PL159183B1 - Sposób wytwarzania polipeptydu podobnego do pollpeptydu naczelnych IL-3 PL PL PL - Google Patents

Sposób wytwarzania polipeptydu podobnego do pollpeptydu naczelnych IL-3 PL PL PL

Info

Publication number
PL159183B1
PL159183B1 PL1987266802A PL26680287A PL159183B1 PL 159183 B1 PL159183 B1 PL 159183B1 PL 1987266802 A PL1987266802 A PL 1987266802A PL 26680287 A PL26680287 A PL 26680287A PL 159183 B1 PL159183 B1 PL 159183B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
dna sequence
polypeptide
dna
expression
sequence
Prior art date
Application number
PL1987266802A
Other languages
English (en)
Other versions
PL266802A1 (en
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27487045&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL159183(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US06/916,335 external-priority patent/US4877729A/en
Priority claimed from US07/021,865 external-priority patent/US4959455A/en
Application filed filed Critical
Publication of PL266802A1 publication Critical patent/PL266802A1/xx
Publication of PL159183B1 publication Critical patent/PL159183B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5403—IL-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Glass Compositions (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)
  • Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
  • Gas Separation By Absorption (AREA)
  • Treating Waste Gases (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

1. Sposób wytwarzania polipeptydu podobnego do polipeptydu naczelnych IL-3 zasadni­ czo wolnego od polaczen z innymi polipeptydami naczelnych, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle linii komórkowej stransformowanej wektorem zawierajacym sekwencje D N A kodu­ jaca ten polipeptyd, który ma sekwencje aminokwasów taka sama lub zasadniczo taka sama jak sekwencja przedstawiona w tabeli 1 lub w tabeli 2 i wykazuje co najmniej jedna wlasciwosc biologiczna podobna do wykazywanych przez polipeptyd naczelnych IL-3. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydu podobnego do polipeptydu naczelnych IL-3. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania nowej rodziny hematopoetycznych czynników wzrostu naczelnych podobnych do IL-3 metodami inżynierii genetycznej.
Hematopoetyny, czyli hematopoetyczne czynniki wzrostu, są białkami, które pobudzają przeżywanie, wzrost i różnicowanie się komórek hematopoetycznych. Czynnki stymulujące kolonizację (CSF) stanowią podzbiór tych hematopoetycznych czynników wzrostu i charakteryzują się zdolnością do podtrzymywania wzrostu m vitro kolonii komórek hematopoetycznych pochodzących z komórek pierwotnych szpiku kostnego, wątroby płodowej i innych organów hematopoetycznych.
159 183
W biochemicznej i biologicznej identyfikacji oraz w charakterystyce określonych hematopoetyn przeszkadzają niewielkie ilości naturalnie występujących czynników możliwych do uzyskania ze źródeł naturalnych, np. krwi lub moczu. Ostatnie niektóre z tych hematopoetyn klonowano molekularnie, doprowadzono do ekspresji w układzie heterologicznym i oczyszczano do uzyskania homogeniczności [D. Metcalf, „The Molecular Biology and Functions of the GranulocyteMacrophage Colony Stimulating Factors, Blood, 67 /2/, 257-267 (1986)]. Do tych hematopoetyn zalicza się ludzki i mysi GM-CSF, ludzki G-CSF, ludzki CSF-1 i mysi IL-3, ludzki GM-CMF [R. Donahuei in., Naturę, 321,872-875 (1986)], mysi IL-3 [J. Kindler i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 83, 1001-1005 (1986); Metcalf i in., Blood, 68, 46-57 (1986)] oraz ludzki G-CSF [K. Welte i in., J. Exp. Med., 165,941-948 (1987)] wykazujące wpływ na hematopoezę in vivo. Mysie białko IL-3, jak dotychczas stwierdzono, nie tworzy kopii w układzie ludzkim [D. R. Coben i in., Nuci. Acids. Res., 14, 3641 (1986)].
Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania rodziny czynników wzrostu naczelnych podobnych do IL-3, zasadniczo wolnych od innych białek naczelnych i charakteryzujących się sekwencjami aminokwasów tymi samymi lub zasadniczo homologicznymi do sekwencji przedstawionych w poniższych tabelach 1 i 2. Sekwencje takie mogą być kodowane przez sekwencje DNA przedstawione w tabelach albo sekwencje zdolne do hybrydyzowania z nimi i kodujące polipeptydy o właściwościach biologicznych podobnych do wykazywanych przez IL-3, względnie mogą być innymi sekwencjami, w różny sposób modyfikowanymi, wykazującymi te właściwości. Polipeptydy te również charakteryzują się właściwościami biologicznymi podobnymi do wykazywanych przez IL-3.
Przykładowo, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania ludzkiego polipeptydu zasadniczo wolnego od połączeń z innymi ludzkimi polipeptydami, charakteryzującego się sekwencją peptydową tą samą, lub zasadniczo tą sarnę, co przedstawiona w tabeli 2 i wykazującego co najmniej ejdną właściwość biologiczną podobną do wykazywanych przez IL-3. Innym przykładem polipeptydów wytwarzanych sposobem według wynalazku jest polipeptyd gibbona zasadniczo wolny od połączeń z innymi białkami naczelnych i charakteryzujący się sekwencją peptydową tą samą, lub zasadniczo tą samą, co przedstawiona w tabeli 1 i wykazujący co najmniej jedną właściwość biologiczną podobną do wykazywanych przez IL-3.
Polipeptydy wytwarzane sposobem według wynalazku charakteryzują się co najmniej jedną właściwością, podobną do wykazywanych przez IL-3, wśród których znajdują się właściwości następujące:
a) pozorna masa cząsteczkowa w zakresie około 14 do około 35 kilodaltonów, oznaczona za pomocą redukującej elektroforezy w żelu SDS-poliakryloamidowym,
b) zdolność do stymulowania, w standardowym teście na ludzkim szpiku kostnym, w stężeniu 10 do 100 pikomolowym, tworzenie różnych typów kolonii hematopoetycznych należących do różnych linii,
c) zdolność do stymulowania, w teście CML, w stężeniu 10 do 100 pikomolowym, namnażania się komórek CML,
d) punkt izoelektryczny w zakresie pH 6,0-7,6
e) pojedynczy ostry pik przy 43 kilodaltonach w sączeniu żelowym na kolumnie Superose 6,
f) pojedyncze pasmo przy 20,5 kilodaltona w żelu po podzieleniu N-glikonazą, oraz
g) poziom zanieczyszczeń nie większy niż 2%, na podstawie N-końcowej analizy z zastosowaniem degradacji Edmana.
Polipeptydy wytwarzane sposobem według wynalazku nadają się do wytwarzania środków farmaceutycznych. Środki te można zastosować do leczenia wielu stanów chorobowych charakteryzujących się niedoborem ilościowym komórek .hematopoetycznych, takich jak leukopenia, trombocytopenia, anemia, niedobór komórek B, niedobór komórek T, zakażenia bakteryjne oraz zakażenia wirusowe, w tym niedobór komórek odpornościowych lub komórek hematopoetycznych po transplantacjach szpiku kostnego. Sposób leczenia polega na podawaniu jednego z polipeptydów wytwarzanych sposobem według wynalazku w skutecznej ilości. Taki sposób może także obejmować podawanie z polipeptydami podobnymi do IL-3, jednocześnie lub kolejno, co najmniej jednej innej hematopoetyny, interleukiny lub czynnika wzrostu, w ilości skutecznej. Do
159 183 przykładowych hematopoetyn nadających się do takiego zastosowania należą GM-CSF, G-CSF, G-CSF-1 lub erytropoetyna. Przykładowymi interleukinami są IL-1, IL-2, IL-4 lub IL-6. W sposobach tych można również stosować czynniki wzrostu, takie jak czynnik wzrostu komórek B, czynnik różnicowania się komórek B, albo czynnik zróżnicowania się eozynofilów.
Termin „właściwość biologiczna podobna do wykazywanych przez IL-3“ w niniejszym opisie odpowiada jednej, lub więcej niż jednej następującej biologicznej właściwości i aktywności in vivo i in vitro. Jedną z tych właściwości jest podtrzymanie wzrostu i różnicowania się komórek pierwotnych zaangażowanych w liniach erytroidalnych, limfoidalnych i szpikowych. I tak np. w standardowym teście na ludzkim szpiku kostnym właciwością biologiczną podobną do wykazywanych przez IL-3 jest stymulowanie kolonii typu granulocytowego oraz ekspansji komórek erytroidalnych. Inną taką właściwością jest interakcja z wczesnym i wielopotencjalnymi komórkami pnia. Biologiczną właściwością podobną do wykazywanych przez IL-3 jest podtrzymywanie wzrostu wieloczynnościowych komórek prekursorowych. Inną właściwością jest zdolność do stymulowania namnażania się komórek przewlekłej białaczki szpikowej (CML). Biologiczną właściwością podobną do wykazywanych przez IL-3 jest także stymulacja namnażania się komórek tucznych. Czynniki wzrostu podobne do IL-3 mogą również podtrzymywać wzrost rozmaitych czynnikozależnych linii komórkowych i/lub indukować ekspresję 20 σ-dehydrogenazy steroidowej (20 σ-SPH) i antygenu Thy-1. Dalej, właściwościami biologicznymi podobnymi do wykazywanych przez IL-3 są: stymulacje tworzenia kolonii przez komórki KG-1 i/lub stymulacja zwiększonej syntezy histaminy w hodowlach śledziony i szpiku kostnego. Jeszcze inną właściwością biologiczną IL-3 jest pozorna masa cząsteczkowa w zakresie około 14 do około 35 kilodaltonów w redukującej elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z siarczanem sodowo-dodecylowym. Inne biologiczne właściwości IL-3 zostały ujawnione w tej dziedzinie techniki.
Specyficzne sekwencje peptydowe przedstawione w tabelach 1 i 2 stanowią dwa przykłady członków rodziny czynników wzrostu wytwarzanych sposobem według wynalazku. Sekwencję DNA o 865 parach zasad według tabeli 1 wyodrębnione ze zbioru ekspresyjnego cDNA z linii komórek T gibbona zakażonych wirusem białaczki małpiej (gibbona), UCD-144MLA [T. G. Kuwakami i in. Naturę, 235, 170 (1972)]. Sekwencja ta zawiera długą pojedynczą otwartą ramę odczytu o 456 nukleotydach, które koduje białko o około 152 aminokwasach, zwane CSF-80, oraz zawiera sekwencję zwykłego lidera wydzielniczego, wskazanego przez sekwencję w wysokim stopniu hydrofobową (Leu Leu Leu Leu Glu Leu Leu). Dojrzałe białko zaczyna się przy aminokwasie nr 20 (alaninie) w tabeli 1. Region kodujący zawiera trzy cysteiny, dwie w dojrzałym białku, sugerując istnienie jednego wiązania disiarczkowego. Istnieją dwa potencjalne, związane z asparaginą, miejsca glikozylacji przedstawione charakterystycznymi sekwencjami Asn-X-Sor lub Asn-XThr. Zarówno wielkość, jak i model glikozylacji ujawniony przez sekwencję kodującą są typowe dla białek podobnych do limfokin. Pozostałe niekodujące części regionu o 865 parach zasad mogą odgrywać rolę regulującą w transkrypcji z naturalnego gospodarza. Koniec 3' powtórek sekwencji ATTTA, co do której przyjmuje się, że odnosi się do stabilności RNA-przekazu. Patrz G. Shaw i N. Kamen, Celi, 46 (5), 659-677 (1986).
159 183
Tablica 1
20 30 49
OICGcGOEcO CTCAAOGAAA AAJAAAATCC AAAC ATC AGC TCC CIO CCC CTC CIO CTC
MET Ser Cys Leu Pro va Leu Leu
CTC 64 CTC CAA CTC CTC CTC 79 AGC CCC GGA CTC CAA 94 GCT OCO ATC ACC CAG 109 ACA ACG
Leu Leu Gin Leu Leu Val Ser Pro Gly Leu Gin Ala Pro MET Thr Gin Thr Thr
TCC TTC AAG 124 ACA AGC TCG CTT AAC 139 TCT TCT AAC AIO ATC 154 GAT GAA ATT AIA ACA
Ser Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn cys Ser Asn MET He Asp Glu Ile Ile Thr
169 CAC TTA AAG CAG CCA 184 CCT TTC CCC TTC CTC 199 GAC TTC AAC AAC CTC 214 AAT GGG GAA
His Leu Lys Gin Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Ehe Asn Asn Leu Asn Gly Glu
GAC CAA 229 GAC ATT CIO ATC GAA 244 AAT AAC CTT CGA AGG 259 CCA AAC CTC GAG GCA 274 TTC
ASO Gin Asp Ile Leu MET Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Ehe
AAC AAG GCT GTC 289 AAG ACT TTA CAG AAT 304 GCA TCA GCA ATC GAG 319 AGC ATT CTT AAG
Asn Lys Ala Val Lys Ser Leu' Gin Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile Leu Lys
AAT 334 CTC CCC OCA TCC CIG 349 CCC ATC GCC ACA GCC 364 GCA CCC ACG CGA CAT 379 CCA ATC
Asn leu Pro Pro Cys Leu Pro MET Ala Thr Ala ALa Pro Thr Arg His Pro Ile
CCT ATC AAG 394 GAC GCT GAC TGG AAT 409 GAA TTC CGG AGG AAA 424 CTC AAG TTC TAT CTC
Arg Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Ehe Arg Arg Lys Leu Lys Rie Tyr Leu
439 AAA ACC CIT GAG 454 AAT GAG CAA GCT CAA CAG 469 ATC ACT TTC AGC CTT 484 GAG ATC TCT
Lys Thr Leu Glu Asn Glu Gin Ala Gin Gin MET Thr Leu Ser Leu Glu Ile Ser
500 510 520 530 540 550 560
,ImL□.oUA\AC GTOCAGOJOΓ OΓOIOTCGGO OoTCIOCCOG OAGCGCOJOA GGACATCAAA AAuAlCAGAA
570 580 590 600 610 620 630
CT^OTAAAC CTOTOGOIOG TCIOIOCCCC COTOOCGGAC CAGAAGCArr TCCCCnTC CTOCGGCdC
640 650 660 670 680 690 700
CGATCCCΓTG TTAAnATCT AA^llCTCAA ATCIG^AG^ OCCATTTOGO GTTGTGIOOΓ TCTOTTCJOC
710 720 730 740 750 760 770
ΊΊΊTTCTOCO AΓTOAGACTA TTTATCTATC TCICTAnTA ΤΤΤΑΠΤΑΓΤ TCΠTCΠGO OTTOJGGCGO
780 790 800 810 820 830 840
OTGCCGTCEC THATTCAG CAGAGGAGOC CTOTOATCCT GOΓTOTOOAA CCACOIOCCG COTGGGOTGG
850 860
GGAGCATCT CAlTiGTACC TCGAG
159 183
Sekwencję DNA o 674 parach zasad według tabeli 2 otrzymano z ludzkiego zbioru genomowego [J. J. Toole i in., Naturę, 312, 342-346 (1984)] przez zastosowanie sekwencji według tabeli 1 jako sondy. Sekwencję DNA według tabeli 2 skonstruowano pierwotnie przez składanie razem egzonów z ludzkiej sekwencji genomowej, które zidentyfikowano przez porównanie z sekwencją DNA polipetydu gibbona podobnego do IL-3 według tabeli 1. Ta sekwencja ludzka potwierdzona przez analizę mRNA odpowiadającego klonowi ludzkiego cDNA również klonuje polipeptyd o około 152 aminokwasach także należący do powyższej rodziny białek naczelnych. Ten polipeptyd ludzki obejmuje sekwencję zwykłego lidera wydzielniczego wskazaną w wysokim stopniu hydrofobową sekwencją (Leu Leu Leu Gin Leu Leu). Dojrzały polipeptyd zaczyna się przy aminokwasie nr 20 (alaninie) w tabeli 2. Region kodujący zawiera dwie cysteiny w dojrzałym białku, sugerując jedno wiązanie disiarczkowe. Istnieją dwa potencjalne, związane z asparaginą, miejsca glikozylacji, przedstawione charakterystyczną sekwencją Asn-X-Ser. Pozostałe niekodujące części sekwencji o 674 parach zasad mogą wykazywać rolę regulującą w transkrypcji u naturalnego gospodarza.
Sekwencje nukleotydów egzonów genu z ludzkiego genomu (tabela 2) były w ponad 96% homologiczne z sekwencją DNA genu gibbona (tabela 1). Zmiany w sekwencji nukleotydów w 11 kodonach powodują różnice w aminokwasach między białkiem gibbona a ludzkim. Nukleotydy przedstawione ponad sekwencją w tabeli 2 wskazują miejsca, gdzie sekwencja gibbona różni się od pokrewnej sekwencji ludzkiej. Podobnie, aminokwasy przedstawione poniżej ludzkiej sekwencji aminokwasów wskazują, w których miejscach sekwencja gibbona różni się od sekwencji ludzkiej. Strzałki wskazują miejsca połączeń egzonów i intronów w ludzkiej sekwencji genomowej.
Tablica 2
C 9 T 24 39 A54
GCTCCCACC ATS AGC CSC CIG COC. .CTC CG CTC CO CTC CCC CTC CIG GTC OSC
MTT Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Hn Leu Leu Val Arg
Cys Ser
(27)
84 (CJ 99
CCC GGA CIC CAA GCT CCC AIG ACC CAG ACA AOG TCC TIG AAG ACA AGC TGG GTT
Pro Gly leu Gin Ala Pro MET Thr Gin Thr Thr Ser leu Lys Thr Ser Trp VłL
114
T 129 144 159
AAC TGC ΊΟ JAC JAT AAC CGA (GAA JAT? AU AA CAC TEA JAG GAG CCA CCT TG
Asn Cys Ssr Jasi JMT Ile dsi Glu He Ile Tur His leu Lys Gin Pro Pro leu
C 174 188> 204
CCT TIG CCT GGC HT ACC AAC CCTC JAA? GGG GAA GAC CCA GA JAT* CIA AA GAA
Pro Leu Ilu ds FTe dn ds Lyei dst dly Hu A?P Gln Ile Leu MTT Glu
219 294 249 A 264
AAT CCC CTT d JAG GCA AA CIG GAG GCA HT? AAC Al n? HC AAA AST TIA
Asn Csn Leu djg drg Po Asn Leu Glu Ala Phi An drj da Vd Lyy Ser Leu
Lys
T 279 C 294 G 300 oc c 924
CAG CCC GCA TTC GGC JAT? GAG JAGC ATT GT1 JAA AAT cct: CCG CCA TCC CIG CCC
Gin Csn Ala Ssu da He Glu ^uj He Lua Lyyi An leu IhOl Pro CCs leu Pro
100 Pro
A A 339 304 G 969
CIG GOC AOG !H GGC GCC AOG GAA CCT GCC ATC CCT JAIC MA GAC CCI GAC TGG
Leu da Utt da JAa Po TBir Arg Hśa Po Ile Hs Ile Lyy ds Gly A? Trp
MTT Arg
159 183
c.d. Tablicy 2
429 }
384 399 A 414 AA
AAT GAA 1TC CCG AGG WAA CTO AO5 TTC ΌΓ CTC AAA ACC CTT GAG AAT GCG CAS
Asn Glu Iłie Alg Arg Dys Leu Thr Ree iyr leu Lys ThU4 Leu Glu Asn Ala Gin
130 Lys Glu
444 459 485
T T A C C 445 TC 495
GCT CAA GCA GOS AAC TTG AGC CTC GCG ATC ΊΤΓ TA^ACCCAACCG CCCAGCTOCT CCTCTGGCCC
Ala GLn Gis Tłu: Thr Llu Sse Ilu Ala Iie The
MET 147 Clu Ser
505 515 555
c C A A 525 535 545 G 565
TTOTOCCOCO ASCGCCTOGC CCCCΓCACCC CCCCCACCCC TTC]CACACC TCTCCCTCAT CTCTCCCCCA
C 575 585 595 605 615 625 635
TTCCAGGACC AGAAGCATTT CACCTTITCC TCOSGCATCA GATCAATTCT TAATTATCTA ATITCTGAAA
645 655 T 665
TCICCAGCTC OGATITCCCC 'rTCCCSCrT CTCITCTCA
Badania komputerowe prowadzone przez National Biomedical Services of Washington, D. C. dowiodły, że sekwencje gibbona i ludzka odpowiadające polipeptydowi podobnemu do IL-3 wykazują w przybliżeniu 29% homologii na poziomie aminokwasów i 45% homologii na poziomie nukleotydów z mysią sekwencją DNA IL-3,jak opublikowali M. C. Fung i in., Naturę, 307,233-237 (1984). Podobnie porównano strukturę egzonów ludzkiego genu polipeptydu podobnego do IL-3 z kodującymi regionami mysiego IL-3.
Nową sekwencję cDN A o 865 parach zasad przedstawioną w tabeli 1, zawartą w plazmidzie w
E. coli HB101, zdeponowano w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD, dnia 11 lipca 1986 pod numerem rejestracyjnym ATCC 67154. Nową sekwencję genomową, do której odnosi się sekwencja cDNA przedstawiona w tabeli 2, zawartą w bakteriofagu podobnie zdeponowano dnia 7 sierpnia 1986 pod numerem rejestracyjnym ATCC 40246. Ludzki DNA IL-3, zawarty w plazmidzie pSHIL-3-1 w E. coli HB101 zdeponowano w ATCC dnia 24 lutego 1987 pod numerem rejestracyjnym ATCC 67326.
Przykładowe polipeptydy, ludzki i gibbona, podobne do IL-3, charakteryzowano dalej za pomocą analizy w żelu SDS-poliakryloamidowym, stosując białka znakowane 35S z transfekowanych komórek COS, jak to opisano w przykładach w poniższej części niniejszego opisu. Obydwa polipeptydy nie są jednolite co do wielkości, stanowiąc typy molekularne o pozornej masie cząsteczkowej w zakresie około 14 kilodaltonów do 35 kilodaltonów. Przyjmuje się, że ten zakres masy cząsteczkowej powyższych przykładowych czynników podobnych do IL-3 jest wynikiem wariacji w glikozylacji oczyszczonych, wytworzonych przez komórkę COS cząsteczek. Oczyszczone białka w stężeniu 10 do 100 pikomolowym powodują tworzenie małych kolonii typu granulocytowego w testach na ludzkim szpiku kostnym in vitro. Oprócz tego, w obecności erytropoetyny w tych badaniach na ludzkim szpiku kostnym, obydwa polipeptydy podtrzymują wzrost komórek pierwotnych typu erytroidalnego lub szpikowego, przy porównywalnym poziomie aktywności. Tak więc, te podobne IL-3 czynniki stanowią multi-CSF. Te czynniki podobne do IL-3 powodują również namnażanie się białaczkowych komórek blastycznych od pacjentów z CML. Polipeptydy te mogą być także zdolne do stymulowania komórek dodatkowych i dojrzałych, takich jak np. monocyty, do wytwarzania innych czynników podobnych do hematopoetycznych, które z kolei stymulują tworzenie kolonii innych komórek hematopoetycznych, jak również pojawienie się innych rodzajów aktywności typu hematopoetycznego.
Rodzina czynników wzrostu podobnych do IL-3 wytwarzana sposobem według wynalazku obejmuje także czynniki kodowane przez sekwencje podobne do sekwencji według tabel 1 i 2, ale w których modyfikacje pojawiły się naturalnie lub zostały wprowadzone rozmyślnie. I tak np., jedną taką zmodyfikowaną sekwencję ludzką jest ludzka sekwencja cDNA przedstawiona w tabeli 2 z
159 183 modyfikacją dotyczącą proliny kodowanej przez tryplet CCC w pozycji aminokwasowej nr 27 zamiast seryny kodowanej przez tryplet TCC, który pojawia się w tabeli w tej pozycji. Tę przykładową zmodyfikowaną sekwencję podobną do IL-3, która daje aktywny ludzki czynnik podobny do IL-3, zawartą w E. coli HB101 jako pHucIL3-2, zdeponowano w ATCC dnia 13 lutego 1987 pod numerem rejestracyjnym ATCC 67319.
Inne modyfikacje w peptydzie lub sekwencji fachowiec w tej dziedzinie techniki może przeprowadzić znanymi metodami. Specyficzne modyfikacje, o które chodzi w tych sekwencjach czynników pokrewnych, podobnych do IL-3, mogą obejmować zastąpienie innymi aminokwasami jednej lub obydwu z dwóch reszt cysteiny w każdej sekwencji kodującej. Korzystnie, obydwie cysteiny zastępuje się innym aminokwasem, takim jak np. seryna, w celu eliminacji mostka disiarczkowego. Mutagenne metody tej zamiany są dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie techniki. Patrz np. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 518 584.
Inne specyficzne mutacje sekwencji czynników podobnych do IL-3 opisanych w niniejszym opisie obejmują modyfikacje jednego lub obydwóch miejsc glikozylacji. Nieistnienie glikozylacji lub glikozylacja tylko częściowa wynika z subss;^^ucji aminokwasów albo delecji przy jednym lub obydwóch miejscach glikozylacji związanych z asparaginą obecnych w sekwencjach czynników podobnych do IL-3 przedstawionych w tabelach 1 i 2. Związane z asparaginą miejsca rozpoznawania dotyczące glikozylacji obejmują tripeptydowe sekwencje specyficznie rozpoznawane przez odpowiednie enzymy komórkowe związane z glikozylacją. Taką tripeptydową sekwencją jest albo asparagino-X-treonina, albo asparagino^-seryna, gdzie X jest zwykle jakimkolwiek aminokwasem. Różne substytucje lub delecje aminokwasów w jednej lub obydwu, pierwszej i trzeciej pozycji miejsca glikozylacji (i/lub delecje w pozycji drugiej) powodują niewystąpienie glikozylacji, co dotyczy zmodyfikowanej sekwencji tripeptydowej.
I tak np. Asn34 w sekwencji według tabeli 1 można zastąpić w jednym ze zmodyfikowanych czynników podobnych do IL-3 glutaminą. Utworzony czynnik (GI1134) powinien zawierać tylko jedno ugrupowanie węglowodorowe związane z asparaginą (przy Asne9) zamiast dwóch takich ugrupowań. Fachowcy w tej dziedzinie techniki zdadzą sobie sprawę z tego, że analogiczne glikoproteiny z tą samą Asne9 - monoglikozylacją można wytworzyć przez substytucję w pozycji 34 z udziałem innego aminokwasu i/lub przez substytucję odnoszącą się do innego aminokwasu w innych pozycjach miejsca rozpoznawania dotyczącego glikozylacji, np. wprowadzając walinę przy Ser36. Podobnie, Asn w pozycji 89 i/lub Ser w pozycji 91 można zmienić metodami mutagenezy na inne aminokwasy w celu deglikozylacji czynnika w tym miejscu. Alternatywnie, można zmieniać oba miejsca, jak wyżej. Te modyfikacje miejsc glikozylacji można również przeprowadzić w celu wytworzenia modyfikacji sekwencji według tabeli 2. Patrz np. A. Miyajina i in., EMBO J., 5 (6), 11193-1197 (1986) oraz przykład IV zamieszczony w poniższej części niniejszego opisu. Inne analogi i pochodne sekwencji według tabel 1 i 2 mogą być skonstruowane przez fachowca w tej dziedzinie techniki, do której odnoszą się ujawnienia z niniejszego opisu, i to w łatwy sposób.
Według wynalazku sposób wytwarzania należących do nowej rodziny czynników wzrostu naczelnych podobnych do IL-3 polega na prowadzeniu hodowli odpowiedniej komórki lub linii komórkowej, transformowanej wektorem zawierającym sekwencję DNA kodującą z ekspresją nowy polipeptyd naczelnych podobny do IL-3, pod kontrolą znanych sekwencji kontrolnych. Odpowiednimi komórkami lub liniami komórkowymi mogą być komórki ssaków, takie jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO). Sdekcja odpowiednich komórek-gospodarzy ssaków i metody transformacji, hodowli, amplifikacji, screeningu i wytwarzania oraz oczyszczania produktu, są znane. Patrz np. Gething i Sembrook, Naturę, 239, 620-625 (1981), albo alternatywnie Kaufman i in., Mol. Celi. Biol., 5 (7), 1750-1759 (1985) lub Howley i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4419446. Inną odpowiednią linią komórek ssaków, opisaną w załączonych przykładach, jest mysia lima komórkowa COS-1. Podobnie użyteczną linią komórek ssaków jest linia komórkowa CV-1.
Podobnie użytecznymi jako komórki-gospodarze nadające się do użycia w sposobie według wynalazku są komórtki bakteryjne. I tak np., różne szczepy E. coli (takie jak np. HB101, MC1061 oraz szczepy zastosowane w następujących przykładach) są dobrze znane jako komórki10
159 183 gospodarze w dziedzinie biotechnologii. W sposobie według wynalazku można także zastosować rozmaite szczepy B. subtilis, Pseudomonas, inne laseczki itp.
Także liczne szczepy komórek drożdży znane fachowcom w tej dziedzinie techniki dostępne są jako komórki-gospodarze do ekspresji polipeptydów wytwarzanych sposobem według wynalazku. Dodatkowo, jeżeli jest to pożądane, można użyć komórek owadzich jako komórek-gospodarzy w sposobie według wynalazku. Patrz np. Miller i in., Genetic Engineering, 8, 277-298 (Plenum Press, 1986) i cytowane tam odnośniki.
W sposobie według wynalazku stosuje się nowe sekwencje DNA wolne od połączeń z sekwencjami DNA kodującymi inne białka naczelnych, kodujące z ekspresją polipeptydy lub czynniki wzrostu naczelnych podobne do IL-3. Sekwencje te obejmują sekwencje DNA przedstawione w tabeli 1 i tabeli 2 w kierunku od 5' do 3' i także sekwencje, które hybrydyzują z sekwencjami DNA według tabeli 1i 2 w ostrych warunkach hybrydyzacji [patrzT. Maniakis i in., Molecular Cloning (A Laboratory Mannual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), strony 387 do 389]. Przykładowo hybrydyzacja w ostrych warunkach przebiega w 4XSSC w temperaturze 65°C z następującym potem przemyciem 0,1 X SSC w temperaturze 65°C w ciągu godziny. Alternatywnie, przykładowa hybrydyzacja w ostrych warunkach może zachodzić w 50% formamidzie, 4XSSC w temperaturze 42°C.
Sekwencje DNA hybrydyzujące z sekwencjami według tabel 1i 2 w złagodzonych warunkach hybrydyzacji i które kodują z ekspresją czynniki wzrostu wykazujące właściwości biologiczne podobne do wykazywanych przez IL-3, kodują także czynmki należące do tej rodziny nowych czynników wzrostu. Przykładowo nieostre warunki hybrydyzacji obejmują: 4 X SSC w temperaturze 50°C lub z 30-40% formamidem w temperaturze 42°C. I tak np. sekwencja DNA, w której regiony o znacznej homologii (takie jak miejsca glikozylacji lub wiązania disiarczkowe) są takie same jak w sekwencjach według tabeli 1 i/lub 2, i która koduje białko naczelnych wykazujące jedną, lub więcej niż jedną właściwość biologiczną wykazywaną przez białko podobne do IL-3, w oczywisty sposób koduje białko należące do tej nowej rodziny czynników wzrostu, nawet jeżeli ta sekwencja DNA nie hybrydyzowałaby silnie z sekwencją według tabeli 1 lub 2.
Podobnie, sekwencje DNA kodujące polipeptydy naczelnych podobne do IL-3 kodowane przez sekwencje według tabeli 1 lub 2, ale wykazujące różnice w sekwencji kodonów wynikające z degeneracji kodu genetycznego lub wariacji allelicznych (naturalnie zachodzące wymiany zasad w populacji stanowiącej gatunek, które mogą, lub nie mogą, powodować zmian aminokwasów) również kodują nowe czynniki wzrostu z rodziny opisanej w niniejszym opisie. Wariacje w sekwencjach DNA według tabel 1 i 2 spowodowane mutacjami punktowymi lub modyfikacjami wprowadzonymi w celu wzmożenia aktywności lub wytwarzania, względnie półokresu trwania polipeptydów kodowanych przez wspomniane sekwencje, także są objęte zakresem niniejszego wynalazku.
Czynniki należące do nowej rodziny czynników wzrostu naczelnych, podobne do IL-3, można stosować w leczeniu szeregu stanów chorobowych, a w szczególności chorób charakteryzujących się obniżonym poziomem komórek albo szpikowych, erytroidalnych, limfoidalnych albo megakariocytów należących do układu hematopoetycznego, względnie kombinacji tych komórek. Oprócz tego, można ich użyć do aktywowania komórek szpikowych dojrzałych i/lub limfoidalnych. Do stanów chorobowych podatnych na leczenie polipeptydami, wytwarzanymi sposobem według wynalazku należy lekuopenia, w której następuje zmniejszenie się ilości krążących leukocytów (białych ciałek) w krwi obwodowej. Leukopenia może powstać w wyniku ekspozycji na pewne wirusy lub na promieniowanie. Często jest ona skutkiem ubocznym leczenia nowotworu, np. skutkiem ekspozycji na leki chemoterapeutyczne. W przypadku leczenia leukopenii środkami zawierającymi polipeptyd podobny do IL-3 można uniknąć niepożądanych wpływów ubocznych spowodowanych działaniem leków obecnie dostępnych.
Na różnego rodzaju niedobory odpornościowe, np. limfocytów T i/lub B, względnie zaburzenia immunologiczne, takie jak np. gościec przewlekły postępujący, także można dobroczynnie wpływać leczeniem polipeptydami wytworzonymi sposobem według wynalazku. Czynniki te, same lub w połączeniu z innymi reżimami leczniczymi, mogą być użyteczne w leczeniu lub korygowaniu niedoborów odpornościowych, które są wynikiem zakażenia wirusowego, np. HTLVI, HTLVII, HIV, poważnej ekspozycji na promieniowanie, leczenia nowotworu lub też które powstają w
159 183 rezultacie innych działań leczniczych. Polipeptydów według wynalazku można także użyć, samych lub w połączeniu z innymi hematopoetynami, w leczeniu innych niedoborów dotyczących komórek krwi, w tym trombocytopenii (niedobór płytek) lub anemii (niedobór krwinek czerwonych). Do innych zastosowań tych nowych polipeptydów należy leczenie pacjentów powracających do zdrowia w związku z transplantacjami szpiku kostnego, oraz zastosowanie związane z tworzeniem się monoklonalnych lub poliklonalnych przeciwciał wytworzonych zwykłymi metodami do użytku diagnostycznego lub leczniczego.
Środki lecznicze, które stosuje się do leczenia stanów chorobowych wyżej przedstawionych, zawierają leczniczo skuteczną ilość jednego, lub więcej niż jednego polipeptydu należącego do rodziny polipeptydów naczelnych podobnych do IL-3 wytwarzanych sposobem według wynalazku, w mieszaninie z farmaceutycznie dozwolonym nośnikiem. Środki te można systematycznie podawać pozajelitowo. Alternatywnie, środki te można podawać dożylnie. Jeżeli jest to pożądane, środki można podawać podskórnie. Przy podawaniu ciągłym środek leczniczy ma postać wolnego od pirogenów pozajelitowo dozwolonego roztworu wodnego. Otrzymywanie takiego pozajelitowo dozwolonego roztworu białka ze zwróceniem należytej uwagi na pH, izotoniczność, stabilność, itp. znajduje się w zakresie możliwości fachowca w tej dziedzinie techniki.
Reżim podawania związany ze sposobem leczenia wyżej opisanych stanów chorobowych może być ustalony przez lekarza leczącego przy uwzględnieniu rozmaitych czynników modyfikujących działanie leków, takich jak np. stan, waga ciała, płeć i dieta pacjenta, stopień ciężkości danego zakażenia, czas podawania i inne czynniki kliniczne. Ogólnie, reżim dzienny powinien obejmować zakres 200-1000//g polipeptydu do 50 do 5000 jednostek polipeptydu na kilogram wagi ciała (odnosi się to do jednostki odpowiadającej stężeniu polipeptydu wywołującemu pobudzenie, stanowiące połowę pobudzenia maksymalnego w standardowym teście na ludzkim szpiku kostnym).
Sposoby leczenia mogą także obejmować podawanie wspólne z innymi czynnikami ludzkimi. Lista (nie wykluczająca innych) pozostałych odpowiednich hematopoetyn, CSF i interleukin do jednoczesnego lub wspólnego podawania z polipeptydami wytwarzanymi sposobem według wynalazku obejmuje GM-CSF, CSF-1, G-CSF, Meg-CSF, erytropoetynę (EPO), IL-1, IL-4, IL-2, czynnik wzrostowy komórek B, czynnik różnicowania się komórek B i czynnik różnicowania się eozynofilów. Szczególne zainteresowanie może budzić połączenie IL-3 z IL-6 (znanym również w tej dziedzinie wiedzy jako czynnik 2 stymulujący komórki B) wykazujące zdolność w teście na ludzkich komórkach blastycznych do wywoływania namnażania się w koloniach ludzkich wczesnych komórek pnia. Oprócz tego, polipeptydy podobne do IL-3 można podawać łącznie, lub w połączeniu chemicznym z monoklonalnymi lub poliklonalnymi przeciwciałami w przypadku zastosowania leczniczego. Alternatywnie, te czynnki wzrostu można przyłączyć do pewnych toksyn, takich jak rycyna, w reżimie leczniczym. Dawkowanie w powyżej przytoczonych przypadkach powinno być przystosowane do uzupełnienia tych dodatkowych składników w środku leczniczym. Postęp w leczeniu pacjenta można kontrolować za pomocą okresowej oceny profilu hematologicznego, np. liczby białych ciałek itp.
Następujące przykłady objaśniająco opisują czynniki należące do nowej rodziny polipeptydów naczelnych podobnych do IL-3 oraz sposoby według wynalazku.
Przykład I. Wyodrębnienie genu gibbona kodującego czynnik podobny do IL-3.
Linię komórek T gibbona zakażonych wirusem białaczki małpiej (gibbona) UCD-144MLA, i dostępnych z National Institute of Health Laboratories indukuje się fitohemagłutyniną i mirystynianooctanem forbolu (PHA/PMA). Całkowity RNA otrzymuje się z tych komórek metodami J. M. Chirgwina i in., Biochem., 18, 5294 (1979). Poli A+ mRNA selekcjonuje się i frakcjonuje w gradiencie sacharozy 10% do 30%. W celu zidentyfikowania mRNA kodującego ten nowy czynnik hematopoetyczny, 16 próbek mRNA z linii komórkowej UCD-144-MLA frakcjonowanego w gradiencie sacharozy wprowadza się na drodze mikroiniekcji do oocytów Xenopus laevis i powstałe kondycjonowane podłoże bada pod względem zdolności do stymulowania namnażania się białaczkowych komórek blastycznych w obecności przeciwciała przeciw ludzkim GM-CSF jak przedstawiono w teście CML z przykładu V w poniższej części niniejsczego opisu. mRNA we frakcjach z gradientu sacharozy zidentyfikowany jako obejmujący przekaz polegający na kodowaniu aktyw12
159 183 nego czynnika wzrostu podobnego do IL-3, przeprowadza się w dwuniciowy cDNA metodą U. Gublera i B. J. Hoffmana, Gene, 25, 263 (1983).
Wektor ekspresyjny komórek COS, pXM, zawierający wzmacniacz SV40, główny promotor późny adenowirusa, sekwencję kodującą DHFR, miejsce dodawnia poli A późnego przekazu SV40 i gen Val przeprowadza się w postać liniową enzymem stanowiącym endonukleazę Xhol, działa na niego dużym fragmentem polimerazy DNA I w obecności dTTP i liguje z równomolowymi ilościami cDNA, przy końcowym stężeniu DNA 100pg/ml. Produkty ligacji utworzone w wyniku trawienia pXM z użyciem Xhol i wprowadzenia sekwencji cDNA zaadaptowanej Xhol stosuje się do transformowania E. coli szczep HB101, którą wysiewa się na płytki L+ Amp z wytworzeniem zbioru około 30· 103 kolonii. Można także użyć innych funkcjonalnie podobnych wektorów ekspresyjnych znanych w tej dziedzinie techniki, jako alternatywy wobec pXM.
Tworzy się repliki zbioru cDNA w pXM na filtrach celulozowych. Kolonie z każdego filtra zdrapuje się do bulionu L i wyodrębnia się plazmidowy DNA. Każdą próbkę DNA otrzymuje się z puli 200-300 kolonii bakteryjnych. DNA oczyszcza się metodą J. A. Meyersai in., J. Bacteriol., 127, 1529 (1976). Małpie komórki COS (ATCC CRL 1650) transfekuje się około 5pg plazmidowego DNA na 106 komórek COS na drodze transfekcji DNA z udziałem DEAE i traktuje chlorochiną zgodnie z metodami opisanymi przez G. G. Wonga i in., Science, 228, 810-815 (1985) oraz R. J. Kaufmana i in., Mol. Celi Biol., 2, 1304 (1982).
Po upływie 72 godzin od transfekcji zbiera się podłoże i bada w ludzkim teście CML, jak opisano w przykładzie V w poniższej części niniejszego opisu. Wyselekcjonowuje się jedną pulę kondycjonowanego podłoża z aktywnością stymulowania kolonizacji i aktywnością dotyczącą namnażania CML całkowicie oporną na neutralizującą surowicę odpornościową przeciw GMCSF, do dalszej analizy. Otrzymuje się plazmidowy DNA z indywidualnych kolonii pobranych z pierwotnej aktywnej puli i stosuje transfekcji w celu otrzymania kondycjonowanego podłoża, które to podłoże bada się pod względem aktywności CSF i namnażania CML. Wyodrębnia się pojedynczy klon odpowiedzialny za tę aktywność. Insert cDNA z tego klonu subklonuje się do M13 i poddaje analizie sekwencji metodą Sangera dotyczącą dideoksy-zakończenia łańcucha. (Patrz tabela 1).
Przykład II. Wyodrębnianie ludzkiego genu czynnika podobnego do IL-3.
Z użyciem sekwencji według tabeli 1 jako sondy, poddaje się screeningowi 1 · 1(0 klonów z ludzkiego zbioru genomowego (mieszanina po częściowym trawieniu Sau3AI ludzkiego DNA klonowanego do miejsca BamHI w wektorze λ JI) (J. J. Toole i in., jak wyżej). Identyfikuje się trzy łysinki zawierające sekwencje hybrydyzujące silnie z sondą cDNA. DNA z dwóch z tych trzech fagów trawi się całkowicie enzymem stanowiącym endonukleazę Sau3AI i subklonuje do miejsca BamHI do klonującego wektora mp9 bakteriofaga > Μ13. Subklony zawierające sekwencje egzonu identyfikuje się przez hybrydyzację z cDNA gibbona. Jeden subklon, ACSF-16 zawierający sekwencję ludzkiego genomowego DNA jako insert Bg 1II o około 10 kilodaltonach zdeponowano w ATCC jak opisano w powyższej części niniejszego opisu. Całkowitą sekwencję wszystkich egzonów genu ludzkiego określa się stosując analizę sekwencji DNA dotyczącą dideoksy-zakończenia łańcucha z użyciem baterii primerów oligonukleotydowych o sekwencjach przyjętych na podstawie sekwencj genu gibbona opisanej w przykładzie I w powyższej części niniejszego opisu. Ponieważ sekwencje nukleotydów egzonów z ludzkiego genu wykazują ponad 96% homologii z sekwencją cDNA gibbona, można zrekonstruować sekwencję nukleotydów odpowiedniego ludzkiego cDNA. Zmiany w sekwencjach nukleotydów w 11 kodonach powodują zmiany nukleotydów w polipeptydach z tych dwóch gatunków. (Patrz tabela 2).
Ludzką sekwencję genomową można wyciąć z Λ CSF-16 i wprowadzić do wektora ekspresyjnego. Liczne typy wektorów tego rodzaju są znane w tej dziedzinie techniki. Służą one do ekspresji ssaków, owadziej, drożdży, grzybów i bakteryjnej. I tak np., ludzką sekwencję genomową wycina się ze zdeponowanego bakteriofaga za pomocą trawienia endonukleazami Smal i Xhol, które rozszczepiają region ludzkiego genu przy nukleotydach, odpowiednio, 629 i 3183. Utworzony fragment o 2,5 kilozasady zawiera całkowite sekwencje ludzkiego genu polipeptydu podobnego do IL-3 i zawiera sekwencję „pokrewną TATAA w regionie promotorowym, jednak brakuje mu sekwencji „pokrewnych CAT“ i sygnału poliadenylacji przy końcu 3' genu. Koniec Smal tego fragmentu przekształca się w Xhol za pomocą handlowo dostępnej sekwencj łącznika. Fragment
159 183 ten subklonuje się standardowymi metodami biologii molekularnej [patrz np.: Y-C. Yang i in., Celi, 47, 3-10 (1986)], do strawionego Xhol plazmidowego wektora ekspresyjnego, pXM, z uzyskaniem plazmidu pY3.
Następnie amplifikuje się pY3 w bateriach i stosuje do transfekcji małpich komórek COS-1, gdzie gen ludzki ulega transkrypcji i RNA składaniu. Podłoża transfekowanych komórek dają wynik dodatni w badaniach aktywności biologicznej podobnej do wykazywanej przez IL-3 w teście na ludzkim szpiku kostnym i w teście CML jak to opisano w poniższej części niniejszego opisu. Hybrydyzacja metodą Northerna z sondą cDNA gibbona wskazuje na obecność pojedynczego mRNA o 1 kilozasadzie, który otrzymuje się z tych komórek i który ma tę samą wielkość co RNA otrzamany z limfocytów krwi obwodowej, jak opisano w poniższej części niniejszego opisu. cDNA syntetyzuje się na podstawie mRNA zwykłymi metodami i identyfikuje klon o aktywności CML. Z niego wyodrębnia się cDNA nowego czynnika wzrostu podobnego do IL-3.
Przykład III. Ludzki czynnik wzrostu podobny do IL-3.
Sekwencję cDNA według tabeli 2 kodującą ludzki polipeptyd podobny do IL-3 można także otrzymać sposobami innymi niz opisane w powyższym przykładzie II. I tak np. sekwencję według tabeli 2 można zsyntetyzować chemicznie metodami dobrze znanymi fachowcom w tej dziedzinie techniki. Jedna z tych metod syntezy chemicznej związana jest z rekonstrukcją genu gibbona kodującego IL-3, w celu zapewnienia sekwencji kodującej ludzki IL-3. Pierwsza różnica dotycząca aminokwasów między dojrzałymi postaciami białka IL-3 ludzkiego i gibbona występuje przy aminokwasie 82. Sekwencję kodującą IL-3 w genie gibbona od aminokwasu 82 do końca genu 3' można zastąpić chemicznie zsyntetyzowanymi sekwencjami DNA kodującymi ludzki L-3, dzięki czemu uzyskuje się funkcjonalny gen zdolny do wytwarzania ludzkiego IL-3 w odpowiednim układzie ekspresyjnym.
Można użyć dwóch pojedynczych miejsc restrykcyjnych w sekwencji gibbona do klonowania syntetycznych segmentów DNA: miejsca AsulI przy aminokwasie 73 i miejsca EcoRI przy aminokwasie 125. „Kasetę DNA do wprowadzania do genu gibbona syntetyzuje się od miejsca AsulI do miejsca EcoRI za pomocą dostarczenia na drodze enzymatycznej dupleksu DNA o około 160 parach zasad z dwóch oligonukleotydów, które są wzajemnie kompelmentarne w ponad 21 parach zasad. Kompletny duplex tworzy się za pomocą uzupełnienia komplementarnego regionu do końca oligonukleotydów z zastosowaniem trifosforanów deoksynukleozydów i fragmentu Klenowa polimerazy DNA I. Kompletny dupleks trawi się AsulI i/lub EcoRI w celu zapewnienia lepkich końców do następującego później klonowania.
Druga „kaseta syntetycznego DNA składa się z dwóch oligonukleotydów, kompelmentarnych wzajemnie w swojej długości, od miejsca EcoRI przy aminokwasie 125 do, włącznie, kodonu terminacyjnego następującego po aminowkasie 152 przy końcu genu. Te oligony konstruuje się z lepkim końcem EcoRI i odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi lub lepkimi końcami przy, albo bezpośrednio za kodonem terminacyjnym, a to w celu klonowania do różnych wektorów ekspresyjnych.
Syntetyzuje się dwa zessawy tych kaset, jeden do ekspresji u ssaków, a drugi do ekspresji bakteryjnej, odpowiednio do różnic między Procaryota a Eucaryota co do użyteczności dla nich kodonów, oraz występowania dubletów CpG w genach eukariotycznych w niewielkim rozmiarze i zachowania różnych miejsc restrykcyjnych do klonowania lub zapotrzebowania na nie. Te preferencje dotyczące kodonów znane są fachowcom w tej dziedzinie techniki. Patrz np. T. Maruyama i in., Nuci. Acids Res., 14, r 151 (1986). Przykładowe zmiany kodonów i lepkie końce dla tych kaset pokazane są w poniższej tabeli 3. Następnie kasety klonuje się do wektora pCSF-MLA w celu przeniesienia go do wektora niosącego gen kodujący ludzki czynnik podobny do IL-3. Utworzonego wektora używa się następnie do ekspresji czynnika ludzkiego.
159 183
Tabela 3 I. Zmiany kodonów
Aminokwas nr Ekspresja bakteryjna Ekspresja u ssaków
1 2 3
73 CGT
74 CGT
75 CCC
82 CGT
86 AGC
87 CTG CTG
88 CAA CAA
89 AAT
91 AGC
97 CTG CTG
100 CTG CTG
102 CGT
105 CCG
108 ACC ACA
109 GCT
111 CCG
112 ACC ACC
113 CGT AGG
115 CCG
120 GAT
127 CCC AGG
128 CGC
131 ACC ACC
137 CTG CTG
140 GCT GCT
143 CAG CAG
145 ACC ACC
146 ACC ACC
147 CTG CTG
152 TTC TTC
II. Zakończenia kaset
Kaseta nr Ekspresja bakteryjna
I 73 125
Arg Arg ... Glu Phe Arg
T CGT .. GAA TTC CGT
A GCA . ... CTT AAG GCA Ekspresja u ssaków
71 125
Asn Leu Arg Arg ... Glu Phe Arg
AAC CTT CGA AGG GAA TCC CGTC
TTG GAA GCT TCC ... CTT AGG GCAG Ekspresja bakteryjna
11 126 152
Phe Arg Phe
AA TTC CGC . ... TTC TGA AACTCGAGACTGCA
G GCG ..... AAG ATC TTGAGCTCTG Ekspresja u ssaków
II 126 152
Phe Arg Phe
AA TTC AGG ... TTC TAG AACTCGAGA
G TCC . AAG ATC TTGAGCTCTTTAA
Alternatywnie, otrzymanie sekwencji cDNA ludzkiego czynnika wzrostu podobnego do IL-3 może być związane z klonowaniem cDNA ze źródła tkankowego. Stosuje się sekwencję cDNA gibbona według tabeli 1 jako sondę, według: T. Maniatis i in., jak wyżej, i zidentyfikowane limfocyty krwi obwodowej jako ludzkie źródło do wyodrębniania mRNA kodującego ten ludzki polipeptyd podobny do IL-3. Poli A+ RN A otrzymuje się ze źródła stanowiącego limfocyty krwi obwodowej, przeprowadza w cDNA i klonuje jako albo fagowy, albo plazmidowy zbiór cDNA.
159 183
Ludzki zbiór cDNA można zidentyfikować przez hybrydyzację z sekwencją kodującą gibbona według tabeli 1 jako sondą DNA i przez ustalenie właściwości biologicznych jako podobnych do wykazywanych przez IL-3.
Dodatkowymi źródłami tkankowymi, które również można poddawać screeningowi pod względem cDNA kodującego ludzki polipeptyd podobny do IL-3, są takie źródła jak śledziona, wątroba, grasica, migdałki, nerka i inne świeże tkanki dostępne w wyniku biopsji, albo trupie. Specjalne zainteresowanie budzą przypadki w których za zwiększoną ilość komórek hematopoetycznych może być odpowiedzialny nowotwór, takie jak białaczka. Dodatkowymi źródłami są linie komórkowe zdeponowane do powszechnego użytku w instytucjach do tego powołanych, np. ATCC, albo dostępne w agencjach rządowych lub z pewnych źródeł prywatnych. Do przykładowych linii komórkowych należą linie transformowanych komórek T i B, oraz linie komórek pochodzenia niehematopoetycznego, ale wytwarzających homatopoetyny.
W celu ekspresji tego ludzkiego polipeptydu podobnego do IL-3 przenosi się kodujący go cDNA do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, np. pCD lub pXM i wprowadza do wybranych komórek-gospodarzy zwykłymi metodami inżynierii genetycznej, jak opisano w powyższej części niniejszego opisu. Jednym z układów ekspresyjnych ssaków dla biologicznie aktywnego, rekombinantowego, ludzkiego polipeptydu podobnego do IL-3, są stabilnie transformowane komórki CHO. Tym niemniej, aktywny polipeptyd może być wytworzony, wewnątrzkomórkowo lub zewnątrzkomórkowo, przez E. coli i inne bakterie. Można też zastosować komórki drożdży lub owadzie jako układy ekspresyjne, jak to opisano w poniższym przykładzie IV.
Innym alternatywnym sposobem ekspresji tego ludzkiego polipeptydu podobnego do IL-3 jest zastosowanie fragmentu Bg III z ACSF-16, zawierającego kompletny gen z ludzkiego genomu, do skonstruowania linii komórkowych ssaków przeprowadzających ekspresję polipeptydu, np. sposobem opisanym w PCT Wo85/20610 odnośnie do ludzkiej erytropoetyny. Oprócz tego, ten gen z ludzkiego genomu można skonstruować z odpowiednim promotorem i sygnałami przetwarzania do ekspresji w pewnych innych układach heterologicznych, np. z promotorami owadzimi w celu otrzymania linii komórek owadzich w hodowli. Podobnie, tego genu z genomu można użyć do ekspresji w drożdżach lub innych eukariotycznych układach komórkowych.
Przykład IV. Ekspresja czynników wzrostu podobnych do IL-3.
Konstrukcji plazmidu pCSF-MLA dokonuje się w prosty sposób przez wprowadzenie sekwencji gibbona według tabeli 1 do pXM strawionego Xhol jak opisano w powyższej części niniejszego opisu. Plazmid z sekwencją ludzką, pSHIL-3-1, konstruuje się syntetycznie w celu ekspresji u ssaków, jak to opisano w powyższym przykładzie III. Inny plazmid, pY3, wytwarza się sposobem opisanym w powyższej części niniejszego opisu. Każdy z tych plazmidów niosących DNA kodujący czynnik wzrostu naczelnych podobny do IL-3 stosowany jest następnie do transformowania zwykłymi metodami wybranych komórek-gospodarzy dla ekspresji polipeptydu.
A. Ekspresja w komórkach ssaków. W cclu uzyskanńa ekspresjj ccynmków podobnych do IL-3 do użycia w badaniach poniżej opisanych, transfekuje się pSHIL-3-1 i pCSF-MLA komórki COS. Kondycjonowane podłoże transfekowanych komórek COS wykazuje aktywność czynnika wzrostu na wysokim poziomie, jak to opisano.
Przedstawione w niniejszym opisie wektory ekspresyjne dla komórek ssaków można syntetyzować metodami dobrze znanymi fachowcom w tej dziedzinie techniki. Składniki tych wektorów, takie jak np. replikony, geny selekcyjne, wzmacniacze, promotory itp. można otrzymać ze źródeł naturalnych lub zsyntetyzować metodami znanymi. Patrz: Kaufman i in., J. Mol. Biol., 159, 511-521 (1982), oraz Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,689-693(1985). Do przykładowych komórek ssaków jako gospodarzy należą w szczególności linie komórek naczelnych i linie komórek gryzoni, w tym linie komórek transformowanych. Odpowiednie są także normalne komórki diploidalne, szczepy komórek otrzymane z hodowli pierwotnej tkanki in vitro, jak również pierwotne eksplanty. Kandydujące komórki nie muszą być genowo deficytowe w genie selekcyjnym w takim zakresie, w jakim gen selekcyjny działa w sposób dominujący. W celu stabilnej integracji wektorowego DNA i następnie amplifikacji zintegrowanego wektorowego DNA, można zastosować komórki CHO i użyć, tak do integracji, jak i do amplifikacji, zwykłych metod. Alternatywnie, wektorowy DNA może obejmować całość lub część genomu wirusa brodawczakowatości bydła
159 183 [Lusky i in., Celi, 36, 391-401 (1984)] i może być niesiony jako stabilny element episomalny przez linie komórkowe, takie jak linia komórek mysich C127. Do innych odpowiednich linii komórek ssaków należą, ale nie tylko one, HeLa, komórki małpie COS-1, mysie komórki L-929, linie 3T3 otrzymane z myszy Swiss, Balb-c lub NIH, linie komórek chomika BHK lub HaK.
Stabilne transformanty poddaje się następnie screeningowi pod względem ekspresji produktu zwykłymi testami immunologicznymi lub enzymatycznymi. Obecność DNA kodującego białka wariantowe można wykryć zwykłymi metodami, takimi jak hybrydyzacja metodą Southerna. Przejściową ekspresją DNA kodującego warianty podczas kilku dni po wprowadzeniu DNA wektora ekspresyjnego do odpowiednich komórek-gospodarzy, takich jak małpie komórki COS-1, ocenia się bez selekcji za pomocą badań aktywności lub immunologicznych białek w podłożu hodowli.
Fachowiec w tej dziedzinie techniki może łatwo skonstruować inne wektory ekspersyjne ssaków porównywalne z pCSF-MLA i pSHJL-3-1 przez np. wycięcie Xhol sekwencji DNA według tabeli 1 lub tabeli 2 z odpowiednich plazmidów i zastosowanie dobrze znanych rekombinantowych metod inżynierii genetycznej i innych znanych wektorów, takich jak pJL3 i pJL4 [Gough i in., EMBO J., 4, 645-653 (1985)] oraz pMT2 (zaczynając od pMT2-VWF, ATCC nr 67 122, patrz zgłoszenie patentowe PCT nr PCT/UJS87/00033). Transformacja tymi wektorami odpowiednich komórek-gospodarzy może wywołać ekspresję czynników wzrostu podobnych do IL-3.
B. Bakteryjne układy ekspresyjne. Podobnie, fachowiec w uj dziedzinie techmki może mampulować sekwencjami według tabel 1 i 2 przez eliminację lub zastąpienie sekwencji regulatorowych ssaków flankujących sekwencje kodujące sekwencjam- bakteryjnymi, w celu wytworzenia wektorów bakteryjnych do wewnątrzkomórkowej lub zewnątrzkomórkowej ekspresji czynników podobnych do IL-3, wytwarzanych sposobem według wynalazku, przez komórki bakteryjne. DNA kodujący czynnik można dalej zmodyfikować, jak opisano w powyższym przykładzie III, aby zawierał inne kodony, do ekspresji bakteryjnej, jak to jest znane w tej dziedzinie techniki. Korzystnie sekwencja jest operatywnie połączona·, w ramie, z sekwencją nukleotydów kodującą lider wydzielniczy polipeptydu pozwalający na ekspresję bakteryjną, wydzielanie i przetwarzanie dojrzałego wariantu białka, jak to również jest znane w tej dziedzinie techniki. Związki powstające w wyniku ekspresji w komórkach bakteryjnych jako gospodarzach, można następnie odzyskać, oczyścić i/lub scharakteryzować w odniesieniu do fizykochemicznych, biochemicznych i klinicznych parametrów, w każdym przypadku metodami znanymi.
W celu skonstruowania takiego bakteryjnego wektora do ekspresji bakteryjnej, konstruuje się częściowo syntetyczną sekwencję DNA ludzkiego polipeptydu podobnego do IL-3, wychodząc z cDNA gibbona i syntetycznych kaset bakteryjnych opisanych w powyższym przykładzie III. Sekwencję tę umieszcza się w wektorze pa 1183 strawionym Nde e/XbaI, który zdeponowany jest w ATCC pod numerem rejestracyjnym 40134. Powstałym wektorem pPLHIL-3-181 transfekuje się E. coli GL400 i prowadzi się hodowlę w warunkach opisanych dla GM-CSF w opublikowanym zgłoszeniu patentowym PCT nr 86/00639.
Czynnik podobny do IL-3 jest w E. coli tworzony jako nierozpuszczalne ciałka inkulzyjne. W celu solubilizowania ich i otrzymania z nich białka, stosuje się następujący sposób postępowania. Około 50 g komórek jako zamrożoną pastę zawiesza się ponownie w 120 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5,' 0,1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i 2mM ditiotreitolu (DDT) (bufor A). Komórki rozbija się za pomocą przepuszczenia przez prasę (French press) lub zawór (Matin Gaulin valve) pod ciśnieniem 68947 kPa lub wyższym. Następnie rozbite komórki odwirowuje się przy 20000 Xg w ciągu 30 minut w celu osadzenia komórkowego debris, zawierającego ciałka inkluzyjne.
Otrzymany osad ponownie zawiesza się w 55% sacharozie w buforze A z przepuszczeniem przez prasę (French press) i ponownie wiruje przy 30000 X g w ciągu 30 minut. Osad zawierający ciałka inkluzyjne z czynnikiem podobnym do IL-3 ponownie zawiesza się w 55% sacharozie w buforze A i nawarstwia na gradiencie stopniowym z 60, 65 i 70% sacharozy. Następnie gradient poddaje się wirowaniu przy 150000 X g w ciągu 2 godzin. Ciałka inkluzyjne z czynnikiem podobnym do IL-3 osiadają w 65% warstwie, którą się zbiera.
159 183
W celu rekonstytucji i ponownego sfałdowania czynnika podobnego do IL-3 o czystości w przybliżeniu około 80%, omawiane ciałka inkluzyjne zawiesza się ponownie w 8 M moczniku przy 2-3 mg białka/ml roztworu mocznika. Roztwór mocznika zawierający białko rozcieńcza się 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM PMSF, 2mM DTT i 0,1 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) (bufor B) do końcowego stężenia mocznika 3 M (w którym to roztworze stężenie IL-3 wynosi w przybliżeniu 1 yg/ml). Do tego roztworu zawierającego mocznik dodaje się bufor redukująco-utleniający zawierający 6mM zredukowany glutation i 6mM utleniony glutation i całość inkubuje się w ciągu 2 godzin w temperaturze 20°C. Roztwór, 3 M pod względem mocznika, ' poddaje się przez noc dializie wobec buforu B w celu usunięcia mocznika. Roztwór białka IL-3 odwirowuje się następnie w celu usunięcia jakiegokolwiek strątu. W tym stadium czynnik podobny do IL-3 jest ponownie sfałdowany, a jego czystość wynosi około 85%.
Ponownie sfałdowany czynnik podobny do IL-3 dializuje się znów wobec 50 mM buforu MES o pH 6,0, zawierającego 0,1 mM EDTA i nanosi na kolumnę z DEAE-Sepharose zrównoważoną tym samym buforem. Czynnik podobny do IL-3 odpowiada, w płynie przepływającym przez DEAE-Sepharose około 99% czytości. W stadium tym usuwane są też wszystkie pirogeny. pH IL-3 z płynu przepływającego przez DEAE-Sepharose doprowadza się do 5,0 za pomocą 200 mM buforu zawierającego octan sodowy o pH 4,0. Czynnik podobny do IL-3 nanosi się na kolumnę z suIfonylopropylo-Sepharose, gdzie wiąże się on z SP-Sepharose i zostaje eluowany buforem zawierającym octan sodowy. W tym stadium czystość i sfałdowanie czynnika podobnego do IL-3 jest prawidłowa. W teście CML ten ludzki czynnik podobny do IL-3 wykazuje aktywność właściwą 1do 3· 107jednostek CML/^g.
Podobnie, sekwencję kodującą według tabeli 1 lub tabeli 2 można wyciąć Xhol z pCSF-MLA lub pSHIL-3-1 i dalej nią manipulować, np. ligować z innymi znanymi łącznikami, albo zmodyfikować przez delecję z niej sekwencji niekodujących, względnie przeprowadzenie w niej zmian nukleotydów innymi znanymi metodami. Zmodyfikowaną sekwencję kodującą polipeptyd podobny do IL-3 można następnie wprowadzić do znanego wektora bakteryjnego stosując metody takie jak opisali T. Taniguchi i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5230-5233 (1980). Takim przykładowym wektorem bakteryjnym można następnie transformować bakteryjne komórkigospodarze, doprowadzając przez to do ekspresji czynnika podobnego do IL-3. Co do strategii doprowadzania do zewnątrzkomórkowej ekspresji czynników podobnych do IL-3 w komórkach bakteryjnych patrz np. zgłoszenie patentu europejskiego nr EPA 177 343.
C. Ekspresja w komórkach owadzich. Podobne manipulacje można przeprowadzić w celu konstrukcji wektora owadziego (patrz np. sposoby opisane w opublikowanym zgłoszeniu patentu europejskiego nr 155 476) do ekspresji w komórkach owadzich. Można skonstruować także wektor drożdżowy, stosując sekwencje regulatorowe drożdży, do wewnątrzkomórkowej lub zewnątrzkomórkowej ekspresji białek wytwarzanych sposobem według wynalazku w komórkach drożdży. Patrz np. sposoby opisane w opublikowanym zgłoszeniu patentowym PCT nr WO 8 600 639 oraz w zgłoszeniu patentu europejskiego nr EP 123 289.
Przykład V. Konstrukcja linii komórek CHO wykazujących na wysokim poziomie ekspresję czynnika wzrostu naczelnych podobnego do IL-3.
Sposób wytwarzania na wysokim poziomie polipeptydów należących do nowej rodziny polipeptydów naczelnych podobnych do IL-3, których dotyczy niniejszy wynalazek, w komórkach ssaków, polega na konstrukcji komórek zawierających liczne kopie heterologicznego genu polipeptydu podobnego do IL-3. Heterologiczny gen może być połączony ze zdolnym do amplifikacji markerem, takim jak np. gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR). W oparciu o ten marker można wyselekcjonować komórki zawierające zwiększoną ilość kopii genu do namnażania się przy zwiększających się stężeniach methotrexate (ΜΤΧ) metodą Kaufmana i Sharpa, J. Mol. Biol. (1982), jak wyżej.
Tego rodzaju podejście do zagadnienia można przyjąć w odniesieniu do szeregu rozmaitych typów komórek. I tak np., pY3 zawiera ludzki gen polipeptydu podobnego do IL-3 w operatywnym połączeniu z innymi sekwencjami plazmidowymi umożliwiającymi jego ekspresję. pY3 i plazmid ekspresyjny DHFR pAdA26SV(A)3 [Kaufman i Sharp, Mol. Cell Biol., 3 (9), 1598-1608 (1983)] można wspólnie wprowadzić do komórek COS deficytowych pod względem DHFR, DUKX-BII, za pomocą koprecypitacji fosforanem wapnia i transfekcji. Alternatywnie, gen można wprowadzić
159 183 do pMT2 jak poprzednio wspomniano i utworzonego wektora użyć zamiast pY3 i pAdA26SV(A)3. Transformanty wykazujące ekspresję DHFR selekcjonuje się pod względem wzrostu w podłożach a z dializowaną płodową surowicą cielęcą, a następnie sełekcjonuje się w związku z amplifikacją przez wzrost przy zwiększających się stężeniach ΜΤΧ (kolejne stadia w 0,02,0,2,1,0 i 5 μΜ ΜΤΧ), jak to opisali Kaufman i in., Mol. Celi Biol., 5, 1750 (1983). Transformanty klonuje się i ekspresję biologicznie aktywnego polipeptydu podobnego do IL-3 kontroluje w testach CML. Ekspresja polipeptydu podobnego do IL-3 powinna wzrastać ze wzrastającym poziomem oporności na ΜΤΧ. Podobne sposoby postępowania można następnie wykorzystać do wytworzenia innych należących do tej rodziny polipeptydów podobnych do IL-3, włącznie zpolipeptydami gibbona podobnymi do IL-3.
Przykład VI. Aktywność biologiczna różnego rodzaju wykazywana przez polipeptyd podobny do IL-3.
Następujące badania przeprowadza się z użyciem zarówno polipeptydu gibbona jak i polipeptydu ludzkiego jako reprezentatywnych polipeptydów należących do nowej rodziny polipeptydów naczelnych, podobnych do IL-3, wytworzonych sposobem według wynalazku. Tym niemniej, inne polipeptydy należące do tej rodziny wykazują właściwości biologiczne podobne do wykazywanych przez IL-3 w takich samych lub innych badaniach, w zależności od ilości właściwości biologicznych podobnych do wykazywanych przez IL-3, a przejawianych przez indywidualny polipeptyd.
A. Test CML. Test CML przeprowadza się zasadniczo zgodnie z metodami opisanymi w Blood, 63 (4), 904-111 (1984). Wyjściową zawiesinę komórek otrzymuje się z zamrożonej próbki krwi obwodowej pacjenta w fazie stałej. Próbkę tę rozmraża się, po czym ponownie zamraża w postaci 500 próbek z 15 - 10e komórek/fiolkę. Komórek tych, „CML 8-3“ używa się do badania aktywności podobnej do wykazywanej przez IL-3, a przejawianej przez polipeptydy podobne do IL-3. Jedną fiolkę rozmraża się szybko w temperaturze 37°C w dniu poprzedzającym dzień uruchomienia eksperymentu. Następnie zawartość fiolki przenosi się do 15 ml probówki i przemywa dwukrotnie 5% ludzką surowicą AB (Hi) w RPMI (GIBCO, RPMI 1640) [HAB/RPMI]. Komórki inkubuje się przez noc w 5% HiHAB/RPMI przy 5% CO2, w temperaturze 37°C. Następnego dnia komórki wyodrębnia się z hodowli, dodaje do nich Ficoll, przemywa, ponownie liczy i odstawia.
Do każdego dołka płytki do mikromiareczkowania dodaje się 100μ1 10% podłoża HIFCS2/RPMI zawierającego materiał, który ma być analizowany. Komórki przygotowane tak jak wyżej osadza się i ponownie zawiesza w 10% HIFCS/RPMI w stężeniu 1,3-2-105 komórek/μΙ. Do każdego dołka dodaje się 100 μΐ komórek i inkubuje w obecności, lub nieobecności, przeciwciał przeciw ludzkiemu GMCSF w temperaturze 37°C w 5% CO2, w ciągu 48 lub 72 godzin. Następnie dodaje się 0,5 μθ 3H-tymidyny na dołek i prowadzi inkubację w ciągu 6 godzin w temperaturze 37°C. Komórki zbiera się przy użyciu rozgałęzionego urządzenia filtracyjnego na bibułę GFC typu C (Schleicher-Schuller), przemywa roztworem soli buforowanym fosforanami i suszy. Następnie filtry zanurza się w płynie do scyntylacji i poddaje zliczaniu pod względem pobrania 3H.
W oparciu o pomiary pobrania tymidyny, uważa się zarówno pochodzący od gibbona czynnik wzrostu podobny do IL-3, jak i ludzki czynnik wzrostu podobny do IL-3, za aktywne w tym teście stymulowania namnażania się białaczkowych komórek blastycznych.
B. Testy na szpiku kostnym. Testy na ludzkim szpiku kostnym, przy stosowaniu nieprzyczepnych komórek szpiku kostnego, prowadzi się tak, jak to opisali G. G. Wongiin, wyżej. Kondycjonowane podłoża, dla czynników zarówno gibbona jak i ludzkiego, wykazują, jak stwierdzono, aktywność w tym teście, dając małe kolonie z linii oczywistego typu granulocytowego. Po morfologicznym badaniu zabarwionych hodowli agarowych stwierdzono również tworzenie kolonii makrofagów, granulocytów-makrofagów i eozynofilów. Gdy test przeprowadza się w obecności erytropoetyny, zdolność kondycjonowanego podłoża do podtrzymywania wzrostu erytroidalnych komórek pierwotnych wykazuje się za pomocą tworzenia kolonii erytrocytów. Gdy porównuje się w teście na ludzkim szpiku kostnym GM-CSF z polipeptydem podobnym do IL-3, polipeptyd podobny do IL-3 podtrzymuje tworzenie większej ilości kolonii niż GM-CSF, kiedy obydwa polipeptydy znajdują się w obecności erytropoetyny. Większość kolonii podtrzymywanych przez GM-CSF są to kolonie pojedynczych linii, podczas gdy polipeptyd wytworzony sposobem według
159 183 wynalazku podtrzymuje tworzenie kolonii różnych linii. Podobnie, w teście tworzenia kolonii na komórkach blastycznych, polipeptydy podobne do IL-3 tworzą większą ilość kolonii komórek blastycznych różnych linii. GM-CSF w tym samym teście tworzy bardzo niewiele kolonii wtórnych.
C. Test na komórkach KG-1. Test KG-1 przeprowadza się tak, jak to opisali G. G. Wongi in., wyżej. Polipeptyd gibbona podobny do IL-3 należący do nowej rodziny czynników wzrostu naczelnych podobnych do IL-3, wytwarzany sposobem według wynalazku, był w tym teście aktywny.
D. Testy różne. W teście cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał, polipeptyd podobny do IL-3 wytworzony sposobem według wynalazku stymulował w sposób zależny od dawki eozynofile, tak, aby zabijały one nowotworowe komórki docelowe pokryte przeciwciałami. Polipeptyd dodatkowo stymulował eozynofile do fagocytozy opsonizowanych surowicą drożdży piekarnicznych i to na drodze bezpośredniego stymulowania tworzenia anionu nadtlenkowego przez eozynofile. W badaniach wstępnych, w których czynniki wytwarzane sposobem według wynalazku podobne do IL-3 podaje się zdrowym małpom w infuzji i oblicza ilość białych ciałek krwi, zaobserwowano powtarzalny wzrost zarówno ilości płytek krwi jak i eozynofilów. Te wstępne wyniki zaobserwowano tak dla ludzkiego czynnego podobnego do IL-3, jak i dla pochodzącego od gibbona czynnika podobnego do IL-3.
Przykład VII. Oczyszczanie polipeptydu podobnego do IL-3 z podłoża kondycjonowanego komórkami COS.
Następujące sposoby postępowania stosowane są obecnie w celu otrzymania jednorodnego białka podobnego do IL-3 z komórek COS, jak opisano w powyższym przykładzie IV.
A. Wymiana jonowa. Podłoża kondycjonowane komórkami COS (DMEM, 0,5% FBS w butlach obrotowych, przy całkowitym stężeniu białka 2^0m(^ml) zawierają ludzki polipeptyd podobny do IL-3 w stężeniu około 2-3pg/ml. Podłoża rozcieńcza się wodą do przewodności właściwej poniżej 8,0 ms/cm2. Ładunek jonitu (QAE Zeta Prep) równoważy się w temperaturze 4°C z użyciem około 500 ml 0,1 M Trsi-Cl, pH 8,0, a następnie 2 litrów 40 mM Tris-Cl, pH 7,4. Podłoża nanosi się z szybkością 40 ml/min, a następnie zbiera frakcję niezwiązaną. Ładunek przemywa się 40 mM Tris-Cl aż do ustania wymywania materiału aktywnego. Frakcję niezwiązaną zatęża się przy użyciu urządzenia do diafiltracji z membraną (Amicon YM-10).
B. Kolumna z lektyną z soczewicy. Kolumnę z lektyną z soczewicy równoważy się 20 mM Tris, pH 7,4, 0 ,05% Tween-20, w temperaturze 4°C (bufor I), a następnie poddaje nanoszeniu przy I objętości kolumny na godzinę. Kolumnę przemywa się buforem I w celu usunięcia niespecyficznie związanego białka, a następnie związane białko eluuje się buforem I z 0,2 M σ-metylomannopiranozydem. Zbiera się wyeluowane frakcje.
C. HPLC z odwróconymi fazami. Powyższy preparat polipeptydu podobnego do IL-3 poddaje się HPLC z odwróconymi fazami w temperaturze pokojowej jak poniżej opisano. Preparat polipeptydu podobnego do IL-3 wstrzykuje się na kolumnę RP HPLC (C4 Vydac) zrównoważoną I00% buforem A. Bufor A stanowi 0,1% kwas trifluorooctowy (TFA) w wodzie, a bufor B 0,I% TFA w 95% acetonitrylu. Gradient odpowiada 0,2%/minutę od 45 do 70% buforu B. Frakcje zebrane w tym gradiencie odpowiadają 46,8% do 47,5% buforu B. Frakcje poddaje się odpędzaniu pod zmniejszonym ciśnieniem w celu usunięcia aceeonitrylu. W drugim stadium HPLC z odwróconymi fazami bufor A stanowi 0,15% kwas heptafluoromasłowy (HFBA) w wodzie i 0,15% HFBA w 95% ac^eoi^iitrylu. Gradient odpowiada 0,2%/minutę od 45 do 70% buforu B. Frakcje zebrane w tym stadium odpowiadają 49-51% buforu B. Frakcje te eluowane z HPLC były wolne od pirogenów.
Przykład VIII. Analizy polipeptydów podobnych do IL-3.
A. SDS-PAGE. Według metody R. J. Kaufmana i P. A. Sharpa, [J. Mol. Biol., 159, 601^621 (1982)] 35S-metionina zostaje włączona do polipeptydów wytworzonych przez komórki COS transfekowane pCSFM-MLA i komórki COS transfekowane pY3. Elektroforeza w żelu SDSpoliakryloamidowym (warunki redukujące) [U. K. Laemmli, Naturę, 227,680-685 (1970)] znakowanych białek wydzielonych przez transfekowane komórki COS-1 ujawniła rozdział polipeptydów o pozornej masie cząsteczkowej w zakresie 14-35 kilodaltonów, tak dla czynnika gibbona jak i ludzkiego. Rozdziału takiego nie było w przypadku nie poddanej transfekcji próbki kontrolnej. Bardziej szczegółowo, ludzki czynnik podobny do IL-3 wytworzony przez CHO ujawnił rozdział w zakresie 21-32 kilodaltonów, co można objaśnić wyższym stopniem glikozylacji w stosunku do czynnika ludzkiego, wytworzonego przez komórki COS, wykazującego rozdział głównie w zakresie 21-28 kilodaltonów.
W wyniku barwienia srebrowego po oczyszczeniu metodami według przykładu VI ujawniły się dwa główne pasma o średniej masie cząsteczkowej 21000 i 25000 w równych w przybliżeniu ilościach w przypadku obu czynników. Różnice między dwoma pasmami przypisuje się obecnie różnicom w N-glikozylacji.
B. Ogniskowanie izoelektryczne. Proste ogniskowanie izoelektryczne polipeptydów oczyszczonych sposobem według powyższego przykładu VII ujawnia cztery rodzaje tak dla polipeptydów gibbona jak i ludzkich, w zakresie wartości Pi od pH 6,0 do pH 7,6.
C. Suprose 6 - szybka chfomatogrfia cieczowa białek. Oczyszczone frakcje z HPLC przenosi się na kolumnę do sączenia żelowego (Superose 6) w 20 mMTris, pH 7,4,200 mMNaCl i 0,05% M Tween-20. Rozdział na kolumnie ujawnia jeden ostry pik o pozornej masie cząsteczkowej 43 kilodaltonów dla obydwu czynników.
D. Aktywność właściwa w teście CML. Aktywność właściwa przykładowego czynnika gibbona podobnego do IL-3 w teście CML opisanym powyżej znajduje się w zakresie 2 · 10e - 1· 107 jednostek rozcieńczeniowych/mg polipeptydu, ze średnią 8 · 10e jednostek rozczeńczeniowych/mg. Stwierdzono, że wytworzony przez bakterie polipeptyd ludzki opisany w powyższym przykładzie IV (B) wykazuje aktywność właściwą 1-3 · 107jednostek rozcieńczernowych/mg polipeptydu. Ludzki czynnik podobny do IL-3 wytworzony przez komórki CHO wykazuje w powyższym teście aktywność właściwą około 2-3 · 10e jednostek/mg białka. Ludzki czynnik podobny do IL-3 wytworzony przez komórki COS wykazuje aktywność właściwą około 1-20· 107 jednostek/mg. Jednostkę rozcieńczeniową (lub jednostkę CML) definiuje się jako rozcieńczenie czynnika dające połowę maksymalnej stymulacji w teście CML.
E. Analiza N-końcowa. Analizę N-końcowej sekwencji polipeptydu gibbona przeprowadza się za pomocą automatycznej degradacji Edmana, która wykazała poziom czystości cennika 98%.
F. Działanie N-glikanazą. Na czynniki: gibbona i ludzki wytworzone przez komórki COS działa się enzymem N-glikanazą, który trawi N-związane ugrupowania węglowodanowe. Wykazano, że każdy z czynników został tą metodą oczyszczony. Rozmazany rozdział 14-35 kilodaltonów dla każdego czynnika w żelu został zredukowany do pojedynczego pasma odpowiadającego 15 kilodaltonom dla czynnika gibbona i 20,5 kilodaltona dla czynnika ludzkiego.
Przewiduje się, że fachowcom po rozważeniu powyższych opisów korzystnych sposobów realizacji niniejszego wynalazku przyjdą na myśl liczne modyfikacje i warianty jego praktycznego zastosowania. Przyjmuje się, że te modyfikacje i warianty objęte są zakresem załączonych zastrzeżeń.
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims (11)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania polipeptydu podobnego do polipeptydu naczelnych IL-3 zasadniczo wolnego od połączeń z innymi polipeptydami naczelnych, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę linii komórkowej stransformowanej wektorem zawierającym sekwencję DNA kodującą ten polipeptyd, który ma sekwencję aminokwasów taką samą lub zasadniczo taką samą jak sekwencja przedstawiona w tabeli 1 lub w tabeli 2 i wykazuje co najmniej jedną właściwość biologiczną podobną do wykazywanych przez polipeptyd naczelnych IL-3.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę linii komórkowej stransformowanej wektorem zawierającym sekwencję cDNA kodującą to białko, które ma sekwencję aminokwasów zasadniczo taką samą jak sekwencja przedstawiona w tabeli 1 i wykazuje co najmniej jedną właściwość biologiczną podobną do wykazywanych przez białko naczelnych IL-3.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę linii komórkowej stransformowanej wektorem zawierającym sekwencję cDNA kodującą ten polipeptyd, który charakteryzuje:
    a) sekwencja aminokwasów zasadniczo taka sama jak przedstawiona jak w tabeli 1, b) pozorna masa cząsteczkowa w zakresie pomiędzy około 14 do około 35 kilodaltonów, oznaczona za pomocą redukującej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS, c) zdolność do stymulacji procesu tworzenia się małych kolonii typu granulocytów w standardowym teście na ludzkim szpiku kostnym w stężeniach 10-100 pikomoli, d) zdolność do stymulowania procesu proliferacji komórek CML w teście CML w stężeniach 10-100 pikomoli.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę linii komórkowej stransformowanej wektorem zawierającym sekwencję cDNA, wybraną z grupy składającej się z (i) sekwencji DNA według tabeli 1, (ii) sekwencji DNA, które hybrydyzują w ostrych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA według tabeli 1 i które kodują ekspresję białka o aktywności hematopoetycznej, (iii) sekwencji DNA, które kodują ekspresję białka kodowanego przez sekwencję DNA określone w (i) i (ii).
  5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę linii komórkowej stransformowanej wektorem zawierającym sekwencję cDNA kodującą ten polipeptyd, który charakteryzuje a) sekwencja aminokwasów zasadniczo jak przedstawiona w tabeli 1 i kodowana przez sekwencję DNA wybraną z grupy składającej się z (i) sekwencji DNA weług tabeli 1, (ii) sekwencji DNA, które hybrydyzują w ostrych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA według tabeli 1 i które kodują ekspresję białka o aktywności hematopoetycznej, (iii) s^lkwei^<^ji DNA, które kodują ekspresję białka kodowanego przez sekwencje DNA określone w (i) i (ii), b) pozorna masa cząsteczkowa w zakresie pomiędzy około 14 do około 35 kilodaltonów, oznaczona za pomocą redukującej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS, c) zdolność do stymulacji procesu tworzenia się małych kolonii typu granulocytów w standardowym teście na ludzkim szpiku kostnym w stężeniach 10-100 pikomoli, d) zdolność do stymulowania procesu proliferacji komórek CML w teście CML w stężeniach 10-100 pikomoli.
  6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę linii komórkowej stransformowanej wektorem zawierającym sekwencję DNA kodującą ekspresję polipeptydu naczelnych wykazującego co najmniej jedną właściwość biologiczną podobną do właściwości IL-3, przy czym sekwencja nukleotydów w kierunku 5' do 3' jest wybrana z grupy składającej się z sekwencji DNA według tabeli 1, sekwencji DNA według tabeli 2, sekwencji DNA, która hybrydyzuje w ostrych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA według tabeli 1 lub 2, sekwencji DNA, która hybrydyzuje z sekwencją według tabeli 1 lub 2 i która koduje ekspresję białka wykazującego co najmniej jedną właściwość biologiczną podobną do właściwości IL-3 i ich allelicznych wariacji.
  7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę linii komórkowej stransformowanej wektorem zawierającym sekwencję DNA kodującą ekspresję polipeptydu
    159 183 naczelnych, który charakteryzuje a) sekwencja aminokwasów zasadniczo taka sama jak przedstawiona w tabeli 1 lub 2 i kodowana przez sekwencję DNA wybraną z grupy składającej się z (i) sekwencji DNA według tabeli 1, (ii) sekwencji DNA według tabeli 2, (iii) sekwencji DNA, która hybrydyzuje w ostrych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA według tabeli 1 lub 2, (v) sekwencja DNA, która koduje ekspresję polipeptydu kodowanego przez sekwencje DNA określone w (i), (ii) oraz (iii) i b) co najmniej jedna właściwość biologiczna podobna do właściwości IL-3.
  8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę linii komórkowej stransformowanej wektorem zawierającym sekwencję DNA kodującą ekspresję polipeptydu naczelnych wykazującego co najmniej jedną właściwość biologiczną podobną do właściwości IL-3, wybraną z grupy obejmującej a) pozorną masę cząsteczkową w zakresie od około 14 do około 35 kilodaltonów, oznaczoną za pomocą redukującej elektroforezy w żelu SDS-poliakryloamidowym,
    b) zdolność do stymulowania procesu tworzenia się licznych typów kolonii hematopoetycznych należących do różnych rodów w standardowym teście na ludzkim szpiku kostnym, w 10-100 stężeniu pikomolowym, c) zdolność do stymulowania procesu proliferacji komórek CML w teście CML w 10-100 stężeniu pikomolowym.
  9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę linii komórkowej stransformowanej wektorem zawierającym sekwencję DNA kodującą polipeptyd zasadniczo wolny od połączeń z innymi polipeptydami naczelnych, który charakteryzuje: a) sekwencja aminokwasów zasadniczo taka sama jak przedstawiona w tabeli 1 lub 2 i kodowana przez sekwencję DNA wybraną z grupy składającej się z (i) sekwencji DNA według tabeli 1, (ii) sekwencji DNA tabeli 2, (iii) sekwencj DNA, która hybrydyzuje w ostrych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA według tabeli 1 lub 2, (v) sekwencji DNA, która koduje ekspresję polipeptydu kodowanego przez sekwencje DNA określone w (i), (ii) oraz (iii) i b) co najmniej jedna właściwość biologiczna podobna do właściwości IL-3.
  10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę linii komórkowej stransformowanej wektorem zawierającym sekwencję DNA kodującą polipeptyd, który charakteryzuje właściwość wybrana z grupy obejmującej a) pozorną masę cząsteczkową w zakresie pomiędzy około 14 do około 35 kilodaltonów, oznaczoną za pomocą redukującej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS, b) zdolność do stymulacji procesu tworzenia się licznych typów kolonii hematopoetycznych różnych rodów w standardowym teście na ludzkim szpiku kostnym w stężeniach 10-100 pikomoli, c) zdolność do stymulowania procesu proliferacji komórek CML w teście CML w stężeniach 10-100 pikomoli.
  11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę linii komórkowej stransforomowanej wektorem zawierającym sekwencję DNA kodującą polipeptyd zasadniczo wolny od połączeń z innymi polipeptydami naczelnych, który charakteryzuje sekwencja aminokwasów, która ma wspólne regiony o znaczącej homologii z sekwencjami aminokwasów według tabeli 1 lub 2 i jest kodowana przez sekwencję DNA, która hybrydyzuje z sekwencją DNA według tabeli 1 lub 2, i która koduje ekspresję białka o właściwościach biologicznych podobnych do właściwości IL-3.
PL1987266802A 1986-07-14 1987-07-13 Sposób wytwarzania polipeptydu podobnego do pollpeptydu naczelnych IL-3 PL PL PL PL159183B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US88506086A 1986-07-14 1986-07-14
US89376486A 1986-08-06 1986-08-06
US06/916,335 US4877729A (en) 1986-07-14 1986-10-07 Recombinant DNA encoding novel family of primate hematopoietic growth factors
US07/021,865 US4959455A (en) 1986-07-14 1987-03-04 Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL266802A1 PL266802A1 (en) 1988-06-09
PL159183B1 true PL159183B1 (pl) 1992-11-30

Family

ID=27487045

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL1987266802A PL159183B1 (pl) 1986-07-14 1987-07-13 Sposób wytwarzania polipeptydu podobnego do pollpeptydu naczelnych IL-3 PL PL PL

Country Status (23)

Country Link
US (1) US5639453A (pl)
EP (2) EP0314705B2 (pl)
JP (2) JP2642942B2 (pl)
KR (1) KR970003518B1 (pl)
CN (1) CN1023901C (pl)
AT (2) ATE433487T1 (pl)
AU (1) AU606881B2 (pl)
CA (1) CA1341489C (pl)
CZ (1) CZ531387A3 (pl)
DE (2) DE3751677T3 (pl)
DK (1) DK173278B1 (pl)
ES (1) ES2007642A6 (pl)
FI (1) FI104903B (pl)
GR (1) GR871029B (pl)
HU (1) HU212518B (pl)
MY (1) MY101578A (pl)
NO (1) NO175825C (pl)
NZ (1) NZ221046A (pl)
OA (1) OA09226A (pl)
PH (1) PH26757A (pl)
PL (1) PL159183B1 (pl)
PT (1) PT85323B (pl)
WO (1) WO1988000598A1 (pl)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ222939A (en) * 1986-12-16 1991-03-26 Gist Brocades Nv Human interleukin-3, production using genetic engineering methods, antibodies to human interleukin-3 and screening of dna library with 3' untranslated region
US6238889B1 (en) 1986-12-16 2001-05-29 Dsm N.V. Molecular cloning and expression of the Pro8 isoform of human IL-3
EP0790307A1 (en) * 1986-12-16 1997-08-20 Gist-Brocades B.V. Molecular cloning and expression of human IL-3
OA09736A (en) * 1987-02-18 1993-11-30 Schering Biotech Corp "Human interleukin-3 and muteins thereof".
US5304637A (en) * 1987-07-13 1994-04-19 Gist-Brocades N.V. Expression and purification of human interleukin-3 and muteins thereof
GB2210883B (en) * 1987-10-08 1992-01-02 British Bio Technology Synthetic interleukin-3 gene
AU2800489A (en) * 1987-12-02 1989-07-05 Tyndale Plains-Hunter Ltd. Hydrophilic polyurethanes of improved strength
US6384194B1 (en) 1987-12-16 2002-05-07 Dsm N.V. Expression and purification of human interleukin-3 and muteins thereof
NZ232913A (en) * 1989-03-15 1992-08-26 Gist Brocades Nv Il-3 produced recombinantly and purified to homogeneity; vectors and pharmaceutical preparations
US5516512A (en) * 1989-08-14 1996-05-14 Gist-Brocades, N.V. N- and C-terminal truncation and deletion mutants of human interleukin-3
EP0810285A3 (en) 1989-08-14 1998-07-08 Gist-Brocades B.V. Mutants of human Interleukin-3
US5738849A (en) * 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
US6153183A (en) * 1992-11-24 2000-11-28 G. D. Searle & Company Co-administration of interleukin-3 mutant polypeptides with CSF's or cytokines for multi-lineage hematopoietic cell production
EP1361273A3 (en) * 1992-11-24 2004-02-11 G.D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) multiple mutation polypeptides
US6403076B1 (en) 1992-11-24 2002-06-11 S. Christopher Bauer Compositions for increasing hematopoiesis with interleukin-3 mutants
US6361976B1 (en) 1992-11-24 2002-03-26 S. Christopher Bauer Co-administration of interleukin-3 mutant polypeptides with CSF'S for multi-lineage hematopoietic cell production
US5772992A (en) * 1992-11-24 1998-06-30 G.D. Searle & Co. Compositions for co-administration of interleukin-3 mutants and other cytokines and hematopoietic factors
DE69432787D1 (de) * 1993-01-15 2003-07-10 Inst Genetics Llc Klonierung von Enterokinase und Verfahren zu deren Verwendung
US6746859B1 (en) 1993-01-15 2004-06-08 Genetics Institute, Llc Cloning of enterokinase and method of use
US5501962A (en) * 1993-06-21 1996-03-26 G. D. Searle & Co. Interleuken-3 (IL-3) human/murine hybrid polypeptides and recombinant production of the same
US6017523A (en) * 1995-06-06 2000-01-25 G.D. Searle & Co. Therapeutic methods employing mutant human interleukin-3 (IL-3) polypeptides
AU2359900A (en) * 1998-12-23 2000-07-31 Edib Korkut M.D. Ph.D. Protection of hematopoietic cells by the induction of post-mitotic quiescence
WO2002044410A1 (en) * 2000-11-28 2002-06-06 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Drug target isogenes: polymorphisms in the interleukin 3 (colony-stimulating factor, multiple) gene
WO2005025489A2 (en) * 2003-05-09 2005-03-24 Curagen Corporation Therapeutic use of g53135-05(fgf-20) in radiation protection
US7597884B2 (en) 2004-08-09 2009-10-06 Alios Biopharma, Inc. Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use
JP6087506B2 (ja) * 2012-01-31 2017-03-01 キヤノン株式会社 描画方法及び物品の製造方法

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US21865A (en) * 1858-10-19 moeison
US885060A (en) * 1907-04-13 1908-04-21 Alfred Leatherman Ratchet-cylinder pulley.
US893764A (en) * 1907-05-20 1908-07-21 Cable Co Supporting means for swinging parts of musical instruments.
US916335A (en) * 1908-05-08 1909-03-23 Klamath River Gold Mining Co Aerial tramway.
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
IN159327B (pl) * 1982-09-02 1987-05-02 Smidth & Co As F L
JPS5962335A (ja) * 1982-09-30 1984-04-09 Kawasaki Steel Corp グレ−トキルン法によるｅｐダストの予備焼成法
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4588684A (en) 1983-04-26 1986-05-13 Chiron Corporation a-Factor and its processing signals
US4695542A (en) * 1983-10-04 1987-09-22 Dnax Research Institute Of Molecular And Cellular Biology, Inc. cDNA clones coding for polypeptides exhibiting multi-lineage cellular growth factor activity
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
WO1985002863A1 (en) * 1983-12-23 1985-07-04 The Australian National University CLONING OF cDNA AND EXPRESSION OF MURINE-INTERLEUKIN-3
ZA848495B (en) 1984-01-31 1985-09-25 Idaho Res Found Production of polypeptides in insect cells
US4658018A (en) * 1984-03-13 1987-04-14 Immunex Corporation Process for producing homogeneous colony stimulating factor
JPS60207595A (ja) * 1984-03-30 1985-10-19 Ajinomoto Co Inc ヒトインタ−ロイキン３の製造法
JPS60207594A (ja) * 1984-03-30 1985-10-19 Ajinomoto Co Inc ヒトインタ−ロイキン３の製造方法
UA39161C2 (uk) 1984-07-06 2001-06-15 Новартіс Аг Рекомбінантний білок gm-csf для збільшення продукції гранулоцитів і макрофагів у пацієнтів, вектор і кднк, що його кодують
EP0177343B1 (en) 1984-10-05 1992-07-22 Genentech, Inc. Dna, cell cultures and methods for the secretion of heterologous proteins and periplasmic protein recovery
DE3785102T2 (de) 1986-01-03 1993-07-22 Genetics Inst Verfahren zur herstellung von faktor-viii:c-typ-proteinen.
US4877729A (en) * 1986-07-14 1989-10-31 Genetics Institute, Inc. Recombinant DNA encoding novel family of primate hematopoietic growth factors
EP0790307A1 (en) * 1986-12-16 1997-08-20 Gist-Brocades B.V. Molecular cloning and expression of human IL-3
NZ222939A (en) * 1986-12-16 1991-03-26 Gist Brocades Nv Human interleukin-3, production using genetic engineering methods, antibodies to human interleukin-3 and screening of dna library with 3' untranslated region
AU1496688A (en) * 1987-01-20 1988-08-10 Immunex Corporation Human interleukin-3 proteins
OA09736A (en) * 1987-02-18 1993-11-30 Schering Biotech Corp "Human interleukin-3 and muteins thereof".

Also Published As

Publication number Publication date
JP2642942B2 (ja) 1997-08-20
CN87104815A (zh) 1988-07-20
MY101578A (en) 1991-12-17
EP0314705A1 (en) 1989-05-10
EP0691403B1 (en) 2009-06-10
DK135488A (da) 1988-03-11
ATE133182T1 (de) 1996-02-15
NO881073D0 (no) 1988-03-10
KR970003518B1 (ko) 1997-03-18
DE3751677D1 (de) 1996-02-29
WO1988000598A1 (en) 1988-01-28
CN1023901C (zh) 1994-03-02
ATE433487T1 (de) 2009-06-15
ES2007642A6 (es) 1989-07-01
AU606881B2 (en) 1991-02-21
JPH07203967A (ja) 1995-08-08
DE3752394D1 (de) 2009-07-23
GR871029B (en) 1987-11-02
JPH01503298A (ja) 1989-11-09
CA1341489C (en) 2005-08-30
NO881073L (no) 1988-03-10
PT85323A (en) 1987-08-01
FI890153L (fi) 1989-01-12
DK173278B1 (da) 2000-06-05
FI104903B (fi) 2000-04-28
NO175825B (no) 1994-09-05
NO175825C (no) 1994-12-14
PL266802A1 (en) 1988-06-09
EP0691403A1 (en) 1996-01-10
EP0314705A4 (en) 1990-02-26
PH26757A (en) 1992-09-28
KR880701737A (ko) 1988-11-04
DE3751677T3 (de) 2007-03-15
US5639453A (en) 1997-06-17
DK135488D0 (da) 1988-03-11
DE3751677T2 (de) 1996-08-08
EP0314705B1 (en) 1996-01-17
CZ531387A3 (en) 1997-10-15
PT85323B (pt) 1990-04-30
EP0314705B2 (en) 2006-08-16
OA09226A (en) 1992-06-30
FI890153A0 (fi) 1989-01-12
HU212518B (en) 1996-07-29
AU7759387A (en) 1988-02-10
NZ221046A (en) 1991-02-26
JP2655591B2 (ja) 1997-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4959455A (en) Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
AU606881B2 (en) A novel family of primate hematopoietic growth factors
US4877729A (en) Recombinant DNA encoding novel family of primate hematopoietic growth factors
AU637620B2 (en) A human cytokine, interleukin-9
EP0494268B1 (en) Method for inhibiting growth of stem cells
DE69527041T2 (de) Gleichzeitige verarbeitung von interleukin-3 mutanten und kolonie stimulierungsfactor
US5573763A (en) Family of CSF-l proteins
PT85285B (pt) Processo para a preparacao de interleuquina-6 e de composicoes farmaceuticas que a contem
US6433142B1 (en) Megakaryocyte stimulating factors
EP0549711A1 (en) Natural killer stimulatory factor
US20040044186A1 (en) Antibodies to natural killer stimulatory factor
US5414071A (en) Human cytokine IL-9
US6348191B1 (en) Production and use of IL-6
WO1991002001A1 (en) A megakaryocytopoietic factor
KR970004941B1 (ko) 신규 영장류 조혈 성장 인자족(family) 발현용 벡터 및 형질전환체
IE70605B1 (en) A novel family of primate hematopoietic growth factors