PT85285B

PT85285B - Processo para a preparacao de interleuquina-6 e de composicoes farmaceuticas que a contem

Info

Publication number: PT85285B
Application number: PT85285A
Authority: PT
Inventors: Steven C Clark; Gordon G Wong; Paul Schendel; John Mccoy
Original assignee: Genetics Institue Inc
Priority date: 1986-07-08
Filing date: 1987-07-08
Publication date: 1990-03-30
Also published as: AU7696287A; DE3751922T2; EP0574955B1; EP0316319B1; ATE124959T1; DK121788D0; AU615630B2; ES2006776A6; DE3751406D1; SK515087A3; WO1988000206A1; SK279144B6; EP0316319A1; NO176665B; IE871726L; NO880929D0; DE3751922D1; JP2664698B2; NO880929L; KR960013601B1

Description

Processo parada preparação de interleuquina-6 e de composições farmacêuticas que a contêm

A presente invenção refere-se à preparação de uma proteína de interleuquina-6 recombinante e novos métodos para a aplicação desta proteína humana que participa na regulação da imunidade.

Antecedentes da invenção

As hematopoietinas ou factores de desenvolvimento hematopoiéticos são proteínas que promovem a sobrevivência, desenvolvimento e diferenciação das células hematopoiéticas.

A identificação bioquímica e biológica e caracterização de certas hematopoietinas têm sido dificultadas pelas pequenas quantidades de factores disponíveis a partir de fontes naturais, por exemplo, sangue e urina. Contudo, por meio de técnicas de engenharia genética de recombinação, algumas destas hematopoietinas têm sido clonadas de um modo molecular, expressas de uma forma heterogénea e purificadas até à obtenção da homogeneidade.

Entre estas hematopoietinas, estão as colónias de factores de estimulação (CSFs) caracterizadas pela capacidade de austentarem o desenvolvimento in vitro de colónias de células hematopoiéticas provenientes de células progenitoras de medula óssea, fígado de fetos e outros orgãos, como por exemplo o GM-CSF, G-CSF, CSF-1 e IL-3. /Ver, por exemplo, D. Metcalf, Blood, §2(2): 257-267 (1986); Y.C. Yang et al., Cell, 47(1):5-10 (1986); R: Donahue et al., Nature,

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321; 872-875 (198617.

De acordo com a presente invenção uma das citadas hematopoietinas é identificada nos pedidos de patente de invenção principais, referidos antes, como CSF-309. Subsequentemente ao registo dos pedidos de patentes de invenção principais, foram publicados vários trabalhos de diversos investigadores que descrevem proteínas, caracterizadas por outras actividades biológicas e nomes, que eram idênticos à nova proteína reivindicada nos pedidos de patente.

Haegeman et al., Eur.J. Biochem., 159:625-632 (1986) e referências aí citadas descrevem-na como uma proteína de 26kd induzivel nos fibroblastos humanos.

Zilberstein et al., EMBO J., 5:2529-2537 (1986) refere-se-lhe como IFN-beta-2 pela sua fraca actividade de interferon. Hirano et al., Nature, 324:73-76 (1986) refere a sua actividade estimulante das células B, designando-a por BGDF ou BSF-2. Várias destas publicações referem a purificação da substância natural. Talcomo sugerido por vários colaboradores, referir-nos-emos à proteína neste pedido de patente de invenção, como IIr-6. /Ver, R. Garman et al., (1987 , no prelo 17.

Breve descrição dos desenhos

A Figura 1 - representa a sequência total de cDNA e a sequência de aminoácidos de IL-6.

A Figura 2 - representa uma sequência modificada de cDNA particularmente apropriada para a expressão bacteriana de IL-6.

A Figura 3 - representa a construção do pAL-Sec-IL-6181

- 3 Breve resumo da invenção

Um aspecto da presente invenção proporciona um processo para a produção de IL-6 humana substancialmente isenta da associação com outras proteínas humanas. 0 processo de preparação, de acordo com a presente invenção, envolve a cultura numa célula hospedeira transformada com uma sequência de DNA, que codifica para a proteína IL-6, sob o controlo de sequências de controlo de expressão apropriadas.

A sequência de DNA que codifica a proteína IL-6 contém a mesma ou substancialmente a mesma sequência nucleotídica desde o nucleótido número 132 até ao nucleotido número 689 ou desde o nucleótido número 51 até ao nucleótido número 1139, como se representa na figura 1.

Uma sequência cDNA para ser utilizada neste processo inclui a sequência nucleotídica completa representada na figura 1; esta sequência de DNA com, aproximadamente, 1,1 kb da figura 1 está incorporada no plasmideo pCSF3O9 no E.coli MC1061, que foi depositado na American Type Culture Oollection, 12301 Parklawn Dr., Rockville Ture MD em 11 de julho de 1986, a que foi atribuído o número de aceitação 67153 da ATCC.

Um aspecto preferido de uma sequência de DNA que codifica IL-6 utilizável neste processo, é a sequência representada na figura 2, que foi deliberadamente modificada para a expressão em células bacterianas. Variantes alélicas (isto é, ocorrências naturais de alteração de base que se manifestam em espécies que podem ou não alterar a sequência de aminoácidos) dos nucleótidos e nas sequências peptídicas correspondentes às representadas nas figuras 1 e 2 e variações, na sequência nucleotídica, que resultam da degeneração do código genético,

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são também abrangidos pela presente invenção quando aquelas codificam um polipéptido que exibe actividade de IIr-6.

Variações na sequência de 1,1 kb, representada na figura 1 originadas por mutações pontuais ou por modificações induzidas para reforçar a actividade ou produção da proteína, não devem alterar a proteína funcional para a qual a sequência codifica na expressão. Portanto, tais variações na sequência são abrangidas pela presente invenção. Por exemplo, a sequência modificada da figura 2 é preferida, presentemente, para a expressão em células bacterianas hospedeiras.

Aquelas modificações nucleotídicas deliberadamente construídas na sequência de DNA podem ser executadas por especialistas na matéria por meio de processos conhecidos. Estas modificações podem originar a delecção, inserção ou substituição de aminoácidos na sequência peptídica de IIr-6. Por exemplo, a substituição de um ou mais de restos de cisteína na sequência codificadora pode eliminar a ponte de disulfureto correspondente.

Além disso, a delecção, inserção ou substituição de um aminoácido em um ou mais sítios de reconhecimento de glicosilação de ligação asparagina de tripéptidos pode resultar na ausência de glicosilação nesse sítio.

As técnicas mutagénicas para uma tal substituição ou delecção sao bem conhecidas dos técnicos /ver, a patente de invenção norte-americana N9 4518584/.

processo da presente invenção compreende a cultura de uma célula apropriada ou linha de células, que foi transformada com uma sequência de cDNA que codifica para IL-6, incluindo sequências modificadas, tal como se descreve antes

e como representados nas figuras 1 e 2. A sequência de DNA que codifica a IL-6 na célula transformada é uma associação operacional com uma sequência de controlo de expressão apropriada.

A escolha de células hospedeiras apropriadas e processos para a transformação, cultura, amplificação, sondagem, produção do produto e sua purificação são técnicas conhecidas. Ver, por exemplo, Gething e Sambrook, Nature 293^620-625. (1981), ou, alternativamente, Kaufman et al. Mol Cell. Biol 5 (7):1750-1759 (1985) ou Howley et al.. patente de invenção norte-americana NQ 4.419.446

As células bacterianas são as células hospedeiras preferidas, presentemente, para o processo de preparação de IL-6. A produção bacteriana resulta em grandes quantidades de IIr-6, particularmente quando se utiliza para a expressão, a sequência modificada representada na figura 2.

Várias estirpes de E.coli bem conhecidas como células hospedeiras na área da biotecnologia /por exemplo, a estirpe MCJ1061 e as estirpes descritas nos exemplos/ são apreciadas para serem utilizadas como células hospedeiras que permitem a produção de IL-6 com actividade biológica. Uma lista, não exclusiva, de várias estirpes bacterianas adequadas para expressão de IL-6 inclui B. subtilis, várias estirpes de Pseudomonas, outros bacilos, etc.

Também se podem utilizar células de mamíferos como células hospedeiras para a produção de IIr-6. Uma linhe de células de mamíferos particularmente apropriada, é a linha de células de ovário de criceto (hamster) chinês /CHO/. Uma outra linha de células de mamífero apropriada, que é descrita nos Exemplos

-/⁶ ’

Λ / ί > inclusos é a linha de células de macaco COS-1. Uma linha de células de mamífero igualmente útil é a linha de células CV-1.

Também são utilizáveis células de várias estirpes de levedura conhecidas pelos especialistas, para a expressão de IL-6. Além disso, caso se pretenda, podem ser utilizadas como células hospedeiras, células de insectos, no processo da presente invenção. Ver, por exemplo, Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press, 1986) e referências aqui citadas.

Um outro aspecto da presente invenção é o fornecimento de vectores para serem utilizados no processo de expressão da proteína IL-6, que contêm as mesmas ou substancialmente as mesmas sequências nucleotídicas descritas antes. De preferência, os vectores contêm uma sequência de DNA completa como as que estão representadas nas figuras 1 e 2.

Os vectores também contêm sequências de controlo de expressão apropriadas que permitem a expressão da sequência de DNA da IL-6. De um modo alternativo, os vectores que incorporam sequências alélicas modificadas ou naturais, como referido antes, também constituem aspectos da presente invenção e são utilizáveis na produção de IL-6.

vector pode ser utilizado no processo de transformação das linhas de células e pode conter sequências reguladoras seleccionadas, numa associação operacional com as sequências, referidas antes, que codificam o DNA da IL-6, que é capaz de dirigir a sua replicação e expressão nas células hospedeiras escolhidas. As sequências reguladoras utilizáveis para tais vectores são conhecidas pelos especialistas e devem

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ser escolhidos de acordo com as células hospedeiras seleccionadas. Essa escolha constitui um processo de rotina e não se considera como parte da presente invenção. Os vectores preferidos são os bacterianos.

Um outro aspecto da presente invenção é o facto de a proteína IL-6 ser substancialmente isenta de qualquer associação com outras proteínas humanas. A IL-6 é caracterizada por uma sequência peptídica que contém a mesma ou substancialmente a mesma sequência peptídica, representada na figura 1, desde o aminoácido número 28 até ao aminoácido número 212. A IL-6 produzida de acordo com o processo da presente invenção é caracterizada por um peso molecular aparente de cerca de 20 a 55 Kd, quando analizada por electroforese em gel de poliacrilamida SDS, sob condições nao redutoras.

Sn meio condicionado por pGSF5O9 a proteína, in vitro, origina a formação de pequenas colónias tipo granulocitos no ensaio em medula óssea de murganho com uma concentração picomolar compreendida entre 10 a 100 picomoles.

A figura 1 representa a sequência DNA completa de 1,1 Kb que codifica para a proteína IL-6 e permite a expressão em células hospedeiras apropriadas. Esta sequência incorpora uma longa cadeia de leitura translacional aberta com 656 nucleótidos, que codifica um polipéptido com 212 aminoácidos, incluindo uma sequência secretora inicial convencional com 50 nucleótidos aproximadamente.

A região de sequência codificadora da proteína com 1,1

Kb prolonga-se desde o nucleótido número 152 (a guanina no codão da alanina, o aminoácido na posição 28) até ao nucleótido núme8

ro 686 que é seguido de um codão TAG de paragem.

Existem dois sítios de glicosilação potencial de ligação asparagina representados pela sequência característica Asn-X-Ser. A região codificadora também contém 4 cisteínas que indicam duas fontes dissulfureto. Os restantes 453 nucleótidos da sequência 3’ não codificadora da região com 1,1 Kb podem ter um papel regulador da transcrição no hospedeiro natural. A extremidade 3’ da sequência também contém um segmento rico em AT incluindo várias repetições da sequência ATTTA, que se pensa estar relacionado com a estabilidade da mensagem do RNA /Ver, G. Shaw e R. Kamen, Cell, 46(5):659-677 (1986)/.

A sequência preferida para expressão bacteriana representada na figura 2 possui a mesma sequência peptídica representada na figura 1 mas possui uma sequência nucleotídica modificada para reforçar a produção de IL-6 em sistemas de expressão bacteriana. Além disso, esta sequência preferida tem delectada uma grande parte da sequência líder e a sequência 3’ não codificadora, que estão presentes na sequência representada na figura 1.

Um aspecto preferido da presente invenção, consiste na IL-6 produzida por via bacteriana. Quando é produzida em células bacterianas a alanina da posição 28 da sequência codificadora da proteína é geralmente eliminada pelas enzimas bacterianas. Portanto, aproximadamente 80$ da proteína IL-6, produzida por via bacteriana, possui prolina na posição 29, como o seu aminoácido inicial 5’· A IL-6 produzida por via bacteriana também não é glicosilada. Consequentemente, a IL-6 produzida por via bacteriana apresenta um peso molecular aparente mais

homogéneo que a IL-6 produzida em outros sistemas de expressão. Adicionalmente, a IL-6 produzida por via bacteriana, quando codificada pela sequência de DNA representada na fig 2, é produzida com elevados rendimentos.

Ainda um outro aspecto da presente invenção, consiste nos métodos e composições terapêuticos que utilizam a IL-6 como, pelo menos, um dos ingredientes activos.

A IL-6 pode ser utilizada isoladamente ou em conjunto com a administração de outros produtos terapêuticos no tratamento de doenças caracterizadas por um nível decrescente quer das células mielóides quer linfóides do sisteme hematopoiético ou de combinação de ambas.

Esta proteína é também, capaz de estimular células acessórias e maduras, por exemplo monocitos, para produzirem outros factores hematopoiéticos que, por sua vez, estimulam a formação de colónias de outras células hematopoiéticas, assim como outras actividades idênticas. Alternativamente, a IL-6 pode reforçar a actividade de outras hematopoíetinas. Por exemplo, a IL-6 demonstrou capacidade, através de um ensaio com medula óssea de murganho tratada com 5-fluorouracilo, para reforçar a faculdade de outras hematopoíetinas, nomeadamente a IL-3 e GSF-1, para estimular a proliferação de células hematopoiéticas mais primitivas, que as induzidas por OSF-1 ou IL-3 isoladas.

Esta característica fora primeiramente atribuída a uma proteína designada por IL-1-alfa ou hematopoietina-1 que pode induzir a expressão da IL-6. De um modo semelhante, um ensaio com IL-6, em uma célula embrionária humana, em associação com

L·.^ IL-5, originou a proliferação de colónias de células humanas de um modo precoce. Assim, a IL-6 possui utilidade farmacêutica potencial, em associação com IL-5, para o tratamento de várias doenças que envolvem deficiências do sistema imunológico.

Várias imunodeficiências, por exemplo, nos linfócitos T e/ou B ou alterações do sistema imunológico, por exemplo, artrite reumatóide, podem ser afectadas de uma forma favorável por meio de tratamento com IL-6.

Imunodeficiências tais com leucopenia, uma redução do número de leocócitos circulantes no sangue periférico, podem ser o resultado de infecções devidas a vírus, por exemplo, HTLVI, HTLVII, HIV, esposição a forte radiação, efeitos secundários da terapia do cancro, ou de outros tratamentos médicos.

tratamento terapêutico da leucopenia com composições que incorporam 11-6, pode evitar efeitos secundários indesejáveis motivadas pelo tratamento com os fármacos presentemente conhecidos.

Outras situações susceptiveis ao tratamento com IL-6 abrangem os doentes que recuperam de transplantes de medula óssea.

As composições utilizáveis no tratamento das condições referidas antes, contêm uma quantidade eficaz de IL-6 misturada com um veículo aceitável em farmácia. Estas composições podem administrar-se, de um modo sistemático, por via parentérica, intravenosa ou subcutânea. Quando administradas de forma sistémica as composições terapêuticas de acordo com

a presente invenção, estão, evidentemente, sob a forma de soluções aquosas isentas de pirogéneos para administração parentérica,

A preparação de uma tal solução de proteína aceitável para administração parentérica tem que considerar o pH, isoto*nia, estabilidade e outros factores de ordem técnica.

regime de dose relacionado com o tratamento das condições referidas antes, deve ser determinado pelo médico tendo em consideração os vários faótores que modificam a actuação dos fármacos, por exemplo, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, a gravidade de infecção, tempo de administração e outros factores clínicos.

De um modo geral, o regime diário deve estar compreendido entre 200 e 1000 microgramas de polipéptido ou entre 50 a 5000 unidades (i.e. uma unidade consiste na concentração de polipéptido que provoca metade da estimulação máxima num ensaio de medula éssea murina padrão) de polipéptido por quilograma de peso corporal.

Num aspecto preferido, a IIr-6 é utilizada em associação com outros agentes, para activar as células linféides maduras. Especificamente, num ensaio publicado /Ϋ. Takai et al., J, Immunol.» 137(11)·5494-35θθ (1986)7 constatado que a IIr-6 possui actividade de CDF. Assim, a IL-6 em associação com IL—2 e gama-interferon activa as células linféides maduras. Esta aesociação particular pode, portanto, mostrar-se utilizável para tratamento terapêutico anti-cancro e anti-vírus. /Ver também, Takai et al,. Science (1986)7· Esta utilização é, em parte, atribuída à actividade citolítica demonstrada pela

IL-6 sobre as células T.

Portanto, pensa-se que o tratamento simultâneo ou seriado de um paciente com IL-6 e IL-2 e gama-interferon possa ser eficaz, especialmente no tratamento das metástases cancerosas. De uma forma similar, a IL-6 pode ser utilizada em associação com a IL-2 para a terapia do LAK.

Uma lista não exclusiva de outras hematopoietinas, CSFs e interleuquinas, para administração conjunta, em simultâneo ou em série, com a interleuquina-6 inclui GM-CSF, GSF-l, I G-CSF, Meg-CSF, eritropoietina (EPO), IL-1, IL-5, factor de desenvolvimento de células-B e factor de diferenciação de eósinofilos. Tais associações podem reforçar a actividade ou efeito do tratamento isolado com outras hematopoietinas.

A IL-6 também pode aumentar a resposta, in vivo, imunológica humoral ou celular quando administrada em conjunto com outros agentes terapêuticos. Por exemplo, a IL-6 pode reforçar a eficácia de vacinas antigênicas virais, tais como HIV e outras ou de vacinas antigênicas tumorais.

A dosagem de IL-6 nestes sistemas de co-administração deve ser ajustada de acordo com a dosagem aconselhada para a administração isolada para compensação dos componentes adicionais, por exemplo, XL-2 nas composições terapêuticas.

progresso do doente tratado pode ser controlado por meio de avaliação periódica do perfil hematológico como, por exemplo, a contagem dos glóbulos brancos ou outros.

A IL-6 também pode ser utilizada, em processos convencionais, para a produção de anticorpos monoclonais ou policlonais, humanos e murinos, para serem utilizados em tera-1^-

pêutica e diagnose. Tais anticorpos monoclonais ou policlonais podem ser utilizados terapeuticamente para ligação a agentes a atingir ou toxinas, marcadores e outros. A IL-6 também actua como um factor de desenvolvimento de hibridomas no meio de cultura para aumentar o rendimento das linhas de células híbridas ·

Descrição Pormenorizada da Invenção

Os exemplos seguintes ilustram o processo da presente invenção que utiliza sequência de cDNA que codificam a IL-6. A ) sequência completa de DNA representada na figura 1 foi isolada a partir de uma biblioteca de polimerase A+ mRNA de C10MJ2 de linha de células T transformadas com HTLV I /National Institute of Health; S., K. Arya et al., Science, 233:1086 (1984)7» por meio de utilização de técnicas de clonagem de expressão descritas no pedido de patente de invenção copendente norte-americana N° 4 675 285 de 23 de Junho de 1987Exemplo I

Construção de um exemplo de um vector de expressão, para expressão intra-celular.

A sequência representada na figura 1 contida no pCSF3O9 (67155 da ATCC) sob a forma de uma inserção Eco RI (ver exemplo III) pode ser removida mediante digestão com Eco RI e inserida num hospedeiro e vector bacteriano apropriados para a produção de IL-6. Contudo, um sistema de expressão bacteriano preferido para IL-6 que permite maiores rendimentos de proteína, por meio da modificação da sequência codificadora 5' de IL-6, utiliza a sequência representada na figura 2.

Esta sequência preferida foi utilizada para a construção do plasmideo de expressão bacteriana pAL309C-781, do

X ί modo seguinte:

clone de cDNA de IL-6 (figura 1) transportado num fragmento EcoRI foi transferido para M15mpl9 /Ver, S. Messing, Methods in Enzymology, 101:20-78 (1985); J. Norrander et al., Gene, 26:101-106 (1985)/ com uma orientação tal que a cadeia não codificadora foi incorporada no fago DNA fágico de cadeia simples foi preparado e circularizado com o oligonucleótido d(GCCCCAGTAGCCCCAGGAGAAG). 0 oligonucleótido foi prolongado com o fragmento de Klenow de DNA polimerase I de E.coli; e a região residual de cadeia simples oligerida com Sl-nuclease. As extremidades foram tornadas coincidentes uma vez mais com o fragmento de Klenow de DNA polimerase; e finalmente, o cDNA de IL-6 de cadeia dupla foi preparado por meio de digestão com HindIII. A extremidade coincidente com o fragmento HindIII foi ligada com pAL-181 (número 40154 da ATCC) que foi digerido com Kpnl, tratado com o fragmento de Klenow de DNA polimerase e digerido com HindIII.

plasmideo pAL509ml81 resultante foi modificado, primeiro por meio de eliminação do fragmento com a sequência de bases compreendida entre o pb número 149 de 169 da figura 1 por meio de mutagenese de sítio dirigido de ansa, in vitro /Ver, Morinaga, et al., Biotechnology 2:656-659 (1984)/.

Esta delecção criou um sítio único NarI na sequência de IL-6. Este plasmideo foi digerido com NarI. As extremidades de cadeia simples foram preenchidas com fragmento de Klenow de DNA polimerase I; seguindo-se digestão com HindIII.

Isolou-se o fragmento, resultante desta digestão, que transportava a extremidade 5’ do gene da IL-6. Este fragmento

foi misturado com um DNA duplex sintético com 42 pb em que uma das extremidades tinha sido tornada coincidente e que na outra extremidade transportava a sequência TA de cadeia simples 5’· A mistura foi ligada com pAL181 e cortada com Ndel e HindIII. Esta ligação de três vias produziu a sequência do gene de IL-6 modificada representada na figura 2 e um plasmideo de expressão designado por pAL3O9B-181.

plasmideo pAL3O9B-181 foi cortado com Bani e a extremidade de cadeia simples preenchida por meio da utilização do fragmento de Klenw de DNA polimerase I· 0 plasmideo foi cortado em seguida com Ndel e isolado o clone de IL-6. Este fragmento de DNA foi inserido entre um sítio Ndel e um sítio Xbal de um sector pAL-181 no qual tinha sido clonada previamente uma sequência sintética de DNA que transportava a sequência de terminação da transcrição putativa situada na extremidade 3’ da sequência codificadora de Ξ. coli aspA.

Este novo plasmideo designado por pAL3O9C-781 pode ser transformado por meio de técnicas convencionais, em uma célula hospedeira que contenha meios para controlar o promotor PL (ver, por exemplo, o Exemplo V) para a expressão da proteína IL-6.

Alternativamente, a sequência codificadora de IL-6 modificada, pode ser eliminada do pAL3O9O-781 por meio de excisão com Nde I e Hindiliou a partir do pCSE3O9 por meio de excisão com Eco RI e ser inserida em um vector bacteriano pretendido, através de utilização de processos e vectores tais como os descritos por T. Maniatis et al., em Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Estes exemplares de vectores bacterianos podem ser

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depois transformados dentro de células hospedeiras bacterianas e, deste modo, expressar IL-6.

Exemplo II

Construção de um exemplo de um vector de expressão bacteriano para a secreção e expressão extracelular

A IL-6 pode ser produzida por secreção da proteína no periplasma de E. coli. Assim produz-se uma proteína totalmente oxidada que possui actividade específica elevada nos bioensaios in vitro. Está descrito o vector para a produção de IL-6 por este processo.

plasmídeo pUC18 /Yanisch-Perron et al., Gene 33 :103 (1985)/ foi cortado com endonuclease Ndel de restrição e as extremidades coesivas resultantes tornadas coincidentes por meio de tratamento com fragmento de Klenow de E. coli de DNA polimerase I e trifosfatos de desoxinucleósidos e o plasmídeo recircularizado com T4-DNA ligases. 0 plasmídeo n° 1, resultante foi depois cortado com PvuII (digestão parcial) e com Eco RI e as extremidades tornadas coincidentes com o auxílio do fragmento de Klenow de DNA polimerase.

Os fragmentos apropriados foram purificados e ligados de novo para formarem o plasmídeo n2 2 em que tinha sido eliminado o fragmento Eco RI a PvuII que continha o promotor lac. 0 plasmídeo n2 2 foi digerido com Eco RI e tratado com SI nuclease para eliminar as extremidades de cadeia simples. 0 plasmídeo foi, em seguida cortado com Kpnl.

plasmídeo pASl /Rosenberg, Ho e Shatzman, Meth. Enzymol. 101:123(1983)/ foi cortado com BamHl e as extremidades de cadeia simples eliminadas por meio de digestão com SI nuclease. A este DNA pASl foi unido um adaptador com a sequência d(GTACCCGGGTAC) para formar o plasmídeo pAS2 que

possui um sítio Kpnl que substitui o sítio BamHl no pASl. 0 pAS2 foi cortado com BglII, as extremidades tornadas coincidentes por meio da acção do fragmento de Klenow de DNA poli merase I e o DNA cortado com Kpnl.

fragmento BglII (blunt) para o Kpnl que contém a sequência do promotor pL foi ligado com EcoRI (blunt”) para a sequência do vector Kpnl do plasmídeo n£ 2, para formar o plasmídeo pAL-181, um plasmídeo que transporta o promotor pL, o sítio de ligação ribossómica e um codão de iniciação ATG, seguido imediatamente pelo sítio Kpnl e a região poliadaptadora do pUC18.

plasmídeo pAL-181 foi registado na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland, em 28 de Agosto de 1984, sob o número de aceitação 40134.

plasmídeo pAL-181 foi cortado com Ndel e Kpnl e inserida a sequência líder de secreção de DNA sintética seguinte :

TATG	AAA	AAT	ATA	ACT	TTC	ATT	TTT	TTT	ATT	TTA	TTA
AC	TTT	TTA	TAT	TGA	AAG	TAA	AAA	AAA	TAA	AAT	AAT
GCA	TCG	CCA	TTA	TAT	GCGGTAC
CGT	AGC	GGT	AAT	ATA	CGC

Esta sequência codifica uma sequência líder secretora típica. 0 plasmídeo resultante desta construção, foi designado por pAL-Sec-181.

pAL-Sec-181 foi cortado com Kpnl e tratado com fragmento de Klenow de DNA polimerase, para se eliminarem as extremidades de cadeia simples. 0 plasmídeo foi cortado de novo com HindIII e ligado a IL-6 que continha o fragmento de DNA descrito nos exemplos I e III. Este fragmento inicia-se com a sequência GCCCCAGTACCCCCAGGAGAAG, que codifica o pri- 18 / /

/ .· meiro codão de alanina da IL-6 madura e continua através da sequência de IL-6 completa até à região 3’ não traduzida até esta alcançar o sítio HindIII no poliadaptador de M13mpl9.

plasmideo resultante, pAIr»Sec-IL6-181 codifica uma proteína cuja síntese é controlada pelo promotor pL, que é composto pela secreção líder fundida com a proteína IL-6 madura.

Exemplo III

Construção de um exemplo de um vector de expressão de mamífero, pCSF3Q9

Para se construir um vector de mamífero para a expressão da IL-6 a sequência de cDNA completa representada na figura 1 foi ligado com EcoRI-vector p91O23B de expressão de células COS digerido /que ^se pode obter por meio de digestão de pCSF-l (n2 39754 da ATCC) com EcoRI para eliminar uma inserção com 750 pb aproximadamente/. 0 p91023B que contem o reforçador SV40, promotor último do maior adenovírus, a sequência codificadora DHFR, o sítio de adição poli A de mene»sagem último do SV40 e o gene VAI. 0 plasmideo resultante da digestão com EcoRI de p91O23B e a inserção da sequência de DNA representada na figura 1 que codifica para IL-6 foi designado por pCSF3O9 (com o número 67155 da ATCC) que pode ser transformado, por meio de técnicas convencionais, numa célula hospedeira de mamífero apropriada para a expressão de IL-6.

Células hospedeiras típicas para a expressão de células de mamífero incluem em especial linhas de células de primatas linhas de células de rodentes e outras, por exemplo,

células COS

Um especialista nesta matéria pode também construir outros vectores de expressão de mamíferos semelhantes a pCSF5O9 mas que contenham menos que a sequência inteira representada na figura 1. Por exemplo sequências flanqueadoras 5’ θ 5* podem ser cortadas da sequência representada na figura 1, se apropriado; ou variações de alelos ou modificadas da sequência da figura 1, podem ser utilizadas por meio de manipulação dessa sequência.

A sequência de DNA representada na figura 1 pode ser cortada a partir do plasmideo com EcoRI, ser modificada por técnicas de engenharia de recombinação genética convencionais e ser inserida em outros vectores habituais tais como pCD ZÕkayama et al.. Mol. Cell Biol. 2:161-170 (1982)7 e pJL5, pJIA· Z&ough et al., EMBO J.. 4:645-655 (1985)7. A transformação destes vectores em células hospedeiras apropriadas pode resultar na expressão de IL-6.

Exemplo» IV

Construção de vectores de insectos ou leveduras

De um modo semelhante ao cbscrito no exemplo I, um especialista pode manipular, a sequência representada na figura 1, por meio de eliminação ou substituição de sequências reguladoras de mamíferos que flanqueiam a sequência codificadora, com outras sequências de controlo de expressão para construir vectores de leveduras ou fungos. Deste modo, esta sequência poderá ser depois expressa em células hospedeiras de fungos.

Uma lista nao exclusiva, de células fúngicas inclui espécies do género Sacchromyces, Aspergillus e Pichia, assim

como outras espécies conhecidas

Para a construção de um vector de levedura de expressão da proteína em células de levedura ver, por exemplo, os processos descritos, no pedido de patente de invenção PCT publicado da Alemanha ocidental 8600639·

Também se podem utilizar células de insectos como células hospedeiras e as sequências representadas nas figuras 1 e 2 alteradas para tais sistemas de expressão. Por exemplo, a sequência codificadora, representada na figura 1, pode ser cortada do pCSFJ09 com EcoRI e em seguida, manipulada (por exemplo ligada a outros adaptadores convencionais ou modificada por meio de delecção das sequências não codificadoras daquela ou por alteração dos seus nucleótidos, por outras técnicas).

Para a construção de um vector de insecto ver, por exemplo, os processos descritos no pedido de patente de invenção europeia publicado, n2 155»4-76.

Exemplo V

Expressão da proteína IL-6

A. Expressão bacteriana - intracelular plasmideo pAL309C-781 referido no Exemplo I foi transformado numa estirpe GI4-55 de E. coli K12, uma estirpe derivada da estirpe W3110 na qual as regiões Cl e Rex do bactereófago que transporta o alelo 0^-857 tinham sido inseridas em sítio Ciai do gene lacZ do genoma bacteriano.

Esta inserção consiste em todas as sequências de

DNA compreendidas entre os nucleótidos 35711 θ 38104 do genoma do fago /Ver, F. Sanger et al J. Mol. Biol. 162:729 (1982)J7.

Quando a estirpe GI455 transformada com pAL309C-781

se desenvolve à temperatura de 30°C para elevada densidade celular e, em seguida é aquecida à temperatura de 40°C, pro duz-se rapidamente IL-6 que se acumula durante as duas ou três horas seguintes até alcançar uma percentagem superior a 10, da proteína celular total.

Esta proteína é produzida sob uma forma insolúvel que pode ser solubilizada e recolhida por processos convencionais Z~Ver, e.g., T. E. Creighton, Brog, Biophys, Molec. Biol.. 22:231-297 (1978)7Esta IL-6 reproduzida de modo bactereológico prevê-se possuir uma actividade específica, por meio do ensaio com medula óssea murina, compreendida, aproximadamente, entre 6 7 e 2X10' unidades por mg de proteína.

B, Secreção Bacteriana plasmideo pAL-Sec-IL-6-181, referido no exemplo II, foi transformado na estirpe GI400 de E. coli K12 que é derivada da estirpe W3110 /Bachmann, Bacterial. Rev. 36,525 (1972)7 em que as regiões C^, Rex e N do bactereófago (nucleótidos 334-98 até 38214 do genoma fágico) /'Sanger et al., J. Mol. Biol. 162:729(1982)7 foi inserida no sítio Ciai do gene lacZ da bactéria. 0 gene Cj desta inserção é o alelo Cj857 sensível à temperatura.

Uma vez o pAL-Sec-IL-6-181 transformado dentro da GI400, as células podem desenvolver-se à temperatura de 30°C para uma certa densidade celular pretendida e aumentar a temperatura para 40°C para se iniciar a secreção de IL-6.

produto isolado do periplasma destas células tinha um peso molecular homogénio. 0 processo seguinte consistiu na remoção da sequência inicial. A alanina do N-ter- 22 f f / t minai também foi removida da proteína segregada produzindo * um produto que, na maioria dos casos, tinha a prolina como o aminoácido do N-terminal. 0 material tem uma actividade específica elevada quando submetido ao ensaio de uma colónia medula óssea, exibindo entre 1 a 20 x 10 unidades por mg de proteína.

0. Expressão de mamíferos

DNA plasmideo, preparado a partir de E. coli

MC1061 que continha o pCSF3O9> como descrito por Maniatis et al., supra, foi purificado por métodos convencionais que envolvem centrifugação equilibrada em gradiente de cloreto de césio contendo brometo de etídio. Células COS (CRL 1650 da ATCC), foram transfectadas com DNA purificado a uma concentração aproximada de 5pg de DNA plasmídico por cada 10 células COS e tratadas com cloroquina, de acordo com os processos descritos por G.G. Wong et al., Science, 280 : 810-815 (1985) e R.J. Kaufman et al., Mol. Cell.Biol,, 2 : l$04 (1982).

Setenta e duas horas após a transfecção o pCSF3O9-contendo meio condicionado de células COS, pode ser recolhido contendo uma proteína que evidencia actividade no ensaio de medula óssea murina padrão, como se descreveu no exemplo V.

Exemplo VI

Actividade de IL-6 no ensaio de medula óssea de murganho in vitro

Os ensaios de medula óssea de murganho foram conduzidos de acordo com a descrição de D. Metcalf em The Hemopoietic Colony Stimulating Factors, Elsevier Press, New York, 1984

com as modificações seguintes:

(a) utilizaram-se 2 x 10^ de medula óssea por ml no ensaio;

(b) o voluma final do ensaio foi de lOOul;

e (c) os ensaios foram realizados em placas microtituladoras padrão de 96 cavidades

A medula óssea foi obtida a partir de fémur de fêmeas de murganho com 6 a 25 semanas Balb/c (Jackson). Utilizando-se meio condicionado WEH1 3 /J.C. Lee et al., J. Immunol., 128: :2393-2398 (1982)que continha interleuquina-3 de murganho como controlo padrão, definiu-se uma unidade de diluição da actividade como a concentração de proteína que resulta em uma resposta máxima no ensaio de medula óssea, i.e. aproximadamente 25 a 35 colónias por 2 x IO²* células de medula óssea de murganho· meio condicionado de células 008 que continha pCSF3O9 verificou-se ser activo pelo menos em uma diluição de 10 , num ensaio de medula óssea de murganho e produzia colónias tipo granulócitos pequenos. 0 número e tipo de células numa resposta máxima poderá variar com a estirpe e idade dos murganhos dadores.

meio condicionado de células de E.coli que continha pAIr-3O9C-781 pode ter uma actividade específica de pelo menos entre 10⁶ e 2X10? unidades por mg de proteína neste ensaio.

A IL-6 produzida bacteriologicamente também produziu colónias granulocíticas.

Exemplo VII

Análise do peso molecular de IL-6

De acordo com os processos descritos por R. J. Kaufman e P. A. Sharp, em J. Mol. Biol. 159;601-629 (1982) a metionina

- 24 / f * pode ser incorporada metabolicamente na proteína IIr-6 produzida por transfecção de células COS com DNA de pCSFJO9. Quando e metionina marcada com do pCSF5O9 contendo meio condicionado de células COS é analisada sob condições não-redutoras, por meio de electroforese em gel de poliacrilamida SDS U. K. Laemmli, Nature 227:680-685 (1970).7, uma larga faixa, indicadora de glicosilação, pode ser detectada, tendo um peso molecular aparente aproximado compreendido entre 20 e 35Kd.

Exemplo VIII

Construção de linhas de células CHO que exprimem níveis de IL-6 elevados

Um método que produz níveis elevados de II-6 a partir de células de mamíferos envolve a construção de células que contêm cópias múltiplas do gene heterólogo de IL-6.

gene heterólogo pode ser ligado a um marcador amplicável por exemplo, o gene de dihidrofolato reductase (DHFR) cujas células que contêm cópias do gene aumentado podem ser escolhidas para propagação em concentrações crescentes de metotrexato (MTX), de acordo com os processos de Kaufman e Sharp, J. Mol.Biol., supra. Esta via pode ser utilizada com um certo número de tipos de células diferentes.

pCSF3O9 β o plasmídeo pAdA26SV(A)3 de expressão de DHFR (Kaufman e Sharp, Mol. Cell Biol., supra), são cotransfectados em células CHO deficientes em DHFR, DUKX-BII por meio de coprecipitação com fosfato de cálcio e transfecção. Os DHFR iniciais que exprimem transformandos são escolhidos para se desenvolverem em meio alfa com soro fetal de vitela dializado e, subsequentemente escolhidas para amplificação / - 25 y /

/ ' por desenvolvimento em concentrações crescentes de MTX (fases sequenciais em 0,02, 0,2 1,0 e 5mM MTX), como foi descrito por Kaufman et al., em Mol., Oell. Biol. jj :1750 (1983)· Os transformandos são clonados e a expressão da proteína IL-6 biologicamente activa é controlada por meio de ensaios em medula óssea murina.

A expressão de IL-6 aumenta com o aumento dos níveis de resistência de MTX.

Numerosas modificações e variações, de acordo com a prática da presente invenção é esperado que ocorram aos especialistas nesta matéria tendo em consideração as descrições referidas antes sobre os aspectos preferidos.

Admite-se que tais modificações e variações estão abrangidas pelas reivindicações apensas.

Claims

1,— Processo para a preparação de IL—6, caracterizado pe lo facto de se cultivar uma célula apropriada transformada com uma sequência de cDNA que codifica uma proteína que contém uma sequência peptídica substancialmente igual ã sequência de aminoácidos desde o aminoácido número 28 até ao aminoácido número 212, como se representa a seguir:

Figura 1

10 20 30 40 50Q)

GAATTCOGGG AAOGAAAGAG AAGCTCTATC TCCCCTCCAG GAGCCCAGCT ATG AAC TCC TTC

MET Asn Ser Phe

65 80 / 95110

TCC ACA AGC GCC TTC GGT CCA GTT'GCC TTC TCC CTG GGG CTG CTC CTG GTG TTG Ser Thr Ser Ala Fhe Gly Pro Val^Ala Phe Ser Leu Gly Leu Leu Leu Vai Leu

125 (28) 140 155170

CCT GCT GCC TTC CCT GCC CCA GTA CCC CCA GGA GAA GAT TCC AAA GAT GTA GCC

Pro Ala Ala Fhe Pro Ala Pro Vai Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Vai Ala (28) 185 200215

GCC CCA CAC AGA CAG CCA CTC ACC TCT TCA GAA CGA ATT GAC AAA CAA ATT CGG

Ala Pro His Arg Gin Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gin Ile Arg

230 245 260275

TAC ATC CTC GAC GGC ATC TCA GCC CTG AGA AAG GAG ACA TGT AAC AAG AGT AAC

Tyr Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn

290 305320

ATG TGT GAA AGC AGC AAA GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC CIT CCA AAG

MET Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala leu Ala Glu Asn Asn leu Asn Leu Pro Lys (100)

335 350 365 380

ATG GCT GAA AAA GAT GGA TGC TTC CAA TCT GGA TTC AAT GAG GAG ACT TGC CTG

MET Ala Glu Lys Asp Gly Cys Fhe Gin Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys leu

395 410 425440

CTG AAA ATC ATC ACT GCT CTT TTG GAG ΤΊΤ GAG GTA TAC CTA GAG TAC CTCCAG

Vai Lys Ile Ile Thr Gly Leu Lsu Glu Phe Glu Vai iyr Leu Glu iyr LeuGin

455 470485

AAC AGA ΤΊΤ GAG AGT ACT GAG GAA CAA GCC AGA GCT CTG CAG ATG ACT ACAAAA

Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gin Ala Arg Ala Vai Gin MET Ser ThrLys

500 515 530545

CTC CIG ATC CAG TTC CTG CAG AAA AAG GCA AAG AAT CTA GAT GCA ATA ACCACC

Vai Leu Ile Gin Phe Leu Gin Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile ThrThr

560 575590

CCT GAC CCA ACC ACA AAT GCC AGC CTG CTG ACG AAG CIG CAG GCA CAG AAC CAG

Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gin Ala Gin Asn Gin

605 620 635 650(200)

TGG CIG CAG GAC ATG ACA ACT CAT CTC ATT CTG OGC AGC TTT AAG GAG TTC CTG

Trp Leu Gin Asp MET Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu

665 680 (211) 696 706716

CAG TCC AGC CTG AGG GCT CTT OGG CAA ATG TAGCATGGGC ACCTCAGATT CTTCTTCTTA Gin Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gin MET_______________

726 736 746 756 766 776786

ATGGGCATTC CITCTTCTGG TCAGAAACCT CTCCACIGGG CACAGAACTT ATGTIGITCT CTATGGAGAA

796 806 816 826 836 846856

CTAAAAGTAT GAGOGTTAGG ACACTATTIT ΑΑΊΤΑΤΪΤ1Τ ΑΑΤΓΤΑΙΤΑΑ TATITAAATA TGIGAAGCTG /

866 876 88^ , 896 906 915926

AGTTAATTTA TGTAAGTCAT ΑΊΊΤΑΤΑΤΤΤ/ TTAAGAACTA CCACTIGAAA CAVTTTATCT ACTAGTTTIG

936 946 956 966 976 986996

AAATAATAAT GGAAAGTGGC TATGCACTTT GAATATCCTT TGTITCAGAG CCAGATCATT TCTTGGAAAG

1006 1016 1026 1036 1046 10561066

IGTAGGCTTA CCTCAAATAA ATGGCTAACT TA.TACATATT TTTAAAGAAA ΤΑΤΓΓΑΤΑΊΤ CTATTTATAT

1076 1086 1096 1106 1116 11261136

AATGTATAAA TGGlTlTlAT ACCAATAAAT GGCATTTTAA AAAATTCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAGAA

TTC e de a referida sequência de cDNA se combinar de uma forma eficaz com uma sua sequência de controlo de expressão.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida sequência de cDNA compreender substancialmente a sequência nucleotídica representada antes.

3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida sequência de cDNA ser substancialmente igual à sequência nucleotídica representada a seguir:

Figura 2.

ATG

Met

(23) 140 155' 170 185 GCT CCA GTA CCT CCA GGT GAA GAT TCT AAA GAT GTA GCC GCC CCA CAC AGA CrtU CCA CTC ACC Ala Pro Vai Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Vai Ala Ala Pro His Arg Gin Pro Leu Thr 200 215 230 245 TCT TCA GAA CGA ATT GAC AAA CAA ATT CGG ATC CTC GAC GGC ATC TCA GCC CTG AGA AAG Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gin Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys 260 275 290 305 320 GAG ACA TGT AAC AAG AGT AAC ATG TGT GAA AGC AGC λλΑ GAG GCA CTG GCA GAA AAC ΛΛν. CTG Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn MET Cys Glu Ser Se r Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu

335 350 365 3S0 AAC CTT CCA AAG ATG GCT GAA AAA GAT GGA TGC TTC CAA TCT GGA TTC AAT GAG GAG nv L TGC Asn Leu Pro Lys MET Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gin Ser Gly Phe Asn Glu Glu Cys 395 410 425 440 CTG GTT AAA ATC ATC ACT GGT CTT TTG GAG TTT GAG GTA TAC CTA GAG TAC CTC CAG AAC AGA Leu Vai Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Vai Tyr Leu Glu Tyr < Leu Gin Asn Arg

(100)

455 470 485 500 TTT GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC AGA GCT GTG CAG ATG AGT ACA AAA GTC CTG ATC CAG TTC Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gin Ala Arg Ala Vai Gin MET Ser Thr Lys Vai Leu Ile Gin rhe 515 530 · 545 560 AGC CTG CAG AAA AAG GCA AAG AAT CTA GAT GCA ATx\ ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACA AAT CCC Leu Gin Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr THl Tro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser 575 590 605 620 635 CTG CTC ACG AAG CTG CAG GCA CAG AAC CAG TCG CTG CAG GAC ATG ACA ACT CAT CTC ATT CTG Leu Leu Thr Lys Leu Gin Ala Gin Asn Gin Trp Leu Gin Asp MET Thr Thr His Leu Ile Leu CCC ACC TTT AAG 650 r» · r» Gnu (200) TTC CTC CAG TCC 665 AGC CTG AGG GCT CTT 680 CCC 1 CAA (211) ATG TAGCATGG Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gin Ser Sçr Leu Arg Ala Leu Arg Gin MET 1 l

4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a referida célula ser uma célula bacteriana.

5. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de se obter a Interleuquina - 6 substancialmente isenta de outras proteínas.

6. - Processo para a preparação de composições terapêuticas para o tratamento do cancro, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade efectiva de IL-6, como ingrediente activo, com um ou mais veículos aceitáveis sob o ponto de vista terapêutico.

7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se incorporar ainda uma quantidade efectiva de pelo menos uma hematopoietina, interleuquina, factor de crescimento ou anticorpo.

8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se incorporar ainda uma quantidade efectiva de interleuquina-3.

9. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se incorporar ainda uma quantidade efectiva de IL-2.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de se incorporar ainda uma quantidade efectiva de gama-interferon.

11. - Vector de transformação, caracterizado pelo facto de conter uma sequência de DNA substancialmente igual ã sequência tal como representada na reivindicação 1 ou na reivindicação 3.

Lisboa, 6 de Julho de 1987

0 Agente Oficial da Propriedade Industrial *

-31RESUMO

Processo para a preparação de interleuquina-6 e de composições farmacêuticas que a contem

I

Descreve-se um processo para a preparação de interleuquina-6 substancialmente isenta de outras proteínas humanas, que consiste em cultivar uma célula apropriada transformada com uma sequência de DNA que codifica para a proteína de IL-6 sob controlo de uma sequência de expressão apropriada

A presente invenção também descreve composições terapêuticas que utilizam a interleuquina-6 isoladamente ou associadas com outras hematopoietinas, como ingrediente activo, utilizáveis no tratamento do cancro.