PL160846B1

PL160846B1 - Sposób wytwarzania nowych pochodnych nukleozydów

Info

Publication number: PL160846B1
Application number: PL28266288A
Authority: PL
Inventors: Bogdan Uznanski; Andrzej Wilk; Andrzej Grajkowski; Wojciech J Stec
Original assignee: Polska Akad Nauk Centrum
Priority date: 1988-07-14
Filing date: 1988-07-14
Publication date: 1993-04-30
Also published as: PL282662A1

Abstract

Sposób wytwarzania nowych pochodnych nukleozydów o ogólnym wzorze 1, w którym Y oznacza grupę dimetoksytrifenylometylową, X oznacza grupę o wzorze 6, w którym R2 oznacza grupę 2-cyjanoetoksylową, a R3 oznacza grupę diizopropyloaminową albo X oznacza stały nośnik związany kowalencyjnie z nukleozydem, Z oznacza atom wodoru lub grupę OH, a B oznacza grupę o wzorze 3, 4 lub 5, znamienny tym, że związek o wzorze 2, w którym B' oznacza resztę adeniny, guaniny lub cytozyny o wzorach odpowiednio 7,8,9, a Z ma wyżej podane znaczenie poddaje się reakcji z chlorkiem lub bezwodnikiem izopropoksyacetylowym, w obecności nadmiaru halogenku trialkilosililowego, selektywnie hydrolizuje się grupy sililowe w obecności wody, po czym otrzymany związek o wzorze 1, w którym Z ma wyżej podane znaczenie, X i Y oznaczają atom wodoru, a B oznacza grupę o wzorze 3, 4 lub 5 poddaje się reakcji z chlorkiem 4,4'-dimetoksytrifenylometylowym, a następnie reakcji w pozycji 3' albo z Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraizopropylodiamidofosforynem 0· 2-cyjanoetylowym lub acetylowaniu, estryfikacji 4-nitrofenolem i reakcji ze stałym nośnikiem o organicznym łańcuchu zawierającym atomy węgla, azotu i tlenu.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych pochodnych nukleozydów o ogólnym wzorze 1, w którym Y oznacza grupę dimetoksytrieenyoometylową,

B oznacza grupę o wzorze 3, o wzorze 4 lub o wzorze 5, X oznacza grupę o wzorze 6, w którym Rg oznacza grupę 2-cyjanoetoksylową o wzorze - OCHgCHgCN, a Rj oznacza grupę diizoprppyoomrninową lub X oznacza stały nośnik związany kowalencyjnie z nukleozydom, a Z oznacza atom wodoru lub grupę OH.

Nowe pochodne nukleozydów o wzorze 1 znajdują zastosowanie do wytwarzania oligonukleotdoowych fragmentów genów kodujących biosyntezę białek. Syntezę oligonukleotddowych fragmentów genów z zastosowaniem nowych pochodnych przedstawiono w zgłoszeniu potenrowyo nr P 273 723 opublikwwanym w BUP nr 2/90.

Naablizszymi znanymi pochodnymi nukleozydów stosowanymi do syntezy fragmentów genów są nukleozydy, w których funkcje aminowe adeniny, guaniny i cytozyny są zablokowane grupą benzoilową lub izobutyrylową. Znane pochodne nukleozydów nie są dogodne w syntezie oligonukleotydów, ponieważ ueumsnl-e grup alokujących wymaga 16 godzinnego ogrzewania produktu syntezy w wodnym roztworze amoniaku, w tempera turze 5O-6O°C lub utrryymy^^nia 48 godzin w temperaturze pokojowej.

Nieoczekiwanie stwierdzono, ze otrymmywane sposobem według wynalazku nowe pochodne nukleozydów są bardzo korzystnymi związkami wyjściowymi w procesie syntezy fragmentów genów, ponieważ pozwwlają na otrzymanie produktu z wysoką wydejnością, pow^^^j 99,6 % dla pojedynczej reakcji przedłużenia łańcucha, a ponadto usunięcie grup blokujących odoywa się w ciągu 2 godzin w 25 % wodnym roztworze amoniaku, w tempera turze 20°C, co korzystnie wpływa na czystość produktu.

160 846

Sposób według wynalazku polega na tym, że związek o wzorze 2, w którym B oznacza resztę adeniny, guaniny lub cytozyny o wzorach odpowiednio 7, Θ, 9, a Z ma wyżej podane znaczenie poddaje się reakcji z chlorkiem lub bezwo<diikieo izopropokeyacetylowym, w obecności nadmiaru halogenku trialkilosililowego, po czym selektywnie hydrolizuje się grupy silLUwe w obecności wody, z wytworzeniem związku o wzorze 1, w którym X i Y oznaczają atomy wodoru,

Z oznacza atom wodoru lub grupę OH, a B oznacza grupę o wzorze 3, 4 lub 5· Otrzymany związek poddaje eię reakcji z chlorkiem 4,4'-dimetokaytrifenylometylowym, która jest znaną reakcją zabezpieczenia grupy 5 -hydroksylowej, a następnie znanej reakcji w pozycji 3 'albo.z Η,Η,Η', H '-teOraioopropnlldlamLdofosfoiyrnem 0-2-cyjanoθtylowym z wytworzeniem związku o wzorze 1, w którym B ma ^żej podane znaczenie, Y oznacza grupę dlOθtlksytrifenyOomstylową, a X oznacza grupę o wzorze 6, w którym Rg oznacza grupę Z-cyjanoetoksylową, a Rj oznacza grupę diizoplopylaam±nową, albo też acetylowaniu, a następnie estryfikacji 4-nitloSenoSem z wytworzeniem aktywnego estru, który poddaje się reakcji ze stałym nośnikiem o organicznym łańcuchu zawierającym atomy węgla, azotu i tlenu, otrzymując związek o wzorze 1, w którym B ma wyżej podane znaczenie, Y oznacza grupę dlmetok8ytrifθnylomstylową, a X oznacza stały nośnik związany kowaaencyjnie z nukleozydeo.

Reakcję związku o wzorze 2 z chlorkiem lub bezwodnikiem izopropokayacetylowym można prowadzić w rozpuszczalniku, np. w pirydynie. V reakcji tej halogenek trialkilo8llilowy stosuje się do przejściowej ochrony grup hydroksylowych. Selektywną hydrolizę grup sililowych prowadzi się w obecności wody.

W reakcji acetylowania, przed związaniem nukleozydu ze stałym nośnikiem, można np. stosować bezwodnik bursztynowy. Przykładowy nukleozyd związany ze stałym nośnikiem przed stawia wzór 10, gdzie CPG oznacza szkło o kontrolowanej porowatości, Y oznacza grupę dimetoksytrifenylooetylową, a B ma wyżej podane znaczenie.

Jak już wsporniono, nowe pochodne nukleozydów są bardzo korzystnymi związkami ^7yłójLoaιłmi w procesie otrzymywania syntetycznych fragmentów genów na drodze kondensacji odpowiednio blokowanych nukleozydów. Wyyaaazek ilustrują niżej podane przykłady.

Przykład I.A, Ng-izopropoksyec3tylo~2'“dozokoysdθelozł-et 50 mmoH.

’=d.l3oksłtdenc^ίy.ny suszono pod wysoką próżnią na łaźni olsioi-zej w temperaturze 50°C przez 6 godzin, następnie zawieszono w 80 ol bezwodnej pirydyny i dodano z mieszaniem 250 maaH tΓioetłllchloroθilίιnu w tempera turze pokojowej. Po dwóch godzinach dodano 75 mnoH bezwodnika izopΓopok8yoclawego i mieszano przez 2 godziny. Odsączono osad chlorowodorku pirydyny, przemyto 20 ml benzenu, przesącze połączono 1 zatęzono do około 40 ml. Następnie dodano 50 ol dioksanu i 30 ol wody. Mieszano przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną zatęzono do sucha. Otrzymany olej oczyszczono na kolumnie z żelem /Merck 60/ przy użyciu eluentu: chloroform/metanol 99:1 - 90:10. Frakcje właściwe zatęzono do sucha. Produkt krystalilaafano z chloroformu. Temoesaturt topnienia 134-135°C; Rf - 0,52; /CHjCN:H20 85:15/5 wydajność 76 %. Analiza elementarna zgodna z teoretyczną.

B. 5 '-dioetokSłtrifenylometylo-Ng-izopropoksy-acetylo-2 '-dezoksyadenozyna. Otrzymany w etapie I.A. związek /2 οο^/ suszono przez odparowanie bezwodnej pirydyny /5 ml/ i zawieszono w 10 ol bezwodnej pirydyny. Dodano chlorku 4,4'd im tok sytrieenyo me t yo wwego /2,2 moJj/. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 godzin. Dodano 2 ol metanolu i zatęzono do sucha. Surowy produkt oczyszczono na kolumnie z żelem r-erck 60K, stosując jako element

160 846 meazaninę: chlornform/metanol /99:1/ zawierającą 0,1 j pirydyny, Rf - 0,68, /CHCl3/C&D^H 90:10/ HPTLC, wydajność 76 % Analiza elementarna zgodna z teoretyczną·

C. C£glzopropokeyaaceylo-5 '-dioetokaytrifenylometylo-2 '-dezoksysdanozyno3'-0-/0-2c_Cylβnoetylo/cϊI,lł-dlizopoopyloaamidofosfoΓyn.

Otrzymany w etapie £ związek /1 mol/ i 1-H-tetrazol /1 mol/ osuszono przez odparowane bezwodnej pirydyny /3 ml/ i przez 2 godziny pod wysoką próżnią. Rozpuszczono w bezwodnym chlorku metylenu /3 ml/ i dodano mieszając ΝΝΗ’, H'-tetraizopropylodiamidofoeforyn O^-cyjanoetyoowy /1,1 mom. Mefiian^e kontynuowano przez 1 godzinę w tempera turze pokojowej* Miiszaninę reakcyjną zatężono do sucha, oczyszczono na kolumnie z żelem Merck 60, stosując jako eluent mieszaninę: benzea/chlorek meeylenu/trietylaamina 8:1:1. Produkt otrzymano z wydajndcią 80 Ui R_f - 0,75 i 0,62, [benzen/0^^/ 60:16:16, <^{ppm 31p}BMB

149,73, 149,46, (cD-OT ) 85 % HjPO^

Przykład I^A. H2-izopropokβylcetylO22'-dzloyagulanozynl. Postępując analogicznie jak w przykładzie I.A. z tym, że po dodaniu dioksanu i wody mieszano przez 12 godzin, a produkt kryytllZlowanl z mieszaniny dioksanie ter etylowy lii, otrzymano związek tytułowy z wyda^^cią 81 %. Temoeratura topnienia>000^oC /z rozkładem', Rf - 0,50, /CH3CB:H20 85:15/. Analiza elementarna zgodna z teoretyczną.

B. 5 *-aimetokβytrlf^>enylooetyll-C2-izoeΓopokayaaltylo-2 '-dezoksyguanozyna. Postępując analogicznie jak w przykładzie I.B., otrzymano produkt z wyddjnością 71 %, Rf - 0,53, /CHC!^w^,CHj^H 90:10/ HPTLC. A^aUza elmentarna zgodna z teoretyczną.

C* H2-izopropokβyaactylo-5 *-aioetok8ytrifθnylooetyll-2 '-dezlksyguanozyno3*d)-/0-2-oyjanoetylo/-Ν,Ν-diizopΓopyll-aolaoflβforyn. Postępując analogicznie jak w przykładzie I.C., otrzymano produkt z wydajnością 82 %, Rf -0,7 benzen^/chlorek metylenu / t^oty^om!^ 60:16:16, <T ppo NMR 149,86, 149,46 /CD3CN/ 85 % H.jPO₄.

Przykład III.A. N₄“izoerlpoksya¢θtyio=-2'-dezokeycytydyna. Postępując analogicznie Jak w przykładzie I.A. z tym, że krystalizację przeprowadzono w czterochlorku węgla, otrzymano produkt z wyddandcią 87 %; Rf - 0,59 /CHyCN^gO 85:15/· Temopratura topnienia 157-158°Co Analiza el^oentarna zgodna z teoretyczną.

B. 5'-dimetlk8ytrifenylomθtyll-N₄-lzlerlpokβyacetylo-2 '-aezlkyycytyaynl. Postępując analogicznie jak w przykładzie I.B., otrzymano produkt z wydajnością 80 %, Rf - 0,75 //CC^3:Cί^o£>C 90:10/ HPTLC. Analiza elementarna zgodna z teoretyczną.

C. N₄-izopropokayacetylo-5 '-dimetokaytrifenylometylo-2 '-dezoksycytydyno-3 '

-0-/O-2-cyjanoetylo/-N,N-diizopropylo-amidoiosioryn. Postępując analogicznie jak w przykładzie I.C., otrzymano produkt z wydajnością 80 %, Rf - 0,62 /chlorek me^fylenu/trietylaamina ⁸4:l6/, ([ppm KMil 149,66, 14^{9,52 /c}Dy^CN/ ⁸5 % h/o₄. , ,

Przykład IV. 5'-dimetoksytrifenylamftylo-N^-izopropoksyacetylo-2 ' -dezokayadenozyna związana ze staymm nośnikiem. 10 mumH związku otrzymanego w przykładzie I.B., 10 Mimoi bezwodnika burazyynowego i 10 mmmH dimetyloaminopirydyny suszono pod wysoką próżnią przez 2 godziny, dodano 10 ml bezwodnej pirydyny i mieszano przez 12 godzin w temperaturze pokojowej. Zatężono do sucha, produkt oczyszczono na kolumnie z żelem /Merck 60/, eluowano mieszaniną chloroiormsmetanol 100:5· 26 mmH produktu, 28 mmH 4-nitrofenolu i 31 mmmH dicykloheksylc^oocznl^ka suszono przez 2 godziny pod wysoką próżnią. V warunkach bezwodnych dodano 3 ol chlorku metylenu, mieszano przez 1 godzinę.

160 846

Do lg szkła o kontrolowanej porowatości z składającym się z atomów węgla, azotu i tlenu dodano produkt w 1 ml trietyoaaminy, mieszano przez 20 godzin, odsączono i przemyto metanolem i pirydyną. Otrzymano produkt o zawartości 35yumooi na lg stałego nośnika.

Przykład V. 5*-dimetokeytrlfenylometylo-2 ddzzksaguaanozyna związana ze stałym nośnikiem. Analogicznie jak w przykładzie IV otrzymano produkt o ztwattości 41,3/moli na lg stałego nośnika.

Przykład VI. 5 -dimetokaytΓifenalometylo-2*-dzzkkaycyaydyna związana ze stałym nośnikiem. Analogicznie Jak w przykładzie IV otrzymano produkt o zawartości 39,8^uwoi na lg stałego nośnika.

Nowe pochodne nukleozydów zastosowano do wytwarzania fragmentów genów metodą kondenasaCi· Otrzymano fragmenty zawierające 14 do 40 nukleotydów, które enzymaayoznie połączono uzyskując np. gen kodująoy ludzką kachektynę, która Jest znanym lekiem przneawn<»Γoaιroroaym·

160 846

WZOR 9

ch₂

I o=c

NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂fyH

C®0

ĆH₂ ch₂ oEt o=ę

CPG—O-St —ch₂ch₂ch₂nh

WZÓR 10

OEt

160 846 ch₃

II I h-n-c-ch₂-o-ch nA Ćh₃ p-r₃

Nr₂

WZÓR 5 WZÓR 6

WZÓR?

160 846

Ηθη 0

OH Z

W2ÓR1

WZÓR 2

II

CH,

H-N-C-CH,-O-CH

I 4 I ch₃

WZÓR 3

WZÓR A

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób wytwarzania nowych pochodnych nukleozydów o ogólnym wzorze 1, w którym Y oznacza grupę dimetokaytrifenylometylową. Z oznacza grupę o wzorze 6, w kt^i^m Rg oznacza grupę 2-cyjanoetoksylową, a Rj oznacza grupę diizopropyloaminuwą, albo Z oznacza atały nośnik związany kowalencyjnie z nukleozydem, Z oznacza atom wodoru lub grupę OH, a B oznacza grupę o wzorze 3, 4 lub 5, znamienny tym, że związek o wzorze 2, w którym B'oznacza resztę adeniny, guaniny lub cytozyny o wzorach odpcowedido 7, 8, 9, a Z ma wf^ż®j podane znaczenie poddaje aię reakcji z chlorkiem lub bezwodnikiem lzopropokayacetylwwym, w ob^<^^<^^<ci nadMaru halogenku trialkiloeililwwago, selektywnie hydrolizuje aię grupy ailUwie w obecności wody, po czym otrzymany związek o wzorze 1, w którym Z mi wyżej podane znaczenie, X i Y oznaczają atom wodoru, i B oznacza grupę o wzorze 3, 4 lub 5 poddaje aię reakcji z chlorkiem 4,4dimetokaytrifenylometylawym, a następnie reakcji w pozycji 3 albo z Ν,Ν,ΝΝ'te traizopropylodaamidofo8loyynem 0-2-cyjanoełylawym, lub acetylowaniu, eetryfik^ji 4-nitrofenolem i reakcji ze stałym nośnikiem o organicznym łańcuchu zawierającym atomy węgla, azotu i tlenu.

* ♦ *