PL162317B1

PL162317B1 - Method for controlling transcription of a chemically controlled gene in plant material

Info

Publication number: PL162317B1
Application number: PL89278117A
Authority: PL
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1988-03-08
Filing date: 1989-03-07
Publication date: 1993-09-30
Also published as: PL278117A1; ZA891726B; DD283647A5

Abstract

1 Sposób regulowania transkrypcji dajacego sie regulowac chemicznie genu w materiale roslinnym, zna- mienny tym, ze A / wyodrebnia sie zasadniczo czysta, dajaca sie regulowac chemicznie sekwencje D N A z daja cego sie regulowac chemicznie genu wystepujacego w ukladzie naturalnym zawierajacym ten gen, droga akty wowania ekspresji R N A z dajacego sie regulowac chemi cznie genu w tym ukladzie, izolowania tego RN A , rózni cujacego skriningowania genomowego banku RN A gene rowanego z RN A wyizolowanego z tego zaktywowanego ukladu, jak równiez banku R N A generowanego z RN A wyizolowanego z ukladu kontrolnego, który nie byl aktywowany, izolowania klonu genomowego, subklo now ano dajacego sie regulowac chemicznie genu z tego klonu genomowego i izolowania zadanej, dajacej sie regulowac chemicznie sekwencji D N A , B / wytwarza sie dajaca sie regulowac chemicznie chimerowa sekwencje D N A zawierajaca pierwsza, nie kodujaca, dajaca sie regulowac chemicznie komponentowa sekwencje D N A wyodrebniona w etapie A /, majaca zdolnosc regulowa nia transkrypcji powiazanej z nia sekwencji D N A w ros linie lub tkance roslinnej, gdzie ta regulacja zalezy od regulatora chemicznego, i druga komponentowa sek wencje D N A mogaca podlegac transkrypcji jako RN A majacy zdolnosc regulowania ekspresji cechy fenotypo- wej wedlug mechanicznego anty-sensownego, albo mogaca podlegac transkrypcji i translacji w roslinie lub tkance roslinnej z wytworzeniem polipeptydu ujawniajacego sie cecha fenotypowa, droga ligacji pierwszej........................ F ig 1 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób regulowania transkrypcji dającego się regulować chemicznie genu w materiale roślinnym.

Postęp w technologii rekombinacji DNA w powiązaniu z osiągnięciami w technologii transformacji i regeneracji roślin umożliwiał wprowadzenie nowego materiału genetycznego do komórek roślinnych, roślin lub tkanek roślinnych, a więc, wprowadzenie nowych cech, to jest fenotypów, zwiększających wartość roślin lub tkanek roślinnych. Wytworzone w ostatnich latach zmodyfikowanymi technikami inżynierii genetycznej rośliny odporne na patogeny (europejskie zgłoszenia patentowe EP-A240332 i EP-A223452) lub owady [M. Vaeck i inni, Naturę 328, 33 (1987)] oraz uzyskiwanie roślin tolerujących środki chwastobójcze [M. DeBlock i inni, EMBO J. 6,2513 (1987)] jasno demonstrują możliwości ulepszania roślin uprawnych. Celem modyfikacji może być szeroki zakres roślin, od drzew i krzewów do kwiatowych roślin ozdobnych i roślin uprawnych. Faktycznie okazało się, ze „roślinę uprawną może stanowić kultura tkanki roślinnej hodowana w bioreaktorze, będąca źródłem dla produktu naturalnego.

W niektórych przypadkach byłoby korzystne kontrolowanie czasu i/lub rozmiarów ekspresji materiału genetycznego wprowadzanego do roślin, komórek roślinnych lub tkanek roślinnych. Idealnym rozwiązaniem byłoby dowolne regulowanie ekspresji wprowadzonej genetycznie cechy, poprzez regulowanie półproduktu, co można byłoby łatwo stosować do roślin uprawnych, krzewów ozdobnych, bioreaktorów i podobnych. Można to obecnie zrealizować za pomocą układu ekspresji genu chimerowego dającego się regulować chemicznie. Układ taki zawiera dającą się regulować chemicznie niekodującą sekwencję DNA sprzężoną przykładowo z genem kodującym cechę fenotypową, tak, ze ekspresja tej cechy znajduje się pod kontrolą regulatora, co oznacza, ze ekspresja regulowanego genu jest determinowana obecnością lub nieobecnością regulatora chemicznego. Układ ten jest pierwszym urzeczywistnieniem koncepcji chemicznego regulowania ekspresji genu chimerowego w roślinach lub tkankach roślinnych. Umożliwia on uzyskiwanie transgenicznych roślin oraz kontrolę ekspresji żądanych cech jako funkcji regulatora chemicznego.

A. Przegląd technologii transformacji roślin.

Znane są różne metody prowadzenia transformacji genetycznej roślin i tkanek roślinnych (to jest, trwałego wprowadzania obcego DNA do roślin). Obejmują one transformację za pomocą rodzaju Agrobacterium oraz transformację przez bezpośrednie przeniesienie genu.

1. Transformacje za pośrednictwem Agrobacterium.

Agrobacterium tumefaciens jest czynnikiem etiologicznym narośli rakowatych (crown gali), choroby wielu roślin dwuliściennych i nagozalążkowych, powodującym powstawanie w miejscu zakażenia nowotworów lub gallusów w tkance roślinnej. Agrobacterium, które normalnie zakaza

162 317 roślinę w miejscu zranienia, jest nośnikiem dużego, pozachromosomalnego elementu, zwanego plazmidem Ti (indukującym nowotwór). Plazmidy Ti zawierają dwa regiony odpowiedzialne za działanie nowotworowe. Jednym takim regionem jest T-DNA (obcy, przeniesiony DNA), będący sekwencją DNA, która przenoszonajest na stałe do genomowego DNA rośliny. Drugim regionem potrzebnym do ujawnienia się działania nowotworowego jest region vir (region wirulencji), biorący udział w mechanizmie przeniesienia. Jakkolwiek region vir jest bezwzględnym warunkiem trwałej transformacji, to sam vir-DNA nie jest przenoszony do zakażonej rośliny. Transformacja komórek roślinnych przez wykorzystanie infekcji bakterią Agrobacterium tumefaciens i następne przeniesienie samego T-DNA jest juz dobrze udokumentowane [np. Μ. V. Bevan iM. D. Chilton, Int. Rev. Genet. 16, 357 (1982)].

Po kilkunastu latach intensywnych badań w wielu laboratoriach nastąpił taki rozwój układu Agrobacterium, który pozwolił na rutynową transformację wielu różnych tkanek roślinnych. Do tkanek roślinnych transformowanych w ten sposób należą: tkanki tytoniu, pomidorów, słonecznika, bawełny, rzepaku, soji i topoli. Pomimo, ze znanych jest bardzo wielu gospodarzy podlegających transformacji plazmidem Ti z użyciem A. tumefaciens jako czynnika zakażającego, to gospodarzem z wyboru jest tytoń z powodu łatwości manipulacji.

Agrobacterium rhizogenes również stosuje się jako wektor do transformacji roślin. Bakteria ta, pobudzająca ukorzenianie u wielu rodzajów roślin dwuliściennych, jest nośnikiem wielkiego elementu pozachromosomalnego, zwanego plazmidem Ri (indukującym wytwarzanie korzeni), funkcjonującego w sposób analogiczny do plazmidu Ti w A. tumefaciens. Transformacja z użyciem A. rhizogenes rozwinęła się podobnie jak transformacja z zastosowaniem A. tumefaciens. Stosuje się ją z powodzeniem do transformowania np. lucerny, Solanum nigrum L. i topoli.

2. Bezpośrednie przeniesienia genu.

W celu transformowania roślin lub tkanek roślinnych bez użycia Agrobacterium jako pośrednika, opracowano szereg procedur tak zwanego bezpośredniego przeniesienia genu. W technice bezpośredniego transformowania protoplastów wejście egzogennego materiału genetycznego do protoplastu można wzmagać stosując środek chemiczny lub pole elektryczne. Taki egzogenny materiał może być następnie włączany do genomu jądrowego. We wczesnych pracach doświadczenia prowadzono na dwuliściennym tytoniu. Okazało się, że obcy DNA wprowadzony do rośliny przechodził do roślin potomnych [np. J. Paszkowski i inni, EMBO J. 3, 2717 (1984) i J. Potrykus i inni, Mol. Gen. Genet. 199, 169 (1985)]. Stosując tę procedurę dokonywano również transformacji protoplastów roślin jednoliściennych, np. Triticum monococcum, Lolium multiflorum (rajgras włoski), kukurydzy i czarnej meksykańskiej kukurydzy słodkiej.

Alternatywnie, obcy DNA można wprowadzać do komórek lub protoplastów przez mikromiekcję. Roztwór plazmidowego DNA wstrzykuje się bezpośrednio do komórki stosując odpowiednio wyciągniętą szklaną kapilarę. W ten sposób transformowano protoplasty lucerny szeregiem plazmidów [np. T. J. Reich i inni, Bio/Technology, 4, 1001 (1986)].

Stosunkowo niedawną procedurą bezpośredniego transformowania genów jest bombardowanie komórek mikropociskami zawierającymi DNA. Patrz T. M. Klein i inni, Naturę 327, 70 (1987). W procedurze tej cząsteczkom wolframu powleczonym egzogennym DNA nadaje się przyspieszenie w kierunku docelowym komórek. W opisywanym przykładzie (cebula) uzyskano co najmniej przejściową ekspresję.

B. Regenerowanie transformowanych tkanek roślinnych.

Tak jak znanych jest wiele metod transformowania tkanek roślinnych, istnieje też wiele sposobów regenerowania roślin z tkanek roślinnych. Wybór konkretnej metody regenerowania zależy od wyjściowej tkanki roślinnej oraz od rodzaju rośliny, która ma być regenerowana. W ostatnich latach stało się możliwe regenerowanie gatunków roślin z tkanki kallusowej pochodzącej z wycinków. Do roślin zdolnych do regeneracji z kallusów należą rośliny jednoliścienne, takie jak kukurydza, ryz, jęczmień, pszenica i żyto, oraz rośliny dwuliścienne, takie jak słonecznik, soja, bawełna, rzepak i tytoń.

Regenerację roślin z tkanek transformowanych bakterią A. tumefaciens prowadzi się już na wielu gatunkach roślin, do których należą: słonecznik, pomidory, koniczyna biała, rzepak, bawełna, tytoń i topola. Przeprowadzono również regenerację lucerny z tkanki transformowanej bakterią A. rhizogenes. Szczególnie użyteczną techniką jest regeneracja roślin z protoplastów

162 317 (D. A. Evans i inni, Handbook of Plant Celi Culture, tom I, wyd. MacMillan Publ. Co 1983, str. 124). Jeśli dany gatunek rośliny może być regenerowany z protoplastów, to wówczas można zastosować procedury bezpośredniej transformacji genu. Taka transformacja nie jest zależna od użycia A.' tumefaciens. Regenerację roślin z protoplastów prowadzi się z powodzeniem na ryżu, tytoniu, rzepaku, ziemniaku, oberżynie, ogórku, topoli i kukurydzy.

Osiągnięcia w technologii transformacji roślin i technologii regenerowania roślin wpływają na zwiększenie potencjalnych możliwości ulepszania roślin na drodze inżynierii genetycznej. I tak, donoszono juz o ulepszonych genetycznie roślinach tytoniu i pomidorów odpornych na infekcje np. wirusem mozaiki tytoniowej (TMV) i odporne na różne klasy środków chwastobójczych. Cechę odporności na owady nadawano drogą inżynierii genetycznej roślinom tytoniu i pomidorów.

C. Kultury komórkowe.

Możliwości inżynierii genetycznej nie ograniczają się do roślin uprawnych lecz również obejmują rośliny ozdobne, paszowe i drzewa. Mniej oczywistym celem biotechnologu roślin, obejmującej zarówno techniki inżynierii genetycznej jak i zastosowania kultur tkankowych, jest zwiększenie produkcji pochodzących z roślin związków chemicznych, takich jak środki zapachowe, barwniki, naturalne środki słodzące, surowce przemysłowe, środki przeciwdrobnoustrojom i farmaceutyki. W większości przypadków związki te należą do szerokiej grupy metabolicznej, ogólnie zwanej produktami wtórnymi. Rośliny mogą wytwarzać tego typu produkty dla obrony przed szkodnikami, przyciągania owadów zapylających lub dla zwalczania chorób infekcyjnych.

Z całego szeregu gatunków roślin można uzyskać kultury komórek roślinnych, które dają się namnazać w bioreaktorze. Większość roślin wytwarzających produkty wtórne o znaczeniu handlowym należy do typowych gatunków. Fakt, że istnieją możliwości indukowania i selekcjonowania trwałych odmian genetycznych pochodzących z kultur tkankowych komórek somatycznych roślin (odmiany somaklonalne) udowodniono w doświadczeniach na wielu roślinach uprawnych ważnych dla rolnictwa. Wytwarzanie związków wtórnych przez hodowlę tkanek roślinnych posiada wiele zalet. Obejmują one (1) możliwość uzyskania produktu o większej czystości, (2) konwersję tanich prekursorów w drogie produkty końcowe w procesie biotransformacji, (3) możliwość wytwarzania nowych związków przez podawanie do hodowli analogów substratu.

D. Korzyści z kontrolowanej ekspresji genu.

Niezależnie od tego, czy celem manipulacji genetycznych roślin jest roślina uprawna, krzew ozdobny, kwiat, drzewo czy hodowla-kultura przeznaczona do hodowli w bioreaktorze, główną korzyścią, jaką powinno się osiągnąć jest kontrola ekspresji genu chimerowego w taki sposób, aby ta ekspresja zachodziła w odpowiednim czasie, w odpowiednim wymiarze i tylko w pewnych sytuacjach w poszczególnych częściach rośliny. Przykładowo, aby uzyskać żądany fenotyp, może być potrzebna ekspresja genu chimerowego na poziomie 1 procent białka ogólnego lub wyższym. Taki przypadek może dotyczyć oporności na grzyby będącej wynikiem ekspresji genu chimerowego i wytwarzania chitynazy albo odporności na owady w wyniku zwiększonej ekspresji genu wytwarzającego inhibitor proteinazy. W tych przypadkach, energia wydatkowana na wytwarzanie wysokich poziomów obcego białka może wyrządzać szkody roślinie, natomiast, jeśli ekspresja genu następuje tylko wtedy, gdy jest to potrzebne, np. w razie niebezpieczeństwa zakażenia grzybem lub owadem, straty energii, a zatem i straty wydajności mogą być ograniczone.

Alternatywnie, jeśli ekspresja genu chimerowego kodującego cechę fenotypową następuje w nieodpowiednim czasie w cyklu rozwojowym rośliny, może to działać niekorzystnie na roślinę. Przykładowo, jeśli produktem genu chimerowego jest hormon roślinny indukujący odcinanie, wówczas wczesna ekspresja mogłaby spowodować odcinanie owocu z rośliny zanim dojrzeją nasiona, a zatem obniżenie wydajności. W tym przypadku byłoby znacznie bardziej korzystne indukowanie ekspresji tego typu genu w czasie, kiedy odcinanie strąka jest korzystne lub mniej szkodliwe dla rośliny.

W przypadku tkanek w kulturze lub w bioreaktorze, wytwarzanie produktu wtórnego w sposób ciągły może prowadzić do zmniejszenia szybkości wzrostu kultury i w rezultacie do zmniejszenia wydajności produktu. Byłoby korzystniej pozwolić na wzrost kultury bez ekspresji produktu wtórnego, a następnie w odpowiednim czasie indukować gen chimerowy tak, aby uzyskać optymalną ekspresję żądanego produktu.

162 317

Biorąc pod uwagę aspekty wyżej wzmiankowane jak również inne staje się oczywiste, ze byłoby wysoce pożądane kontrolowanie czasu, rozmiarów i lub miejsca ekspresji genu chimerowego w roślinach lub w tkankach roślinnych. Kontrola, którą łatwo byłoby uzyskać na polu, w cieplarni lub w bioreaktorze, miałaby szczególne znaczenie handlowe.

E. Znane, podlegające regulacji układy ekspresji genów w roślinach.

Wiadomo, ze niektóre geny roślinne są indukowane różnymi czynnikami wewnętrznymi i zewnętrznymi, takimi jak hormony roślinne, szok cieplny, substancje chemiczne, patogeny, brak światła lub tlenu. Chociaż szczegółowo opisanych jest niewiele takich układów, to z obserwacji układów najlepiej scharakteryzowanych wynika, ze zwiększona akumulacja mRNA prowadzi do zwiększonego poziomu specyficznego produktu białkowego.

Jako przykład regulacji genu przez hormon roślinny można wymienić indukowanie przez kwas abscysynowy (ABA) dużej ilości mRNA związanego z późną embriogenezą w bawełnie [G. A.Galau i inni, Plant Mol. Biol. 7,155 (1986)]. Innym przykładem jest indukowanie przez kwas giberelinowy (GA3) transkryptów syntazy jabłczanowej w nasionach rycynusa i izozymów alfaamylazy waleuronowych warstwach jęczmienia [D. Rodriguezi inni, Plant Mol. Biol. 9,227(1987), R. C. Nolan i inni, Plant Mol. Biol, 8, 13 (1987)].

Dokładnie zbadano regulację genów białka szoku cieplnego w soji. Utrzymywanie roślin przez kilkanaście godzin w temperaturze 40°C powoduje syntezę de novo pewnych tak zwanych białek szoku cieplnego [J. Key i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 3526 (1981)]. Wyizolowano kilka takich genów i prześledzono dokładnie ich regulację. Ekspresja tych genów jest początkowo kontrolowana na poziomie transkrypcji. Dokonano fuzji promotora genu hsp70 z genem neomycyno-fosfotransferazy II (NptII). Okazało się, ze taki gen chimerowy jest indukowany szokiem cieplnym [A. Spena i inni, EMPBO J. 4, 2736 (1985)], aczkolwiek na nizszym poziomie niż endogenne geny szoku cieplnego.

Inną klasą genów indukowanych w roślinach są geny regulowane światłem. Należy do nich jądrowy gen dla małej podjednostki rybulozo-l,5-bisfosforano-karboksylazy (RUBISCO). Wykazano [G. Morelli i inni, Naturę 315, 200 (1985) i L. Hererra-Estrella, Naturę 310, 115 (1984)], że sekwencje flankujące 5' genu pea RUBISCO mogą nadawać zdolność indukowania przez światło opisywanemu genowi, jeśli połączony jest on w sposób chimerowy. Obserwacja ta okazała się słuszna również dla innych genów indukowanych światłem, takich jak gen białka wiążącego chlorofil a/b.

Wyczerpująco zbadano geny dehydrogenazy alkoholowej (adh) kukurydzy. Wyizolowano gen adhl-s z kukurydzy. Okazało się, że część 5'-flankującego DNA ma zdolność indukowania ekspresji opisywanego chimerowego genu (to jest genu acetylotransferazy chloramfenikolu, CAT), o ile przejściowo transformowaną tkankę poddać warunkom anaerobowym [E. Howard i inni, Planta 170, 535,(1987)].

Ostatnio opracowano grupę związków znanych jako „środki ochronne, chroniących rośliny uprawne przed potencjalnym zniszczeniem przez stosowanie środków chwastobójczych. Chociaż ogólny mechanizm działania tych związków nie jest w pełni wyjaśniony, zakłada się, ze jednym z możliwych mechanizmów może być regulacja genów podlegających regulacji naturalnej. Ostatnio doniesiono, ze w kukurydzy traktowanej środkiem ochronnym, estrem benzylowym kwasu 2chloro-4-trójfluorometylo-5-metylotiazolokarboksylowego, indukowane są wyższe poziomy glutationo-S-transferazy (SGT), [R. C. Wiegand i inni, Plant Mol. Biol., 7,235 (1986)]. Pomimo, iz stwierdzono podwyższanie się poziomu GST mRNA pod wpływem traktowania środkiem ochronnym, to nie omówiono mechanizmu prowadzącego do takiego podwyższenia.

Wiele roślin reagujących nadwrażliwością na różne patogeny ulega stymulacji z wytworzeniem grupy dających się ekstrahować kwasem białek o niskiej masie cząsteczkowej, związanych z patogenezą (PR) [L. C. Van Loon, Plant Mol. Biol. 4, 111 (1985)]. Szczególnie interesująca jest jednak obserwacja, ze te same białka PR gromadzą się w wysokich poziomach w roślinach traktowanych środkami chemicznymi, takimi jak kwas poliakrylowy i kwas acetylosalicylowy [S. Gianinazzi i inni, J. Gen. Virol. 23,1 (1974), R. F. White, Virology 99,410(1979)]. Okazało się, ze istnieje korelacja między obecnością białek PR, a indukowaniem oporności przeciw wielu różnym patogenom zarówno miejscowej jak i systemicznej. Zaobserwowano, że interspecyficzna

162 317 hybryda tytoniu odporna na wirusa mozaiki tytoniowej (TMV) wytwarza konstytutywnie białka PR [P. Ahli inni, Plant Sci. Lett. 26, 173 (1982)]. Ponadto, immunoprecypitacja produktów translacji in vitro z zastosowaniem mRNA z tytoniu albo zakażonego TMV albo traktowanego środkiem chemicznym wskazuje, że zwiększony poziom białka PR jest wynikiem akumulacji RNA [B. J. C. Cornelissen i inni, EMBO J., 5,37 (1986), J. P. Carr i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7999 (1985)]. Tak więc, indukowanie genów białka PR substancjami chemicznymi bądź patogenami jest drogą rozwiązania problemu chemicznej regulacji ekspresji genu w roślinach i w tkankach roślinnych.

Wynalazek obejmuje regulowanie ekspresji genu chimerowego i/lub heterologicznego w transformowanych roślinach.

Zgodny z wynalazkiem sposób regulowania transkrypcji dającego się regulować chemicznie genu w materiale roślinnym polega na tym, ze a/ wyodrębnia się zasadniczo czystą, dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA z dającego się regulować chemicznie genu występującego w układzie naturalnym zawierającym ten gen drogą aktywowania ekspresji RNA z dającego się regulować chemicznie genu w tym układzie, izolowania tego RNA, różnicującego skriningowania genomowego banku RNA generowanego z RNA wyizolowanego z tego zaktywowanego układu, jak również banku RNA generowanego z RNA wyizolowanego z układu kontrolnego, który nie był aktywowany, izolowania klonu genomowego, subklonowania dającego się regulować chemicznie genu z tego klonu genomowego i izolowania żądanej, dającej się regulować chemicznie sekwencji DNA, B/ wytwarza się dającą regulować chemicznie chimerową sekwencję DNA zawierającą pierwszą, me kodującą, dającą się regulować chemicznie komponentową sekwencję DNA wyodrębnioną w etapie a/, mającą zdolność regulowania transkrypcji powiązanej z nią sekwencji DNA w roślinie lub tkance roślinnej, gdzie ta regulacja zalezy od regulatora chemicznego, i drugą komponentową sekwencję DNA mogącą podlegać transkrypcji jako RNA mający zdolność regulowania ekspresji cechy fenotypowej według mechanizmu anty-sensownego, albo mogącą podlegać transkrypcji i translacji w roślinie lub tkance roślinnej z wytworzeniem polipeptydu ujawniającego się cechą fenotypową, drogą ligacji pierwszej, nie kodującej, dającej się regulować chemicznie komponentowej sekwencji DNA z drugą komponentową sekwencją DNA, c/ transformuje się protoplasty roślin, komórki roślin, tkanki roślinne lub całe rośliny za pomocą chimerowej sekwencji DNA wytworzonej w etapie b/, stosując metody transformacji polegające na transformacji za pośrednictwem Agrobacterium, bezpośrednim przenoszeniu genów, mikroimekcji lub bombardowaniu mikropociskami, wybiera się stransformowane komórki lub tkanki roślinne i e/ stosuje się regulator chemiczny na tkankę roślinną, roślinę lub nasiona, zawierające chimerową sekwencję DNA z etapu b/.

Figura 1 przedstawia mapę restrykcyjną lambda tobchrPR1013. Przedstawiony jest rekombinantowy genom faga o długości 49 kb z prawym i lewym ramieniem lambda. Poniżej mapy genomu faga lambda jest pokazany powiększony insert tytoniu o długości 19 kb. Położenie genu PR-la jest oznaczone polem zakratkowanym, a kierunek transkrypcji oznaczony jest strzałką. P = Pst, H = Hind III, C = Ciał, R = EcoRI.

Figura 2 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pBS-PR013Cla z faga lambda tobchrPR1013. Fragment o długości 19 kb między dwoma miejscami dla Ciał jest subklonowany do plazmidu „bluescript. C = ClaI, agaroza LGT =agaroza o niskiej temperaturze żelowania.

Figura 3 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pBS-PR 1013Eco z lambda tobchrPR 1013. Fragment EcoRI o długości 3,6 kb, zawierający gen PR-1A z lambda tobchrPrl013,subklonujesię do plazmidu „bluescript. R = EcoRI, agaroza LGT = agaroza o niskiej temperaturze żelowania.

Figura 4 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pBS-PR1013Eco z pBS-PR1013Cla. Fragment EcoRI o długości 3,6kb, zawierający gen PR-la, subklonuje się do miejsca EcoRI w plazmidzie „bluescript C = ClaI, R = EcoRI, agaroza LGT = agaroza o niskiej temperaturze żelowania.

Figura 5 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pBS-PR 1013EcoAPst z pBS-PR 1013Eco. Z pBS-PR 1013Eco usuwa się fragment Pstl o długości 600 bp. P = PstI, R = EcoRI, X = XhoI, S — Sali, agaroza LTG = agaroza o niskiej temperaturze żelowania.

Figura 6 przedstawia sposób konstruowania pBS-PR1013EcoAPstAXho z pBS-PR1013EcoAPst. Z plazmidu pBS-PR1013EcoAPst usuwa się fragment Xhol o długości 2kb. R = EcoRi, P = PstI, X = XhoI, S = SalI, agaroza LTG = agaroza o niskiej temperaturze żelowania.

162 317

Figura 7 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pCIB270 z pBI 101.3 i pBSPR1013EcoAPstAXho. Fragment Pstl-Xhol, zawierający część genu PR-la i sekwencję flankującą 5', subklonuje się do pBI 101.3 trawionego uprzednio Sall-BamHI. Miejsca Xho i Sali są między sobą zgodne i podczas ligacji likwidują się obydwa te miejsca restrykcyjne. Miejsce Pstl adaptuje się do miejsca BamHI stosując adapter molekularny. X = XhoI, P=PstI, (X/S) = miejsce fuzji Xhol i Sali. Miejsca (X/S) nie przetme żaden enzym. LB = lewe ramię T-DNA, RB = prawe ramię T-DNA. Kierunek transkrypcji z dającego się indukować regionu PR-la w plazmidzie pCIB270 jest pokazany strzałką. Pola zakratkowane w plazmidzie pCIB270 oznaczają miejsce 3' procentu w genie NOS. Zaciemnione pole w pCIB270 oznacza gen beta-glukuronidazy. Pole zakropkowane w pCIB270 oznacza gen neomycyno-fosfotransferazy II. Pole zakreskowane oznacza promotor NOS.

Figura 8 przedstawia sposób konstruowania plazmidów M13mpl8-PR1013EcoAPstAXho oraz M13mpl9-PR1013EcoAPstAXho. Fragment Pstl-Asp718, zawierający część sekwencji kodującej PR-la oraz sekwencję flankującą 5', subklonuje się z pBS-PR1013EcoAPstAXho do M13mpl8 lub 19 trawionych uprzednio enzymami Asp718 i Pstl. R = EcoRI, H = Hindlll, P = Pstl, K = KpnI (Asp718 jest izoschizomerem KpnI), agaroza LGT = agaroza o niskiej temperaturze żelowania.

Figura 9 przedstawia schemat konwersji kodonu ATG z PR-la do miejsca Ncol. Linią ciągłą oznaczony jest jednoniciowy DNA z M13mpl8-PR1013EcoAPstAXho. Sekwencję TCATGG przekształca się w sekwencję CCATGG poprzez kierowaną miejscem mutagenezę. K = KpnI, X = XhoI, B = BstEII, P=PstI.

Figura 10 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pCIB268. Fragment BstEII-Pstl pochodzący z replikacyjnej formy M13mpl8-PR1013EcoAPstAXho.Nco subklonuje się do pBSPR1013EcoAPstAXho trawionego uprzednio BstEII-Pstl, z utworzeniem pCIB268. X = XhoI, B — BstEii, N = Ncol, P = Pstl.

Figura 11 przedstawia sposób konstruowania pCIB269 z pBS-GUS 1.2 i pCIB268. X = Xhol, N = NcoI, P = PstI. Pole zakratkowane w plazmidzie pCIB269 oznacza sekwencje genu GUS, a pole zacienione oznacza sekwencje pochodzące z genu PR-la.

Figura 12 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pBS-GUS1.2. Plazmid pBS-GUS1.2 uzyskuje się poprzez trójstopniową ligację z fragmentów pochodzących z pRAJ265, pBI221.1 i plazmidu „bluescript. S — Sali, R = EcoRI, N = Ncol.

Figura 13 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pCIB271 z pCIB269 i pCIB200. X = Xhol, N = Ncol, R = EcoRI, S = Sali, (S/X) = fuzja miejsc Sali i Xhol, agaroza LGT = agaroza o niskiej temperaturze żelowania.

Figura 14 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pCIB219. Plazmid ten konstruuje się przez dodanie fragmentu adaptowa EcoRI/XhoI do fragmentu XhoI/EcoRi z pCIB269 zawierającego geny PR-1 i GUS i następną ligację do pCIB712 trawionego Sali.

Figura 15 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pCIB272. Plazmid ten konstruuje się przez ligację fragmentu Asp718I/BamHI z pCIB282, zawierającego gen PR-1 GUS (-833 do + 1 z PR-1 A) z plazmidem pCIB200 uprzednio trawionym Asp7181/BamHI.

Figura 16 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pCIB273. Plazmid ten kontruuje się przez ligację fragmentu Asp7181/BamHI zpCIB283 zawierającego gen PR-1 GUS (-603 do + 1 z PR-la) z plazmidem pCIB200 trawionym Asp7181/BamHI.

Figura 17 przedstawia mapę restrykcyjną pCIB1004. Ten plazmid konstruuje się przez ligację fragmentu Xhol/Ncol z pCIB269 (zawierającego promotor PR-la) z genem BT wyciętym z pCIB10(35Bt/607) jako fragment Ncol/BamHI i pCIB710 trawionym Sall/BamHI.

Figura 18 przedstawia mapę restrykcyjną pCIB200/PRl-BT. Plazmid ten konstruuje się z pCIB1004 i pCIB200.

Figura 19 przedstawia mapę restrykcyjną pCIB1207. Fragment Xbal o długości 5,8 kb z klonu genomowego lambda zawierającego gen AHAS Arabidopsis klonuje się do plazmidu „bluescript trawionego Xbal.

162 317

Figura 20 przedstawia mapę restrykcyjną pCIB 1216. Fragment Ncol/Xbal o długości 3,3 kb z plazmidu CIB1207 klonuje się do pCIB269 uprzednio ciętego enzymami Ncol i Xbal dla usunięcia genu GUS.

Figura 21 przedstawia mapę restrykcyjną pCIB1233. Z plazmidu pCIB 1216 izoluje się fragment Kpnl/Xbal o długości 4,2 kb i poddaje się go ligacji z pCIB200 uprzednio trawionym enzymami KpnI i Xbal.

Figura 22 przedstawia mapę restrykcyjną pBSGluc39.1-GUS. Fragment z pBSGluc39.1 o długości 1462 bp klonuje się do BS-GUS1.2 uprzednio trawionego enzymami Ncol i KpnI.

Figura 23 przedstawia mapę restrykcyjną pCIB200/Gluc39.1-GUS. Z plazmidu pBSGluc3 9.1/GUS izoluje się fragment Kpnl/Xbal zawierający promotor β-glukanazy i gen GUS, po czym poddaje się go ligacji z pCIB200 uprzednio trawionym KpnI i Xbal.

Figura 24 przedstawia mapę restrykcyjną pCIB200/GIuc39.1-BT. Poddaje się ligacji: fragment KpnI/Ncol z pCIB 1004 zawierający gen BT, fragment KpnI/Ncol z pBSGluc39.1/GUS oraz pCIB200 cięty enzymem KpnI i traktowany alkaliczną fosfatazą z grasicy cielęcej.

Figura 25 przedstawia mapę restrykcyjną pBSGluc39.1/AHAS, konstruowanego z fragmentu Ncol/Xbal plazmidu pBSGluc.39.1/GUS i fragmentu Ncol/Xbal o długości 3,3 kb z pCIB1207 zawierającego gen AHAS.

Figura 26 przedstawia mapę restrykcyjną pCIB200/Gluc39.1-AHAS. Z pBSGluc39.1/ / AHAS izoluje się fragment Kpnl/Xbal zawierający promotore-glukanazy i poddaje się go ligacji z pCIB200 uprzednio ciętym enzymami KpnI i Xbal.

Figura 27 przedstawia mapę restrykcyjną pBSGLuc39.3/GUS. Fragment z pBSGluc39.3 o długości 1677 bp klonuje się do pBS-GUS1.2 uprzednio trawionego Ncol i KpnI.

Figura 28 przedstawia mapę restrykcyjną pCIB200/Gluc39.3-GUS. Z plazmidu pBSGluc3 9.3/GUS izoluje się fragment Kpnl/Xbal zawierający promotor j3-glukanazy i gen GUS, po czym poddaje się ligacji z pCIB200 trawionym KpnI i Xbal

Figura 29 przedstawia mapę restrykcyjną pCIB200/Gluc39.3-BT. Poddaje się ligacji: fragment KpnI/Ncol z pCIB 1004 zawierający gen BT, fragment KpnI/Ncol z pBSGluc39.3/GUS oraz pCIB200 uprzednio trawiony KpnI i traktowany alkaliczną fosfatazą z grasicy cieląt.

Figura 30 przedstawia mapę restrykcyjną pBSGluc39.3/AHAS, konstruowanego z fragmentu Ncol/Xbal, pBSGluc39.3/GUS i fragmentu Ncol/Xbal o długości 3,3 kb z pCIB1207 zawierającego gen AHAS.

Figura 31 przedstawia mapę restrykcyjną pCIB200/Gluc39.3-AHAS. Z pBSGluc39.3/AHAS izoluje się fragment Kpnl/Xbal zawierający promotor /3-glukanazy i gen AHAS i poddaje się ligacji z pCIB200 trawionym KpnI i Xbal.

Figura 32 przedstawia mapę restrykcyjną pCIB 1208. Fragment Xbal o długości 5,8 kb z klonu genomowego lambda, zawierający zmutowany gen AHAS Arabidopsis klonuje się do plazmidu „bluescript¹¹ trawionego Xbal.

Figura 33 przedstawia mapę restrykcyjną pCIB 1230. Fragment Ncol/Xbal o długości 3,3 kb z plazmidu pCIB 1208 klonuje się do pCIB269 uprzednio ciętego enzymami Ncol i Xbal dla usunięcia genu GUS.

Figura 34 przedstawia mapę restrykcyjną pCIB1232. Z pCIB1230 izoluje się fragment Kpnl/Xbal o długości 4,2 kb i poddaje się go ligacji z pCIB200 uprzednio ciętym KpnI i Xbal.

Figura 35 przedstawia mapę restrykcyjną pBSGluc39.1/AHAS-SuR, skonstruowanego z fragmentu Ncol/Xbal plazmidu pBSGluc39.1/GUS oraz fragmentu Ncol/Xbal o długości 3,3 kb pochodzącego z pCIB 1208, zawierającego gen AHAS.

Figura 36 przedstawia mapę restrykcyjną pCIB200/Gluc39.1-AHAS-SuR. Z pBSGluc 39.1/AHAS-SuR izoluje się fragment Kpnl/Xbal zawierający promotor^-glukanazyi gen AHAS i poddaje się ligacji z pCIB200 ciętym KpnI i Xbal.

Figura 37 przedstawia mapę restrykcyjną pBSGluc39.3/AHAS-SuR, skonstruowanego z fragmentu Ncol/Xbal pochodzącego z pBSGluc39.3/GUS i fragmentu Ncol/Xbal o długości 3,3 kb pochodzącego z pCIB 1208 zawierającego gen AHAS.

Figura 38 przedstawia mapę restrykcyjną pCIB200/Gluc39.3/AHAS-SuR. Fragment Kpnl/Xbal zawierający promotor/3-glukanazy i gen AHAS izoluje się z plazmidu pBSGIuc39.3/AHASSuR i poddaje się go ligacji z pCIB200 uprzednio trawionym KpnI i Xbal.

162 317

Figura 39 przedstawia sekwencję genomowego DNA fragmentu o długości 2kb między miejscami Xhol i Bg 1II genu PR-1 tytoniu. Strzałka przy nukleotydzie 903 wskazuje miejsce startu transkrypcji, a pionowe strzałki na nukleotydach 207 i 313 oznaczają końce dwu niezależnych klonów cDNA, Ujawiona jest również sekwencja polipeptydowa kodowana przez część kodującą tego genu.

Figura 40 przedstawia sekwencję genomowego DNA genu PR-1 tytoniu i sekwencję aminokwasową polipeptydu kodowanego przez region kodujący tego genu.

Figura 41 przedstawia sekwencję cDNA dla chitynazy PR ogórka i sekwencję aminokwasową polipeptydu kodowanego przez region kodujący tego genu.

Figura 42 przedstawia sekwencję cDNA większej formy genu PR-R tytoniu, a fig. 42a przedstawia sekwencję z fig. 42 i sekwencję aminokwasową polipeptydu kodowanego przez region kodujący tego genu.

Figura 43 przedstawia sekwencję genomowego DNA genu zasadowej β-1,3-glukanazy tytoniu zawartego w klonie pBSGluc39.1.

Figura 44 przedstawia sekwencję genomowego DNA genu zasadowego /3-1,3-glukanazy tytoniu zawartego w klonie pBSGluc39.3.

Figura 45 przedstawia sekwencję cDNA PR-Q tytoniu zawartego w plazmidzie pBSchtl5.

Figura 46 przedstawia sekwencję DNA izolowanego cDNA zawartego w plazmidzie pBSGIóe. Ten cDNA koduje kwasową formę /3-1,3-glukanazy.

W niniejszym opisie opisano izolację, klonowanie i identyfikację sekwencji DNA mających zdolność regulowania w tkankach roślinnych transkrypcji powiązanej z nią sekwencji DNA, tam, gdzie regulacja ta jest zależna od refulatora chemicznego. Takie sekwencje DNA mogą mieć zastosowanie do konstruowania genów chimerowych, w których ekspresja genu może być regulowana tego typu regulatorami. Możność regulowania ekspresji genu chimerowego w roślinach transgenicznych metodą chemiczną ma zastosowanie do uzyskania odpowiedniej ekspresji cechy fenotypowej przy minimalnym niekorzystnym wpływie na wzrost i rozwój rośliny. Tego typu regulacja ma istotne znaczenie przy wytwarzaniu produktów wtórnych lub innych produktów klonowanych w kulturach tkanek roślinnych lub w bioreaktorach. Regulowanie klonowanej sekwencji jest również ważne dla regulowania produktów innego genu według mechanizmu anty-sensownego.

Ekspresję danej sekwencji kodującej w określonym, szczególnym czasie można regulować stosując regulator chemiczny, na ogół stosowany do tkanki roślinnej. Geny zaangażowane w kontrolę określonych pośrednich stadiów rozwoju mogą być również regulowane przez połączenie sekwencji DNA dającej się regulować chemicznie z odpowiednią sekwencją kodującą DNA. W ten sposób, zwiększając lub zmniejszając poziom regulatora chemicznego, można zatrzymywać rozwój rośliny w określonym stadium lub przyspieszać ten rozwój do określonej szybkości.

Dające się regulować chemicznie sekwencje DNA mogą być stosowane do zwiększania ekspresji obcych genów, np. nadających odporność lub tolerancję środków chwastobójczych (na przykład tolerancja atrazyny w soji), nadających odporność na owady (na przykład krystaliczne białko Bacillus thuringiensis w bawełnie) lub wymagających selektywnej ekspresji (na przykład bezpłodność żeńska lub męska). Dające się regulować chemicznie sekwencje DNA mogą również znaleźć zastosowanie do zwiększania transkrypcji takich sekwencji DNA, które będą kontrolowały ekspresję drugiej sekwencji DNA według mechanizmu anty-sensownego.

Zgodnie z powyższym, wynalazek dotyczy sposobu chemicznego regulowania ekspresji sekwencji kodujących DNA związanych z sekwencjami DNA dającymi się regulować chemicznie, np. w celu regulowania cechy fenotypowej.

Dla jasnego i jednoznacznego zrozumienia opisu wynalazku i zastrzeżeń podano poniżej definicje stosowanych terminów.

Mechanizm typu anty-sensownego. Mechanizm regulacji genu oparty na kontrolowaniu szybkości translacji mRNA do białka w wyniku obecności w komórce cząsteczki RNA komplementarnej do co najmniej części mRNA, którego translacja przebiega w komórce.

Powiązana sekwencja DNA: Sekwencja DNA, której aktywność komórkowa (1) albo reguluje aktywność innej sekwencji DNA, (2) albo jest regulowana inną sekwencją DNA. Definicja ta obejmuje zwłaszcza (lecz nie ogranicza się) sekwencje, które sąsiadują ze sobą w ciągłej nici DNA

162 317 albo są od siebie fizycznie oddzielone. Oddzielenie fizyczne obejmuje np. oddzielenie w obrębie tej samej nici DNA, lokalizację w różnych DNS lub nieciągłe sekwencje rozrzucone (np. przemiennie, sekwencje podlegające regulacji i kodujące) w jednej nici.

Sekwencja DNA dająca się regulować chemicznie: Sekwencja DNA mająca zdolność regulowania transkrypcji powiązanej z nią sekwencji DNA, przy czym regulacja ta jest zalezna od regulatora chemicznego. Sekwencje te mogą być pochodzenia naturalnego lub syntetycznego.

Gen dający się regulować chemicznie: Gen zawierający co najmniej jedną niekodującą, dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA i co najmniej jedną powiązaną z nią sekwencją DNA. Geny te mogą być pochodzenia naturalnego, syntetycznego lub częściowo naturalnego (syntetycznego).

Regulator chemiczny: (dla dającej się regulować chemicznie sekwencji DNA). Drobiny pierwiastkowe lub cząsteczkowe, które kontrolują (inicjują, kończą, zwiększają lub zmniejszają), w wyniku działania bezpośredniego lub pośredniego, aktywność sekwencji DNA dającej się regulować chemicznie w układzie, w którym regulator chemiczny normalnie nie występuje w formie aktywnej, w ilości wystarczającej do regulowania transkrypcji podlegającej transkrypcji sekwencji DNA powiązanej z sekwencją DNA dającą się regulować chemicznie, w żądanym stopniu i w żądanym czasie. Terminologia ta obejmuje sytuacje, w których, w czasie gdy pożądana jest transkrypcja, regulator albo jest nieobecny albo występuje w niewielkiej ilości, albo sytuacje w których występuje pewna ilość regulatora ale wymagane jest zwiększenie lub zmniejszenie regulacji dla uzyskania wpływu na transkrypcję.

Jeśli zatem układem zawierającym dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA jest roślina, np. roślina transgeniczna, wówczas regulatorem chemicznym jest substancja nie występująca w roślinie w stanie naturalnym w ilości wystarczającej do uzyskania chemicznej regulacji, a zatem, transkrypcji powiązanego genu w żądanym stopniu i czasie.

Termin „działanie bezpośrednie oznacza, że działanie regulatora chemicznego jest wynikiem bezpośredniej interakcji pomiędzy regulatorem chemicznym, a sekwencją DNA. Termin „działanie pośrednie oznacza, ze działanie regulatora jest wynikiem bezpośredniej interakcji pomiędzy tym regulatorem chemicznym, a jakimś innym endogennym lub egzogennym czynnikiem w układzie. Ostatecznym wynikiem tej bezpośredniej interakcji jest aktywacja lub supresja aktywności sekwencji DNA. Termin „forma aktywna oznacza, że regulator chemiczny występuje w formie wymaganej dla uzyskania kontroli.

Sekwencja chimerowa lub gen chimerowy: Sekwencja DNA zawierająca co najmniej dwie części heterologiczne, to jest części pochodzące z naturalnie występujących sekwencji DNA, które nie są powiązane w ich stanach naturalnego występowania lub zawierająca co najmniej jedną część pochodzenia syntetycznego, nie występującą w naturze.

Sekwencja kodująca DNA: Sekwencja DNA, z której przez jej transkrypcję i translację powstaje komórkowy polipeptyd.

Gen: Wydzielony region chromosomu odpowiedzialny za konkretny produkt komórkowy.

Niekodującą sekwencja DNA: Sekwencja DNA, która nie podlega transkrypcji i translacji prowadzącej do powstania komórkowego polipeptydu jeśli jest powiązana z daną sekwencją kodującą DNA. Tak więc sekwencja, która jest sekwencją niekodującą w powiązaniu z jedną sekwencją kodującą, może stać się sekwencją kodującą, jeśli zostanie powiązana z inną sekwencją kodującą lub niekodującą.

Cecha fenotypowa: Zauważalna właściwość będąca wynikiem ekspresji genu.

Tkanka roślinna: Każda tkanka roślinna w roślinie lub w kulturze. Termin ten obejmuje rośliny, komórki roślinne, organy roślinne, nasiona, protoplasty, kallusy, kultury komórkowe i dowolne grupy komórek roślinnych zorganizowanych w jednostki strukturalne lub funkcjonalne, lecz nie ogranicza się do nich. Użycie tego termimu, samego lub razem z określonym typem tkanki roślinnej wymienionej powyżej lub objętej niniejszą definicją nie ma na celu wykluczenia innego typu tkanki roślinnej.

PR lub białka związane z patogenezą: Białka wytwarzane w roślinach reagujących nadwrażliwością na patogeny. Termin ten obejmuje kwasowe i zasadowe formy białek, tytoniu PR-la, PR-lb, PR-lc, PR-1', PR-2, PR-N, PR-O, PR-P, PR-Q, PR-S, PR-R, chitynazę, będącą odpowiednikiem PR-Plub PR-Q i beta-l,3-glukanazę(glukano-endo-l,3-/3-glukozydaza,EC3.2.1.39), która

162 317 jest odpowiednikiem PR-2, PR-N lub PR-O, jak również indukowaną patogenem chitynazę z ogórka lecz nie ogranicza się do tych białek. Reakcja nadwrażliwości charakteryzuje się nekrozą tkanek w miejscu bezpośrednio otaczającym miejsce infekcji patogenem i następną lokalizacją patogenu, czym różni się od reakcji wrażliwości, w której patogen rozprzestrzenia się w całej roślinie. Patogenami są wirusy lub wiroidy, np. wirus mozaiki tytoniowej lub ogórkowej, wirus plamistości pierścieniowej lub wirus nekrozy, wirus kędzierzawienia liści pelargonii, wirus plamistości koniczyny łąkowej, wirus karłowacema krzaczastego pomidorów itp., grzyby, np. Phythophthora parasitica lub Peronospora tabacina, bakterie, np. Pseudomonas siringae lub Pseudomonas tabaci, albo maszyce, np. Myzus Persicae. Nie jest to lista wyczerpująca, pod żadnym względem.

Regulacja: Zwiększanie (indukowanie) lub zmniejszanie (represja) poziomu ekspresji genu lub poziomu transkrypcji sekwencji DNA. Definicja ta me obejmuje żadnego, konkretnego mechanizmu.

Zasadniczo czysta sekwencja DNA: Sekwencja DNA wyizolowana w zasadniczo czystej formie ze źródła naturalnego lub nienaturalnego. Taka sekwencja może występować w układzie naturalnym, takim jak bakteria, wirus lub roślina albo komórka zwierzęca, względnie można ją uzyskać na drodze syntetycznej albo jako sekwencję cDNA. Zasadniczo czyste sekwencje DNA na ogół izoluje się w postaci wektora zawierającego określony DNA. Termin „zasadniczo czysta oznacza, ze sekwencje inne od żądanej występują w ilościach bardzo małych, np. poniżej 5%, poniżej 1% lub korzystnie, poniżej 0,1%. Zasadniczo czyste sekwencje DNA i zawierające je wektory mogą i zazwyczaj są utrzymywane w roztworze, np. w roztworze wodnym zawierającym bufory albo w pożywce hodowlanej.

Zasadnicza homologia sekwencji: Termin „zasadnicza homologia sekwencji oznacza ścisłe powiązania strukturalne między sekwencjami nukleotydów lub aminokwasów. Przykładowo, zasadniczo homologiczne sekwencje DNA mogą wykazywać homologię, w 80%, korzystnie w 90%, a nawet 95%, a zasadniczo homologiczne sekwencje aminokwasów wykazują na ogół homologię w 50% lub w większym stopniu. Za homologiczne uważa się ponadto powiązania, w których opuszczona jest jedna lub kilka sekwencji nukleotydowych lub aminokwasowych albo wstawione są sekwencje z dodatkowymi nukleotydami lub aminokwasami.

A. Sekwencje DNA dające się regulować chemicznie.

Opisano niekodujące sekwencje DNA, które pod wpływem regulatora chemicznego mają zdolność regulowania transkrypcji powiązanej z nią sekwencji DNA w roślinie lub w tkance roślinnej. Są to zwłaszcza niekodujące sekwencje DNA mające zdolność regulowania transkrypcji powiązanej sekwencji DNA w roślinie lub w tkance roślinnej, w której regulacja ta zależy od regulatora chemicznego. Korzystnie, sekwencje DNA istnieją w zasadniczo czystej formie w stosunku do genu lub genomu, w którym występują, jeśli pochodzą ze źródła naturalnego, albo w stosunku do mieszaniny DNA, jeśli występują w mieszaninie syntetycznej.

Korzystnie, niekodującymi, dającymi się regulować chemicznie sekwencjami DNA są te sekwencje, które w powiązaniu z sekwencją kodującą DNA regulują ekspresję tej sekwencji kodującej w tkance roślinnej, przy czym stopień tej regulacji zależy od regulatora chemicznego. Sekwencje takie mogą być syntetyzowane de novo albo pochodzić (np. mogą być izolowane lub klonowane) z genu występującego w stanie naturalnym i dającego się regulować chemicznie. Występowanie dających się regulować chemicznie sekwencji DNA nie ogranicza się do tkanek roślinnych. Takie dające się regulować chemicznie sekwencje mogą pochodzić z różnych źródeł naturalnych, takich jak źródła bakteryjne, wirusowe i zwierzęce. Przykładowo, można je izolować z regionu flankującego 5' albo z regionu flankującego 3' występującego w stanie naturalnym genu dającego się regulować chemicznie. Alternatywnie, ńiekodującą sekwencję DNA można zsyntetyzować chemicznie albo uzyskać na drodze enzymatycznej jako cDNA identyczny do izolowanej sekwencji albo wykazujący zasadniczą homologię do tej sekwencji. Przez klonowanie niekodującej sekwencji DNA dającej się regulować chemicznie, sekwencję tę można oddzielić od innych sekwencji przylegających do niej w genie występującym w stanie naturalnym. W ten sposób można uzyskać zasadniczo czystą sekwencję DNA.

Zgodnie z wynalazkiem, regulacja zachodzi pod wpływem regulatorów chemicznych, które są albo regulatorami indukcyjnymi albo represyjnymi. Przykładami genów podlegających represji,

162 317 to znaczy genów hamowanych przez represyjnie działającą substancję chemiczną są np. geny TrpR albo AroH. Dodanie represora tryptofanu lub samego tryptofanu hamuje ekspresję tych genów. Istnieje wiele innych genów regulowanych przez tego typu represję produktem końcowym i w każdym przypadku produkt końcowy działa jako regulator chemiczny, który może być użyty do hamowania ekspresji genu. Dające się regulować sekcje takich genów mogą stanowić część konstruktów chimerowych, które można regulować chemicznie, regulując w ten sposób transkrypcję powiązanych sekwencji DNA w roślinie lub w tkance roślinnej.

Przykładami genów dających się indukować chemicznie, to znaczy genów indukowanych przez indukujący regulator chemiczny, są geny białka PR, zwłaszcza geny białka PR tytoniu, np. PR-la, PR-lb, PR-lc, PR-Γ, PR-Q, PR-R i PR-S, gen chitynazy ogórka oraz geny zasadowej i kwasowej /3-1,3-glukanazy tytoniu. W szczególnym przypadku użyteczne są zasadniczo czyste sekwencje DNA będące niekodującymi sekwencjami DNA dającymi się regulować chemicznie lub sekwencje DNA zasadniczo homologiczne do takich sekwencji, stanowiące część występującego w stanie naturalnym genu podlegającego regulacji chemicznej, np. występujących w stanie naturalnym, dających się regulować chemicznie genów w roślinach i tkankach roślinnych roślin jedno- i dwu-liściennych lub nagozalązkowych. Korzystnie, taka sekwencja DNA ma zdolność regulowania transkrypcji powiązanej sekwencji DNA w roślinie lub w tkance roślinnej, gdzie ta powiązana z mą sekwencja jest sekwencją kodującą. Transkrypcja tej sekwencji DNA może być regulowana przez represyjny lub indukujący regulator chemiczny. Szczególnie korzystnymi sekwencjami DNA są te, w których genem podlegającym chemicznej regulacji jest gen białka PR, np. z roślin dwuliściennych, takich jak tytoń lub ogórek. Najbardziej korzystne są sekwencje DNA, w których genem dającym się regulować chemicznie jest gen tytoniu PR-la, PR-lb, PR-lc, PR-T, PR-Q lub PR-R, gen chitynazy ogórka albo gen zasadowej lub kwasowej /3-1,3-glukanazy, zwłaszcza gen PR-la i PR-Γ tytoniu, lecz również gen chitynazy ogórka oraz geny zasadowej i kwasowej /3-1,3-glukanazy tytoniu. W pierwszym rzędzie rozpatrywane są tu sekwencje DNA, w których genem dającym się regulować chemicznie jest gen PR-la lub gen zasadowej /3-1,3-glukanazy tytoniu.

Okazało się, ze dająca się indukować chemicznie sekwencja DNA korzystnych genów PR i pokrewnych występują w sekwencjach mekodujących przyległego regionu 5' flankującego sekwencje kodujące. Przykładowo, w sekwencji wyizolowanej z fragmentu genu PR-la tytoniu o długości 6500 bp, zawierającej część regionu kodującego, znaleziono region o około 900-1200 bp przyległy w stanie naturalnym do miejsca startu transkrypcji, dający się indukować chemicznie. Cecha ta pozostaje we fragmencie zawierającym około 500-700 bp przyległym do miejsca startu transkrypcji. Tak więc najbardziej korzystne są sekwencje DNA zlokalizowane w regionie flankującym 5' genu PR lub genów pokrewnych, np. w 1200 parach zasad przyległych do miejsca startu transkrypcji.

Niekodującą sekwencję DNA mającą zdolność regulowania transkrypcji powiązanej z nią sekwencji DNA w roślinie lub w tkance roślinnej, przy czym regulacja ta jest zalezna od regulatora chemicznego, oraz sekwencje DNA zasadniczo homologiczne do tej sekwencji niekodującej wytwarza się tak, że DNA izoluje się z genu występującego w stanie naturalnym w zasadniczo czystej formie albo syntetyzuje się go na drodze chemicznej lub enzymatycznej.

W szczególności, zasadniczo czystą, dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA z genu dającego się regulować chemicznie, w naturalnie występującym układzie zawierającym ten gen, wytwarza się tak, ze (a) aktywuje się w tym systemie ekspresję RNA z genu dającego się regulować chemicznie, (b) izoluje się ten RNA, (c) rózmcująco skrininguje się bank genomowy RNA generowanego z RNA wyizolowanego z takiego zaktywowanego systemu, jak również RNA generowanego z RNA wyizolowanego z systemu kontrolnego, który nie był aktywowany, (d) izoluje się klon genomowy, (e) subklonuje się gen dający się regulować chemicznie z tego klonu genomowego i (f) izoluje się żądaną, dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA.

W przypadku, gdy układem naturalnym jest roślina, dająca się regulować chemicznie sekwencję DNA uzyskuje się także (a) aktywuje się w tej roślinie syntezę poliA + RNA z genu dającego się rgulować chemicznie, (b) izoluje się ten poliA+ RNA, (c) konstruuje się bank cDNA z tego poliA + RNA, (d) rózmcująco skrininguje się ten bank cDNA w stosunku do cDNA generowanego z RNA pochodzącego z roślin kontrolnych, nie aktywowanych, (e) izoluje się klony cDNA dające

162 317 się regulować chemicznie, (f) izoluje się klon genomowy z banku genomowego tej rośliny, stosując jako sondę klon cDNA z etapu (e), (g) subklonuje się gen dający się regulować chemicznie z tego klonu genomowego i (h) izoluje się żądaną, dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA.

Korzystny jest sposób, w którym genem dającym się regulować chemicznie jest gen dający się indukować chemicznie, np. gen białka PR, a więc, geny PR-la, PR-lb, PR-lc, PR-Γ, PR-Q lub PR-R tytoniu, gen chitynazy ogórka, albo gen zasadowej lub kwasowej /3-1,3-glukanazy tytoniu. Ponadto, korzystny jest sposób, w którym gen białka PRaktywuje się w etapie (a) induktorem chemicznym lub patogenem.

B. Dające się regulować chemicznie sekwencje DNA z częściami występujących w stanie naturalnym sekwencji kodujących.

Poza w całości niekodującymi, dającymi się regulować chemicznie sekwencjami DNA opisanymi w części A, uzyskano również niekodujące sekwencje DNA naturalnie występujących, dających się regulować chemicznie sekwencji DNA w połączeniu z częścią ale nie z całą sekwencją kodującą, z którą sekwencja dająca się regulować jest powiązana w genie występującym w stanie naturalnym. Bardziej szczegółowo, są to, korzystnie w zasadniczo czystej formie, sekwencje DNA, które zawierają pierwszą sekwencję komponentową DNA, będącą niekodującą, dającą się regulować chemicznie sekwencją DNA występującego w stanie naturalnym genu dającego się regulować chemicznie (lub sekwencję zasadniczo homologiczną do tej sekwencji), przy czym ta pierwsza sekwencja komponentowa ma zdolność regulowania transkrypcji powiązanej z nią sekwencją DNA w roślinie lub w tkance roślinnej, gdzie regulacja ta jest zależna od regulatora chemicznego oraz drugą sekwencję komponentową DNA, będącą częścią (ale nie całą sekwencją) sekwencji DNA podlegającej transkrypcji lub wykazującą zasadniczą homologię do tej części, z którą pierwsza sekwencja komponentowa jest powiązana w występującym w stanie naturalnym genie dającym się regulować chemicznie. Naturalnie występującym genem dającym się regulować chemicznie może być gen pochodzenia roślinnego, na przykład występujący w roślinach jedno- lub dwuliściennych i może być regulowany regulatorem chemicznym wywołującym represję lub indukcję. Drugą komponentową sekwencją DNA jest na ogół sekwencja kodująca. Korzystną drugą sekwencją DNA jest sekwencja kodująca peptyd sygnalny dowolnego białka wytwarzanego przez ekspresję występującego w stanie naturalnym genu dającego się regulować chemicznie.

Opisano tu zwłaszcza sekwencje DNA, zawierające pierwszą niekodującą, dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA oraz drugą kodującą sekwencję DNA z genu białka PR, np. z genu białka PR roślin dwuliściennych, korzystnie z tytoniu lub ogórka, takiego jak PR-la, PR-lb, PR-lc, PR-Γ, PR-Q lub PR-P, genu chitynazy lub z genu zasadowej lub kwasowej /3-1,3-glukanazy. Korzystna jest sekwencja DNA z genu białka PR, w którym transkrypcja jest regulowana przez indukujący regulator chemiczny. Opisano zwłaszcza sekwencja DNA, w których pierwsza sekwencja niekodującą jest zlokalizowana w regionie flankującym 5jednego z wyżej wymienionych genów białka PR, np. jest zlokalizowana w około 2000 parach zasad przylegających do miejsca startu transkrypcji genu białka PR. Najbardziej korzystna jest sekwencja DNA zawierająca wyżej wymienioną pierwszą sekwencję niekodującą i drugą sekwencję kodującą peptyd sygnałowy, wspomniany powyżej. '

Najbardziej korzystne są zasadniczo czyste sekwencje DNA przedstawione na fig. -9, 40, 43 i 44 oraz zasadniczo czyste sekwencje DNA zasadniczo homologiczne do tych sekwencji. Sekwencje te są przykładami dających się regulować chemicznie sekwencji DNA zawierających pierwszą niekodującą i drugą kodującą sekwencję DNA. Pochodzą one z genów PR-la i Pr-1'dla białka PR tytoniu i odpowiednio z dwu form zasadowej β-1,3-glukanazy tytoniu. Fig. 39 przedstawia sekwencję reprezentatywnego genu PR-la tytoniu. Nukleotydy od 1 do 1150 stanowią niekodującą, flankującą 5' sekwencję DNA dającą się indukować chemicznie oraz część sekwencji kodującej PR-la, która występuje w roślinach tytoniu. W tym przypadku, dająca się indukować chemicznie komponenta sąsiaduje z sekwencją kodującą. Nukleotydy kodujące pierwsze trzydzieści aminokwasów stanowią sekwencję kodującą peptyd sygnałowy białka PR-la. Sekwencję kodującą można oddzielić od sekwencji niekodującej, uzyskując niekodującą, dającą się indukować chemicznie sekwencję DNA, wolną od jakiejkolwiek sekwencji kodującej, opisaną powyżej w części A. Rozdział taki można przeprowadzić znanymi technikami, takimi jak trawienie enzymem restrykcyjnym.

162 317

Sposób wytwarzania sekwencji DNA zawierającej pierwszą komponentową sekwencję DNA będącą niekodującą, dającą się regulować chemicznie sekwencją DNA występującego w stanie naturalnym genu dającego się regulować chemicznie (lub sekwencją zasadniczo homologiczną do tej sekwencji), przy czym ta pierwsza komponentowa sekwencja ma zdolność regulowania transkrypcji powiązanej z nią sekwencji DNA w roślinie lub w tkance roślinnej, gdzie regulacja ta jest zależna od regulatora chemicznego i drugą komponentową sekwencję DNA będącą częścią (lub wykazującą zasadniczo homologię do tej sekwencji) sekwencja DNA podlegającej transkrypcji (ale me całą taką sekwencją), z z którą jest powiązana pierwsza komponentowa sekwencja w występującym naturalnie genie dającym się regulować chemicznie, polega na tym, ze z naturalnie występującego genu izoluje się DNA w zasadniczo czystej formie lub DNA ten syntetyzuje się chemicznie lub enzymatycznie. Korzystnie są sposoby opisane w części A powyżej i zasadniczo czyste sekwencje DNA uzyskane tymi sposobami.

C. Geny chimerowe zawierające dające się regulować chemicznie sekwencje DNA.

Chimerowa sekwencja DNA (gen chimerowy) zawiera co najmniej jedną sekwencję DNA dającą się regulować chemicznie. Jako przykłady służą dwa typy takich sekwencji chimerowych. Prostsza, lub dwuczęściowa chimerowa sekwencja DNA zawiera dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA i sekwencję DNA podlegającą transkrypcji. Taki gen chimerowy ma zdolność ekspresji w tkance roślinnej w odpowiednich warunkach regulacji chemicznej. W szczególności dająca się regulować chemicznie chimerowa sekwencja DNA, zawiera pierwszą, niekodującą, dającą się regulować chemicznie, komponentową sekwencję DNA, zdolną do regulowania transkrypcji powiązanej z nią sekwencji DNA w roślinie lub w tkance roślinnej, przy czym ta regulacja zależy od regulatora chemicznego i drugą, komponentową sekwencję DNA podlegającą transkrypcji w roślinie lub w tkance roślinnej. Komponentowe sekwencje DNA mogą pochodzić ze źródeł naturalnych lub mogą być wytwarzane syntetycznie.

W wyniku transkrypcji drugiej sekwencji DNA może powstawać RNA zdolny do regulowania ekspresji cechy fenotypowej według mechanizmu anty-sensownego. Alternatywnie, druga sekwencja DNA w chimerowej sekwencji DNA może podlegać transkrypcji i translacji w tkance roślinnej, dając w części A powyżej i zasadniczo czyste sekwencje DNA uzyskane tymi sposobami.

Zakresem wynalazku objęta jest chimerowa sekwencja DNA (gen chimerowy) zawierająca co najmniej jedną sekwencję DNA dającą się regulować chemicznie. Jako przykłady służą dwa typy takich sekwencji chimerowych. Prostsza, lub dwuczęściowa chimerowa sekwencja DNA zawiera dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA i sekwencję DNA podlegającą transkrypcji. Taki gen chimerowy ma zdolność ekspresji w tkance roślinnej w odpowiednich warunkach regulacji chemicznej. Zakresem wynalazku objęta jest szczególnie dająca się regulować chemicznie chimerowa sekwencja DNA, zawierająca pierwszą, niekodującą, dającą się regulować chemicznie, komponentową sekwencję DNA, zdolną do regulowania transkrypcji powiązanej z nią sekwencji DNA w roślinie lub w tkance roślinnej, przy czym ta regulacja zależy od regulatora chemicznego i drugą, komponentową sekwencję DNA podlegającą transkrypcji w roślinie lub w tkance roślinnej. Komponentowe sekwencje DNA mogą pochodzić ze źródeł naturalnych lub mogą być wytwarzane syntetycznie.

W wyniku transkrypcji drugiej sekwencji DNA może powstawać RNA zdolny do regulowania ekspresji cechy fenotypowej według mechanizmu anty-sensownego. Alternatywnie, druga sekwencja DNA w chimerowej sekwencji DNA może podlegać transkrypcji i translacji w tkance roślinnej, dając polipeptyd, a w rezultacie cechę fenotypową. Gen chimerowy jest skonstruowany w taki sposób, że druga sekwencja DNA jest odpowiednio skojarzona z regulowaną chemicznie sekwencją DNA, na ogół w orientacji przylegającej do tej sekwencji, co zapewnia transkrypcję. Łączenie prowadzi się znanymi technikami.

Korzystna jest chimerowa sekwencja DNA zawierająca pierwszy, niekodujący, regulowany chemicznie komponent DNA i drugi, podlegający transkrypcji komponent DNA, w której to sekwencji, pierwszą, niekodującą sekwencją DNA jest jedna z korzystnych sekwencji DNA, opisanych powyżej, w części A. Pierwsza komponentowa sekwencja DNA może być regulowana przez represyjny lub indukujący regulator chemiczny. Szczególną sekwencją jest chimerowa sekwencja DNA, w której pierwsza komponentowa sekwencja DNA wykazuje zasadniczą homologię

162 317 do dającej się regulować chemicznie sekwencji DNA w dającym się regulować chemicznie genie występującym naturalnie w roślinie.

Korzystna jest chimerowa sekwencja DNA, w której pierwszą komponentową sekwencją DNA jest dająca się regulować chemicznie sekwencja DNA (lub sekwencja zasadniczo homologiczna do tej sekwencji) zawarta w występującym w stanie naturalnym, dającą się regulować chemicznie genie z rośliny, a drugą sekwencją komponentową DNA jest sekwencja kodująca podlegająca transkrypcji i translacji, z wytworzeniem polipeptydu dającego w rezultacie cechę fenotypową. Korzystnie, ta druga komponentowa sekwencja DNA sąsiaduje z pierwszą sekwencją kodującą DNA. Szczególnie korzystna jest taka chimerowa sekwencja DNA, w której pierwszą komponentową sekwencję DNA stanowi (lub wykazuje zasadniczą homologię do niej) indukowana chemicznie sekwencja DNA w genie białka PR, np. białka PR z roślin dwuliściennych, takich jak tytoń lub ogórek. Przykłady ich są wymienione w części A.

Drugi przykładowy typ chimerowej sekwencji DNA zawiera trzy komponentowe sekwencje DNA pochodzące z dwu lub większej liczby źródeł. W najprostszym rozwiązaniu, taka chimerowa sekwencja DNA zawiera dwuczęściową sekwencję DNA opisaną powyżej w części B oraz trzecią sekwencję DNA pochodzącą z co najmniej jednego odmiennego źródła. Bardziej szczegółowo, ten typ chimerowej sekwencji DNA zawiera pierwszą komponentową sekwencję DNA, będącą niekodującą, dającą się regulować chemicznie sekwencją DNA (lub sekwencją zasadniczo homologiczną do tej sekwencji) występującego w stanie naturalnym genu dającego się regulować chemicznie, która to pierwsza komponentowa sekwencja DNA ma zdolność regulowania transkrypcji powiązanej z nią sekwencji DNA w roślinie lub w tkance roślinnej, przy czym ta regulacja zalezy od regulatora chemicznego, drugą komponentową sekwencję DNA (lub sekwencję zasadniczo homologiczną do tej sekwencji) będącą częścią podlegającej transkrypcji sekwencji DNA (ale nie całą tą sekwencją), z którą jest powiązana pierwsza sekwencja komponentowa w podlegającym chemicznej regulacji genie występującym w stanie naturalnym, oraz trzecią, komponentową sekwencję DNA podlegającą transkrypcji w roślinie lub w tkance roślinnej. Korzystnie, dającym się regulować chemicznie genem występującym w stanie naturalnym jest gen roślinny.

Druga i trzecia sekwencje komponentowe DNA to na ogół sekwencje kodujące. Trzecia sekwencja komponentowa może pochodzić z więcej niz jednego źródła naturalnego lub syntetycznego. Pierwsze dwie sekwencje komponentowe DNA będą zwykle pochodzić ze źródła naturalnego. Jeśli tym źródłem jest roślina, to jest to roślina jednoliścienna, dwuliścienna lub nagozalążkowa. W korzystnym rozwiązaniu, druga sekwencja DNA zawiera sekwencję nukleotydową kodującą peptyd sygnałowy z dającego się regulować chemicznie genu, w którym występują te pierwsze dwie sekwencje DNA. Jeśli dająca się regulować chemicznie sekwencja DNA jest powiązana z częścią sekwencji kodującej genu, z którego pochodzi, to trzecia sekwencja DNA musi występować me tylko we właściwej orientacji lecz również w fazie odczytu zgodnej z drugą sekwencją DNA. Orientację tę można uzyskać znanymi technikami.

Korzystne są chimerowe sekwencje DNA, w których pierwsza i druga sekwencje komponentowe są korzystnymi sekwencjami opisanymi w części B powyżej. Przykładowo, w korzystnej chimerowej sekwencji DNA, pierwsza komponentowa sekwencja DNA jest dającą się indukować chemicznie sekwencją DNA w genie białka PR z rośliny dwuliściennej, np. z tytoniu lub z ogórka, lub sekwencją zasadniczo homologiczną do powyższej sekwencji. Przykłady genów białka PR są podane powyżej.

Opisane powyżej geny chimerowe obejmują wiele możliwych konstrukcji. Dająca się regulować chemicznie sekwencja mekodująca może być powiązana z genem kontrolującym kwitnienie lub dojrzewanie owoców, genem wpływającym na tolerancję lub odporność na środki chwastobójcze lub wiele typów szkodników, takich jak grzyby, wirusy, bakterie, owady, obleńce, lub pajęczaki, genem kontrolującym wytwarzanie enzymów lub wtórnych metabolitów, genem sterylności męskiej lub żeńskiej, genem zahamowania wzrostu, zapachowym, genem jakości odżywczej, ltp. Dzięki opisanym genom chimerowym, cechy te mogą być wzmocnione przez rolnika lub ogrodnika. Nie muszą być dłużej zalezne jedynie od czynników naturalnych. Przedmiotem szczególnego zainteresowania jest kontrola cechy fenotypowej w procesie wytwarzania metabolitów w hodowli tkankowej lub w bioreaktorze.

162 317

Korzystną sekwencją chimerową DNA jest sekwencja dwu- lub trójkomponentowa, w której komponentowa sekwencja kodująca koduje cechę fenotypową, np. cechę tolerancji lub odporności na środek chwastobójczy, grzyba, wirusa, bakterię, owada, obleńca lub pajęczaka, wytwarzania wtórnych metabolitów, cechę sterylności męskiej lub żeńskiej, wytwarzanie enzymu lub innego opisywanego związku. Szczególnie korzystna jest dwu- lub trójkomponentowa chimerową sekwencja DNA. w której komponentowa sekwencja kodująca koduje tolerancję lub odporność na środki chwastobójcze, np. koduje syntetazę acetohydroksykwasową (AHAS) typu dzikiego lub oporną na środek chwastobójczy albo, w której ta sekwencja kodująca koduje odporność na owady, np. koduje odporność na endotoksynę Bacillus thuringiensis (BT).

Jeśli sekwencja chimerową ma być użyta do oznaczenia regulatorów chemicznych, wówczas cechę fenotypową stanowi dający się oznaczyć marker. Do odpowiednich markerów należą (ale nie ograniczają się do nich) lucyferaza (LUX), acetylotransferaza chloramfenikolu (CAT), fosfotransferaza neomycynowa (NPT), syntaza nopalinowa (NOS), syntaza oktopinowa (OCS), /3-1,3glukuronidaza (GUS), syntaza acetohydroksykwasowa (AHAS) i endotoksyna Bacillus thuringiensis (BT). Korzystnymi markerami są /3-1,3-glukuronidaza (GUS), syntaza acetohydroksykwasowa (AHAS) i endotoksyna Bacillus thuringiensis (BT). Reprezentatywnym przykładem takiej chimerowej sekwencji DNA opisanym szczegółowo w przykładach jest dwuczęściowa chimerowa sekwencja DNA, zawierająca 5' flankującą, niekodującą sekwencję z genu PR-la.

Pomimo, iz jako przykładowy, marker jest wymieniona sekwencja kodująca genu GUS, to może być w niej użyty dowolny wyżej wymieniony marker. Analogiczna chimerową sekwencja trójczęściowa zawiera część sekwencji kodującej genu PR-la. Tego typu konstrukcje są szczególnie użyteczne, ponieważ w komórkach roślinnych lub ekstraktach tych komórek jest łatwo wykrywalny efekt indukcji chemicznej, np. aktywność enzymu /3-glukuronidazy. Inne szczególne rozwiązana, przykładowo takie, w których zawarta jest sekwencja niekodującą jednego z gatunków /3-1,3-glukanazy tytoniu, oraz takie, które zawierają sekwencję kodującą syntetazę acetohydroksykwasową typu dzikiego lub oporną na środki chwastobójcze albo endotoksynę Bacillus thuringiensis, opisano w przykładach.

Korzystną chimerową sekwencją DNA jest dwu- lub trzykomponentowa sekwencja DNA, w której pierwszą komponentową sekwencję stanowi region flankujący 5genu PR-la tytoniu zawierający powyżej 300 bp, np. 300-2000 bp, korzystnie 600-1000 bp sąsiadujących z miejscem stanu transkrypcji. Korzystna jest również chimerową sekwencja DNA zawierająca trzy komponenty, przy czym druga komponentowa sekwencja DNA koduje peptyd sygnałowy, przykładowo ta druga sekwencja koduje peptyd sygnałowy z genu białka PR, korzystnie genu PR-la albo peptyd o zasadniczej homologu do tego peptydu.

Sposób wytwarzania chimerowej sekwencji DNA dającej się regulować chemicznie, zawierającej pierwszą, niekodującą, dającą się regulować chemicznie komponentową sekwencję DNA, mającą zdolność regulowania transkrypcji powiązanej z nią sekwencji DNA w roślinie lub w tkance roślinnej, przy czym ta regulacja jest zalezna od regulatora chemicznego oraz drugą komponentową sekwencję DNA podlegającą transkrypcji w roślinie lub w tkance roślinnej, polega na tym, że te sekwencje komponentowe DNA poddaje się ligacji. Sposób wytwarzania chimerowej sekwencji DNA zawierającej pierwszą komponentową sekwencję DNA, będącą niekodującą, dającą się regulować chemicznie sekwencją DNA (lub sekwencję zasadniczo homologiczną do tej sekwencji) z dającego się regulować chemicznie genu występującego w stanie naturalnym, przy czym ta pierwsza komponentowa sekwencja DNA ma zdolność regulowania transkrypcji powiązanej z nią sekwencji DNA w roślinie lub w tkance roślinnej, gdzie regulacja ta zalezy od regulatora chemicznego, drugą komponentową sekwencję DNA (lub sekwencję o zasadniczej homologii z tą sekwencją) będącą częścią podlegającej transkrypcji sekwencji DNA (ale nie całą taką sekwencją), z którą pierwsza sekwencja komponentowa jest powiązana w dającym się regulować chemicznie genie występującym w stanie naturalnym oraz trzecią komponentową sekwencję DNA mającą zdolność transkrypcji w roślinie lub w tkance roślinnej, polega na tym, że komponentowe sekwencje DNA poddaje się ligacji równoczesnej lub kolejnej.

D. Wektory.

Wektory wytwarza się standardowymi technikami i zawierają one albo dające się regulować chemicznie sekwencje DNA opisane w części A lub B albo chimerowe sekwencje DNA opisane

162 317 w części C powyżej. Wektory są rekombinantowymi sekwencjami DNA, które mogą być użyte do izolowania i multiplikacji wymienionej sekwencji DNA oraz do transformacji odpowiednich gospodarzy tymi sekwencjami. Wektorami korzystnymi do celów izolacji i multiplikacji są plazmidy, które można namnażać w odpowiednim mikroorganizmie jako gospodarzu, np. w E. coli. Wektorami korzystnymi dla transformacji są takie wektory, które stosuje się do transformowania komórek roślinnych albo Agrobacteria. Bardziej szczegółowo, jeśli transformowane są komórki roślinne inne niż protoplasty, wówczas korzystnym wektorem jest wektor pochodzący z plazmidu Ti. Dla bezpośredniego wprowadzenia DNA do protoplastów można stosować każdy z wymienionych wektorów. Odpowiednie wektory, które można stosować jako materiały wyjściowe, są znane Wektory odpowiednie do transformowania tkanek roślinnych i protoplastów zostały opisane w następujących publikacjach: A deFramond i inni, Bio/Technology, 1. 263 (1983), G. An i mm, EMBO J. 4, 277 (1985), 1. Potrykus i inni, jak wyżej, J. S. Rothstein i inni, Gene 53, 153 (1987). Ponadto opisano wiele innych wektorów nadających się do zastosowania jako materiały wyjściowe w opisanych tu sposobach.

Wektory, które zawierają jedynie sekwencję DNA dającą się regulować chemicznie opisaną w części A lub B, mogą być stosowane jako półprodukty do sporządzania wektora zawierającego chimerową sekwencję DNA opisaną w części C powyżej. Insercja odpowiedniej sekwencji, która ma zdolność transkrypcji do takiego pośredniego wektora, daje wektor zawierający chimerową sekwencję DNA. Sekwencję tę można następnie stosować do transformowania żądanej tkanki roślinnej, protoplastu lub innego gospodarza. Alternatywnie, można przygotowywać chimerową sekwencję DNA, po czym dokonać jej insercji do odpowiedniego wektora, który z kolei może być użyty do transformowania żądanej tkanki roślinnej lub innego gospodarza.

Konstruowanie i multiplikację wektorów można prowadzić w odpowiednim gospodarzu, np. w E. coli. Do odpowiednich szczepów E. coli należą: HB101, JM83, DH1, DH5a, LE392 i podobne Wektory można stosować jako takie w bezpośrednim przeniesieniu genu lub w technice mikroiniekcji. W pewnych przypadkach korzystna jest linearyzacja wektora przed jego użyciem. Alternatywnie, można transformować wektory do Agrobacterium jako gospodarza. Taką transformację prowadzi się znanymi technikami, do których należą: kojarzenie dwóch rodziców [R. Simon i inni, Bio/Technology, 174(1983)], kojarzenie trzech rodziców [G. Ditta i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7347 (1980)] lub transformacja [M. Holsters i inni, Mol. Gen. Genet. 163, 181 (1978)]. Do odpowiednich szczepów należą (lecz nie ograniczają się do nich) A. tumefaciens LBA4404, CIB542 i C58Z7O7.

Do korzystnych wektorów należą te, które zawierają korzystne sekwencje DNA opisane w częściach A, B i C powyżej. Korzystnym wektorem jest ponadto taki wektor, który jest funkcjonalny w komórkach roślinnych lub w Agrobacterium. Szczególnie korzystne są wektory opisane w przykładach.

E. Tkanki roślinne, rośliny i nasiona.

Otrzymane tkanki roślinne, rośliny lub nasiona zawierające chimerowe sekwencje DNA opisane powyżej. Korzystne są tkanki roślinne, rośliny lub nasiona zawierające te chimerowe sekwencje DNA, o których wzmiankowano, że są korzystne.

Komórki tkanek roślinnych transformuje się opisanymi powyżej wektorami stosując znane techniki, w tym również techniki podane w powyższych publikacjach oraz techniki szczegółowo opisane w poniższych przykładach. Do tych technik należy bezpośrednia infekcja lub ko-hodowla roślin lub tkanek roślinnych z Agrobacterium. Bardzo dogodną techniką jest transformacja krążków liści opisana przez R. B. Horscha i innych, Science 225, 1229 (1985). Alternatywnie, wektor transformuje się bezpośrednio, np. przez elektroporację, przez mikroimekcję lub przez transformację protoplastów w obecności glikolu polietylenowego (PEG), chlorku wapniowego albo w polu elektrycznym, co szerzej opisano poniżej.

Transformowane komórki mogą pochodzić z roślin j'ednoliściennych lub dwuliściennych i mogą zawierać jeden lub większą liczbę genów chimerowych dających się regulować chemicznie. Tak więc do tkanki roślinnej wprowadza się geny kodujące oporność lub tolerancję na środki chwastobójcze oraz wiele różnych szkodników, w tym, owadów, wirusów, bakterii, grzybów i innych szkodników, geny kodujące sterylność, rozmiary, kwitnienie i dojrzewanie owoców, po czym te komórki lub protoplasty regeneruje się, uzyskując rośliny, w których te cechy mogą być

162 317 kontrolowane poprzez manipulację regulatorem chemicznym. Alternatywnie, komórki można namnazać w hodowli tkankowej lub w bioreaktorze, uzyskując enzymy lub wtórne metabolity. Jeśli wymagane jest oznaczanie enzymu, wówczas część kodująca genu chimerowego może zawierać np. wskazany uprzednio gen LUX, CAT, NPT, NOS, OCS, GUS, AHAS lub BT. Takie geny chimerowe, zawierające wykrywalną chemiczną sekwencję z genu PR, są korzystne z powodu łatwości stosowania regulatora i łatwego wykrywania produktu enzymu.

Po transformacji prowadzi się selekcję lub sknnmg transformowanych komórek lub tkanek roślinnych znanymi technikami. Transformowana komórka lub tkanka roślinna zawiera opisaną powyżej chimerową sekwencję DNA. Komórkę taką regeneruje się stosując znane techniki, między innymi opisane w cytowanych powyżej publikacjach oraz opisane w poniższych przykładach, odnoszące się zarówno do roślin jednoliściennych jak i dwuliściennych. Do roślin, które można regenerować tymi technikami należą (lecz nie ograniczają się do nich): kukurydza, słonecznik, rzepak, koniczyna, tytoń, marchew, bawełna, lucerna, ryz, ziemniaki, oberżyna i ogórek. Następnie regenerowane rośliny poddaje się skriningowi znanymi sposobami, uzyskując rośliny tylko transformowane. W celu uzyskania linii ulepszonych roślin i nasion, potomstwo regenerowanych roślin poddaje się ciągłemu skriningowi i selekcji na stałą obecność zintegrowanej sekwencji DNA. Taką sekwencję DNA można przenosić do innych linii genetycznych w różny sposób, w tym poprzez klasyczną hodowlę, fuzję protoplastów, przeniesienie jądra i przeniesienie chromosomu.

F. Korzyści i zastosowania.

Wynalazek przynosi szereg korzyści i zastosowań wynikających z łatwo kontrolowanej, dającej się regulować ekspresji w roślinach i w tkankach roślinnych genów zawierających dające się regulować chemicznie sekwencje DNA. Możliwa staje się regulacja genów działających według mechanizmu antysensownego lub genów, ekspresja których uwidacznia się powstawaniem cechy fenotypowej. Przedmiotem szczególnego zainteresowania jest możliwość kontrolowania czasu i stopnia ekspresji genu oraz łatwość tej kontroli, albo jednolicie, w całej roślinie, albo w zlokalizowanych częściach rośliny.

Kontrolę taką można przeprowadzić w zwykły sposób, stosując regulator chemiczny na tkankę roślinną lub na roślinę albo część tej rośliny, w taki sposób i w takiej ilości aby uzyskać regulację genu chimerowego, ekspresja którego jest pożądana w komórkach roślinnych, tkankach roślinnych lub w roślinach. Jeśli np. ekspresja danej cechy ma wystąpić jedynie w liściach, wówczas przez opryskanie lub opylenie liści w czasie optymalnym dla wystąpienia ekspresji w liściach, a przed migracją do innych części rośliny, można łatwo i skutecznie osiągnąć cel.

Alternatywnie, jednorodną ekspresję w całej nadziemnej części rośliny można uzyskać stosując regulator na całą roślinę (to znaczy łodygę i obydwie strony liści). Dla uzyskania ekspresji w korzeniach, możliwym sposobem regulacji jest stosowanie na nasiona, do gleby wokół nasion albo do korzeni. Ekspresję w bioreaktorze uzyskuje się całkiem łatwo, np. przez dodanie regulatora chemicznego do pożywki kontaktującej się z komórkami.

Możliwość kontrolowania czasu, stopnia i/lub ekspresji genu, kodującego nową cechę fenotypową w transgenicznych roślinach, daje wiele korzyści. Jeśli przykładowo do rośliny wprowadza się cechę tolerancji na środek chwastobójczy lub inny środek szkodnikobójczy na nasadzie mechanizmu detoksyfikacji, to cechę tę można maksymalizować przez dozowanie w odpowiednim czasie regulatora chemicznego. Regulator taki można stosować przed, w czasie lub po stosowaniu środka chwastobójczego lub innego środka szkodnikobójczego, zależnie od tego, który sposób daje optymalną tolerancję.

Obecnie staje się również możliwe regulowanie produkcji związków, biosynteza która jest kontrolowana endogennymi lub obcymi genami. Po indukcji chemicznej można rozpocząć wytwarzanie tych produktów w żądanych czasie. Indukowanym procesom może być biosynteza wieloetapowa lub jednoetapowa konwersja metabolitu.

Inną zaletą wynalazku jest możliwość regulowania procesów rozwojowych w roślinach w określonym czasie przez zastosowanie regulatora chemicznego. Można na przykład uzyskać synchronizację rozwoju rośliny (kiełkowanie, puszczanie pędów, pączkowanie, powstawanie kwiatów, dojrzewanie owoców, wysychanie, odrywanie się owoców). Ponadto, można zapobiegać normalnemu rozwojowi rośliny. Można to uzyskać przez wprowadzenie np. genu toksyny, który będzie zakłócał żądane stadium rozwoju, sekwencji DNA, która będzie blokowała stadium rozwoju na

162 317 drodze mechanizmu anty-sensownego, albo genu, ekspresja którego będzie blokowała przejście w nowe stadium rozwoju i który będzie podlegał represji chemicznej, nie pozwalając na przebieg rozwoju. Użytecznym zastosowaniem jest wprowadzenie bezpłodności męskiej lub żeńskiej podczas kontrolowanej hybrydyzacji zbiorów.

Jako dodatkowe korzyści, wynikające z zastosowania wynalazku, można wymienić nowe sposoby oznaczenia, korzystnie, sposoby oznaczania enzymów. Obecnie identyfikacja nowych regulatorów chemicznych stała się całkiem prosta. W sposobach tych mają zastosowanie transformowane rośliny lub komórki roślinne zawierające chimerową sekwencję DNA, określoną powyżej. Związek chemiczny stosuje się do transformowanego gospodarza i mierzy się transkrypcję sekwencji DNA podlegającej transkrypcji wobec kontroli. Transkrypcję wykrywa się na ogół w postaci produktu translacji albo jako skutek działania takiego produktu. Oznaczenia takie można prowadzić wieloma różnymi drogami, ale na ogół prowadzi się je stosując całe regenerowane rośliny (stosując związek chemiczny do rośliny) albo hodowle komórkowe lub tkankowe (stosując związek chemiczny do komórek lub do tkanek), a następnie dostarcza się substrat dla danego enzymu. Produkt aktywności enzymatycznej wykrywa się standardowymi technikami, np. spektrofotometryczme.

Sposób identyfikacji regulatora chemicznego polega na transformowaniu gospodarza chimerową sekwencją DNA opisaną powyżej w części C lub wektorem zawierającym taką chimerową sekwencję DNA, podaniu przypuszczalnego regulatora chemicznego do transformowanego gospodarza i pomiarze ekspresji cechy fenotypowej. Korzystny jest taki sposób, w którym transformowanym gospodarzem jest tkanka roślinna lub komórki roślinne. Korzystny jest poza tym sposób, w którym chimerową sekwencją DNA jest sekwencja wymieniona powyżej jako korzystna, np. taka, w której pierwszą komponentową sekwencją DNA w tym chimerowym DNA jest sekwencja dająca się indukować chemicznie (lub sekwencja o zasadniczej homologii) będąca dając się indukować chemicznie sekwencją genu białka PR i w której cechą fenotypową kodowaną przez ten chimerowy DNA jest wykrywalny marker enzymatyczny.

Wynalazek umożliwia rozwój nowych metod identyfikacji innych, dających się regulować chemicznie sekwencji DNA. Przygotowuje się wektor zawierający przypuszczalną, dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA, np. z dającego się selekcjonować markera gospodarza i markera dającego się selekcjonować lub oznaczyć. Do markerów nadających się do selekcji należą geny oporności na antybiotyk i geny oporności na środek chwastobójczy. Reprezentatywnymi genami oporności na antybiotyki są geny dla higromycyny, kanamycyny, chloramfenikolu, Neomycyny, puromycyny, kinkomycyny, G418 i metotreksatu. Szczególnie dogodnym genem oporności na higromycynę jest gen fosfotransferazy aminoglikozydowej IV. Wektory nadające się do transformacji roślin zawierające gen oporności na higromycynę zostały opisane przez S. J. Rothstein i innych, Gene 53,153 (1987). Przykładami genów oporności na środki chwastobójcze są geny kodujące oporność na np. sulfonylomoczniki, glyphosate, phosphinotricin i atrazynę.

Odpowiednimi markerami dającymi się oznaczyć są geny dla enzymów, antygenów, immuglobin, itp., jak również geny oporności na antybiotyki. Do markerów enzymatycznych należą LUX, CAT, NPT, NOS, OCS, GUS, AHAS i BT. Szczególnie dogodnym enzymem jest )3-1,3glukuronidaza (GUS) z powodu łatwości oznaczenia tego enzymu. Insercję sekwencji DNA kodującej marker dający się oznaczać do wektora wykonuje się znanymi technikami.

Przypuszczalną, dającą się regulować sekwencję DNA włącza się zwykle w taki sposób aby sąsiadowała z genem markera dającego się oznaczać tak, aby ekspresja tego markera znajdowała się pod kontrolą przypuszczalnej sekwencji DNA. Taki wektor stosuje się następnie do transformowania tkanki roślinnej lub innego, odpowiedniego gospodarza. Selekcji transformowanej tkanki roślinnej lub innego gospodarza dokonuje się w oparciu o nadający się do selekcji marker roślinny, na ogół, marker oporności na antybiotyk. Następnie do tej tkanki roślinnej lub innego gospodarza podaje się regulator chemiczny i prowadzi selekcję albo regenerację transformowanej tkanki. Indukcja lub represja takiego markera po zastosowaniu regulatora chemicznego wskazuje na obecność przypuszczalnej sekwencji DNA jako sekwencji mającej zdolność regulowania transkrypcji sąsiedniej sekwencji DNA, regulacja której jest zależna od regulatora chemicznego. Oznaczenie można prowadzić na całych roślinach, regenerowanych lub transformowanych roślinach,

162 317 21 np. przez stosowanie regulatora chemicznego na liście lub inną tkankę roślinną i pomiar ekspresji oznaczanego markera.

Alternatywnie, oznaczenie prowadzi się na transformowanej tkance kallusa lub na innym gospodarzu w hodowli komórkowej, stosując przypuszczalny regulator chemiczny do kallusa lub innej hodowli i stosując pomiar ekspresji dającego się oznaczyć markera.

Sposób identyfikacji dającej się regulować chemicznie sekwencji DNA polega na (a) transformowaniu gospodarza przypuszczalną, dającą się regulować chemicznie sekwencją DNA lub wektorem zawierającym tę sekwencję, drugą sekwencję DNA będącą markerem genu umożliwiającym selekcję w gospodarzu i trzecią sekwencję DNA kodującą cechę fenotypową, (b) stosowaniu regulatora chemicznego do tego transformowanego gospodarza i (c) pomiarze ekspresji lub selekcjonowaniu pod względem zmian w ekspresji cechy fenotypowej kodowanej przez trzecią sekwencję DNA.

Korzystny jest sposób, w którym trzecią sekwencję DNA stanowi marker umożliwiający selekcję w gospodarzu lub marker genu dającego się oznaczyć oraz sposób, w którym drugą lub trzecią sekwencją DNA jest marker genu oporności na środek chwastobójczy lub antybiotyk, np. na higromycynę, kanamycynę, chloramfenikol, bleomycynę, puromycynę, linkomycynę i metotreksat, zwłaszcza gen fosfotransferazy aminoglikozydowej IV nadający oporność na higromycynę.

Korzystny jest również sposób, w którym przypuszczalna, dająca się regulować chemicznie sekwencja DNA jest powiązana i korzystnie sąsiadująca z trzecią sekwencją. Ponadto, korzystny jest sposób, w którym transformowanym gospodarzem jest tkanka roślinna lub komórki roślinne.

Korzystny jest tez sposób, w którym trzecia sekwencja DNA koduje marker oznaczalnego enzymu, takiego jak lucyferazy (LUX), acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT), fosfotransferazy chloramfenikolu (NPT), syntetazy nopaliny (NOS), syntetazy oktopiny (OCS), /3-1,3-glukuronidazy (GUS), syntetazy acetohydroksykwasowej (AHAS) i 'endotoksyny Bacillus thuringiensis (BT).

Opracowano również sposób selekcjonowania transformowanego materiału roślinnego. Materiał roślinny wystawiony na działanie egzogennej sekwencji DNA zawierającej dający się regulować chemicznie sekwencję DNA, dla której znanyjest regulator chemiczny i drugą sekwencję DNA dla cechy fenotypowej traktuje się regulatorem i obserwuje się ekspresję cechy fenotypowej. Obserwacja tej cechy potwierdza, że istotnie zaszła transformacja przypuszczalnych transformantów. Typowymi cechami fenotypowymi nadającymi się w tym sposobie są markery umożliwiające selekcję gospodarza i markery dające się oznaczać, opisane powyżej.

Sposób selekcjonowania transformowanych komórek lub tkanek roślinnych, poddanych transfomacji DNA zawierającym pierwszą komponentową sekwencję DNA, dającą się regulować chemicznie znanym regulatorem chemicznym i powiązaną z nią drugą sekwencją DNA kodującą marker fenotypowy, polega na tym (a) traktowaniu przypuszczalnych transformantów tym znanym regulatorem chemicznym i (b) selekcjonowaniu transformantów pod względem ekspresji cechy fenotypowej kodowanej przez drugą sekwencję DNA. Korzystny jest taki sposób, w którym cechę fenotypową stanowi oporność na antybiotyk, np. na higromycynę, kanamycynę, chloramfenikol, bleomycynę, puromycynę, linkomycynę, G418 i metotreksat, albo marker dającego się oznaczyć enzymu, np. lucyferazy (LUX), acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT), fosfotransferazy neomycyny (NPT), syntetazy nopaliny (NOS), syntetazy oktopiny (OCS), /3-1,3-glukuronidazy (GUS), syntezy acetohydroksykwasowej (AHAS) i endotoksyny Bacillus thuringiensis (BT).

G. Peptydy sygnalne.

Peptydem sygnalnym lub sekwencją sygnalną jest specjalna, N-terminalna sekwencja aminokwasowa w białku wchodzącym do retikulum endoplazmatycznego. Taka sekwencja w komórkach eukariotycznych zawiera na ogół około 15-40 reszt aminokwasowych, przy czym wiele z nich jest hydrofobowych. Sekwencja ta jest odszczepiana z dojrzałego białka.

Peptyd sygnalny genu dającego się regulować chemicznie jest użyteczny przy konstruowaniu trzy-częściowych konstrukcji chimerowych opisanych powyżej. Takie konstrukcje chimerowe zawierają pierwszą, dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA, drugą sekwencję DNA kodującą peptyd sygnalny w białkach i trzecią sekwencję, kodującą cechę fenotypową. Korzystną cechą fenotypową jest cecha łatwa do wykrycia, np. w procedurze oznaczania. Włączenie do

162 317 konstrukcji chimerowej sekwencji DNA kodującej peptyd sygnałowy umożliwia to, ze produkt ekspresji trzeciej sekwencji DNA opuszcza retikulum endoplazmatyczne komórki gospodarza i jest kierowany do miejsca docelowego.

Tak więc szczególnie użyteczny jest peptyd sygnalny z białka PR-la tytoniu oraz białko o sekwencji aminokwasowej zasadniczo homologicznej do tego peptydu. Peptyd ten ma następującą sekwencję aminokwasową:

MetGlyPheValLeuPheSerGlnLeuProSerPheLeuLeuValSerThrLeuLeuLeuPheLeuValIleSerHisSerCysArgAla.

Użyteczna jest również sekwencja DNA kodująca ten peptyd (patrz, fig. 39) oraz sekwencje DNA zasadniczo homologiczne do tej sekwencji. Użycteczne są też wspomniane juz powyżej (I) sekwencje DNA zawierające dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA w połączeniu z sekwencją kodującą peptyd sygnalny i (2) trzy-częściowe sekwencje sygnalne DNA zawierające komponent dający się regulować chemicznie, sekcję kodującą peptydu sygnalnego oraz sekwencję DNA podlegającą transkrypcji korzystnie z translacją.

H. Nowe geny PR.

Uzyskano nowe wyizolowane i zidentyfikowane sekwencje genomowego DNA PR i cDNA z genów tytoniu oznaczonych jako PR-la, PR-Γ i PR-R, genu indukowanej patogenem chitynazy z ogórka, z genu PR-Q z tytoniu, zasadowej /3-1,3-glukanazy 39.1 i 39.3 z tytoniu, kwasowej /3-1,3-glukanazy z tytoniu oraz sekwencje zasadniczo homologiczne do tych genów. Sekwencje DNA tych genów przedstawiono na fig. 39-46. Nowe geny z sekwencji przedstawionych na fig. 39, 40. 43 i 46 (odpowiednio PR-la, PR-Γ i /3-1,3-glukanazy 39.1 i 39.3) są również szczególnym przykładem nie-kodujących, dających się regulować chemicznie sekwencji DNA otrzymanych sposobem według wynalazku. Nowe sekwencje przedstawione na fig. 4I i 42, 45 i 46 kodują odpowiednio białka PR chitynazy ogórka, PR-R tytoniu. PR-Q tytoniu i kwasowej formy /3-1,3glukanazy tytoniu. Szczegółowe dane dotyczące izolowania i charakteryzacji genów podane są w przykładach.

I. Regulatory chemiczne.

Regulator chemiczny jest zdefiniowany jako substancja regulująca ekspresję genu poprzez dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA w odpowiednich warunkach, co zostało podane w definicji tego terminu

Substancja, w formie jonowej lub obojętnej, z dodatkiem lub bez dodatku cząsteczek lub anionów solwatujących lub kompleksujących, będzie zwykle egzogenna w stosunku do układu zawierającego gen dający się regulować chemicznie, w czasie, kiedy pożądana jest regulacja. Korzystne jest stosowanie egzogennych regulatorów chemicznych z powodu łatwości i wygody kontrolowania ilości regulatora w układzie. Jednakże, można również stosować regulatory endogenne, to jest substancje chemiczne, których aktywność lub poziom w układzie można sztucznie kontrolować poprzez inne komponenty w układzie lub oddziałujące na układ.

Do regulatorów chemicznych należą substancje chemiczne znane jako induktory białek PR w roślinach lub ich bliskie pochodne. Przykładami są kwas benzoesowy, salicylowy i poliakrylowy oraz ich podstawione pochodne, zawierające takie podstawniki jak niższa grupa alkilowa, niższa grupa alkoksylowa, niższa grupa alkilotio lub atom chlorowca. Zastosowane na tkankę roślinną, zwykle na liście i całe rośliny, zwiększają poziomy mRNA i w tkance roślinnej wytwarzane są białka PR.

Dodatkową grupą regulatorów dla dających się regulować chemicznie sekwencji DNA i genów chimerowych są związki o strukturze benzo-l,2,3-tiadiazolu, np. kwas benzo-1,2,3tiadiazolokarboksylowy, kwas benzo-l ,2,3-tiadiazolotiokarboksylowy, cyjanobenzo-l,2,3-tiadiazol, amid kwasu benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowego i hydrazyd kwasu benzo-I,2,3-tiadiazolokarboksylowego oraz ich pochodne.

Odpowiednimi pochodnymi są zwłaszcza związki, w których ugrupowanie benzo-1,2,3tiazolu jest niepodstawione lub podstawione małymi podstawnikami, zwykle występującymi w aromatycznych układach pierścieniowych związków stosowanych w agrochemii, takimi jak nizsza grupa alkilowa, niższa grupa alkoksylowa, nizsza grupa chlorowcoalkilowa, niższa grupa chlorowcoalkoksylowa, niższa grupa alkilotiolowa, cyjanowa, nitrowa lub atom chlorowca. Do tego typu pochodnych należą ponadto benzo-l,2,3-tiadiazole, w których funkcyjna grupa kwasu karboksy162 317 lowego. tiokarboksylowego, amidu kwasu karboksylowego lub hydrazydu kwasu karboksylowego jest niepodstawiona lub podstawiona grupami alifatycznymi, aryloalifatycznymi lub aromatycznymi. Przykładami takich grup są grupa alkilowa (zwłaszcza niższa grupa alkilowa), alkoksylowa (zwłaszcza mzsza grupa alkilowa), niższa grupa alkoksyalkilowa, alkoksyalkoksyalkilowa, cykloalkilowa, cykloalkiloalkilowa, fenyloalkilowa (zwłaszcza benzylowa), naftyloalkilowa, fenoksyalkilowa, alkenylowa i alkinylowa, przy czym alkilowa część podstawnika jest niepodstawiona lub podstawiona grupą hydroksylową, chlorowcem, grupą cyjanową lub nitrową, a część aromatyczna podstawnika jest niepodstawiona albo podstawiona małymi podstawnikami, zwykle występującymi w aromatycznych układach pierścieniowych związków stosowanych w agrochemii, takimi jak nizsza grupa alkilowa, niższa grupa alkoksylowa, niższa grupa chlorowcoalkilowa, mzsza grupa chlorowcoalkoksylowa. nizsza grupa alkilotio, grupa cyjanowa, grupa nitrowa lub atom chlorowca.

Regulatory oparte na strukturze benzo-1.2,3-tiadiazolu obejmują wszystkie układy cząsteczkowe o właściwości uwalniania cząsteczki rzeczywiście działającej jako regulator.

Do korzystnej grupy regulatorów opartych na strukturze benzo-l,2,3-tiadiazolu należą kwas benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowy i estry alkilowe kwasu benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksvlowego. w których grupa alkilowa zawiera 1-6 atomów węgla, oraz podstawione pochodne tych związków. Do odpowiednich podstawników należą niższa grupa alkilowa, nizsza grupa alkoksylowa. nizsza grupa alkilotio i atom chlorowca. Korzystnymi induktorami chimerowych sekwencji DNA zawierających dające się regulować chemicznie sekwencje DNA wyizolowane z genów białka PR są zwłaszcza kwas benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowy-7, i jego estry alkilowe, np. ester metylowy kwasu benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowego-7. Sposoby wytwarzania wyżej wymienionych regulatorów chemicznych i ich zastosowanie jako biocydów ujawniono w brytyjskim opisie patentowym nr 1 176 799 i w publikacji P. Kirby'ego i innych, J. Chem. Soc. C 2250 (1970).

Pochodne benzo-1.2,3-tiadiazolu, które również można stosować jako regulatory, opisano w zgłoszeniu patentowym St. Zjedn. Am. nr 234 241 z dnia 18 sierpnia 1988 r.

Korzystnymi związkami o strukturze benzo-l,2,3-tiadiazolu są np. kwas benzo-1,2,3tiadiazolokarboksylowy-7, ester metylowy kwasu benzo-l,2,3-tiadiazolokaΓboksylowego-7, ester η-propylowy kwasu benzo-1,2.3-tiadiazolokarboksylowego-7, ester benzylowy kwasu benzo-1,2,3tiadiazolokarboksylowego-7, Il-rzęd.-butylohydrazyd kwasu benzo-1,2,3-tiadiazolokarboksylowego-7 ltp.

Drugą grupą regulatorów dla dających się regulować chemicznie sekwencji DNA są związki oparte na strukturze kwasu pirydynokarboksylowego, np. na strukturze kwasu izonikotynowego, a korzystnie na strukturze kwasu chlorowcoizonikotynowego. Korzystne są kwasy dwuchloroizonikotynowe i ich pochodne, np. ich niższe estry alkilowe. Odpowiednimi regulatorami z tej klasy związków są np. kwas 2,6-dwuchloroizonikotynowy i jego niższe estry alkilowe, zwłaszcza ester metylowy.

Jak już wyżej opisano, opracowano sposób regulowania transkrypcji genu dającego się regulować chemicznie przez zastosowanie takiego regulatora chemicznego na tkankę roślinną, roślinę lub nasiona zawierające dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA opisaną w części A, B lub C powyżej. Korzystny jest sposób, w którym ta tkanka roślinna, roślina lub nasiona zawierają dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA wspomnianą powyżej jako korzystną.

Regubtory chemiczne można stosować w formie czystej, w roztworze lub w zawiesinie, w postaci proszków lub proszków pylistych lub w innej dogodnej formie użytkowej stosowanej w rolnictwie lub w procesach prowadzonych w bioreaktorach. Takie formy użytkowe mogą zawierać stałe lub ciekłe nośniki, to jest materiał z którymi jest połączony regulator w celu łatwiejszego stosowania na rośliny, tkanki, komórki, kultury tkankowe lub podobne, albo w celu polepszenia warunków przechowywania, operacji lub transportu. Przykładami odpowiednich nośników są krzemiany, iły, węgiel, siarka, żywice, alkohole, ketony, węglowodory aromatyczne itp. Przy sporządzaniu często stosowanego proszku zwilżalnego albo emulsji wodnej, do użytkowej formy regulatora można dodać jeden lub większą liczbę środków powierzchniowo czynnych, jonowych lub niejonowych, takich jak środki zwilżające, emulgujące lub dyspergujące.

Regubtory można stosować do roślin również w połączeniu z innym środkiem korzystnym dla rośliny, przy czym korzyść ta może być związana lub nie związana z cechą kontrolowaną przez gen chimeryczny znajdujący się pod kontrolą regulatora. Regulator można np. mieszać z nawozem

162 317 sztucznym i stosować bezpośrednio przed ekspresją cechy transgenicznej niezależnej od nawożenia. Regulator można ponadto stosować w połączeniu ze środkiem chwastobójczym w celu osłabienia niekorzystnego wpływu tego środka w okresie, kiedy wpływ ten osiągałby swe maksimum.

W postaci ciekłych form użytkowych regulator można stosować jako ciecz opryskową na liście, łodygi lub gałęzie roślin, na nasiona przed wysiewem albo do gleby lub innego podłoża wzrostu rośliny. Regulatory można również stosować w hodowlach prowadzonych w bioreaktorach, uzyskując regulację przez zwykłe dodanie formy użytkowej regulatora do środowiska reakcji lub przez stopniowe dozowanie w określonym czasie.

Regulator stosuje się w ilości i w czasie potrzebnym do uzyskania właściwej regulacji. Korzystnym regulatorem jest taki, który nie wywiera fitotoksycznego lub innego niekorzystnego wpływu na roślinę, tkankę roślinną lub komórki roślinne, na które jest stosowany, lub wpływ ten zaznacza się jedynie w minimalnym stopniu.

Spośród sekwencji DNA opisanych w częściach A i B oraz chimerowych sekwencji DNA opisanych w części C, korzystne są zwłaszcza te, których transkrypcja jest regulowana regulatorem chemicznym wymienionym powyżej, zwłaszcza kwasem benzoesowym, salicylowym, acetylosalicylowym i poliakrylowym oraz podstawionymi pochodnymi tych związków albo kwasem benzo1,2,3- tiadiazolokarboksylowym, kwasem benzo-l,2,3-tiadiazolotiokarboksylowym,cyjanobenzo1,2,3- tiadiazolem, amidem kwasu benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowego i hydrazydem kwasu benzo-l 2,3-tiadiazolokarboksylowego oraz ich pochodnymi albo kwasem dwuchloroizonikotynowym lub jego pochodnymi. Najbardziej korzystne są te sekwencje DNA, transtrypcja których jest regulowana przez wspomniane, korzystne regulatory chemiczne, np. kwas benzo-1,2,3tiadiazolokarbkksylowy-7, ester metylowy kwasu benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowego-7, ester n-propylowy kwasu benzo-1,2,3-tiadiazolokarboksylowego-7, ester benzylowy kwasu benzo-1,2,3tiadiazolokarboksylowego-7, Il-rzęd.butylohydrazyd kwasu benzo-1,2,3-tiadiazolokarboksylowego-7. kwas 2,6-dwuchlo-oizonikotynowy lub ester metylowy kwasu 2,6-dwuchloroizonikotynowego, a zwłaszcza ester metylowy kwasu renzo-l,2,3-tladlazolokarboksylowego-7.

J. Depozyty w ATCC.

W American Type Culture Collection (Kolekcja Kultur Typu Amerykańskiego) zdeponowano następujące bakterie, plazmidy i zawiesiny kultur:

E. Coli HB101 /pTJS75-Km, nr ATCC 67628, zdeponowany 12 lutego 1988 r., plazmid pBS-PR1013Cla, nr ATCC 40426, zdeponowany 12 lutego 1988 r., plazmid pBS-PR1019 nr ATCC 40427, zdeponowany 12 lutego 1988 r., zawiesinę kultury Zea mays 6-2717-GC', nr ATCC 40326, zdeponowano 20 maja 1987 r., plazmid pBS-Glu39.1, nr ATCC 40526, zdeponowany 29 grudnia 1988 r., plazmid pBS-Glu39.3, nr ATCC 40527, zdeponowany 29 grudnia 1988 r., plazmid pBScucchi/Chitynaza, nr ATCC numer 40528, zdeponowany 29 grudnia 1988 r., plazmid pBSGL6e, nr ATCC numer 40535, zdeponowany 18 stycznia 1989 r.

K. Opis części doświadczalnej.

Geny chimerowe zawierają regulowane chemicznie sekwencje DNA z dowolnego źródła, naturalnego lub syntetycznego, w połączeniu z jedną lub większą liczbą, podlegających transkrypcji sekwencją DNA. Na ogół co najmniej część podlegającej transkrypcji sekwencji DNA będzie podlegać translacji, dając cechę fenotypową, aczkolwiek mogą być również użyteczne geny chimerowe działające na zasadzie mechanizmu anty-sensownego. Chociaż poniższy opis i wiele przykładów dotyczy dających się regulować chemicznie sekwencji DNA występujących w stanie naturalnym w genomach roślinnych, co w równym stopniu użyteczne są także sekwencje, które występują w innych układach naturalnych, np. w układach bakteryjnych, wirusowych i zwierzęcych, jako, ze techniki izolowania takich sekwencji są ogólnie znane. Dotyczy to również sekwencji pochodzących z układów syntetycznych lub innych układach me-naturalnych.

Dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA izoluje się ze źródła, w którym występuje w stanie naturalnym, lub ze źródła syntetycznego, i w razie potrzeby charakteryzuje się ją w znany sposób. Jeśli sekwencję DNA izoluje się z genu występującego w stanie naturalnym, to gen ten aktywuje się odpowiednim regulatorem, chemicznym lub innym, znanym dla tego genu. RNA powstający w wyniku takiej aktywacji izoluje się i stosuje do konstruowania banku cDNA. Bank ten stosuje się do różnicującego skriningu, stosując znakowany pierwiastkiem radioaktywnym

162 317 cDNA generowany zarówno z (1) RN A wyizolowanego z zaktywowanego układu jak i (2) RNA wyizolowany z drugiego układu, nieaktywowanego regulatora. Klony zawierające dający się regulować chemicznie cDNA izoluje się i korzystnie w tym etapie poddaje sekwencjonowaniu. Te klony cDNA używa się następnie do identyfikacji i izolacji klonu genomowego z banku genomowego, izolując klon genomowy zawierający dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA. Korzystnie, gen ten poddaje się sekwencjonowaniu i sporządza się mapę funkcjonalną dającej się regulować chemicznie sekwencji DNA przez subklonowanie fragmentów tego genu, ligację z opisywanym genem i ocenę ich aktywności w transgenicznym materiale roślinnym lub w przejściowych roślinnych układach ekspresyjnych.

Stosując standardowe techniki, dla genów białka PR z tytoniu konstruuje się bank genomowy lambda, po czym identyfikuje się i oczyszcza klony zawierające dające się regulować chemicznie sekwencje DNA. Charakteryzuje się jeden z tych klonów. Identyfikuje się fragmenty restrykcyjne zawierające dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA. Dla genu PR-la fragmenty te obejmują fragment Ciał o długości 20 000 bp, fragment Hind III o długości 6500 bp i fragment EcoRI o długości 3600 bp. Fragment Hundlll zawiera około 500 kodujących par zasad i około 600 par zasad niekodujących w regionie flankującym 5' sąsiadującym z przejściowym miejscem startu. Niektóre z tych fragmentów klonuje się do plazmidów i stosuje się jako źródła DNA do dalszego subklonowania i pełnej charakteryzacji, to jest sporządzenia mapy restrykcyjnej, sekwencjonowania DNA i identyfikacji przejściowego miejsca startu w genie. Dla genu PR-la, fragment EcoRI o długości 3600 bp bezpośrednio klonuje się z klonu genomowego lambda i następnie subklonuje się do ostatecznego klonu o długości 1200 bp flankowanego miejscami dla Xhol i Pstl. Ten klon zawiera dającą się indukować chemicznie sekwencję DNA z genu PR-la i część sąsiadującego regionu dla tego genu. Ta część zawiera sekwencję kodującą peptyd sygnalny z genu dla białka PR-la.

Podobnie izoluje się klony genomowe, kodujące zasadową formę /3-1,3-glukanazy. Dwa klony o symbolach 39.1 i 39.3 charakteryzuje się i identyfikuje się fragmenty restrykcyjne zawierające dające się regulować chemicznie sekwencje DNA.

Stosując opisane tu wektory można użyć te klony do sporządzenia genów chimerowych, zawierających opisane powyżej trzy części. Te chimerowe sekwencje DNA zawierają dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA, część DNA podlegającego transkrypcji i trzecią sekwencję DNA z obcego źródła. Alternatywnie, klony te można poddawać dalszym manipulacjom, np. kierowanej miejscem mutagenezie, w celu usunięcia całości lub większej części kodującego fragmentu z macierzystego genu przed przyłączeniem do sekwencji kodującej z obcego źródła, dla skonstruowania opisanego powyżej dwuczęściowego genu chimerowego.

W korzystnym rozwiązaniu, ta część genu chimerowego, która nie jest sekwencją dającą się regulować chemicznie, stanowi gen dla łatwej do obserwowania i wykrycia cechy fenotypowej. W poniższych przykładach opisano geny dla /3-l,3-glukuronidazy, dzikiej i opornej na środek chwastobójczy syntetazy acetohydroksykwasowej i endotoksyny Bacillus thuringiensis. Można ponadto podać wiele innych genów dla cech łatwych do identyfikacji. W następnym korzystnym rozwiązaniu, kodująca sekwencja komponentowa w genie chimerowym koduje tolerancję lub oporność na środki chwastobójcze albo oporność na owady. Rozwiązanie to jest opisane na przykładzie wspomnianych genów dla syntetazy acetohydroksykwasowej i dla endotoksyny Bacillus thuringiensis.

Geny chimerowe i wektory zawierające te geny wprowadza się do komórek roślinnych wieloma technikami, uzyskując wzrost transformowanych komórek, tkanek i roślin oraz kultur komórkowych w bioreaktorach. W poniższych przykładach opisano szczegółowo kilka technik, stosowanych zarówno do roślin jednoliściennych jak i dwuliściennych. Niektóre z tych metod są przedmiotem innych zgłoszeń patentowych, a zwłaszcza zgłoszeń patentowych St. Zjedn. Am. nr 056506 z dnia 29 maja 1987 r. i nr 165 665 z dnia 8 marca 1988 r.

Transformowany materiał roślinny traktuje się następnie regulatorem chemicznym i dokonuje się obserwacji i/lub pomiaru ekspresji genu kodującego cechę fenotypową. Ten rodzaj układu jest łatwym narzędziem skriningu dla identyfikacji aktywności regulacyjnej konkretnego związku chemicznego. W związku z tym opracowano ulepszony sposób oznaczania aktywności enzymatycznej /51 ronidazy (GUS), pozwalający na skrining dużej ilości próbek z wysoką precyzją

162 317 w krótkim czasie. Oznaczenie to polega na reakcji ekstraktów tkanek roślinnych w próbkach poniżej 0,5 ml zawierających 1,5-3 mM 4-metylo-umberliferylo-glukuronidu w temperaturze około 37°C w ciągu 1-5 godzin i oznaczeniu stężenia uwalnianego indykatora fluorescencyjnego.

Oznaczenie ilościowe stałych poziomów RNA jest zasadniczym etapem w analizie ekspresji genu. W tym celu opracowano sposób wydłużenia primera. Zgodnie z tym sposobem znakuje się oligonukleotyd specyficzny dla genu pierwiastkiem radioaktywnym, nadając mu wysoce specyficzną radioaktywność, hybrydyzuje się ten oligonukleotyd z próbką RNA i wydłuża się hybrydę odwrotną transkryptazą. Produkty wydłużenia rozdziela się na denaturujących żelach akryloamidowych i uwidocznia metodą autoradiograficzną. Zalety tego sposobu w stosunku do poprzednich sposobów oznaczania polegają na łatwości przygotowania sondy, prostocie procedury oznaczania i krótszym czasie potrzebnym do wykonania oznaczenia. Ten sposób wydłużania primera jest równie czuły i ilościowy jak sposób mapowania endonukleazą SI.

Sposób wydłużania primera, stosowany w konkretnych warunkach reakcji opisanych poniżej w przykładach zoptymalizowano dla oznaczenia poziomu mRNA PR-1 w ogólnym RNA ekstrahowanym z zakażonych TMV liści tytoniu. W tych liściach PR-1 mRNA jest wytwarzany w ilości 1% ogólnego MRNA. Wyniki te uzyskano w oparciu o ilościową analizę danych uzyskanych z użyciem sposobu wydłużenia primera i analizę częstości występowania klonów cDNA w banku cDNA pochodzącym z tego RNA. Ulepszenia osiągnięto dzięki opisanemu tu sposobowi w stosunku do poprzednio opisanych sposobów polegając na znakowaniu oligonukleotydu do wysoko specyficzniej aktywności, zmniejszeniu molowej ilości sondy stosowanej do oznaczenia (na ogół 0,01-0,05 pmola), optymalizacji czasu hybrydyzacji i elongacji i optymalizacji stężeń trójfosforanów nukleotydów. Tak więc sposób oznaczania ilości specyficznego RNA w roztworze RNA polega na (a) znakowaniu specyficznego dla RNA primeru oligonukleotydowego o długości 12-18 nukleotydów, nadając mu wysoce specyficzną radioaktywność, (b) hybrydyzacji tego RNA ze znakowanym oligonukleotydem w stężeniu 0,1-20 mM w ciągu od 2 minut do 24 godzin, w temperaturze około 37°C, (c) elongacji tego primeru oligonukleotydowego odwrotną transkryptazą w obecności trójfosforanów nukleotydów, w stężeniu 0,003-1 mM, w ciągu 1 — 120 minut i (d) wydzieleniu i uwidocznieniu produktów elongacji metodą autoradiograficzną.

L. Przykłady.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.

Reakcje enzymatyczne przeprowadza się zgodnie z procedurami zalecanymi przez producentów, o ile nie wskazano inaczej. Geny chimeryczne i wektory konstruuje się używając powszechnie znanych technik. Odpowiednie techniki opisano w następujących publikacjach: T. Maniatis i inni, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982), Methods in Enzymology, tomy 68,100, 101 i 118 (1979, 1983, 1983 i 1986) i DNA Cloning D. M. Glover, IRL Press, Oxford (1985). Składy pożywek opisano w publikacji J. H. Millera, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972), jak również w publikacjach podanych uprzednio.

Skróty

ATP trójfosforan adenozyny bp pas ;nsad

CETAB bromek heksadecylotrójmesyloamonlowy

2,4-D kwas 2,4-dwuchloroeenossyoctowy

DTT dttlOtΓettol dicamba kwas 3,6-douchloro-2-metoksybenfOsrowy

EDTA kwas esylenodwuamlno-N,N,N',N'-czterooctowy kb yysiące pas zaaad

MES l^w^^s 2-(N~moffoilnoe^ranosulfonowy

MU glukuronid 4-mesyloumbeilfesylu

PEG giiko 1 poiiesylenowy picloram kwas 4-amlno-3,5,ί^trójchloropikoiinowy

SDS sodowy

TFA kwas tI·ójfiuorooctowy

TMV w^us mozaik i zto^nui

Tris-HCl chlorowodorek ttój(hzdtoeszmetzlo)metzlorminz

162 317

Pożywki.

Pożywka SH-O: pożywka według R. U. Schenka i innych, Can. J. Bot., 50(1972) 199-204, bez hormonów. Pożywka SH może być płynna lub zestalona przy użyciu 0,8% agaru lub 0,5% GelRite. Pożywkę sterylizuje się termicznie w autoklawie w temperaturze około 110-121°C przez 15-20 minut.

Pożywka SH-30: pożywka SH-O zawierająca 30μΜ dicamba.

Pożywka SH-45: pożywka SH-O zawierająca 45μΜ dicamba.

Pożywka RY-2· pożywka według Y. Yamady i innych, Plant Celi Reports, 5, 85-88 (1986).

Pożywka OMS: pożywka według T. Murashige i F. Skooga, Physiologia Plantarum 9, 473 (1968). Pożywkę można zestalić dodając 0,8% agaru lub agarozy, względnie 0,5% GelRite.

W tabeli 1 podano skład stosowanych pożywek. Makroelementy ^a/. mikroelementy ^a/ i FeEDTA dodaje się zgodnie z literaturą: pożywka KM według K. N. Kao i innych, Planta 126, 105-110 (1965), pożywka N6 według Chu i innych, Scientia Sernica 18, 659 11975).

Tabela 1

Pożywki	KM-8p°' ^c' N6
Związki organiczne i witaminy (mg/litr)
biotyna	0.01	-
pirvdoksvna-HCI	1,00	0.5
tiamina-HCI	10.00	0.1
amid kwasu nikotynowego	1.00
kwas mkotvnowv	0,10	0.5
kwas foliowy	0.40	-
D-Ca-pentotenian	1,00	-
kwas p-aminobenzoesowy	0,02	-
chlorek choliny	1 00	-
ryboflawma	0,20	-
witamina B12	0.02	-
glicyna	0.10	2,0
Cukry 1 alkohole pochodne cukrów (g/lilr)
sacharoza	0,25	30,0
glukoza	68,40	-
mannit	0,25	-
sorbit	0,25	-
celobioza	0,25	-
fruktoza	0,25	-
mannoza	0,25	-
ramnoza	0.25	-
rvboza	0,25	-
ksyloza	0.25	-
mioinozyt	0.10	-
Końcowe pH	5.8	5.6
Sterylizacja	filtracja	ainoklauouanie

Objaśnienia odnośników a/ Makroelementy przygotowuje się jako dziesięciokrotnie stężony roztwór podstawowy, mikroelementy jako tysiąckrotnie stężony roztwór podstawowy b/ Roztwór kwasów cytrynowego, fumarowego i jabłkowego (każdy o stężeniu końcowym 40 mg/litr) i pirogromanu sodowego (o stężeniu końcowym 20 mg/litr) przygotowuje się jako stukrotme stężone roztwory podstawowe, o pH doprowadzonym do wartości 6,5 przy użyciu NH«OH, i dodaje się do tej pożywki

162 317

Ro/iworv adeniny (końcowe stężenie 0 I mg/lnr) oraz guamny. tymidyny, uracylu, hipoksantyny i cytozyny (każdy o stężeniu końcowym 0.03 mg/litr) przygotowuje się jako tysiąckrotnie stężone roztwory podstawowe. o pH doprowadzonym do wartości 6.5 przy użyciu NH4OH, 1 dodaje się do tej pożywki d/ Następujące aminokwasy dodaje się do lej pożywki używając dziesięciokrotnie stężonego roztworu podstawowego (o pH 6.5 doprowadzonym przy użyciu NH4OH). osiągając podane stężenia końcowe glutamina (5.6 mg/litr). alanina, kwas glutaminowy (po 0.6 mg/litr) cysteina (0.2 mg/litr). asparagina, kwas asparaginowy. cystyna. histydyna. izoleucyna. leucyna. lizyna, metionina. fenyloalanina. prolina seryna. treonina. tryptofan. tyrozyna 1 walina (po 0.1 mg/litr) e/ Roztwór podstawowy witamin przygotowuje się standardowo stukrotme stężony Materiały.

Agaroza: Przygotowanie i oczyszczanie agarozy opisali Guiseley i Renn. „The Agarose Monograpg. Marinę Colloids Division FMC Corp.. 1975. Agaroza jest jednym ze składników agaru. Agar dostępny w handlu składa się z mieszaniny obojętnej agarozy i jonowych agaropektyn z dużą liczbą grup bocznych. Zazwyczaj pewna liczba łańcuchów bocznych pozostaje nienaruszona i determinuje fizykochemiczne właściwości agarozy. takie jak tworzenie żelu i temperatura topnienia. Korzystnym środkiem zestalającym jest agaroza topniejąca w niskiej temperaturze. zwłaszcza agaroza SeaPlaque.

Hydrolizat kazeiny: Hydrolizat kazeiny-Hyrolizat enzymatyczny z mleka krowiego. Typ 1. Sigma Co . P. O. Box 14508. St. Louis. MO 63178. USA

Cellulaza RS: Cellulaza RS. Yakult Honsha Co.. Ltd.. 1. 1. 19 Higashi-Shinbashi. Minato-ku. Tokio. 105 Japonia.

GelRite: GelRite Gellan Gum. Scott Laboratories Inc.. Fiskerville. R. J. 02823. USA.

GeneScreen Plus: nr katalogowy NEF 976. NEW Research Products. 549 Albany St.. Boston. MA 02118. USA.

IBI Random primer kit: „Pnme Time“ zestaw losowych primerów. International Biotechnologies Inc.. P. O. Box 1565. New Haven. CT 07606. USA.

Filtr Nalgene: Nalge Co.. Division of Sybron Corp. Rochester. N. Y. 14602. USA.

Pectolyase Y-23: Seishin Pharmaceutical Co. Ltd.. 4-13 Koamicho. Nihonbashi. Tokio. Japonia.

Parafilm: folia laboratoryjna Parafilm - American Can Co. Greenwich. CT 06830. USA.

SSC: 1,54 mM NaCl. 0.154 mM cytrynian sodowy.

Spin column: gotowa. wypełniona kolumna Sephadex G25. nr katalogowy 100402. Boehringer Mannheim Biochemicals. Piscatway. NJ. USA.

Bufor TAE i bufor TBE: odpowiednio bufor Tris-octan i bufor Tris-boran. powszechnie używane bufory do elektroforezy. patrz Maniatis i inni. j. w.

1. Techniki ogólne.

Ta grupa przykładów opisuje ogólne techniki stosowane w następnych przykładach szczegółowych.

Przykład I. Ligacja w agarozie.

Po trawieniu restrykcyjnym plazmidowego DNA i elektroforetycznym rozdziale fragmentów na żelu topniejącym w niskiej temperaturze w buforze TAE. prążki zawierające odpowiednie fragmenty dokładnie wycina się i ogrzewa do temperatury 65°C w celu stopienia agarozy. 2-5μ\ tej agarozy dodaje się do 15μ1 wody. a następnie roztwór pozostawia się na 10 minut w temperaturze 65°C. Roztwór ten chłodzi się do temperatury 37°C i pozostawia na 5 minut w celu wyrównania temperatury. 2μ1 dziesięciokrotnie stężonego buforu do ligazy (200 mM Tris. pH 8.0. 100mM MgCfe, 100 mM DTT. 10 mM ATP) dodaje się wraz z 1 μ\ ligazy DNA T4 (New England BioLabs). a następnie roztwór ten pozostawia się do zestalenia i inkubuje przez noc w temperaturze 15°C.

Przykład II. Transformacja z agarozy.

Agarozę zawierającą odpowiedni DNA topi się inkubując przez 10 minut w temperaturze 65°C. 10μ1 tego roztworu dodaje się do 30 μΐ buforu TE (10 mM Tris pH 7.5.1 mM EDTA). miesza i pozostawia w temperaturze pokojowej. Zamrożone komórki kompetentne (szczep DH5a E. coli) umieszcza się w mokrym lodzie w celu rozmrożenia. Rozcieńczony roztwór DNA dodaje się do 200AI komórek i pozostawia w lodzie przez 20 minut. Komórki zawierające DNA poddaje się następnie szokowi termicznemu w temperaturze 41 °C przez 90 sekund. Komórki te pozostawia się następnie w temperaturze pokojowej na 10 minut. Dodaje się 0.8 ml pożywki SOC [D. Hanahan

162 317

J. Mol. Biol. 166,557-580 (1983)] i kulturę inkubuje się przez jedną godzinę w temperaturze 37°C. 100 μΙ kultury wysiewa się na płytki z pożywką LB (Miller, j. w.) zawierającą ampicylinę (L-amp) w stężeniu H^0//g/ml. Następnie płytki inkubuje się przez noc w temperaturze 37°C. Wybiera się kolonie dodatnie i przesiewa na drugą płytkę z tą samą pożywką, a następnie płytki inkubuje się przez noc w temperaturze 37°C.

Przykład III. Technika Soztherna.

^g DNA tytoniu trawi się różnymi enzymami restrykcyjnymi w warunkach zalecanych przez dostawcę. DNA ekstrahuje się fenolem, wytrąca etanolem i następnie ponownie zawiesza w buforze do nanoszenia na żel (15% ficoll, 0,025% błękit bromofenolowy, 10 mM EDTA, pH 8). Próbki nanosi się i poddaje elektroforezie na 0,5% żelu agarozowym przy 5V/cm, do momentu, aż barwnik - błękit bromofenolowy osiągnie koniec żelu. DNA przenosi się na Gene-Screen Plus (DuPont), stosując zasadową procedurę przenoszenia według opisu dostawcy. Pre-hybrydyzację, hybrydyzację i przemywanie prowadzi się według zaleceń producenta. Hybrydyzację wykrywa się metodą autoradiografii.

Przykład IV. Adaptory molekularne.

Typowym adaptorem molekularnym do przekształcania miejsca restrykcyjnego Pstl w BamHI jest sekwencja

5'-GGGATCCCTGCA-3'.

Cząsteczkę tę syntetyzuje się. w syntetyzatorze Applied Biosystems Synthesizer stosując metodę z użyciem/5-cyjanoetyloamidofosforyn i oczyszcza metodą HPLC z odwróconymi fazami. Około 2//g tego oligonukleotydu fosforyluje się według Maniatisa i innych, j. w.,str. 125. Roztwór oligonukleotydu ogrzewa się do temperatury 65°C w łaźni wodnej, a następnie pozostawia do ochłodzenia do temperatury pokojowej przez około 30 minut. Około dziesięciokrotny nadmiar molowy tego wygrzanego adaptora dodaje się do strawionego DNA z dziesi^ciokrotnie stężonym buforem do ligazy, ligazę DNA T4 i odpowiednią ilość wody.

W skład typowej mieszaniny reakcyjnej wchodzą: DNA, który ma być łączony z adaptorem 1-2 μ] (~1 pmol); adaptor 1 μ\ (—Opmol); 10-krotnie stężony bufor do ligazy 1μ1; ligaza DNA T4 1 μ1; woda 5-6/1.

Roztwór ten inkubuje się w temperaturze 12-15°C przez 30 minut i ogrzewa się w temperaturze 65°C przez 30 minut w celu inaktywacji ligazy. Stężenie soli i objętość dostosowuje się dla zapewnienia odpowiednich warunków do trawienia restrykcyjnego i połączony z adaptorem DNA trawi się w celu wyeksponowania „lepkiego końca. Nie wbudowane adaptory usuwa się przez elektroforezę na żelu agarozowym lub przez kolejne wytrącanie izopropanolem.

Przykład V. Mapowanie wydłużonego primera.

A. Synteza i znakowanie końców 5' primerów dla procesu wydłużania primera.

Następujące oligomery primerowe syntetyzuje się w syntetyzatorze Applied Biosystems Synthesizer, stosując metodę z użyciem jJ-cyjanoetyloamidofosforynu

PR-1: 5'-ATAGTCTTGTTGAGAGTT-3'

GUS: 5'-TCACGGGTTGGGGTTTCTAC-3'

AHAS: 5'-AGGAGATGGTTTGGTGGA-3'

BT: 5'-ATACGTTCTACTATCATAGT-3

Oligonukleotydy oczyszcza się metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) z odwróconymi fazami. 5pmoli każdego oligonukleotydu fosforyluje się (T. Maniatis i inni, j. w. str. 125), używając 200//Ci ³²P ATP (6000Ci/mmol, 10μΟ/μ0. Po 30 minutowej inkubacji w temperaturze 37°C mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się do objętości 100μ1, ekstrahuje mieszaninę fenol/chloroform i natępnie wytrąca trzy razy z 50//g nośnikowego RNA. Końcowy osad zawiesza się w buforze do odwrotnej transkryptazy (50 mM Tris—HC1 pH 7,5,40 mM KC1, 3 mM MgCk) o stężeniu 2nM. Oznaczona aktywność właściwa znakowanego oligonukleotydu wynosi około 3 X I0⁶ Cvcpm/pmol.

B. Wytwarzanie całkowitego RNA.

Całkowity RNA przygotowuje się zasadniczo jak opisali L. M. Lagrimini i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7542 (1987). Tkankę uciera się pod ciekłym azotem tłuczkiem w moździerzu. Roztartą tkankę dodaje się do buforu do ucierania (Lagrimini i inni. j. w.) stosując 2,5 ml na gram tkanki. Następnie dodaje się równą objętość fenolu i homogenizuje emulsję w homogenizatorze

162 317

Brinkman polytron. Dodaje się połowę objętości chloroformu i emulsję miesza się łagodnie przez 15 minut. Fazy rozdziela się przez wirowanie i usuwa fazę wodną. RNA wytrąca się przez dodanie octanu sodowego do stężenia 0,3 M oraz 2,5 objętości etanolu. Osad oddziela się przez wirowanie i zawiesza ponownie w 2 ml jałowej wody. Dodaje się chlorek litowy do końcowego stężenia 3 M i pozostawia przez noc w temperaturze 4°C. Roztwór wiruje się, a uzyskany osad przemywa 80% etanolem schłodzonym lodem. Następnie osad suszy się i zawiesza ponownie w 500μ1 jałowej wody. Stężenie całkowitego RNA w tym preparacie oznacza się spektrofotometrycznie. Alternatywnie, RNA ekstrahuje się z kallusa jak opisano powyżej z tą różnicą, że tkankę kallusa tnie się w około 3 mm kostki i wprowadza do uprzednio ochłodzonego moździerza i uciera tłuczkiem w ciekłym azocie przed etapem homogenizacji w homogenizatorze Brinkman polytron.

C. Wydłużanie primera.

50yjg całkowitego RNA liofilizuje się w probówce Eppendorfa o objętości 500μ1. RNA zawiesza się ponownie w 30μ! roztworu sondy znakowanej izotopem radioaktywnym i ogrzewa do temperatury 70°C przez 10 minut. Probówkę chłodzi się powoli do 37°C i inkubuje przez noc. Do probówki umieszczonej w łaźni wodnej w temperaturze 37°C wprowadza się 2μ1 dziesięciokrotnie stężonego buforu do odwrotnej transkryptazy (500 mM Tris-HCI, pH 7,5, 400 mM KC1, 30 mM MgCl₂), 1μ1 albuminy surowicy bydlęcej o stężeniu 5mg/ml, 5μ1 100mM ditiotreitolu, 5μ1 dziesięciokrotnie stężonego dNTP (10 mM wodnego roztworu każdego dNTP), 3μ1 wody, 2μ1 RNazyny (80 jednostek) i 2μ1 odwrotnej transkryptazy (400 jednostek) i mieszaninę reakcyjną inkubuje się przez 30 minut w temperaturze 37°C. W celu zahamowania reakcji dodaje się 5μ1 3 M octanu sodowego (pH 5) i 150μ1 etanolu absolutnego. Probówkę pozostawia się w temperaturze -20°C przez 30 minut, osad oddziela się przez wirowanie, a następnie przemywa 80% etanolem i pozostawia do wyschnięcia na powietrzu. Osad zawiesza się ponownie w 10—20μ/1 buforu z barwnikiem do nakładania na elektroforezę (90% amid kwasu mrówkowego, 0,05% błękit bromofenolowy, 0,05% ksylenocyjanol, 1 mM EDTA) i produkty wydłużania rozdziela się na 6% żelu do sekwencjonowania (T. Maniatis i inni, j. w.). Produkty wydłużania uwidacznia się metodą autoradiografii.

Przykład VI. Mapowanie nukleazą SI.

Plazmid pBS-PR 1013Cla trawi się restryktazą SfaNI, defosforyluje fosfatazą zjelita cielęcego i fosforyluje stosując ³²P-ATP. Po ekstrakcji fenolem i wytrąceniu etanolem, DNA trawi się restryktazą BstEII i fragment o długości 300 bp odpowiadający sekwencji od nukleotydu 750 do 1035 na fig. 39 izoluje się po elektroforezie na żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania. Sondę zawiesza się ponownie w buforze do hybrydyzacji zawierającym amid kwasu mrówkowego [A. J. Berk i inni, Celi 12, 721 (1977)] w stężeniu około 2 nM. Aktywność właściwa sondy wynosi około 5X10 Cvcpm/pmol.

Zliofilizowany całkowity RNA (50μg) rozpuszcza się w 30μ1 roztworu sondy i probówki ogrzewa się do temperatury 65°C przez 10 minut, a następnie pozostawia się przez noc do hybrydyzacji w temperaturze 48°C. Traktowanie nukleazą S11 elektroforezą żelową przeprowadza się zasadniczo jak opisano, używając nukleazę SI w stężeniu 400 jednostek/ml i stosując temperaturę inkubacji 30°C. Właściwe stężenie nukleazy SI oznacza się we wstępnych doświadczeniach.

Przykład VII. Mapowanie miejsca początku transkrypcji.

Miejsce początku transkrypcji genu PR-la określa się poprzez połączenie mapowania nukleazą SI i analizy wydłużania primera. Autoradiogram z doświadczenia wydłużania primera bada się używając albo RNA wyizolowanego z liści zainfekowanych TMV albo subklonuje mpl9 fragmentu restrykcyjnego Xhol-Pstl jako wzorca i 17-zasadowego oligonukleotydu komplementarnego do pozycji 1025-1042 sekwencji PR-la jako specyficznego primera. Sam primer znakuje się przy fosforanie 5', dlatego wielkość produktu wydłużania będzie identyczna z wielkością odpowiadającą wielkości prążka na ścieżce elektroforezy sekwencyjnej. Pojawienie się dwóch silnych prążków odpowiadających pozycjom 902 i 903 i słabego prążka odpowiadającego pozycji 901 klonu genomowego sugeruje rozpoczynanie transkrypcji w którejkolwiek z tych pozycji. Sama analiza wydłużania primera nie może być użyta do identyfikacji końca 5'mRNA. Np. na skutek procesu składania genowego, mRNA zawierać może koniec 5' z innej (leżącej w kierunku 5') pozycji.

W celu ostatecznego określenia końca 5' stosuje się mapowanie nukleazą SI o wysokiej rozdzielczości w połączeniu z wydłużaniem primera. Fragment SfaNI znakuje się przy końcu 5'

162 317 i trawi restryktazą BstEII, otrzymując specyficzną sondę rozciągającą się od pozycji 759 do L040. Sondy tej używa się do mapowania końca 5 transkryptów PR-la w RNA izolowanym z liści tytoniu zainfekowanych TMV. Stwierdza się główny prążek o długości 137±2 zasad odpowiadający pozycjom 901-905 klonu genomowego. W doświadczeniach o wysokiej rozdzielczości z nukleazą SI, w których produkty trawienia poddaje się elektroforezie wraz z standartami masy cząsteczkowej z reakcji sekwencjonowania przeprowadzanej na sondzie, uwidaczniają się trzy prążki odpowiadające pozycjom 901, 902, 903. Jeśli chodzi o inicjację transkrypcji, jedna z możliwych interpretacji tych wyników jest taka, ze polimeraza RNA rozpoczyna transkrypcję w którejkolwiek zasadzie 901, 902 lub 903 z barzdiej lub mniej równym prawdopodobieństwie. Jednakże, ponieważ transkrypcja eukariotyczna rozpoczyna się najczęściej w miejscu A, najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem dla pozornie wielokrotnych końców 5'jest, że mRNA PR-la zaczyna się w pozycji 903 (pozycja A), a mRNA PR-lb i - lc zaczyna się każdy przy jednej z innych pozycji na ich odpowiadających genach.

2. Identyfikacja i charakteryzacja białek.

Białka PR opisane w tych przykładach izoluje się, oczyszcza i sekwencjonuje, w niektórych wypadkach po raz pierwszy, w innych zaś zgodnie z procedurami opisanymi w literaturze w celu ostatecznego potwierdzenia identyczności ich genów dających się indukować chemicznie.

Przykład VIII. Oczyszczanie białka PR-la i PR-lb.

Rośliny Nicotiana tabaccum cv. Xanthi hoduje się w szklarni i infekuje kiedy mają 8 tygodni przez delikatne nacieranie liści zawiesiną powszechnie występującego szczepu (Ul) TMV (0,5//g/ml). Liście zbiera się 7 dni po zainfekowaniu, płyn wewnątrzkomórkowy (ICF) wymywa się z liści i zbiera zgodnie z procedurą opisaną w literaturze. 250 ml ICF zatęża się do 50 ml przez liofilizację i wprowadza do kolumny z żelem Ultragel ACA54, zrównoważonej Tris-HCl pH 8,0 i 1 mM EDTA. Eluat analizuje się przez elektroforezę na 10% żelach poliakrylamidowych. Frakcje zawierające białka PR-1 zbiera się razem, liofilizuje, ponownie zawiesza w 3 ml wody i następnie dializuje się przez noc wobec wody. Preparat ten dalej oczyszcza się metodą chromatografii aniono-wymiennej HPLC w kolumnie TSK-DEAE 5 PN, prowadząc elucję gradientową z użyciem 0-0,6 M NaCl w 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA. Frakcje analizuje się metodą elektroforezy na żelu poliakrylamidowym (PAGE). Najpierw z kolumny eluuje się PR-lb przy 0,18 M NaCl, a PR-la eluuje się przy 0,28 M NaCl. Frakcje zawierające każde z tych białek zbiera się, dializuje wobec wody i liofilizuje. Czystość preparatów białkowych PR-la i PR-lb potwierdza się metodą HPLC z odwróconymi fazami stosując kolumnę Aquapora phenyl (2,1 X 100 mm, Brownlee) i prowadząc elucję gradientową z użyciem mieszanin o liniowo wzrastającym stężeniu (5-80%) mieszaniny acetonitryl/izopropanol (1:1) w 0,1% TFA.

Przykład IX. Określanie sekwencji białka.

Oczyszczone, zliofilizowane białka PR-la rozpuszcza się w 6M chlorowodorku guanidyny zawierającym 1 M Tris-HCl, pH 8,6, 10 mM EDTA. Dodaje się ditiotreitol do stężenia 20 mM i

4-winylopirydynę do stężenia końcowego 50 mM. Próbkę inkubuje się następnie przez 1,5 godziny w atmosferze azotu. Pirydyloetylowany materiał odsala się metodą HPLC w kolumnie z Aquapore phenyl (2,1 X 10 cm, Brownlee), prowadząc elucję gradientową z użyciem mieszanin o liniowym azrastającym stężeniu (5-80%) mieszaniny acetonitryl/izopropanol (1:1) w 0,1% kwasie trifluorooctowym (TFA).

Automatyczne degradacje Edmana prowadzi się w sekwentorze białek z fazą gazową Applied Biosystems 470A. Fenylotiodantoinowe (PTH) aminokwasy identyfikuje się w analizatorze PTH Applied Biosystems 120A.

Trawienie bromkiem cyjanu prowadzi się m situ według R. J. Simpsona i innych, Biochem. Intl. 8, 787 (1984). Trawienie PR-1 aminopeptydazą piroglutamimanu (Boehringer Mannheim) przeprowadza według G. Allena, Plant Sci. Lett. 26, 173 (1982).

PR-la trawi się endopeptydazą Lys-C (Eoehringer Mannheim) w 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5, przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, przy stosunku enzymu do substratu 1:10. Peptydy izoluje się metodą HPLC w kolumnie Aguapore C-8 (lX22cm, Browlee) prowadząc elucję gradientową z użyciem mieszanin o liniowo wzrastającym stężeniu (0-60%) mieszaniny acetonitryl/izopropanol (stosunek 1:1) w 0,1% TFA.

Trawienie N-końcowego peptydu, powstałego po trawieniu endopeptydazą Lys-C, trypsyną (Cooper) prowadzi się w 0,1 M wodorowęglanie amonowym, pH 8,2, zawierającym 0,1 M chlorek

162 317 wapniowy, przez 5 godzin w temperaturze 37°C, przy stosunku enzymu do substratu 1:100. Powtałe dwa peptydy rozdziela się metodą HPLC, stosując takie same warunki jak dla peptydów powstałych po trawieniu endopeptydazą Lys-C.

Przykład X. Sekwencja peptydów PR-la.

Korelacji sekwencji DNA trzech klonów cDNA z białkami PR-la, -lb i -lc dokonali po raz pierwszy B. J. C. Cornelissen, i inni, j. w., w oparciu o porównanie opublikowanych sekwencji białek trzech peptydów otrzymanych z PR-la [J. Lucas i inni, EMBO J. 4, 2745 (1985)] i strukturę białka wywnioskowaną z klonów cDNA. Jednakże klon cDNA oznaczony jako PR-la skrócony jest przy końcu 5' i można go porównać tylko z dwoma z trzech peptydów z zamienioną jedną resztą. Kodowana sekwencja aminokwasowa wywnioskowana z cDNA otrzymanego i zanalizowanego powyżej posiada nie tylko, jak donoszono, zamienioną resztę tryptofanu w porównaniu z opublikowaną sekwencją cDNA PR-la (U. M. Pfizner i inni, j. w.), lecz także zmieniona jest w trzech innych pozycjach aminokwasów. Te nieprawidłowe miejsca stanowią pod znakiem zapytania identyfikację tego klonu jako PR-la. Dlatego też identyczność klonu tobchrPR 1013 jako genu PR-la weryfikuje się przez określenie dużych części struktury pierwszorzędowej oczyszczonego białka PR-la przez sekwencjonowanie aminokwasów.

Sekwencję aminokwasów białka PR-la porównuje się z sekwencjami aminokwasów wywnioskowanych z klonów cDNA dla PR-la, -lb i -lc. Sekwencja cDNA użyta w analizie pochodzi z klonów cDNA izolowanych powyżej i sekwencji jakie podali U. M. Pfitzner i inni, j. w. które zgodne są w każdej pozycji. Oznacza się ponad 80% ekwencji dojrzałego białka i sekwencja ta odpowiada wywnioskowanej sekwencji białka dla tobchrPR 1013. Porównując wywnioskowaną sekwencję aminokwasów otrzymaną z przypuszczalnych klonów cDNA PR-lb i PR-lc (B. J.C.Cornelissen i inni, j. w.) stwierdza się odpowiednio 7 i 6 zmian. Dowody te jasno wykazują, że tobchrPR1013 jest rzeczywiście klonem genu PR-la.

3. Wytwarzanie klonów.

Przykłady z tej grupy opisują klony wytworzone w wyniku izolacji genu i identyfikacji dających się regulować chemicznie sekwencji i genów chimerycznych zawierających te sekwencje.

Przykład XI. Wytwarzanie tobchrPR1013.

Jądra izoluje się z liści Nicotiana tabaccum przez zamrożenie 35 g tkanki w ciekłym azocie i rozcieranie do drobnoziarnistego proszku tłuczkiem w moździerzu. Proszek dodaje się do 250 ml buforu do rozcierania (0,3 M sacharoza, 50 mM Tris, pH 8,5, 5mM chlorek magnezowy, 5mM wodorosiarczyn sodowy, 0,5% NP40) i miesza się, chłodząc w lodzie przez 10 minut. Mieszaninę sączy się przez 6 warstw gazy i ciecz przenosi do probówek wirówkowych i wiruje się przy 700 X g przez 10 minut. Osady jeszcze dwukrotnie zawiesza się w buforze do rozcierania i wiruje. Po ostatnim wirowaniu osady zawiesza się w buforze do rozcierania i zawiesinę tę nakłada się na powierzchnię 20 ml zimnej warstwy sacharozowej zawierającej 10 mM Tris, pH 8,0,1,5 mM chlorek magnezowy, 140 mM chlorek sodowy, 24% sacharozę i 1% NP40. Probówki te wiruje się przy 17 000 Xg przez 10 minut. Osady na tym etapie zawierają głównie jądra i granulki skrobi. DNA o wysokiej masie cząsteczkowej izoluje się z jąder zasadniczo według T. Maniatisa i innych, j. w. DNA trawi się częściowo restryktazą Mbol i liguje w miejscu BamHI wektora EMBL3. Po przetestowaniu 300000 płytek ze znakowaną sondą cDNA PR-lb wyizolowano i scharakteryzowano 50 dodatnich klonów. DNA klonów z dodatnich płytek oczyszcza się i charakteryzuje stosując analizę restrykcyjną. W wyniku tej analizy klony te sklasyfikowano w ośmiu różnych grupach. Jeden z klonów zidentyfikowano jako tobchrPR1013. Częściowa mapa restrykcyjna tobchrPR1013 przedstawiona jest na fig. 1. Izolowanie i manipulowanie DNA przeprowadza się zasadniczo jak opisał T. Maniatis i inni, j. w.

Przykład XII. Wytwarzanie pBS-PR1013CLa.

Fragment restrykcyjny CLal z klonu tobchrPR 1013 subklonuje się w plazmidzie Bluescript (Stratagene Cloning Systems), otrzymując plazmid pBS-PR1013Cla (patrz fig. 2). Sekwencjonuje się fragment restrykcyjny Xhol-Bgl II o długości 2 kb z pBS-PR 1013Cla. Jak stwierdzono, pozycje 913 do 1711 (fig. 39) odpowiadają dokładnie sekwencji klonu cDNA PR-la wyizolowanego przez U. M. Pfitznera i innych, j. w. Możliwe przedstawienie DNA tytoniu podczas procedury klonowania wyklucza się analizując przewidywane fragmenty restrykcyjne genomowego DNA. W oparciu o dane sekwencyjne i mapę restrykcyjną pBS-PR 1013Cla, trawienie genomowego DNA tytoniu

162 317 restryktazami EcoRI, Hind III, Xhol + Bgl II, lub HindUI + PStl powinno powodować powstanie fragmentów o długości, odpowiednio, 3,2 kb, 6,7 kb, 2,0 kb lub 6,4 kb, które zawierają gen PR-1 a. W celu przetestowania tego przypuszczenia, 3pg chromosomalnego DNA tytoniu trawi się odpowiednimi enzymami i poddaje elektroforezie na 7% żelu agarozowym. DNA przenosi się na błonę nylonową i sonduje znakowanym fragmentem restrykcyjnym XhoI-BstEII z genu PR-la. Dla kontroli trawi się i poddaje elektroforezie DNA plazmidu pBS-PR 1013Cla. Jak przewidywano, trawienie restryktazami EcoRI, HindUl, Xhol + B^Hl i HindUl + Pstl powoduje powstanie fragmentów o oczekiwanych masach cząsteczkowych, migrujących razem z prążkami kontrolnymi. Dlatego tez DNA zawarte w klonie tobchrPR1013 reprezentuje sąsiadujące odcinki DNA genomu tytoniu.

Przykład XIII. Wytwarzanie plazmidu pBS-PR1013Eco.

A. Plazmid pBS-PR 1013Eco konstruuje się poprzez subklonowanie fragmentu restrykcyjnego EcoRI o długości 3,6 kb zawierającego gen PR-la z tobchrPR 1013 (przykład IX) w jednym miejscu restrykcyjnym EcoRI plazmidu bluescript. Plazmid bluescript (nr katalogowy 21203) otrzymuje się z Strategene Cloning Systems, La Jolla, California. Strukturę plazmidu pBS-PR 1013Eco potwierdza się zarówno przez mapowanie restrykcyjne jak i sekwencjonowanie DNA. Ten sposób konstruowania plazmidu przedstawiono na fig. 3.

B. Alternatywnie, plazmid pBS-PR1013Cla trawi się restryktazą EcoRI i izoluje fragment o długości 3,6 kb zawierający gen PR-1. pBluescript trawi się restryktazą EcoRI, miesza i liguje z uprzednio wyizolowanym fragmentem restrykcyjnym EcoRI o długości 3,6 kb. Ten sposób konstruowania plazmidu przedstawiono na fig. 4.

Przykład XIV. Wytwarzanie plazmidu pBS-PR 1013Eco APst.

Plazmid pBS-PR 1013Eco trawi się restryktazą Pstl i fragmenty DNA rozdziela się na 2,5% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania. Duży fragment zawierający wektor bluescript i fragment DNA tytoniu o długości 3,0 kb wycina się i ogrzewa do temperatury 65°C w celu stopienia agarozy. Następnie 2μ1 dodaje się do 15μΙ wody i DNA liguje się w agarozie jak opisano w przykładzie I. Po inkubacji przez noc, agarozę zawierającą DNA topi się inkubując w temperaturze 65°C przez 10 minut i następnie przeprowadza się transformację z agarozy, zasadniczo jak opisano w przykładzie II. Porcją kultury bakteryjnej z każdej z sześciu przypuszczalnych dodatnich konstrukcji inokuluje się 5 ml pożywki LB (Miller, j. w.) zawierającej K^O/rg na ml ampicyliny i kulturę tę inkubuje się przez noc w temperaturze 37°C. Komórki zbiera się przez wirowanie w wirówce klinicznej przy pełnej szybkości obrotów przez 10 minut. Supernatant usuwa się, a komórki zawiesza ponownie w 100μ1 roztworu o składzie: 50 mM glukoza, 25 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA i zawiesinę przenosi się do probówek wirówkowych Eppendorfa o pojemności 1,5 ml. Następnie dodaje się 25μ1 świeżo przygotowanego roztworu lizotymu o stężeniu lOmg/ml i zawiesinę pozostawia w lodzie przez 10 minut. Następnie dodaje się 200μ1 roztworu o składzie: 0,2 N wodorotlenek sodowy, 1% sodowy siarczan dodecylu i zawiesinę miesza się i pozostawia w lodzie na 2 minuty.

Następnie dodaje się 200μ1 2M octanu sodowego (pH 4,8) i roztwór pozostawia się na 15 minut w lodzie. Otrzymany roztwór wiruje się przy pełnej szybkości otworów w wirówce Eppendorfa, a supernatant usuwa się do nowej probówki i ekstrahuje 400μ1 mieszaniny fenol/chloroform (1:1). Usuwa się fazę wodną do nowej probówki i ekstrahuje 400μ1 chloroformu. Fazę wodną z tej ekstrakcji usuwa się do następnej probówki i wytrąca DNA poprzez dodanie dwóch objętości etanolu i przechowywanie w temperaturze -20°C przez 30 minut. Wytrącony DNA zbiera się przez wirowanie przez 15 minut w mikrowirówce Eppendorfa przy pełnej szybkości obrotów. Usuwa się etanol, a osady przemywa 80% etanolem. Etanol usuwa się ponownie i pozostawia osady do wyschnięcia na powietrzu. DNA zawiesza się ponownie w 100μ1 buforu TE. Konstrukcje weryfikuje się poprzez trawienie restryktazą Pstl. Plazmid rodzicielski daje prążki o długości 6 kb i około 650 pb, z których mniejszy nie utrzymuje się w nowych konstrukcjach. Jeden z tych plazmidów wybrano jako plazmid pBS-PR 1013Eco APst. Strukturę tego subklonu weryfikuje się metodą analizy sekwencji. Sposób konstruowania tego plazmidu przedstawiono na fig. 5.

162 317

Przykład XV. Wytwarzanie plazmidu pBS-PR 1013EcoAPstAXho.

Wstępna mapa restrykcyjna plazmidu pBS-PR 1013Eco jest już ustalona. Miejsce restrykcyjne Xhol zlokalizowane jest około 1200 bp od miejsca Pstl w kierunku zgodnym z kierunkiem transkrypcji. Plazmid pBS-PR 1013EcoA Pst trawi się restryktazą Xhol i fragmenty rozdziela się na 0,9% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania. W wyniku elektroforezy uwidoczniają się fragmenty o długości 3,9 kb i 1,7 kb. Prążek zawierający fragment o długości 3,9 kb wycina się ostrożnie z żelu i liguje w agarozie zasadniczo jak opisano powyżej. Następnie agarozę stapia się i DNA transformuje kompetentny szczep HB 101 E. coli jak opisano powyżej. Jedną, przepuszczalnie dodatnią kolonią inokuluje się pożywkę LB-amp i izoluje DNA zasadniczo jak opisano powyżej. Strukturę tego nowego subklonu pBS-PR 1013EcoA PstA Xho weryfikuje się metodą analizy restrykcyjnej i sekwencjonowania DNA. Fig. 6 przedstawia sposób konstruowania tego plazmidu.

Przykład XVI. Wywarzanie plazmidu pCIB270.

Plazmid pBHOl .3 (nr katalogowy 6024. J) otrzymano z Clonetech Labs, Pało Alto, California. Plazmid ten trawi się najpierw restryktazą BamHI, a następnie SalL. Plazmid pBS-PR 1013EcoA PstA Xho trawi się restryktazą Pstl. Adaptor Pstl BamHI o sekwencji

5'-GGGATCCCTGCA-3' wytwarza się jak opisano w przykładzie IV, i liguje z plazmidem pBS-PR 1013EcoA PstA Xho trawionym restryktazą Pstl. Produkt ligacji trawi się najpierw restryktazą BamHI, a następnie Xhol. Fragment BamHI/XhoI izoluje się, miesza i liguje z trawionym plazmidem pBT101.3, a następnie transformuje bakterie. Przypuszczalnie dodatni klon pCIB270 izoluje się i weryfikuje metodą analizy restrykcyjnej i analizy sekwencji DNA. Sposób wytwarzania tego plazmidu przedstawia fig 7.

Przykład XVII. Wytwarzanie plazmidów M13mpl8- lub mpl9-PR1018EcoA PstA Xho.

Plazmid pBS-PR 1013EcoA PstA Xho trawi się restryktazami Pstl i Asp718. Po elektroforezie na 1% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania wTAE izoluje się fragment Asp718 Pstl o długości 1,1 kb. Formę replikacyjną (RF) faga coli M13mpI8 lub M13mpl9 przygotowuje się według J. Messinga, Meth. Enzymol. 101, 20 (1983). Alternatywnie, wektory te można otrzymać z Bethesda Research Labs. Gaithersburg, Maryland. Obydwa wektory trawi się najpierw restryktazą Asp718, a następnie Pstl. Po usunięciu fragmentu polilinkerowego poprzez elektroforezę na 0,7% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania w TAE, powstały wektor miesza się i liguje w agarozie z przygotowanym jak opisano powyżej fragmentem o długości 1,1 kb. DNA transformuje się bakterie, a następnie przypuszczalnie dodatnie kolonie izoluje się i weryfikuje się strukturę metodą analizy DNA RF. Sposób konstrukcji MI3mpl8-i mpl9-PR1013EcoA PstA Xho przedstawia fig. 8.

Przykład XVIII. Wytwarzanie plazmidów M13mpI8- lub mpI9-PR1013EcoA PstA Xho. Nco i pCIB 268.

Jednoniciowe DNA faga M13mpl8-PR1013Ecoó Pstó Xho izoluje się według Messinga, j. w. Oligonukleotyd primerowy o długości 18 bp i sekwencji 5'-AATCCCATGGCTATAGGA-3', syntetyzuje się jak opisano powyżej. Primer fosforyluje się kinazą polinukleotydową T4 (T. Maniatis i inni, j. w., str. 125) stosując nieznakowany ATP. Po inkubacji w temperaturze 37°C przez 60 minut mieszaninę reakcyjną ogrzewa się przez 15 minut do temperatury 68°C i następnie chłodzi umieszczając w lodzie. Primer ten i primer sekwencjonuje Μ13 -40 (New England Biolabs nr 1212) ogrzewa się w celu uzyskania jednoniciemowego DNA M13mpl8-PR1013EcoA PstA Xho po zmieszaniu w stosunku molowym 1:1:1, poprzez powolne chłodzenie po ogrzewaniu przez 10 minut w temperaturze 68°C. Wygrzaną mieszaninę umieszcza się w lodzie i dodaje się 1/10 objętości dziesięciokrotnie stężonego buforu do elongacji (20 mM Tris, pH 7,5, 6mM MgCl2, 1 mM DTT, mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP i 1 mM dTTp).

Następnie dodaje się 10 jednostek dużego fragmentu polimerazy I DNA (fragment Klenowa, New England Biolabs nr 210) i 0,1 jednostki ligazy DNA T4 (NEB nr 202) i reakcję prowadzi się przez 14 godzin w tempertaurze 15°C. Po upływie tego czasu dodaje się dodatkową ilość każdego enzymu i reakcję prowadzi się przez dodatkowe dwie godziny w temperaturze 25°C, przed użyciem mieszaniny do transformowania kompetentnego szczepu IM101 E. coli. Diagram ogólnego przebiegu tej procedury przedstawia fig. 9.

162 317

W celu identyfikacji zmutowanych fagów, płytki przenosi się do Gene Screen Plus (Dupont) i poddaje procedurze zgodnej z zaleceniami producenta. DNA na sączkach hybrydyzuje się wstępnie przez 4 godziny i hybrydyzuje przez noc w temperaturze 42°C, w roztworze do hybrydyzacji producenta zawierającym 0,9 M NaCl. Sączki przemywa się następnie w sposób ciągły NaCl o stężeniu 0,9 M i monitoruje metodą autoradiografii, zwiększając temperaturę przemywania o 5°C na każdym etapie. DNA fagów zidentyfikowane przez hybrydyzację jako zmutowane sekwencjonuje się w celu potwierdzenia zmiany zasady.

Wyizolowano i strawiono restryktazami Pstl i BstEII DNA replikacyjnej formy jednego z takich kandydatów (M13mpl8-PRI013EcoA PstA Xho. Nco) w celu wytworzenia fragmentu o długości 394 bp, którego używa się do zastąpienia odpowiadającego nie zmutowanego fragmentu o długości 394 bp w plazmidzie pBS-PR1013EcoA PstA Xho jak ilustruje to fig. 10. W rezultacie otrzymuje się plazmid pCIB268, posiadający miejsce restrykcyjne Ncol w pozycji 930, po której następuje 217 bp sekwencji kodującej genu PR-la. Strukturę tego plazmidu potwierdza się metodą analizy sekwencyjnej.

Przykład XIX. Wytwarzanie genów chimerycznych zawierających GUS i zmienną długość sekwencji promotorowej PR.

A. Konstruowanie plazmidu pCIB269.

Fragment o długości 930 bp izoluje się po elektroforezie na 1,0% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania w TAE plazmidu pCIB268 trawionego restryktazami Xhol i Ncol. Fragment ten liguje się następnie z plazmidem pBS-GUS.1.2 (patrz przykład ΧΙΧΒ) strawiony restryktazami Xhol i Ncol. Transformanty izoluje się i poddaje analizie restrykcyjnej oraz sekwencjonowaniu DNA. Wybrano jeden dodatni plazmid i nazwano pCIB269. Sposób konstruowania tego plazmidu przedstawia fig. 11

B. Konstruowanie plazmidu pBS-GUS1.2.

Plazmid pBS-GUS1.2 tworzy się przez trzyczęściową ligację fragmentu restrykcyjnego SalL/SnabI pochodzącego z pRA265 [R. A. Jefferson i inni, EMBO J. 6.3091-3907 (1987) i GUS User Manuał, Clonetech Labs., Pało Alto, Ca] z fragmentem Snabl/EcoRI o długości 1707 bp z plazmidem pBI221 (R. A. Jefferson i inni, EMBO J., j. w.) i plazmidem pBS trawionym restryktazami Sa 111 EcoRI, patrz fig. 12. Transformanty izoluje się i analizuje przez trawienie restrykcyjne i sekwencjonowanie DNA. Jeden ze zweryfikowanych klonów nazwano pBS-GUS1.2.

C. Konstruowanie plazmidu pCIB200.

Najpierw tworzy się TJS75Kan poprzez trawienie plazmidu pTJS75 [Schmidhauser i Helinski, J. Bacteriol. 164,446-455 (1985)] restryktazą Narl w celu wycięcia genu oporności na tetracyklinę i następnie insercję fragmentu restrykcyjnego AccI pochodzącego z plazmidu pUC4K [J. Messing i

J. Vierra, Gene 19, 259-268 (1982)] niosącego gen NptI. Następnie tworzy się plazmid pCIB 200 przez ligację linkerów Xhol z fragmentem restrykcyjnym EcoRI pochodzącym z plazmidu pCIB7 [zawierającym lewą i prawą sekwencję graniczną T-DNA, roślinny dający się selekcjonować gen chimeryczny nos/nptll i polilinker pUC, S. J. Rothstein i inni, Gene 53, 153-161 (1987)] i klonowanie trawionego restryktazą Xhol fragmentu do TJS75Kan trawionego restryktazą Sali.

D. Konstruowanie plazmidu pCIB271.

Plazmid pCIB269 (przykład XIX A) trawi się restryktazami Xhol i EcoRI i po elektroforezie na 10% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania w TAE, izoluje się fragment o długości 3023 bp niosący promotor genu białka PR-la połączony z 3'-końcem nos. Fragment ten liguje się z wektorem, który może ulegać ekspresji w różnych komórkach pCIB200, strawionym restryktazami Sali i EcoRI. Następnie izoluje się transformanty i przeprowadza analizę restrykcyjną. Jeden ze zweryfikowanych klonów nazwano pCIB271. Sposób konstruowania tego klonu przedstawiono na fig. 13.

E. Konstruowanie plazmidu pCIB272.

Plazmid pCIB268 (przykład XVIII) trawi się restryktazami Alul i Ncol, a następnie, po elektroforezie na 0,7% żelu agarozowym w TAE, izoluje się fragment o długości 833 bp. Fragment ten liguje się z genem /3-glukuronidazy z końcem 3'-nos w pBS-GUS1.2 (przykład XIX B). Promotor i GUS następnie wycina się z tego plazmidu, nazwanego pCIB282, jako fragment restrykcyjny Asp7181/BamHI i liguje z plazmidem pCIB200, który strawiono restryktazami

162 317

Asp71811 BamHI przed transformacją szczepu DH5aE. coli. Transformanty izoluje się i przeprowadza analizę restrykcyjną. Jeden ze zweryfikowanych klonów nazwano pCIB272.

F. Konstruowanie plazmidu pCIB273.

Plazmid pCIB268 trawi się restryktazami Haelil i Ncol, a następnie, po elektroforezie na 0,7% żelu agarozowym w TAE, izoluje się fragment o długości 603 bp. Fragment ten umieszcza się przed genem /3-glukuronidazy z 3'-końcem nos w pBS-GUS1.2. Następnie promotor i GUS wycina się z tego plazmidu, nazwanego pCIB283, jako fragment restrykcyjny Asp7181/BamHI i liguje z plazmidem pCIB200, który strawiono restryktazami Asp7181 i BamHI przed transformacją szczepu DH5a E. coli. Transformanty izoluje się i przeprowadza analizę restrykcyjną. Jeden ze zweryfikowanych klonów nazwano pCIB273.

Przykład XX. Wytwarzanie genu chimerycznego w wektorze niosącym gen oporności na hygromycynę.

Plazmid pCIB269 trawi się restryktazami Xhol i EcoRI, a następnie, po elektroforezie na 1,0% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania w TAE, izoluje się fragment o długości 3023 bp niosący promotor genu PR-la połączony z genem GUS z 3'-końcem nos. Fragment ten przekształca się następnie we fragment restrykcyjny Xhol Sali poprzez ligację z adaptorem o sekwencji:

5'-AATTCGTCGACG-3'.

Fragment restrykcyjny Xhol Sali liguje się z plazmidem pCIB712 trawionym restryktazą Sa 11 (S. J. Rothstein i inni, j. w.), w celu-wytworzenia plazmidu pCIB219, (patrz fig. 14).

Przykład XXI. Wytwarzanie plazmidu pCIB200/PR 1-BT.

A. Ligacja z plazmidem pCIB200.

Plazmid pCIB1004 (patrz poniżej) trawi się z restryktazą SphI, ekstrahuje fenolem, wytrąca etanolem i ponownie zawiesza. Syntetyzuje się oligonukleotyd o sekwencji

Y-CCGGTACCGGCATG-3' oczyszcza go, fosforyluje i liguje z plazmidem pCIB1004 strawionym restryktazą SphI. Po ligacji, inaktywuje się ligazą i trawi DNA restryktazą KpnI. To DNA poddaje się elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania. Plazmid pCIB200 (przykład XIX C) trawi się restryktazą KpnI i traktuje pochodzącą z jelita cielęcego fosfatazą zasadową, a następnie poddaje się elektroforezie jak opisano powyżej. DNA z prążków wektora pCIB200i fuzji PR-1 5' -końcowe sekwencje flankujące (BT miesza się i liguje tworząc plazmid pCIB200) PR-1-BT.

B. Wytwarzanie plazmidu pCIB1004.

Plazmid pCIB10(35Bt/607) trawi się restryktazami Ncol i BamHI i poddaje elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania. Plazmid pCIB269 (przykład XIX A) trawi się restryktazami Ncol i Xhol i poddaje elektroforezie jak opisano powyżej. Plazmid pCIB710(S. J. Rothstein i inni, j. w.) trawi się restryktazami Sali i BamHI i poddaje elektroforezie jak opisano powyżej. Prążki zawierające strawiony restryktazami Sali i BamHI wektor obejmujący koniec 3' promotora 35S CaMV sklonowany w pUC19, gen BT oraz 5'-końcowy region flankujący PR-1 wycina się, miesza i DNA liguje tworząc plazmid pCIBI004.

C. Wytwarzanie plazmidui pCIB10(35Bt/607).

Plazmid pCIB10(35Bt/607), częściowo wydeletowany gen protoksyny zawierający sekwencję kodującą około 607 aminokwasów, wytwarza się z plazmidu pCIB10/35Sbt, plazmidu zawierającego gen protoksyny endotoksyny Bacillus thuringiensis. Szczep MC 1061 E. coli zawierający plazmid pCIB10/35Stb zdeponowano w American Type Culture Collection, nr ATCC 67329, 27 lutego 1987 roku. Częściowo wydeletowany gen protoksyny konstruuje się poprzez wprowadzenie miejsca rozpoznawanego przez restryktazę BamHI (GGATCC) po nukleotydzie 1976 w sekwencji genu BZ. Robi się to przez klonowanie fragmentu restrykcyjnego BamHI, zawierającego sekwencję protoksy pochodzącą z plazmidu pCIBlO 35Stb do mpl8 i stosując standardową procedurę mutagenezy oligonukleotydu. Po mutagenezie przygotowuje się dwuniciową replikacyjną formę DNA z klonu M13, którą trawi się następnie BamHI. Fragment o długości, w przybliżeniu, 1,9 kb zawierający częściowo wydeletowany gen protoksyny wbudowuje się do rozciętego restryktazą BamHI plazmidu pCIB 10 710. Powstały plazmid poddaje się selekcji na kanamycynę. Szczegółowy opis przygotowania zawiera zgłoszenie patentowe St. Zjedn. Ameryki nr 122 109, złożone 18 listopada 1987 roku.

162 317

Przykład XXII. Wytwarzanie plazmidu pCIB1233 (pCIB200 PR1-AHAS).

A. Ligacja z plazmidem pCIB200.

Plazmid pCIB200, a następnie pCIB1216 trawi się restryktazami KpnI i Xbal i poddaje elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania. Następnie wycina się prążek zawierający DNA o długości około 4,3 kb obejmujący 5'-końcowe sekwencje flankujące PR-1 poddane fuzji z sekwencją kodującą AH AS oraz prążek zawierający wektor pCIB200, miesza DNA i liguje tworząc plazmid pCIB1233

B. Wytwarzanie plazmidu pCIB1216.

Plazmid pCIB269 (przykład XIX A), a następnie pCIB1207 trawi się restryktazami Xbal Ncol i poddaje elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania. Następnie wycina się prążek zawierający wektor bluescript z 5'-końcowymi sekwencjami flankującymi PR-1 oraz prążek zawierający DNA o długości 3,3 kb obejmujący sekwencję kodującą AHAS, DNA miesza się i liguje tworząc plazmid pCIB1216.

C. Wytwarzanie plazmidu pCIB1207 zawierającego gen AHAS Arabidopsis.

Izoluje się całkowite DNA z 5-tygodniowych roślin Arabidopsis thaliana, ekotyp Kolumbia. 250//g tego DNA trawi się 4000 jednostek restryktazy Xbai przez 4 godziny. Produkty trawienia frakcjonuje się przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym. Fragment DNA o długości pomiędzy

6,5 kb i 4,36 kb (w oparciu o markery długości z trawionego restryktazą Hindlll DNA faga lambda) izoluje się z żelu używając błony NA-45 DEAE (Schleicher i Schuell, Keene, NH, USA) zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta. Preparat ramienia DNA faga ongC (longC) strawionego restryktazą Xbal i traktowanego fosfatazą otrzymano z Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA, USA). 0,1 pg wstawianego fragmentu restrykcyjnego Xbal DNA Arabidobsis liguje się z DNA ramion longC zgodnie z procedurą zalecaną przez Stratagene. 2,5 pl produkt ligacji upakowuje się w główkach faga lambda stosując zestaw Gigapack Plus (Stratagene Cloning Systems) zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta. Aktywność banku oznacza się na szczepie VCS257 E. coli (Stratagene Cloning Systems).

50pg DNA plazmidu pE16 8-c4 (J. Polarna, Carlsberg Res. Comm. 49, 577-584) trawi się restryktazą EcoRI i produkty trawienia poddaje się elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym. Fragment restrykcyjny EcoRI o długości 2 kb zawierający sekwencję genu AHAS drożdży izoluje się z żelu, stosując błonę NA45 DEAE zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta. Znakowane izotopem promieniotwórczym sondy na fragment o długości 2 kb syntetyzuje się w dniu reakcji hybrydyzacji z mieszaniną losowych primerów stosując zestaw Prime Time (International Biotechnologies Inc., New Haven, CT, USA) zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta.

250000 zrekombinowanych fagów wysiewa się na murawę szczepu VCS257. Następnie przenosi się fagi pochodzące z łysinek na błony, stosując błony Colony/PIaque Screen (NEW Research Products, Du Pont, Boston, MA, USA) zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta. DNA na błonach hybrydyzuje się wstępnie w buforze do hybrydyzacji LS, następnie przenosi do 150 ml świeżego buforu do hybrydyzacji LS zawierającego 0,25 pg sondy fenu AHAS drożdży znakowanej izotopem fosforu ³²P, przygotowanej jak opisano powyżej. Błony inkubuje się przez 16 godzin w temperaturze 42°C łagodnie wytrząsając, następnie przemywa dwukrotnie po 15 minutach, w temperaturze pokojowej dwukrotnie stężonym SSC, przemywa trzykrotnie po 2 godziny w temperaturze 42°C buforem do przemywania LS (25% amid kwasu mrówkowego, pięciokrotnie stężony SSC, 1 % SDS) i przemywa dwukrotnie po 30 minut buforem do przemywania (0,1-krotnie stężony SSC, 0,l%SDS). Błony wyjmuje się i poddaje fluorografii stosując Cronex Lightening PlusScreens (Du Pont, Wilmington, DE, USA) i film XAR-5 (Kodak). Wybiera się łysinki z regionów płytek, które dają dodatnie sygnały na błonie filmowej i replikuje fagi z nich pochodzące, replikuje się z niską gęstością - fagi z 300 łysinek na płytę o średnicy 15 cm. Replikację powtarza się az do wyizolowania pojedynczych hybrydyzujących klonów faga.

Preparatykę na małą skalę DNA fagowego z klonu oczyszczonego z łysinki przeprowadza się zgodnie z procedurą wykorzystującą zestaw LambdaSorb Phage Adsorbent (Promega, Madison, WI, USA). DNA fagowe tnie się restryktazą Xbal i wstawiony fragment o długości 5,8 kb klonuje się w miejscu Xbai plazmidu pBS(-) (Stratagene Clonig Systems). Identyczność sklonowanego fragmentu z fragmentem restrykcyjnym Xbal zawierającym gen AHAS Arabidopsis weryfikuje się przez porównanie jego mapy restrykcyjnej i sekwencji DNA z tymi publikacjami dla genu przez

162 317

Haughna i innych, Mol. Gen. 211, 266 (1988) i Mazura i innych, Plant Physiol, 85, 1110 (1987). Plazmid ten oznaczono jako pCIB1207.

Przykład XXIII. Wytwarzanie plazmidu pCIB1232 (pCIB200/PRl-AHAS-SuR).

A. Ligacja z plazmidem pCIB200.

Plazmidy pCIB200 (przykład XIX C) oraz pCIB1230 trawi się restryktazami KpnI i Xbal i poddaje elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania. Następnie wycina się prążek zawierający DNA o długości około 4,3 kb obejmujący 5'-końcowe sekwencje flankujące poddane fuzji z sekwencją kodującą AHAS-SuR oraz prążek zawierający wektor pCIB200, DNA miesza się i liguje tworząc plazmid pCIB1232.

B. Wytwarzanie plazmidu pCIB1230.

Plazmid pCIB1208 (patrz poniżej) trawi się restryktazami Xbal i Ncol i fragmenty rozdziela przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania wTAE. Plazmid pCIB269 (przykład XIX A) trawi się restryktazami Ncol i Xbal i poddaje elektroforezie jak opisano powyżej. Fragment plazmidu pCIB269 zawierający wektor bluescript i promotor genu PR-1 oraz fragment o długości 3,3 kb zawierający zmutowany gen AHAS [zidentyfikowany przez homologię krzyżową i analizę fragmentów restrykcyjnych z genem opisanym przez Mazura i innych, Plant Physiol. 85, 1110—1117 (1987)] wycina się, topi agarozę i liguje razem w celu stworzenia klonu oznaczonego jako pCIB1230.

C. Wytwarzanie plazmidu pCIB1208.

Bank DNA genomowego konstruuje się jak opisano w przykładzie XXII C, używając DNA wyizolowanego z roślin Arabidopsis wyselekcjonowanych na oporność na sulfonylomocznikowe środki chwastobójcze jak opisali Haughn i Somerville, Mol. Gen. Genet. 204, 430-434 (1986). Łysinki zawierające geny kodujące syntazę acetohydroksykwasów (AHAS) identyfikuje się przez hybrydyzację krzyżową z sondą genu syntazy acetohydroksykwasów drożdży (patrz .przykład XXII C). Zrekombinowane DNA subklonuje się Bluescript (Stratagene) tworząc klon oznaczony jako pCIB1208. Plazmid ten zawiera gen kodujący zmutowaną syntazę acetohydroksykwasów, która jest oporna na hamowanie przez sulfonylomocznikowe środki chwastobójcze.

Przykład XXIV. Izolowanie klonu genomowego kodującego zasadową formę /3-1,3glukanazy (endo-l,3-/3-glukozydazy glukanu) z Nicotiana tabaccum.

DNA o wysokiej masie cząsteczkowej otrzymuje się z liści Nicotiana tabacum cv. Havana 425 drogą procedury CETAB [Murray i Thompson, Nucleic Acid Res. 8, 4321 (1980)]. 100pg DNA trawi się całkowicie restryktazą Sacl. DNA to rozdziela się przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym. Region żelu odpowiadający zakresowi mas cząsteczkowych fragmentów od 3 do 7 kb tnie się na 6 skrawków równej wielkości i DNA tych skrawków poddaje się elektroelucji oraz wytrąca jako oddzielne frakcje. DNA zawiesza się ponownie i ilość z każdej frakcji poddaje elektroforezie na żelu agarozowym i analizuje techniką Southerna. Frakcje zawierające DNA, który hybrydyzuje z sondą cDNA /3-1,3-glukanazy [H. Shinshi i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5541-5545 (1988)] sumuje się i używa do konstruowania banku.

Wektor lambdaOngC zakupiony w Stratagene Corp. trawi się restryktazą Sacl. 1 pg tego DNA miesza się z 0,1 pg strawionego restryktazą Sacl DNA tytoniu i liguje DNA ligazą T4 zgodnie z zaleceniami producenta. Zligowany DNA upakowuje się następnie w cząsteczkach fagowych stosując procedury upakowania m vitro według Stratagene. Fagi wysiewa się z bakteriami jak sugerują opisy dotyczące faga lambda. Około 75 000 łysinek testowano stosując sondę cDNA /3-1,3-glukanazy znakowaną izotopem fosforu 3²P. Zidentyfikowano 11 dodatnich łysinek. Fagi zawarte w tych łysinkach oczyszcza się przez kolejne przesiewania i testowania.

Izoluje się DNA z oczyszczonych klonów i klony analizuje przez trawienie restrykcyjne ich DNA używając restryktaz HindUl, EcoRI i Sacl. Stwierdzono dwa typy klonów, jeden reprezentowany przez klon 39.1 i drugi reprezentowany przez klon 39.3. Wstawki o długości 4,5 i 4,7 kb w klonach, odpowiednio, 39.1 i 39.3. subklonuje się w strawionym restraktazą Sacl plazmidzie bluescript i izoluje subklony pBSGluc39.1 (fragment restrykcyjny Sacl otrzymany z klonu faga lambda 39.1) oraz pBSGluc39.3 (fragment restrykcyjny otrzymany z klonu faga lambda 39.3). Sekwencje DNA fragmentów restrykcyjnych zawartych w subklonach pBSGluc39.1 i pBSGluc39.3 określa się przez sekwencjonowanie DNA. Sekwencje przedstawiono na odpowiednio, fig. 43 i 44.

162 317

Znaleziono sekwencję kodującą i zlokalizowano dużą sekwencję wtrąconą w pobliżu końca 5' sekwencji kodującej.

Przykład XXV. Identyfikowanie miejsca początku transkrypcji genu/5-1,3-glukanazy.

A. Mapowanie wydłużonego primera.

Syntetyzuje się syntetyczny primer DNA komplementarny do zasad od 2399 do 2416 i używa go do doświadczeń wydłużania primera jak opisano w przykładzie V. RNA do tych doświadczeń izoluje się z tytoniu zainfekowanego Phytophora parasitica var. nicotiana. Produkty wydłużania primera poddaje się elektroforezie wraz ze standardami masy cząsteczkowej, w których znakowany primer stosuje się w reakcji sekwencjonowania DNA z użyciem didezoksynukleotydów z subklonem pBSGluc39.1 użytym jako wzorcem. Produkty wydłużania odpowiadające pozycjom 1433, 1446 i 1447 sekwencji /3-1,3-glukanazy 39.1, fig. 43, identyfikuje się po elektroforezie żelowej i autoradiografiijak opisano w przykładzie V. Ponieważ pomiędzy pozycjami 1554 i 2345 sekwencji pBSGluc39.1 znajduje się duży intron, uzyskany obraz mas cząsteczkowych może nie odzwierciedlać prawidłowo produktów wydłużania. Dlatego też przeprowadza się drugie doświadczenie mapowania wydłużonego primera przy użyciu primera komplementarnego do pozycji 1530 do 1547. Używając tego primera mapuje się trzy końce 5' mRNA glukanazy do miejsca A w pozycjach 1434, 1448 i 1449.

B. Mapowanie nukleazą SI.

Syntetyczny oligonukleotyd komplementarny do pozycji 1415 do 1504 syntetyzuje się w celu użycia jako sondy w mapowaniu nukleazą SI. Oligonukleotyd fosforyluje się przy końcu 5' używając ^P-ATP i kinazy polinukleotydowej T4 zgodnie z zaleceniami dostawcy. Po ekstrakcji fenolem i wytrącaniu etanolem znakowany oligonukleotyd zawiesza się ponownie w buforze do hybrydyzacji zawierającym amid kwasu mrówkowego (patrz przykład VI) w stężeniu około 2 nM. Zastosowany w tych doświadczeniach RNA izoluje się z tytoniu zainfekowanego Phytophthora parasitica jak opisano w poprzednim przykładzie. Mapowanie nukleazą SI przeprowadza się na tym RNA używając znakowany oligonukleotyd jak opisano w przykładzie VI. Po elektroforezie żelowej wykryto trzy prążki, które odpowiadają pozycjom 1434, 1448 i 1449 sekwencji DNA pBSGluc39.1. '

C. Określanie miejsca początku transkrypcji.

Obie procedury, mapowania wydłużonego primera i mapowania nukleazą SI, lokalizują końce 5' mRNA w pozycjach 1434, 1448 i 1449. Dlatego miejsca te, wszystkie będące resztkami adeniny, odpowiadają miejscu początku transkrypcji genu /5-1,3-glukanazy.

Przykład XXVI. Wytwarzanie plazmidu pBSGluc39.1/GUS. Oligonukleotydy o sekwencjach

A/ 5'-GTTTATGTGAGGTAGCCATGGTGGGAAGACTTGTTGGG-3'

B/ 5'-GATCGCGGTACCGAGCTCCTCTAGGGGGCCAAGG-3' syntetyzuje się, oczyszcza i używa w reakcji katalizowanej przez polimerazę (PRC) zgodnie ze wskazówkami dostawcy (Perkin Elmer Cetus, DNA thermal cycler i Perkin Elmer Cetus, GeneAmp Reagent Kit) do amplifikacji fragmentu DNA o długości 1494 bp z plazmidu pBSGluc39.1. Oligonukleotydy przeznaczone są do dodania miejsca restrykcyjnego KpnI bezpośrednio po stronie 5' miejsca restrykcyjnego SacI przy pierwszej parze zasad sekwencji glukanazy i do wytworzenia nowego miejsca restrykcyjnego Ncol przy 1462 parze zasad. DNA otrzymane po procedurze amplifikacji PCR ekstrahuje się fenolem/chloroformem i wytrąca etanolem. DNA zawiesza się ponownie i trawi zarówno restryktazą Ncol jak i KpnI i poddaje elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania. Prążek zawierający DNA o długości 1462 bp wycina się i używa w następnej ligacji. Plazmid pBS-GUS 12 (przykład XIX B) trawi się restryktazami Ncol i KpnI, poddaje elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym i wycina prążek zawierający wektor. Prążek zawierający wektor pBS-GUS 12 i prążek zawierający DNA o długości 1462 bp z reakcji PCR liguje się i używa do transformacji E. coli. Wybiera się dodatnie kolonie i testuje w kierunku posiadania wstawki DNA o długości 1462 bp. Plazmidy zawierające wstawki są przypuszczalnie klonami pBSGluc39.1/GUS, jednakże ze względu na stosunkowo dużą częstość mutacji przy tej procedurze (około 1/1000 zasad), kilka klonów zsekwencjonowano od początku do końca fragmentu o długości 1462 bp. Jeden z klonów posiadający oczekiwaną sekwencję wybrano jako klon pBSGluc39.1/GUS.

162 317

Przykład XXVII. Wytwarzanie plazmidu pSGluc39.3/GUS.

Oligonukleotydy o sekwencjach.

A/ 5'-GTTTATCTGAGGTAGCCATGGTGAGAAGACTTGTTGGA-3'

B/ 5'-GATCGCGGTACCGAGCTCCCTTGGGGGCAAG-3' syntetyzuje się, oczyszcza i używa w reakcji katalizowanej przez PCR do amplifikacji fragmentu DNA o długości 1677 bp z plazmidu pBSGIuc39.3. Oligonukleotydy przeznaczone są do wprowadzenia nowego miejsca restrykcyjnego KpnI bezpośrednio przylegającego do miejsca restrykcyjnego Sacl w pozycji pierwszej sekwencji glukanazy 39.3 i nowego miejsca restrykcyjnego w pozycji 164.5. DNA otrzymane po amplifikacji PCR ekstrahuje się fcnolem/chloroformem, wytrąca etanolem, ponownie zawiesza, trawi obiema restryktazami - Ncol i KpnI i poddaje elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania. Prążek zawierający DNA o długości 1646 bp wycina się i używa w następnej ligacji. Plazmid pBS-GUS1.2 trawi się restryktazami Ncol I i KpnI i poddaje elektroforezie jak opisano powyżej. Wycina się prążek zawierający wektor, miesza z prążkiem zawierającym DNA o długości 1646 bp z reakcji PCR i liguje tworząc plazmid pBSGluc39.3/GUS. Jak uprzednio izoluje się i sekwencjonuje kilka przepuszczalnie dodatnich plazmidów. Jeden z plazmidów o oczekiwanej sekwencji wybrano jako plazmid pBSG!uc39.3/GUS.

Przykład XXVIII. Wytwarzanie plazmidów pCIB200/Gluc39.1-GUS i pCIB200/Gluc

39.3- GUS.

A. Plazmidy pCIB200 (przykład XIX C) i pBSGluc39.1/GUS (przykład XXVI) trawi się restryktazami KpnI i Xbal i poddaje elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania. Prążek zawierający wektor pCIB200 i prążek zawierający fragment restrykcyjny Kpnl-Xbal obejmujący 5' -końcowe sekwencje flankujące genu glukanazy poddaje fuzji z genem GUS wycina się i liguje DNA tworząc plazmid pCIB200/Gluc39.1-GUS.

B. Podobnie, plazmid pBSGluc39.3/GUS (przykład XXVII) trawi się i liguje ze strawionym plazmidem pCIB200 tworząc plazmid pCIB2OO/Gluc39.3-GUS.

Przykład XIX. Wytwarzanie plazmidów pCIB200/Gluc39.1-BT i pCIB200/Gluc39.3-BT.

A. PCIB200/Gluc39.1-BT.

Plazmidy pBSGluc39.1/GUS i pCIB1004 (przykład ΧΧΙ/Β) trawi się restryktazami KpnI i Ncol i poddaje elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania. Plazmid pCIB200 (przykład XIXC) trawi się restryktazą KpnI.defosforyluje używając fosfatazy zasadowej pochodzącej z jelita cielęcego i poddaje elektroforezie jak opisano powyżej. Prążek zawierający wektor pCIB200, prążek zawierający 5' -końcowy region flankujący genu glukanazy i prążek zawierający gen BT wycina się, miesza razem i liguje DNA tworząc plazmid pCIB200/Gluc39.3-BT.

Podobnie, plazmid pBSGluc39.3/GUS trawi się i liguje ze strawionymi plazmidami pCIB 1004 i pCIB200 tworząc plazmid pCIB200/Gluc39.3-BT.

Przykład XXX. Wytwarzanie plazmidów pCIB200/GIuc39.1-AHAS i pCIB2(M)/Gluc

39.3- AHAS.

A. Ligacja z plazmidem pCIB200.

Plazmidy pBSGłuc39.1/AHAS i pCIB200 (przykład XIX C) trawi się restryktazami KpnI i Xbal i poddaje elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania. Prążek zawierający fuzję glukanaza/AHAS i prążek zawierający wektor ekspresyjny pCIB200 wycina się, miesza i liguje DNA tworząc plazmid pCIB200/Gluc39.1-AHAS.

Podobnie, plazmid pBSGluc39.3/AHAS trawi się i liguje ze strawionym plazmidem pCIB200 tworząc plazmid pCIB200/Gluc39.3-AHAS.

B. Wytwarzanie plazmidów pBSGluc39.1/AHAS i pBSGIuc39.3/AHAS.

Plazmidy pBSGluc39. 1/GuS (przykład XXV) i pCIB 1207 (przykład XXIIC) trawi się restryktazami Ncol I i Xbał i poddaje elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania. Prążek zawierający 5'-końcowe sekwencje flankujące glukanazy i wektor, oraz prążek zawierający sekwencję kodującą AHAS wycina się, miesza i liguje DNA tworząc plazmid pBSGluc39.1/AHAS.

Podobnie, plazmid pBSGluc39.3/GUS (przykład XXVII) trawi się i liguje ze strawionym plazmidem pCIB 1207 tworząc plazmid pBSGluc39.3/AHAS.

162 317 41

Przykład XXXI. Wytwarzanie plazmidów pCIB200/Gluc39.1-AHAS-SuR i pCIB200/Gluc39.3-AHAS-SuR.

A. Ligacja z plazmidem pCIB200.

Plazmidy pBSGluc39.1/AHAS-SuR i pCIB200 (przykład XIX C) trawi się restryktazami KpnI i Xbal i poddaje elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym o niskiej tempertaurze żelowania. Prążek zawierający fuzję glukanaza/AH AS-SuR i prążek zawierający wektor ekspresyjny pCIB200 wycina się, miesza i liguje DNA tworząc plazmid pCIB200/Gluc39.1-AHAS-SuR.

Podobnie, plazmid pBSGluc39.3/AHAS-SuR trawi się i liguje ze strawionym plazmidem pCIB200 tworząc plazmid pCIB200/Gluc39.1-AGAS-SuR.

B. Wytwarzanie plazmidów pBSGluc39.1/AHAS-SuR i pBSGluc39.3/AHAS-SuR.

Plazmidy pBSG1uc39. 1/GUS (przykład XXVI) i pBSG1uc39.3/GUS (przykład XXVII) trawi się restryktazami Ncol i Xbal, a następnie fragmenty restrykcyjne rozdziela się na 0,8% żelu, a agarozowym o niskiej temperaturze żelowania w TAE. Plazmid pCIB1208 (przykład XXIIIC) trawi się restryktazami Xbal i Ncol i fragment o długości 3,3 kb zawierający zmutowany gen AHAS (oporny na sulfonylomocznikowe środki chwastobójcze, SuR) izoluje się przez elektroforezę na żelu agarozowym. Fragmenty zawierające promotor genu glukuronidazy i wektor pBS wycina się, topi agarozę i liguje DNA z fragmentem AHAS w celu skonstruowania klonów oznaczonych odpowiednio pBSGluc39.1/AHAS-SuR i pBSGluc39.3/AHAS-SuR.

4. Identyfikacja nowych genów.

Następujące przykłady opisują izolowanie i charakteryzację pozostałych nowych genów białka PR.

Przykład XXXII. Izolowanie innych klonów genomowych i cDNA.

A. Izolowanie klonu genomowego kodującego PR-1'.

Konstruuje się bankgenomowy i testuje z sondą cDNA PR-1 jak opisano w przykładzie XI. Po przetestowaniu, izoluje się odpowiedni klon oznaczając go lambdatobchrPR 1019. Następnie ustala się wstępnie mapę restrykcyjną. Fragment restrykcyjny Ciał subklonuje się w wektorze bluescript i następnie ustala mapę restrykcyjną plazmidu pBS-PR1019Cla. Duży fragment restrykcyjny Xhol deletuje się z tego plazmidu otrzymując plazmid pBS-PR1019Cla Xho. Plazmid ten zawiera fragment DNA tytoniu o długości 2,7 kb obejmujący gen PR1019. Plazmid ten deletuje się częściowo i serie delecji używa się do sekwencjonowania DNA.

Figura 40 przedstawia około 21(X)bp tego genu. Białko kodowane przez PR1019 jest jak stwierdzono w około 65% homologiczne z PR-la, PR-1 b lub PR-1 c, dlatego nazwano ten nowy gen PR-1'.

B. Izolowanie klonu cDNA kodującego chitynazę ogórka.

Chitanazy indukowane przez patogeny izoluje się z zainfekowanych liści ogórka jak opisano [J. P. Metraux i inni, Physiological and Molecular Plant Pathology, 33, 1-9 (1988)]. Z tego homogennego preparatu białkowego wytwarza się peptydy zasadniczo metodami powszechnie znanymi i jak opisano w przykładach IX i X. Wybiera się dwa regiony białka i syntetyzuje sondy oligonukleotydowe komplementarne do wszystkich możliwych wariantów matrycowych RNA zdolnego do kodowania tych białek. Sekwencjami tymi są:

AT A

Sonda 1: 5'-CCATTTCTGNCCCCAGTA-3'

G G G G C

Sonda 2: 5'-GGATTATTATAAAATTGNACCCA-3'

Liście ogórka infekuje się Tabacco Necrosis Virus (TNV) i 5 dni po infekcji izoluje się RNA, jak opisano w przykładzie V. Poliadenylowane RNA izoluje się standardowymi technikami i konstruuje bank cDNA w wektorze lambda Zap(Stratagene) zasadniczo jak opisali U. Gubleri B. J. Hoffman, Gene 25,263 (1983). 300 000 łysinek z wysianych płytek przenosi się na błony i testuje stosując jako sondę znakowaną izotopem fosforu P mieszaninę oligonukleotydów 1 (sonda 1) albo mieszaninę 2 (sonda 2). Izoluje się łysinki wykazujące dodatni wynik podczas testowania z którąkolwiek z sond. Izolowanie fagów i automatyczne wycinanie przeprowadza się jak opisano w opisie laboratoryjnym Stratagene Lambda Zap.

Jednocześnie, klony cDNA chitazyny izoluje się w wektorze bluescript i sekwencjonuje metodą didezoksynukleotydów. Sekwencję genu chitazyny przedstawia fig. 41.

162 317

C. izolowanie klonu cDNA kodującego główną formę PR-R.

Liście Nicotiana tabaccum cv Xanthi-nc infekuje się wirusem mozaiki tytoniu i zbiera 5 dni po infekcji. Całkowite RNA preparuje się jak opisano w przykładzie V i izoluje poliadenylowane RNA używając standardowych technik. Bank cDNA konstruuje się używając tego poliadenylowanego RNA w wektorze Lambda ongC (Stratagene). Około 300000 łysinek testuje się stosując sondę oligonukleotydową o sekwencji

5'-GAACTTCCTAAAAGCTTCCCCTTTTATGCC-3'

Fagi z dodatnich łysinek oczyszcza się standardowymi technikami i preparuje fagowe DNA. Fragment rekombinowanego faga zawierający cDNA subklonuje się w plazmidzie bluescnpt. Określa się sekwencję tego cDNA. Sekwencję jednego klonu, kodującego główną formę PR-R (W.

S. Pierpoint i inni, Physiol. Plant Pathol. 31, 291 (1987)] przedstawia fig;. 42. Białko przez niego kodowane posiada bardzo silną homologię do znanego inhibitora trypsyny / σ-amylazy wyizolowanego z kukurydzy [M. Trichardson i inni, Naturę 327, 432 (1987)]. Sklonowane białko PR-R może być inhibitorem albo proteaz albo σ-amylaz i w ten sposób nadawać roślinom w których ulega ekspresji transgenicznej aktywności owadobójczą, wirusobójczą lub grzybobójczą.

D. Izolowanie cDNA kodującego PR-Q.

Liście Nicotiana tabaccum cv Xanthi-nc infekuje się wirusem mozaiki tytoniu i zbiera 5 dni po infekcji. Całkowite RNA preparuje się jak opisano w przykładzie V imizoluje poliadenylowane RNA używając standardowych technik. Bank cDNA konstruuje się używając tego poliadenylowanego RNA w wektorze lambda ongC (Stratagene). Około 300000 łysinek testuje się używając znakowanej sondy cDNA kodującej gen zasadowej chitazyny tytoniu i przemywając sączki w roztworze o składzie: 0,125 mM NaCI, 1% SDS, 40 mM fosforan sodowy (pH 7,2), 1 mM EDTA, w temperaturze 50°C. Oczyszcza się fagi z 24 dodatnich łysinek i określa sekwencję DNA klonu nazwanego pBSchtl5. Sekwencję tą przedstawia fig. 45.

Białko PR-Q oczyszcza się częściowo z płynu wewnętrzkomórkwoego liści tytoniu zainfekowanych TMV jak opisano w przykładzie VIII. Frakcje po chromatografii na żelu Ultragel ACA54 zawierające białko PR-O, PR-R, PR-Q i PR-R zbiera się i zatęża przez liofilizację. Dalej białka oczyszcza się przez elektroforezę na żelu poliakrylamidowym. Wycina się prążek białkowy zawierający PR-Q i białko eluuje zgodnie z Applied Biosystems User Biulletin nr 36, 21 marzec, 1988. Białko trawi się aminopeptydazą piroglutaminianu i sekwencjonuje metodą automatycznej degradacji Edmana jak opisano w przykładzie IX. Określono sekwencję N-końca PR-Q (Xxx aminokwas niepewny):

GlnGlyIleGlySerIleValThrXxxAspLeuPheAsnGluMetLeu

Białko kodowane przez klon o sekwencji przedstawionej na fig. 45 określono jako związane z patogenezą białka Q na podstawie: 1/ ograniczonej homologii strukturalnej do zasadowej chitazyny tytoniu 2/ identyczności z N-końcową sekwencją białka PR-Q określoną przez jego sekwencjonowanie.

E. Izolowanie cDNA kodującego kwasową formę J-l,3-glukanazy.

Około 300 000 łysinek z banku cDNA opisanego w przykładzie XXXIID (powyżej) testuje się stosując znakowaną sondę cDNA kodującą zasadową formę /3-1,3-glukanazy (H. Shinshi i inni, j. w.) i przemywa sączki roztworem o składzie: 0,125 M NaCI, 1% SDS, 40 mM fosforan sodowy (pH 7,2), 1 mM EDTA, w temperaturze 50°C. Izoluje się 20 dodatnich łysinek i wstawkę subklonuje się w plazmidzie bluescript. Częściowe sekwencjonowanie DNA wykazało, że klony 5 i 6 kodują identyczne cDNA, które mają 55% homologii ze znaną sekwencją DNA zasadowej formy/1-1,3glukanazy. Określa się sekwencję cDNA klonów 5 i 6; sekwencję tą przedstawia fig. 46. Wniosek, że cDNA ten koduje kwasową formę β-1,3-glukanazy wyciąga się w oparciu o ograniczoną homologię sekwencji aminokwasów i bardziej kwasowy punkt izoelektryczny kodowanego białka.

F. Izolowanie klonu genomowego kodującego gen chitynazy ogórka.

Izoluje się jądra komórkowe z Cucumis sativus cv. Long Marketer i izoluje DNA jak opisano w przykładzie XI. 3 pg tego DNA trawi się albo restryktazami EcoRV, EcoRI, BamHI lub H ind 111 i rozdziela fragmenty restrykcyjne na 0,5% żelu agarozowym. Analiza przeprowadzana techniką Southern'a z użyciem jako sondy cDNA chitazyny ogórka (fig. 41) wykazała w DNA strawionym EcoRI obecność pojedynczego prążka odpowiadającego fragmentowi o długości 12 kb. Dlatego też

162 317 43 zdecydowano się na izolowanie genu chitynazy ogórka używając wszystkich fragmentów DNA powstałych po trawieniu EcoRI i IIgując z wektorem Lambda typu „z zastąpieniem.

10pg DNA wyizolowanego jak opisano powyżej trawi się całkowicie używając restryktazy EcoRI. DNA ten ekstrahuje się następnie fenolem, wytrąca etanolem i liguje w miejscu restrykcyjnym EcoRI EMBL 4. Około 100000 łysinek testuje się ze znakowaną sondą cDNA chitynazy ogórka (fig. 41). Wybiera się 10 dodatnich łysinek, fagi z nich pochodzące oczyszcza się i analizuje wstawkę DNA przez wstępne mapowanie trawieniem restrykcyjnym. Dla wszystkich klonów uzyskano takie same wyniki i dlatego wybrano jeden do dalszej analizy. Wstawkę o długości 12 kb tego klonu subklonuje się następnie w plazmidzie bluescript otrzymując plazmid pBScucchi/chitinase. Ustala się mapę restrykcyjną dla tego sklonowanego DNA, subklonuje fragmenty i określa sekwencję DNA.

G. Izolowanie klonu genomowego kodującego kwasową /3-1,3-glukanazę.

Bank genomowy konstruuje się jak opisano w przykładzie XI i testuje klonem cDNA kwasowej /51,3-glukanazy, przykład XXXII E. Izoluje się klon lambda i jego fragment restrykcyjny EcoRI o długości 1 kb subklonuje się w Bluescript jak opisano powyżej w przykładzie XXXII A. Klon bluescript nazwano pBSGLóe.

5. Stabilna transformacja i regeneracja roślin.

Tkankę roślinną transformuje się wektorami opisanymi powyżej każdą z powszechnie znanych metod. Takie metody stosowane do przenoszenia DNA do komórek roślinnych obejmują np. bezpośrednie infekowanie roślin, tkanki roślinnej lub komórek bądź też ich wspólne hodowanie z A. tumefaciens [R. B. Horsch, i inni, Science 225,1229(1985). L. Marton, Celi Cultureand Somatic Celi Genetics of Plants, tom 1, 514-521, 1984], traktowanie protoplastów egzogennym DNA metodami takimi jak opisane w następujących publikacjach: J. Paszkowski i inni, EMBO J. 3,2717 (1984), europejskie zgłoszenie patentowe nrO 164 575, R. D. Shillito i inni,Bio/Technology 3,1099 (1985), I. Potrykus i inni,j. w., H. Loerzi inni, Mol. Gen. Genet. 199,178 (1985), M. Fromm i inni, j.w. brytyjski opis patentowy nr 2 140822 i I. Negrutiu i inni, Plant Mol. Biol. 8, 363 (1987), inkubację z glikolem polietylenowym (PEG) (I. Negrutiu i inni, j. w.), mikroiniekcję [T. J. Reich i inni, Bio/technology 4, 1001-1004 (1986), T. J. Reich i inni, Can J. Bot, 64, 1259-1267 (1986)], techniką „bombardowania mikropociskami [T. M. Klein i inni, Naturę 327, 70, (1987)].

Przykład XXXIII. Transformacja Agrobacterium.

DNA plazmidów pCIB270 (przykład XXVI), pCIB271, pCIB272 i pCIB273 (przykłady XIX D, E i F) oczyszcza się gradientowo za pomocą układu chlorek cezu/bromek 2,7-dwuamino-9fenyli^-K^-e^tt^lt^ft^r^^i^^^ydyniowy i używa się do transformowania szczepu A136 A. tumefaciens zawierającego plazmid pomocniczy pCIB542, według procedury M. Holstersa i innych, Mol. Gen. Genet. 163, 181-187 (1978), otrzymując szczepy CIB270, CIB271, CIB272, CIB273.

Stosując tę samą procedurę, plazmidami pCIB271, pCIB272 i pCIB273 transformuje się wlrulertre szczepy P. tumefaciens - 151955, A208, A281 i szczep A-4 A. rhizogenes, tworząc szczepy oznaczone jako pCIB271 X 15955, pCIB271 X A208, pCIB271 X A281, pCIB271 X A4, pCIB272 X 15955, pCIB272 X A208, pCIB272 X A281, pCIB272 X A4, pCIB273 X 15955, pCIB273 χ A208, pCIB273 X A281 i pCIB273 X A4.

Szczep pCIB542 Agrobacterium jest szczepem EHA101 [Hood i inni, J. Bacteriol. 168, 1291-1301 (1986)], w którym marker selekcyjny - gen oporności na kanamycynę plazmidu zastąpiono częściową Tn7 - genem oporności spektynomycynę/streptomycynę.

Przykład XXXIV. Transformacja krążków z liści tytoniu.

Szczepy CIB270, CIB271, CIB272 i CIB273 Agrobacterium hoduje się przez 18-24 godzin na pożywce zawierającej sole glutaminy, o pH doprowadzonym do wartości 5,6, uzupełnionej o 0,15% manmtol, 50pg/ml kanamycyny, 50//g/ml spektynomycyny i 1 mg/ml streptynomycyny, przed jej rozcieńczeniem, tą samą pożywką nie zawierającą antybiotyków, do wartości Οϋβοο równej 0,2. Bakterie wzrastające następnie przez 3-5 godzin przed rozcieńczeniem do wartości ODeoo równej 0,2-0,4 w celu inokulacji krążków o średnicy 5-7 mm wyciętych z liści Nicotiana tabacum cv. Xanthi, które hodowano jałowo w pojemnikach GA7 według zmodyfikowanej metody R. Hoscha i innych, Science 227, 1229-1232 (1985).

Krążki liści utrzymuje się na 0,7% agarze zawierającym sole makro- i mikroelementów Murashiego i Skoog'a (MS), 1 mg/ml benzyloadeniny i 1 mg/ml kwasu ff-naftalenooctowego,

162 317 przez dwa dni przed przeniesieniem do tej samej pożywki zawierającej 50pg/ml kanamycyny, 100pg/ml karbemcyliny i 100pg/ml mefoxim. Tworzące się na krążkach odroślą wycina się i rozmnaża, do otrzymania sześciu sadzonek, hodując końce odrośli na pożywce MS zawierającej 50pg/mI kanamycyny w pojemnikach GA7.

Sadzonki ukorzenia się w podłożu nie zawierającym żadnych hormonów, a zawierającym 50pg/ml kanamycyny, przenosi do gleby i hartuje w fitotronie przed przeniesieniem do cieplarni w celu indukcji regulatorami chemicznymi. W okresie kwitnienia indukuje się samozapylanie kwiatów Po dojrzeniu zbiera się nasiona.

Doświadczenia z indukcją opisano w przykładach LXIII i LXVI, a ich wyniki podano w tabeli 2.

Przykład XXXV. Wytwarzanie transgenicznej tkanki kallusa i roślin tytoniu.

Szczep pCIB270 lub pCIB271 Agrobactenum używa się do transformacji kallusa tworzącego się z krążków liści (przykład XXXIV). Kallus tworzący się na podłożu selekcyjnym MSBN zawierającym kanamycynę utrzymuje się na podłożu wzrostowym dla kallusa złożonym z soli makro- i mikroelementów MS, Fe-EDTA (Gibco nr 500-1117, 4,3 g/1), witamin MS, 100mg/l mioinozytolu, 20 g/1 sacharozy, 2mg/l kwasu naftalenooctowego i 0,3mg/l kinetyny.

Kallus może zostać użyty do regenerowania roślin transgenicznych przez przeniesienie kawałków kallusa do podłoża MSBN używając metod opisanych w przykładzie XXXIV. Kallus używany jest także do pomiarów indukcji genów następującej do zastosowania substancji chemicznych i do testowania substancji chemicznych indukujących geny.

Przykład XXXVI. Transformacja marchwi.

Szczepy CIB270, CIB271, CIB272, CIB273, pCIB271 X 15955, pCIB271 X A208, pCIB271 X A281, pCIB271 X A4, pCIB272 X 15955, pCIB272 X A208, pCIB272 X A281, pCIB272 X A4, pCIB273 X 15955, pCIB273 X A208, pCIB273 X A281i pCIB273 X A4 Agrobacterium hoduje się jak opisano w przykładzie XXXIV. Bakterie rozcieńczone do wartości ODeoo równej 0,2-0,4 używa się następnie do inokulacji krążków odcinanych z sterylizowanej powierzchniowo marchewki.

W celu sterylizacji powierzchni marchew obiera się i następnie moczy przez 20 minut w 10% roztworze chloroxu. Marchew przemywa się jałową wodą, kroi na 5 mm kawałki i umieszcza podstawową stroną ku górze na podłożu agarowym z wodą. Następnie nanosi się 20-50μΙ bakterii na górną powierzchnię krążków. Po 7 dniach krążki przenosi się na 0,7% podłoże agarowe zawierające sole MS, 3% sacharozę, 0,1 mg/1 2,4-D, 50pl/ml kanamycyny, 1(X)pg/ml karbenicyliny i 100pg/ml mefoxm. Tworzący się wokół pierścienia kambium kallus wycina się i umieszcza na 0,7% agarze MS uzupełnionym o 3% sacharozę, 0,1 mg/ml 2,4-D, 50pg/ml kanamycyny, 100pg/ml karbenicyliny i 100pg/mI mefoxin. Po wyrośnięciu kallusa tnie się go na małe kawałki i losowo rozkłada na czterech płytkach z tym samym podłożem. Gdy kallus ten wypełni płytki, 3 z nich opryskuje się wodą, 50 mM salicylanem sodowym, pH 5,6, lub estrem metylowym kwasu benzo-1,2,3--iadiazokarboksylowego-7 o stężeniu 250pg/l w celu indukcji ekspresji genu chimerycznego PR-la/GUS.

Doświadczenia z indukcją i ich wyniki opisano w przykładach LXVIII i LXVI.

Przykład XXXVII. Transformacja słonecznika.

Szczepy CIB270, CIB271, CIB272, CIB273, pCIB271 X 15955, pCIB271 X A208, pCIB271 X A281, pCIB271 X A4, pCIB272 X 15955, pCIB272 X A208, pCIB272 X A281, pCIB272 X A4, pCIB273 X 15955, pCIB273 X A208, pCIB273 X A281, i pCIB273 X A4 Agrobacterium hoduje się jak opisano w przykładzie XXXIV. Bakterie rozcieńczone do wartości ODeoo równej 0,2-0,4 używa się następnie do inokulacji łodyg sadzonek słonecznika przygotowanych jak następuje:

Nasiona słonecznika moczy się przez 10 minut w 10% roztworze kaptanu, następnie przez 10 minut w 10% roztworze chloroxu i przemywa jałową wodą. Usuwa się łupiny z nasion i nasiona utrzymuje się na 0,7% podłożu agarowym z wodą przez 3 dni w obecności by wykiełkowały po czym umieszcza się je w inkubatorze w temperaturze 23°C stosując 12-godzinny fotoperiod (dzień i noc po 12 godzin). Siewki hoduje się przez tydzień, przed dekapitację i inokulacją bakterii na powierzchni ciętej łodygi.

Po tygodniu łodygi zainkulowane szczepami CIB270, CIB271, CIB272 tnie się i umieszcza na 0,7% podłożu agarowym zawierającym sole MS, 3% sacharozę, 2 mg/ml kwasu σ-naftaleno162 317 octowego, 1 mg/ml 6-benzyloaminopuryny, 100pg/ml karbenicyliny, 100pg/ml mefoxim i 50pg/ml kanamycyny. Łodygi zainkulowane szczepami pCIB271 X 15955, pCIB271 X A208, pCIB271X A281, pCIB271 X A4, pCIB272 X 15955, pCIB272 X A208, pCIB272 X A281, pCIB272 X A4, pCIB273 X 15955, pCIB273 X A208, pCIB273 X A281i pCIB273 X A4 tnie się i umieszcza na 0,7% agarze zawierającym sole MS, 3% sacharozę, 100pg/ml karbenicyliny i 100pg/ml medoxin. Kallus przenosi się na świeże podłoże co 2 tygodnie dopóki nie otrzyma się tkanki w ilości wystarczającej na 4 płytki. Połowę kallusa rosnącego z tkanki zainfekowanej wirulentnymi szczepami Agrobacterium przenosi się na podłoża bez hormonów zawierające 50pg/ml kanamycyny Po uzyskaniu wystarczającej ilości kallusa w obecności lub nieobecności kanamycyny, traktuje się go w celu indukcji genu, jak opisano powyżej dla transformowanego kallusa marchewki.

Przykład XXXVIII. Transformacja pomidora

Szczepy CIB270, CIB271, CIB272, CIB273, pCIB271 X 15955, pCIB271 X A208, pCIB271 X A281, pCIB271 X A4, pCIB272 X 15955, pCIB272 X A208, pCIB272 X A281, pCIB272 X A4, pCIB273 X 15955, pCIB273 X A208, pCIB273 X A281 i pCIB273 X A4 Agrobacterium hodowano jak opisano w przykładzie XXXIV. Bakterie rozcieńczone do wartości ODeoo równej 0,2-0,4 używano następnie do mokulacji łodyg siewek pomidora przygotowanych jak następuje:

Nasiona pomidorów moczy się przez 20 minut w 10% roztworze chlorox i płucze jałową wodą. Następnie nasiona otrzymuje się na 0,7% podłożu agarowym z wodą w ciemności przez 3 dni by wykielkowały, po czym umieszcza saę je w inkubatorze w temperaturze 23°C stosując 12-godzinny fotoperiod. Siewki hoduje się przez tydzień przed dekapitacją i inkubacją bakterii na przeciętnej powierzchni łodygi. Po tygodniu łodygi zainokulowane szczepami CIB270, CIB271, CIB272 lub CIB273 tnie się i umieszcza na 0,7% podłożu agarowym zawierającym sole MS, 3% sacharozę, 2 mg/ml kwasu σ-naftalenooctowego, 1 mg/ml 6-benzyloaminopuryny, 100pg/ml karbenicyliny. 100pg/ml mefoxin i 50pg/ml kanamycyny. Łodygi zainokulowane szczepami pCIB271 X 15955, pCIB271 X A208, pCIB271X A281, pCIB271 X A4, pCIB272 X 15955, pCIB272 X A208, pCIB272 X A281, pCIB272 X A4, pCIB273 X 15955, pCIB273 X A208, pCIB273 X A281 i pCIB273 X A4 tnie się i umieszcza na 0,7% podłożu agarowym zawierającym sole MS, 3% sacharozę, 100/ig/ml karbenicyliny i 100/rg/ml mefoxin. Kallus przenosi się na świeże podłoże co 2 tygodnie dopóki nie otrzyma się tkanki w ilości wystarczającej na 4 płytki. Połowę kallusa rosnącego z tkanki zainfekowanej wirulentnymi szczepami Agrobacterium przenosi się na podłoża bez hormonów zawierające 50pg/ml kanamycyny. Po uzyskaniu wystarczającej ilości tkanki kallusa w obecności lub nieobecności kanamycyny, traktuje się go w celu indukcji genu, jak opisano powyżej dla transformowanego kallusa marchewki.

Przykład XXXIX. Transformacja bawełny.

Szczepy pCIB271 X 15955, pCIB271 X A208, pCIB271 X A281, pCIB271 X A4, pCIB272 X 15955, pCIB272 X A208, pCIB272 X A281, pCIB X A4, pCIB273 X 15955, pCIB273 X A208, pCIB273 X A281 i pCIB273 X A3 hoduje się jak opisano w przykładzie XXXIV. Bakterie rozcieńczone do wartości OD«» równej 0,2-0,4 używa się następnie do inokulacji liścieni bawełny przygotowanych jak następuje:

Nasiona bawełny moczy się przez 20 minut w 10% roztworze chlorox i płucze jałową wodą. Nasiona utrzymuje się na 0,7% podłożu agarowym w ciemności by wykielkowały. Siewki hoduje się przez tydzień przed inokulacją bakterii na powierzchni liścieni.

Zainkulowane liścienie pozostawia się do momentu wytworzenia kallusa, następnie tnie się je i umieszcza na 0,7% podłożu agarowym zawierającym sole MS, 3% sacharozę, 100/fg/ml karbenicyliny i 100pg/ml mefoxin. Kallus przenosi się na świeże podłoże co 2 tygodnie dopóki nie otrzyma się tkanki w ilości wystarczającej na 4 płytki. Połowę kallusa rosnącego z tkanki zainfekowanej wirulentnymi szczepami Agrobacterium przenosi się na podłoża bez hormonów zawierające 50//g/ml kanamycyny. Po uzyskaniu wystarczającej ilości tkanki kallusa w obecności lub nieobecności kanamycyny, traktuje się go w celu indukcji genu, jak opisano powyżej dla transformowanego kallusa marchewki.

Przykład XL. Wytwarzanie specjalnego typu kallusa z Zea mays, wyselekcjonowanej linii wsobnej Funk 2717.

Rośliny Zea mays z linii wsobnej Funk 2717 hoduje się do zakwitnięcia i samozapylenia w cieplarni. Niedojrzałe kolby, zawierające zarodki o długości 2-2,5 mm, usuwa się z roślin i steryli46

162 317 zuje w 10% roztworze Cloroxu przez 20 minut. Zarodki usuwa się jałowo z ziaren i umieszcza osią zarodka do dołu na podłożu ONS zawierającym 0,1 mg/litr 2,4-D, 6% (w/o) sacharozę i 25 mM L-prolinę, zestalonym 0,24% (w/o) Gelrite” (podłoże wstępne). (Skrót w/w wskazuje, ze są to procenty wagowo/objętościowe). Po 2-tygodniowej hodowli w ciemności w temperaturze 27°C, rozwijający się na tarczce kallus usuwa się z zarodka i umieszcza na podłożu BS [O. L. Gamborg, i inni. Expemmental Celi Research 50, 151 — 158 (1968)] zawierającym 0,5 mg/litr 2,4-D, zestalonym 0,24% (w/o) Gerlite. Kallus przenosi się co 2 tygodnie na świeże podłoże. Po całkowitym okresie 8 tygodni od umieszczenia zarodków na podłożu wstępnym, identyfikuje się na podstawie charakterystycznej morfologii specjalny typ kallusa. Kallus ten hoduje się dalej na tym samym podłożu. Po okresie następnych 2 miesięcy przenosi się kallus na podłoże N6 zawierające 2 mg/litr 2,4-D zestalone Gelrite i w sposób ciągły hoduje na nim.

Przykład XLI. Wytwarzanie zawiesiny hodowli Zea mays, wyselekcjonowanej linii wsobnej Funk 2717.

Kallus opisany w przykładzie XL hoduje się przez co najmniej 6 miesięcy. Typ kallusa wybrany do hodowania jest stosunkowo mało śluzowaty, ziarnisty i bardzo drobny tak, że rozdzielony jest na małe oddzielne agregaty komórek po umieszczeniu w podłożu płynnym. Nie otrzymuje się hodowli zawierających agregaty z dużymi, rozrośniętymi komórkami. W przybliżeniu, podwielokrotne ilości 500 mg specjalnego typu kallusa Zea mays wyselekcjonowanej linii wsobnej Funk 2717 umieszcza się w 30 ml podłożaN6 zawierającego 2 mg/litr 2,4-D w 125 ml kolbach Delonga. Po upływie jednego tygodnia hodowli prowadzonej w temperaturze 26°C, w ciemności, na wytrząsarce obrotowej (130 rpm, wychylenie 2,5 cm) wymienia się podłoże na świeże. Zawiesiny hoduje się w ten sposób przez następny tydzień. W tym czasie kontroluje się kultury zatrzymując te, które nie zawierają dużych ilości rozrośniętych komórek i jednocześnie eliminując te, które zawierają agregaty takich komórek Korzystna tkanka składa się ze zbitych agregatów dzielących się komórek mających charakterystycznie gładszą powierzchnię w porównaniu ze zwykłym typem agregatów komórek. Zachowane kultury posiadały co najmniej 50% komórek występujących w tych małych agregatach. Jest to pożądana cecha morfologiczna. Zawiesiny te charakteiyzowały się także szybkim tempem wzrostu, z czasem podwajania krótszym niż jeden tydzień. Cotygodniowo zawiesinę hodowli pasażowano przez przeniesienie 0,5 ml PCV (objętość upakowanych komórek = objętości komórek osadzonych w pipecie) do 25 ml świeżego podłoża. Po 4-6 tygodniach takiego pasażowania, hodowle zwiększały się 2-3 razy na prowadzoną przez tydzień hodowlę. Do dalszego hodowania zachowuje się hodowle, w których więcej niż 75% komórek posiada pożądane cechy morfologiczne. Linie utrzymuje się poprzez każdorazowe wybieranie do pasażowania kolby, której zawartość przejawia najlepsze cechy morfologiczne. W niektórych przypadkach w celu zwiększenia rozproszenia hodowli stosuje się okresową (co 2 tygodnie) filtrację przez sita ze stali nierdzewnej o otworach wielkości 630μτη, nie jest ona jednak konieczna.

Przykład XLII. Wytwarzanie protoplastów z zawiesiny hodowli Zea mays.

1-1,5 ml PCV komórek zawiesiny hodowli otrzymanej jak w przykładzie XLI inkubuje się w 10-15 ml wysterylizowanej przez filtrację mieszaniny złożonej z 4% (w/o) celulazy RS z 1% (w/o) Rhozyme w roztworze soli KmC 8,65 g/litr KC1,16,47 g/litr MgCb X 6 H20,5 g/litr MES, pH 5,6. Trawienie przeprowadza się w temperaturze 30°C, na stale wahadłowym przy wolnych obrotach, przez okres 3-4 godzin. Proces kontroluje się przez obserwację uwalniania prostoplastów w mikroskopie inwersyjnym. Uwolnione protoplasty zbiera się w następujący sposób: Preparat filtruje się przez sito o otworach 100μιη, a następnie przez sito o otworach 50μτη. Protoplasty przymywa się na sitach roztworem soli KCM o objętości równej początkowej objętości roztworu enzymu. 10 ml preparatu protoplastów umieszcza się w każdej z kilku będących do dyspozycji plastikowych probówek wirówkowych i podwarstwia się 1,5-2 ml 0,6 M roztworu sacharozy [zbuforowanej do pH 5,6 0,1% (w/o) kwasem morfolinoetanosulfonowym (MES i KOH)]. Probówki wiruje się przy 60-100Xg przez 10 minut i warstwę protoplastów na granicy faz zbiera się pipetą i umieszcza w następnych probówkach. Preparat protoplastów zawiesza się ponownie w 10 ml świeżego roztworu soli KMC 1 wiruje przez 5 minut przy 60-100 X g. Supernatant usuwa się, a protoplasty ostrożnie zawiesza się w pozostałej części supernatantu i następnie stopniowo dodaje 10 ml 13/14 stężonego roztworu KMC. Po ponownym wirowaniu przez 5 minut, supernatant usuwa się ponownie, a protoplasty zawiesza w 6/7 stężonym roztworze KMC. Pobiera się próbkę

162 317 do kontroli i ponownie osadza protoplasty przez wirowanie. Protoplasty zawiesza się przy stężeniu K)7 (dziesięć milionów) na ml w pożywce KM-8p (tabela 1) lub w 0,5 M mannicie zawierającym 6mM MgCh lub innej pożywce odpowiedniej do stosowania w transformacji, jak opisano w następnych przykładach. Tak uzyskaną zawiesinę protoplastów używa się do transformacji i hoduje jak opisano w przykładach XLIII i XL1V.

Przykład XLIII. Transformacja protoplastów Zea mays przez elektroporację.

A. Wszystkie etapy, z wyjątkiem szoku cieplnego, przeprowadza się w temperaturze pokojowej (22-28°C). W ostatnim etapie przykładu XLII protoplasty zawieszono w 0,5 M mannicie zawierającym 0,1% (w/v) MES i 6 mM MgCb. Opór tej zawiesiny merzy się w komorze Dialog Electroporator (DIA-LOG G. m. b. H., D-4000 Duesseldorf 13, RFN) i doprowadza do wartości 1-12 kQ używając 300 mM roztwór MgCb. Protoplasty poddaje się szokowi cieplnemu przez zanurzenie probówki zawierającej próbkę w łaźni wodnej o temperaturze 45°C na 5 minut i następnie chłodzi się do temperatury pokojowej w lodzie. Do 0,25 ml tej zawiesiny dodaje się 4pg plazmidu w formie liniowej, zawierającej roślinny gen oporności na higromycynę, który może być markerem służącym do selekcji, takiego jak opisany przez S. J. Rothsteina i innych, j. w., lub chimerycznych konstrukcji genowych jak opisano w przykładach ΧΙΧ-ΧΧΧΙ oraz 20/yg DNA nośnikowego z grasicy cielęcej. Do protoplastów dodaje się 0,125 ml 24% (w/o) roztworu glikolu polietylenowego (PEG) (MW 8000) w 0,5 M mannicie zawierającym 30 mM MgCl₂. Mieszaninę miesza się dokładnie lecz ostrożnie i inkubuje przez 10 minut. Próbkę przenosi się do komory elektroporatora i poddaje trzykrotnie impulsom elektrycznym z 10-sekundowymi przerwami, przy napięciach początkowych 1500. 1800, 2300 lub 2800 Vcm1, i wykładniczym czasie zaniku 10 /rs.

Protoplasty hoduje się jak następuje. Próbki wysiewa się na 6 cm szalkach Petri'ego w temperaturze pokojowej. Po dalszych 5-15 minutach dodaje się 3 ml pożywki KM-8p (tabela 1) zawierającego 1,2% (w/o) agarozy SeaPlaque i 1 mg/ml 2,4-D. Agarozę i protoplasty miesza się dokładnie i podłoże pozostawia do zestalenia.

B. Przykład XLIII A powtarza się z jedną lub większą liczbą następujących modyfikacji:

(1) oporność preparatu protoplastów doprowadza się do wartości 0,5-0,7 kQ, (2) stosuje się PEG o masie cząsteczkowej 4000, (3) nie dodaje się PEG, lub dodaje się połowęobjętości 12% (w/o) PEG, (4) stosuje się impulsy przy przerwach 3-sekundowych, (5) po elektroporacji protoplasty wysiewa się na szalki umieszczone na płycie schłodzonej do temperatury 15°C, (6) po etapie elektroporacji protoplasty umieszcza się w probówkach, przemywa 10 ml 6/7 stężonego roztworu KmC lub roztworu W5 (złożonego z 380mg/litr KC1, 18,375 g/litr CaCl₂X X 2H₂O, 9 g/litr NaCl, 9 g/litr glukozy, pH 6,0), następnie zbiera się przez wirowanie przy 60 g przez 10 minut, ponownie zawiesza w 0,3 ml pożywki KM i wysiewa jak w punkcie A, (7) nie daje się DNA nośnikowego z grasicy cielęcej.

Przykład XLIV. Transformacja protoplastów Zea mays przez traktowanie glikolem polietylenowym (PEG).

A/. Protoplasty zawieszone w ostatnim etapie przykładu XLII w 0,5 M roztworze mannitu zawierającym 12-30 mM MgCJ₂ poddaje się szokowi cieplnemu w temperaturze 45°C przez 5 minut, jak opisano w przykładzie XLIII. Protoplasty rozmieszcza się w ilościach koniecznych do transformacji w probówkach wirówkowych - 0,3 ml zawiesiny protoplastów na probówkę. Podczas następnych 10 minut dodaje się kolejno: DNA (jak w przykładzie XLIII) i roztwór glikolu polietylenowego (PEG) [masa cząsteczkowa 6000,40% (w/o), zawierający 0,1 M Ca/N ()3)2 i 0,4 M mannitol, pH 8-9 doprowadzone KOH] uzyskując stężenie końcowe 20% PEG. Mieszaninę tę inkubuje się przez 30 minut stosując rzadko łagodne wytrząsanie i następnie protoplasty umieszcza się na szalkach Petri'ego (0,3 ml początkowej zawiesiny protoplastów na szalkę o średnicy 6 cm) i hoduje jak opisano w przykładzie XLIII.

B. Przykład XLIV A powtarza się 1 protoplasty przemywa po 30 minutach inkubacji w roztworze PEG z przykładu VLIV A przez pięciokrotne dodawanie 0,3 ml roztworu W5 przy 2 do 3-minutowych przerwach. Zawiesinę protoplastów wiruje się, usuwa supernatant i protoplasty hoduje jak w przykładzie XLIII A.

C. Przykłady XLIV A i XLIV B powtarza się z natępującą modyfikacją: końcowe stężenie PEG jest pomiędzy 13, a 25% (w/o).

162 317

Przykład XLV. Regeneracja kallusa z protoplastów.

Płytki zawierające protoplasty w agarozie umieszcza się w ciemności w temperaturze 26°C. Po 14 dniach z protoplastów powstają kolonie. Agarozę zawierającą kolonie przenosi się na powierzchnię szalek Petrfego o średnicy 9 cm, zawierających 30 ml pożywki N6 (Tabela 1) zawierającej 2mg/litr 2,4-D i zestalonej dodatkiem 0,24% w/w Gerlite. Podłoże to oznaczone jest jako 2N6. Kallus hoduje się dalej w ciemności w temperaturze 26°C i kawałki kallusa przenosi co 2 tygodnie na świeże podłoże stałe 2N6.

Przykład XLVI. Selekcja stransformowanego kallusa Zea mays.

Przykład XLV powtarza się z następującą modyfikacją: do podłoża 2N6 dodaje się 100 mg/litr lub 200 mg/litr higromycyny B w celu wyselekcjonowania komórek, które uległy transformacji.

Przykład XLVII. Regeneracja roślin kukurydzy.

A. Kallus przechowuje się na podłożu 2N6 oraz podłożach 0N6 (pożywka N6 pozbawiona 2,4-D) i N61 (pożywka N6 zawierająca 0,25 mg/litr 2,4-D i 10 mg/litr kinetyny) w celu zapoczątkowania regeneracji. Kallus rosnący na podłożach 0N6 i N61 hoduje się na świetle (16 godzin światła na dzień o 10-100 pgeinsteinów/m² s z białej lampy fluorescencyjnej). Kallus rosnący na podłożu N61 przenosi się npo 2 tygodniach na podłoże 0N6, jeśli przedłużony czas na podłożu N61 jest szkodliwy. Kallus przenosi się co 2 tygodnie na świeże podłoże, nawet jeśli jest to podłoże o tym samym składzie. Sadzonki pojawiają się po około 4-8 tygodniach. Kiedy mają one co najmniej 2 cm wysokości przenosi się je na podłoże 0N6 w pojemnikach GA7. Korzenie tworzą się w ciągu 2-4 tygodni i gdy wyglądają już na dobrze wykształcone, wystarczająco do umożliwienia wzrostu sadzonki przenosi się do gleby w torfie doniczkowym, przy zacienionym świetle przez pierwsze 4-7 dni. Sadzonkom można ułatwiać zahartowanie poprzez nakrycie ich na 2-3 dni odwróconymi przezroczystymi filiżankami. Kiedy sadzonki się umocnią, traktuje się je jak normalne rośliny kukurydzy i hoduje do okresu dojrzewania w cieplarni. W celu uzyskania plonów rośliny poddaje się samozapyleniu lub krzyżuje z typem dzikim.

B. Przykład XLVII A powtarza się z następującą modyfikacją: do podłoża stosowanego do przechowywania kallusa dodaje się 100 mg/litr lub 200 mg/litr higromycyny B.

Przykład LXVIII. Wytwarzanie ambriogennej zawiesiny z tkanki Dactylis glomerata L. (kupówki pospolitej).

A. Hodowane w cieplarni rośliny kupówki pospolitej (Dactylis glomerata L.) nacina się u podstawy najmłodszych liści w celu zainicjowania procesu tworzenia się embriogennej tkanki, jak opisali G. E. Hanning i inni, Theor. Appel. Genet. 63, 155-159 (1982). Liście sterylizuje się powierzchniowo przez zanurzenie w rozcieńczonym 1:10 roztworze Cloroxu (5,25% (w/o) podchloryn sodowy, The Clorox Company, Oakland, Ca.) na około 10 minut i następnie tnie się na małe segmenty o długości lub średnicy 1-5 mm. Segmenty te wysiewa się na jałowe podłoże SH-30 zawierające 0,8% (w/o) agarozę jako środek zestalający. Kallus i/lub struktury embriogenne pojawiają się 2-6 tygodniach po wysianiu, w hodowli prowadzonej w 25°C. Embriogenny kallus przechowuje się w ciemności, w temperaturze 25°C.

B. Hodowle embriogennej zawiesiny zapoczątkowuje się przez umieszczenie około 0,5 g mokrej masy embriogennej kallusa w 50 ml płynnej pożywki opisanej przez D. J. Gray'a i innych, Plant Celi Tissue Organ. Cult. 4,123-133 (1985), zawierającej 45 pM dicamba i 4g/litr hydrolizatu kazeiny. Hodowle te, prowadzone w kolbach Delonga o objętości 125 ml pozatykanych metalowymi kapturkami i parafilmem na wytrząsarce obrotowej przy około 130 wstrząsach na minutę, wzrastały w temperaturze 27°C przy zastosowaniu fosfoperiodu: 16 godzin światła (40pE/m² s) i 8 godzin ciemności. Po około 4 tygodniach pozwala się, przez około 30 sekund, osiąść na dnie kolby dużym grudkom, po czym pobiera się 10 ml supernatantu kultury zawierające grudki małych komórek i przenosi je do 50 ml świeżej pożywki. Proces ten powtarza się co 3-4 tygodnie, wybierając do dalszego prowadzenia kultury charakteryzujące się jak najmniejszą wielkością grudek i obecnością w nich małych, młodych komórek. Po 5-8 takich pasażach zawiesiny wolne są zasadniczo od komórek nie-embriogennych, a większość grudek tych komórekjest drobna (150 do 2000 pm).

162 317

Przykład XLIX Izolowanie i oczyszczanie protoplastów Dactylis glomerata L.

Protoplasty otrzymuje się z hodowli embriogennej zawiesiny z przykładu XLVIII przez sterylne sączenie komórek na sączkach Nalgene o średnicy porów 0,2μιτι i następnie dodanie po 0,5 g mokrej masy komórek do każdych 12,5 ml mieszanki enzymatycznej do otrzymania protoplastów, na szalce Petrfego. W skład mieszanki enzymatycznej wchodzą: 2% (w/o) ęelulaza RS, 7 mM CaCl2XHzO, 0,7 mM NaHzPO4XH2O, 3mM MES (pH 5,6) i glukoza (55OmOs/kg H2O, pH 5,6); mieszankę tę sterylizuje się przez filtrację. Mieszankę wytrząsa się na wytrząsarce kołowej przy około 50 rpm i przyciemnionym świetle (<5 μΕ/m² s), przez około 4-5 godzin. Mieszaninę produktów trawienia przesiewa się przez sito ze stali nierdzewnej (ΙΟΟμηυ) i rozmieszcza w 12 ml probówkach wirówkowych, które następnie wiruje się przy około 60-100g przez około 5 minut. Osad zawierający protoplasty przemywa się następnie trzykrotnie pożywką hodowlaną dla protoplastów - KM-8p doprowadzoną glukozą do 55OmOs/kg H2O. Preparat można oczyszczać dalej stosując następującą procedurę: Przemyte protoplasty nanosi się na 10 ml pożywki hodowlanej KM-8p doprowadzonej sacharozą do 7OOmOs/kg H2O. Po wirowaniu przy 60-100 Xg przez około 10 minut, zbiera się cienką pipetą warstwę protoplastów na granicy faz. Ostatecznie, protoplasty zawiesza się ponownie w 1-2 ml pożywki hodowlanej KM-8p 1 przesiewa przez sito ze stali nierdzewnej (20μπι). Przechodzące przez sito protoplasty zbiera się, i zawiesza ponownie w pożywce KM-8p lub w pożywce wyrównanej osmotycznie, odpowiedniej do transformacji według przykładów LI-LIII.

Przykład L. Hodowla protoplastów Dactylia glomerata L. i kallusa.

A Oczyszczone protoplasty, o gęstości 5 X 10⁵ protoplastów na ml, wysiewa się na pożywkę hodowlaną KM-8p zawierającą 1,3% (w/o) agarozy SeaPlaque^R (FMC Corp., Marinę Colloids Division. Rockland, Maine. USA) wzbogaconą o 30-40% (w/o) pożywki otrzymanej z 3-4 tygodoniowych hodowli zawiesiny embrionalnej Dactylis glomerata L. poprzez sączenie przez jałowe sączki Nalgene o średnicy porów 0,2μπι, dodanie glukozy do 550mOsm/kg H2O 1 ponowną sterylizację przez filtrację. Płytki umieszcza się następnie w ciemności w stałej temperaturze 28°C. Po 10-14 dniach agarozę tnie się w kliny i prowadzi „hodowlę perełkową jak opisali R. D. Shillito i inni, Plant Celi Reports 2, 244-247 (1983), stosując 20 ml pożywki do hodowli zawiesiny SH-45 z 3% (w/o) sacharozy na 3 ml wyjściowej hodowli osadzonej w agarze. Płytki kładzie się na wytrząsarce 1 wytrząsa się przy około 50 wstrząsach na minutę, na świetle (8 μΕ^2). Gdy kolonie wyrosną na agarozie i uwolnią komórki do płynnego podłoża, wytworzy się nowa zawiesina komórek. Tę nową zawiesinę wysiewa się na pożywkę SH-30 zestaloną agarem i umieszcza w ciemności w temperaturze 25°C do chwili powstania kallusa.

B. Protoplasty hoduje się jak opisano powyżej w przykładzie L A z tym wyjątkiem, ze nie wzbogacano pożywki hodowlanej.

Przykład LI. Transformacja protoplastów Dactylis glomerata L. przez elektroporację.

A. Bezpośrednio po oczyszczaniu protoplastów, przeprowadza się elektroporację zgodnie z metodą R. D. Shillit i innych Bio/Technology 3, 1099-1103 (1985), używając plazmidu w formie liniowej, jak opisano w przykładzie XX. Protoplasty, po ostatnim przemyciu, zawiesza się w buforze do elektroporacji (0,4 M mannit, 6 mM MgCb) według proporcji 7 X 10⁶ protoplastów na ml buforu. 0,7 ml protoplastów umieszcza się w 10 ml plastikowych probówkach wirówkowych. Do probówek dodaje się plazmidowe DNA z przykładu XX i sonifikowane DNA z grasicy cielęcej (Sigma), uzyskując stężenie końcowe, odpowiednio, K^jwg^ml i 50μg/ml. Następnie dodaje się 0,38 ml roztworu glikolu polietylenowego (PEG) [24% w/o) PEG 6000 w 0,4 M mannicie, 30 mM MgCl_2>0,1 % (w/o) MES, pH 5,6] 1 roztwór ostrożnie miesza się. Zawiesinę protoplastów przenosi się do komory Dialog Electroporator i poddaje 10 razy impulsom elektrycznym z 30-sekundowymi przerwami, przy napięciu początkowym 3250 V/cm i wykładniczym czasie zaniku 10μΞ. Próbkę usuwa się z komory 1 umieszcza na szalce Petri'ego o średnicy 10cm. Dodaje się 10 ml pożywki KM-8p zawierającej 12% (w/o) agarozy SeaPlaque, protoplasty rozprowadza w pożywce 1 pozostawia do zestalenia.

B. Przykład LI A powtarza się z tym wyjątkiem, że stosuje się napięcie początkowe 3500 V/cm, 4000 V/cm, 5000 V/cm, 3000 V/cm lub 2500 V/cm.

C. Przykłady LI A i B powtarza się z tym wyjątkiem, że używa się PEG o masie cząsteczkowej 4000 lub 8000.

162 317

D. Przykłady LI A - C powtarza się z tym wyjątkiem, ze końcowe stężenie PEG wynosi 10-30% (w/o).

Przykład LII. Transformacja protoplastów Dactylis glomerata L. przez traktowanie glikolem polietylenowym.

A. Pośredniczone przez PEG przenoszenia genów przeprowadza się według I. Negrutiu i innych, j. w. Używanym DNA jest opisany w przykładzie XX plazmid w formie liniowej.

Protoplasty po ostatnim przemyciu zawiesza się w 0,5 M mannicie zawierającym 15 mM MgCl2 według proporcji około 2X 10^e na ml. 1 ml zawiesiny protoplastów umieszcza się w 10 ml plastikowych probówkach wirówkowych. Dodajesię DNA jak opisano powyżej w przykładzie LI, i następnie dodaje się 0,5 ml roztworu PEG [40% (w/o) PEG w 0,4 M mannicie, 0,1 M CaNCC>3)2, pH 7,0]. Roztwory miesza się ostrożnie i inkubuje przez 30 minut w temperaturze pokojowej (około 24°C), stosując rzadko łagodne wytrząsanie. Następnie dodaje się 1,4 ml roztworu do przemywania i zawartość ostrożnie miesza. Roztwór do przemywania składa się z 89mM mannitu, II5mM CaCb, 27 mM Mg CI2,39 mM KC1,7 mM Tris-HCl i 1,7 g/litr mioinozytolu, pH 9,0. Cztery dalsze

1,4 ml porcje roztworu do przemywania dodaje się z 4 minutowymi przerwami, mieszając po każdym dodaniu. Probówki wiruje się następnie przy około 60 Xg przez około 10 minut i usuwa supernatant. Osadzone protoplasty rozprowadza się w 1 ml pożywki hodowlanej KM-8p i umieszcza na szalkach Petri'ego o średnicy 10 cm. Dodaje się 10 ml pożywki KM-8p zawierającej 1,2% (w/o) agarozy SeaPlaque^R. Protoplasty rozprowadza się w pożywce i agarozę pozostawia do zestalenia.

B. Przykład LII A powtarza się z jedną lub większą liczbą następujących modyfikacji:

(1) pH roztworu do przemywania doprowadza się do wartości 5,6 lub 7,0, (2) stosowanym PeG jest PEG o masie cząsteczkowej 6000, 2000 lub 8000, (3) roztwór do przemywania składa się z 154mM NaCl, 125 mM CaCb, 5mM KC1, 5raM glukozy o pH doprowadzonym do 6,0 KOH, 0,2 M CaCb, 0,1% (w/o) MES, o pH doprowadzonym do 6,0 KOH, lub 0,2 M CaCb, 7 mM Tris/Hcl, o pH doprowadzonym do 9,0 KOH.

Przykład LIII. Transformacja protoplastów Dactylis glomerata L. przez elektroporację lub traktowanie PEG.

Transformację przeprowadza się jak opisano w przykładzie LI lub LII z tym wyjątkiem, że protoplasty utrzymuje się przez 5 minut w temperaturze 45°C przed ich rozdzieleniem do probówek do transformacji lub po rozdzieleniu, a przed dodaniem PEG.

Przykład LIV. Selekcja stransformowanych kolonii.

A. Płytki hodowlane (szalki Petri'ego), zawierające protoplasty otrzymane jak w przykładach LI—LIII, inkubuje się przez 10 dni w ciemności w temperaturze około 25°C, a następnie tnie na 5 równych skrawków w celu prowadzenia „hodowli perełkowej [R. D. Shillito i inni, Plant Celi Reporst 2,244-247 (1983)]. Każdy z czterech skrawków umieszcza się w 20 ml pożywki hodowlanej SH-45 z 4 g/litr hydrolizatu kazeiny i 20pg/ml higromycyny B. Piąty skrawek wkłada się do 20 ml tej samej pożywki, lecz bez higromycyny B dla nieselekcjonowanej kontroli. Po 4-5 tygodniach, przypuszczalnie stransformowane kolonie komórek pochodzących od protoplastów rosnące w obecności higromycyny B, wycina się z agarozy i umieszcza na szalce Petri'ego o średnicy 19 mm wraz z 2 ml płynnej pożywki SH-45 zawierającej 20pg/ml higromycyny B i wytrząsa na wytrząsarce przy 50 wytrząsach na minutę. Po następnych 4-5 tygodniach wszystkie kolonie, które rosnąc tworzą nowe zawiesiny, przenosi się do 125 ml kolb Erlenmeyera i hoduje podobnie jak wyjściową kulturę zawiesinową z tym wyjątkiem, ze do pożywki wprowadza się 20/fg/ml higromycyny B.

Nowe zawiesiny przenosi się na świeżą pożywkę SH-45 zawierającą 4 g/litr hygrolizatu kazeiny i 20pg/ml higromycyny B, co 1-3 tygodni. Komórki z tych zawiesin wysiewa się na stałą pożywkę SH-30 zawierającą 20pg/mI higromycyny B i inkubuje się w temperaturze około 25°C w ciemności. Tkankę kallusa, która wyrosła z tych komórek, przenosi się na świeżą pożywkę co 2 tygodnie. Przypuszczalnie komórki rosnące w obecności higromycyny B są transformantami.

B. Selekcję przeprowadza się jak opisano w przykładzie LIV A z tym wyjątkiem, że kolonie komórek pochodzących od protoplastów rosnące na pożywce zawierającej higromycynę B, umieszcza się na płytkach ze stałą pożywką SH-30 zawierającą 20pg/ml higromycyny B i inkubuje w temperaturze około 25°C w ciemności.

162 317

Przykład LV. Regeneracja stransformowanych roślin Dactylis glomerata L.

A. Kallus Dactylis glomerata L. (otrzymany jak opisano w przykładzie LIV) pochodzący z protoplastów hoduje się na stałej pożywce SH-30 i pasażuje co 2 tygodnie. Wszystkie tworzące się zarodki usuwa się, i wysiewa na podłoże do kiełkowania (SH-O) i umieszcza na świetle (45-55μΕ/m² s). Rozwój tych zarodków trwa I -4 tygodni i powstające w jego wyniku sadzonki umieszcza się na podłożu SH-O na świetle w celu wytworzenia systemu korzeniowego. W stadium 6-12 liści przenosi się je do cieplarni i stopniowo hartuje.

B. Kallus (otrzymany jak opisano w przykładzie LIV) pochodzący z protoplastów hoduje się na podłożu SH-O zestalonym dodatkiem 0,24% (w/o) Gelnte, na świetle (45-55 μΕ^2 s) i pasażuje co 2 tygodnie. Powstające sadzonki umieszcza się w mieszaninie SH-O i OMS (1:1) zestalonej dodatkiem 0,12% (w/o) Gerlite i 0,4% (w/o) agaru, na świetle w celu wytworzenia systemu korzeniowego. W stadium 6-12 liści przenosi się je do cieplarni i stopniowo hartuje.

C. Otrzymuje się małe sadzonki jak opisano powyżej w przykładach XLIVA i XLIV B, i umieszcza się je na podłożu OMS zestalonym dodatkiem 0,8% (w/o) agaru na świetle w celu wytworzenia systemu korzeniowego. W stadium 6-12 liści przenosi się je do cieplarni i stopniowo hartuje.

D. Otrzymuje się małe sadzonki, jak opisano powyżej w przykładzie XLIV A, i umieszcza się je na mieszaninie SH-O i OMS zestalonej dodatkiem 0,12% (w/o) Gerlite i 0,4% (w/o) agaru na świetle w celu wytworzenia systemukorzeniowego. W stadium 6-12 liści przenosi się je do cieplarni i stopniowo hartuje.

6. Krótkotrwała ekspresja genu.

Następne przykłady opisują jak można wprowadzić i wykorzystać geny chimeryczne bez konieczności ich stałej inkorporacji do genomu rośliny.

Przykład LVI. Wprowadzanie DNA do protoplastów N. tabacum przez traktowanie PEG.

A. Wytwarzanie protoplastów N. tabacum można przeprowadzać zgodnie z metodami opisanymi w następujących publikacjach: J. Paszkowski i inni, EMBO J. 3, 2717 (1984), brytyjskie zgłoszenie patentowe nr 2 159 173, europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 129668, R. D. Shillitu, R.D. i I. Potrykus, Methods in Enzymology, R. Wu i L. Grossman, Academic Press, Orlando, Florida, tom 153, 313-306 (1987) lub innymi powszechnie znanymi metodami.

B. Protoplasty otrzymane jak opisano w przykładzie LVI A zawiesza się ponownie, po kolejnym ostatnim przemyciu w roztworze składającym się z 0,4 M mannitu, 15-30 mM CaCh, 0,1% (w/o) MES według proporcji 1,6-2X10⁶ protoplastów na ml. Zawiesinę protoplastów rozdziela się po 0,5 ml do 10 ml plastikowych probówek wirówkowych. Dodaje się DNA z przykładów ΧΙΧ-ΧΧΧΙ w 10μ1 jałowej wody destylowanej, wysterylizowanej jak opisali J. Paszkowski i inni, EMBO J. 3, 2717 (1984). Następnie dodaje się 0,5 ml roztworu PEG [40% (w/o) PEG MW 8000 w 0,4 M mannicie, 0,1 M Ca(NOa)2, pH 7,0]. Roztwory miesza się ostrożnie i inkubuje się przez 30 minut w temperaturze pokojowej (około 24°C), rzadko wytrząsając. Następnie dodaje się 1 ml roztworu do przemywania i zawartości probówki ostrożnie miesza. Roztwór do przemywania składa się z 154 mM NaCl, 125 mM CaCb, 5 mM KC1,5 mM glukozy, o pH doprowadzonym do 6,0 KOH. Dalsze ilości roztworu do przemywania: 2 ml, 3 ml i 4 ml dodaje się kolejno z 5 minutowymi przerwami, mieszając po każdym dodaniu. Probówkę wiruje się następnie przy około 10-100 Xg przez około 10 minut i usuwa supernatant. Osadzone protoplasty rozprowadza się w pożywce hodowlanej K3 z 0,3 M glukozą jako składnikiem zapewniającym odpowiednie ciśnienie osmotyczne, ale bez sacharozy, w ilości wystarczającej do uzyskania końcowej gęstości protoplastów 100000 na ml i hoduje się na szalce Petri'ego o średnicy lOcm.

C. Przykład LVI B powytwarza się z jedną lub większą liczbą następujących modyfikacji:

(1) pH roztworu do przemywania doprowadza się do 5,6 lub 7,0, (2) stosowanym PEG jest PEG o masie cząsteczkowej 4000, (3) roztwór do przemywania składa się z 0,2 M CaCh, 0,1 % w/o MES, o pH doprowadzonym do 6,0 KOH, lub z 0,2 M CaCh, 7 mM Tris/HCl, o pH doprowadzonym do 9,0 KOH, (4) wraz z plazmidowym DNA dodaje się 50μg DNA z grasicy cielęcej w 25 μΐ jałowej wody, (5) DNA plazmidowe przeprowadza się w formę liniową stosując odpowiedni enzym restrykcyjny (np. BamHI).

162 317

Przykład LVII. Wprowadzanie DNA do protoplastów N. tabacum przez elektroporację.

A. Wprowadzenie DNA do protoplastów N. tabacum wywołuje się działając na protoplasty impulsami elektrycznymi w obecności odpowiedniego DNA, modyfikując metody Μ. E. Fromma, Methods in Enzymology, R. Wu i L. Grossman, Academic Press, Orlando, Florida, tom 153, 307 (1987) i R. D. Shillito i L. Potrykusa j. w., strony 283-306.

Protoplasty izoluje się jak opisano w przykładzie LVI A. Protoplasty zawiesza się ponownie, po kolejnym ostatnim przemyciu, w następującym roztworze: 0,2 M mannit, 0,1% (w/o MES) 72 mM NaCl, 70 mM CaCk, 2,5 mM KC1, 2,5 mM glukoza, o pH doprowadzonym do 5,8 KOH, według proporcji 16-2 X10⁸ na ml. Zawiesinę protoplastów rozdziela się po 1 ml do plastikowych kuwet i dodaje 10pg DNA, jak opisano w przykładach LVI B i C. Oporność roztworu mierzona pomiędzy elektrodami z zestawu elektrod 471 aparatu do elektroporacji, opisanego poniżej, pozostaje w zakresie 6 omów.

DNA z przykładów ΧΙΧ-ΧΧΧΙ dodaje się do 10/L/1 jałowej wody wysterylizowanej jak opisali J. Paszkowski i inni, EMBO J. 3. 2717 (1984). Roztwór miesza się ostrożnie i następnie poddaje w temperaturze pokojowej (24-28°C) impulsom elektrycznym o napięciu 400 V/cm z wykładmczką stałą zaniku równą lOms w aparacie do elektroporacji BTX-Transfector używając elektrod 471. Protoplasty pozostawia się, bez naruszania, przez 5 minut, a następnie przenosi na szalkę Petrfego i dodaje pożywkę K3 jak opisano w przykładzie LVI w ilości wystarczającej do uzyskania końcowej gęstości protoplastów 100000 na ml.

B. Przykład LVII A powtarza się z jedną lub większą liczbą następujących modyfikacji:

(1) stosuje się napięcie 200 V/cm lub napięcie 100-800 V/cm, (2) wykładnicza stała zaniku wynosi 5ms, 15ms lub 20 ms, (3) wraz z plazmidowym DNA dodaje się 50/yg DNA z grasicy cielęcej w 25 μ\ jałowej wody, (4) plazmidowe DNA przeprowadza się w formę liniową stosując odpowiedni enzym restrykcyjny (np. BamHI).

Przykład LVIII. Wprowadzenie DNA do protoplastów linii 2717 Zea mays.

Protoplasty linii wsobnej Funk 2717 kukurydzy otrzymuje się jak opisano powyżej w przykładach XL-XLVII i zawiesza w którymkolwiek z roztworów dla zawieszania protoplastów N. tabacum opisanych powyżej w przykładach LVI i LVII przy gęstości 10⁷ na ml. Transformację przeprowadza się zasadniczo jak opisano w przykładach LVI i LVII. Po transformacji protoplasty hoduje się przy gęstości 2 X 10⁶ na ml na pożywce KM-9p zawierającej 1 mg/ml2,4-D, bez środków zestalających.

Przykład LIX. Wprowadzanie DNA do protoplastów Sorghum bicolor.

Protoplasty z zawiesiny sorgo FS 562 otrzymuje się zasadniczo jak opisano w przykładzie XL dla Zea mays i zawiesza w którymkolwiek z roztworów dla zawieszania protoplastów N. tabacum opisanych powyżej w przykładach LVI i LVII przy gęstości 10⁷ na ml. Transformację przeprowadza się zasadniczo jak opisano w przykładzie LVIII. Po transformacji protoplasty hoduje się przy gęstości 2X 1)6 na ml na pożywce KM-8p bez dodawania środków zestalających.

Przykład LX. Wprowadzanie DNA do protoplastów Nicotiana plumbaginifolia, Petunia hybrida i Lolium multiflorum.

Protoplasty N. plumbaginifolia, P. hybrida lub L. multiflorum otrzymuje się jak opisali Shillito i Potrykus, j. w. i traktuje jak opisano w przykładach LVI i LVII. Hoduje się je na pożywce opisanej przez Shillito i Potrykusa j. w. bez dodawania agarozy ani żadnych innych środków żelujących.

Przykład LXI. Wprowadzanie DNA do protoplastów Glycine max.

Protoplasty Glycine max otrzymuje się metodami opisanymi przez D. M. Tricoliego i innych, Plant Celi Reports, 5, 334-337 (1986) lub V. K. Chowhury'ego i J. M. Windholma, Plant Celi Reports4,289-292 (1985) lub A. S. Kleina i innych, Planta 152,105-114(1981). DNA wprowadza się do tych protoplastów zasadniczo jak opisano w przykładach LVI i LVII. Protoplasty hoduje się jak opisali A. S. Klein i inni, j. w., V. K. Chowhury i J. M. Widholm, j. w., lub D. M. Tricoli i inni, j.w., bez dodawania algimanu dla zestalenia podłoża. 7. Regulacja chemiczna transgenicznych tkanek roślinnych.

Następne przykłady opisują procedury regulacji chemicznej genów podlegających takiej regulacji w reprezentatywnych transgenicznych tkankach roślin. Jakkolwiek te przykłady dotyczą indukcji podobne procedury mogą być stosowane dla systemów działających przez represję.

162 317

W celu traktowania komórek transgenicznych regulatorami chemicznymi dostępne są różnorodne techniki. Np. komórki można zawiesić w zawierającym regulatorze podłożu płynnym. Kallus można hodować lub przenieść na podłożu zawierające regulator. Regulator można także stosować używając jałowego pędzla lub opryskiwacza roślin. Podobnie można postępować, stosując roztwory i zawiesiny, w stosunku do roślin lub części roślin.

Ekspresja cechy fenotypowej w roślinach transgenicznych zawierających geny chimeryczne podlegające regulacji chemicznej, proporcjonalna jest do ilości regulatora zastosowanego wobec rośliny lub tkanki roślinnej.

Przykład LXII. Indukcja chemiczna w hodowlach transgenicznego kallusa.

A. W kallusie otrzymanym zgodnie z uprzednio opisanymi procedurami oznacza się indukcję chemiczną wywołaną przez stosowanie wysterylizowanego przez sączenie roztworu 0,l-50mM kwasu salicylowego, doprowadzonego dopH 6,0-8,0 przez dodawanie NaOH, używając jałowego pędzla lub opryskiwacza roślin.

Po indukcji kallus inkubuje się przez 2 dni, zbiera się go, zamraża w ciekłym azocie i przechowuje w temperaturze -80°C do czasu oznaczania indukcji genów jak opisano w przykładzie LXV i/lub LXVI.

B. Alternatywnie, do indukcji używa się następujących roztworów:

(2) 0,1-50 mM kwas benzoesowy, doprowadzony do pH 6,0-8,0 przez dodanie NaOH.

(2) 0,1-50 mM kwas pohakrylowy, doprowadzony do pH 6,0-8,0 przez dodanie NaOH.

(3) Ester metylowy kwasu benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowego-7. Roztwór przygotowuje się przez zawieszenie zwilzalnego proszku zawierającego odczynnik w jałowej wodzie na kilka minut, w stężeniu 1 mg/ml. Nierozpuszczalną, stałą pozostałość usuwa się z roztworze przez sączenie sterylizacyjne.

(4) 0,1 do 50mM kwas benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowy-7, pH 6,0-8,0. Związek ten rozpuszcza się w minimalnej objętości dwumetylosulfotlenku (DMSO), a następnie rozcieńcza jałową wodą do żądanego stężenia. Otrzymaną zawiesinę używa się bez sączenia.

(5) 0,1-50 mM Ester n-propylowy kwasu benzo-l,2,3-tiadiazolo-7-karboksylowego, przygotowany jak opisano w (4).

(6) 0,l-50mM Ester benzylowy kwasu benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowego-7, przygotowany jak opisano w (4).

(7) 0J^51mM N-II. rz. butylohydrazydu kwasu benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowego-7, przygotowany jak opisano w (4).

(8) 0,l-50mM kwas 2,6-dichloroizonikotynowy, przygotowany jak opisano w (4).

(9) 0,l-50mM Ester metylowy kwasu 2,6-dwuchIoroizonikotynowego, przygotowany jak opisano w (4).

Przykład LXIII. Indukcja chemiczna roślin transgenicznych.

A. Ekspresję genów w roślinach otrzymanych zgodnie z uprzednio opisanymi procedurami indukuje się przez spryskiwanie drobnopyłowe, opryskiwaczem do roślin, liści 0,1 -50 mM roztworem kwasu salicylowego doprowadzonego NaOH do pH 6,0-8,0.

Po indukcji rośliny inkubuje się przez 2 dni, zbiera je, zamraża w ciekłym azocie i przechowuje w temperaturze -80°C do czasu oznaczania indukcji genów jak opisano w przykładzie LXV i/lub LXVI.

B. Alternatywnie do indukcji używa się następujących roztworów:

(1) 0,1-50 mM Kwas benzoesowy doprowadzony do pH 6,0-8,0 przez dodanie NaOH.

(2) 0,1-50 mM Kwas poliakrylowy doprowadzony do pH 6,0-8,0 przez dodanie NaOH.

(3) Ester metylowy kwasu benzo-1,2,3-tiadiazolokarboksylowy-7. Roztwór przygotowuje się przez zawieszenie zwilzalnego proszku zawierającego odczynnik w jałowej wodzie na kilka minut, w stężeniu 1 mg/ml. Nierozpuszczalną, stałą pozostałość usuwa się z roztworu przez sączenie sterylizacyjne.

(4) 0,1-50 mM Kwas benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowy-7, pH 6,0-8,0. Związek ten rozpuszcza się w minimalnej objętości dwumetylosulfotlenku (DMSO), a następnie rozcieńcza jałową wodą do żądanego stężenia. Otrzymaną zawiesinę używa się bez sączenia.

(5) 0J^50mM Ester n-propylowy kwasu benzo-l,2,3-tiadiazoIokarboksylowy-7, przygotowany jak opisano w (4).

162 317 (6) 0,1 -50 mM Ester benzylowy kwasu benzo-1,2,3-tiadiazolokarboksylowy-7, przygotowany jak opisano w (4).

(7) 0,1-50mM N-II-rz.-butylohydrazyd kwasu benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowy-7, przygotowany jak opisano w (4).

(8) 0,1-50 mM Kwas 2,6-dwuchloroizomkotynowy, przygotowany jak opisano w (4).

(9) 0,l-50mM Ester metylowy kwasu 2,6-dwuchloroizomkotynowy, przygotowany jak opisano w (4).

Przykład LXIV. Indukcja ekspresji wprowadzonego DNA w protoplastach N. tabacum, Zea mays, N. plumbaginifolia, P. hybrida L. multiflirum i Sorghum bicolor.

A. Protoplasty traktowane jak opisano powyżej w przykładach LVI-LXI hoduje się w temperaturze 26°C, w ciemności przez 2 dni. Po tym czasie dodaje się kwas salicylowy do stężenia 0,1-50 mM w postaci zobojętnionego roztworu, pH 6,0-8,0. Protoplasty hoduje się przez dalsze 2 dni, zbiera przez wirowanie, szybko zamraza i oznacza jak opisano w następnych przykładach.

B. Alternatywnie, dodaje się do protoplastów zobojętnione roztwory lub zawiesiny następujących związków do stężenia końcowego 0,1-50 mM:

(1) kwasu benzoesowego, (2) kwasu poliakrylowego, (3) estru metylowego kwasu benzo-l, 2,3-tiadiazolokarboksylowego-7, (4) kwasu benzo-l,2,3-tiadiazoJokarboksylowego-7, (5) estru n-propylowego kwasu benzo-l ,2,3-tiadiazolokarboksylowego-7, (6) estru benzylowego kwasu benzo-l ,2,3-tiadiazolokarboksylowego-7, (6) estru benzylowego kwasu benzo-l 2 J-tiadiazoloka^i^t^c^l^^ylc^wego-7, (7) N-II-rz.-butylohydrazydu kwasu benzo-l 2,3-tiadiazolo-7-karboksylowego, (8) kwasu 2,6-dwuchloΓOlZonikotyncwego, (9) estru metylowego kwasu 2,6-dwuchloroizonikotynowego,

C. Alternatywnie, indukcję przeprowadza się jak opisano w przykładach LXIV A i B z tym wyjątkiem, że protoplasty hoduje się przez 1 dzień, 2 dni lub 3 dni przed inkubacją.

D. Indukcję przeprowadza się jak opisano w przykładach LXIX A, B lub C, z tym wyjątkiem, ze protoplasty hoduje się 1 dzień, 3 dni lub 5 dni po indukcji, a przed etapem zbierania przez wirowanie.

Przykład LXV. Oznaczanie podlegających indukcji chemicznej sekwencji DNA: synteza mRNA.

W materiale roślinnym poddanym indukcji i zebranym jak opisano w przykładach LXII i LXII1 oznacza się indukcję gatunków mRNA przez izolację RNA i oznaczenie wydłużania primera jak opisano w przykładzie V.

Kallus lub zregenerowany materiał roślinny otrzymany z roślin transgenicznych zawierających, podlegające regulacji chemicznej, geny chimeryczne kodujące GUS, AHAS lub BT i indukowane kwasem salicylowym, estrem metylowym kwasu benzo-l, 2,3-tiadiazolokarboksylowego-7, kwasem benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylcwym-7, estrem n-propylowym kwasu benzo-1,2,3-tiadiazolokarboksylowego-7, estrem benzylowym kwasu benzo-l, 2,3-tiadiazolokarboksylowego-7, N-II-rz. butylohydrazydem kwasu benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowy-7, kwasem 2,6-dwuchloroizonikotynowym, estrem metylowym kwasu 2,6-dwuchlorcizonikotynowego lub TMV wykazują podniesione poziomy mRNA w oznaczaniu wydłużania primera z primerem, odpowiednio, GUS, AHAS lub BT. Poziom mRNA jest proporcjonalny do ilości użytego regulatora.

Przykład LXVI. Oznaczanie podlegających indukcji chemicznej sekwencji DNA: aktywność enzymatyczna j3-l,3-glukuronidazy.

A. Oznaczanie na płytkach do testu ELISA.

Zamrożoną tkankę liści rozciera się w moździerzu w obecności ciekłego azotu do powstania drobnoziarnistego proszku. Ekstrakt z liści przygotowuje się przez mieszanie danej wagi (w g) z równą objętością (w ml) buforu do ekstrakcji GUS (50 mM bufor fosforanowy, pH 7,0,0,1 % Triton Χ-100, 0,1% sarkozyl, 10 mM /5-merkaptoetanol) jak opisali R. A. Jefferson i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8447-8451 (1986).

162 317

Reakcje przeprowadza się w płytce ze studzienkami do testu ELISA przez zmieszanie 5-25 μ\ ekstraktu z 120—100//1 buforu do oznaczania G US (50 mM bufor fosforanowy, pH 7,0,0,1% Triton Χ-100, 10 mM /3-merkaptoetanol) zawierającym glukuronid 4-metyloumbelIiderolu (MU) w stężeniu końcowym 2mM w całkowitej objętości 125/1. Płytkę indukuje się w temperaturze 37°C przez 1-5 godzin i reakcję zatrzymuje się przez dodanie 150μ1 3 M Na2CO3. Stężenie uwalniającego się wskaźnika fluorescencyjnego określa się przez odczytywanie płytki w czytniku do płytek ELISA Flow Labs Fluoroskan II.

B. Wyniki.

W tabeli 2 podano aktywność właściwą w Kat MU/mg białka

Tabela 2

Roślina’	A	B	C	D	E°
1	2	3	4	5	6
Η 1	5,39+1.9	13.9 ±1.2	13,5=0,8	20,1 ±5J	33.6=2,6
H 3	0.21 ±0.02	6,92±0,88	11,95=0,85	1.66x0.02	6,54= 1,43
H 4	8,39+1.31	27,5 =0,7	18,52±l,07	2,28±0,78	25.1 x0.9
H6	0,10=0,04	4,08x0.58	2.58±0.0l	0,09±0,06	2.8 ±1,2
H 9	0,23	10.8	9,1	0,5	7,5
Alu 1	5 6	20,0	206,9	20,5	70,5
Alu 2	2,0	6.6	83,2	8,9	155,3
Alu 3	0.1x0 07	2,8zx 0.9	2.0=0,9	2,O±O,5	5 8x3.8
Alu 4	2,1x1	43.0± 19	7.1x2,6	6,1x3.2	7.5=3.5
Alu 5	0.6=0,2	4.4x 2.3	l.2±0,6	0.5x0,3	8 3x3.7
Alu 6	0,8	28.8	67,0	3,1	36,4
Alu 7	1.7	38.7	29,1	21,7	63.0
Alu 8	0.6	0.4	0,4	0,6	0,2
Alu 9	0,9	0.6	0.4	0,3	nd
Alu 10	4,0	39,2	52,0	8,1	37,9
Alu II	1,6±0.8	l,9±0,9	2,8±1,3	2,2±2,6	2,8±2,9
Alu 12	0,7±0,4	57,1±22	73,4	2,3± 1,2	78,0±41,4
Alu 13	0,1	19,1	13,2	1,9	10,6
Hae 1	0,6	1,6	2,6	1,7	3,9
Hae 2	2,3	8,8	11,8	0,4	0,8
Hae 3	1,7	11,1	11.2	3,0	1,6
Hae 4	2,0	8,1	10,8	1,7	0,82
Hae 5	18.1	59,4	132,5	36,6	14,0
Hae 8	0,4	30,6	28,9	0,6	29,0
Hae 9	2,6	63,9	129,7	12,5	55,2
Hae 10	1,6	70,5	98,2	13,5	94,5
Hae II	2,6	81.8	58,5	3,9	46,0
Hae 12	0.2	2,5	5.8	0,6	14,5
Hae 13	0,01	0.7	0,1	-	-
Hae 14	0,1	1.8	8,6	0,1	3.3
Hae 15	0,1	6,4	7,2	3,4	7,4
Hae 16	0,1	2,3	4,3	0.8	2,7

162 317

Objaśnienia odnośników a/ H 1-9 są roślinami tyiomu otr7ymanvmi z krążków liści siransformowanvch szczepem CIB27I -Mu 1-13 są roślinami tytoniu otrzymanymi z krążków liści stransformowanych szczepem CIB272 Hae 1-16 są roślinami tytoniu otrzymanymi z krążków liści stransformowanych szczepem CIB273 b/ A Woda

B kwas salicylowy

C ester metylowy kwasu benzo-l 2.3-nadiazolokarboksylowego-7 D bufor E TMV

Stransformowany kallus tytoniu (przykład XXIII): dla próbek stransformowanego kallusa zebranego 21 dni po traktowaniu otrzymuje się następujące aktywności GUS. Stransformowany CIB271 opryskiwanie H2O: 1,8 nKat MU/mg białka: opryskiwanie 50 mM salicylanem sodowym: 3.8nKat MU/mg białka. Stransformowany CIB271 (inne doświadczenie): opryskiwanie H2O: 2.8 nKat MU/mg białka; opryskiwanie estrem metylowym kwasu benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowego-7 (250pg/litr): 13,7 nKat MU/mg białka. Stransformowany CIB273: opryskiwanie H2O: 0,46 nKat MU/mg białka; opryskiwanie estrem metylowym kwasu benzo-1,2,3-tiadiazolokarboksylowego-7: 31,2 nKat MU/mg białka.

Stransformowana marchew (przykład XXXVI); dla próbek stransformowanego pCIB27I kallusa zebranego 21 dni po traktowaniu otrzymuje się następujące aktywności GUS. Opryskiwanie H2O: 5,2pKat MU/mg białka. Opryskiwanie 50 mM salicylanem sodowym: 1 l,6pKat MZ/mg białka. Opryskiwanie estrem metylowym kwasu benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowego-7 (250/rg/Iitr): 22,1 pKat MU/mg białka.

Stransformowany pomidor (przykład XXXVIII): dla próbek stransformowanego kallusa zebranego 21 dni po traktowaniu otrzymuje się następujące aktywności GUS. Stransformowany CIB271. opryskiwanie H2O I7,2pKat MU/mg białka; opryskiwanie estrem metylowym kwasu benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowego-7 (250pg/litr): 56,1 pKat MZ/mg białka. Stransformowany CIB273 X A4: opryskiwanie H20:4,6 pKat MU/mg białka; opryskiwanie estrem metylowym kwasu benzo-1,2,3-tladiazolokarboksyIowego-7 (250pg/Iitr): 22,1 pKat MU/mg białka.

Krótkotrwała ekspresja w protoplastach tytoniu (przykład LVI) potraktowanych pCIB269. H2O· 36,6±13pKat MU/mg białka; ester metylowy kwasu benzo-1,2,3-tiadiazolokarboksyIowego-7: 66,6±20pKat MU/mg białka.

Przykład LXVII. Oznaczanie indukcji chemicznej genu endogennego.

Oznacza się transkrypcję mRNA endogennego genu PR-la metodami opisanymi w przykładzie V, w materiale roślinnym pochodzącym z tytoniu, indukowanym jak opisano w przykładach 62 do 64 kwasem salicylowym, estrem metylowym kwasu benzo-1,2,3-tiadiazolokarboksylowego-7 i TMV. Podwyższone poziomy mRNA wykrywa się po indukcji wszystkimi trzema induktorami.

Przykład LXVIII. Oznaczanie podlegającej indukcji chemicznej sekwencji DNA: aktywność enzymatycznej syntazy acetohydroksykwasów (AHAS).

A. Przygotowywanie próbki do oznaczania aktywności AHAS.

Określa się masę materiału tkankowego liścia i lub korzenia, który ma być oznaczony. Tkankę umieszcza się w ciekłym azocie i uciera do drobnoziarnistego proszku. Dodaje się objętość (w ml), równą dwukrotnej masie (w g) tkanki, zimnego buforu do homogenizacji (50 mM bufor NaHaPOą, pH 7,0; 0,5 mM EDTA pH 7,0; 0,5 mM MgCh; 1mM pirogronian sodowy, pH 7,0; 10μΜ dinukleotyd flawinowo-adeninowy; 1 mM fluorek fenylometylosulfonylowy; 10% gliceryna) i mieszaninę przenosi się do prasy komórkowej (French pressure celi). Wszystkie następne etapy przeprowadza się utrzymując materiał w niskiej temperaturze (około 4°C). Komórki rozbija się przy cieśnieniu IIOMPa, a następnie zbiera do pojemnika chłodzonego lodem. Alternatywnie, tkankę rozciera się z buforem do homogenizacji w moździerzu zamiast traktowania w prasie komórkowej. Rozbite komórki wiruje się 5 minut przy 10 000 obrotach na minutę w celu sklarowania homogenatu. Mierzy się objętość supernatantu 1 dodaje siarczanu amonu, o czystości odpowiedniej dla enzymów do 25% nasycenia (144 mg /NIWSOOą/mI supernatantu). Mieszaninę miesza się w lodzie przez 15 minut, następnie wiruje przez 5 minut przy 10 000 obrotach na minutę. Osad usuwa się a supernatant doprowadza do 50% nasycenia siarczanu amonu (158 mg /NH4/2SO4/ml supernatantu). Po mieszaniu w lodzie przez 15 minut, osad zbiera się przez wirowanie przy 10000 obrotach na minutę przez 5 minut. Otrzymany osad rozpuszcza się w 1 ml buforu do kolumny na każde 2 g materiału z liści lub 5 g z korzeni. Ekstrakt odsala się w kolumnie z żelem Sephadex G50 zrównoważonej buforem do kolumny (50 mM bufor NaH2PO4, pH 7,0:0,1 mM

162 317

EDTA; 0,5 mM MgCb, ΙΟμηι dwunukleotyd flawinowo-ademnowy; 1 mM fluorek fenylometylosulfonowy, 10% gliceryna). Próbkę eluuje się buforem do kolumny, zbierając 2 ml próbki na każdy ml próbki naniesionej na kolumnę.

B. Oznaczanie w probówce

5-50μ1 ekstraktu otrzymanego zgodnie z przykładem LXVIII A rozpuszcza się w całkowitej objętości 0,5 ml mieszaniny reakcyjnej (20 mM bufor NaH2PO4, pH 7,0; 20 mM pirogroman sodowy, pH 7,0, 0,5 mM pirofosforan tiaminy; 5 mM MgCL, ΙΟμιη dwunukleotyd flawinowo-adeninowy). Mieszaninę inkubuje się przez 30 minut w temperaturze 37°C. Reakcję zatrzymuje się przez dodanie 6N H2SO4. Mieszaninę inkubuje się przez 15 minut w temperaturze 60°C i następnie traktuje 625μιη odczynnika naftolowego(500μl 5% σ-naftolu w 2,5 M NaOH 1 125 μΐ kreatyniny o stężeniu 25 mg/ml 1 inkubuje przez kolejne 15 minut w temepraturze 60°C. Jeśli tworzy się osad, usuwa się go 1 absorbację mierzy przy 520 nm. Stężenie (pmole) tworzącej acetoiny oblicza się z krzywej wzorcowej o zakresie 0,4μg — 10μg acetoiny. Aktywność właściwą wyraża się jak pKat/mg białka.

C. Oznaczanie na płytkach do testu ELISA.

1-20μ1 próbki umieszcza się w studzienkach płytki do testu ELISA w całkowitej objętości 0,15 ml mieszaniny reakcyjnej. Reakcja przebiega przez 30 minut w temperaturze 37°C. Reakcję zatrzymuje się przez dodanie 50/1 2,4 M H2SO4 zawierającego 1% kreatyninę. Mieszaninę inkubuje się przez 30 minut w temperaturze 60°C. Jakikolwiek obecny osad oddziela się przez wirowanie. 150/11 oznaczanej mieszaniny przenosi się do nowej płytki do testu ELISA, traktuje 100/gl 10% σ-naftolu w 5 M NaOH 1 inkubuje przez kolejne 20 minut w temperaturze 60°C. Absorbancję mierzy się przy 520 nm 1 aktywność właściwą wyraża jak w przykładzie LVIII B.

Przykład LVIX. Oznaczanie podlegających indukcji chemicznej sekwencji DNA: endotoksyna Bacillus thuringiensis.

A. Procedura ekstrakcji roślin.

Około 100 mg tkanki roślinnej homogenizuje się w 0,1 ml buforu do ekstrakcji (50 mM Na2CO3, pH 9,5; 10 mM EDTA; 0,05% Triton Χ-100; 0,05% Tween; 100 mM NaCl; 1 mM fluorek fenylometylosulfonowy (dodany bezpośrednio przed użyciem) i 1 mM leupeptyna (dodana bezpośrednio przed użyciem). Po ekstrakcji dodaje się 2M Tris, pH 7,0, w celu doprowadzenia pH do wartości 8,0-8,5. Ekstrakt wiruje się następnie przez 10 minut w mikrowirówce Backmana 1 supernatant wykorzystuje do analizy testem ELISA.

B. ELISA.

Płytkę do testu ELISA traktuje się wstępnie etanolem. Do studzienek płytki dodaje się oczyszczonej przez powinowactwo antysurowicy króliczej skierowanej przeciwko Bt (50μ1) o stężeniu 3μg/ml w soli buforowej boranem (lOOmM kwas borowy, 25 mM boran sodowy, 75 mM NaCl, pH 8,4-8,5) i pozostawia do inkubacji przez noc w temperaturze 4°C. Antysurowicę wytwarza się poprzez immunizację królików z oczyszczonymi gradientowo kryształami Bt (endotoksyny Bacillus thuringiensis) [B. J. Ang i K. W. Nickerson, Appl. Environ. Microbiol. 36, 625-626 (1978)] rozpuszczonymi w dodecylosiarczanie sodowym. Płytki przemywa się buforem do przemywania (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,05% Tween 20, 0,02% azydek sodowy), następnie traktuje się w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę buforem do blokowania (10 mM bufor fosforanowy, pH 7,4; 140 mM NaCl; 1% albumina z surowicy wołowej, 0,02% azydek sodowy). Ekstrakt roślinny dodaje się w ilości dającej 50μg białka (zazwyczaj 5 μΐ ekstraktu; białko oznacza się metodą M. Bradforda, Anal. Biochem. 72,248 (1976) używając zestawu handlowego Bio-Rad) i inkubuje przez noc w temperaturze 4°C. Po przemyciu dodaje się 50μ1 oczyszczonej przez powinowactwo antysurowicy koziej skierowanej przeciwko Bt do stężenia 3μg/ml w rozcieńczalniku do testu ELISA (10 mM bufor fosforanowy, pH 7,4, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 1% albumina z surowicy wołowej, 0,02% azydek sodowy) i inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Po przemyciu dodaje się 50μ1 przeciwciał królika skierowanych przeciwko przeciwciałom kozim, związanych z fosfatazą alkaliczną (Sigma Chemicals, St. Louis, Mo., USA) rozcieńczonych w rozcieńczalniku do testu ELISA w stosunku 1:500 i inkubuje przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Po przemyciu dodaje się 50/z1 substratu (0,6mg/mI fosforanu p-nitrofenołu, 0,05 mg/ml MgCl2 = 10% dietanoloaminy, pH 9,8 doprowadzone HC1) i inkubuje przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Reakcję kończy się przez dodanie 50μ1 3 M NaOH. Absorbację odczytuje się przy 405 nm w zmodyfikowanym czytniku do testu ELISA (Hewlett Packard, Stanford, Ca., USA).

162 317

Atobchr PR1013 kb ramie Λ

-19kb onm .-< 9.2kb

PR- 1A τ-Τ7ι i mr

R PHR R R RPC

Fig 1

Atobchr PR1013

C C |xCla I |x agaraza LGT l_

Jx Cla I jx agaroza LGT j

jmieszame J ligacja Jtransformacja

Fig 2

|x EcoRI jx EcoRI jx a^garoza U3T jx agaroza LGT \___/

J mieszanie 1 ligacja j transformacja

Fig 3

^jxagaroza LGT J i mieszanie J ligacja

J transformacja

j transformacja

Fig. 5

Fig ί

| mieszanie | ligac^ja {^trans^formac^ja

PBS-PR1013 EcoAPst AXho

Fig 6

Fig 7 pohlinker

JxAsp 718 jxPst I {x agaroza LGT

P |xAsp 718 Jx Pst I jx agaroza

LGT {mieszanie i ligacja ^j łrans^formac^ja

Insert w obydwa orientacjach

Fig 8 u ΚΧ B P jednoniciowy ------lj-1_i_____

M13mp18-PR1013 EcoAPst AXho {wygrzewanie primerow | wydłużanie fragmentem Klenowa I ligocja

5' Β P 3’

-⁵- CTCCTATAGTCATGGGATTT-·—¹

-y----G^GAAAATC^C^TACCCT^^--.----i transformacja i izolacja mutanta c* B P v'

- i-CCATGG-1 -³- M13m^p18-PR 1013

-j---GGTACC->- EcoAPst A XhoNco

Ncol

Fig.9

RFM13 , (mp18- PR1013I EcoPst Xhcą . .. *p ~N |xBst Eli JxPst I k_ ^pBS-PR1013\ EcoAPst

AXho lxBstEII JxPst I 'mieszanie i ligacja | transformacja X

Fig.10

X

jx Nco I

Jxagaroza LGT k_.

|xagaroza LGT

J mieszanie | ligacja ł transformacja

Fig.11

jxSal I jxSnaBI JxSall |xSnaBI jxEcoRI jx EcoRI |xagaroza LGT ixcg)arozaLGT jxagaro>za LGT \/ mieszanie ligacja transformacja

Fig 12

Fig.13 Fig U

Delecja 5' sekwencji promotora PRla (Alul-Ncol) na poczqtku genu GUS w pCIB 200

Fig 15

Delecja 5' sekwencji promotora PR la(Haelll-Nco I) na początku genu GUS w pCIB 200

Fig.16

Promotor PR1a na początku skreconego genu endotoksyny Bacillus thuringensis klonowanego do pCIB7lD trawionego Sal l/BamHI

Fig.17

6759

2000

EcoRl<12320/Sst I

Pstl

Xhol

I

Sekwencja promotora z genu PR1a na początku skróconego genu endotoksyny Badllus thuringensis

800!

θςΙΙ

Hmd ni vul vu II St I Sstll Xba I •000

3000 Ncol Sst II Hindlll

Hindlll '4000 coRI BamHI

Hindlll

Fig 18

Fig 19

Promotor PR1a na początku genu AHAS typu dzikiego z Arabidopis klonowanego do plazmidu

Bluescript

Fig 20

Sekwencja promotora z genu PR 1a na początku genu AHAS typu dzikiego z Arabidopsis klonowanego do pCIB 200

Fig 21 Fig.22

Sekwencja promotora z klonu genu -1,3-glukoromdazy w pBSGIuc 391 na poczqtku genu GUS z pBSUS! 2

Fig 23

EcoRI<12884/Sst I PvuL

12000 EcoRI, EcoRI Nco I

Sekwencja promotora z klonu genu β-1,3-glukuronidazy w pBSGluc 39 1 na początku skróconego genu endotoksyny Bacillus thuringensis

Fig 24

Promotor ^glu^kanaz^{y 39}1 na poczq^tku g^enu AHA^Stypu dzikiego z Arabidopsis klonowanego do plazmidu Bluescript

Fig. 25

162 317

KpnK Ssti/1i.0U<EcoRl 1ŁO1

EcoR EcoRI

Sst I ¹Hind 12000Hind Ul BamH Hmdll.

H ind Ul HindUSj Sst/ i· BomHr 10000

Xbal<BamH Pstl< Sol HindllKSfWI

Ρνυ I

mdlii < Ρνυ l

Pstl

Xhol Cla I Sma I Hmdlll

Sekwencja promotora z klonu ii-1,3-glukuronidazy w pBSGIuc39 1 na początku genu AHAS typu dzikiego w Arabidopsis

Fig. 26

Fig.27

Sekwencja promotora z klonu ft - 1,3-glukurontdazy w pBSGIuc 39 3 na początku genu GUS z pBSGUS12

Fig 28

EcoRl<l30 36/Sstl

6000

Sekwencja promotora z klonu β-1,3-glukuromdazy w pBSGIuc 39 3 na początku skróconego genu endotoksyny Bacillus thuringensis

Fig 29

Promotor glukanazy 39 3 na poczqtku genu

AHAS typu dzikiego, klonowanego do plazmidu

Bluescript

Fig. 30

Pvul

Kpnl <Sstl/14196 < EcoRI 14000

Zn

EcoRI.

Ncol Sstl .

Hind III1200Γ ‘Pvu I

ΧοαΚθα/ηΗ

PstKSal

Hind III <Sphl

Ńdei

6000

Sekwencja promotora z klonu /ł-1.3-glukuoonjdazy w pBSGluc 39 3 na początku genu AHAS typu dzikiego- z Arabidopsis

Fig 31

8759

Hmd II Hmdlll

2000

Hindll ul νυ II ^StVt.l Xbal 1000

3000 Ncol SstH Hind III

Hind III 4000 EcoRI !on HI

Gen AHAS z Arabidopsis opornego na herbicyd w plazmidzie Bluescript

Promotor PR1a na początku genu AHAS z Arabidopsis opornego na herbicyd, klonowanego do plazmidu Bluescript

Fig 32

Fig 33

Kpnl< Sst I/13482* EcoRI

Ρνυ I

Ncol

4000

Pstl Ndel «OO vul Sst ll Sphl

Bal l< 2000 Sst ll indlll‘Pvui

10000

X ba KBamH PsIKSall

HindllKSphi Ncol

Sekwencja promotora z genu PR1a na poczqtku genu AHAS z Arabidopsis opornego na herbicyd, klonowanego do pCIB 200

Fig.34

Promotor glukanazy 391 na początku genu AHAS z Arabidopsis opornego na herbicyd, klonowanego do plazmidu Bluescript

Kpnl< Sst l/14044 < EcoRI

Ecq^{r| U001}'

EcoR·

Nco Sst I·

indlll<Pvu l

Xbal<BamH

PstKSol Hind II! < Sph

Pstl Xhol Clal Sma I

Hmdlll

Fig 35

Sekwencja promotora z klonu fi -13 -glukuronidazy w pBSGIus 39 1 na początku genu AHAS z Arabidopsis opornego na herbicyd

Fig. 36

162 317

8772

8000. ΡνυΙ

Kpnl<Sst l /14196<EcoRl 14000 Sphl

EcoRI.

Ncol,

Sstll

Xbal<BamHI

PstKSoll· HmdllK Sphl·

vu I Pstl 000

Pstl Xhol Jol Sma i Hindlll

Promotor glukanazy 39 3 na początku genu AHAS z Arabidopsis opornego na herbicyd, klonowanego do plazmidu Bluescript

Sekwencja promotora z klonu ^-1.3-glukuronidazy w pBSGIuc39 3 na początku genu AHAS z Arabidopsis opornego na herbicyd

Fig.37

Fig. 38

30 50

CTTGAGGATTTCGAGTTTTGGCTTTTTCAAAACTTGAGCTTTCTTTTTCATTAATTTCGG

00 110

AGAGCAATGTAAACGTAATCTATTTGTAAAGGATCTAAAAAAACTCCATTTGAATCTAAA

130 1500 170

TTCAGATCGTGATTGGGATAGGGAGACGTAAATTTTTTTATATTTTGAGTCAAGTTGTGA

2W 200 ttggtacgagataatataaaattactgtatcgcgtttgtagcattagatcggaaattagg

250 700 200

GTAAATTTATTTAGAGTTGAGAACTCATAAATTTTTTGATTTTCTTTACGTCITTTATCTGAT

310 300 500 agttatctaacgtcatcggggtgacggccatgttcaagttttccgcgagtattgaggaag

370 300 110 ggggaagaggatttaaactgtgtttggtattattatagtttttttttttagtaagttga

430 400 470

TTGTACATATTGAGGATGTGGTGTGTTATTCTATAGTGTGATTATTAGTGGGGCTGGACG

430 H 0 503 ttaaggtgtttattttaaattcttcctttttttgacgttcccattctgagagggggaaag

Fig 39 (I)

550 570 590

TATAAATATGGAAGTA/AAATTAATCACG\TCGTTAAATGTA(G\AAATATTAATTAACACA 610 630 650

TTAACnATAAnCAGTCTACTTTATTTTTCTTTmnTCATCTGATAGTTCTATAAAGTGT 650 600 710

TTATCTTCTTGCATTGACcr(TTT/ATrTTTATTTTGCAACATCGGGTTATTAT;TATTTTTCA 530 700 500

AnAATTGGTAACTGCATATATAAGTTTTATTTGGTTTnnTTGAAAATAGGATTTTATTATn 590 100 300

TATATnAGGATATATTACATTGATATTTnCTT’GTnAAAAAATTTTGTATGTACATGTATA 850 870 890

ATCACCGTGA,TTrCTTTAAGATTTCTCCTATAAATAra:TTGGTAGTAAATCTAGTπTT f_„ 910 930 950 n(CATTnATGATACAA(nTΠ'TCTCCTATAGT(nATGGGATTTGTTCTCTΓTTCACTATTGnC

MetGlyPheValLeuPheSerGl nLeuPr 950 990 1010

TTCATTTCTTCTTGTCTCTACACTTCTCTTATTCCTAGTAATATCCCACTCTTGCCGTGC oSerPheLeuLeuVal SerThrLeuLeuLeuPheLeuVal 11 eSerHi sSerCysArgAl

Fig.39 (Π)

1030 1050 1070

CCAAATTTCTCAACAAGACTATTTGGATGCCCATAACACAGCTCGTGCAGATGTAGGTGT aGt nAsnSerGI nGl nAspTyrLeuAspAlaHisAsnThr AlaArgAlaAspVal GlyVa

1090 1110 1130

AGAACCTTTGTCCTGGGACGACCA(GGTAGCAGCCTATGCGCATTTrΓTATGCTTCCCAATT I GI uProLeuThrTrpAspAspGl nVal Al aAlaTyrAI aG I nAsnTy r Al aSerGI nLe

1150 1170 1190

GGCTGnAGTTTGTATnCTnGTACTTTCTCATGGT(A(ATACGGCGAAAACCTAGCTGAGGG uAI aAlaAspCysAsnlLe^al HisSerHi sGlyGI nTyrGl yGl uAsnLeuAlaGl uGI

1210 1230 1250

TTGTGGCGTTTTCATGACGGCTGCTTAGGCTGTTGAGATGTGGGTCGTTGAGATACAGTT y SerGl yAspPheMet ThrAl a Ala Lys Al aVa IGl uMetTrpValAspGI uLysGl nTy

1270 1290 1310

T TATGTCCATGACTCAAATTCTTGTGCA<AAAG(:T^CTG&TGTGTGGACTC TATACTCAGGT r Tyr AspHisAspSerAsnThrCysAla Gl nGl yGl nValCysGlyHi sTy rThrGlnVa

1330 1350 1350

GGTTTGGCGTAACTCGGTTCGTGTTGGATGTGCTAGGGTTTAGTGTAACAAT(GTAC&ATT l Val TrpArgAsnSerVal ArgValGl yCysAlaArgVal Gl nCssAsnAsnGlyGlyTy

Fig 39 (ΙΠ)

1390 1410 14 30

TGTTGTCTCTTGCAACTATGATCCTCCAGGTAATTATAGAGGCGAAAGTCCATACTAATT rVal Val SerCysAsnTyr AspProProGI yAsnTy r ArgGl yGl u Ser Pro Ty rEnd

1450 1470 1490

GAAACGACCCACCTCCATTTCACGGTAATATGTATGGATTGTTCTGCTTGATATCAAGAA

1510 1133 1550

ACCCCCAACCTGCTCTAAACCGAAACTTAAAGTCAAGTATATAGTAATCTTAATACACCT

1500 1150 1610

GCCCTCACCTTAAGTGGATACCCCAAAAGAAACAGTGGTCATAACC AAGTGGAACACCAC

1630 1150 1600

TATTTTATGTCCACTAACTCGTATGATCTGATACTATTATGAACACTCTTTCAATCACCC

1600 UTOI 1730

TCATACTTTGTTGATGGTCTAGCCACCTTATATATTAAGCGAAACATTACTCACCAAATT

1750 1770 1790

CACCC(TTACCAAGTCCACACAGTTACCCCCACCCAATAGAGTTAAAAAAAAATGACAACC

1810 1830 1850

CACAACTCATATTGTAGGAGGATATCGACCTTTTAGCAGCTAGTTTTCCTAAIcΓGCACTC

Fig 39(IY)

1870 1800 1010

TCTTCCTCAACπTAAGGTCTAAAAATAπTACATCATCATTCAACCCACAAGTTAACCA 1930 1900 1970

TCTTTAAATATCTATGCATAATTCTAAATAGTAATCTGCCCACCACCCrGCCAACCAAACC 1900 0010 2030

TCCCAAACCAACTAATATACTCTGTCCTACCCCATTCCTAATGTCA'ΠΆGCAGACCCC

Fig. 39 (V) ,0 30 50 πACCTCCCAAGTATCATTAACATCCTATCCTCAAACAATCATATAGAGATTCTACACCA 70 00 110

TACTCAACTATATATCΆCATTCGTCCCCTATACCTCGTATATAGATTTTTAACTAAAAGAA 130 150 170

TTTAACA T TACCAAATAAATCATCGTTTAAATCAAATTCCGACTATACATCCGATACACT 100 HO 200

ATCπTTCGTACTCGACCACCAAAT<TTCCTGCπCCATTΆCCCCTATCGCAGATAACCCA 250 700 290

CTTTATAAGGATGTATTCACTTTCTACCCCCATCATACTCTGTπCATTTTTCCCGAACC 310 300 500

TTCTATACGTTCGACAG(AcTCCCTCCAATCGAACAGGTCCATCTCCACAACTTCCCGCAC 370 000 HO

AATCACCCCCATCACACTCTTTCCTCGCAACACACCCATGCTCAAATACACTGGTAACCA 430 450 4TO

CTTATCACCACTACCTTCCTGTATATACTACAAATCACCGATCTCTAAACGTCGTTCAAAC 400 510 300

CATGATCATGTCCCCCCCCGTTGCTCCTCAATATCTCTACTCCTCCACTGTAGGCTTTCT

Fig .40(1)

550 570 590

TTTCTTTAACGAATATGATCTAACGTTCTTTGMTTAACGGAGCTATAATTTTATACTAT

610 630 650

TCTTTTCAAATATGGCTAAA(AGTTTGCTAACAAGTTGC.AAACTTTGTAACTCAGCTATA

670 900 700

TTCTTCCCTATAAAAATCATCCTTATTTTGCTTTGTTTCTCACCAAAAGCIAAAAAA-GGG

MetGI

730 750 770 τπATTTTCTTCAATATTTGCTTTTTTCATTTACTTTGATATATTAATTCACTCATCAAA yPheLeuThr Thr II eVal AlaCysPhell eThrPheAla I leLeu I le His Ser SerLy

790 8Ό 830

TTCTCAATTCTCACAAAAATATTATCTTAAACCTCACTVTTGAATATATTAGACAAGTTTT sAlaGt nAsnSerProGl nAspTyrLeu AsnProHis AsnAla AlaArg ArgGl n ValGI

850 870 890

TTTTGTCCCAATTAAATGGGACTATTA(G3ATAGCATAATATGAAAAAAAπATGAAAATAT yVa I Gl y Pr oMetThr T rpAspAsnArgLeuAlaAl aTyrAI aGl nAsnTyrAI aAsnGI

Fig 40(H)

9I0 930 950

TTGATTTTGTGAGTGAGGGATGATAGACTATATTGTAAGTTAATGATAAAAAATTGCATC nArglleGlyAspCysGlyMet 11 eH i sSerHi sGI yProTyrGl yGI u AsnLeuAl aAI

970 990 I0I0

ATGCTTCAATAAAATTAAAGATGATTGTTATTTTAAAATTTGGGTAGATGAGAATCTTTT aAloPheProGI n LeuAsnAlaAlaGI yAlaVal LysMetTrpValAspG I uLysArgPh

I030 7050 I070

CTTTGATTTAAATTAAAATTCTTGTGTAGGAGGATTATGTGGAAAATATACT(AGGGTGTT eTyrAspTyrAsnSerAsnSerCysVal Gly Gl y Val CysGI yHi sTy rTh r GI nVal Va

I090 III0 II30

TTGGAGTTTTGTGAGTAAGTGTATGTTTTGCTTGTTTTA(GTTGGATT(ATATITTTTTGTTTTT lTrpArgAsn SerVa lAgLeuGlyCysAla Arg^/aA ArgSerAsnAsnGlyTrpPhePh

II50 II70 I190

ATTAAATTGAAATTATGiATAAAAAATGTAATTTTTTAGGAAAAAGTAAATTTGGATATAT eIleThrCysAsnTyrAspProProGlyAsnPheI I eGI yGI n ArgProPheGI yAspLe

I2I0 7230 I250

TTACTGTTAATCACTTGATTCCATTATTGGMCTTCCMCTGATGTATAATGAGTGCAATT uGI uGI uGI nProPheAspSerLysLeuGI u LeuProThrAspVal Koniec

Fig. 40(IH)

1270 1290 1310

ACATGMCAAATTATCATGAATAAAGGAAAATAAAATGCAGTGCTATGCTATGTCGATTTT 1330 1350 1370

AGCTTCCCAGTTGGATAATAATCTGATGGTGTAGTAACTGGCCGAGTGTTTCGACCCTAC 1390 1410 1430

CπTCATGTTGGTAGATGCCATCATTTTATATATGAGTTTTCTGTTGGCTTATTTTTTTT 1450 1470 1490

TTTTTTTAATCTTATTCTAGTTTTTCAGTTTTTTATTTGTACTATATGTGTAT(GG3TCCA 1510 1500 1S50

TTTTTTTTCTTCCACGACCTTTTTCGTTTTCTTCATTCGACCGGGTTCCTTCGAATCTGC 1570 1500 16W

TTCCCAATGGCATAC(TT:CCTAGGGCCATTGAATGTGTCGTATGACTCTTGTATTTTTTTT 1630 1650 1670

TTCCCCTTTAGGGAATATT/TACTTATTCCCTCGGATATCAATTGTATTTTTTTTCTTTCA 1650 1700 1700

TTTCTTAATGGTTTCTCTCTAGTATATMAGGTTTCTTTAAA(XTTGTAAGT(T3C«;TTT 1750 1770 1500

TTTCTCTTTTAAGCTTACTAATCTTG(τ^T(GTAJATGAAATATCTCTCTTCTCTTTTTCTTTT

Fig 40(IY)

1810 1830 1850

TT7TTTCTTTTTTTTATTATCTTCAGCTACGATTTACCCCTTCTTTTTTGATTTTTTTTT 1370 1500 19Ί0

TCTAAAATGTTTTAACATCTTTTGAGT(TTAAAT^TTTGGCNCCGTCTTTGGGGTTTTCTT 1930 1500 1570

TATCTTAATCATAGTTCTCATCTTGTTTTCTGAATTTATTTTTTCTTTTCTTCTATCCT 1950 0000 0000

CTTAATTATCATCAATGTCSCCATTGGTTTTGTAGCTATτ^TGCTTTASACTTCTTCTCTA 2050 2070 0590

TTAACTCCTTAACTCCCTCATACCAτACTCCGGCAGTGTACTCAATTTGAATT

Fig. 40 (Y)

30 50

TAAGTMGCTCπTAAGCMTGGCTGCCXA(CTAATLTTCTACAAQKTTTCCATCπCTT

MAAHK ITTTLSIFF 70 50 110

CCTCCTTTCCTCTTTTT1^^C^C^^(^TC^(T^(^GC^CTGTATU^^TC^TCTATTGGTGTCA LLS SIFR SSDAAG IAIYWGO

130 150 170

ATACTTCAACGACT3GCTCTCTTGCATCCTCCTTCTCAACTGGTAACTACGAGTTCGTCAA

NGNEGSLASTCATGNYEFVN

150 210 230

CTTTTCATTTCTCTCTTCCTTTGGCACCCGTCTTTCTCCATTTCTCTACCTTGCTCGTCA

I AFLSSFGSGO APYLNLAGH

250 270 250

CTGCATCCCTTACAACTACTGTTGCGCTπTTTTTTCTACGTTATAATCTCTTGCTAAAG CNPDNNGCAFLSDEINSCK S

Fig.41 (I)

310 330 350

TCAAAATGTCAA^GGTCCTCCTCTCTATCGGTGGTG^^G^^(GG^^C^^TkTT^.^(CTlCT^^TC

QNVKVLLSIGGGAGSYSLSS 370 390 410

CGCCGACGATGCGAAACAAGTCGCAAACTTGATTTGGAACAGCTACCTTGGCGGGCAGTC

ADOAKQVANFIWNSYLGGQS

430 450 470

GGATTCCAGGCCACTTGGCGCTGCGGGTTTOGATGGCGTTGATITCGATATCGAGTCTGG

DSRPLGAAVLDGVDFDIESG 490 510 530

CTCGG^(C^>^(3TTiCTG^(^G^(^^Tr^(^Tr^C^C^TC/^G^GAGGCTAA^GGAATTTTGGAC^GT^TTTT

SGQFWDVLAQELKNFGQVIL

550 570 590

ACCTGTTGTGCTGTGGCGTCCAATACCAGGTGCCTATTTAGACGCCGTGGCTAGGGTCGG

SAAPOCPIPDAHLDAAIKTG

Fig. 41 (II)

610 630 650

ACCGCCCGATCCCGCCCGGGCTTAGTCTCGCGGTGG(TCTGTTGCGTACGCCCGTAGGCGA

LFDSVWVQFYNNPPCMFADN

670 690 710

TGCG(CGTGGCTCTTCAGTC(T\TGGCGGCAGTGGACGGCGTTTTCGATATCGGA(CTTTCA

ADNLLSSWNCIWT AFPTSK LY

730 750 770

CATGGGACCGTCGGCGGCATGGGAGGIτGGCGC£GAGCGGGGGATTCACCCTGGTGGGCGC MGLPAAREAAPS G G F I P A D V

790 610 830

GTCCG'CπC T TGGGCTCCCTTGGTCGCCG A AGCTT T^TTGGTCAC^GGGGGGGCGGCGCC

LISQVLPTIK ASSNYGGVML 850 870 890

ATGGGGT/AGGGCGΓΓTCcACAATGGCTACAGCGATTT(TACCGGAGCCAGTGCCGGTCGGGG

WSKAFDNGYSDSIKGSIG·

Fig. 41 (III)

910 330 900

GA AGC^dA AGTT T AAT T T TAGCTAGAGTTGTGAATGGGTTTTGGGGCATCGTGACGGC 970 990 1010

TAA>GGGGT(CGGAC^TΓCATCTCCCTCACTCAGTCCCGCATTAAATTAGTGTGACGTGGCAG 1030 1050 1070

ΓTGACATCCTCCTTTTCATTACTATACTACCGGCΓGTTTGAGACTG(GGGGCGTTGATCCTG

1090

GTGGGG^(^TT^(^TG^(^TTT^TCT

Fig 41 (IY)

AAAAAGAAAA AAAAAATGAA

CCTTTATTTT GGCCAATACT 101 ACATTGTCAA CAAATGCACC 151 GGAGGCAGGC GGCTCGACTC 201 AGGAACAGTC CAGGCTCGCA 251 GCAGTGGCCG AGGTAATTGT 301 TGTCAAGGCT ATGGAAAAGC 351 TCAACCCAAT CAGGACTTTG 401 TCCCCATGGA ATTCAGCCCG 451 ACAGCACCTA TTAACGAACA 501 ATGTAACAAC CCATGTACTG 551 ATGGGCCTGG ATCATGTGGG 601 AGATGCCCTG ATGCTTATAG

CTTCCTCAAA AGCTTCCCCT TTTTTGCCTT TTGTAGCTGT TACTCATGCT GCCACTTTTG TACACAGTCT GGGCCGCGGC CTCTCCAGGT AGGCCAATCT TGGAGCATTA ATGTGAACCC TTTGGGGTCG AACCAATTGC AACTTCGATG GAGACTGGAG ACTGTAACGG GATGTTAGAG ACCTAACACT TTAGCTGAAT TTGCACTTAA TCGACATCTC TCTTGTTGAT GGATTTAACA ACCAATGGAG GATGTCGTAA TCTCAGATCG ATGCCCAGCA CAGTTGAAAA CACAAGGTGG TGATAAAAAC CAATGAATAT TGTTGTACAA CCTACTGATT TGTCGAGATT TTTTAAGGAA TTATCCACAG GATGATCCAA CCTGTTTGTT

Fig. 42 (I)

551 TACGTGTCCT TCTGGTACTA ATTACAGGGT TGTCTTCTGC CCTTGAAATT 701 GAAGCCTGCA AAATTATGAC TATGTAATTT GTAGTTTCAA ATATATAAGC 751 TACACAAGTA GTACTAAGCA CTATTAAATA AAAAAGAGAG TGACAAAGAG 801 GAGAGGCTGT GGGTCAGATT CTCTTGTTCG CTGTTGTCGT TGTTGTAGCA 851 TTCTGGTTTT AAGAAATAAA GAAGATATAT ATCTGCTAAA TTATTAAATG

Fig. 4 2 (II)

30 50

AAAAAGAAAAAAAAAATGAACTTCCTCAAAAGCTTCCCCTTTTTTGCCTTCCTTTATTTT

Met AsnPheLeuLy s Ser PheProPhePheAl aPheLeuT yrPhe 70 90 110

GGCCAATACTTTGTAGCTGTTACTCATGCTGCCACTTTTGACATTGTCAACAAATGCACC Gl yGI nTyrPheVal AlaVal ThrHisAl aAI aThrPheAspIleVal AsnLysCysThr

130 150 170

TACACAGTC TGGGCCGCGGCCTCTCCAGGTGGAGGCAGGCGGCTCGAC TCAGGCCAATCT TyrThr Val T rpAl aAI aAlaSerProGI yGI yGI yArgArgLeuAspSerGI yGI n Ser

190 210 230

TGGAGCATTAATGTGAACCCAGGAACAGTCCAGGCTCGCATTTGGGGTCGAACCAATTGC TrpSer 11 eAsnVal AsnProGlyThrValGl nAlaArg I leTrpGlyArgThrAsnCys

250 270 290

AACTTCGATGGCAGTGGCCGAGGTAATTGTGAGACTGGAGACTGTAACGGGATGTTAGAG AsnPheAspGI y SerGI y ArgG ly A snCysG I uThrGlyAspCysAsnGI yMetLeuGI u

Fig. 42a (I)

310 330 350

TGT(CAAX5CtATGGAAAAGCACCTAACACTTTAGCTGAATTT(G:ACTTAATCAACCCAAT CysGI nCI yTyrCl y LysAla ProAsnThrLeuAlaCI uPheAla LeuAsnCI nPro Asn

370 390 410 tA(GArCAAAGAC(AAATATATATAGGAGATCGATTAAACATtttCAAGGAAAAtAGCtCC Cl nAspPheVal AspIleSerLeuVal AspGly PheAsnlleProMetCI uPheSerPro

430 450 470

ACAAAACGAGACTGT(ASATCA'CT(A^GATGCΔCAG(TACCTATTAACAAACAATCttCAGAA ThrAsnClyCI y CysArgAsnLeuArgAysAhrAI a Pro I l e AsnCI uCI nCysProAl a

490 510 530

TAGAAGAAAACACAAGAA(AACAAAATAACtCATAAAGTGAGAAAAAAACCAAAGAATAA Cl nLeυLysThrGtnGlyGlytysAsnAsnProCysThrVal 11 eLysThrAsnCI uTyr

550 570 590

ACAAATACAAATGGGCtTG<ATT<ArTGTGGGGttACTGATTTGACGAGATTATTTAAGATA CysCysThr AsnCI yProClySerCysCly ProThrAspLeuSer ArgPhePheLysCI u

Fig A2a (II)

610 630 650

ACAAGtATAAAAGC AAAAAGA AATCCAtACGAAGATCAAAtTACπ TCT T TATGTCTtt T ArgtysProAspAlaAyrSerTy rProd nAspAspProAhrSerLeuPheT yrCysPro

670 690 710

TtAGGAACTAAAAATAAAATΆGACAACACTtCAAGACATTCAACCTTCCAAAATTATATT SerCI yAhrAsnAyΓAΓgValValP^e?CysProEnd

730 750 770

AAAGAACATTCTACTTAtAAAAATATATAtTACAtAACTACTAtTAAGCAtTATAAAATC

790 810 830

AAAAAACGCGAGAAArAAT3(AAAAACtAATAGAAACGTTATAATGAAtCTTGAACAtGA

850 870 890

ACAAGAACTAAAtACCTATArAAG>AA^ArAAAAAGAAAAAAATtACtAAAAAAATAAAATC

Fig.£2a (III)

101

151

201

251

301

351

401

451

501

551

601

651

701

GACtAtTAtT

AAAAGAtCAA

AAAATTAACA ttCAAttCAA

AAAAGAAAGA

TTtAAACACt

AAGAtCGAAt tAATACTtAT

CCCTCtAAGt

AAACATtTtA

AAATAtCACA

ATACACAtAG

AACAACAAAA

AATAAAAATA

AACAAtAAAt

AGCCGGCACA

CAGAAAGAAA

CAAATACACA

AAAtCAAAAA tgacaaaaca

AAtAAAAAAG

AAAAAAAAAA

CTAAGTGAAA

TTCAGAAAAT

ATAAAAAAAA

AAAGAAAAAA tGAGCCATAA

TAACGAAAAA

ATAGCTAAAA

ATAAAAAAAA

GCCAAATCAA AAACtAAATC GAAAAAAAAA AACCAACTtA AATACAAAAA ATAAACCGCA AAAAAtATAT GGACCCAAAA ^^^^TAT GACCAAAATC AACAAGAAAA AAAtATTTAT CAAACCAGAA AACAAAAGTA AAAAAAAAAt CAGCCAttAC AAAACAAAAG CCAtTAAAAT tCCCAAAAAA AAAATGAAAA ATACAAtATT AAAtAtTAtC AATAtAATGC TGtAATAACA ttAGAACAAT ATtAAACAAT AACAtAATAA AGAAAAAAAA ATCCAGtAAA ACAAtAACAA ATCACACCCA TAACAAAAAC AATCCtAAAT ACACAAAAAG CACGAAAAGA AtAACCAAAA GAAATACGGA AATCATTAAA AAtAAAATTA ACGAAAAAAA AAAAAAAAAA AAATACAGAA AGAAGAATAG tAAAAAACAA ACttACCAtA

Fig. Λ3 (I)

751 801 851 901 951 1001 1051 1101 115Ί 1201 12^1 1301 1351 urn U 51

1501

1551

1601

1651

1701

1751

1801

1851

1901

1951

2001

2051

2101

2151

2201

GTTAGAATCC AGTTTCCTCT AATAAATGCA CATTAAATCA ATTCATATAA TTTAAAAATA CGATTCGAGA CTGTTATGGA AGGCGTTGCC ATTGCTTTCG TGCAATAGCA ATATGACATC AAATGAAAGT CATATAGAAC TTTAAAATCT TTCAAAATAC GACCAATATT TATTACTTAC TATGTATTTT ATCTTGAAAT TGAATTGAAA ATATAAACAA TAGATATCGT TAAGTATTTA GTAACGATGA TTAAGCAGGA ATTCCTCTGG TAACTAGCTA TAATTTCTTT TGTAAAGTCA GAGAAAATAA ATAACTTTAC ATCATCAAAC AATGATCAAG TTGACATGTT AATAGCCAGG CTTCATTAGC CTAC6AATAA CAAATCCAAT TATATATATC TCAATATAAA TAGCTCGTTG AAGTCTTCCC ATCATGTCTA CCTCACATAA

Fig. 43 (II)

GCGAAATATT AGAAGACTTT CTAGACATGG AAAAAAAAAA TTCGATGTAG ATTCTCATCC TTATTCTTAG AACTACTTTT CTCAACTAGT TTTAAGGGAA TTATGGATAA ATTTAAATAA ATATTAAATT ACTTGGTTTA CCACAAACAT TTTATTAGTT TTGTGCAGGA TGAAAGAAAC AGATAGTACG GCACCTTATG TCATCTTCTT TTTTCCACAA TCACCGGGGG CGGCTCTTAA ATTATATTTA CACAAGGCTA TTCATCTTAA TTCTCCCAAC ACATAATACT CCTCAAATGG

CTGCTATCAC ACTCCTAGGA TTACTACTTG TTGCCAGCAG CATTGACATA GCAGjTTTCT ggtcaaatat ttgaacttcc cagccaaaaa tattgtctta TAATTTTGTG TGCGCAAAAT TTTAATTTAG TTGATAGTTA TTTGCTTATT TTTCTTTTCA AATTGCTTGT GTTTTTTTCT CAAATTAACT TGCACCGTAT TCATTTAGCG ATAGTTATTT GCTCTATTTT TGTGTAACAC TCACTCACAA ACTTTTCAAT TTGAGGGGAG GACAGTGAAT CTAAGATTGA AATTTATGAG TTTAATTAGA CTAATTCCCA TTTGATTTAT TGGCTAGAAG TCAATTATTT GCATAGTGAG TCTTTTAACA CACAGATTTG AGTTAAAGCT ACTACGTTCG TATTAACCCA TAACATATAC ACCTTCTGTT CTAATTTCTT TGACACTTTT TGTTAGTTTG TTCCAAAAAG GACGGACATA TTTGATATTT GAGAATACTT TACCTTAACC TTAATAGAAT TTTTTATGAC ATCACATATA TTATGGAATA TATACGACCA TAATTTTCAA ATATCTTATA GTCGTACAAA TATTATAGCA TGTTTAATAC CACAACTTTC AAATTCTTCT TTTCCTTAAA AACAAAATAT GTCACATAAA TTAAAATAGA GGAAGTATAC TACATCAATC AGCCCCTAGT GGAGGGGACC CTACTGTAAG TTTT.TAAGTT TTCAAGAATT CAGTAATTGA

Fig. 43 (III)

2251	TTAGGAGCCC	GTCTGGACAT	AAAAAAAAAT	TCCTTTTTTT	CCAAAAAATG
2301	CCCACTAAAT	TTCTAACACT	ATTTTGTAAT	TCTTATTGAG	CAGGGGGCTC
2351	AATCGATAGG	TGTTTGCTAT	GGAATGCTAG	GCAACAACTT	GCCAAATCAT
2401	TGGGAAGTTA	TACAGCTCTA	CAAGTCAAGA	AACATAGGAA	GACTGAGGCT
2451	TTATGATCCA	AATCATGGAG	CTTTACAAGC	ATTAAAAGGC	TCAAATATTG
25C1	AAGTTATGTT	AGGACTTCCC	AATTCAGATG	TGAAGCACAT	TGCTTCCGGA
2551	ATGGAACATG	CAAGATGGTG	GGTACAGAAA	AATGTTAAAG	ATTTCTGGCC
2501	AGATGTTAAG	ATTAAGTATA	TTGCTGTTGG	GAATGAAATC	AGCCCTGTCA
2551	CTGGCACATC	TTACCTAACC	TCATTTCTTA	CTCCTGCTAT	GGTAAATATT
2701	TACAAAGCAA	TTGGTGAAGC	TGGTTTGGGA	AACAACATCA	AGGTCTCAAC
2751	TTCTGTAGAC	ATGACCTTGA	TTGGAAACTC	TTATCCACCA	TCACAGGGTT
2801	CGTTTAGGAA	CGATGCTAGG	TGGTTTGTTG	ATCCCATTGT	TGGCTTCTTA
2851	AGGGACACAC	GTGCAOCTTT	ACTCGTTAAC	ATTTACCCCT	ATTTCAGTTA
2901	TTCTGGTAAT	CCAGGCCAGA	TTTCTCTCCC	CTATTCTCTT	TTTACAGCAC
2951	CAAATGTGGT	GGTACAAGAT Fig	GGTTCCCGCC . 43 (IY)	AATATAGGAA	CTTATTTGAT

3001 GCAATGCTGG ATTCTGTGTA TGCTGCCCTC GAGCGATCAG GAGGGGCATC 3051 TGTAGGGATT GTTGTGTCCG AGAGTGGCTG GCCATCTGCT GGTGCATTTG 3101 GAGCCACATA tgacaatgca gcaacttact tgaggaactt aattcaacac 31^1 GCTAAAGAGG GTAGCCCAAG AAAGCCTGGA CCTATTGAGA CCTATATATT 3201 TGCCATGTTT GATGAGAACA ACAAGAACCC TGAACTGGAG AAACATTTTG 3251 GATTGTTTTC CCCCAACAAG CAGCCCAAAT ATAATATCAA CTTTGGGGTC 330Π TCTGGTGGAG TTTGGGACAG TTCAGTTGAA ACTAATGCTA CTGCTTCTCT 3351 CGTAAGTGAG ATGTGAGCTG ATGAGACACT TGAAATCTCT TTACATACGT 3401 ATTCCTTGGA TGGAAAACCT AGTAAAAACA AGAGAAATTT TTTCTTTATG 3451 CAAGATACTA AATAACATTG CATGTCTCTG TAAGTCCTCA TGGATTGGTA 3501 TCCAGTGACG ATGCAACTCT GAGTGGTTTT AAATTCCTTT TCTTTGTGAT 3551 ATTGGTAATT TGGCAAGAAA CTTTCTGTAA GTTTGTGAAT TTCATGCATC 3601 ATTAATTATA CATCAGTTCC ATGTTTGATC AGATTGGGAT TTGGTAACTT 3651 CAATGTTTAG TTATTTATTA ATTAGTGTCT TTATCATTTG ACTATCAATT 3701 AATCTTTATT TGGCAAGGCT TGATATATTT GAGTTACTCT TAGGTATTTG Fig. 43 (V)

3751	CAAGCAACTG	ATCTTTCTTT	TATCCCGTTT	CTCCGTTAAA	CCTCATTAGA
3801	AATATATTAT	AATGTCACCT	ACTCTGTGGT	TTAAGACATT	CCCTTACATT
3851	ATAAGGTATT	TCACGTCGTA	TCAGGTCGAA	AAAAATAATG	GTACGCTCTT
3901	TCTTATCACA	AATTTCTCTC	AACTTCTAGA	CCAATTGAAT	CTTGTCTCCA
3951	ATAAGCATTG	CTTTTACTGT	ATGTTTCTCT	CTATCAATTC	AAGGCTCAAG
4001	CCATCAAATC	GCTTGGTATT	TCTCGCTCCC	ATTTAACCAA	TCGAGCTGTT
4051	AGCTCTGCTA	AAGTCTCATT	CTTCAGCTTC	TCAAACCACT	CAGAGCTTCT
4101	CCAACCAAAA	ATGTAGAAAA	AATCTTTGAT	CCACATGTAA	AACCCCAGAA
4151	TTGTCATTCG	AGTGAAGGAA	GGTGCTGGAA	ACGCGACATC	AAACACGGAT
4201	TTGCCAGCTG	ATTGTCATAG	GAAAAAGAAA	AGTTGATCAG	ATAGTTCGTG
4251	CGGGGTATTT	CCTACCTCGC	CTTTGATCAT	AGCTCTAGGC	TTGCGAAACT
4301	AAGTTATGCA	CGAGGCCCCC	TGCGAATCCA	TAAATCTAAG	AAGCATGCCA
4351	CAACAAACGG	GATAACTTCC	AGCTAAGAGA	TCTATTTTGA	TCTTACCCAC
4401	AAACTAGCTC	CGTGTGAATT	GTCCATTTCA	TCAACTCCAA	AGGCAGGAAA
4451	GAAGACTCTA	TTCAGAGAGC AGCAAAAGAG Fig 43 (VI)	CTC

GAGCTCCCTT GGGGGGCAAG GGCAAAACTT TTTGCTAAAT GGAAAAATAT 51 TATACCAAGT GTTTGTAATA GTTACTCAAT TTGAATTAAC AAAGGGGCAA 101 ATTTGACTAT TTTGCCCTTA TATCTTTTGG TCACAAAAAC ATAAAATATC 151 CCATCCGAAA TTCCAAATGG TCCATTATCG GCAAGTAGCT TTCTTTAATT 201 ATAGTTAGTT GACAAAACAC TATCAAGATA TCATTATTAT AATAATAACT 251 TCAAAGTCCA TCATCTTAGC TGCCTCCTCA GTAGAGCCGC CAGTAAAATA 301 AGAGCGATCA AATAAAAGCC GCCATTAAAA TAATGAATTT TAGGACTCTC 351 GATTGGCACG TAAGTGCCAA AACTCTTCCA ATACTTTGCT GCAACTTGGG 401 GCTGCTAGGT TCTGAGCTTC CAGATATGGG ATATTTCTAA GTTTATCTCC 451 TAATTTACAT CTCAACTAAT ATTAAGAAAT TAAACAGGTA CAGCAAATCA 501 TAAAATTTTC CTCTAAAGAA GACAATGAAT CCGGTTACTG ATTCATTGGC 551 CTTTTCAGAG TCTGCATGCC ATATTCACTA AGGGGTCGTT TGGTACAAGA 601 AATAATAATA ATAATTTCGG GATAGAATTT GAGATTGCAT TTATCTTGTG 651 TTTAATTATA AGTATTAGCT AATTTCAGAA TAAATTTTAC ACTAAAATAG

Fig 44 (I )

TAAAATCAAC TATCACATGT AGAAGGTGGA ATGGAATAGC GCCACTCACA TAGAATATCC TTATTTATCT CACTATTTTA GGTTAGTCTT CATGAGAATC CAGTATCCTC AATAAATGCA AGAAAATTTT CATTAAATCA ATTCATATAA TTTAAAAATA AGCACTTAAG ATACAATAAA AGATGTACCG TTAATAATAA AGAGTTTTAA ATAGGAAAAA AAAAACGGTT CGAGACACTC CGTTGTCTTC AAAGTAGATT CTCATTCATT GCTCTGGTGC TGACATCTTA CTCTTAAGAT ACAGCGAGCC ACTCTACAAT ATACTCAAAT GAAAGTTTTA GAGAACTTTC AAATCTCTCA AGGGAATTCA AAATACGACC AATATTTATT ACTTACTTAC ATGATATGAA TTTTATTTTA AATTTGAATT GAAAATATTA TTTAATATAA ACAATAGATA TCGCTAAGTA TTTACCACAA ACTACAGAAG ATTTTATTAT TTGTAACGAT GATTAAGCAG GGTTGTGCAG GATGAAAGAA AGTAACTAGC TATAATTTCT

Fig A (f

TAATCCCATA

CCAAATGATC

GTAAGAAGTT

TTAGATATGG

AAGATAAGAT

TTATGGAAGG

AATAGCAAAA

CTTCTATTGT

ACTACTTTTA

TTATAGTTAA

AATTACTTGA

ACATGGAGAT

CTATTCATCT

TTTGTAAAGT

CAAGATAGTA CGGCACCTTT ACTCATTTTC TTTTTTCCAC GGTCAGCCGG GGCGSCTCTT CCAATAATAT TCCACTCGAA TAAATAGCTC ATTGTTCATC TCTACCTCAG ATAAACATAA AGGATTACTA CTTGTTGCCA ATATTTGAAC TTCCGAGCCA AAATCTTAAT TTAGTTGATA TTGTGTTTTT TTCTCAAATT ATTTGCTCTT TTTTCGGGTA GGGAGGGCGG TGAATCTAAA CATTTGATTT ATTGGCTAGA CACATACACC GACCTGAGTC

GGANNAAATA TAAAACTTGT AAAATGATCA AGTTGACATG AACTTCATTA GCCTACGAAT TATTTACATT TACACAAGGC TTAATTCTTC CAACAAGTCT TACTCCTCAA ATGGCTGCTA GCACCATTGA GATAGCAGGT AAAATATTGT CTTATAATTT GTTATTTGCT TATTTTTCTT TACTTGCACT ATATTCATTT ACACTCACTC ACAAGCTTTT ATTTGAAATT TATGAGTTTA CGTCTATTAG TTGTATAGTA AAAGCTATTA GGTTCGTATT

ACATCATCAA

TTAATAGCCA

AACAAATACT

TATCTCAATA

TCTCATCATG

TCACACTGCT

TTCTGGTCAA

TGTTGGTGCA

ATCAAATTGC

AGCGATAGTT

CAAATTTGAG

GACTAGTGTC

AATCTTTTAA

AACACATAAC

Fig LL (III)

2101	ACATATTCCC	TCTGTTCTAA	TTTATGTGAC	ACACTTTCTG	TTAGTTTCTT
2151	CCAAAGAGAA	TGACATATTT	GATATTTAAA	AATATTTTAA	CTTTAAACTT
2201	TTTATTCTCA	ACCTTTTATA	ACATCACAAA	TATTATGGAA	CATATTAGAC
2251	TACAAGTTCC	AAATATCTTA	TAGTCTGTAC	AAATATTATA	GCATGTTTAA
2301	TAACACAATT	TTCACATTCT	TCTTTTTCTT	AAACTTTGTG	CCGAATTAAA
2351	TTATGTCACA	TAAATTAAAA	TGGTTACATC	ATCCCCTAGT	GGAGGGACCT
2401	ACCATGTCTA	CTGTAAGTTT	TTAACTTTTC	AAGAATTACA	TAATTGATTT
2451	AGTTTCTAAC	ACTAATTCTA	ATTCTTATTG	AGCAGGGGCT	CAATCAATAG
2501	GTGTTTGCTA	TGGAATGCTA	GGCAACAACT	TGCCAAATCA	TTGGGAAGTT
2551	ATACAGCTCT	ACAAGTCAAG	AAACATAGGA	AGACTGAGGC	TTTATGATCC
2601	AAATCATGGA	GCTTTACAAG	CATTAAAAGG	CTCAAACATT	GAAGTTATGT
2651	TAGGACTTCC	CAATTCAGAT	GTCAAGCACA	TTGCTTCCGG	AATGGAACAT
2701	GCAAGATGGT	GGGTACAAAA	AAATGTTAAA	GATTTCTGGC	CAGATGTTAA
2751	GATTAAGTAT	ATTGCTGTTG GGAATGAAAT Fig.44 (IV)	CAGCCCTGTC	ACAGGCACAT
2801	CTTACCTTAC	CTCATTTCTT	ACTCCTGCCA	TGGTAAATAT	TTACAAAGCA
2851	ATTGGTGAAG	CTGGTTTAGG	AAACAACATC	AAGGTCTCAA	CTTCTGTAGA
2901	CATGACCTTG	ATTGGAAACT	CTTATCCACC	ATCACAGGGT	TCGTTTAGGA
2951	ACGATGCTAG	GTGGTTTACT	GATCCAATTG	TTGGGTTCTT	AAGGGACACA
3001	CGTGCACCTT	TACTCGTTAA	CATTTACCCC	TATTTCAGCT	ATTCTGGTAA
3051	TCCAGGGCAG	ATTTCTCTCC	CCTATTCTCT	TTTTACAGCA	CCAAATGTGG
3101	TAGTACAAGA TGGTTCACGC	CAATATAGGA	ACTTATTTGA	TGCAATGCTG
31^1	GATTCTGTGT ATGCTGCCCT	CGAGCGATCA	GGAGGGGCAT	CTGTAGGGAT
3201	TGTTGTGTCC	GAGAGTGGCT	GGCCATCTGC	TGGTGCATTT	GGAGCTACAT
3251	ATGACAATGC	AGCAACTTAC	TTGAGGAACT	TAATTCAACA	CGCTAAAGAG
3301	GGTAGCCCAA	GAAAGCCTGG	ACCTATTGAG	ACCTATATAT	TTGCCATGTT
3351	TGATGAGAAC AACAAGAACC	CTGAACTGGA	GAAACATTTT	GGATTGTTTT
3401	CCCCCAACAA GCAGCCCAAA	TATAATCTCA	ACTTTGGGGT	CTCTGGTGGT
3451	GTTTGGGACA GTTCAGTTGA	AACTAATGCT	ACTGCTTCTC	TCATAAGTGA

Fig 44 (V )

3501 3551 3601 3651 3701 3751 3801 3851 3901 39 51 4001 4051 Z 101 i 151

GATGTGAGAT

GAAAGCTTAG

TAACATTGCA

GCAACTCTGA

GCAAGAAACT

TGAATTTCAT

AGGATTTGGT

ATTTGACTCG

CGACTCTTAG

CGTTAACCCT

TAGAGCTTCA

GGACATTCTG

AAATAATGGT

AATTGAATCT

GAGACACTTG TAAAAACAAG CGTCTCTGTA GTGGTTTTAA TTCTGTAAGT GCACCATCAA AATTGCAAAG ATCAATTAAT GTAGTGGCAT CAT TAGAAAT AAATCGATTG TTACATTATA ACGCTCTTTC TGTCTCCAAT

Fi

AACTCTcm

AGAAAmAT

AGTCCTCATG

Arcccrrrrc

ΠΟΓΟΑΑΙΤΓ

TTATACATCT mAG^ATT

CmAATTGG tcaactgatc

ATATTATAAT

ACAACAGTTT

AGOTAmCA rrATCACAAA

AACTATTGCT g 44(VI)

ACATAAGTAT

TCTTCATGCA

GATTGTTATC mG^A^

CATGACTTTC mCCATGU

Μ^ΑΑ^ΑΟ

TAAGGCTTGA mCTeKAT

GTCACCTAAA

TGGAGTTACA

CGTCGTATCA mCTCTCAA mAGmAT

TGCTTAGATG

AGACACTAAA

CAGAGACGAT

TG^OmG tgatcacatt τGrcrττArc

TATATCGGAG

CCCATGTCTC

TCAGAGGTTT crownA

AGGTCGAATA

CTTCTAGACC

Grrrcrcrcr

1201 4251 4301 4 351 4401 4 451 4501 4 551 z 601 4651

ATCAATTCAA

TTAACCAATC

AAACCACTCA

ACATGTAAAA

ATGCAACGAA

ACTTGATTAG

AGCTTTAGGC

AAATCTGAGG

CTATTTGATC

AACTCCAAAG

GGCTCAAGCC

GAGCTGTTAA

AAGCTTCTCC

CCCCArAACC

CAAACACGGC

ATAGTTCOTO rTGCGAAACr

AGCATGCCAC rTACCCACTA

GCAGGAAAGA

ATCAAATCGC

CTCTGCTAAA

AACAAAAAAA

ATG^ATTCG mOCCACTC

CGGGGCAm

AAGTAGAACC

AGCAAAAAGG

ACTAGCTCTG

AGACTATTGA rτGGrArrrc

GrcτcArrcr

GTAGAAAAAA

AGTGAAGGAA

CHOWANO

CCTACCTCGC

TAAGGCCCCA rrAGcrτrcA

TGrGAArτGr

GAGAGCAGCA

TCGCTCTCAA reAGCneTC

ACmGATCC

GGrGcrrGAA

GTAAAAGAAA ^ΚΟΑ^Η

GCGAArCCGr

GArAAGAGAr

CCATTTCATC

AAAGAGCTC

Fig 44(ΥΠ)

1- 50 AAAAAAAAAA

-100 ATCACCAATG 101-150 GCTTGGCACA 151 -200 ATGCTGAAGA 201 -250 nAWA^CA 251 - 300 CTOGTOATGA 301 - 350 ACTTCTCACG 351-4OO AGGGTATTGC 401- 450 GAGGACCCAT 451 - 500 GCAATTOGAC 501-550 TACTATATCA 551 - 600 ACAAGCCATC 601 - 650 GCGGATCAGG 651 - 700 CARAACOGT

AAAAACATAA GAAAGTACAG GCAnOTm orrGrorGrr AGGCArroor υπΑκο^Α ATAGGAACGA CGGrAGArGr kca^oc^ CTC^A^C rAcrGCCCGr aggaaagaaa AAACTACTGG TOGATCCCTO mGTTAGGC AAAATGACCA CCAATTGACA AACCGAAATA AAGAGCTAGT TAACAACCCT TTCAAAACAG CTATA^H TTCCCACGAC GTTATCATCG CGGCGAArCG AOTACCAGOT GGAArrGAAr GTOGCATAGO

AGGAAAATGG AGTTTTCTGG TTTCCTGTTC TTAACAGGGA CGAGTGACTT GTTCAACGAG CCTGCCAATG GCTTCTACAC CTTTCCTGGT TTTGGAACTA TTGCTGCCTT TTTCGGTCAA AGTGCAGAAC CATTTACAGG GAGTGACAGA TATTATGGTA ACTATGAGAA AGCTGGAACT GATTTAGTGG CCACAGATGC TTGGATGACA CCACAGGACA GTCGTTGGAC TCCGTCTGCC TACGGTGTAA TTACCAACAT ACGGTAATGAC GCAGTGGAAG

Fig. 45(1)

701-750 ATCGAATTGG ATACTACAGG AGGTATTGTG GTATGTTAAA TGTTGCTCCG 751 -800 GGGGAAAACT TGGACTGTTA CAACCAAAGG AACTTCGGCC AGGGCTAGGC 801-850 TTCGTTACAT AGAATGCAGA TCATGTTATG TATACAAGTT ATATTTGTAT 851-900 TAATTAATGA ATAAGGGGAT TGTGTATCCA TTAAGAATTA GGTGAAATAT 901-950 TTCTGTTATT TGTCTTCTTG GGAAGAACCA ATAGCTCCTA TATATGAGGC 951- 0 GCTTTTAAGT GATGAGGCTA CTGCATTGAT GAAAACGAAA TTTCTATCCA

1001- 20 GAAATAAAAG TTCCTTGTCT

Fig. 45(11)

1- 50 CAGGTGCTCA AGCAGGAGTT TGTTATGGAA GGCAAGGGAA 51-100 TCTCCAGCAG ATGTTGTGTC GCTATGCAAC CGAAACAACA 101-150 GAGAATATAT GATCCTGACC AGCCAACTCT CGAAGCGCTT 151-200 ACATTGAGCT CATGCTAGGT GTCCCGAATC CGGACCTTGA 201250 GCTAGCCAAG CCAATNCAGA TACTTGGGTC CAAAACAATG 251- 300 TGGTAATGTC AAGTTCAGGT ATATAGCAGT TGGAAATGAA 301- 350 TAAATGAAAA CTCTAAGTAT GTACCTGTCC TTCTCAACGC 351- 400 ATTCAAACTG CCATATCTGG TGCTGGTCTT GGAAACCAGA 401 - 450 CACAGCTATT GAAACTGGAC TTACTACAGA CACTTCTCCT 451 - 500 GGAGATTCAA AGATGATGTT CGACAGTTTA TAGAGCCTAT 501- 550 CTAGTGACCA ATCGCGCCCC TTTGCTTGTC AACCTTTATC 551- 600 AATAGCAAAC AATGCAGATA TTAAGCTTGA GTATGCACTT 601 - 650 CTGAAGTTGT TGTAAATGAT AACGGAAGAG GATACCGAAA 651- 700 GCCATCTTAG ATGCCACATA CTCGGCCCTT GAAAAGGCTA

TGGATTACCA

TTCGTAGGAT

AGAGGCTCCA

GAATGTTGCT

TTAGGAACTA

GTTAGTCCCT

CATGCGAAAC

TCAAAGTCTC

CCATCAAATG

CATCAACTTC

CTTACTTTGC

TTTACATCCT

CCTTTTTGAT

GTGGCTCGTC

Fig. 46(1)

701-750 TTTGGAGATT GTTGTATCAG 751- 800 AATTAACATC CATTGACAAT 801-850 CACGTGAAGG GAGGGAGTCC 851-900 GTTTTCGCTC TGTTTGATGA 901- 950 TTTTGGACTA TTTTCAGCAA 951- 0 ACTAGTTAAA AGCAAGAGGA

1001- 50 GTATGAAGAG AAAGTAGTCC 1051-100 TGCTCATAAA GAAAGCAGTT 11(01- 107 CCATCAA

AGAGTGGTTG GCCTTCAGCT GGAGCAGGAC GCCAGGACTT ataacaacaa cttgattagt CAAAAGGCTT CCGGTCCAAT AGAGACCTAC AGATCAGAAA GA(XCTGAAA TTGAGAAGCA ACATGCAACC AAAGTACCAG ATCAGTTTTA GAGCATTAAT AGGAATAAGG ACTTTCCTTT ATTGGCACTA TGTACTGAAA CTATATATCA ATTACAATAA TGAAACACTT ACAAGAAAAG

Fig. 46(11)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób regulowania transkrypcji dającego się regulować chemicznie genu w materiale roślinnym, znamienny tym, że A/ wyodrębnia się zasadniczo czystą, dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA z dającego się regulować chemicznie genu występującego w układzie naturalnym zawierającym ten gen, drogą aktywowania ekspresji RNA z dającego się regulować chemicznie genu w tym układzie, izolowania tego RNA, różnicującego skriningowania genomowego banku RNA generowanego z RNA wyizolowanego z tego zaktywowanego układu, jak również banku RNA generowanego z RNA wyizolowanego z układu kontrolnego, który nie był aktywowany, izolowania klonu genomowego, subklonowania dającego się regulować chemicznie genu z tego klonu genomowego i izolowania żądanej, dającej się regulować chemicznie sekwencji DNA, B/ wytwarza się dającą się regulować chemicznie chimerową sekwencję DNA zawierającą pierwszą, nie kodującą, dającą się regulować chemicznie komponentową sekwencję DNA wyodrębnioną w etapie A/, mającą zdolność regulowania transkrypcji powiązanej z nią sekwencji DNA w roślinie lub tkance roślinnej, gdzie ta regulacja zależy od regulatora chemicznego, i drugą komponentową sekwencję DNA mogącą podlegać transkrypcji jako RNA mający zdolność regulowania ekspresji cechy fenotypowej według mechanicznego anty-sensownego, albo mogącą podlegać transkrypcji i translacji w roślinie lub tkance roślinnej z wytworzeniem polipeptydu ujawniającego się cechą fenotypową, drogą ligacji pierwszej, nie kodującej, dającej się regulować chemicznie komponentowej sekwencji DNA z drugą komponentową sekwencją DNA, C/ transformuje się protoplasty roślin, komórki roślin, tkanki roślinne lub całe rośliny za pomocą chimerowej sekwencji DNA wytworzonej w etapie B/, stosując metody transformacji polegające na transformacji za pośrednictwem Agrobacterium, bezpośrednim przenoszeniu genów, mikroiniekcji lub bombardowaniu mikropociskami, wybiera się stransformowane komórki lub tkanki roślinne i E/ stosuje się regulator chemiczny na tkankę roślinną, roślinę lub nasiona, zawierające chimerową sekwencję DNA z etapu B/.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA uzyskuje się z układu naturalnego stanowiącego roślinę w następujących etapach: aktywuje się w tej roślinie ekspresję poliA + RNA z dającego się regulować chemicznie genu, izoluje się ten poliA + RNA, konstruuje się bank cDNA z tego poli + RNA, różnicująco skrininguje się ten bank cDNA wobec cDNA generowanego z RNA pochodzącego z roślin kontrolnych, które nie były aktywowane, izoluje się klony cDNA, które dają się regulować chemicznie, izoluje się klon genomowy zbanku genomowego tej rośliny, z zastosowaniem jako sondy klonu cDNA z poprzedniego etapu, subklonuje się dający się regulować chemicznie gen z tego klonu genomowego, i izoluje się żądaną, dającą się regulować chemicznie sekwencję DNA.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, ze jako gen dający się regulować chemicznie stosuje się gen dla białka PR.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że gen dla białka PR aktywuje się induktorem chemicznym lub patogenem w pierwszym etapie podanym w zastrz. 2.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako induktor chemiczny stosuje się kwas benzoesowy, salicylowy, acetylosalicylowy, poliakrylowy, benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowy, benzo-l,2,3-tiadiazolotiokarboksylowy, cyjanobenzo-1, 2,3-tiadiazol, amid kwasu benzo-1,2,3tiadiazolokarboksylowego, hydrazyd kwasu benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowego lub kwas dwuchloroizonikotynowy względnie pochodne tych związków.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze jako regulator chemiczny stosuje się kwas benzoesowy, salicylowy, acetylosalicylowy, poliakrylowy, benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowy, benzo-l,2,3-tiadiazolotiokarboksylowy, cyjanobenzo-1, 2,3-tiadiazol, amid kwasu benzo-1,2,3tiadiazolokarboksylowego, hydrazyd kwasu benzo-l,2,3-tiadiazolokarboksylowego lub kwas dwuchloroizonikotynowy względnie pochodne tych związków.

162 317
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze regulator stosuje się na tkankę roślinną, roślinę lub nasiona, w których pierwsza komponentowa sekwencja DNA w chimerowej sekwencji DNA jest sekwencją dającą się indukować chemicznie w genie PR albo sekwencją o zasadniczej homologii do tej sekwencji.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze regulacji chemicznej poddaje się gen dający się regulować chemicznie, kodujący cechą fenotypową taką jak stadium rozwoju, sterylność, odporność na choroby, odporność na szkodniki, tolerancja lub odporność na środki chwastobójcze, wytwarzanie wtórnego metabolitu i wytwarzanie markera będącego enzymem dającym się oznaczyć.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że regulacji poddaje się gen kodujący wytwarzanie markera enzymatycznego, którym jest lucyferaza (LUX), acetylotransferaza chloramfenikolu (CAT), fosfotransferaza neomycynowa (NPT), syntetaza nopalinowa (NOS), syntetaza oktopinowa (OCS), β-1,3-glukuronidaza (GUS), syntetaza acetohydroksykwasowa (AH AS) lub endotoksyna Bacillus thuringiensis (BT).
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, ze regulacji poddaje się gen kodujący wytwarzanie markera enzymatycznego, którym jest β-1,3-glukuronidaza (GUS), syntetaza acetohydroksykwasowa (AHAS) lub endotoksyna Bacillus thuringiensis (BT).