6: Promoter-Operator-Systems ein heterologes Gen (menschliches Wachstumshormon) zu exprimieren
Fig. 7: *das Ergebnis einer Polyacrylamid-Gel-Trennung von Zellprotein, das menschliches Wachstumshormon enthält, welches direkt unter der Kontrolle des trp—Promoter-Operator-Systems esprimiert wurde
Fig, 8, aufeinanderfolgende Stufen in einem bevorzugten Fig. 9a, Schema für die Herstellung eines Plasmids, das Fig. 9b fähig ist, heterologe Gene (in dem dargestellten und Fall für Somatostatin) fusioniert mit einem Teil Fig. 10: des trpE-Polypeptids zu esprimieren, wobei die Fusion später gespalten werden kann
Fig. 11: das Ergebnis einer Polyacrylamid-Gel-Trennung von Zellprotein, das homolog(trpE)-heterologe
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fusionsproteine zum Herstellen von Somatostatin bzw. Thymosin<?Ci, menschlichem Proinsulin und der A- und B-Ketten des menschlichen Insulins enthält
Pig. 12 aufeinanderfolgende Stufen der Art und Weise, und auf welche das Plasmid, das durch die Schemata Pig. 13: der Pig. 8 bis einschließlich 10 konstruiert wurde, manipuliert wird,um ein System zu bilden, in dem andere heterologe Gene als Pusion mit trpS-Polypeptidsequenzen austauschbar exprimiert werden können.
In den Piguren werden aus Gründen der Klarheit der Darstellung in den meisten Fällen nur der codierende Strang des doppelsträngigen Plasmids und lineare DUA-Stränge gezeichnet. Gene, die für die Resistenz gegen ein Antibiotikum codieren, werden als .ap"1 (Ampicillin-Resistenz)
τ? ~
und te (Tetracyclin-Resistenz) bezeichnet. Die Bezeich-
S nung te bedeutet ein Gen für Tetracyclin-Resistenz, das nicht unter der Kontrolle eines Promoter-Operator-Systems steht, so daß Plasmide, die dieses Gen enthalten, dennoch
S Tetracyclin-sensitiv sind. Die Bezeichnung ap bezeichnet eine Ampicillin-Sensitivität, die durch die Deletion eines Teils des Gens entstanden ist, das für Ampicillin-Sensitivität codiert. Promotoren und Operatoren des Plasmids werden mit ρ und ο bezeichnet. Die Buchstaben A, T, G bzv/. C bezeichnen die Fukleotide, die die Basen Adenin, T.hymin, Guanin und Cytosin enthalten. Weitere Legenden der Piguren werden aus dem Text ersichtlich.
Sine im folgenden beschriebene bevorzugte Ausführungsform der Erfindung schließt die Verwendung einer Anzahl allgemein erhältlicher Restriktionsendonukleasen ein, die im
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folgenden bezeichnet und mit ihrer zugehörigen Erkennungssequenz sowie dem Schneidemuster (angezeigt durch Pfeile) beschrieben sind.
Xbal:
EcoRI
BgIII PvuII BamBI:
| TCTAGA | Taql: | TCGA |
| AGATCT | AGCT t | |
| GAATTC | Hindlll: | AAGCTT |
| CTTAAG 1 | TTCGAA | |
| I AGATCT | Hpal: | GTTAAC |
| TCTAGA | CAATTG f I | |
| GAGCTG | Pstl: | CTGCAG |
| GTCGAC i * GGATCC . | GACGTC t | |
| CCTAGG |
Wo die Schnittpunkte auf den entsprechenden Strängen voneinander entfernt sind, werden die geschnittenen Enden "sticky", d. h. überstehend, und insofern: in der Lage sein, sich wieder neu zu verbinden, bzw. diese "stickyends" können mit einer anderen, komplementären "stickyend"-DEA durch Watson-Crick-Basenpaarung (A mit T und G mit C) korrekt miteinander verzapft werden. Einige Restriktionsenzyme, beispielsweise die oben beschriebenen Hpal und PvuII, hinterlassen nach dem Schnitt stumpfe Enden. Die oben gezeigten lukleotidsequenzen sind gemäß einer diesbezüglichen Übereinkunft in der folgenden Yieise dargestellt: Der obere Strang ist der Protein-codierende Strang, und man bewegt sich fortschreitend von links nach rechts vom 5f- zum 3'-Ende dieses Strangs, d. h. in Rieh-
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tung der Transkription von einem proxLmalen zu einem distalen Punkt.
Schließlich bezeichnet, im Hinblick auf die Übereinkunft, das Symbol "Δ." eine Deletion. Daher bezeichnet eine Benennung eines Plasmids, wie beispielsweise "AEcoRI-Xbal", dasjenige Plasmid, aus welchem die Hukleotidsequenz zwischen den EcoRI- und XbaX-Erkennungsstellen der entsprechenden Restriktionsenzyme durch Verdauung durch diese Enzyme entfernt wurde. Der Einfachheit halber v/urden verschiedene Deletionen durch Zahlen bezeichnet. Die Bezeichnung "Λ1" bedeutet daher, beginnend vom ersten Basenpaar (Bp) der EcoRI-Erkennungsstelle, die auf das Gen für Tetra cyclin-Resistenz in dem Elternplasmid pBR322 folgt, eine Deletion vom Bp 1-30 (d. h. ÄEcoRI-Hindlll) und daraus folgend ein Ausschalten des Tetracyclin-Promoter-Operator-Systems. Als "Δ2" wird eine Deletion der Bp 1-375 verstanden (d. h.AEcoRI-BamHI) und infolgedessen ein Entfernen sowohl des Tetracyclin-Promoter-Operators und der Strukturgene, die für Tetracyclin-Resistenz codieren. Die Bezeichnung "A3" bedeutet eine Deletion der Bp36i1-4359 (d. h. APstl-EcoRI) und die Eliminierung der Ampicillin-Resistenz, "A4" wird verwendet, um das Entfernen der Bp *-9OO-~15OO vom trp-Operon-Pragment 5 (Pig- 1) zu bezeichnen, in dem die Strukturgene für das trpD-Polypeptid eliminiert sind.
Die trp-Leader-Sequenz ist aus den Basenpaaren (Bp) 1-162 aufgebaut, angefangen vom Startpunkt für die trp-mRNA. Ein auf 14 Aminosäuren geschätztes trp-Leader-Polypeptid wird durch die Bp 27-71 codiert, die den ATG-Hukleotiden folgen, die für das Translations-Startsignal codieren. Die trp-Attenuator-Region enthält aufeinanderfolgend GC-reiche und
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Ατ-reiche Sequenzen, die zwischen den Bp 114 und 156 liegen. Die Attenuierung wird offensichtlich, durch mRHA-Uukleotide bewirkt, die durch die Bp ~134-141 der Leader-Sequenz codiert v/erden. Um heterologe Polypeptide unter dem Einfluß der trp-Leader-Ribosomen-Bindestelle zu exprimieren und gleichzeitig die Attenuierung zu verhindern, müssen die folgenden Kriterien beachtet werden:
1, Die Basenpaare 134-141 oder noch mehr über das Bp 141 hinaus müssen deletiert werden,
2, das ATG-Codon des inserierten Gens muß, wie bekannt, in der richtigen Lage zu einer'Ribosomen-Bindestelle ausgerichtet sein (siehe z. B. J. A* Steitz "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RITA" in Biological Regulation and Control (ed, R, Goldberger) Plenum Press, U.Y. (1978)),
3, wo ein homolog-heterologes Fusionsprotein produziert werden soll, sollte das Translations—Startsignal einer homologen Polypeptidsequenz verfügbar bleiben, und die Codons für den homologen Teil des Fusionsproteins müssen in Phase ohne dazwischenliegende Translations-Stopsignale inseriert werden.
Wenn beispielsweise alle Basenpaare innerhalb der Leader-Sequenz distal vom Bp 70 deletiert werden, wird die Attenuator-Region entfernt, die ATG-Sequenz, die für das Translations-Startsignal codiert, verbleibt und der dazwischenliegende Translations—Stop, codiert durch TCA (Bp 69-71), wird entfernt durch Eliminieren von A und die darauffolgenden lukleotide. Sine derartige Deletion hätte als Ergebnis die Expression eines Fusionsproteins, das mit dem Leader-Polypeptid beginnt und mit demjenigen Polypeptid endet, das durch irgendeine heterologe Insertion
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codiert wird. Ton diesen Polypeptiden wird eine distale Region eines an die Leader-Sequenz anschließenden trp-Operon-Polypeptids eingeschlossen, die durch das Ausmaß der Deletion in der 3'-Sichtung bestimmt wird. Eine in das Gen E hineinreichende Deletion würde daher zur Expression eines homologen Vorläufers führen, der die L-Sequenz und die distale Region des Gens E (jenseits des Endpunkts der Deletion) enthält, verbunden mit der Sequenz, die durch irgendeine folgende Insertion codiert wird, usw.
Zwei besonders brauchbare Plasmide, aus denen die Attenuator-Region entfernt wurde, sind die Plasmide pGM1 und pGM3 (G. P. Miozzari et al,, J. Bacteriology 1335 1457 (1978)). Diese Plasmide tragen die Deletionen trp ÄLE 1413 und trpÄLE 1417 und exprimieren (unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operators) ein Polypeptid, das ungefähr die ersten sechs Aminosäuren des trp-Leaders und distale Regionen des E-Polypeptids enthält. In dem besonders bevorzugten Pail des Plasmids pGM1 wird lediglich etwa das letzte Drittel des E-Polypeptids exprimiert, wohingegen pGM3 nahezu die gesamte distale Hälfte des E-Polypeptid-Codons exprimiert. Der Stamm E.coli K-12 W3IIO tna 2~trp~ Δ102, der pGM1 enthält, ist bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Hummer 31622 hinterlegt. Das Plasmid pGM1 kann auf herkömmliche Weise aus dem genannten Stamm zur Verwendung in den unten beschriebenen Verfahren entfernt werden.
Eine Möglichkeit, um mit den durch die Erfindung bereitgestellten Mitteln Deletionen einzuführen, ist das spezifische Schneiden von doppelsträngiger DUA an j'eder gewünschten Stelle. Ein Beispiel dieser Schneidetechnik ist unten im Teil IV der Beschreibung der Experimente därge-
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legt. Dabei wird doppelsträngige ΏΈΑ in einem den beabsichtigten Schneidepunkt -umgebenden Bereich durch Reaktion mit λ -Esonuklease in einzelsträngige DUA umgewandelt. Daraufhin wird ein synthetischer oder anderer Einzel strang-DHA-Primer an das vorher gebildete Einzelstrangstück durch Watson-Crick-Basenpaarung hybridisiert. Dabei muß sichergestellt sein, daß das 5'-Ende der Primer-Sequenz exakt gegenüber demjenigen Hukleotid auf dem ersten Strang endet, das genau vor dem beabsichtigten Schneidepunkt liegt. Als nächstes wird der Primer durch Reaktion mit DlA-Polymerase in 3'-Richtung verlängert, wodurch derjenige Teil der ursprünglich doppelsträngigen DNA, der vor dem beabsichtigten Schnittpunkt liegt, wieder hergestellt wird, der im ersten Schritt verlorengegangen war. Gleichzeitig oder danach wird derjenige Teil des ersten Stranges, der jenseits des beabsichtigten Schnittpunkts liegt, wegverdaut. Das nachfolgende Schema veranschaulicht diesen Vorgang noch einmal, wobei 11V" den beabsichtigten Schnittpunkt kennzeichnet:
a) b) c) d) e)
beabsichtigter Schnittpunkt "v"
Bilden eines Sinzelstranges im Bereich von "τ"
Primer-Hybridisierung
Verlängerung des Primers
Einzelstrangverdauung
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Schritte (d) und (e) gleichzeitig ausgeführt, wobei eine Polymerase verwendet wird, die gleichzeitig die vorstehenden Einzelstrangenden in der 3' —*· 5'-Richtung verdaut und den Primer (in Anwesenheit von dATP, dGTP, dTTP und dCTP) in der 5' * 3'-Richtung verlängert. Besonders geeignet für diese Zwecke ist die Klenow-Polymerase I, d. h. dasjenige Fragment, das durch proteolytisch.es Spalten der DUA-Polymerase I erhalten wird und die 5'—r»· 3f-Polymeri-
sierungsaktivität sowie die 3' »· 5'-Exonukleaseaktivität
des Elternenzyms aufweist, dagegen seine 5' —*- 3'-Ξχο-nukleaseaktivität verloren hat (A. Kornberg, DHA Synthesis, 98, W. H. Freeman und Co., SPO (1974)).
Bei Verwendung des eben beschriebenen Verfahrens können Attenuator-Deletionen in einem ein trp-Operon enthaltenden Plasmid auf jede nur gewünschte V/eise eingeführt werden« Das Plasmid wurde vorher in die lineare Porm überführt, beispielsweise durch einen Schnitt an einer Restriktionserkennungsstelle stromabwärts von dem beabsichtigten Schnittpunkt, an dem das Molekül stumpfendig sein soll (siehe Bereich "v" im oben gezeigten Schema), Each dem Deletieren der Attenuator-Region wird das Plasmid wieder in die Ringform gebracht. Dies kann beispielsweise durch Verbinden der stumpfen Enden oder auch durch andere Methoden geschehen, die dem Fachmann bekannt sind.
Obwohl die Erfindung die direkte Expression heterologer Polypeptide unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operators umfaßt, ist der bevorzugte Fall die Expression von fusionierten Proteinen, die sowohl homologe als auch heterologe Sequenzen enthalten, wobei letztere vorzugsweise durch extrazelluläre Maßnahmen spezifisch von den homologen Proteinen abspaltbar sind. Ganz besonders bevorzugt sind
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Fusionen, in denen der homologe Teil eine oder mehrere Aminosäuren des trp-Leader-Polypeptids enthält und etwa ein Drittel oder mehr der trpE-Aminosäuresequenz (distales Ende). So erhaltene Fusionsproteine scheinen unter Expressionsbedingungen bemerkenswert stabil gegen Abbau zu sein.
Das Bakterium E.ooli K-12, Stamm W3110 tna 2~trp~AiO2 (pGM1), ATGC Hummer 31622, kann dazu verwendet werden, den Vorrat des Plasmids pGM1 zu vervielfachen, das bevorzugt für die Konstruktion des Attenuator-freien trp-Promoter-Operator-Systems der Erfindung verwendet wird· Dieser Stamm ist in Gegenwart von Anthranilat phänotypisch trp und kann in Mnimalmedium, beispielsweise LB, das mit 50/Ug/ml Anthranilsat supplementiert wurde, ?/achsen<
Alle Bakterienstämme, die im Zusammenhang mit der Erfindung für die trp—Promoter-Operator dirigierte Expression verwendet werden, sind trp Repressor (trp R ) wie im Fall des Wildtyp E.coli, so daß die Repression sichergestellt ist, bis die heterologe Expression angestrebt wird·
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die DUA-Rekombination in E.coli K-12, Stamm 294 (end A, thi , hsr~, hsm, ), ATGC Hummer 31446, durchgeführt, einem Bakterienstamm, dessen Membraneigenschaften die Transformation erleichtern. Plasmide, die heterologe Polypeptide produzieren und im Stamm 294 gewachsen sind, werden auf die übliche Weise extrahiert und in Lösung gehalten (beispielsweise 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) bei Temperaturen von etwa -20 C bis 4 0C Für die Expression unter industriellen Bedingungen wird andererseits jedoch bevorzugt ein widerstandsfähigerer Stamm verwendet, nämlich
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E.ooli K-12 /Cp'RY 308 strr, gal 308", ATCC Nummer 31608. RY 308 ist ernährungsmäßig Wildtyp und wächst gut in Minimalmedium, in dem alle nötigen Macromoleküle aus einer üblichen Mischung von Ammonium-, Phosphat- und Magnesiumsalzen, Spurenelementen und Glukose synthetisiert v/erden. Each der Transformation einer RY 308-Kultur mit dem aus dem Stamm 294 abgeleiteten Plasmid v/ird die Kultur auf einem Medium plattiert, das für einen Marker selektiv ist (beispielsweise Resistenz gegen ein Antibiotikum), den das Plasmid trägt. Bine Transformantenkolonie wird abgeimpft und in einer Piaschenkultur gezüchtet. Aliquots dieser Piaschenkultur werden in 10 % DMSO oder Glycerinlösung (in sterilen Wheaton-Pläschchen) in einem Äthanol-Trockeneisbad schockgefroren und auf -80 C tiefgefroren. Um das codierte heterologe Polypeptid zu produzieren, werden Proben der Kultur in einem Medium gezüchtet, das Tryptophan enthält, um den trp-Promoter-Operator zu reprimieren. Anschließend wird dem System das zugegebene Tryptophan entzogen, um die Expression zu ermöglichen.
Pur die erste Wachsturnsstufe kann beispielsweise LB-Medium verwendet vrerden (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, 433, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)), das pro Liter wäßriger Lösung 10 g Bacto Trypton, 5 g Bacto Hefeextrakt und 10 g ITaCl enthält. Vorzugsweise läßt man die beimpfte Kultur bis zu einer optischen Dichte (o.D.) von 10 oder mehr (bei 550 mn), insbesondere zu einer o.D. von 20 oder mehr, besonders bevorzugt jedoch zu einer o,D. von 30 oder mehr wachsen, jedoch nicht bis zur stationären Phase.
Pur die Derepression und Expression wird die beimpfte Kultur als nächstes unter Bedingungen gezüchtet, unter denen der Zelle das zugegebene Tryptophan entzogen wird,
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Ein geeignetes Medium für ein derartiges Wachstum ist M9 (J, H. Miller, Seite 431, a.a.O.), das wie folgt hergestellt wird (pro Liter):
| KH2PO4 | 3 | g |
| Na2HPO4 | 6 | g |
| ITaCl | 0 | ,5 g |
| Ha Cl | 1 | g |
!lach dem Autoklavieren wird dieser Mischung zugegeben:
10 ml 0,01 M CaCl2 1 ml 1 M MgSO4 10 ml 20 % Glukose Vitamin B1 1 ,ug/ml "Humko Hycase Amino" oder DIPCO ' Kasein-Aminosäuren 40 ,ug/ml.
Das Aminosäuresupplement ist ein Hydrolysat von Kasein, dem Tryptophan fehlt.
Um die Expression des heterologen Polypeptide zu starten, kann man beispielsweise die in einem Tryptophan-reichen Medium gewachsene Impfkultur in einem größeren Volumen eines Mediums verdünnen, das kein zusätzliches Tryptophan enthält (beispielsweise in einer 2- bis 10fachen Verdünnung) . Man läßt die Kultur dann bis zu einer gewünschten Dichte wachsen (vorzugsweise bis kurz vor die stationäre Wachstumsphase) und erhält das angestrebte Produkt auf übliche Weise durch Lyse, Zentrifugieren und Reinigen* In dem Wachstumsstadium des Tryptophanentziigs laßt man die Zellen vorzugsweise bis zu einer o,D. von mehr als 10,
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insbesondere von mehr als 20 und besonders bevorzugt bis zu oder über eine o.D, von 30 (.jeweils bei 550 nm) wachsen, ehe das angestrebte Produkt isoliert wird.
Alle DNA-Rekombinations-Experimente, die in dem folgenden experimentellen Teil beschrieben werden, wurden bei Genentech Inc. in Übereinstimmung mit den Richtlinien äes national Institutes of Health (ITIH) bezüglich der Forschung mit rekombinanter DUA durchgeführt.
I. Expression des D-Polypeptid-Fusionsproteins
Mit Bezug auf die Fig. 1 bis 3 wird ein bevorzugtes Verfahren zur Expression von Fusionsproteinen beschrieben, die das gewünschte Polypeptid enthalten und, daran angebunden, einen Teil der Aminosäuresequenz des trpD-Polypeptids, das in vitro mittels einer Aminosäure Methionin,'die spezifisch für ein CHBr-Spalten sensitiv ist, abgetrennt werden kann.
A) Konstruktion von pBRHtrp
Das Plasmid pGM1 (1, Fig. 1) trägt das E.coli-Tryptophan-Operon, das die Deletion ^JE .1413 enthält (G. F. Miozzari et al., (1978), J. Bacteriology 1457-1466) und esprimiert somit ein Fusionsprotein, das die ersten sechs Aminosäuren des trp-Leaders und annähernd das letzte Drittel des trpE-Polypeptids (im nachfolgenden als die Verbindung IE' bezeichnet^ ebenso wie das vollständige trpD-Polypeptid, enthält, alle unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operator-Systems. 20vUg des Plasmids werden mit dem Restriktionsenzym PvuII verdaut, das das Plasmid an fünf Stellen schneidet. Das Gen-
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fragment 2 (S1Ig* 1) wird als nächstes mit einer EcoRI-Verbindungsstelle, einem sogenannten Linker (bestehend aus einem in sich selbst komplementären Oligonukleotid 3 (Fig, 1) der Sequenz pCATGAATTCATG) kombiniert, wodurch eine EcoRI-Schnittstelle für ein späteres Clonen in ein Plasmid 20 (Fig, 6), das eine EcoRI-Erkennungsstelle enthält, zur Verfügung gestellt wird. Die durch das Plasmid pGM1 erhaltenen 20/Ug des DEFA-Fragments 2 (Fig. 1) werden mit 10 Einheiten T,-DHA-Ligase in Anwesenheit von 200 Picomolen des 5'-phosphorylierten, synthetischen Oligonukleotids 3 (Fig. 1) mit der Sequenz pCATGAATTCATG und in 20 /ul T,-DTTA-Ligase-Puff er (20 roll Tris, pH 7,6; 0,5 mM ATP, *10 mM MgCIg, 5 mM Dithiothreit) bei 4 °C über Haent behandelt. Die Lösung wird daraufhin 10 Minuten lang bei einer Temperatur von 70 C erhitzt, um die Ligasebindung zu stoppen« Die Linker werden durch EcoRI-Verdauung geschnitten, und die Fragmente, die nun EcoRl-Enden enthalten, werden mittels 5 folger Polyacrylaniid-Gel-Elektrophorese (im folgenden PAGE genannt) voneinander getrennt. Die drei größten Fragmente werden sodann aus dem Gel isoliert, indem sie zuerst mit Äthidiumbromid markiert, danach die Fragmente mit Ultraviolett-Licht lokalisiert und schließlich die interessierenden Teile aus dem Gel herausgeschnitten werden. Jedes GeIfragment' wird mit 300 Mikrolitern 0,1 χ TBE in einen Dialyseschlauch überführt und in einem 0,1 χ TBB-Puffer bei 100 V eine Stunde lang einer Elektrophorese unterworfen (der TBS-Puffer enthält 10,8 g Tris, 5,5g Borsäure, 0,09 g ITa2EDTA in 1 1 HpO), Die wäßrige Lösung wird aus dem Dialyseschlauch gesammelt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert, und 0,2 Hatriumchlorid-molar gemacht und die DlTA in Wasser
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überführt, nachdem sie mit Äthanol gefällt wurde, (Sämtliche DliA-Fragment-Isolierungen, die im folgenden beschrieben werden, wurden unter Verwendung von PAGE, gefolgt von der eben beschriebenen Methode des Elektroeluierens, durchgeführt·) Das Gen 5 (Pig. 1), das den trp-Promoter-Operator enthält sowie über-.stehende EcoRI-Enden aufweist, wird in einem Verfahren identifiziert, das als nächstes beschrieben werden wird, welches das Einfügen von Fragmenten in ein Tetracyclin-sensitives Plasmid G (Fig. 1) zur Folge hat, das, infolge der Promoter-Operator-Insertion, Tetracyclin-resistent wird.
B) Herstellen des Plasmids pBRHtrp, das unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operators Tetracyclin-Resistenz exprimiert sowie Identifizieren und Vervielfältigen des im obigen Abschnitt A) isolierten DSA-Fragments 5 (Fig, 1), das den trp-Promoter-Operator enthält« .
Das Plasmid 6 (Fig. 1) mit der Bezeichnung pBRH1 (S. I. Rodriguez et al., Nucleic Acids Research 6, 3267-3287 (1979)) exprimiert Ampicillin-Resistenz. und enthält das Gen für Tetracyclin-Resistenz, welches allerdings, da kein dazugehöriger Promoter vorhanden ist, diese Resistenz nicht exprimiert. Dementsprechend ist das Plasmid Tetracyclin-sensitiv, Durch Einführen eines Promoter-Operator-System3 in die EcoRI-Erkennungsstelle kann das Plasmid Tetracyclin-resistent gemacht werden. Das Plasmid pBRH1 wird mit EcoRI verdaut, worauf das Enzym durch Phenol-Extraktion entfernt 7/ird, gefolgt durch eine Chloroform-Extraktion und-Wiederaufnahme in 7/asser nach
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einer Äthano If aliting. Das entstandene DEA-Holekül 7 (Pig. 1) wird, in getrennten Reaktionsmischiingen, mi jedem der drei DNA-Fragmente, die im oben geschilderten Teil A) erhalten wurden, kombiniert und mit T--DEA-Mgase, wie vorstehend beschrieben, verbunden. Die in der Reaktionsmischung vorhandene DUA wird durch Standardtec.hniken (Y. Hershfield et al., Proc Hat'l Acad Sei USA 71, 3455-3459 (1974)) dazu verwendet, um einen kompetenten S.coli K-12, Stamm 294 (K* Backman et al·, Proc Hat'l Acad Sei USA 73, 4174-4198 (1976)) (ATCC Hummer 31448) zu transformieren, worauf die Bakterien auf IB-Platten, die 20 ,ug/ml Ampicillin und 5/Ug/ml Tetracyclin enthalten, plattiert werden. Es werden einige Tetracyclin-resistente Kolonien selektiert, die Plasmid-DHA isoliert und die Anwesenheit des gewünschten Fragments durch eine Restriktionsenzym-Analyse sichergestellt. Das resultierende Plasmid 8 (Fig. 1), mit der Bezeichnung pBRHtrp, esprimiert ß—Lactamase, verleiht Ampicillin-Resistenz, und es enthält ein DITA-Fragment, das den trp-PromoterOperator einschließt und für ein erstes Protein codiert, das aus einer Fusion der ersten sechs Aminosäuren des trp-Leaders und annähernd des letzten Drittels des trpS—Polypeptids (dieses Polypeptid wird LE' genannt) besteht, sowie für ein zweites Protein, entsprechend der ungefähr ersten Hälfte des trpD-Polypeptids (dieses Polypeptid wird D1 genannt) und weiterhin für ein drittes Protein, für das das Gen für Tetracyclin—Resistenz codiert,
C) Cionierende Gene für verschiedene Endprodukt-Polypeptide und die Expression dieser Gene als Fusionsproteine, die das Endprodukt und einen spezfisch spaltbaren trpD-Polypeptid-Yorläufer enthalten (Fig. 2).
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Aus dem Plasmid pBRHtrp 8 erhält man ein den trp-Promoter-Operator und Codons für die LE1- und Df-Polypeptide aufweisendes DITA-Fraginent, das in Plasmide inseriert wind, die Strukturgene für verschiedene gewünschte Polypeptide enthalten, im folgenden beispielshaft dargestellt für den Pail des Soinatostatin (Pig. 2).
Das Plasmid pBRHtrp 8 wird mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und das so entstandene Fragment (Fig. 2) durch PAGE und Elektroeluierung isoliert, Das EcoRI-verdaute Plasmid pSomi1 (K. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977)); GB-PS 2 007 676 A) wird mit Fragment 5 (Fig. 2) vereint. Die Mischung wird, wie oben beschrieben, mit T.-DHA-Ligase verbunden, und mit der resultierenden DHA wird S.coli K-12, Stamm 294, wie bereits geschildert, transformiert, Transformierte Bakterien werden auf Ampicillin enthaltenden Platten selektiert. So erhaltene Ampicillinresistene Kolonien werden durch Hybridisieren der Kolonien geprüft (M, Gruenstein et al., Proc Nat'l Acad Sei USA 72, 3951-3965 (1975)), wobei als Vergleich das aus dem Plasmid pBRHtrp 8 isolierte, den trp-Promoter-Ot>erator enthaltende Fragment 5 (Fig. 2)
verwendet wird, das mit P radioaktiv markiert wurde.
Verschiedene Kolonien, die sich bei der Hybridisierung der Kolonien als positiv herausgestellt haben, werden selektiert, die Plasmid—DHA wird isoliert und die Orientierung des inserierten Fragments durch Restriktionsanalj-Tse bestimmt, wobei die Restriktionsenzyme BgIII und BanHI in einer Doppelverdauung verwendet werden. Der Stamm S.coli 294, der das Plasmid 11 (Fig. 2) mit der Bezeichnung pSom7A2 enthält, welches das trp-Promoter-Operator-Fragment in der
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gewünschten Orientierung aufweist, wird in LB-Medium gezüchtet, das 10/ug/ml Ampicillin enthält, Man läßt die Zellen bis au einer optischen Dichte von 1 wachsen (bei 550 nm), sammelt sie durch Zentrifugieren und resuspendiert sie in M9-Medium in zehnfacher Verdünnung. Man läßt die Zellen daraufhin zwei bis drei Stunden lang wachsen, bis sie wieder eine optische Dichte von 1 aufweisen, lysiert sie und analysiert das vollständige zelluläre Protein mit SDS (Hatriumdodecylsulfat), Harnstoff (15 %) und. Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (J. Y. Maizel Jr. et al., Meth Viral 5, 180-246 (1971)).
In Pig. 3 ist eine Protein-Gel-Analyse dargestellt, bei der sämtliches Protein von verschiedenen Kulturen der Größe nach getrennt wurde. Die Dichte der einzelnen Banden gibt die Menge wieder, in der die entsprechenden Proteine vorliegen. In der Abbildung der Fig. 3 sind die Spalten 1 und 7 Kontrollen, die eine Vielzahl von Proteinen enthalten, deren Größe vorher bestimmt wurde und die als Referenz dienen. In den Spalten 2 und 3 ist zelluläres Protein von Kolonien des Stammes S.coil 294 gewandert, der mit dem Plasmid pSom7A2 11 transformiert wurde und ent- ?/eder in LB-Medium (Spalte 2) oder in M9-Medium (Spalte'3) gezüchtet wurde, Die Spalten 4 und 5 enthalten zelluläres Protein, das aus ähnlichen Zellen erhalten wurde, die mit dem Plasmid pThaL7Ä2 transformiert wurden. Hierbei handelt es sich um ein Thymosin-esprimierendes Plasmid, das durch ein im wesentlichen mit dem bereits beschriebenen identischen Verfahren erhalten wird, wobei von dem Plasmid pTboO ausgegangen wird (siehe die gemeinsam von
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Roberto Crea und Ronald B. Wetzel auf die Anmelderin übergegangene US-Patentanmeldung, eingereicht am 28. Februar 1980 bezüglich der Thymosin<X1-Produktion; durch dieses Zitat ist die Patentanmeldung in die Offenbarung mit einbezogen). Die Spalte 4 enthält zelluläres Protein von E.coli 294/pT.hc*7Ä2, das in IiB-Medium gewachsen ist, wohingegen die Spalte 5 Zellprotein aus derselben Transformanten enthält, die jedoch in M9-Medium gewachsen ist. Spalte 6, eine weitere Kontrolle, ist das Proteinmuster von E.coli 294/pBR322, gewachsen in LB-Mediuiru
Sin Vergleich mit den Kontrollen zeigt, daß die oberste der beiden am stärksten hervortretenden Banden in den Spalten 3 und 5 Proteine derjenigen Größe enthalten, die im Fall der Expression eines Fusionsproteins erwartet wird, das das D'-Polypeptid und Somatostatin bzw, Thymosin enthält (die andere ausgeprägte Bande enthält das ES'-Polypeptid als Ergebnis der Deletion des Attenuators), Fig, bestätigt, daß die Expression in Tryptophan-reichem Medium reprimiert ist, jedoch unter Tryptophan-Mange!bedingungen dereprimiert ist,
D) Bromcyan-Spaltung und Radiοimmunoassay des Hormonprodukts
Sowohl im Pail des Thymosins als auch des Somatostatins wird das vollständige zelluläre Protein mit Bromcyan gespalten, das Spaltprodukt wiedergewonnen und nach dem Trocknen in Puffer resuspendiert und durch Radioimmunoassay analysiert, vrodurch sichergestellt wird, daß das Sxpressionsprodukt immunologisch identisch ist mit Somatostatin bzw.
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Thymosin. Das Spalten mit Bromcyan ist beschrieben bei D. V. Goeddel et al., Proe HatΊ Acad Sei USA 76, 106-110 (1979).
II· Konstruktion von Plasmiden für die direkte Expression heterologer Gene unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operator-Systems
Die Strategie für eine direkte Expression hat die Schaffung eines PlasEiids zur Folge, das distal von allen Kontrollelementen des trp-Operons eine einzige Restriktionserkennungsstelle aufweist, in welche heterologe Gene anstelle der trp-Leader-Sequenz und in richtigem, räumlichem Verhältnis zu der trp-Leader-Ribosomen-Bindestelle des Polypeptids geclont v/erden können. Die Durchführung der direkten Expression wird im folgenden für den Pail der Expression des menschlichen Wachstumshormons beispielhaft beschrieben»
1OyUg des Plasmids pSom7/l2 11 werden mit EcoRI geschnitten und das D¥A-Fragment 5 (Pig· 4)5 das die genetischen Bestandteile für Tryptophan enthält, wird durch PAGE und Elektroeluierung isoliert« 2/Ug dieses Fragments werden mit zwei Einheiten, der Restriktionsendonuklease Taql verdaut, und zwar 10 Minuten bei 37 0C, so daß im Durchschnitt nur eine der vermutlich fünf . Taql-Erkennungsstellen in jedem Molekül geschnitten wird. Diese teilweise verdaute Fragmentmischung wird durch PAGE getrennt und ein annähernd 300 Basenpaare langes DlTA Fragment 12 (Fig. 4), das ein EcoRI-Ende und ein Taql-Ende enthält, wird durch Elektroeluierung isoliert, Die korrespondierende Taql-Erkennungsstelle ist zwischen den Startstellen für die Transkription und die Translation angeordnet und liegt 5 Nukleotide
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stromaufwärts vom ATG-Codon des trp-Leader-Peptids. Die DHA-Sequenz dieses Bereichs ist in Fig, 4 gezeigt. Wenn man wie beschrieben verfährt, kann ein Fragment isoliert werden, das alle Kontrollelemente des trp-Operons enthält, d. h. das Promoter-Operator-System, das Transkriptions-Initiationssignal und die trp-Leader-Ribosomen-Bindestelle.
Als nächstes wird der dem Translations-Startsignal für die trp-Leader-Sequens benachbarte Taql-Rest am 3'-Ende des erhaltenen Fragments in eine Xbal-Erkeirnungsstelle umgewandelt, wie Fig. 5 zeigt. Dies erfolgt durch Anknüpfen des oben erhaltenen Fragments 12 an ein Plasmid, das nur eine einzige EeoRI- und eine einzige Xbal-Srkennungsstelle enthält. Für diese Zwecke kann man im wesentlichen jedes Plasmid verwenden, das aufeinanderfolgend ein Replikon, einen selektierbaren Marker, beispielsweise eine Antibiotikum-Resistenz, und SeοRl-, Xbal-und BamHI-Erkennungsstellen enthält. Hierzu kann beispielsweise eine Xbal-Srkennungsstelle zwischen die EcoRI- und BamHI-Srkennungsstelle auf dem Plasmid pBR322 eingefügt werden (F. Boliver et al., Gene 2, 95-119 (1977)), und -zwar beispielsweise in der Weise, daß an der einzigen Hindlll-Erkennungsstelle des Plasmids mit dem Restriktionsenzym Hindlll geschnitten wird, gefolgt von einer Einzelstrang-spezifischen ITukleaseverdauung der so entstandenen überstehenden Enden und Verknüpfen der stumpen Enden eines sich selbst fest verbindenden doppe1strängigen, synthetisehen Fukleotids, das beispielsweise eine Srkennungsstelle CCTCTAGAGG enthält. Andererseits können auf natürliche Weise erhaltene DiTA-Fragmente verwendet werden, wie im vorliegenden Fall, die eine einzelne Zbal-Erkennungsstelle zwischen EcoRI- und BainHI-Schneideresten enthalten.
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Mit üblichen Mitteln wurde somit ein EcoRI- und BamHI-Verdauungsprodukt des Genoms des Hepatitis B-Virus hergestellt und zwischen die EcoRI- und BamHI-Erkennungsstellen des Plasmids pGH6 eingefügt (D, Y. Goeddel et al,, ITature 281, *544 (1979)), wodurch das Plasmid pHS32 gebildet, wird. Das Plasmid pHS32 wird mit Xbal geschnitten und aufeinanderfolgend mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt. Es wird dann mit 1 /ul E.coli-Polymerase I, Klenow-Pragment in 30 /ul Polymerase-Puffer (50 mM Calciumphosphat pH 7,4} 7 mM MgCl35 1 mM ß-Mercaptoäthanol), enthaltend 0,1 mM dTTP und 0,1 ml! dCTP, vorerst 30 Minuten lang bei 0 0C und dann 2 Stunden bei 37 °C behandelt. Diese Behandlung hat zur Polge, daß zwei der vier, au der am 5'-Ende überstehenden Xbal-Schneidestelle komplementären Uukleotiden aufgefüllt v/erden:
CT
AGA 5' CTAGA
T 3
TCT
Zwei Uukleotide, dC und dT, werden auf diese Weise eingebaut, wodurch ein Ende mit zwei 5'-überstehenden Uukleotiden entsteht, Dieser lineare Rest des Plasmids pHS3213 wird (nach Phenol- und Chloroformextraktion und Wiederaufnahme in Wasser nach Äthanolfällung) mit EcoRI geschnitten. Das große Plasmidfragment 13 (Pig» 5) T.?ird von dem kleineren EcoRI-Sbal-Pragment durch PAGE getrennt und nach Elektroeluierung isoliert. Dieses DHA-Pragment 13 von pHS32 (~0,2/Ug) wird, unter ähnlichen Bedingungen wie oben beschrieben, an das EcoRI-Taql-Pragment des Tryptophan-Operons (0,01 /ug) angeknüpft, wie in Pig. 5 dargestellt, Bei diesem Verfahren wird das überstehende Taql-Ende mit dem verbleibenden überstehenden Xbal-Ende verknüpft, wobei sogar vermutet
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wird, daß nicht überall T/atson-Crick-Basenpaarung vorliegt :
TCTAGA
AGC TCT AGCTCT
Sin Teil dieser Verknüpfungs-Reaktionsmischung wird in E.coli 294-Zellen transformiert, wie oben in Abschnitt I beschrieben, hitsebehandelt und auf LB-Platten, die Ampicillin enthalten, plattiert. 24 Kolonien werden selektiert, in 3 ml LB-Medium gezüchtet und das Plasmid isoliert. Sechs dieser Plasmide zeigten via S.coli katalysierter DETA-Reparatur und -Replikation eine völlig wiederhergestellte Xb a I-Erkennungsstelle:
rnrfrn
1AGA TCTAGA
AGCTCT' AGATCT
Diese Plasinide wurden auch sowohl durch EcoRI als auch Hpal geschnitten und ergaben die erwarteten Restriktionsfragmente, Ein Plasmid 14 (Fig. 5)» genannt pTrp 14, wurde für die Expression heterologer Polypeptide verwendet, wie im folgenden diskutiert werden wird, ·
Das Plasmid pHGH107, mit dem Bezugsaeichen 18 in Pig, 6 (D, .Y9 Goeddel et al,, nature, 2S1, 544 (1979)) enthält ein Gen für menschliches Wachstumshormon, bestehend aus 23 Aminosäurecodons, hergestellt aus synthetischen DEA-Fragmenten und weiteren 163 Aminosäurecodons, erhalten aus komplementärer DlTA, die mittels reverser Transkription der m-RITA des menschlichen Wachstumshormons erhalten wurde, Dieses Gen 21 (Pig. 0) enthält, obwohl ihm
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die "pre"-Sequenz des menschlichen Wachstumshormons fehlt, ein ATG-Translations-Initiationscodon. Das Gen wird aus 10/Ug pHGHTO7 nach Behandlung mit EcoRI und nachfolgend mit E.coli-Polymerase-I-Klenow-Fragment und dTTP und dATP, Yd.e beschrieben, isoliert, itfach einer Phenol- und Chloroformextraktion und Äthanolfällung wird das Plasmid mit BamHI behandelt, siehe dazu Fig, 6. Das Fragment 21, welches das Gen für menschliches Wachstumshormon (HGH) enthält, wird durch PAGE, gefolgt durch Elektroeluierung, isoliert, Das erhaltene DltfA-Fragment enthält weiterhin die ersten 350 Hukleotide des Strukturgens für Tetracyclin- . Resistenz, nicht dagegen das Tetracyclin—Promoter— Operator-System, so daß - wenn es anschließend in einem Eispressionsplasmid geclont wird - Plasmide, die die Insertion tragen, dadurch gefunden werden können, daß die Tetracyclin-Resistenz wieder hergestellt ist. Da das EcoRI-Snde des Fragments 21 (Fig. G) durch die Behandlung mit der Klenow-Polymerase-I aufgefüllt wurde, v/eist das Fragment ein stumpfes und ein überstehendes Ende auf, wodurch beim späteren Einfügen in ein Espressionsplasmid die korrekte Orientierung sichergestellt ist, siehe dazu Fig. 6»
Als nächstes wird das Sxpressionsplasmid pTrp1414 vorbereitet, um das vorstehend hergestellte, das HGH-Gen enthaltende Fragment aufzunehmen» Dazu wird das Plasmid pTrp1414, Xbal-verdaut, und die erhaltenen überstehenden Enden werden mit dem Klenow-Polymerase-I-Verfahren unter Verwendung von dATP, dTTP, dGTP und dCTP aufgefüllt. ITach Phenol- und Chloroformextraktion und Äthanolfällung wird die resultierende DlTA 16 (Fig. 6) mit BamHI behandelt und das so erhaltene große Plasmidfragment (Fig. 6) durch PAGE und Elektroeluierung isoliert. Das
βΟ 999 18
2 A 3 L 0 8 3
von pTrp14 abgeleitete Fragment 17 (Pig, 6) hat ein stumpfes und ein überstehendes Ende, wodurch Rekombination mit dem das HGH-Gen 21 enthaltenden Fragment, das oben beschrieben wurde, in korrekter Orientierung sichergestellt ist.
Das HGH-Genfragment 21 (Pig. 6) und das pTrp14 Xba-BamHI-Fragment 17 (Pig. β) werden unter ähnlichen Bedingungen wie oben beschrieben zusammengefügt und miteinander verknüpft. Die aufgefüllten Xbal- und ScoRI-Enden werden durch stumpfendige. Verknüpfung miteinander verbunden, wodurch sowohl die Xbal- als auch die EcoRI-Erkennungsstellen wieder hergestellt v/erden:
Xbal,
aufgefüllt
-TCTAG
-AGATC
EcoRI, aufgefüllt
AATTCTATG TTAAGATAC -
'HGH-Gen-Initiation
TJCTAGjAATTCTATG AGATOTTAAGATAC
Xbal EcoRI
Diese Konstruktion stellt auch das Gen für Tetracyclin-Resistenz wieder her. Da das Plasmid pHGH107 die Tetracyclin—Resistenz von einem Promoter aus esprimiert, der stromaufv/ärts vom HGH-Gen 21 liegt (dem lac-Promoter), erlaubt diese Konstruktion 22 (Fig. 6), genannt pHGE207, die Expression des Gens für Tetracyclin-Resistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators, Dazu . wird E.coli 294 mit der Verknüpfungsmischung transformiert und die Kolonien auf LB-Platten, die 5/Ug/ml Tetracyclin enthalten, selektiert.
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Um die direkte Expression des menschlichen Wachstumshormons vom Plasmid pHGH2O7,22, nachzuweisen, wird das gesamte zelluläre Protein aus der Kultur E.coli 294/pHGH2O7 gewonnen, nachdem die Kultur bis zu einer optischen Dichte von 1 in LB-Medium mit 10/ug/ml Ampicillin gezüchtet, danach in H9~Medium 1:10 verdünnt und wieder bis zu einer optischen Dichte von 1 gezüchtet wurde. Das gesamte zelluläre Protein wird einer SDS-Gel-Elektrophorese, wie im obigen Abschnitt I geschildert, unterworfen und mit ähnlichen Slektrophoresedaten für menschliches Wachstumshormon verglichen, die früher von anderen gefunden wurden (D. V, Goeddel et al., Eature, 281, 544 (1979)). Fig. 7 ist eine Fotografie des so erhaltenen, gefärbten Gels. Die Spalten 1 und 7 enthalten Yergleichsproteine verschiedener bekannter Größen; die Spalte 2 ist eine Kontrolle mit dem gesamten zellulären Protein des Stammes E.coli 294/pBR322; die Spalte 3 enthält Protein von E.coli 294/ pHGH107j gewachsen in LB-Medium; die Spalte 4 enthält Protein von E.coli 294/pHGH107, gewachsen in M9-Medium; die Spalte 5 enthält Protein von E.coli 294/pHGH207, gewachsen in LB-Medium; und Spalte 6 enthält Protein E.coli 294/pHGH207, gewachsen in M9-Medium. Die dichte Bande in Spalte 6 ist menschliches Wachstumshormon, wie durch den Vergleich zu den ähnlichen Banden in den Spalten 2 bis 4 gezeigt ist. Wie durch die Erfindung vorausgesagt, produziert der Organismus E.coli 294/pHGH2O7, wenn er in Tryptophan-reichem LB-Medium wächst, γ/eniger Wachstumshormon aufgrund der Tryptophan-Repressor-Operator-Interaktion, und, gezogen in M9-Medium, beträchtlich mehr HGH als E.coli 294/pHGH107, bedingt durch die Induktion des im Gegensatz zum lac-Promoter-Operator-System in pHGH107 stärkeren Tryptophan-Promoter-Operator-Systems.
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III· Herstellen eines allgemeinen Expressionsplasmids für die direkte Expression heterologer Gene unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators
Das im vorstehenden Abschnitt hergestellte Plasmid pHGH2O7,22, wird als nächstes dazu verwendet, um ein DITA-Fragment zu erhalten,das die Kontrollelemente des Tryptophan-Operons enthält (mit Ausnahme des Attenuators) und einen Plasmid-Expressions-Vektor herzustellen, der für die direkte Expression verschiedener, inserierter Strukturgene geeignet ist. Zur Strategie des Hersteilens des allgemeinen Expressionsplasmids gehört das Entfernen der Tryptophan-Kontrollregion von pHGH207 durch EcoRI-Yerdauung und Inserieren in das EcoRI-verdaute Plasmid pBRH1, das oben in Abschnitt I verwendet wurde. pBRH1 ist, wie bereits erwähnt, ein Ampicillin-resistentes Plasmid, das die Gene für Tetracyclin-Resistenz enthält, jedoch Tetracyclin-sensitiv ist, da ein geeignetes Promoter-Operator-System fehlt.
Das so erhaltene Plasmid, pHKY1,24, dessen Konstruktion unten detailliert beschrieben wird und in Pig. 8 dargestellt ist, ist sowohl Ampicillin- als auch Tetracyclin-resistent, enthält das Tryptophan-Promoter-Operator-System, enthält nicht den Tryptophan-Attenuator und enthält eine einzige Sbal-Erkennungsstelle, die distal vom Tryptophan-Promoter-Operator liegt. Der Tryptophan-Promoter-Operator und die einzige Tbal-Erkennungsstelle sind von EcoRI-Erkennungsstellen eingefaßt, so daß das Fragment, das den Tryptophan-Promoter-Operator und die Xbal-Erkennungsstelle enthält, zum Zwecke des Einfügens in andere Strukturgene, enthaltende Plasmide entfernt werden kann.
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Andererseits können heterologe Strukturgene entweder in die ZbaI-Erkennung3Stelle oder (nach teilweiser EcoRI-Yerdauung) in die EcoRI-Erkennungsstelle distal von der Tryptophan-Kontrollregion eingefügt v/erden, in jedem Pail mit dem Ziel, die Strukturgene der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operator-Systems zu unterwerfen.
Das Plasmid pHGH2O7,22, wird EcoRI-verdaut und das den trp-Promoter enthaltende ΞcoRI-Fragment 23 (Pig* 8) wird durch PAGS, gefolgt von Elektroeluierung, wiedergewonnen.
Das Plasmid pBRH1,6, ?d.rd EcoRI-verdaut und die geschnittenen Enden mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) behandelt (1/Ug, in 50 mM Tris pH8 und 10 mM MgCl2, 30 Minuten lang bei 65 0C), um die Phosphatgruppen an den überstehenden EcoRI-Snden zu entfernen. Der Überschuß an bakterieller alkalischer Phosphatase wird durch Phenolextraktion, Chloroformextraktion und Äthanolfällung entfernt. Die resultierende lineare DUA 7a (Pig. 8) wird, da an ihren überstehenden Enden Phosphate fehlen, bei einer Verknüpfung nur Insertionen annehmen, deren komplementäre überstehende Enden phosphoryliert sind, und wird nicht in sich selbst rezirkularisieren, wodurch das Aussieben nach Plasmiden, die die Insertion tragen, erleichtert wird» Das von Plasmid pHGH2O7,22, abgeleitete EcoRI-Fragment und die vom Plasmid pBRH1,6, erhaltene lineare DHA wurden in Anwesenheit von T^-Ligase, wie bereits beschrieben, vermischt und verknüpft. Mit einem Teil der so erhaltenen Mischung wird der Stamm . E.coli 294, wie bereits beschrieben, transformiert, auf LB-Medium, enthaltend 5/Ug/ml Tetracyclin, plattiert, und es werden zwölf
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Tetracyclin-resistente Kolonien selektiert. Aus jeder Kolonie wird das Plasmid isoliert und auf die Anwesenheit einer DM-Insertion durch. Restriktionsendonuklease-Analyse unter Verwendung von EcoRI und XbaJ überprüft. Ein Plasmid 24, das die Insertion enthielt, wurde pHKY1 genannt.
IV. Herstellen eines Plasmids, das das Tryptophan-Operon enthält, fähig zur Expression eines spezifisch spaltbaren Fusionsproteins, das aus sechs Aminosäuren des trp-Leader-Peptids, dein letzten Drittel des trpE-Polypeptid3 (genannt LE') sowie einem heterologen Strukturgen-Produkt besteht
Die Strategie für das Herstellen eines Plasmids, das ein IE'-Pusionsprotein ezprimiert, beinhaltet folgende Schritte:
a) Bereitstellen eines Genfragments, das aus Codons für die distale Region des IS '-Polypeptide besteht und überstehende Enden einer Bglll-Erkennungsstelle am 5'-Ende und einer EcoRI-Erkennungsstelle an 3'-Ende des codierenden Strangs aufweist
b) Eliminieren der Codons von der distalen Region des LE'-Genfragments und derjenigen für die:trpD-Gene aus dem Plasmid Som7Ä2 und Inserieren des in Stufe 1 gebildeten- Fragments *, wodurch: die lE^-C.odonsequenz unmittelbar stromaufwärts von der für das heterologe Gen für Somatostatin codierenden Codonsequenz wiederhergestellt wird*
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Fig. 9a zeigt die Hindlll-Yerdauung des Plasmids pSom7A2,11, gefolgt von einer /l-Exonuklease-Verdauung (einer 5r + 3'-E:xonuklease) unter Bedingungen,
die so gewählt werden, daß jenseits der BgIII-Restruktionserkennungsstelle innerhalb der LEf codierenden Region verdaut wird, 20 /Ug des HindIII-verdauten pSom7A2werden in Puffer gelöst (20 mM Glycinpuffer pH 9»β, 1 mM MgCl2, 1 mM ß-Mercaptoäthanol). Das erhaltene Gemisch wird mit 5 Einheiten λ-Ξχο-nuklease 60 Minuten lang bei Raumtemperatur behandelt. Die so erhaltene Reaktionsmischung wird dann Phenolextrahiert, Chlorofrom-extrahiert und mit Äthanol gefällt.
Um letztlich einen EcoRI-Rest am distalen Ende des LSfGenfragments herzustellen, wird mittels der bewährten Phosphotriester-Methode (R. Crea et al., Proc Hat1! Acad Sei USA 75, 57o5 (1978)) ein Primer -52PCCTGTGCATGAt synthetisiert und an ein Einzelstrangende des LE'-Genfragments hybridisiert, das durch ^-Ezonuklease-Yerdauung erhalten wurde. Die Hybridisierung wird im folgenden beschrieben.
20 ug des 'A-Es:onuklease behandelten Hindlll-Verdauungsprodukts des Plasmids pSom7A2, 11, wird in 20 /ul HpO gelöst und mit 6,ul einer Lösung vereint, die etv/a 80 Picomole der 5'-phosphorylierten Oligonukleotide, wie oben beschrieben, enthält. Das synthetische Pragment wird an das 3f-Snde der LEf codierenden Sequenz hybridisiert, und der verbleibende Einselstrangteil des LE'-Fragments wird durch das ICLenow-Polymerase-I-Verfahren, wie oben beschrieben, aufgefüllt, wobei dATP, dTTP, dGTP und dCTP verwendet werden.
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Die Reaktionsmischung wird auf 50 0G erhitzt und langsam auf 10 0G abgekühlt, wonach 4/ul Klenovy-Enzym zugegeben werden. Efach 15 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur, gefolgt von 30 minütiger Inkubation bei 37 0G, wird die Reaktion durch Zugabe von 5/Ul 0,25 molarem EDTA gestoppt. Die Reaktionsmischung wird Phenol-estrahiert, Chloroform-extrahiert und mit Äthanol gefällt. Anschließend wird die DUA mit dem Restriktionsenzym BgIII geschnitten. Die Fragmente werden durch PAGS getrennt. Ein aus dem Gel erhaltenes Autoradio-
32 gramm zeigt ein P-markiertes !Fragment der erwarteten Länge von annähernd 470 Bp, das durch Elektroeluierung rückgewonnen wird. Wie bereits hervorgehoben, hat das Fragment LE'(d) ein BgIII- und ein stumpfes Ende, das mit dem Anfang des Primers übereinstimmt.
Das Plasmid pThX.1, 30, das oben im Abschnitt I. (C) beschrieben wurde, enthält ein Strukturgen für .Thyrnosin c£1, das an.seinem 5'-Ende des codierenden Strangs in eine EcoRI-Erkennungsstelle und an seinem 3'-Ende in eine BamHI-Erkennungsstelle geclont ist. Wie in Fig,9b gezeigt, enthält das Gen für Thymosin eine zusätzliche Bglll-Erkennungsstelle,
Das Plasmid pThoO enthält weiterhin ein Gen für Ampicillin-Resistenz. Um ein Plasmid herzustellen, das in der Lage ist, das wie oben geschildert hergestellte LE»(d)-Fragment aufzunehmen, wird das Plasmid pThatf ,30, mit EcoRI verdaut, gefolgt von einer Klenow-Polymerase-I-Reaktion mit dTTP und dATP, um die EcoRI-Reste stumpfendig zu machen. Durch Bglll-Verdauung des so erhaltenen Produkts wird ein lineares DiTA-Fragment 33 (Fig. 9b) hergestellt, das die Gene für Ampicillin-Resistenz und, jeweils an den entgegengesetzten Enden,
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einen überstehenden Bglll-Rest und ein stumpfes Ende enthält. Das so erhaltene Produkt kann durch Reaktion mit dem IEf(d)-Fragment, das ein überstehendes BgIII-Ende und ein stumpfes Ende enthält, in der Gegenwart von T^-Ligase rezirkularisiert werden,.um das Plasmid pTrp24, 34, (Fig* 9b) zu bilden. Während dieses Vorgangs wird eine EcoRI-Erkennungsstelle an der Position wiederhergestellt, v/o die Verknüpfung der stumpfen Enden erfolgte·
Im weiteren Verlauf wird, wie in Pig. 10 gezeigt, nacheinander das Plasmid pTrp24, 34, mit BgIII und EcoRI verdaut, danach PAGE behandelt und elektroeluiert, wodurch ein Fragment entsteht, das die Codons für das LEr(d)-Polypeptid mit einem überstehenden Bglll-Ende und einem überstehenden EeoRI-Ende, angrenzend an seinen 3'Terminus des codierenden Strangs aufweist·. Das LE'(d)-Fragment 38 (Fig. 10) kann in die Bglll-Erkennungsstelle des Plasmids pSom7&2, 11, geclont werden, um ein LE'-Polypeptid/Somatostatin— Fusionsprotein zu bilden, das unter der Kontrolle des .Tryptophan—Promoter—Operators esprimiert wird, wie in Fig. 10 gezeigt. Ein solches Verfahren erfordert erstens eine partielle EcoRI-Verdauung des Plasmids pSom7Ä2, 11, um die EcoRI-Erkennungsstelle distal vom Tryptophan-Promoter-Operator zu schneiden, wie in Fig. 10 gezeigt, und zweitens eine korrekte Wahl der Primer-Sequenz (Fig. S), um den korrekten Godon-Leseraster zu erhalten und eine EcoRI-Schneidestelle wiederherzustellen.
Dazu werden I6,ug des Plasmids pSom7A2, 11, in 200 /ul Puffer, bestehend aus 20 mfii Tris, pH 7,5, 5 oM MgCl9,
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0,02 % 1IP40 Detergeiis, 100 mlvl UaCl verdünnt und mit 0,5 Einheiten EcoRI "behandelt. Mach 15 minütiger Behandlung szeit bei 37 C wird die Reaktionsmischung Phenol-extrahiert, Chloroform-extrahiert und mit Äthanol gefällt und anschließend mit BgIII verdaut. Das größere, so erhaltene Fragment 3δ (Fig. 10) wird durch die PAGE-Behandlung isoliert, gefolgt von Elektroeluierung, Dieses Fragment -36 enthält die Codons LE'(p) für das proximale Ende des LEf-Polypeptide, d« h« diejenigen Codons, die stromaufwärts von der Bglll-Erkennungsstelle liegen. Das Fragment 36 (Fig.10) wird als nächstes an das Fragment 38 (Fig, 10) in Anwesenheit von T^-Ligase verknüpft, um das Plasmid pSom7A2d4, 39, zu bilden, das, nach Transformation in den Stamm E.coil 294, wie bereits beschrieben, wirksam unter die Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators ein Fusionsprotein produziert, das aus dem vollständig rekonstituierten LE '-Polypeptid und Somatostatin besteht. Das Fusionsprotein, von dem das Somatostatin dank der Anwesenheit eines Methionine am 5T-Ende der Somatostatinequenz spezifisch gespalten werden kann, wird durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, wie bereits beschrieben, segregiert. Das Fusionsprotein-Produkt stellt die am deutlichsten sichtbare Bande in der Spalte 6 der Fig. 11 dar, wie im Detail im noch folgenden;; Ab schnitt Yl beschrieben werden \7ird.
7. Herstellen eines Expressionssystems für trp-LEf-Polypeptid-Fusionsprodukte, wobei die Tetracyclin-Resistens unter der Kontrolle des Tryptophan-Pronioter-Operators steht.
Die Strategie für das Herstellen eines Expressionsvektors, der in der Lage ist, eine große Anzahl ver-
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sch.ied.ener heterologer Gene für Polypeptide als trp-IE'-Fusionsproteine unter der Kontrolle des Tryptophan-Operons zu exprimieren, erfordert die Konstruktion eines Plasmids, das die folgenden Charakteristika.aufweist :
1, eine Tetracyclin-Resistenz, die im Falle des Herausschneidens des Promoter-Operator-Systems, das die Gene für diese Resistenz kontrolliert, verlorengehen würde
2. durch Wiedereinfügen des Promoter-Operator-Systems, das die Tetracyclin-Resistenz kontrolliert, und Rezirkularisieren durch dessen Verknüpfen mit einem heterologen Gen sowie einem Tryptophan-Promoter-Operator-System in richtiger Lesephase wird Tetracyclin-Resistenz wieder hergestellt und entsprechend die Identifizierung von Plasmiden, die den heterologen Geneinschluß erhalten, ermöglicht.
In Kürze gesagt und in ÜbereinStimmung mit der Uatür der beabsichtigten Insertionen, soll ein lineares Stück DUA hergestellt werden, das einen Pst-Rest an seinem 3'-Ende und einen BgIII-Rest an seinem 5T-Ende aufweist, die an ein Gen angrenzen, das fähig ist, Tetracyclin- Resistenz zu spezifizieren, wenn es unter die Kontrolle eines Promoter-Operator-Systems gebracht wird·
Dazu wird, v/ie in Fig, 12 dargestellt, das Plasmid pBR322, 43, mit Hindlll verdaut und das überstehende Hindlll-Ende daraufhin mit Si-Uuklease verdaut, Die 31-ITuklease-Verdauung besteht aus der Behandlung von 10/Ug eines Hindlll-geschnittenen Plasmids p3R322 in 30,ul S1-Puffer (0,3 M UaGl), 1iii ZnCl2, 25 mM
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Natriumacetat, pH 4,5) mit 300 Einheiten S1-lTuklease 30 Minuten lang bei 15 0C, Die Reaktion wird durch Zugeben von 1 /ul von 30 X SI-ITuklease-Stoplösung (0,8 M Tris, 50 mM SDTA) gestoppt. Die Mischung wird Ph.enol-exfcrah.iert, Chloroform-extrahiert und mit Äthanol gefällt, dann EcoRI-verdaut, wie bereits beschrieben, und das große Fragment 46 (Pig· 12) durch PAGS-Behandlung erhalten, worauf eine Elektroeluierung folgt. Das erhaltene Fragment hat ein erstes4 überstehendes ScoRI-Ende und ein zweites stumpfes Ende, dessen codierender Strang mit dem Nukleotid Thvmidin beginnt. Wie im folgenden gezeigt wird, 'kann der S1-verdaute Hindlll-Rest, der mit Thjrmidin beginnt, mit einem Klenow-Polymerase-I-behandelten BgIII-Rest verbunden werden, so daß nach der Verknüpfung die BgIII-Restriktionserkennungsstelle wieder hergestellt ist.
Das Plasmid pSom7d2, 11, das im obigen Abschnitt I vorbereitet wurde, wird Bglll-verdaut und die so entstandenen überstehenden Bglll-Enden mit dem Klenow— Polymerase-I-Verfahren doppelsträngig gemacht, wobei alle vier Desosynukleotidtriphosphate verwendet werden. Das EcoRI-Schneiden des resultierenden Produkts, gefolgt durch PAGE und Elektroeluierung des kleinen Fragments 42 (Fig. 13), stellt ein lineares Stück DIiA zur Verfugung, das den Tryptophan-Promoter-Operator und Codons der prosimalen Sequenz des IE'-Proteins stromaufwärts der Bglll-Erkennungsstelle (LEr(p)) enthält. Das DITA-Stück hat ein EcoRI-Ende und ein stumpfes Ende als Ergebnis des Auffüllens der Bglll-Erkennungsstelle. Die Bglll-Erkennungsstelle kann jedoch durch Anknüpfen des stumpfen Endes des Fragments 42 (Fig.13) an das stumpfe Ende des Fragments 46 (Fig. 13) wieder hergestellt werden. Dazu werden die beiden Fragmente, in Anwesenheit von T,-DITA~Ligase verknüpft, um das
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rezirkularisierte Plasmid ρΞΚΥΙΟ 47 (siehe Pig. 12) zu bilden, das durch Transformation in kompetente Zellen des Stammes S.coli 294 vermehrt wird# Tetracyclinresistente Zellen, die das rekombinante Plasmid pHKYIO 47 tragen, werden gezüchtet, die Plasmid-DIA extrahiert und nacheinander mit BgIII und Pst verdaut, daraufhin durch das PAGS-Verfahren isoliert und das große Fragment elektroeluiert, das als lineares Stück DlIA vorliegt und überstehende Pst- und Bglll-Snden aufweist, Dieses DITA-Fragment 49 (Pig* 13) enthält den Origin (die Anfangsstelle) der Replikation und hat sich infolgedessen als erster Bestandteil bei der Konstruktion eines Plasmids als nützlich erwiesen, bei dem sowohl die Gene, die für das trp-LE'Polypeptid-Fusionsprotein codieren, als auch die Tetracyclin-Resistenz-Gene durch den trp-Promoter-Operator kontrolliert werden.
Das Plasmid pSom7A2M, 39, das auf die in Abschnitt beschriebene Weise hergestellt werden kann, kann so manipuliert werden, daß es als zweite Komponente des Systems dient, das in der Lage sein soll, -eine große Anzahl verschiedener heterologer Strukturgene aufzunehmen. Wie in Pig. 13 gezeigt, wird das Plasmid einer Teil-EcoRI-Verdauung unterworfen (siehe Abschnitt IV), gefolgt von einer Pst-Verdauung. Das so erhaltene Fragment 51 (Fig. 12) enthält den trp-Promoter-Operator und wird durch das PAGS-Verfahren isoliert, gefolgt von Elektroeluierung. Die Teil-EcoRl-Verdauung ist nötig, um ein Fragment zu erhalten, das unmittelbar anschließend an das 5'-3nde des Somatostatingens geschnitten wird, jedoch nicht an der ScoRI-Erkennungsstelle geschnitten wird, die zwischen dem Gen für Ampicillin-Resistenz und dem trp-Promoter-Operator
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liegt. Die durch, den Pstl-Schnitt im Gen für Ampicillin-Resistenz verlorengegangene Ampicillin-Resistenz kann durch Verknüpfung mit Fragment 51 (Pig.· 12) wieder hergestellt werden.
In einer ersten Äusführungsform kann der dritte Bestandteil, ein Strukturgen für Thymosin<X1 durch ScoRl- und BamHI-Yerdauung des Plasmids pT.hodi erhalten werden. Das so hergestellte Fragment 52 (Fig. 12) wird durch PAGS gereinigt und elektroeluiert,
Die drei Genfragmente 49, 51 und 52 können nun, wie in Fig. 12 dargestellt, in richtiger Orientierung miteinander verknüpft werden, um das Plasmid pThc*L7ÄiM> 53j zu bilden, das aufgrund der Wiederherstellung der Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz selektiert werden kann. Wenn mit diesem Plasmid 53 der Stamm S.coli 29.4 transformiert wird und der Stamm unter Bedingungen gezüchtet wird, wie sie im Abschnitt I beschrieben wurden, wird ein trp-LD'-Polypeptid-Fusionsprotein exprimiert, von dem ThymosinOCI durch Bromcyan-Behandlung spezifisch gespalten werden kann. Wenn andere heterologe Strukturgene, die EcoRI- und BamHI-Snden aufweisen, auf ähnliche Weise mit von ρΗΙΓίΊΟ, 47, und pSom7^2M, 39) abgeleiteten Bestandteilen verknüpft werden, können ähnlich wirksame trp-LS'-Polypeptid-Fusionsproteine erhalten werden, die jeweils diejenigen Polypeptide enthalten, für welche die heterologen Gene codieren. Fig. 11 zeigt eine SDS-Polyacrylamid-Gel-Slektrophorese-Trennung des totalen zellulären Proteins von E.coli 294-Transformanten, wobei die dunkelsten Banden in .jedem Fall das Fusionsprotein repräsentieren, das unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operator-Systems
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produziert wurde. Die Spalte 1 in Fig. 11 ist eine Kontrolle, die das vollständige zelluläre Protein des Stammes E.coli 294/pBR322 enthält. Die Spalte 2 enthält das Somatostatin-Fusionsprodukt des Plasmids pSom7ZL2ü4j dessen Herstellung in Abschnitt IV beschrieben wurde. Spalte 3 ist das Somatostatin-enthaltende Expressionsprodukt des Plasmids pSomTd.1 44. Spalte 4 enthält das Expressionsprodukt des Plasmids pTHo£ 7Λ1M, wohingegen Spalte 5 das Produkt enthält, das durch ein Plasmid exprimiert wird, das erhalten wird, wenn, die pHKYIO-abgeleiteten und pSomTd 2A4—abgeleiteten Fragmente, wie oben erörtert, mit einem ScoRI/BamHI-terminierten Strukturgen verknüpft ?/erden, das für menschliches Proinsulin codiert, das teilweise bei der Anmelderin hergestellt wurde. Die Spalten 6 bzw. 7 enthalten, als dunkelste Banden, ein trp-LE'-Polypeptid-Fusionsprotein, von dem in dem einen Fall die B-Kette und in dein anderen Fall die A-Kette des menschlichen Insulins gespalten werden kann. Die B- und A-Strukturgene des Insulins werden durch EcoRI- und BamHI-Verdauung des Plasmids pI31 bzw. pIA11 erhalten, deren Herstellung bei D. V, Goeddel et al., Proc ITatΊ Acad Sei USA 76, 106 Ci979), beschrieben ist. Die Spalte 8 enthält Grö.ßenmarker, wie bereits beschrieben.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist unter Verwendung von E.coli beschrieben. Es können jedoch wahlweise andere Enterobacteriaceen als V/irtssellen für die Expression und als Quelle für die trp-Operons dienen, von denen beispielsweise Salmonella typhimurium und Serratia marcesans zu erwähnen sind. Somit ist die Erfindung nicht auf die geschilderten Ausführungsbeispiele beschränkt.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren neu zu konstruierenden Plasmide sind neue, in ihrer Struktur eindeutig definierbare chemische Substanzen,
Claims (4)
1· Verfahren zur Herstellung eines Expressionsplasmids für die Esnpression eines heterologen Gens, gekennzeichnet dadurch, daß in Phase die folgenden Elemente gleichzeitig verknüpft werden:
a) ein erstes lineares doppelsträngiges DUA-Fragment, das ein Replikon enthält und ein Gen, das eine selektierbare Eigenschaft exprimiert, wenn es unter die Steuerung eines bakteriellen Promoters gestellt wird, wobei das Fragment keinen derartigen Promoter auf v/eist,
b) ein zweites lineares doppelsträngiges DITA-Fragment, das das genannte heterologe Gen aufweist,
c) ein drittes doppelsträngiges DITA-Fragment, das einen bakteriellen Promoter auf weist.,
wobei die verknüpfbaren Enden der genannten Fragmente so gestaltet sind, dai3 nach dem Verknüpfen zum Bilden eines sich replizierenden Plasmids sowohl das Gen für die selektierbare Eigenschaft als auch das heterologe Gen unter die Steuerung des Promoters kommen^ wodurch . die Verwendung der selektierbaren Eigenschaft bei der Selektion von transformierten, Bakterienkolonien möglich. ist, welche zur Expression der heterologen Gene fähig sind.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß ' die selektierbare Eigenschaft eine Aiitibiotilcumresistenz ist.
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- 243408 :
3· Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die selektierbare Eigenschaft Tetracyclin-Resistenz ist und der bakterielle Promoter der trp-Promoter ist,
4. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Verknüpfung ebenso ein Operon für die Expression von Ampicillin-Resistenz wiederherstellt.
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