PL155850B1 - Agrimotor-mounted unit for grinding cereals and dry volume fodder - Google Patents

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 155 850 POLSKA

URZĄD

PATENTOWY

RP

Patent dodatkowy do patentu nr--Int. Cl.⁵ C12N 15/81

Zgłoszono: 86 10 17 (P. 288208)

Pierwszeństwo: 85 10 18 dla zastrz. 1

Stany Zjednoczone Ameryki 86 03 18 dla zastrz. 2

Stany Zjednoczone Ameryki

Zgłoszenie ogłoszono: 87 10 19

Opis patentowy opublikowano: 1992 08 31

Twórca wynalazku-Uprawniony z patentu: Pfizer Inc., Nowy Jork (Stany Zjednoczone Ameryki)

Sposób wytwarzania transformantu Y. lipolytica

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania transformantu Yarrowia lipolytica.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku wytwarza się transformanty drożdży, zawierające wektory ekspresji i wydzielania. Transformanty te stosuje się do wytwarzania białek heterologicznych w ich natywnej, funkcjonalnej postaci.

Poszukiwania dróg równomiernego i ilościowo pokrywającego zapotrzebowania, wytwarzania białek i polipeptydów cennych dla przemysłu (na przykład proreniny, bydlęcego hormonu wzrostu) lub dla celów medycznych (urogastron, aktywator plazminogenu tkankowego, ludzka anafilotoksyna C3a) a zwłaszcza, poszukiwania źródeł, z których można byłoby uzyskiwać produkty o wysokiej jakości w łatwej do wyodrębnienia funkcjonalnej formie, skierowały wysiłki badaczy w kierunku atrakcyjnej ekonomicznie technologii rekombinacji DNA i wytwarzania heterologicznych białek w mikroorganizmach jako „fabrykach¹¹.

Prowadzone obecnie szerokie badania ogniskują się na wydzielaniu białka, jako na potencjalnym rozwiązaniu trudności napotykanych przy odzyskiwaniu egzogennego lub heterologicznego (obcego) białka w postaci aktywnej biologicznie a gromadzonego wewnątrz zrekombinowanych komórek gospodarza, zwłaszcza na wyodrębnianiu z komórek E.coli. W E.coli białko heterologiczne jest zazwyczaj wytwarzane we wnętrzu komórki w formie silnie uginających światło ciał inkluzyjnych. Białko to na ogół jest słabo rozpuszczalne w wodzie i wykazuje niewielką aktywność biologiczną lub wcale nie wykazuje aktywności. Ekstrakcja tego białka z tych ciał inkluzyjnych wymaga zazwyczaj ostrej obróbki chemicznej, która może być kosztowna a w wyniku jej stosowania można otrzymać niewiele, lub wcale nie uzyskać białka w żądanej, natywnej, biologicznie aktywnej postaci. Ponadto, możliwość zanieczyszczenia tego białka niepożądanymi substancjami wytwarzanymi przez E.coli zwiększa się przez konieczność niszczenia komórek w celu uwolnienia z ciał inkluzyjnych. Poza E.coli, inne organizmy również wytwarzają białko heterologiczne w nierozpuszczalnej formie wewnątrzkomórkowej. Przykładowo, w opisie patentowym Wielkiej Brytanii nr 2091 271 ujawniono modyfikację genetyczną S.cerevisiae na drodze technologii rekombinacji DNA dla uzyskania ekspresji reniny lub chymozyny cielęcej, przy czym terminy te stosowano zamiennie. Z powodu powyższych trudności, badania skierowano na wydzielenie tego białka poza

155 850 organizm gospodarza, widząc w tym możliwość opracowania drogi wytwarzania tego białka w jego natywnej, aktywnej konfiguracji.

Okazuje się, że to, czy konkretne białko, w tym białko lub polipeptyd heterologiczny jest wydzielane przez dany organizm poza komórkę, zależy od tego białka. W większości komórek eukariotycznych część aparatu syntetyzującego białko jest związana z błoną endoplazmatyczną retikulum a sekwencja aminokwasów (zwana sekwencją sygnałową) w pobliżu N-końca powstałego łańcucha polipeptydowego służy do kierowania białka do przechodzenia przez błonę. Ta sekwencja sygnałowa jest następnie odszczepiana proteolitycznie w procesie sekrecji, w wyniku czego powstaje aktywne, dojrzałe białko. Czyniono szereg wysiłków w celu opracowania sposobów wydzielania białek heterologicznych z zastosowaniem sekwencji sygnałowych w mikroorganizmach, w tym, w Bacillus subtilic, Saccharomyces cerevisiae i w hodowlach komórkowych ssaków. Okazało się jednak, że te organizmy nie są idealne. W wysiłkach tych przeszkodziły właściwości gatunkowe B. subtilis. Bakteria ta wydziela wiele białek, w tym liczne proteazy, które rozkładają wydzielane białko heterologiczne. Transformowane szczepy tych bakterii są niestabilne tracąc heterołogiczny DNA.

Udało się metodą inżynierii genetycznej modyfikować komórki ssaków w taki sposób, aby zachodziła w nich ekspresja i wydzielanie białek heterologicznych. Hodowla takich układów jest jednak technologicznie trudna i kosztowna, co powoduje, że wytwarzanie większości białek na skalę przemysłową staje się nieopłacalne.

Pomimo, iż badania wydzielania białka w organizmach S. cerevisiae są bardziej obiecujące niż w organizmach B. subtilic, to okazało się, że S. cerevisiae, jako układy wydzielania białek stwarzają również pewne ograniczenia wynikające z cech gatunkowych tego gospodarza. W opisie zgłoszenia patentowego europejskiego nr 0123544 opublikowanym 31 października 1984 r. ujawniono izolowanie genów czynnika -a S. cerevisiae i użycie w plazmidzie ich części zawierających promotor i/lub sekwencję sygnałową białka w połączeniu z DNA kodującym białko heterologiczne dla drożdży, dla transformowania komórek drożdży zdolnych do wytwarzania oddzielonego od pre-sekwencji, dojrzałego białka podczas hodowli komórek. W opisie zgłoszenia patentowego europejskiego nr 0088632 opublikowanym 14 września 1983 r. opisano sposób uzyskiwania ekspresji i sekwencji białka heterologicznego w S. cerevisiae. Jednak wielkość białek, które S. cerevisiae są w stanie wydajnie wydzielać w tych i innych układach wydzielniczych jest ograniczona do około 20000 daltonów. Przezwyciężenie tej ogólnej niewydolności S. cerevisiae jako organizmu wydzielniczego wymaga wielokrotnych mutacji, opisanych przez Smith'a i wsp.; Science 229, 1219-1224 (1985). Jedynym wyjątkiem od tej zasady jest obserwacja, że enzymy pochodzące z Aspergillus, większe od 20 000 daltonów mogą być wydzielone przez S. cerevisiae, ale w gospodarzu tym, enzymy te mają wysoki stopień zglikozylowania, co może mieć wpływ na wydajność sekrecji.

Przedmiotem szczególnego zainteresowania jest Yarrowia lipolytica, ważny z punktu widzenia przemysłowego gatunek drożdży, stosowany do produkcji kwasu cytrynowego i białka komórkowego. Można go również stosować do produkcji erytrytu (butanotetraolu), mannitolu i kwasu izopropylo-jabłkowego. Są to drożdże szczególnie cenne, gdyż w przeciwieństwie do S. cerevisiae, Y. lipolytica wykazują zdolność wydajnego wydzielania białek o wysokim ciężarze cząsteczkowym (proteaza alkaliczna, proteaza kwaśna i RNA-za) do środowiska wzrostu (podłoża), co pozwala na wyodrębnienie białek heterologicznych w ich natywnej formie, bez potrzeby niszczenia wytwarzających je komórek. Ponadto Y. lipolytica wydziela ilościowo bardzo niewiele białek, stwarzając potencjalne możliwości produkcji żądanego białka heterologicznego w środowisku wzrostu, jako białka dominującego, co ułatwia odzysk tego białka heterologicznego.

Y. lipolytica wytwarza duże ilości pozakomórkowej proteazy. Jest to główne białko wydzielane przez Y. lipolytica. Rodzaj konkretnej proteazy (alkaliczna, kwaśna lub obojętna) zależy od użytego szczepu Y. lipolytica [Ogrydziak i wsp., J. Cen. Microbiol. 128, 1^1^^—1234 (1982)]. W publikacji tej cytuje się częściową analizę sekwencji fragmentu N. końcowych reszt aminokwasowych alkalicznej, pozakomórkowej proteazy.

W opisie zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 634 505 z dnia 25 lipca 1984 r. opisano sposoby transformowania Y. lipolytica i klonowania genów Y. lipolytica przez komplementację mutacji. Ujawniono tam klonowanie genu XPR2 kodującego wydzielaną alkali155 850 czną proteazę przez komplementację mutacji xpr2 Y. lipolytica. Metodologia ta obejmuje transformowanie szczepu gospodarza Y. lipolytica produktem częściowego trawienia enzymem BgUI banku genów Y. lipolytica w wektorze pLD40, opisanym w opisie zgłoszenia patentowego europejskiego nr 0138508 opublikowanym 24 kwietnia 1985 r. stanowiącego odpowiednik podanego powyżej zgłoszenia Stanów Zjednoczonych Ameryki.

Wytwarza się wektory, które jeśli zostaną wprowadzone do Y. lipolytica jako gospodarza, nadają temu gospodarzowi zdolność wytwarzania i wydzielania do środowiska specyficznych białek kodowanych przez heterologiczny DNA pochodzący z dowolnego źródła, a zwłaszcza z organizmów eukariotycznych oraz przez DNA syntetyczny.

Wytwarza się ponadto nośniki klonujące Y. lipolytica zawierające DNA heterologiczny, kodujący ekspresję białka ssaków lub innych polipeptydów, w tym plazmidy nadające się do transformowania Y. lipolytica jako gospodarza, a zwłaszcza integracyjne wektory ekspresyjne, zawierające gen promotora LEU2, gen promotora XPR2, prepro-region dla alkalicznej proteazy i region terminatora XPR2, jak również plazmidy ekspresyjne, zawierające heterologiczną sekwencję kodującą wraz z sygnałami wydzielniczymi XPR2 usytuowanymi za promotorem LEU2. Plazmidy te mają zdolność ekspresji i sekrecji heterologicznego białka w transformowanych nimi drożdżach Y. lipolytica.

Wynalazek obejmuje sposób wytwarzania genetycznie zmienionych komórek Y. lipolytica, w których zachodzi ekspresja i wydzielanie dojrzałego białka heterologicznego, a zwłaszcza, proreniny i ludzkiej anafilotoksyny C5a. Odkrycie i dokładne oznaczenie sekwencji aminokwasowej oraz sekwencji DNA dla pozakomórkowej proteazy alkalicznej Y. lipolytica umożliwiło ustalenie, że białko heterologiczne może być wytwarzane i wydzielane na drodze rekombinacji DNA i produkowane w hodowli komórkowej. W przypadku proreniny, wytwarzana jest i wydzielana dojrzała forma zymogenu (prekursora reniny).

Okazało się, że drożdże Y. lipolytica można modyfikować genetycznie na drodze technologii rekombinacji DNA, otrzymując transformanty zdolne do ekspresji i wydzielania białek heterologicznych w ich formie natywnej. Uzyskano to przez skonstruowanie wektorów zawierających część sygnałową lub część sygnałową i pierwszą (pro 1) lub obydwie prosekwencje (pro 1 + pro2) genu XPR2, przyłączone do sekwencji genu strukturalnego wydzielanego białka heterologicznego.

Transformanty otrzymane przez integrację w locus XPR2 wektora DNA zawierającego fragment genu XPR2, z pominięciem komponent regulatorowych lub strukturalnych na obydwu końcach tego genu, przestają wytwarzać alkaliczną proteazę, co jest cechą pożądaną nie tylko z punktu widzenia wydzielania heterologicznego białka, lecz również dlatego, że cechę tę można wykorzystać do skriningu przewidywanych transformantów.

Ponadto, wektory zawierające promotor XPR2 i sekwencje kodujące wydzielniczą sekwencję sygnałową alkalicznej proteazy nadają transformowanej komórce Y. lipolytica zdolność wydzielania dojrzałego, heterologicznego białka. Niektóre wektory rekombinantowego DNA tego typu nadają zdolność ekspresji i wydzielania niezależnie od miejsca integracji z genomem gospodarza drożdżowego. Na ogół, wektory zawierające wystarczające boczne regiony flankujące 5' i 3' DNA, wywołują ekspresję produktu niezależnie od miejsca integracji.

Nieoczekiwanie okazało się także, że integracja plazmidu pBR322 z chromosomalnym DNA Y. lipolytica daje obszar homologii, który sprzyja dalszej, kierowanej miejscem, transformacji integracyjnej. Zintegrowana kopia pBR322 służy zatem jako tzw. platforma dokowania dla przyłączanego DNA transformującego. Integracja kopii pBR322 z chromosomalnym DNA Y. lipolytica stwarza zatem znane miejsce docelowe dla integracji, pomimo, że pBR322 nie jest natywnym DNA Y. lipolytica. Transformanty Y. lipolytica, które przyjęły plazmid, takie, które zawierają tego rodzaju miejsce, mają dwie cechy korzystne, przewyższające transformanty, które nie mają tego miejsca, obecność regionu o znanej sekwencji i znanej mapie restrykcyjnej, który to region ma służyć jako „cel“ dla kierowanej miejscem integracji oraz sposobność do określenia (stosując pBR322jako „cel“ integracji), czy wchodzący plazmid zawiera kompletną jednostkę funkcjonalną lub gen, czy jedynie część żądanego genu. Przykładowo, plazmid zawierający tylko fragment 3' genu XPR2 mógłby transformować przyjmujący go XPR2-1002, jeśli zawierałby on kodon typu dzikiego i integrował w locus XPR2. Jednak ten sam plazmid nie mógłby transformować gospoda4

155 850 rza XPR2-1002 dając fenotyp proteazo-dodatni, jeśli byłby zintegrowany w pBR322, ponieważ nie zawiera on kompletnej jednostki funkcjonalnej.

Tak więc, w transformantach Y. lipolytica posiadających obszar homologii z heterologicznym DNA wektora, obszar ten, zawierający egzogenny DNA służy jako miejsce przyjmujące podczas integracyjnej transformacji tych Y. lipolytica. Poza pBR322 i jego pochodnymi, do wytwarzania transformantów Y. lipolytica posiadających tę tzw. platformę dokowania można zastosować kosmidy, bakteriofagi, takie jak M13 i lamda, DNA otrzymany syntetycznie oraz powszechnie znane plazmidy, takie jak pUC13.

Termin sekwencja promotor LEU2 oznacza niepodlegający translacji region przed ATG. Zawiera ona większość, jeśli nie wszystkie cechy wymagane dla ekspresji.

Termin sekwencja promotora XPR2 oznacza nie podlegający translacji region przed sekwencją (lub pre-sekwencją) sygnałową. Jest on niezbędny dla ekspresji. Ponadto, można zastosować sekwencję sygnałową z genu XPR2 (z/lub bez prosekwencji dla uzyskania wydzielania białek pod kontrolą promotorów ekspresyjnych Y. lipolytica innych niż gen XPR2. Zatem, wektory posiadające promotor LEU2 i sekwencje sygnałowe dla wydzielania alkalicznej proteazy są zdolne do spowodowania wydzielania przez transformowaną komórkę Y. lipolytica dojrzałego heterologicznego białka.

Ludzka anafilotoksyna C5a, znana również jako białko dopełniacza C5a (ludzka C5a) jest biologicznie aktywnym odcinkiem polipeptydowym powstającym in vivo w wyniku aktywacji dopełniacza. Działa ona jako immunomodulator w regulacji pewnych aspektów humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Struktura pierwszorzędowa tej anafilotoksyny i innych anafilotoksyn została już wyjaśniona. Ich własności chemiczne, fizyczne i właściwości biologiczne zostały opisane przez Hugli'ego w „Complement, pod redakcją M.J.MullerEberhard'a i P.A. Miescher'a, str. 73-99 (1985) wydawca Springer-Verlag, Nowy Jork.

Dla specjalistów jest zrozumiałe, że w niniejszym wynalazku, po dokonaniu niezbędnych zmian, może być zastosowany heterologiczny DNA kodujący dowolną znaną sekwencję aminokwasową.

Ujawniona tutaj metodologia, po dokonaniu niezbędnych zmian, nadaje się do zastosowania w produkcji i wydzielaniu dowolnego znanego białka heterologicznego. Przykłady takich białek są podane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 532 207. Poza tym, zamiast genu XPR2 można zastosować dowolny inny gen z Y. lipolytica kierujący wydzielaniem białek, na przykład geny dla rybonukleazy czy kwaśnej proteazy oraz geny hybrydowe, konstruowane przez połączenie fragmentów dwóch lub więcej tych genów, na przykład sekwencji sygnałowej genu XPR2 i sekwencji promotora genu dla rybonukleazy.

Zakresem wynalazku objęte są również funkcjonalne równoważniki opisanych powyżej DNA lub sekwencji nukleotydowych. Degeneracja kodu genetycznego pozwala na podsta wienie niektórych kodonów innymi kodonami określającymi ten sam aminokwas, przez co można uzyskać zwiększone wytwarzanie tego samego białka.

DNA lub nukleotydowe sekwencje mogą różnić się znacznie, ponieważ za wyjątkiem metioniny i tryptofanu, znane aminokwasy kodowane są przez więcej niż jeden kodon. Tak więc, części lub cały gen XPR2 można syntetyzować, otrzymując sekwencję DNA znacznie się różniącą od przedstawionej na fig. 3. Powinna być jednak zachowana kodowana przez ten gen sekwencja aminokwasowa. Takie funkcjonalne zmiany danej sekwencji DNA lub nukleotydowej dają sposobność do pobudzania wydzielania i/lub przetwarzania heterologicznych białek kodowanych przez przyłączone do niej sekwencje obcego DNA. Wszystkie zmiany sekwencji nukleotydowej genu XPR2 i jej fragmentów dopuszczalne w zakresie kodu genetycznego są zatem również objęte zakresem wynalazku.

Jest również możliwe wykonanie delecji kodonów lub podstawienie jednego lub więcej kodonów przez kodony inne niż kodony zdegenerowane, co prowadzi do wytworzenia polipeptydu o zmodyfikowanej strukturze, ale takiego, który ma takie samo zastosowanie lub aktywność jak polipeptyd wytwarzany przez cząsteczkę niezmodyfikowanego DNA. Te dwa polipeptydy są funkcjonalnie równoważne, tak jak równoważne są te dwie cząsteczki DNA, które wywołują ich zwiększone wytwarzanie, nawet jeśli różnice między tymi cząsteczkami DNA nie są' związane z degeneracją kodu genetycznego. Najprostszym tego przykładem jest prorenina A i prorenina B,

155 850 5 dwie formy alleliczne proreniny, różniące się jedynie obecnością reszty kwasu asparginowego w pozycji 286 w proreninie A i obecnością reszty glicyny w tej samej pozycji w proreninieB.

Stosując tę metodologię, uzyskano ekspresję i wydzielanie heterologicznych białek ssaków -proreniny i ludzkiej anafilotoksyny C5a w Y. lipolytica, stosując sygnały ekspresji i wydzielania z genów Y. lipolytica XPR2 i/lub LEU2. Sekwencje DNA dla proreniny lub ludzkiej anafilotoksyny C5a łączy się poprzez syntetyczne oligonukleotydy z sekwencją genu XPR2 w miejscach, które przypuszczalnie zawierają kod dla peptydu sygnałowego alkalicznej proteazy albo w miejscach kierujących przetwarzaniem prekursora proteazy, oznaczonych jako pro 1 i pro 2 i stosuje się je do wytworzenia konstruktówgenu. Następnie, dokonuje się insercji tych konstruktów do Y. lipolytica poprzez transformację integracyjną. Hodowle rekombinantowe wytwarzają heterologiczne białka o ciężarze cząsteczkowym i reaktywności immunologicznej znamiennej dla proreniny i ludzkiej anafilotoksyny C5a i wydzielają te białka do środowiska wzrostu. Przypuszcza się, że tak wytworzona prorenina jest pofałdowana w konfiguracji natywnego białka, gdyż po usunięciu propeptydu wykazuje pełną aktywność enzymatyczną.

Termin materiał rekombinantowego DNA oznacza każdy materiał zawierający co najmniej jeden z następujących składników: gen XPR2 z Y. lipolytica; sekwencję sygnałową (lub presygnałową), pro-1 i pro 2 - (które łącznie stanowią proregion); sekwencję promotora lub terminatora tego genu; promotor LEU2, oraz funkcjonalne równoważniki powyższych sekwencji możliwe z racji degeneracji kodu genetycznego.

Takim reprezentatywnym materiałem rekombinantowego DNA są fragmenty DNA, plazmidy lub wektory albo transformanty, zawierające niektóre lub wszystkie z wyżej wymienionych sekwencji.

Materiały. Endonukleazy restrykcyjne i ligazę T4 otrzymano z New England Biolabs, bakteryjną fosfatazę alkaliczną otrzymano z Bethesda Research Laboratories, kinaza polinukleotydowa T4 pochodziła z PL-Biochemicals, a y-³⁴ P-ATP pochodził z firmy New England Nuclear. Wszystkie enzymy stosowano w warunkach zalecanych przez dostawcę.

Podłoża. Podłoże CGP (glicerol) pożywka: (proteaza-pepton) zawierało w litrze: 6,7 g glicerolu, 1,6 g proteaza-pepton „Difco“, 1,7 g wyciągu drożdżowego „Difco Yeast Nitrogen Base“ bez aminokwasów i siarczanu amonowego, 30 mg uracylu i 0,5 ml/litr glikolu polipropylenowego o ciężarze cząsteczkowym 2000 (Polysciences) w 40 mM buforze fosforanowym (pH 6,8), w hodowlach przeznaczonych do stosowania w próbach oznaczanych reniny glikol polipropylenowy nie występował). Pożywkę proteazowo-peptynową oddzielnie sterylizuje się w autoklawie w buforze fosforanowym.

Podłoże YEPD - (podłoże: wyciąg drożdżowy (peton/glikoza) zawiera w litrze: 5g wyciągu drożdżowego, 10 g peptonu i 20 g glikozy. Hodowlę E.coli prowadzono na podłożu LB w temperaturze 37°C. Podłoże LB zawierało w litrze: 10 g Bactotryptonu, 10 g wyciągu drożdżowego „Bacto“, 10 g chlorku sodowego; pH podłoża doprowadzono do wartości 7,5 wodorotlenkiem sodowym. Analiza sekwencji DNA. Odcinki DNA z różnych plazmidów izolowano w żelach poliakryloamidowych i oznaczano ich sekwencje metodą Maxam'a i wsp., Methods in Enzymology 65,499 (1980).

Metody ligacji. Odcinki DNA, w tym pocięte wektory plazmidowe poddaje się ligacji przez zmieszanie żądanych komponentów (odcinków DNA z końcami odpowiednio zmodyfikowanymi, aby zapewnić prawidłowe łączenie z ligazą DNA T4. Na mikrogramowe ilości fragmentów wektora i insertu stosowano około 10 jednostek ligazy. Produktami reakcji ligacji transformowano kompetentne komórki E.coli K12, szczep MM294 (ATCC 33625) lub HB101 (ATCC-33694).

Wytwarzanie syntetyzowanego chemicznie DNA. W celu skonstruowania genów hybrydowych kodujących ekspresję i sekrecję proreniny, syntetyzuje się 8 oligonukleotydów zmodyfikowaną metodą z zastosowaniem pochodnych amidofosfinowych (Sinha i wsp., Tetrahedron Letters 24, 5843 (1983) w automatycznym aparacie do syntezy DNA „Genetic Design 6500“ (Watertown, MA). Oligonukleotydy te oczyszcza się w 20% żelach poliakryloamidowych z dodatkiem 6M mocznika. Odpowiednie ilości komplementarnych oligonukleotydów miesza się i łączy ze sobą w odcinki dwuniciowe (przyżarza) w temperaturze 4°C przez dobę w buforze TE (10 mM tris-HCl); pH 8,0,1 mM NaEDTA). Odpowiednie ilości (około 2 jug) dwuniciowych oligonukleotydów fosforyluje się w 20μΐ mieszaniny reakcyjnej zawierającej 70 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCb, 5 mM ditiotreitolu, 5mM ATP, w temperaturze 37°C, stosując kinazę polinukleotydową T4.

155 850

Wytwarzanie plazmidowego DNA. Wytwarzanie plazmidowego DNA na dużą skalę prowadzi się metodą Holmes'a i wsp. Anal. Biochem. 114, 195-197 (1981) i następnie wiruje się przy gradiencie gęstości bromku etidium i CaCl. Minipreparatywne ilości plazmidowego DNA przygotowuje się stosując metodę alkalicznej ekstrakcji w połączeniu z elektroforezą żelową - wobec SDS, opisaną przez Birmboim'a i wsp., NAR 1, 1513 (1979).

Konstrukcja wektorów ekspresyjno-wydzielniczych dla proreniny. Dla otrzymania finalnych wektorów ekspresyjnych wykonuje się serię różnych konstrukcji. Wszystkie etapy są schematycznie przedstawione na załączonych figurach. Na ogół, odcinki DNA izoluje się w procesie elektroforezy żelowej i poddaje ligowaniu z innymi odcinkami albo z przeciętym plazmidowym DNA w 20/L/1 buforu 50 mM Tris HC1 (pH7,5), 10 mM MgCb, 20 mM ditiotreitolu, 1mM ATP, wobec 200 jednostek ligazy T4, w temperaturze 4°C. Tam, gdzie wymagane jest częściowe trawienie DNA endonukleazą restrykcyjną, optymalny czas reakcji rozszczepiania oznacza się eksperymentalnie.

Identyfikacja proreniny w płynie hodowli. Transformanty drożdży zawierające wektory ekspresyjne hoduje się przez dobę na podłożu GPP (patrz powyżej). Po odwirowaniu komórek drożdży do każdej próbki płynu hodowli w ilości 5 ml dodaje się 1 ml 50% TCA i utrzymuje się w temperaturze 4°C w czasie 60 minut. Osady otrzymane w wyniku wirowania przemywa się dwukrotnie ilością 2 ml zimnego acetonu. Wytrącone białko rozpuszcza się w 100 μΐ buforu próbki SDS i poddaje elektroforezie na 10% żelach poliakryloamidowych - wobec SDS (Laemmli U.K., Naturę 227,680 (1970). Białka rozdzielone na żelu przenosi się elektroforetycznie na nitrocelulozę (Schleicher i Schuell; 0,22/rm) i identyfikuje proreninę wykonując analizę immunologiczną typu „biot (bibułową) wycinków żelu (Hawkes E. i wsp., Anal. Biochem. 119,142 (1982). Na filtry nawarstwia się przeciwciała przeciw proreninie królika i inkubuje się ze skonjugowanymi peroksydazą kozimi przeciwciałami przeciw IgC królika (Cappel, Malvern, Pa). Związane przeciwciała wykrywa się przez barwienie 4-chloro-l-naftolem i nadtlenkiem wodoru.

Oznaczanie aktywności proreniny w płynie hodowli w próbie ścinania mleka. Płyny hodowli różnych transformantów Y. lipolytica oznacza się na aktywność ścinania mleka stosując modyfikację metody Ernstroma J. Dairy Sci. 41,1664(1958). Pokrótce, metoda polega na pomiarze czasu, w którym renina zawarta w aktywowanych supernantach hodowli ścina buforowane, oddzielone od śmietanki mleko i porównaniu tych wartości ze standardem oczyszczonej reniny. Hodowle drożdży (25 ml) poddaje się wzrostowi przez dobę w podłożu GPP. Po odwirowaniu komórek, próbki po 5 ml supernantów hodowli liofilizuje się. Każdą próbkę liofilizowanego supernantu zawiesza się ponownie w 300/1 wody destylowanej. Jako standardowe próbki kontrolne przygotowuje się seryjne rozcieńczenia oczyszczonej proreniny cielęcej. Proreninę zawartą w koncentratach podłoży i w próbkach kontrolnych aktywuje się przez dodanie około 5 do 10/1 stężonego HC1, do osiągnięcia pH około 2 i inkubację przez godzinę w temperaturze 22°C. Zbierane mleko przygotowuje się przez dodanie 60 g suchego sproszkowanego zbieranego mleka (Difco) do 500 ml roztworu zawierającego 41,5 mM octanu sodowego (pH 6,3) i 13,6 mM CaCb i mieszanie w czasie 20 minut w temperaturze 4°C. Mleko stosuje się do prób bezpośrednio po przygotowaniu. Do ilości 1 ml tego zbieranego mleka w temperaturze 37°C dodaje się po 60μΐ (ilość równoważna 1 ml supernantu hodowli) każdego preparatu enzymu i mierzy czas ścinania mleka.

Wytwarzanie syntetycznych oligonukleotydów dla genu anafilotoksyny C5a. Oligonukleotydy stosowane do syntezy genu strukturalnego dla anafilotoksyny C5a przygotowuje się na drodze chemicznej zmodyfikowaną metodą poprzez pochodne amidofosfinowe (Sinha i wsp. cyt. powyżej) w automatycznym aparacie do syntezy „Genetic Design 6500“ (Watertown, MA) z nośnikiem szklanym o kontrolowanej wielkości porów. Według przepisu, do odszczepiania grupy trójfenylometylowej stosuje się 3% (wag./obj.) kwas dwuchlorooctowy w dwuchlorometanie, liniowe aktywowanie pochodnej amidofosfinowej nasyconym roztworem tetrazolu w acetonitrylu, zablokowanie nieprzereagowanych grup OH nukleozydu związanego z nośnikiem za pomocą tetrazolidu dietoksyfosfiny i utlenianie mieszaniną: wodny roztwór jodu (THF/Matteucci i wsp. J.Amer. Chem. Soc.105, 3183). Całkowity czas jednego cyklu addycji wynosi 14 minut. Otrzymuje się dziesięć 47-merów (segmenty A-J na fig. 9), ze średnią wydajnością 98,8%/etap (oznaczoną metodą analizy grupy trójfenylometylowej). Segmenty te odblokowuje się metodą Matteucci i wsp. (cyt. powyżej), wytrąca etanolem z 0,3 M roztworu octanu sodowego i izoluje metodą preparatyw155 850 7 nej elektroforezy w 10% żelach denaturujących: poliakryloamid-mocznik, po czym prowadzi się reakcję tworzenia odcinków dwuniciowych (przyżarzanie).

Konstruowanie, klonowanie i analiza sekwencji genu ludzkiej anafilotoksyny C5a. Na fig. 9 przedstawiono sekwencję aminokwasową tego białka oraz rozmieszczenie syntetycznych oligonukleotydów wymagane dla powstania genu kodującego białko ludzkiej anafilotoksyny C5a. Wszystkie oligomery, za wyjątkiem A i F fosforyluje się na końcach 5', stosując kinazę polinukleotydową T4. Skonstruowanie tego genu wymaga przeprowadzenia dwóch pierwszorzędowych reakcji tworzenia odcinków dwuniciowych („przyżarzania) i ligacji oligomerów A, B, I i J oraz oligomerów C, D, E, F, G i H. Otrzymane odcinki dwuniciowego DNA o długości 94 pary zasad i 141 par zasad izoluje się po elektroforezie w 10%o żelu poliakryloamidowym, poddaje reakcji ligacji i otrzymany produkt o długości 235 par zasad izoluje się metodą elektroforezy żelowej. Ten odcinek DNA o długości 235 par zasad, zawierający gen strukturalny anafilotoksyny C5a włącza się przez insercję pomiędzy miejsca EcoRI i Hindlll w DNA wektora pBR322 i transformuje do kompetentnych komórek E.coli K12, szczep HB101. Analiza restrykcyjna plazmidowego DNA wyizolowanego z 6 transformantów wykazuje, że 5 spośród 6 klonów zawiera fragment EcoRI/Hind III o właściwej długości. Sekwencję nukleotydową regionu genu anafilotoksyny C5a każdego z tych plazmidów oznacza się metodą Maxam'a i wsp., Methods Enzymol. 65, 499 (1980).

Konstrukcja i charakteryzacja plazmidu zawierającego gen ekspresji anafilotoksyny C5a do transformowania E.coli. Postępowanie przy izolacji odcinka DNA i warunki reakcji ligacji są opisane przez Maniatisa i wsp. Molecular Cloning: A laboratory Manuał, Cold Spring Harbor (1982). Region promotor trp - operator z E. coli otrzymano po raz pierwszy z ptrpLl (Edman i wsp., Maturę, 291, 503 (1981). Odcinek EcoRI o długości 360 par zasad, zawierający sekwencję: promotor trp-operator stosowany w plazmidzie ekspresyjnym genu anafilotoksyny C5a (pC5a-48) izoluje się z plazmidu ekspresyjnego genu proreniny pPFZ-R2, opisanego w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0147178 z 3 lipca 1985 r. Identyfikacja anafilotoksyny C5a w płynie hodowli Y. lipolytica.

Stosuje się taką samą procedurę, jak opisano powyżej dla proreniny, z tym, że w teście immunologicznym stosuje się kozie przeciwciała przeciw anafilotoksynie C5a i królicze przeciwciała przeciw IgG kozy (Cappel). Kozie przeciwciała przeciw ludzkiej anafilotoksynie C5a otrzymuje się metodą Manderino i wsp. J. Ummunol. Methods 53, 41-50 (1982).

Wektory pLD40 - opisany w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0138508

Mikroorganizmy:	z 24 kwietnia 1985 r.
ATCC 20774	Yarrowia lipolytica PC 30869
ATCC 20781	Yarrowia lipolytica DLI 12 - PC-30869 transformowany genem XPR2,
ATCC 20776	Yarrowia lipolytica DL-148. Transformant Y. lipolytica ATCC 20688 zawierający plazmid pLS-3 trawiony Sna BI,
ATCC 20775	Yarrowia lipolytica DL-144, Transformant Y. lipolytica ATCC 20688 zawierający niecięty pLS-3,
ATCC 20777	Transformant Y. lipolytica PC-30869 zawierający plazmid pC5aX-3 trawiony SnaBI,
ATCC 20778	Transformant Y. lipolytica PC-30869, zawierający plazmid pXX-l 1 trawiony SnaBI,
ATCC 20779	Transformant Y. lipolytica PC-30869, zawierający plazmid ΡΧΧ-22 trawiony SnaBI,
ATCC 20780	Transformant Y. lipolytica PC-30869, zawierający plazmid pXX-33 trawiony SnaBI,
ATCC 20794	Transformant Y. lipolytica PC-30869, zawierający plazmid pLD56,
ATCC 20795	Transformant Y. lipolytica ATCC 20794, zawierający plazmid pLX-34 trawiony Nrul.

Na mocy Porozumienia Budapeszteńskiego mikroorganizmy te są zdeponowane w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland ogólnie znanym muzeum, zapewniającym niezmienność szczepów i powszechną dostępność, jeśli na to zgłoszenie zostanie udzielony patent. Zdeponowane szczepy są dostępne w czasie trwania tymczasowej ochrony zgłoszenia osobom określonym przez Komisarza Urządu Patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki jako do tego uprawnionych, zgodnie z 37 CFR 1.14 i 35 Kodeksu Stanów Zjednoczonych 122 oraz w krajach, w których dokonano zgłoszenia niniejszego wynalazku, zgodnie z prawem patentowym danego

155 850 kraju. Wszystkie ograniczenia dostępności zdeponowanych mikroorganizmów będą nieodwołalnie zniesione po udzieleniu patentu.

Badania toksonomiczne Y. lipolytica ATCC 20774 (w kolekcji firmy Pfizer Inc. oznaczone jako PC 30869) zostały przeprowadzone przez dr J.R. DeZeeuw, który sporządził poniższy opis. W badaniach tych zastosowano metody zalecane przez J.L. Lodder'a w „The Yeasts, II wydanie, N. Holland Publishing Co., Amsterdam, 1970.

Dla porównania prowadzono badania CBS 599, hodowli typowej dla gatunku Candida lipolytica („The Yeasts, II wydanie, N. Holland Publishing Co., Amsterdam 1970) i CBS 6124, hodowli typowej dla Saccharomycopsis lipolytica („The Yeasts, III wydanie). Wcześniej gatunek ten był oznaczony jako Endomycopsis lipolytica. Jego niedoskonałą formą jest Candida lipolytica. Pozycję taksonomiczną tego gatunku ustalił van der Walt i von Arx, Antonie van Leeuwenhoek, 46, 517-521 (1980). Obecnie zalecaną nazwą jest Yarrowia lipolytica.

Charakterystyka hodowlana, morfologiczna i fizjologiczna szczepu PC-30869 odpowiada standardowemu opisowi dla gatunku opisanego jako Saccharomycopsis lipolytica w „The Yeasts, III wydanie, pod redakcją Kryger-van Rij, str. 406-408, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam 1984. _{T b 1 1}

T a b e1a 1

Porównanie szczepów Yarrowia lipolytica

Oznaczenie firmy Pfizer	Źródło	Genotyp
PC-30265	NRRL YB-423 (również CBS 6124) typowa hodowla w „The Yeasts“, III wyd.	Diploid typu dzikiego
PC-30286	CBS 599, typowa hodowla „The Yeasts”, II wyd.	Haploid MATA typu dzikiego
PC-30869	patrz poniżej	MATB bio-6 leu2-40 xpr2-1002

PC-30869 otrzymuje się przez genetyczną rekombinację odpowiednich mutantów Y. lipolytica PC-22208, wyizolowanych w firmie Pfizer z gleby i Y. lipolytica PC-30026, podhodowli NRRL Y1094. Pod względem fenotypowym PC-30869 różni się od szczepów rodzicielskich dzikiego typu tym, że: (1) nie wytwarza aktywnej pozakomórkowej proteazy alkalicznej, (2) do wzrostu wymaga biotyny i (3) wymaga źródła L-leucyny.

Podczas fazy wzrostu logarytmicznego PC-30869 na podłożu: ekstrakt drożdżowy-peptonglikoza (YEPD) pączkujące komórki są owalne i mają średnie wymiary 2,6 X 5,5 mikronów. Na agarze YEPD wyróżniają się: pseudo-grzybnia i grzybnia właściwa. Obecne są blastospory występujące głównie pojedynczo w pozycjach pleuralnych. Nie stwierdza się barwników karotenoidowych. Hodowla zachowuje się jak haploid o typie kojarzenia „B“. W próbach krzyżowania z porównawczymi szczepami testowymi tego gatunku (tabela 5).

Na agarze V8 obserwuje się typową askosporulację. Dane dotyczące asymilacji węgla przedstawiono w tabeli 2. Fermentacja nie zachodzi. Jedynymi źródłami azotu przyswajanego są: jon amoniowy i mocznik ale nie azotany (tabela 3).

Szczep PC-30869 wymaga jako witamin tiaminy i D-biotyny (tabela 4). Hodowle rodzicielskie dzikiego typu wymagają tylko tiaminy. W temperaturze 37°C nie obserwuje się wzrostu.

Tabela 2 Asymilacja węgla ^a/

Hodowla

Źródło węgla
opisu w literaturze	30265	30286	30869
1	2	3	4	5
L.arabinoza	-	-	-	-
Celobioza	-	-	-	-
Erytryt/butanotetrazol/	+	+++	+++	+++
D-galaktoza	-	-	-	- '
D.glikoza	+	+++	+++	+++

155 850

1	2	3	4	5
Inozytol	-	-	-	-
Laktoza	-	-	-	-
Maltoza	-	-	-	-
D.Mannitol	+	+++	+++	+++
Rafinoza	-	-	-	-
Rybitol	-	-	-	-
D-ryboza	//+/	-	-	++
L.Ramnoza	-	-	-	-
Skrobia rozpuszczalna	-	-	-	-
Sacharoza	-	-	-	-
Trechaloza	-	-	-	-
D-Ksyloza	-	-	-	-
Kwas bursztynowy	+	+++	+++	+++
Kwas cytrynowy	-t-	+++	+++	+++

/a/jako podłoże podstawowe stosowano podłoże azotowe Bactoyeast z dodatkiem 1Opg/litr D-biotyny 149mg/litr chlorowodorku estru etylowego L-leucyny, co odpowiada lO) mgrfitr L-leucyny.

/b/ Kreger-van Rij (cytowany powyżej)

Tabela 3 Przyswajanie azotu^/a/

Źródło azotu	Odniesienie do . opisu w literaturze'!	Hodowla
30265	30286	30869
/NH4/2SO4	+	+++	+++	+++
kno3	-	-	-	-
Mocznik	+	+++	+++	+++

/a/ Jako podłoże podstawowe stosowano podłoże węglowe Bacto-yeast z dodatkiem 116mjg/litr soli sodowej kwasu ketoizokapronowego (co jest równoważne lOOmj/litr Lleucyny) i 10pg/litr D-biotyny.

/b/K.reger-van Rij (cytowany powyżej).

Tabela 4

Wymagania witaminowe ^M

Dodatek do podłoża podstawowego*'	Odniesienie do opisu w literaturze'6' .	Hodowla
30265	30286	30869
Bez dodatku	-	ślady	ślady	-
Tiamina· HC1	+	+++	+++	-
D-biotyna	-	ślady	ślady	ślady
Tiamina + biotyna	+	+++	+++	+++

/a/ Jako podłoże podstawowe stosowano podłoże drożdżowe Bacto bez witamin oraz 149mg/litr chlorowodorku estru etylowego L-leucyny (co odpowiada lOOmg/litr L-leucyny).

/b/ Kreger-van Rij (cytowany powyżej).

/c/ 200/jg/litr chlorowodorku tiaminy i/lub lOypg-Zlitr D-biotyny, według wskazania w tabeli.

Tabela 5 Askosporulacja

Szczep porównawczy .	Hodowla
30265	30286	30869
Brak (samokojarzenie)	++	-	-
30264 (typ kojarzenia A)	++	-	+++
30267 (typ kojarzenia B)	++	+++	-

/a/ Hodowle 30264 i 30267 są szczepami haploidalnymi o typie kojarzenia odwrotnego, udostępnionymi grzecznościowo przez dr L.J. Wickerham'a. Są one opisane w Science 167, 1141 (1970).

/b/ 3026-4 jest szczepem C.lipolytica YB-421 opisanym przez Wickerham'a.

/c/ 30267 jest szczepem C.lipolytica YB-423-12 opisanym prze? Wickerham'a.

155 850

Tabela 6

Inne cechy charakterystyczne

	Odniesienie do opisu w literaturze /a/	Hodowla
30265	30286	30869
Kształt komórek Średnie wymiary komórek	owalny	owalny	owalny	owalny
(w mikronach)	/2-4,5/X/4-22/	3,3 X 9,1	3,0 X 8,2	2,6 X 5,5
Rozmnażanie wegetatywne	pączkowanie	pączkowanie	pączkowanie	pączkowanie
Fermentacja	nie zachodzi	nie zachodzi	nie zachodzi	nie zachodzi
Wzrost w temperaturze 37°C	brak	brak	brak	brak
Wzrost kolonii	Te trzy kolonie rosną, podobnie zgodnie z opi-

sem literaturowym. Wyróżnia się grzybnia rzekoma i właściwa. Obecne są plastospory, głównie, pojedynczo w pozycjach pleuralnych. Nie stwierdza się barwników karotenoidowych /a/ Kreger-van Rij (cytowany powyżej).

Szczep PC-30869 różni się od innych szczepów Y. lipolytica opisanych w literaturze patentowej, czego dowodzi porównanie ich cech fenotypowych (tabele 7 i 8).

Szczep 20228 (Nubel i wsp., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr4 153811) cechuje odżywianie dzikiego typu. Zachowuje się on tak, jak szczepy typowe dla gatunku, CBS 599 i CBS 6124. Nie wymaga on do wzrostu uracylu, leucyny lub biotyny i rozpłynnia żelatynę.

Szczep ATCC 20628 (DeZeeuw. i wsp., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 407 953) odmiennie niż ATCC 20228 wymaga do wzrostu dodatku leucyny. Podobnie jak ATCC 20228 nie wymaga do wzrostu uracylu lub biotyny i również rozpłynnia żelatynę.

Szczep ATCC 20688 (opis zgłoszenia patentowego europejskiego nr 0138508) rośnie tylko wówczas, jeśli podłoże zawiera zarówno uracyl jak i leucynę. Te wymagania w stosunku do uracylu odróżniają szczep ATCC 20688 zarówno od ATCC 20228 jak i ATCC 20628. ATCC 20688 nie wymaga biotyny i rozpłynnia żelatynę.

Hodowla PC-30869 różni się od wszystkich powyższych. Wymaga ona do wzrostu biotyny i leucyny ale nie uracylu. Nie rozpłynnia żelatyny.

Tabela 7

Wymagania składników odżywczych

Hodowla	Składniki odżywcze pominięte w podłożu
Brak	Leucyna	Uracyl	Biotyna
CBS 599	+++	+++	+++	+++
CBS 6124	+++	+++	+++	+++
ATCC 20228	+++	+++	+++	+++
ATCC 20628	+++	-	+++	+++
ATCC 20668	+++	-	-	+++
PC-30869	+++	-	+++	-

Pełne podłoże zawiera 16,7 g/litr wyciągu drożdżowego Bacto bez witamin + 100 mg/litr uracylu, 100 mg/litr L-leucyny, 10//g/litr D-biotyny i 200/zg/litr chlorowodorku tiaminy.

Tabela 8 Rozpłynnianie żelatyny

Hodowla	Rozpłynnianie
CBS 599	+
CBS 6124	+
ATCC 20228	+
ATCC 20628	+
ATCC 20688	+
PC-30869	-

155 850

Podłoże zawiera 120 g/litr żelatyny i 16,7 g/litr wyciągu drożdżowego Bacto bez witamin oraz lOOmg/litr uracylu, lOOmg/litr L-leucyny, lOj/g/litr D-biotyny i 200 gg/litr chlorowodorku tiaminy.

Figura 1 przedstawia częściową liniową mapę restrykcyjną częściowo pokrywających się plazmidów pLD57, pLD58 i pLD62, wyizolowanych z Y. lipolytica, szczep DL 112; fig. 2 syntetyczne oligonukleotydowe sondy dla genu XPR2. W opublikowanej sekwencji dla większości z pierwszych 24. reszt aminokwasowych dojrzałej proteazy (Ogrydziak i wsp. cytowany powyżej) dwa regiony (oznaczone jako I i II) stwarzają możliwość zsyntetyzowania 14-merowych sond oligonukleotydowych z 32-krotna lub mniejszą degeneracją. Te dwa regiony zaczynają się odpowiednio od aminokwasów 7 i 18. Dla każdego regionu przygotowano cztery różne mieszane sondy o 8-krotnej degeneracji i oznaczono numerami od 170 do 186. W przewidywanych kwasach nukleinowych, sekwencje oznaczone znakiem X oznaczają wszystkie cztery zasady, sekwencje oznaczone jako U oznaczają obydwie zasady purynowe, a sekwencje oznaczone jako Y oznaczają obydwie zasady pirymidynowe; fig. 3 - sekwencję nukleotydową genu XPR2, w której uwidoczniony jest promotor, pre-sekwencja /-157 do -136/, pro 1/-135 do -98./, prg 2 /-97 do -1/, oraz sekwencje dla zewnątrzkomórkowej proteazy i sekwencje terminatora; fig. 4 - schemat konstruowania sekwencji dla wektora terminatora pterm 4; fig. 5 - schemat konstruowania sekwencji i mapę restrykcyjną plazmidu pIS-3; fig. 6 - schemat konstruowania sekwencji i mapę restrykcyjną plazmidu pXX-33; fig. 7 - schemat konstruowania sekwencji i mapę restrykcyjną plazmidu pXX-22; fig. 8 - schemat konstruowania sekwencji i mapę restrykcyjną plazmidu pXX-l 1; fig. 9 -sekwencję aminokwasową ludzkiej anafilotoksyny C5a; fig. 10 - mapę restrykcyjną plazmidu pC5a-48; fig. 11 - schemat konstruowania sekwencji i mapę restrykcyjną plazmidu pC5aX-4; fig. 12 - sekwencję nukleotydową genu LEU 2; fig. 13 - schemat konstruowania sekwencji i mapę restrykcyjną plazmidu pLX-34.

Analiza sekwencji genu XPR2. Analizę sekwencji DNA w sklonowanym genie XPR2 prowadzi się metodą degradacji chemicznej [Maxam i wsp., Methods Enzymol, 65,499 (1980)] pokrywających się częściowo odcinków restrykcyjnych otrzymanych z plazmidów pLD 57, pLD 58, pLD 62 (fig. 1) oraz pLD 84 i pLD 86 (patrz poniżej). Wyniki analizy wskazują, że sklonowane genomowe DNA drożdży rzeczywiście zawierają gen dla pozakomórkowej alkalicznej proteazy. Sekwencja nukleotydową genu XPR2 oraz wyprowadzona z sekwencji nukleotydowej sekwencja aminokwasowa prekursora alkalicznej proteazy łącznie z jego sekwencją sygnałową przedstawiona jest na fig. 3, Dotychczas duża część sekwencji aminokwasowej pozakomórkowej proteazy była nieoznaczoną (Ogrydziak i wsp., cytowany powyżej) i w niniejszym opisie jest przedstawiona po raz pierwszy. Ponadto, po raz pierwszy opisane są tu sekwencje wymagane dla ekspresji i wydzielania pozakomórkowej proteazy. Sekwencja DNA kodująca alkaliczną proteazę, jej prekursor i sekwencje sygnałowe składają się ze 1362 par zasad (fig. 3). Z sekwencji tej wyprowadzono strukturę pierwszorzędową łańcucha tego polipeptydu. Zawiera ona 454 reszt aminokwasowych. Alkaliczna proteaza jest syntetyzowana w komórce w formie prekursora, który jest proteolitycznie przetwarzany w formę dojrzałą, wydzielaną poza komórkę.

Analiza N-terminalnej sekwencji aminokwasowej wyprowadzonej z sekwencji nukleotydowej ujawniła w cząsteczce prekursora obecność dotychczas domniemanego peptydu sygnałowego. Ten peptyd sygnałowy zawiera 22 reszty aminokwasowe a jego cechy strukturalne są podobne do cech peptydów sygnałowych w wyższych organizmach prokariotycznych i eukariotycznych [Perlman i wsp., J. Mol. Biol., 167,391 (1983)]. Region w wyprowadzonej sekwencji aminokwasowej, zasadniczo zgodny ze znaną N-terminalną sekwencją 25 aminokwasów dojrzałej alkalicznej proteazy [Ogrydziak i wsp., J.Gen. Microbiol., 128, 1225 (1982)], jest poprzedzony 157-mioma resztami aminokwasowymi, zawierającymi peptyd sygnałowy i dwa miejsca podlegające trawieniu trypsyną (Lys-Arg). Te miejsca rozszczepienia stosuje się do podzielenia pro-regionu na pro 1(-135 do -98) oraz pro 2 (-97 do -1), (patrz fig. 3). Jak wynika z sekwencji nukleotydowej, dojrzała alkaliczna proteaza zawiera 297 aminokwasów. Sekwencje aminokwasowe różnych form proteazy, wyprowadzone z sekwencji nukleotydowej są w zgodzie z rozmiarami oczyszczonych form tego enzymu, Poza strukturalną sekwencją prekursora alkalicznej proteazy oznaczono sekwencję flankującą -5' o wielkości około 500 par zasad i sekwencję flankującą -3' o wielkości 600 par zasad. Analiza tych

155 850 regionów wykazała, że zawierają one sekwencje analogiczne do sekwencji innych promotorów i terminatorów eukariotycznych i również są niezbędne dla ekspresji alkalicznej proteazy.

Jak wspomniano powyżej, w opisie patentowym europejskim nrEPOl38508 podana jest metodologia transformowania Y. lipolytica i klonowania genów Y. lipolytica przez komplementację mutacji, łącznie z klonowaniem genu XPR2 zawierającego kod dla wydzielania alkalicznej proteazy na drodze komplementacji mutacji xpr2. Opisana tam metoda polega na transformowaniu szczepu gospodarza Y. lipolytica produktem częściowego trawienia banku genów Y. lipolytica w wektorze pLD 40 enzymem Bg III. Wektor ten charakteryzuje się tym, że zawiera mały segment zawierający region LEU 2 z Y. lipolytica oraz następujące miejsca dla endonukleaz restrykcyjnych: 3 miejsca dla Eco RI, 4 miejsca dla Eco RV, 6 miejsc dla Ava 11 miejsce dla Bg III, 1 miejsce dla Nco I, 1 miejsce dla Apa I, 2 miejsca dla Xho I i 1 miejsce dla Bst XI. Jeden z transformantów Y. lipolytica XPR2 użyto dla wyodrębnienia genu typu dzikiego (pLD 84 i pLD 86) pochodzącego z Y. lipolytica NRRL Y-1094 i użyto go do konstruowania wektora ekspresyjno-wydzielniczego, co jest opisane w przykładzie I.

Analiza sekwencji genu LEU 2. Analizę sekwencji DNA genu LEU 2 klonowanego w plazmidzie pLD 25 (opis patentowy europejski nr 0138508) wykonuje się metodą degradacji chemicznej [Maxam i wsp., Methods Enzymol. 65,499 (1980)] pokrywających się częściowo odcinków restrykcyjnych. Dla zlokalizowania regionu kodującego dehydrogenazę β-izopropylojabłczanu (IPM) i właściwej ramy odczytu wykorzystano sekwencję aminokwasową wyprowadzoną z oznaczonego wcześniej genu LEU 2 z S.cerevisiae [Andreatis i wsp., J. Biol. Chem. 259,8059 (1984)]. Zidentyfikowano region genomowej sekwencji Y. lipolytica, kodujący sekwencję aminokwasową homologiczny z regionem dla sekwencji białkowej w S. cerevisiae. Sekwencja nukleotydowa genu LEU 2 o wielkości 2,8 kilopar zasad oraz wyprowadzona z sekwencji nukleotydowej sekwencja aminokwasowa /J-dehydrogenazy -IPM jest przedstawiona na fig. 12. Ponadto w niniejszym opisie po raz pierwszy opisano sekwencje wymagane dla ekspresji /3-dehydrogenazy-IPM w Y. lipolytica. Sekwencja DNA zawierająca kod dla tego białka złożonego z 405 aminokwasów, składa się z 1215 par zasad (fig. 12).

Poza sekwencją kodującą y-dehydrogenazę-IPM, oznaczono sekwencję flankującą -5' o długości 798 par zasad oraz sekwencję flankującą -3' o długości 797 par zasad (w tym kodon zakańczania translacji TAA). Analiza tych regionów wykazała, że zawierają one sekwencje analogiczne do sekwencji innych promotorów i terminatorów eukariotycznych i że odgrywają one podstawową rolę w ekspresji.

W genie Y. lipolytica LEU 2, region znajdujący się „w górę od 5' zawiera sekwencję TATATATA zlokalizowaną w odległości 78 par zasad przed początkiem translacji i 30 par zasad przed przypuszczalnym miejscem startowym dla informacyjnego RNA. Następną sekwencją ważną dla inicjowania transkrypcji u eukariotów jest tzw. skrzynka CAAT, która w genie LEU 2 jest zlokalizowana w odległości 74 par zasad przed przypuszczalnym miejscem początku transkrypcji znajdującym się w odległości -48 par zasad od ATG (fig. 12).

Region „w dół“ od 3', za kodonem stopu TAA zawiera sekwencję od siedemdziesiątego drugiego do stu dwudziestego nukleotydu, homologiczną do proponowanej przez Zareta sekwencji 5' -TAG...TA /GT...TTT-3'[ Zaret i wsp., Celi., 28, 563 (1982)], odpowiedzialnej według tego autora za zakańczanie transkrypcji w S.chrhvisiah.

Przykład I. Jako szczep gospodarza stosuje się ATCC20774 (MATB leu2-40 bio-6 xpr21002). Transformant XPR2, Y. lipolytica ATCC 20781, wykrywa się jako kolonię tworzącą strefę na płytkach indykatorowych zbieranego mleka po posiewach na płytki-repliki z płytek z podłożem bez leucyny. Z tego transformantu wypreparowuje się chromosomalny DNA stosując metodę podaną w opisie patentowym europejskim nr 0138605. DNA ten stosuje się do wyizolowania genu dla wydzielanej proteazy. Ten chromosomalny DNA trawi się częściowo enzymem Bg III, poddaje ligacji z odcinkiem wektora zawierającym zarówno replikon E.coli jak i gen oporności na ampicylinę, z utworzeniem cząsteczki kolistej i stosuje się do transformowania E.coli. Chromosomalny DNA trawi się również enzymem Sa II i stosuje w próbie Southern'a, która wykazuje, że normalny region LEU 2 w transformancie nie jest uszkodzony (jako sondę stosuje się odcinek Sal I-Eco RI o długości 520 par zasad z regionu LEU 2, znajdujący się w kierunku 5' od odcinka LEU 2 zawartego

155 850 13 w plazmidzie pLD 40). Ponieważ do integracji plazmidu pochodzącego z banku w Y. lipolytica wymagana jest homologia, to miejscem integracji musi być region XPR2.

Z Y. lipolytica ATCC 20781 wyodrębnia się początkowo 3 częściowo pokrywające się lecz różne plazmidy: pLD 57, pLD 58 i pLD 62. Są one przedstawione na fig. 1. Próby hybrydyzacji z sondami syntetycznych oligonukleotydów dla genu XPR2, zsyntetyzowanych w oparciu o znaną sekwencję pierwszych 25 reszt aminokwasowych dojrzałego wydzielanego białka proteazy (fig. 2 i 3) wykazują, że gen dla wydzielanej proteazy został sklonowany. Dla określenia, czy wyodrębniony gen jest kopią typu dzikiego czy kopią zmutowaną, przyjmujący ten gen szczep Y. lipolytica transformuje się plazmidem pLD 58. Ponieważ nie otrzymano proteazo-dodatnich transformantów z żadnego z transformantów niezależnych od leucyny, wyciągnięto wniosek, że pLD 58 zawiera zmutowaną allelę tego genu.

Formę genu XPR2 obecną w szczepie dzikiego typu - NRRL Y-LO94 otrzymuje się w próbach hybrydyzacji kolonii E.coli. Jako sondę stosuje się odcinek PYul do EcoRI o długości 2 kilopary zasad, który, jak wynika z danych dotyczących sekwencji, powinien zawierać cały gen strukturalny. Z oryginalnego banku odcinków DNA pochodzących z częściowego trawienia enzymem Sau 3A DNA NRRL Y-1094 w plazmidzie pLD40, opisanego w opisie patentowym europejskim nr 0138508 otrzymuje się szereg kolonii, które hybrydyzują z tą sondą. Dwie z tych kolonii zawierają bardzo podobne plazmidy oznaczone symbolami pLD 84 i pLD 86. Plazmidy te stosuje się do przygotowania wektorów ekspresyjnych. Obydwa te plazmidy zawierają ten sam koniec 5': region XPR2 - miejsce dla Sau 3A (które przyłącza się i regeneruje miejsce dla BamHI w wektorze) od którego zaczyna się sekwencja przedstawiona na fig. 3. Każdy z tych plazmidów zawiera cały gen strukturalny dla proteazy, przypuszczalny terminator transkrypcji oraz cały insert z regionu XPR2 szczepu NRRL Y-1094 o wielkości 4 do 5 kilopar zasad. Insert w plazmidzie pLD 86 zawiera przy końcu 3' kilkaset dodatkowych par zasad. Ponieważ do konstruowania wektora ekspresyjnego użyliśmy przedłużenia 3 jako miejsca dla Bg III (para zasad 2655) plazmidy te zawierają DNA, który jest funkcjonalnie identyczny co do sekwencji z DNA przedstawionym na fig. 3.

Konstruowanie wektorów ekspresyjno-wydzielniczych. Dla uzyskania ekspresji i wydzielania proreniny w Y. lipolytica opracowano plan skonstruowania różnych genów hybrydowych w integrującym wektorze przeznaczonym do klonowania. W takim podejściu, konstruuje się szereg różnych plazmidów posiadających długie regiony zwykłych sekwencji DNA. W rzeczywistości, zastosowano modułowy schemat konstrukcji wektorów z insercją genu dla proreniny w kierunku 3' do przypuszczalnego miejsca przetwarzania peptydu sygnałowego XPR2, przypuszczalnego miejsca przetwarzania pro 1- oraz miejsca rozszczepiania, o którym wiadomo, że generuje dojrzałą alkaliczną proteazę. W zasadzie, dla uzyskania ekspresji jest pożądane, aby dokonywać insercji genu heterologicznego pomiędzy sekwencjami promotora i terminatora drożdżowego. Zakłada się, że część N-terminalna sekwencji genu hybrydowego będzie się różnić w różnych konstrukcjach plazmidowych, lecz w każdej konstrukcji plazmidu ekspresyjnego powinna być · zawarta taka sama sekwencja genu strukturalnego proreniny, sekwencja terminatora XPR2 oraz DNA wahadłowego wektora drożdżowo-bakteryjnego (shuttle vector).

W założeniach planu przyjęto, że w każdej konstrukcji plazmidu ekspresyjnego powinien być użyty ten sam odcinek genu strukturalnego dla proreniny i terminator/wektor, co jest opisane poniżej. Różne konstrukcje plazmidowe dla ekspresji i wydzielania proreniny różnią się w regionie bezpośrednio za sekwencją promotora genu XPR2 pod względem długości N-terminalnej sekwencji dla prekursora alkalicznej proteazy, która poprzedza sekwencję genu dla proreniny. Tak więc, komponentę odcinka promotora w każdym plazmidzie ekspresyjnym zaprojektowano jako sekwencję zmienną w regionie połączenia: XPR2 - prorenina. Wszystkie wektory ekspresyjnowydzielnicze skonstruowano w podobnych reakcjach ligacji z użyciem trzech odcinków składowych.

Etapy doświadczalne zastosowane podczas konstruowania wektora terminatora pterm4 przedstawione są na fig. 4. Syntetyczny linker poddaje się ligacji z odcinkiem zawierającym koniec 3' genu XPR2 łącznie z sygnałami zakończenia transkrypcji i poliadenylacji. Pokrótce, plazmid pLD84 trawi się endonukleazą KpnI i poddaje ligacji z syntetycznym, dwuniciowym linkerem DNA przedstawionym na fig. 4. Produkt ligacji rozszczepia się endonukleazami Hind III i Bg III i wyizolowany odcinek o długości 760 par zasad włącza się prze'z insercję do plazmidu pLD41

155 850 doprowadzonego uprzednio do postaci liniowej tymi samymi dwiema endonukleazami. Otrzymuje się plazmid pterm4. Plazmid ten jest scharakteryzowany mapą restrykcyjną. Zanalizowano odcinki powstałe w wyniku seryjnego trawienia endonukleazami restrykcyjnymi: EcoRV, EcoRI, KpnI, Bg 1II-Hind III i Bg III-Bc II. W wyniku tego trawienia otrzymuje się odpowiednie odcinki potwierdzające obecność syntetycznego linkera i „całkowitego końca 3' genu XPR2 w wahadłowym (shuttle) plazmidzie pLD41 opisanym w publikacji zgłoszenia europejskiego nr 0138508. Częściowa mapa restrykcyjna tego wektora terminatora o długości 7,3 kilopar zasad jest przedstawiona na fig. 4.

Konstruowanie plazmidu ekspresyjno-wydzielniczego pLS-3. Na figurze 5 przedstawiona jest konstrukcja pierwszego plazmidu użytego do wywołania sekrecji proreniny w Y. lipolytica. Na tej figurze jest przedstawiona mapa restrykcyjna tego plazmidu. Konstrukcję plazmidu zawierającego kod dla wydzielania proreniny rozpoczyna się od przygotowania odcinka zawierającego główną część sekwencji genu strukturalnego dla proreniny. Z plazmidu pPFZ-84A E.coli zawierającego kod ekspresji proreniny izoluje się po częściowym trawieniu enzymami BClI-BamHI, fragment DNA o długości 1080 par zasad, zawierający sekwencje kodujące reszty aminokwasowe proreniny od 6 do 365. (Plazmid pPFZ-84A jest pochodną plazmidu ekspresyjnego dla proreniny pPFZ-R2, którego konstruowanie jest opisane w opisie patentowym europejskim nr0147178. Plazmid ten otrzymano na drodze mutagenezy kierowanej syntetycznym oligonukleotydem, z zastosowaniem wymiany odcinka restrykcyjnego. Plazmid pPFZ-84A różni się od plazmidu pPFZ-R2 tylko dwiema parami zasad kodującymi reszty aminokwasowe proreniny 214 (Asn — Asp) i 286 (Asp — Gly), to znaczy, zawiera on kod tak zwanej alleli proreniny A. Obydwa plazmidy zawierają jednakże potrzebną sekwencję dla proreniny i w tym przykładzie są równoważne).

Komponentę odcinka promotora, zawierającą sekwencje kodujące prekursor alkalicznej proteazy, aminokwasy 1do 157 i proreninę, aminokwasy 1 do 5, przygotowuje się w sposób następujący: z pod-klonowanego genem XPR plazmidu pLD 90 izoluje się odcinek DNA Hind III-AvaI o długości 870 par zasad, zawierający region promotora i koniec 5' genu alkalicznej proteazy. Odcinek ten poddaje się ligacji z syntetycznym fragmentem o strukturze:

⁵' CCGAGATTCCGCTTCTTCTAATGCCAACCGAGCTGAGATCACTAG 3'

CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTGGACTCTATCCATCCTAG ⁵' kierunek odczytu Powstała sekwencja zawiera lepki koniec Aval, po którym następują sekwencje ostatnich 9 kodonów dla propeptydu alkalicznej proteazy, a za nimi, sekwencje kodujące cztery pierwsze aminokwasy proreniny i kończy się miejscem dla BamHI.

Komponentę odcinka promotora przygotowuje się w standartowej reakcji ligacji fragmentu syntetycznego z odcinkiem HindIII-AvaI o długości 870 par zasad, wobec ligazy T4 i przez następne trawienie enzymami Hind III i BamHI. Powstałe zligowane sekwencje oczyszcza się metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym, oddzielając odcinek DNA Hind III-Bam HI o długości 916 par zasad. Koniec 3' genu hybrydowego otrzymuje się z plazmidu: terminator/wektor, ptcrm4, opisanego powyżej. Plazmid pterm4 trawi się enzymami Hind III i Bc II, po czym z żelu agarozowego izoluje się fragment terminator/wektor Hind III-Bc II o długości 7,3 kilopar zasad, zawierający terminator XPR2, marker selekcyjny LEU 2 i pBR322.

Plazmid pLS-3, zawierający kod ekspresji i wydzielania proreniny otrzymuje się przez inkubację trzech opisanych powyżej składowych odcinków DNA (trawiony Hind III-Bc II plazmid pterm4, promotor Hind III-Bam HI o długości 916 par zasad oraz odcinek BamHI-BclI o długości 1080 par zasad, zawierający gen proreniny) w obecności ligazy T4 (patrz fig. 5).

Mieszaninę reakcji ligacji stosuje się do transformowania E.coli K12, szczep MM 294 metodą Dagerta i wsp. z użyciem CaCb [cene, 6,23-28 (1979)]. Z transformantów wyselekcjonowanych w oparciu o cechę oporności na ampicylinę izoluje się plazmidy i plazmid pLS-3 identyfikuje się jego mapę restrykcyjną (fig. 6A). Dla potwierdzenia prawidłowej sekwencji syntetycznego DNA i właściwego połączenia żądanych odcinków prowadzi się analizę sekwencji regionu XPR2 - prorenina w tym plazmidzie.

155 850 15

Przygotowanie plazmidu pLD 90. Plazmid ten zawiera podklon z plazmidu pLD 84. Region DNA rozciągający się od miejsca dla Pvul w regionie promotora XPR2 do miejsca dla EcoRI w regionie terminatora podklonowuje się do miejsca dla Hind III w plazmidzie pBR322 w sposób następujący. Kilka (kilkanaście) mikrogramów pLD84 trawi się wyżej wymienionymi enzymami restrykcyjnymi. Następnie, na lepkie końce trawionych cząsteczek DNA działa się fragmentem Klenowa polimerazy DNA I.Następnie, końce te łączy się z poddanymi uprzednio działaniu kinazy linkerami Hind III (CAAGCTTG, z firmy New England Biolabs) za pomocą ligazy DNA T4. Nadmiar linkerów usuwa się. i generuje się lepkie końce Hind III przez następne trawienie tym enzymem. Mieszaninę cząsteczek DNA rozdziela się w preparatywnym żelu agarozowym i wycina się żądane pasmo o długości 2 kilopar zasad. Po oczyszczeniu stosuje się go do reakcji ligacji z traktowanym bakteryjną fosfatazą alkaliczną wektorem pBR322 po jego uprzednim trawieniu enzymem Hind III. Mieszaninę po ligacji stosuje się do transformowania kompetentnych komórek E.coli. Plazmid o orientacji takiej, że miejsce dla Eco RI terminatora XPR2 jest bliżej miejsca dla Eco RI w plazmidzie pBR322 nazwano pLD 90, a plazmid o orientacji odwrotnej nazwano pLD 91.

Kraniec 5' regionu promotora XPR2 włączony do pLS-3 jest miejscem dla Pvu I o długości około 280 par zasad, licząc od początku obszaru podanego na fig. 3. Okazało się, że plazmidy zawierające gen proteazy dzikiego typu pod kontrolą jedynie tej części promotora, jeśli zostaną zintegrowane z genomem w miejscu z dala od znajdującego się w nim locus xpr2, nie nadają transformantowi zdolności wytwarzania dużych ilości proteazy (co określono wielkością strefy klarowania na płytkach ze zbieranym mlekiem).

Zauważyliśmy, że jeśli pLS-3 zawiera skrócony, a zatem jakby niekompletny promotor, to wówczas zintegrowana cząstka, powstała w wyniku rekombinacji między plazmidem a obecnym tam genem XPR2 dzikiego typu mogłaby dawać kompletny promotor kierujący ekspresją produktu fuzyjnego prochymozyny ale niekompletny promotor kierujący ekspresją proteazy. Analogiczny typ doświadczenia przerywania genu przeprowadził z genem aktyny S.cerevisiac Shortle i wsp. [Science 217 , 371-373 (1982)]. Zgodnie z naszymi oczekiwaniami, niektóre leucynoniezależne transformanty transformowane pLS-3 były istotnie ubogie w proteazę. Być może transformanty ubogie w proteazę są bardziej pożądanymi produktami integracji w locus XPR2 niż niepożądane produkty uboczne, takie jak konwertanty genowe w locus leu 2. Okazało się, że w przyjmującym szczepie ATCC 20688, niecięty pLS-3 generował 6,5% transformantów ubogich w proteazę, podczas gdy plazmid cięty enzymem SnaBI dawał około 70% transformantów ubogich w proteazę. Aspekt rozerwania genu w tej transformacji został zastosowany dla ominięcia potrzeby wykonania wielkiej ilości prób Southerna dla znalezienia właściwie zintegrowanej cząstki spośród wszystkich transformantów.

Plazmidy zawierające gen strukturalny proteazy dzikiego typu pod kontrolą promotora XPR2 (zaczynający się sekwencjami przedstawionymi na fig. 3), jeśli zostaną włączone do komórek Y. lipolytica i zintegrowane w miejscu innym niż locus xpr2, wywołują ekspresję znacznych ilości proteazy. Jednak wydajna ekspresja genów heterologicznych z tego rodzaju integrantów może wymagać dalszej modyfikacji tego kontrolnego regionu DNA.

Wydzielanie proreniny. Y. lipolytica, szczep ATCC 20688 transformuje się DNA nieciętego plazmidu pLS-3 i DNA plazmidu pLS-3 trawionego przez SnaBI, otrzymując odpowiednio transformanty xpr leu+ AtCc 20775 (dl 144) i ATCC 20776 (DL 148). Te szczepy transformantów posiewa się do probówek testowych na podłoże YEPD i poddaje wzrostowi przez dobę w temperaturze 28°C. Ilość 250μ1 tych hodowli rozcieńcza się ilością 25 ml podłoża GPP (rozcieńczanie 1: 100) i prowadzi hodowlę w kolbach w trzęsawce w temperaturze 28°C przez 16-18 godzin, do czasu uzyskania absorbancji przy 600 nM = 5,0-7,0. Komórki zbiera się przez wirowanie. Otrzymany płyn hodowli lub supernatant analizuje się na obecność proreniny przez zatężenie supernatantu i poddanie analizie elektroforetycznej w żelu poliakryloamidowym wobec SDS. Wycinek żelu przenosi się elektroforetycznie na bibułę nitrocelulozową w roztworze zawierającym 20 mM zasady Tris, 150 mM glicyny, 20% metanolu i 500 jednostek ampicyliny przez 2 godziny, w temperaturze 4°C. Usunięcie białka z wycinka żelu sprawdza się przez barwienie błękitem Coomassie.

Bibułę nitrocelulozową suszy się w temperaturze 37°C i ogrzewa w temperaturze 65°C przez godzinę, po czym przemywa w roztworze TBS (200 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5). Bibułę tę inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 30 minut w roztworze TBS zawierającym 10%

155 850 surowicy końskiej (Gibso, Chagrin Falls, Ohio) i następnie inkubuje w roztworze TBS zawierającym 10% surowicy końskiej i odpowiednie rozcieńczenie przeciwciała przeciw proreninie przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Bibułę przemywa się trzykrotnie przez 10 minut w roztworze TBS, następnie inkubuje w roztworze TBS zawierającym 10% surowicy końskiej, a po tym inkubuje przez 2 godziny w roztworze TBS zawierającym 10% surowicy końskiej i odpowiednie rozcieńczenie koziego przeciwciała przeciw IgG królika skoniugowanego z peroksydazą chrzanu.

Bibułę przemywa się trzykrotnie przez 10 minut w roztworze TBS i wywołuje w roztworze TBS z dodatkiem 0,01% nadtlenku wodoru, w obecności 4-chloro-l-naftolu (3ng/ml, w metanolu), dodanego w takiej ilości, aby uzyskać stężenie 0,5 mg/ml.

W obydwu supernatantach stwierdza się obecność proreniny o ciężarze cząsteczkowym 40000,

W próbkach przygotowanych z hodowli transformantów ATCC 20775 i 20776, zawierających pLS-3 występuje znaczna aktywność ścinania mleka po aktywacji kwasem zatężonym supernatantów hodowli (patrz powyżej). Jak oczekiwano, w supernatancie kontrolnej hodowli szczepu wyjściowego Y. lipolytica ATCC 20688 nie stwierdza się aktywności ścinania mleka.

Konstruowanie ekspresyjno-wydzielniczego plazmidu pXX-33. Na figurze 6 przedstawiona jest modyfikacja polegająca na przeprowadzeniu plazmidu pLS-3 w ulepszony plazmid ekspresyjny pXX-33. W modyfikacji tej, powiększa się region promotora XPR2 o 280 par zasad. Tak jak w przypadku plazmidu pLS-3, ekspresyjny plazmid pXX-3 zawierą gen hybrydowy kodujący cały pre-propeptyd (157 reszt aminokwasowych) alkalicznej proteazy, który to gen jest przyłączony do sekwencji kompletnego genu strukturalnego kodującego proreninę.

Przed konstruowaniem plazmidów ekspresyjno-wydzielniczych dla proreniny zawierających sekwencję promotora XPR2 powiększoną o 280 par zasad w stosunku do pLS-3, niezbędne jest podklonowanie odcinka restrykcyjnego zawierającego kompletny gen alkalicznej proteazy do miejsca Hind III. Taki podklon preparuje się przez podłączenie syntetycznych linkerów do odcinka restrykcyjnego wyizolowanego z banku klonów genomowego XPR2 w pLD 86. Konstruowanie podklonu XPR2 z „górnym“ miejscem dla Hind III rozpoczyna się od przygotowania odcinka DNA zawierającego cały gen alkalicznej proteazy. Fragment otrzymany w wyniku częściowego trawienia enzymami EcoRI-BamHI o długości 2,5 kilopar zasad genomowego regionu klonu XPR2 w pLD-86 oczyszcza się przez elektroforezę w żelu agarozowym i poddaje ligacji z syntetycznym fragmentem o sekwencji: 5' CATCGAAGCTTG 3'

3' ITCGAACTTAA 5'

Ta sekwencja linkera zawiera lepki koniec BamHI (lecz nie regeneruje miejsca BamHI), po którym następuje miejsce dla Hind III, a następnie lepki koniec EcoRI. Produkt ligacji trawi się za pomocą Hind III i dokonuje insercji w miejscu dla Hind III w plazmidzie pBR322. Plazmid pXHP-24 identyfikuje się przez mapowanie restrykcyjne. Stanowi on źródło odcinków promotora XPR2 dla następnych konstrukcji plazmidowych.

Gen XPR2 podklonowany w plazmidzie pXHP-24 zawiera w swej sekwencji 5' promotora XPR2 o około 280 par zasad więcej niż sekwencja promotora XPR2 w plazmidzie pLS-3. Komponentę odcinka promotora wytwarza się w standartowej reakcji ligacji odcinka syntetycznego DNA (opisanego powyżej dla pLS-3) z odcinkiem HindIII-Aval o długości 1150 par zasad, pochodzącym z ΧΗΡ-24, za pomocą ligazy T4 i przez następne trawienie enzymami Hind III i BamHI. Otrzymane połączone sekwencje oczyszcza się metodą elektroforezy żelowej, oddzielając fragment Hind III - BamHI o długości około 1196 par zasad. Drugi odcinek zawierający sekwencje kodujące reszty aminokwasowe proreniny od 6 do 151 preparuje się z plazmidu pLS-3 przez trawienie enzymami BamHI i Xmal i następne oczyszczanie na drodze elektroforezy żelowej otrzymanego odcinka BamHI - Xmal o długości 440 par zasad.

Trzeci odcinek zawierający resztę genu proreniny, terminator XPR2 i sekwencje wektora, wytwarza się z pLS-3 przez trawienie za pomocą Hind III i Xmal i następne oczyszczanie na drodze elektroforezy żelowej fragmentu wektora Hind III - Xmal o długości 8,0 kilopar zasad. Te trzy odcinki poddaje się ligacji metodą standartową opisaną powyżej. Mieszaninę reakcji ligacji stosuje się do transformowania E.coliK12, szczep MM 294. Z transformantów wyselekcjonowanych w oparciu o cechę oporności na ampicylinę izoluje się plazmidy i plazmid pXX-33 identyfikuje się przez mapowanie restrykcyjne (fig. 6). Dla potwierdzenia właściwego żądanych odcinków wykonuje się analizę sekwencji regionu proteaza-prorenina w tym plazmidzie.

155 850

Plazmidem pXX-30, po jego uprzednim trawieniu enzymem SnaBI transformuje się Y. lipolytica ATCC 20774, otrzymując Y. lipolytica ATCC 20780. Proreninę wydzielaną do podłoża przez transformowane hodowle oznacza się w sposób opisany powyżej dla pLS-3. Stwierdza się obecność proreniny w supernancie hodowli. Po aktywacji kwasem zatężonych supernantów hodowli obserwuje się znaczną aktywność ścinania mleka w próbkach przygotowanych z transformantowej hodowli Y. lipolytica ATCC 20780.

Konstruowanie ekspresyjno-wydzielniczego plazmidu pXX-22. Etapy konstruowania ekspresyjno-wydzielniczego plazmidu pXX-22 przedstawione są na fig. 7. Między tym wektorem ekspresyjnym a pLS-3 występują dwie różnice. Podobnie jak pXX-33, zawiera on dodatkowy segment o długości 280 par zasad w sekwencji promotora XPR2. Po drugie, zawiera on sekwencję kodującą peptyd sygnałowy alkalicznej proteazy i tylko 38 reszt aminokwasowych pro-peptydu (pro 1).

Schemat konstruowania pXX-22 jest analogiczny do schematu dla pXX-33. Na początku przygotowuje się komponentę odcinka promotora w standartowej reakcji ligacji odcinka Hind III -Bgl II o długości 890 par zasad, pochodzącego z pCHP-24 z syntetycznym odcinkiem o sekwencji:

5' GATCTTGCTGACATCACTAG 3'

3' AACGACTCTAGTCATCCTAG 5' wobec ligazy T4 i przez następne trawienie enzymami Hind III i BamHI. Otrzymane połączone sekwencje oczyszcza się na drodze elektroforezy w żelu, izolując odcinek DNA Hind III - BamHI o długości 920 par zasad.

Drugi odcinek, kodujący reszty aminokwasowe proreniny od 6 do 151 izoluje się , w pLS-3 przez trawienie Barn HI i Xmal i następnie oczyszczanie w żelu otrzymanego odcinka BamHI -Xmal o długości 440 par zasad. Trzeci odcinek, zawierający resztę genu proreniny, terminator XPR2 i sekwencje wektora preparuje się przez trawienie pLS-3 enzymami Hind III i Xmal i oczyszczanie na drodze elektroforezy żelowej fragmentu wektora o długości około 8,0 kilopar zasad. Następnie dokonuje się ligacji tych trzech odcinków DNA, stosując standartową, opisaną powyżej procedurę. Mieszaninę reakcji ligacji stosuje się do transformowania E.coli K12, szczep MM294. Z wyselekcjonowanych transformantów izoluje się plazmidy i plazmid pXX-22 identyfikuje się przez mapę restrykcyjną (fig. 7).

Plazmidem pXX-22 uprzednio trawionym enzymem SnaBI transformuje się Y. lipolytica ATCC 20774 otrzymując Y. lipolytica ATCC 20779. Proreninę wydzielaną przez transformowane hodowle do podłoża hodowli oznacza się w sposób opisany dla pLS-3. Obecność proreniny w supernancie hodowli stwierdza się wyżej opisaną metodą. Po aktywacji kwasem zatężonych supernantów hodowli (patrz powyżej) obserwuje się znaczną aktywność ścinania mleka w próbkach transformowanych hodowli Y. lipolytica ATCC 20779.

Konstruowanie ekspresyjno-wydzielniczego plazmidu pXX-l 1. Etapy eksperymentalne zastosowane do konstruowania plazmidu ekspresyjno-wydzielniczego proreniny pXX-ll przedstawiono na fig. 8. Ten plazmid zawiera sekwencję promotora XPR2 i sekwencję dla 22 reszt aminokwasowych peptydu sygnałowego, przyłączone do sekwencji kodującej proreninę. Schemat konstruowania plazmidu pXX-l 1 jest podobny do schematu zastosowanego dla pXX-22 i ΡΧΧ-33. Pokrótce, komponentę odcinka promotora przygotowuje się w standartowej reakcji ligacji fragmentu Hind III-Bg 1II o długości 750 par zasad pochodzącego z pXHP-24 z syntetycznym odcinkiem o sekwencji:

5' TGGCGGCTCCCCTGCCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG 3'

3' AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGCGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG 5' wobec ligazy T4 i przez następne trawienie enzymami Hind III i Barn HI. Połączone sekwencje oczyszcza się metodą elektroforezy żelowej izolując odcinek DNA Hind III-Bam HI o długości 790 par zasad. Drugi odcinek, kodujący reszty aminokwasowe proreniny od 6 do 151 izoluje się z pLS-3 przez cięcie enzymami BamHI i Xma[ i oczyszcza się na drodze elektroforezy żelowej, izolując odcinek DNA BamHI-XmaI o długości 440 par zasad. Trzeci odcinek zawierający pozostałą część genu strukturalnego proreniny, terminator XPR2 i sekwencje wektora wahadłowego (shuttle vector) preparuje się przez trawienie plazmidu pLS — 3 enzymami Hind III i Xmal, i oczyszcza na drodze elektroforezy żelowej. Izoluje się odcinek wektora o długości około 8,0 kilopar zasad.

155 850

Następnie, te trzy odcinki DNA poddaje się ligacji stosując opisaną powyżej metodę standartową. Mieszaninę reakcji ligacji stosuje się do transformowania E.coliK12, szczep MM294. Z wyselekcjonowanych transformantów izoluje się plazmidy i plazmid pXX-ll identyfikuje się przez mapowanie restrykcyjne (fig. 8). Dla potwierdzenia właściwej sekwencji tego syntetycznego DNA i prawidłowego połączenia żądanych odcinków, prowadzi się analizę sekwencji części XPR2 prorenina w tym plazmidzie.

Plazmidem pXX-ll, uprzednio trawionym enzymem SnaBI, transformuje się Y. lipolytica ATCC 20774 otrzymując Y. lipolytica 20778. Proreninę wydzielaną do podłoża hodowli przez transformowanie komórki oznacza się w sposób opisany dla pLS-3. Obecność proreniny w supernancie hodowli stwierdza się wyżej opisaną metodą. Próba na ścinanie mleka (patrz powyżej) wykazuje znaczną aktywność ścinania mleka w supernancie hodowli transformantów ATCC 20778 zawierających plazmid pXX-ll.

Przykład II. Konstruowanie tzw. platformy dokowania. Gen BIO dzikiego typu, odpowiadający alleli bio-6 w szczepie ATCC 20774 klonuje się przez komplementację w sposób następujący. Konstruuje się bank genów trawionego częściowo enzymem Sau 3A chromosomalnego DNA Y. lipolytica, włączonych w miejscu dla Barn HI w plazmidzie pLD40 (pLD40 jest plazmidem pBR322 + LEU2 w miejscu dla EcoRI) i przygotowuje się dużą ilość DNA tego banku w postaci mieszaniny z preparatem plazmidowym z hodowli E.coli (jest to ten sam bank, który stosuje się do klonowania genu XPR2). Kilka (kilkanaście) mikrogramów DNA z tego banku trawi się enzymem Apal (który daje jedno cięcie w regionie LEU-2). Następnie, ten DNA stosuje się do transformowania ATCC 20774 (leu 2 xpr2 bio), posiewając mieszaninę transformacyjną na płytki z syntetycznym podłożem nie zawierającym leucyny. Otrzymuje się dziesiątki tysięcy transformantów leucynoniezależnych. Dla wykrycia kolonii, które zawierają plazmidy banku z genem BIO, transformanty leucyno-niezależne posiewa się techniką replik na płytki agarowe z podłożem selekcyjnym pod względem biotyny. Podłoże to w 1 litrze zawiera: 25 mg destiobiotyny, 20 g glikozy, 5 g siarczanu amonowego, lg KH2PO4, 0,5g MgSO4X7H2O, 0,1 g CaCk, 0,1 g NaCl, 500pg kwasu borowego, 400pg chlorowodorku tiaminy, 400pg ZnSO4X7PkO, 400pg MnSO4XH2O, 200//g Na₂MoO X 2 H₂O, 200pg FeCk X 6 H₂O, 100/rg KJ i 40//g CuSO4 X H₂O).

Jeden z kilku transformantów BIO+ Y. lipolytica mający zdolność wzrostu na podłożu selekcyjnym pod względem biotyny nazwano DL31. Następnie, ze szczepu Y. lipolytica DL31 odzyskuje się plazmid z banku genów, zawierający gen BIO. Z hodowli szczepu DL31 preparuje się chromosomalny DNA. Kilka mikrogramów tego chromosomalnego DNA trawi się enzymem restrykcyjnym Apa I dla wycięcia plazmidu pochodzącego z banku. Pewną ilość trawionego DNA poddaje się reakcji ligacji dla zamknięcia pierścienia nieznanego plazmidu z banku.

Następnie, mieszaninę ligacyjną stosuje się do transformowania hodowli E.coli dla nadania jej oporności na ampicylinę, w celu odzyskania nieznanego plazmidu zawierającego BIO w E.coli. Otrzymuje się kilka opornych na ampicylinę transformantów E.coli. Z tych transformantów E.coli wykonuje się preparaty plazmidowe w małej skali. Produkty trawienia enzymami restrykcyjnymi tak otrzymanego plazmidowego DNA dowodzą, że jak oczekiwano, nieznany plazmid zawierający gen BIO jest równoważny z plazmidem pLD40 z insercją w miejscu Barn HI. Plazmid ten musi pochodzić z banku genów - nadano mu nazwę pLD51.

Plazmid pLD 56 generuje się jako podklon plazmidu pLD 51 przez usunięcie z pLD 51 genu LEU 2 w sposób następujący. Pewną ilość plazmidu pLD 51 trawi się enzymem EcoRI dla usunięcia regionu LEU2. Trawiony DNA poddaje się reakcji ligacji dla utworzenia postaci kolistej plazmidu, następnie prowadzi się transformację E.coli w celu podklonowania mniejszego plazmidu zawierającego gen BIO. Jeden z opornych na ampicylinę transformantów E.coli zawiera oczekiwany mniejszy plazmid, któremu nadano nazwę pLD 56. Prowadzi się szereg reakcji trawienia enzymami restrykcyjnymi tego plazmidu. Segment zawierający gen BIO w plazmidzie pLD 56 jest insertem w pBR322 w miejscu dla BamHI i ma długość około 3,6 kilopar zasad.

Poniżej podana jest bardzo pobieżna mapa restrykcyjna insertu o długości 3,6 kilopar zasad DNA Y. lipolytica, podłączonego w miejscu dla BamHI plazmidu pBR322 (zawierającego pLD 56). Przybliżone odległości (wyrażone w parach zasad) od początku insercji podane są w nawiasach. Oznaczeń wielkości dokonano na podstawie kilku analiz w żelach agarozowych; są one obserwowane stosunkowo dużymi błędami ilościowymi: PvuII (800), PVuII (1200), Pstl (1800),

155 850

Mlul (2000), Pstl (2300), EcoRV (2700), Ncol (3200). Dla orientacji, miejsce dla Sal I w plazmidzie pBR322 powinno poprzedzać opisane miejsca w miejsce dla Hind III powinno znajdować się za nimi.

Szczep ATCC 20774 (MATB leu-2-40 bio-6 xpr-2-1002) transformuje się intaktnym pLD 56 (pBR322 + około 3,6 kilopar zasad chromosomalnego DNA Y. lipolytica zawierających gen BTO). Trzy różne transformanty biotyno-niezależne testuje się na wysoką częstość transformacji ciętego przez Nrul (cel w pBR322) 1PD40 (gen LEU 2 w pBR322) w stosunku do szczepu rodzicielskiego, dla określenia, który z nich zawiera region tkwiącego w nim pBR322 zintegrowany z genem BIO. Wszystkie trzy transformanty mają zdolność transformacji z wysoką częstością ponieważ pLD40 jest zintegrowany z zawartym w nich pBR322. Potwierdzają to próby hybrydyzacji Southerna typu „biot. Jeden z trzech nowych transformantów ΒΙΟ Y. lipolytica otrzymał nazwę DL 118 i został użyty jako biorca DNA. Sporządzenie powyższej mapy restrykcyjnej było potrzebne w celu określenia: (I) co można zastosować jako ΒΙΟ-specyficzną sondę hybrydyzacyjną (odcinek NcolPvuII); (II) jaki enzym jest potrzebny dla prawidłowego cięcia plazmidu pLD56 (Mlu I); (III) który enzym tnie tylko raz w obszarze pBR322 (Ciał) i (IV) jaki enzym nie dokonuje żadnych cięć w plazmidzie (Apal).

Próby hybrydyzacji Southerna produktów trawienia DNA z ATCC 20774 i DL 118 enzymami Ciał i Apal (jako sondę stosuje się odcinek -BIO) wykazują, że jak oczekiwano, region biotyny w DL 118 (w porównaniu do regionu BIO w ATCC 20774) jest rozdzielony insercją DNA o wielkości odpowiadającej pLD56. Produkty trawienia DNA Dl 118 przez Mlul (jako sondę stosuje się pBR322) również wykazują insercję o takiej samej wielkości jak intaktny pLD56.

Konstruowanie ekspresyjno-wydzielniczego plazmidu pLX-34. Konstruuje się plazmid ekspresyjny, który umieszcza sekwencję kodującą proreniny wraz z sygnałami wydzielniczymi XPR2 (157 aminokwasów pre-pro-sekwencji) w dół od promotora LEU2. Ten plazmid ekspresyjny jest dowodem na to, że dla uzyskania wydzielania heterologicznych białek można użyć promotora innego niż promotor XPR2. Ten wektor ma ponadto zdolność wywoływania ekspresji i wydzielania niezależnie od miejsca integracji w genomie Y. lipolytica. Uzyskanie wydzielania proreniny z użyciem promotora innego niż promotor XPR2 demonstruje możliwość skonstruowania wektora ekspresyjnego w celu identyfikacji nowych alternatywnych silnych promotorów w Y. lipolytica. Takie założenie może być zastosowane do wytwarzania hodowli szczepu wykazującego ekspresję, z dwoma oddzielnymi hybrydowymi genami proreniny, zintegrowanymi w różnych miejscach w genomie gospodarza, przy czym ekspresja jednego jest wywołana przez promotor LEU2, a drugiego - przez promotor XPR2.

Na figurze 13 przedstawione są etapy eksperymentalne konstruowania wektora ekspresyjnego, który zawiera gen proreniny z sygnałami sekrecji alkalicznej proteazy (157 aminokwasów prepro-sekwencji XPR2), przy czym ekspresja tego genu jest wywoływana przez sekwencję promotora LEU2. Konstruowanie (ego plazmidu rozpoczyna się od preparowania odcinka promotora LEU2 zawierającego około 300 par zasad niepodlegającej translacji sekwencji 5', poprzedzającej kodon inicjacji translacji ATG w genie dehydrogenazy J-izopropylojabłczanu (fig. 12). Z wektora wahadłowego (ahuttle vector) pLD40 izoluje się odcinek DNA Hind III-Fok I o długości 300 par zasad, zawierający porcję 270 par zasad sekwencji promotora LEU2. Ten odcinek poddaje się ligacji wobec ligazy T4 z syntetycznym linkerem o długości 54 pary zasad o sekwencji:

------ Leu2 ----- Foki

5' - ATACAACCACACACATCCACAATG

3' - TTGGTGTGTCTAGGTGTTAC _________ _ __ _Xpr2 _ ____ _

Bgii

AAGCTCGTTACCGCCTTTACTATTCTCACTGCCGTTC -3'

TTCGAGCGATGGCGGAAATGATAAGAGTGACGGC -5'

155 850 a następnie poddaje się trawieniu enzymem Hind III. Otrzymane połączone sekwencje oczyszcza się na drodze elektroforezy żelowej izolując odcinek DNA Hind III-Bgll o długości około 3610 par zasad. Następną komponentę, to znaczy odcinek kodujący pozostałą część prepro-sekwencji XPR2 i pierwsze 152 reszty aminokwasowe proreniny izoluje się z plazmidu ekspresyjnego pXX-33 (fig. 6) przez trawienie enzymami Bgll i Xmal. Otrzymany odcinek DNA o długości 887 par zasad oczyszcza się przez elektroforezę żelową. Trzeci odcinek zawierający resztę genu proreniny, terminator XPR2 i sekwencje wektora preparuje się przez cięcie plazmidu pXX-33 enzymami Hind III i Xmal i oczyszczanie na żelu fragmentu wektora o długości około 8,0 kilopar zasad. Te trzy odcinki DNA poddaje się ligacji standartową metodą opisaną powyżej. Mieszaninę ligacyjną stosuje się do transformowania E.coli K12 szczep HB101. Z transformantów wyselekcjonowanych w oparciu o cechę oporności na ampicylinę izoluje się plazmidy i plazmid pLX-34 identyfikuje się poprzez jego mapę restrykcyjną (fig. 13).

Plazmidem pLX-34 trawionym uprzednio enzymem Nrul transformuje się Y. lipolytica ATCC20794 (DL 118) otrzymując Y. lipolytica ATCC20795 (DL251). Proreninę wydzielaną do płynu hodowli przez hodowlę tego leucyno-niezależnego transformantu oznacza się w sposób opisany dla pLS-3. Ta procedura transformacji ukierunkowuje integrację plazmidu pLX-34 do sekwencji pBR322 wprowadzonych uprzednio do locus bio w chromosomie gospodarza (co jest opisane powyżej). Integrację pLX-34 w tym miejscu potwierdza analiza Southerna. Użycie DL 118 jako biorcy. Próby hybrydyzacji Southerna prowadzi się w sposób następujący. Trawienie enzymem Nrul DNA pochodzącego z transformantów DL 118 (produkty trawienia hybrydyzuje się z sondą, na przykład prochymozyny jeśli wchodzący plazmid był plazmidem ekspresyjnym prohymozyny (dokładnie wycina wchodzący plazmid. Próbka kilku nanogramów transformującego plazmidu trawionego Nrul służy do sprawdzenia dokładnego miejsca hybrydyzującego pasma. Również produkty trawienia enzymem Mlul (Mlul nie ma miejsca cięcia w transformujących plazmidach) DNA pochodzącego z tych transformantów (hybrydyzowane z sondą znaczonego ³²P-pBR322), wykazują, że sekwencja PBR322 znajdująca się w DL 118 jest przedzielona insercją jednej lub więcej cząsteczek transformującego plazmidu. Dowodzi to, że integracja zachodzi w żądanym miejscu.

Transformowany szczep Y. lipolytica ATCC 20795 (DL 251) hoduje się na podłożu YEPD w temperaturze 22°C, w warunkach sprzyjających ekspresji promotora LEU2. Obecność proreniny w supernancie hodowli wykrywa się w próbie ścinania mleka przez aktywowane kwasem supernanty hodowli i potwierdza się poprzez analizę immunologiczną (patrz powyżej). Powyższe wyniki wskazują, że ten gen hybrydowy jest niezależną jednostką ekspresyjną zdolną do ekspresji i wydzielania, jeśli zintegrowana jest w miejscu innym niż XPR2 lub LEU2. Ta cecha pozwala na konstruowanie szczepu ekspresyjnego z wieloma genami hybrydowymi, co daje potencjalne możliwości uzyskiwania zwiększonych poziomów pozakomórkowej proreniny.

Przykład III. Sekwencja syntetycznego genu dla ludzkiej anafilotoksynyC5A. Zaprojektowany plan uzyskania produkcji ludzkiej anafilotoksyny C5a w organizmach bakteryjnych jest analogiczny do metod poprzednich stosowanych do syntezy i ekspresji EGF, opisanych w zgłoszeniu patentowym europejskim nr0147178. W planie tym stosuje się konstrukcję genu, w którym sekwencja kodująca aktywowaną komponentę dopełniacza C5a jest otrzymana syntetycznie. Wychodząc ze znanej sekwencji aminokwasowej ludzkiej C5a zaprojektowaliśmy fragment DNA kodujący informację dla jej 74 aminokwasów (fig. 9). Sekwencja syntetycznego genu została wybrana dla maksymalnego zużytkowania kodonu preferowanego przez E.coli i S. cerevisiae. Pozwala to również na wprowadzenie szeregu miejsc dla endonukleaz restrykcyjnych dla ułatwienia charakteryzacji. Takie podejście umożliwia ponadto bezpośrednio ekspresję anafilotoksyny C5a w E.coli przez wprowadzenie kodonu ATG inicjującego syntezę białka przed tripletem kodującym pierwszy aminokwas polipeptydu C5a. Dla ułatwienia insercji tego syntetycznego genu w plazmidzie pBR322 w żądanej orientacji, gen C5a tak skonstruowano, aby na swych końcach zawierał miejsca rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne EcoRI i Hind III. W celu wytworzenia sekwencji genu C5a zsyntetyzowano 10 47-merów metodą poprzez pochodne amidofosfinowe i połączono je w dwuniciowy fragment DNA o długości 235 par zasad. Następnie dokonuje się insercji tego fragmentu DNA do odpowiednio przeciętego plazmidu pBR322 i klonowany gen identyfikuje się metodą analizy odcinków restrykcyjnych plazmidowego DNA z arbitralnie wybra155 850 nych transformantów. Następnie analizuje się kilka klonów zawierających gen anafilotoksyny C5a na drodze sekwencj onowania DNA w celu zidentyfikowania klonu zawierającego właściwą sekwencję. Właściwą sekwencję nukleotydową dla regionu genu C5a wykryto w 2 spośród 5 badanych klonów.

Ekspresja ludzkiej anafilotoksyny C5a w bakteriach. Konstruowanie plazmidów ekspresyjnych dla ludzkiej anafilotoksyny C5a rozpoczyna się przez rozszczepienie podklonu C5a endonukłeazą restrykcyjną EcoRI. Następnie prowadzi się defosforylację przez traktowanie bakteryjną fosfatazą alkaliczną. Plazmid ekspresyjny C5a konstruuje się stosując odcinek DNA EcoRI o długości 360 par zasad z plazmidu pPFZ-R2 zawierający region promotor trp-operator i sekwencje posiadające miejsca wiązania z ribosomem. Kompetentne komórki E.coli szczep HP 101 transformuje się mieszaniną ligacyjną. Kilka opornych na lek kolonii pochodzących z każdej transformacji oczyszcza się i ich plazmidowy DNA analizuje się przez mapowanie miejsc restrykcyjnych w celu identyfikacji tych, w których orientacja promotora trp umożliwiłaby transkrypcję genu C5a. Po wielokrotnej izolacji produktów, z tej mieszaniny ligacyjnej wyodrębnia się plazmidy zawierające gen anafilotoksyny C5a sąsiadujący z sekwencją promotora bakteryjnego w konfiguracji wymaganej dla bezpośredniej ekspresji anafilotoksyny C5a. Mapa restrykcyjna plazmidu ekspresyjnego pC5a-48 zawierającego gen ludzkiej anafilotoksyny C5a jest przedstawiona na fig. 10.

Ekspresja i wydzielanie ludzkiej anafilotoksyny C5a w Y. lipolytica. Ekspresyjno-wydzielniczy wektor pC5aX-3 kodujący wydzielanie ludzkiej anafilotoksyny C5a preparuje się techniką podaną w przykładzie I dla plazmidu pXX-33. Następnie tym wektorem wydzielniczym transformuje się Y. lipolytica ATCC 20774. Ludzką anafilotoksynę C5a wytwarzaną przez hodowle transformantów oznacza się w sposób podany powyżej, z tym, że w próbie immunologicznej stosuje się kozie przeciwciała przeciw anafilotoksynie C5a i przeciwciała królika przeciw koziej IgG. Dla plazmidu opisanego w tym przykładzie stwierdzono obecność ludzkiej anafilotoksyny C5a w supernancie hodowli.

Konstruowanie ekspresyjno-wydzielniczego plazmidu pC5aX-3. Etapy konstruowania plazmidu pC5aX-3 zawierającego kod ekspresji i wydzielania anafilotoksyny C5a są przedstawione na fig. 11. Ten plazmid zawiera sekwencje dla „całego promotora XPR2,157 aminokwasów sygnałowych i pro-peptydu, przyłączone do syntetycznej sekwencji kodującej 74 reszty aminokwasowe ludzkiej anafilotoksyny C5a. Plan konstruowania pC5aX-3 jest podobny do planu konstruowania pXX-33. Na początku, plazmid pXHP-24 (lub inny plazmid zawierający żądaną sekwencję) rozszczepia się enzymami Hindlll i Aval i izoluje się w żelu odcinek o długości 1150 par zasad, zawierający promotor XPR2. Drugi odcinek zawierający sekwencje końca 3' pro-peptydu XPR2 i genu strukturalnego C5a wytwarza się w standartowej reakcji ligacji odcinka Hindl-Hind III o długości około 220 par zasad pochodzącego z ekspresyjnego plazmidu pC5a-48 E.coli z syntetycznym fragmentem o sekwencji:

5' CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCCA 3'

3' CTAAGGCGAAGAAGATTACGGTTCGCTTGA 5' wobec ligazy T4 i następnie trawi się enzymami Aval i Hind III. Otrzymane połączone sekwencje oczyszcza się metodą elektroforezy żelowej izolując odcinek Aval-Hind III o długości około 250 par zasad. Następnie poddaje się ligacji odcinek Hind III-AvaI zawierający promotor z odcinkiem AvaI-HindIII kodującym anafilotoksynę C5a wobec ligazy T4, po czym trawi się enzymem Hind III. Fragment o długości około 1,4 kilopar zasad oczyszcza się w żelu i stosuje do ligacji z trawionym Hind III plazmidem pterm 4 (opisanym powyżej). Mieszaninę reakcji ligacji stosuje się do transformowania E.coli K12, szczep MM 294. Z transformantów wyselekcjonowanych w oparciu o cechę oporności na ampicylinę izoluje się plazmidy i plazmid pC5aX-3 identyfikuje się przez mapowanie restrykcyjne.

Plazmidem pC5aX-3 po uprzednim trawieniu enzymem SnaBI transformuje się Y. lipolytica szczep PC-30869, ATCC 20774. Anafilotoksynę C5a wydzielaną do podłoża hodowli przez transformowane komórki oznacza się w sposób opisany powyżej. Stwierdza się obecność ludzkiej anafilotoksyny C5a w supernancie hodowli.

155 850

Wiadomo, że wiele białek syntetyzowanych przez ribosomy związane z retikulum endoplazmatycznym powstaje w formie glikoprotein. W istocie, glikozylacja może wpływać na wydzielanie danego białka. Glikozylacja przy grupie aminowej w białkach eukariotycznych występuje w trójpeptydowych sekwencjach arginina-X-treonina i asparagina-X-seryna, gdzie X oznacza dowolny aminokwas oprócz przypuszczalnie kwasu asparaginowego [Hubbard S. i wsp., Ann. Rev. Biochem. 50,555 (1981)]. Sekwencja aminokwasowa proreniny zawiera dwie takie trójpeptydowe sekwencje, jednakże analiza metodą elektroforezy żelowej proreniny wydzielanej przez hodowle Y. lipolytica nie wykazała glikozylacji. W innych wydzielanych białkach eukariotycznych nie wszystkie miejsca asparagina-X-treonina lub seryna są zglikozylowane. Jest prawdopodobne, że niektóre reszty asparaginy w obrębie sekwencji trójpeptydowych nie są zglikozylowane, gdyż są niedostępne dla enzymów glikozylujących.

W przypadku ludzkiej anafilotoksyny C5a, sekwencja aminokwasowa zawiera jedno miejsce glikozylacji lub sekwencję trójpeptydową (Asn-Ile-Ser), przy której normalnie występuje złożony oligosacharyd przyłączony do asparaginy [Fernandez H. i wsp., J. Immunol. 117, 1688 (1976)]. Pewna część cząsteczek anafilotoksyny C5a wydzielanych do podłoża hodowli Y. lipolytica jest zglikozylowana, ponieważ w próbie immunologicznej jest widoczny szeroki region aktywności antygenowej w części o wysokim ciężarze cząsteczkowym. Ta heterogeniczna ruchliwość elektroforetyczna jest analogiczna do obserwowanej dla innych wydzielanych białek i prawdopodobnie wynika z różnych stopni podstawienia węglowodorami.

W przypadku wynalazku, widoczna glikozylacja niektórych wydzielanych białek heterologicznych wykazuje, że sposób ekspresji i wydzielania białek z użyciem Y. lipolytica może być użyteczny do wytwarzania wielu normalnie zglikozylowanych białek eukariotycznych.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania transformantu Y. lipolytica nie wytwarzającego alkalicznej proteazy, znamienny tym, że dokonuje się transformacji szczepu Y. lipolytica XPR+ konstruktem ekspresyjnym XPR.
2. 2. Sposób wytwarzania transformantu Y. lipolytica, znamienny tym, że dokonuje się integracji wektora ekspresyjnego z transformantem Y. lipolytica posiadającym region homologii z heterologicznym DNA wektora, który to region zawiera egzogenny (obcy) DNA służący jako miejsce przyjmujące podczas integracyjnej transformacji tego Y. lipolytica.

   155 850

   I___________________PLD58_________________|

   I-----------------pLD 57 —_ΓΚ·_Λ------------1 £______pLD62_______| .|_EU2—-> ^_x|jr^-1002_._>

   BE EEBE BBEB n~-.............................

   Schematyczne przedstawienie plazmidów wyodrębnionych z Iransformantu Y. lipolitica, szczep DL112, zawierającego qen.XPR2.

   Zaznaczone regiony zawierają (od strony lewej do prawej) materia! z Y. lipolytica, który nie byl sekwencpncwany, maty segment plazmidu pBR 322 pomiędzy miejscem dia EeoRl a miejscemtączenia z DNA Y. lipolytica (poprzednio miejsce dla BatmHi), gen l_EU 2 z Y. lipolytica, duży segment plazmidu pBR322 oraz zmutowanq a llelę XPR 2, której sekwencje zostały zanalizowane.

   Miejsca dla Bgl U sq oznaczone symbolem B, a miejsca dla EcoRIsymbolem E

   Te trzy plazmidy, przedstawione w postaci liniowej wyodrębniono jako czqsteczki koliste, połączone korcami w miejscu dla Bglll.