DD283647A5

DD283647A5 - Verfahren zur regulierung der transkiption eines chemisch regulierbaren gens in pflanzlichem material

Info

Publication number: DD283647A5
Application number: DD89326307A
Authority: DD
Inventors: John Ryals; Alice Montoya; Christian Harms; John Duesing; Christoph Sperisen; Fred Meins; George Payne
Original assignee: Ciba-Geigy Ag,Ch
Priority date: 1988-03-08
Filing date: 1989-03-06
Publication date: 1990-10-17
Also published as: PL162317B1; PL278117A1; ZA891726B

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Regulierung der Transkription eines chemisch regulierbaren Gens in pflanzlichem Material, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man innerhalb eines natürlich vorkommenden Systems eine im wesentlichen reine, nicht-kodierende, chemisch regulierbare DNA-Sequenz, die in der Lage ist, die Transkription einer assoziierten DNA-Sequenz innerhalb einer Pflanze oder eines pflanzlichen Gewebes zu regulieren, wobei besagte Regulation von der Gegenwart eines chemischen Regulators abhängig ist, aus einem chemisch regulierbaren Gen, das innerhalb dieses natürlichen Systems vorliegt, isoliert, b) eine chimäre chemisch regulierbare DNA-Sequenz herstellt, c) pflanzliche Protoplasten, Zellen, Gewebe oder ganze Pflanzen mit der chimären DNA-Sequenz transformiert, d) transformierte Zellen oder Gewebe selektiert; und e) einen chemischen Regulator auf pflanzliche Zellen, Gewebe oder ganze Pflanzen und/oder deren Samen. welche die chimäre DNA-Sequenz enthalten, Appliziert.{Regulierung; Transkription; Gen chemisch regulierbar; Material pflanzlich; DNA-Sequenz, chemisch regulierbar; chimär; Transformation; Selektion; Regulator chemisch; Pflanzen applizieren}

Description

Verfahren zur Regulierung der Transkription eines chemisch regulierbaren Gens in pflanzlichem Material

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Regulierung der Transkription eines chemisch regulierbaren Gens in pflanzlichem Material*

Anwendungsgebiete sind die Gentechnik, die Landwirtschaft und die Biotechnologie *

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Portschritte in der Rekombinant-DNA-Technik, verbunden mit Portschritten in der Pflanzentransformations- und -regenerationstechnik, haben es möglich gemacht, neues genetisches Material in Pflanzenzellen, Pflanzen oder Pflanzengewebe einzuführen, und damit neue Merkmale, z» B. Phänotypen, einzuführen, wodurch sich der Wert von Pflanzen oder Pflanzengewebe erhöht. Jüngste Demonstrationen von durch Gentechnik geschaffenen Pflanzen, die resistent gegen Pathogene (EP-A 240 332 und SP-A 223 452) oder Insekten (Vaeck, M. u. a., Nature 328, 33 (1987)) sind, und die Erzeugung von herbizid-toleranten Pflanzen (DeBlock, IvL u. a., ЕТ.ШО J. 6, 2513 (1987)) unterstreichen die Möglichkeiten für die Srnteertragssteigerung« Die Zielkulturen können von Bäumen und Büschen bis zu Zierblumen und Feldfrüchten reichen. Tatsächlich ist klar, daß die "Prucht" die Kultur eines Pflanzengewebes sein kann, die in einem Bioreaktor als Quelle für ein llaturprodukt gezogen wurde«

A. Allgemeiner Überblick über die Technik der Pflansentransfonnation

In Fachkreisen sind verschiedene Methoden bekannt, um die genetische Transformation ston Pflanzen mad PfIanζengewebe vorzunehmen (d* h., die stabile Einführung von Fremd-DITA in Pflanzen) Dazu gehören die Transformation durch die Spezies Agrobacterium und die Transformation durch direkten Gen-Transfer.

^|nsfc.rm|;tignen

Lz. tumefaciens ist das ätiologische Agens von Kronenkahlheit, eine Krankheit mit starker Verbreitung bei Dikotylen und Nacktsamern, die zur Bildung von Tumoren oder Wucherungen an der Infektionsstelle im Pflanzengewebe führt« Agrobacterium, das die Pflanzen normalerweise an wunden Stellen infiziert, enthält ein großes extrachromosomales Element, das als Ti-Plasmid (tumurinduzierendes Plasmid) bezeichnet wird.

Ti-Plasmide enthalten zwei für die Tumorogenizität erforderliche Regionen» Eine Region ist die T-DNA (transferierte DNA), welches die DNA-Folge ist, die letztlich als stabil auf die genomische Pflanzen-DNA übertragen festgestellt wird* Die andere für die Tumorogenizität erforderliche Region ist die vir-Region (Virulenz), die in den Transfer-Mechanismus impliziert wurde«, Obwohl die vir-Region für eine stabile Transformation absolut erforderlich ist, wird die vir-DNA nicht tatsächlich auf die infizierte Pflanze übertragen« Es gibt bereits Dokumentationen über die Transformation von Pflanzenzellen, die durch Infektion mit Agrobacterium tumefaciens und die anschließende Übertragung allein der T-DNA vermittelt wurde* Siehe beispielsweise Bevan, M₈ W. und Chilton, M-D., Int. Rev. Genet. 16, 357 (1982),

Nach mehreren Jahren intensiver Forschung in zahlreichen Labors wurde das Agrobacterium-System so ausgebaut, daß es die routinemäßige Transformation einer Reihe von Pflanzengewebe ermöglicht« Zu den repräsentativen, auf diese Weise transformierten Geweben gehören Tabak, Tomaten, Sonnenblume, Baumwolle, Rübsamen, Kartoffel, Sojabohne und Pappel. Ea ist zwar bekannt, daß der Wirtsbereich für die Ti-Plas-

mid-Transformation unter Verwendung von A^ tumafaciens als infizierendem Agens sehr groß ist, wegen der Einfachheit der Manipulation wurde jedoch Tabak als Wirt gewählt.

Auch Agrobacterium rhizogenes wurde als Vektor für die Pflanzentransformation verwendet. Dieses Bakterium, das die Haarwurzelbildung bei vielen zweikeimblättrigen Pflanzenspezies anregt, weist ein großes extrachromosomales Element auf, das als Ri-Plasmid (root-jLnducing - wurzelinduzierend) bezeichnet wird und analog zum Ti-Plasmid von iU_ tumefaciens funktioniert. Die Transformation unter Verwendung von A^ rhizog;enes wurde analog zu der mit A^ tumefaciens entwickelt und wurde erfolgreich angewendet, um beispielsweise Luzerne, Solanum nigrum Iu und Pappel zu transformieren·

2. D irjkj; er_ G en₌ Transfer

Es wurden mehrere sogenannte direkte Gen-Transfer-Verfahren entwickelt, um Pflanzen und Pflanzengewebe ohne die Verwendung des Agrobacterium-Vermittiers zu transformieren. Bei der direkten Transformation von Protoplasten kann die Aufnahme des exogenen genetischen Materials in ein Protoplast durch die Anwendung eines chemischen Agens oder eine elektrischen Feldes verstärkt werden» Das exogene Material kann dann in das Kerngenom integriert werden. Die ersten Arbeiten wurden an der Dikotyle Tabak vorgenommen, wobei gezeigt wurde, daß die Fremd-DNA in Nachkommenpflanzen einbezogen und übertragen wurde, siehe z» B. Paszkowski, J₈ u* a_e, EMBO J*

3, 2717 (1984), und Potrykus, I. u_e a., Mol. Gen. Genet. 199, 169 (1985)«

ltfach diesem Verfahren wurde auch monokotyle Protoplaste übertragen, beispielsweise bei Triticum monoсоссum, Lolium Multiflorum (italienisches Reihergras), Mais und schwarzem mexikanischen Zuckermais.

Als Alternative dazu kann exogene DUA durch Mikroinjektion in Zellen oder Protoplästen eingeführt werden« Eine Lösung von Plasmid-ША wird mit einer fein gezogenen Glasnadel direkt in die Zelle injizierte Auf diese V/eise wurden Luzerne-Protoplasten durch eine Reihe von Plasmiden transformiert, siehe z« B_e Reich, Τ« J, u. a«, Bio/Technology 4, 1001 (1986),

Ein erst in jüngster Zeit entwickeltes Verfahren für den direkten Gen-Transfer sieht das Bombardement von Zellen durch Mikroprojektile, welche die DUA tragen, vor, siehe Klein, T* M. u„ a., Uature 327s 70 (1987). Bei diesem Verfahren werden WoIframteilchen, die mit der exogenen DNA überzogen sind, zu den Zielzellen hin beschleunigt, was zumindest zur transienten Expression bei dem angegebenen Beispiel (Zwiebel) führt«

B. Regeneration von transformiertem Pflanzengewebe

Ebenso wie es eine Vielzahl von Methoden für die Transformation von Pflanzengewebe gibt, gibt es auch eine Vielzahl von Methoden für die Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengewebe. Die jeweilige Regenerationsmethode ist vom Ausgangspflänzengewebe und der zu regenerierenden jeweiligen Pflanzenspezies abhängige In den letzten Jahren ist es möglich geworden, zahlreiche Pflanzenspezies aus Callusgewebe, das von PfIanzenexplantaten abgeleitet wurde, zu regenerieren» Zu den Pflanzen, die aus Callus regeneriert werden können, gehören Monokotyle, wie Mais, Reis, Gerste, Weizen und Roggen, und Dikotyle, wie Sonnenblumen, Sojabohnen, Baumvrolle, Rübsaat und Tabak«

Die Regeneration von Pflanzen aus Gewebe, das mit A. tumefaciens transformiert war, wurde bei mehreren Pflanzenspezies demonstriert*

Dazu gehören Sonnenblume, Tomate, Weißklee, Rübsamen, Baumwolle, Tabak und Pappel« Die Regeneration von Luzerne aus Gewebe, das mit A. rhizogenes transformiert v/orden war, wurde auch demonstriert» Die Pflanzenregeneration aus Protoplasten ist eine besonders brauchbare Methode, siehe Evans, D_e A» u« a· in "Handbook of Plant Gell Culture" (Handbuch der Pflanzenzellkultur), Bd. 1, MacMillan Publ„ Co*, 1983, S* 124» Wenn eine Pflanzenspezies aus Protoplasten regeneriert werden kann, können Methoden des direkten Gen-Transfers angewendet werden, und die Transformation ist nicht von der Verwendung von A» tumefaciens abhängig« Die Regeneration von Pflanzen aus Protoplasten wurde für Reis, Tabak, Rübsamen, Kartoffel, Aubergine, Gurke, Pappel und Mais demonstriert.

Die technischen Fortschritte in der Pflanzentransformations- und -regenerationstechnik unterstreichen die Möglichkeiten der Kulturverbesserung durch Gentechnik* Es gibt Berichte über genetisch manipulierte Tabak- und Tomatenpflanzen, die resistent gegen Infektionen von beispielsweise dem Tabakmosaikvirus (TMV) und resistent gegen verschiedene Klassen von Herbiziden sind« Durch gentechnische Maßnahmen wurde bei Tabak- und Tomatenpflanzen Insektenresistenz entwickelte

G, Zellkulturen

Das Potential der genetischen Technik ist nicht auf !feldfruchte beschränkt, sondern schließt Verbesserungen an Zierpflanzen, Futterfrüchten und Bäumen ein« Ein weniger augenfälliges Ziel der Pflanzen-Biotechnik, die sowohl Anwendungen der Gentechnik als auch von Gewebekulturen einschließt, ist die verstärkte Produktion einer enormen Vielfalt von chemischen Verbindungen, die

von Pflanzen abgeleitet werden, einschließlich Geschmacksstoffe, Aromastoffe, Pigmente, natürliche Süßungsmittel, industrielle Ausgangsstoffe, Antimikrobiotika und Pharmazeutika. In den meisten Fällen gehören diese Verbindungen zu einer ziemlich breiten Stoffwechselgruppe, die zusammen als Sekundärprodukte bezeichnet werden. Pflanzen können solche Sekundärprodukte erzeugen, um potentielle Räuber abzuwehren, Bestäuber anzulocken oder infektiöse Krankheiten zu bekämpfen»

Pflanzenzellkultüren können von einer beeindruckenden Vielfalt von Pflanzenspezies gewonnen und in einem Bioreaktor vermehrt werden« Zu den typischen Pflanzenspezies gehören die meisten der Pflanzen, die Sekundärprodukte von kommerziellem Interesse erzeugen» Bei einer Reihe von landwirtschaftlich wichtigen Kulturpflanzen wurde eindeutig nachgewiesen, daß stabile genetische Varianten, die aus der Gewebekultur von somatischen Pflanzenzellen (somaklonale Variation) hervorgegangen sind, induziert und selektiert werden können_e Aus der Pflanzengewebekulturproduktion von Selmndärverbindungen ergeben sich zahlreiche Vorteile« Dazu gehören (1) die Möglichkeit einer verbesserten Reinheit des resultierenden Produkts, (2) die Umwandlung von billigen Vorläufern in teure Endprodukte durch Biotransformation und (3) die Möglichkeit der Zuführung von Substratanalogen in die Kultur, um neuartige Verbindungen zu schaffen«,

D„ Vorteile der gesteuerten Gen-Expression

Ob es das Ziel der Gentechnik bei einer Pflanze ist, eine Feldfrucht, einen Zierstrauch, eine Blume, einen Baum oder eine Gewebekultur zum Einsatz in einem Bioreaktor zu manipulieren, immer wird man als einen Hauptvorteil die Steue-

rung der Expression des schimärischen Gens erkennen, so daß dieses nur zum entsprechenden Zeitpunkt und im entsprechenden Umfang und, in einigen Situationen, nur in bestimmten Teilen der Pflanze erpressiert wird. Beispielsweise kann es, um einen wünschenswerten Phänotyp zu erhalten, erforderlich sein, das schimärische Gen mit Werten von 1 % des Gesamtproteins oder mehr zu expressieren* Das kann durchaus der Fall sein "bei Pilzresistenz durch schimärische Chitinase-Expression oder bei Insektenresistenz durch erhöhte Proteinase-Inhibitor-Expression· In diesen Fällen kann die Energie, die zur Erzeugung hoher Werte des Fremdproteins verbraucht wird, zu einer Schädigung der Pflanze führen, während die Energieableitung und damit die Ertragsminderung verringert werden könnten, wenn das Gen nur dann expressiert wird, wenn das wünschenswert ist, beispielsweise bei einem imminenten Pilzoder Insektenbefall.

Andererseits könnte der durch das schimärische Gen expressierte Phänotyp zu schädlichen Auswirkungen auf die Pflanze führen, wenn die Expression zu einem ungeeigneten Zeitpunkt in der Entwicklung erfolgt. Wenn das schimärische Gen-Produkt beispielsweise ein Pflanzenhormon wäre, das die Ablösung der Schale induziert, könnte eine frühzeitige Expression die Ablösung der Frucht von der Pflanze bewirken, bevor der Samen ausgereift ist, was zu einem verminderten Ertrag führen würde,, In diesem Fall wäre es viel vorteilhafter, die Expression dieses Typs von Gen zu einem Zeitpunkt zu induzieren, an dem die Schalenablösung vorteilhaft oder wenigstens unschädlich für die Pflanze ist.

Bei Gewebe in Kultur oder in einem Bioreaktor könnte die unzeitgemäße Produktion eines Sekundärproduktes zu einer

Verringerung der Y/achstumsrate der Kultur führen, was in einer Verringerung im Ertrag des Produkts resultieren würde. Es wäre daher vorteilhaft, die Kultur ohne Expression des Sekundärproduktes wachsen zu lassen und dann das chimära Gen zu einem geeigneten Zeitpunkt zu induzieren, um eine optimierte Expression des gewünschten Produktes zu ermöglichen.,

Angesichts solcher wie auch anderer Erwägungen, ist es offensichtlich, daß die Steuerung des Zeitpunkts, des Umfangs und/ oder der Stelle der Expression des Chimären Gens in Pflanzen oder Pflanzengewebe äußerst wünschenswert wäre* Eine Steuerung, die leicht auf dem Feld, im Gewächshaus oder im Bioreaktor erfolgen könnte, wäre von besonderem kommerziellen V/ert.

E_e Bekannte regulierbare Gen-Expressionssysteme bei Pflanzen

Es ist bekannt, daß verschiedene Pflanzengene durch verschiedene innere und äußere Paktoren, einschließlich Pflanzenhormone, Wärmeschock, Chemikalien, Pathogenen Mangel an Sauerstoff und Licht, induziert werden. Es wurden einige dieser Systeme detailliert beschrieben, bei den am besten charakterisierten führt eine erhöhte Akkumulation von mHNA zu einem erhöhten Wert des spezifishhen Proteinprodukts.

Als Beispiel für die Gen-Regulierung durch ein Pflanzenhormon wurde gezeigt, daß Abszissinsäure (ABA) die späten, überschießenden Embryogene si s-mRITA von Baumwolle induziert, siehe Galau, G* A. u. a., Plant Mol. Biol. 7» 155 (1986). Bei einem anderen Beispiel induziert Gibbere11insäure (GA3) Malatsynthasetranskripte in Rhizinusbohnensamen und Alpha-Atnylaseisozyme in Gerste-Aleuronschichten, siehe Rodriguez,

D_e u. a«, Plant MoI. Biol. 9, 227 (1987); Nolan, R* С« u. a., Plant MoI. Biol. 8, 13 (1987).

Die Regulierung von Wärmeschock-Protein-Genen von Sojabohnen wurde ausführlich untersuchte Die Behandlung der Pflanzen über mehrere Stunden bei 40° C führt zur cle novo-Synthese von mehreren sogenannten Wärmeschock-Proteinen (Key, J₈ u_e a., Proc. ITati. Acad, Sei. USA, 78, 3526 (1981))· Mehrere dieser Gene wurden isoliert und ihre Regulierung im Detail untersucht. Die Expression dieser Gene wird vorwiegend auf Transkriptionsebene gesteuert. Der Promoter des hsp70~ Gens wird mit dem Neomyzinphosphotransferase-II-Gen (Nptll-Gen) verschmolzen, und es wurde nachgewiesen, daß das chimäre Gen durch Wärmeschock induziert wird (Spena A. u« a., EMBO J_e 4_S 2736 (1985)), wenn auch mit einem geringeren Pegel als die endogenen Wärmeschock-Gene.

Zu einer anderen Klasse von induzierbaren Genen in Pflanzen gehören die lichtregulierten Gene, vor allem das nuklear-codierte Gen für die kleine Untereinheit von Ribulose-1,5-biphosphatkarboxylase (RUBISGO), Morelli, G. u. a. (Nature 315, 200 (1985)) und Hererra-Estella, L. u. a, (Nature 310, 115 (1984)) haben gezeigt, daß die 5^!-Flankierungssequenzen eines Erbsen-RUBISCO-Gens Lichtinduzierbarkeit auf ein Reporter-Gen übertragen können, wenn die Zuordnung in chimärer Weise erfolgt. Diese Peststellung wurde auf andere lichtinduzierbare Gene ausgedehnt, beispielsweise das Chlorophyll-a/b-Bindungsprotein*

Die Alkoholdehydrogenasegene (adh-Gene) von Mais wurden umfassend untersuchte Das adh1-s-Gen von Mais wurde isoliert, und es wurde gezeigt, daß ein Abschnitt der 5'-Flankierungs-DNA in der Lage ist, die Expression eines Chimären Re-

porter-Gens (ζ_β Β* Chloramphenikolazetyltransferase, CAT) zu induzieren, wenn das transient transformierte Gewebe anaeroben Bedingungen ausgesetzt wurde (Howard, E. u. a_e, Planta 170, 535 (1987)).

Ss wurde eine Gruppe von Chemikalien entwickelt, die als Safener (Zusatzstoff, der Reaktionen zwischen Bestandteilen von Wirkstoffgemischen verhindert) bekannt sind, um Kulturen vor potentiell schädlichen Anwendungen von Herbiziden zu schützen oder "sicher zu machen"» Zwar wurde noch kein allgemeiner Mechanismus für die Wirkung dieser Verbindungen entwickelt, aber die Regulierung von natürlich regulierbaren Genen durch solche Verbindungen ist ein möglicher Mechanismus* Kürzlich wurde berichtet, daß höhere Werte von Glutathion-S-Transferase (GSZ) in Mais induziert werden, der mit dem Safener 2-Chloro-4-(tri£luoromethyl)-5-methylthiazolkarboxylsäurebenzylester behandelt wurde, siehe Wiegand, Ro С. и» a., Plant Mol. Biol 7, 235 (1986). Zwar ist der Pegel der GST-mRWA nach der Behandlung mit dem Safener erhöht, über den dahin führenden Mechanismus wird jedoch nichts angegeben.

Viele Pflanzen werden, wenn sie hypersensitiv auf verschiedene Pathogene reagieren, zur Produktion einer Gruppe von säureextrahierbaren, pathogenesebezogenen (PR) Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht angeregt (Van Loon, L. C, Plant Mol. Biol 4, 111 (1985))о Von besonderem Interesse aber ist die Beobachtung, daß sich eben diese PR-Proteine zu hohen Werten in Pflanzen akkumulieren, die miü seihen Chemikalien wie Polyacrylsäure und Azetylsalizylsäure behandelt wurden (Gianinazzi, S. u. a., J. Gen_e Virol* 23, 1 (1974); White, R. F., Virology 99, 410 (1979))· Das Vorhandensein von PR-

Proteinen wurde mit der Induzierung einer lokalen wie auch einer systemischen Resistenz gegen einen breiten Bereich von Pathogenen in Verbindung gebracht«, Es wurde gezeigt, daß ein interspezifischer Tabakhybrid, der gegen den Tabakmosaikvirus (TIvIV) resistent ist, die PR-Proteine grundsätzlich expressiert (AhI, P* u. a., Plant Sei« Lett. 26, 173 (1982)), Außerdem zeigte die Immunoausfällung von in vitro-Translationsprodukten unter Verwendung von mRNA von TMV-infiziertem oder chemisch behandelten Tabak (Gornelissen, B* J_e C. u, a#, EMBO J* 5, 37 (1986); Carr, J· P, u. a., Proc. Natl. Acad* Sei* USA 82, 7999 (1985)), daß der erhöhte Pegel von PR-Protein ein Ergebnis von RUA-Akkumulation war» Daher stellt die Induzierung von PR-Protein-Genen durch Chemikalien oder Pathogene eine Methode dar, das Problem der chemisch regulierten Genexpression in Pflanzen und Pflanzengewebe in Angriff zu nehmen.

In einigen Fällen ist es wünschenswert, die Zeit und/oder das Ausmaß der Expression des eingeführten genetischen Materials in Pflanzen, Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe zu steuern. Eine Idealsituation wäre die Regulierung der Expression eines auf diese Weise eingeführten Merkmals, die bewußt und nach 7/illen über eine regulierende Zwischenstufe erfolgt, die leicht bei Feldfrüchten, Zierbüschen, Bioreaktoren usw. angewendet werden kann«

Ziel der Erfindung;

LIit der Erfindung wird ein Verfahren zur Regulierung der Transkription eines chemisch regulierbaren Gens in pflanzlichem Llaterial bereitgestellt, das es ermöglicht, die Zeit und/oder das Ausmaß der Expression des eingeführten genetischen Materials in Pflanzen, Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe zu steuern«,

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Regulierung der Transkription eines chemisch regulierbaren Gens in pflanzlichem Material zu entwickeln«

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Regulierung der Transkription eines chemisch regulierbaren Gens in pflanzlichem Material, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(a) innerhalb eines natürlich vorkommenden Systems eine im wesentlichen reine, nicht-kodierende, chemisch regulierbare DUA Sequenz, die in der Lage ist, die Transkription einer assoziierten DlTA Sequenz innerhalb einer Pflanze oder eines pflanzlichen Gewebes zu regulieren, wobei besagte Regulation von der Gegenwart eines chemischen Regulators abhängig ist, aus einem chemisch regulierbaren Gen, das innerhalb dieses natürlichen Systems vorliegt, isoliert, indem man

(i) innerhalb dieses natürlichen Systems die Expression von RIiA eines chemisch regulierbaren Gens aktiviert;

(II) besagte ESA isoliert;

(iv) ein differentielles "Screening" einer genomischen Genbibliothek durchführt, die sowohl aus RITA erzeugt wurde, welche zuvor aus diesem besagten aktivierten System isoliert wurde als auch aus RKA, welche zuvor aus einem nicht aktivierten Kontrollsystem isoliert wurde;

(iV) einen genomischen Klon isoliert;

(v) ausgehend von diesem genomischen Klon das chemisch regulierbare Gen subkloniert; und

(vi) die gewünschte chemisch regulierbare DlTA Sequenz isoliert;

(b) eine chimäre chemisch regulierbare DNA Sequenz herstellt, die aus einer ersten, gemäß Abschnitt (a) isolierten, nichtkodierenden, chemisch regulierbaren DHA Seqquenzkomponente zusammengesetzt ist, die in der Lage ist, die Transkription einer assoziierten DNA Sequenz innerhalb einer Pflanze oder eines pflanzlichen Gewebes zu regulieren, wobei besagte Regulation von der Gegenwart eines chemischen Regulators abhängig ist sowie aus einer zweiten DNA-Sequenzkomponente, die innerhalb einer Pflanze oder eines pflanzlichen Gewebes transkribierbar ist, indem man die erste, nichtkodierende, chemisch regulierbare DNA-Sequenzkomponente mit der zweiten Sequenzkomponente verknüpft;

(c) pflanzliche Protoplasten, Zellen, Gewebe oder ganze Pflanzen mit der Chimären DNA-Sequenz, gemäß Abschnitt (b) transformiert, unter Verwendung eines Transformationsverfahrens ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Agrobacterium-vermittelter Transformation, direktem Gentransfer, Mikroinjektion oder Mikroprojektil-Beschüß;

(d) transformierte Zellen oder Gewebe selektiert; und

(e) einen chemischen Regulator auf pflanzliche Zellen, Gewebe oder ganze Pflanzen und/oder deren Samen_s welche die chimäre DIfA-Sequenz gemäß Abschnitt (b) enthalten, appliziert,

Die Erfindung beinhaltet demzufolge (a) chemisch regulierbare DNA-Folgen, vorzugsweise in im wesentlichen reiner Form; (b) eine oder mehrere chemisch-regulierbare DNA-Folgen in Kombination mit einem oder mehreren Teilen, nicht aber allen einer der codierenden DNA-Folgen, denen die regulierbaren Folgen in natürlich vorkommenden Genen zugeordnet sind; (c) chimäre Gene, die ein

oder mehrere chemisch regulierbare ША-Folgen enthalten; (d) Vektoren, die Polgen oder Gene von (a), (b) oder/und (c) enthalten; (e) Pflanzen, Samen und Pflanzangewebe, welche die chemisch regulierbaren Chimären Gene enthalten, und (f) die chemische Regulierung von chemisch regulierbaren schimärischen Genen in Pflanzengewebe. Die Erfindung betrifft außerdem

ein Signalpeptid, eine DNA-Folge, welche das Signalpeptid codiert, und die im wesentlichen reinen Formen von verschiedenen natürlich vorkommenden, chemisch induzierbaren Genen,

Vorliegende Erfindung schließt außerdem verschiedene Anwendungen von chemisch regulierbaren DNA-Folgen ein: (a) Regulierung von schimärischen Genen in Zellen, die in einem Bioreaktor vermehrt werden; (b) eine Untersuchung auf chemische Regulatoren; (c)die Entwicklungsregulierung der Pflanze; (d) die Regulierung der Pflanzensterilität und (e) die Regulierung der schimärischen und/oder heterologen Genexpression in einer transformierten Pflanze« Andere Anwendungen und Vorteile werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen ersichtlich, in denen

Abbe 1 eine partielle Restriktionsendonukleasekartierung von Lambda-tobchrPR10i3 ist. Das rekombinante 49 kb-Phagengenom wird so dargestellt, daß die rechten und linken Arme von Lambda bezeichnet sind» Das 19 kb-Tabak-Insert ist unter der Lambda-Kartierung vergrößert» Bezeichnet sind die Lage des PR-1a-Gens (schraffierte Box) und die Transkriptionsrichtung (Pfeil)о P = Pst, H = Hindlll, C = CIaI, R = jScoRI«,

Abb* 2 die Konstruktion von pBS-PRIOWla aus Lambda tobchrPR1013 zeigt о Das 19 kb-DNA-Fragment zwischen den beiden Clal-Sequenzen wurde in das Bluescript-Plasmid subkbniert« C = GhI, LGT-Agarose = Agarose mit niedriger Gelierungstemperatur»

Abb» 3 die Konstruktion von pBS-PR1013ßco aus LambdatobchrPR1013 darstellt,, Das 3,6 kb-ScoRI-Fragment, welches

das PR-1A-Gen von Lambda ѢоЪспгРИЮІЗ enthält, wird in Bluescript subcloniert» R = EcöRI, LGT-Agarose = Agarose mit niedriger Gelierungstemperatur*

АЪЪ₈ 4 die Konstruktion von pBS-PRIO^Eco aus pBS-PRIOWIa zeigt. Das 3,6 kb-EcoRI-Fragment, -welches das PR-1a-Gen enthält, wird in die EcoRI-Sequenz des Bluescript-Plasmids subkloniert* C = CIaI, R = EcoRI, LGT = Agarose mit niedriger Gelierungstemperatur*

АЪЪ. 5 die Konstruktion von pBS-PR1013Eco&Pst aus pBS-PR1013ECO zeigt« Das 600 bp-Pstl-Fragment wird aus pBS-PR1013ECO-deletierto P = Pstl, R = EcoRI, X = Xhol, S = Sail, LGT-Agarose = Agarose mit niedriger Gelierungstemperatur ·

АЪЪ. 6 die Konstruktion von pBS-PR1013Eco£PstXho aus pBS-PR1013Eco^Pst zeigt. Das 2 кЪ-XhoI-Pragment wird aus dem Plasmid pBS-PR1013EcoAPst deletiert« R - EcoRI, P = Pstl, X = Xhol, S = Sail, LGT-Agarose = Agarose mit niedriger Gelierungstemperatur«.

АЪЪ* 7 die Konstruktion von pCIB270 aus ρΒΙ101*3 und pBS-PR1013Eco^PstAXho zeigt«, Das Pstl-Xhol-Pragment, das einen Teil des PR-1a-Genes und die 5'-Flankierungssequenz enthält, wird in Sall-BaraHI.-verdautes pBH101„3 subkloniert* Die Xhol- und Sall-Sequenzen sind kompatibel und zerstören, wenn sie ligiert werden, beide Restriktionsstellen» Die Pstl-Stelle ist einer BamHI-Stelle unter Verwendung eines Molekularadapters angepaßt. X = Xhol, P = Pstl, (X/S) = Stelle der Xhol- und Sall-Fusion* Keines der Enzyme wird nun an dieser (X/S)-Stelle geschnittene LB = T-DNA linker

Rand, RB = T-DlTA rechter Rand* Die Transkriptionsrichtung aus der PR-1a-induzierbaren Region wird durch den Pfeil an pGIB27O veranschaulicht. Der schraffierte Bereich an pCIB27O stellt die З'-Prozessierungsstelle des UOS-Gens dar. Der einfach schraffierte Bereich von pCIB27O stellt das Beta-Glukuronidase-Gen dar» Der punktierte Bereich von pCIB27O stellt das Neomyzinphosphotransferase-II-Gen dar_e Der gestreifte Bereich von pCIB27O stellt den NOS-Promoter dar.

Abb„ 8 die Konstruktion von M^raplS-PRIO^Sco^Pst^Sho und M13mp19-PR1013EcqAPst&Xho zeigt. Das Pstl-Asp718-I'ragraent, das einen Teil der PR-Ia-Codierungssequenz und die 5'-Flankier ungssequenz enthält, wird aus pBS-PR1013Eco£PstAXho in Asp718-PstI-verdautes M13mp18 oder 19 subkloniert. R = EeoRI, H = Hindlll, P = Pstl, K = Kpnl (Asp718 ist ein Isoschizomer von Kpnl), LGT-Agarose = Agarose mit niedriger Gelierungstemperatur*

Abb« 9 ein Ablaufschema der Umwandlung des ATG-Codons von PR-Ia in eine Ncol-Sequenz zeigt. Die einzelsträngige DNA von M13mp18-PR1013EcодРSt₁^XhO wird durch eine durchgezogene Linie gezeigt. Die Sequenz TCATGG wird durch sequenzgerichtete Mutagenese in CGATGG umgewandelt. K = Kpnl, X = Xhol, B = BstEII, P = Pstl*

Abb. 10 die Konstruktion von рСІВ2б8 zeigt«. Das BstEII-Pstl-Fragment, das von der replikativen Form von M13mp18-PR1013ΞcoдPstдXho.Nco abgeleitet wurde, wird in BstEII-Pstl-verdautes pBS-PR1013Eco^Pst/vXho subkloniert, um pCIB268 zu bilden* X = Xhol, B = BstEII, TS = Ncol, P = Pstl,

Abb. 11 die Konstruktion von рСІВ2б9 aus pBS-GUS1„2 und

PÖIB268 zeigt. Σ = Xhol, N = Ncol, P = Pstl. Die kreuzscliraffierte Box von рСІВ2б9 stellt die GUS-Genaequenzen dar, und die einfach schraffierte Box zeigt die Sequenzen, die vom PR-1a-Gen abgeleitet wurden«

Abb. 12 die Konstruktion von pBS-GUS1.2 zeigt» pBS-GUSI.2 wird über eine Dreiweg-Ligation aus Fragmenten hergestellt, die von pRAJ265, pBI221.1 und pBlueskript abgeleitet wurden. S = Sail, R = EcoRI, H = Nool.

Abb. 13 die Konstruktion von pCIB271 aus рСІВ2б9 und pCIB2OO zeigt. X = Xhol, Έ = NcqI, R = EcoRI, S = Sail, (S/X) = Fusion der Sail- und Xhol-Sequenzen, LGT-Agarose = Agarose mit niedriger Gelierungstemperatur*

Abb_e H die Restriktionsendonukleasekartierung von pCIB219 zeigt. Dieses Plasmid wird durch Hinzufügen eines EcoRI/ Xhol-Adapters zum pCIB269»XgoI/EcoRI-Fragment, welches das PR-1- und das GUS-Gen enthalt, und dessen Ligation in SaII-restriktiertes pCIB712 konstruiert»

Abbe 15 die Restriktionsendonukleasekartierung von pCIB272 zeigt. Dieses Plasmid wird durch Ligation eines Asp718I/ BamHI-Fragmentes von pCIB 282, das ein PR-1/GUS-Gen (-833 bis +1 von PR-Ia) enthält, in Asp718I/BamHI-restriktiertes pCIB2OO hergestellt.

Abb. 16 die Restriktionsendonukleasenkartierung von pCIB273 zeigt. Dieses Plasmid wird durch Ligation eines Asp718I/ BamHI-Pragmentes von pGIB283, das ein PT-1/GUS-Gen (-603 bis +1 von PR-Ia) enthält, in Asp718/BamHI-restriktiertes pCIB200 konstruiert.

АЪЪв 17 die Restriktionsendonukleasenkartierung von pCIB1OO4 zeigt» Dieses Plasmid wird durch. Ligation eines Xhol/Ncol-Fragmentes von рСІВ2б9 ( das den PR-Ia-Promoter enthält) mit dem BT-Gen, das aus pCIB1O/35Bt(6O7) als KcoI/BamHI-Pragment herausgeschnitten wurde, und Sall/BamHI-verdauten pCIB71O konstruiert»

Abb* 18 die Restriktionsendonukleasenkartierung von pCIB2OO/ PR1-BI zeigt. Dieses Plasmid wird aus pCIB1OO4 und pCIB2OO konstruierte

Abb. 19 die Restriktionsendonukleasenkartierung von pGIB12O7 zeigt«. Ein 5»8 kb-Xbal-Fragment des lambda-genomischen Klons, der das Arabidopsis-AHAS-Gen enthält, wird in das Xbal-restrierte Blueskript kloniert»

Abb« 20 die Restriktionsendonukleasekartierung von рСІВ121б zeigt. Ein 3_S3 kb-NcoI/Xbai-Fragment von pCIB1207 wird in рСІВ2б9 kloniert, das mit IIcoI und Zbal restriktiert worden ist, um das GUS-Gen zu entfernen«

Abb. 21 die Restriktionsendonukleasekartierung von pCIB1233 zeigt. Ein 4,2 кЪ-КрпІ/ХЪаІ-Fragment wird aus рСІВ121б isoliert und in pCIB200 ligiert, das mit Kpnl und Zbal restriktiert worden ist.

Abb. 22 die Restriktionsendonukleasekartierung von pBSGluc-39.1/GUS zeigt. Ein 1462 bp-Fragment von pBSGluc39.1 wird in pBS-GUS1_e2 kloniert, das mit Ncol und Kpnl restriktiert worden ist.

Abb. 23 die Restriktionsendonukleasekartierung von pGIB2OO/Gluc39.1-GUS zeigt. Ein Kpnl/Xbal-Pragment, welches

den. ß-Glukanasepromoter und das GUS-Gen enthält, wird aus pBSGluc39.1/GUS isoliert und in pCIB2OO ligiert, das mit Kpnl und Xbal restriktiert worden ist*

Abb. 24 die Restriktionsendonukleasekartierung von pCIB2OO/Gluc39«1-BT zeigt. Ein КрпІ/йсоІ-Fragment von pCIB1004, welches das BT-Gen enthält, ein Kpnl/Ncöl-Fragment von pBSGluc39.1/GUS und pCIB200, das mit Kpnl restriktiert und mit einer alkalischen Kalbsthymusphosphatase behandelt worden ist, werden ligiert_β

Abbe 25 die Restriktionsendonukleasekartierung von pBSGluc39e1/AHAS zeigt, das aus einem Hcol/Xbal-Fragment von pBSGluc39*1/GUS und einem 3*3 kb-Ncol/Xbal-Fragment von pCIB12O7, welches das AHAS-Gen enthält, konstruiert worden istβ

Abb«, 26 die Restriktionsendonukleasekartierung von pCIB2OO/Gluc39*1-AHAS zeigt. Ein Kpnl/Xbal-Fragment, welches den ß-Glukanasepromoter und das AHAS-Gen enthält, wird aus pBSGluc39*1/AHAS isoliert und in pCIB2OO ligiert, das mit Kpnl und Xbal restriktiert worden ist«

Abb. 27 die Restriktionsendonukleasekartierung von pBSGluc39*3/GUS zeigt. Ein 1677 bp-Pragment von pBSGluc39.3 wird in pBS-GUSI.2 kloniert, das mit Ncol und Kpnl kloniert worden ist»

Abb. 28 die Restriktionsendonukleasekartierung von pCIB200/Gluc39o3-GUS zeigt. Ein Kpnl/XbaI-Fragment, welches den ß-Glukanasepromoter und das GUS-Gen enthält, wird aus pBSGluc39«3/GUS isoliert und in pCIB200 ligiert, das mit Kpnl und Xbal restriktiert worden ist«

Abbe 29 die Restriktionsendonukleasekartierung von pCrB200/Gluc39o3-BT zeigt· Ein Kpnl»Wool-Fragment von pCIB1OO4, welches das BT-Gen enthält, ein Kpnl/Nсöl-Fragment von pBSGluc39.3/GUS und pCIB200, das mit Kpnl restriktiert und mit alkalischer Kalbsthymusphosphatase behandelt worden ist, werden ligiert.

Abb« 30 die Restriktionsendonukleasekartierung von pBSGluc39o3/AHAS zeigt, das aus einem Ncol/Xbal-Fragment von pBSGluc39»3/GUS und einem 3_S3 kb-lcoI/Xbal-Fragment von pCIB1207, welches das AHAS-Gen enthält, konstruiert worden ist»

Abb« 31 die Restriktionsendonukleasekartierung von pCIB2OO/Gluc39_e3-AHAS zeigt. Sin Kpnl/Xbal-Fragment, das den ß-Glukanasepromoter und das AHAS-Gen enthält, wird aus pBSGluc39.3/AHAS isoliert und in pCIB2OO ligiert, das mit Kpnl und Xbal restriktiert worden ist,

Abbe 32 die Restriktionsendonukleasekartierung von pCIB1208 zeigt«, Ein 5_S8 kb-Xbal-Fragment des genomischen Lambda-Iilons, welches ein mutiert es Arabidopsis-AHAS-Gen enthält, wird in das Xbal-restriktierte Blueskript kloniert_e

Abb. 33 die Restriktionsendonukleasekartierung von pCIB123O zeigt. Ein 3,3 kb-TJcoI/Xbal-Fragment von рСІВІ208 wird in рСІВ2б9 kloniert, das mit Ncol und Xbal restriktiert worden ist, um das GUS-Gen zu entfernen_e

Abb« 34 die Restriktionsendonukleasekartierung von pCIB1232 zeigte Ein 4,2 kb-Kpnl/Xbal-Fragment wird aus pCIB123O isoliert und in pCIB200 ligiert, das mit Kpnl und Xbal ligiert worden istβ

АЪЪ„ 35 eine Restriktionsendonukleasekartierung von pBSGluc39*1 /AHA-S-SuR zeigt, das aus einem Ncol-Xbal-Fragment von pBSGluc39-.1/GUS und einem 3,3 kb-HcoI/Xbal-Fragment von pCIB1208, welches das ABAS-Gen enthält, konstruiert worden ist β

АЪЪ_в 36 die Restriktionsendonukleasekartierung von pGIB200/Gluc39.1-AHAS-SuR zeigt« Ein Kpnl/Xbal-Fragment, das den ß-Glukanaseproraoter und das AHAS-Gen enthält, wird aus pBSGluc39_e1/AHAS-SuR isoliert und in pGIB200 ligiert, das mit Kpnl und Xbal restriktiert worden ist.

Abb. 37 die Restriktionsendonukleasekartierung von pBSGluc39e3/AHAS-SuR zeigt, das aus einem Ncol/Xbal-Fragment von pBSGluc39.3/GÜS und einem 3,3 kb-NcoI/Xbal-Fragment von pCIB1208, welches das AHAS-Gen enthält, konstruiert worden ist«

Abb„ 38 die Restriktionsendonukleasekartierung von pCIB2OO/Gluc39.3-AHAS-SuR zeigt« Bin Kpnl/XbaI-Fragment, das den ß-Glukanasepromoter und das AHAS-Gen enthält, wird aus pBSGluc39.3/AHAS-SuS isoliert und in pCIB2OO ligiert, das mit Kpnl und Xbal restriktiert worden ist.

Kurze Beschreibung der Sequenzen

Sequenz 1 legt die genomische DMA-Folge des 2 kbp-Fragmentes zwischen den Zhol- und Bglll-Stellen des Tabak-PR-1a-Gens offen. Der Pfeil etwa bei Nukleotid 903 kennzeichnet die Transkriptionsstartsteile, und die mit 207 und 313 gekennzeichneten senkrechten Pfeile identifizieren die 3nden der beiden unabhängigen cDUA-Klone. Offengelegt wird auch die Polypepxidsequenz, die durch den Codierungsabschnitt des Gens codiert wird«

Sequenz 2 legt die genomische DITA-Sequenz des Tabak-PR-1'-Gens und die Aminosäurefolge des Polypeptids offen, das durch den Codierungsbereich des Gens codiert wird«

Sequenz 3 legt die cDNA-Folge von Gurken-PR-Chitinase und die Aminosäurefolge des Polypeptids offen, das durch den Codierungsbereich des Gens codiert wird*

Sequenz 4 legt die сША-Folge der Hauptform des Tabak-PR-R-Gens offen, und (4a) legt sowohl die Folge {%) als auch die Aminosäurefolge des Polypeptids offen, das durch den Codierungsbereich des Gens codiert wird.

Sequenz 5 legt die genomische ША-Folge des basischen Tabalcß-1,3-Glukanase-Gens offen, das im Klon pBSGluc 39*1 enthalten ist«,

Sequenz 6 legt die genomische DNA-Folge des basischen Tabakß-1,3-Glukanase-Gens offen, das im Klon pBSGluc39»3 enthalten ist«,

Sequenz 7 legt die cDNA-Folge des Tabak-PR-Q offen, das im Plasmid pBScht15 enthalten ist„

Sequenz 8 legt die DMA-Folge einer isolierten сША offen, die .im Plasmid pBSGL6e enthalten ist«, Die cDliA codiert die saure Form von ß-1,3-Glukanase*

Vorliegende Erfindung beschreibt die Isolierung, Klonierung und Identifizierung von DNA-Folgen, welche die Transkription einer zugeordneten DUA-Folge in Pflanzengewebe regulieren

können, wobei die Regulierung von einem chemischen Regulator abhängig ist_β Diese DMA-Folgen können dazu genutzt werden, schimärische Gene zu konstruieren, in denen die Expression des Gens durch solche Regulatoren oder Regler reguliert werden kann« Die Fähigkeit, die Expression eines schimärischen Gens in einer transgenen Pflanze durch eine chemische Methode zu regulieren, ist nützlich bei der Erlangung einer geeigneten Expression des phänotyplachen Merkmals bei minimalen schädlichen Auswirkungen auf das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze» Diese Regulierung ist wichtig bei der Produktion von Sekundärprodukten oder anderen klonierten Produkten in Pflanzengewebe in der Kultur oder in Beioreaktoren. Die Regulierung der klonierten Sequenz ist auch bei der Regulierung anderer Gen-Produkte durch einen "anti-sense"-Mechanismus.

Die Expression einer gegebenen Codierungssequenz zu einem bestimmten Zeitpunkt kann unter Verwendung eines chemischen Reglers reguliert werden, der im typischen Fall auf Pflanzengewebe aufgebracht wird,, Gene, die bei der Steuerung distinktiver Entwicklungsübergangsstufen eine Rolle spielen, können ebenfalls durch Zuordnung einer chemisch regulierbaren DNA-Folge zu einer geeigneten codierenden DNA-Folge reguliert werden« Auf diese Weise kann die Entwicklung einer Pflanze in einer bestimmten Stufe angehalten werden, bis der Pegel eines chemischen Reglers erhöht _y oder bei einer spezifischen Rate beschleunigt werden, wenn der Pegel eines chemischen Reglers gesenkt wird*

Die chemisch regulierbaren DNA-Folgen können dazu genutzt werden, die Expression von Fremdgenen anzutreiben, die beispielsweise Herbizidresistenz oder -toleranz übertragen (z. B= Atrazintoleranz bei Sojabohnen), Insektenresistenz

übertragen (ζ* B„ Bacillus thuringiensis-Kristallprotein bei Baumwolle) oder selektive Expression verlangen (wie männliche oder weibliche Sterilität)« Die chemisch regulierbaren DNA-Folgen können auch genutzt werden, um die Transkription einer DNA-Folge anzutreiben, welche die Expression einer zweiten Codierungssequenz durch einen "anti-sense"-Mechanismus steuert»

Die vorliegende Erfindung beinhaltet demzufolge:

aβ ein schimärisches Gen, dessen Expression in Pflanzengewebe durch einen chemischen Regler reguliert wird»

b_e Im wesentlichen reine, chemisch regulierbare DbTA-Polgen, welche die genetische Aktivität von anderen DNA-Folgen in Pflanzengewebe in Reaktion auf einen chemischen Regler steuern können*

c. Chemisch regulierbare DNA-Polgen in Kombination mit einem Teil, nicht aber der Gesamtheit einer codierenden DNA-Folge, mit der sie in natürlich vorkommenden Genen assoziiert sind-,

d. Vektoren, welche die chemisch regulierbaren DNA-Polgen mit den oder ohne die anderen Teile von natürlichen vorkommenden Genen, in denen sie vorkommen können, enthalten»

e. Vektoren, welche die schimärischen Gene enthalten,

f. Pflanzengewebe, Pflanzen und Samen, die von Zellen abgeleitet wurden, die durch diese Vektoren transformiert wurden.

g_e Verfahren der chemischen Regulierung der Expression von DITA-Codierungsfolgen, die den chemisch regulierbaren DNA-Folgen zugeordnet sind, um beispiels7/eise ein phänotypisches Llerlonal zu regulieren«

h. Verfahren zur Identifizierung neuer chemischer Regler unter Anwendung der schimärischen Gene dieser Erfindung und von Pflanzengewebe, in welchem diese enthalten sind»

i. Signalpeptidfolgen in Proteinen₉ die durch chemisch regulierte Gene codiert sind«

j« Im wesentlichen reine, pathogenese-bezogene Protein-Gene« Definitionen

Um ein klares und folgerichtiges Verständnis der Patentbeschreibung und der Patentansprüche, einschließlich des darin gegebenen Rahmens, zu ermöglichen, v/erden die folgenden Definitionen gegeben:

"Anti-sense"-Mechanismus; Ein Mechanismus zur Gen-Regulierung auf der Grundlage der Steuerung der Translationsrate der mRNÄ auf das Protein auf Grund des Vorhandenseins eines RHA-Moleküls in einer Zelle, welches komplementär zu wenigstens einem Abschnitt der translaterierten тША ist*

Assoziierte oder zugeordnete DNA-Folge: Eine DNA-Folge, deren Zellaktivität entweder (1) die Aktivität einer anderen DNA-Folge reguliert oder (2) durch eine andere DUA-Folge re-

guliert wird« Diese Definition umschließt insbesondere, ist aber nicht beschränkt auf Folgen, die in einem kontinuierlichen DNA-Strang räumlich nebeneinander liegen oder die räumlich getrennt sind. Die räumliche Trennung schließt beispielsweise eine Trennung innerhalb desselben DM-St ranges, die Lage in unterschiedlichen DNA-Strängen oder unterbrochene, eingestreute Folgen (z« B₈ regulierbare und codisrende Folgen im Wechsel) in einem Strang ein«

Chemisch regulierbare DNA-Folpe; Eine DNA-Folge, welche die Transkription einer assoziierten DNA-Folge regulieren kann, wobei die Regulierung von einem chemischen Regler abhängig ist. Die Folgen können natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein«

Chemisch regulierbares Gen; Sin Gen, das wenigstens eine nicht-codierende, chemisch regulierbare DNA-Folge und wenigstens eine assoziierte, codierende DNA-Folge enthält» Die Gene können natürlichen, synthetischen oder teils natürlichen/teils synthetischen Ursprungs sein.

Chemischer Regler (für eine chemisch regulierbare DNA-Folge) : Eine elementare oder molekulare Spezies, welche durch direkte oder indirekte Wirkung die Aktivität einer chemisch regulierbaren DNA-Folge in einem System steuert (z. B, einleitet, beendet, verstärkt oder verringert), in welchem der chemische Regler normalerweise nicht in ausreichender Menge in einer aktiven Form vorhanden ist, um die Regulierung der Transkription einer transkribierbaren DNA-Folge, die der chemisch regulierbaren DNA-Folge zugeordnet ist, im gewünschten Maße und zum gewünschten Zeitpunkt zu bewirken.«

Wenn also das System, welches die chemisch regulierbare DNA-Folge enthält₉ eine Pflanze ist, beispielsweise eine transgene Pflanze, dann ist ein chemischer Regler eine Spezies, die natürlicherweise in der Pflanze nicht in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, um die chemische Regulierung und damit die Transkription eines assoziierten Gens im gewünschten Maße zum gewünschten Zeitpunkt zu bewirken.

Unter "direkter Wirkung" versteht man, daß die chemische Reglerwirkung aus der direkten Wechselwirkung zwischen dem chemischen Regler und der DNA-Folge resultierte Unter "indirekter Wirkung" versteht man, daß die Reglerwirkung aus der direkten Wechselwirkung zwischen dem chemischen Regler und einer anderen endogenen oder exogenen Komponente im System resultiert, wobei das Endergebnis dieser direkten Wechselwirkung die Aktivierung oder Unterdrückung der Aktivität der DNA-Folge ist. Unter "aktiver Form" versteht man, daß der chemische Regler die zur Bewirkung der Steuerung erforderliche Form hat«

Schimärische Folge oder Gen: Eine DNA-Folge, die wenigstens zwei heterologe Teile enthält, z„ B. Teile, die von natürlich vorkommenden DNA-Folgen abgeleitet wurden, die in ihren naürlich vorkommenden Zuständen nicht assoziiert sind, oder die wenigstens einen Teil enthält, der synthetischen Ursprungs ist und in der Natur nicht vorkommt.

Codierende DNA-Folge; Eine DNA-Folge, die zur Bildung eines zellularen Polypeptids führt, wenn sie transkribiert oder translaterieirt wird«

Gen: Ein diskreter Chromosomenbereich, der für ein diskretes Zellularprodukt verantwortlich ist.

Nicht-codierende DNA-Folge: Eine DNA-Folge, die nicht transkribiert und translateriert wird and zur Bildung eines Zel lular popypeptids führt_s wenn sie mit einer besonderen, codierenden DNA-Folge assoziiert wird_e So kann beispielsweise eine Folge, die bei der Zuordnung zu einer Codierungsfolge nicht-codierend ist, tatsächlich codierend sein, nenn sie einer anderen codierenden oder nicht-codierenden Folge zugeordnet

Phänotypisches Merkmal; Eine feststellbare Eigenschaft, die aus der Expression eines Gens resultierte

Pflanzengewebe; Jedes Gewebe einer Pflanze in planta oder in Kultur_e Dieser Begriff schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf, Pflanzen, Pflanzenzellen, Planzenorgane, Pflanzensamen, Protoplaste, Kallus, Zellkulturen und alle Gruppen von Pflanzenzellen, die zu strukturellen und/oder funktioneilen Einheiten organisiert sind» Die Verwendung dieses Begriffs in Verbindung mit oder ohne einen speziellen Typ von Pflanzengewebe, wie er oben aufgeführt wurde oder anderweitig durch diese Definition eingeschlossen wird, darf nicht als Ausschluß anderer Typen von Pflanzengewebe betrachtet werden«

PR oder pathogenese-bezogene Proteine: Proteine, die in Pflanzen expressiert werden, die hypersensitiv auf Pathogene reagieren,, Dieser Begriff schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf, die sauren und basischen Formen von Tabak-PR-Ia-, -PR-Ib-, -PR-Ic-,-PR-1'-, -PR-2-, -PR-N-,-PR-O-, -PR-P-, -PR-Q-, -PR-S-, -PR-R-Proteine, die ChiAinase, die das basische Gegenstück zur PR-P oder PR-Q ist, und die Beta-1_S3-Glukanase (Glucan-endo-1_s3-ß-Glukosidase, EC 3*2,1.39), die das basische Gegenstück zu PR-2, PR-N oder PR-O ist,

und die pathogeninduzierbare Chitinase von Gurke« Sine hypersensitive Reaktion ist gekennzeichnet durch eine lokale llekrose der Gewebe, welche die Infektionsstelle des Pathogens unmittelbar umgeben, und eine anschließende Lokalisation des Pathogens, was zur sensitiven Reaktion im Gegensatz steht, bei der sich das Pathogen über die Pflanze aus™ breitet« Pathogene sind beispielsweise Viren oder Viroide, ζ« B₈ der Tabak- oder Gurkenmosaikvirus, der Ringpunktvirus oder der liekrosevirus, der Pelargonienblattkräuselvirus, der Rotkleefleckenvirus, der Tomatenstrauchkrüppelvirus und ähnliche Viren, Pilze, z. B. Phvthophthora parasitica oder Peronospora tabacina, Bakterien, z* B. Pseudomonae syringaie oder Pseudomanas tabaci, oder Blattläuse, ^{Ze B}» Myζus persicae« Diese Liste ist in keiner Weise einschränkende

Regulierung; Die Steigerung (Induzierung) oder Verringerung (Unterdrückung) des Pegels der Expression eines Gens oder des Pegels der Transkription einer DNA-Folge« Die Definition soll keinen bestimmten Mechanismus zum Ausdruck bringen_β

Іш wesentlichen reine DHA-Folge; Eine DNA-Folge, die in im wesentlichen reiner Form aus einer natürlichen oder nichtnatürlichen Quelle isoliert wurde. Eine solche Folge kann in einem natürlichen System vorkommen, beispielsweise in Bakterien, Viren oder in Pflanzen- oder Tierzellen, oder sie kann beispielsweise durch synthetische Mittel oder als eine cDNA-Folge geschaffen werden« Im wesentlichen reine DNA-Folgen werden in der Regel in Form eines Vektors isoliert, der die.vorgesehene DNA umfaßt« Im wesentlichen rein heißt, daß andere DNA-Folgen als die vorgesehenen nur in Grenzmengen, bäspielsweise von weniger als 5 %, weniger als 1 %

oder vorzugsweise von weniger als 0,1 %<, Im wesentlichen reine DMA-Polgen oder Vektoren, welche diese enthalten, können in Lösung vorhanden sein und sind es im typischen Fall auch, beispielsweise in wässriger Lösung, die Puffer enthält, oder in den üblichen Kulturmedien«

Wesentliche Sequenzhomologie: Unter einer wesentlichen Sequenzhomologie versteht man ein enges strukturelles Verhältnis zwischen Sequenzen von Nukleotiden oder Aminosäuren. Beispielsweise können im wesentlichen homologe DNA-Polgen zu 80 % homolog sein, vorzugsweise zu 90 % oder 95 % homolog, und im wesentlichen homologe Aminosäurefolgen können im typischen Fall zu 50 % homolog oder mehr sein. Homologie schließt auch ein Verhältnis ein, bei dem eine oder mehrere Subsequenzen von Nukleotiden oder Aminosäuren fehlen oder Subsequenzen, bei denen zusätzliche Nukleotide oder Aminosäuren eingestreut sind»

A„ Chemisch regulierbare DNA-Folgen

Vorliegende Erfindung betrifft nicht-codierende DNA-Folgen, die unter dem Einfluß eines chemischen Reglers die Transkription einer assoziierten DNA-Folge in einer Pflanze oder in Pflanzengewebe regulieren können. Insbesondere betrifft die Erfindung nicht-codierende DNA-Folgen, welche die Transkription einer assoziierten DNA-Folge in einer Pflanze oder in Pflanzengewebe regulieren können, wobei diese Regulierung von einem chemischen Regler abhängig ist- Vorzugsweise ist· die DNA-Folge in im wesentlichen reiner Form im Verhältnis zum Gen und Genom, in welchem sie vorkommen, vorhanden, wenn sie von einer natürlichen Quelle abgeleitet wurde, oder im Verhältnis zu einem DNA-Gemisch, wenn sie in einem synthetischen Gemisch vorhanden sind«

Vorzugsweise sind die nicht-codierenden, chemisch, regulierbaren DNA-Folgen dieser Erfindung solche, die bei der Zuordnung au einer codierenden DNA-Folge die Expression der Codierungsfolge in Pflanzengevvebe regulieren, wobei das Ausmaß der Regulierung von einem chemischen Regler abhängig ist. Solchen Polgen können de novo synthetisiert oder aus einem natürlich vorkommenden, chemisch regulierbaren Gen abgeleitet (z. B₈ isoliert oder kloniert) werden» Das Vorkommen von chemisch regulierbaren DMA-Folgen ist nach der Erfindung nicht auf Pflanzengewebe begrenzt, d* h., die chemisch regulierbaren DMA-Folgen können von einer TSelzahl natürlicher Quellen abgeleitet werden, ζ_β B* bakteriellen, viruellen oder tierischen Quellen. Sie können beispielsweise isoliert werden aus dem 5'-Flankierungsbereich oder aus· dem 3^f-Flanierungsbereich eines natürlich vorkommenden, chemisch regulierbaren Gens« Als Alternative dazu können die nicht-codierenden DNA-Folgen chemisch synthetisiert oder enzymatisch synthetisiert werden als cDNA, die mit der isolierten Folge identisch ist oder eine wesentliche Sequenzhomologie zu dieser hat. Durch Klonierung der chemisch regulierbaren, nicht-codierenden DMA-Folge kann die Folge von anderen Folgen getrennt werden, die im natürlich vorkommenden Gen an diese angrenzen. Auf diese V/eise kann man eine im wesentlichen reine DNA-Folge erhalten.

Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung schließt Regulierung chemische Regler ein, die entweder induzierende oder unterdrückende Regler sind., Zu den Beispielen für chemisch unterdrückbare Gene, d. h., Gene, die durch eine unterdrückende Chemikalie unterdrückt werden, gelieren u. a, Gene wie TrpR oder Aroli, wobei der Zusatz des Tryptophan-

Repressionsmittels oder von Tryptophan selbst die Expression aus diesen Genen unterdrückt. Es gibt viele andere Gene, die durch diesen Typ von Endproduktrepression reguliert werden, und in jedem Fall wirkt das Endprodukt als chemischer Regler, der zur Unterdrückung der Expression des Gens eingesetzt werden kanne Die vorliegende Erfindung schließt die regulierbaren Sektionen dieser Gene an sich oder als Teil von schimärischen Konstruktionen ein, die zur Transkription einer assoziierten DNA-Folge in einer Pflanze oder in Pflanzengewebe chemisch reguliert werden kennen.

Beispiele für chemisch induzierbare Gene, d_e h., Gene, die durch einen induzierenden chemischen Regler induziert werden, sind PR-Protein-Gene, vor allem die Tabak-PR-Protein-Gene, beispielsweise die PR-Ia-, PR-Ib-, PR-Ic-,' PR-1^!-, PR-Q-, PR-R- und PR-S-Gene_? das Gurken-Chitinase-Gen und die basischen und sauren Tabak-ß-1,3-Glukanase-Gene« Nach einem besonderen Gesichtspunkt schließt die vorliegende Erfindung eine im wesentlichen reine DNA-Folge ein, die eine nicht-codierende, chemisch regulierbare DNA-PоIge ist oder eine wesentliche Sequenzhomologie zu dieser hat, welche Teil eines natürlich vorkommenden, chemisch regulierbaren Gens ist, beispielsweise eines natürlich vorkommenden, chemisch regulierbaren Gens in einer Pflanze oder in Pflanzengewebe von einer einkeimblätfeigen, zweikeimblättrigen oder nacktsamigen Pflanze* Vorzugsweise ist eine solche DNA-Folge in der Lage, die Transkription einer assoziierten DNA-Folge in einer Pflanze oder in Pflanzengewebe zu regulieren, wobei diese assoziierte DNA-Folge eine Codierungsfolge ist. Die Transkription dieser DNA-Folge kann durch einen unterdrückenden chemischen Regler oder durch einen induzierenden

chemischen Regler reguliert werden.. Besonders in Betracht gezogen werden die DNA-Folgen, bei denen das chemisch regulierbare Gen ein PR-Protein-Gen ist, beispielsweise von einer zweikeimblättrigen Pflanze, z, B* Tabak oder Gurke, Bevorzugt werden vor allem DNA-Polgen, bei denen das chemisch regulierbare Gen ein Tabak-PR-Ia-, -PR-Ib-, -PR-Ic-, -PR-T-, -PR-Q- oder -PR-R-Gen, ein Gurken-Chitinase-Gen ader ein basisches oder saures ß-1_S3-Glukanase-Gen, besonders das Tabak-PR-1a- und -PR-1'-Gen ist, aber auch das Gurken-Chitinase-Gen und die basischen und sauren Tabak-:-1,3-Glukanase-Gene_e In erster Linie werden DNA-Polgen in Betracht gezogen, bei denen das chemisch regulierbare Gen ein Tabak-PR-1a- oder ein basischen ß-1,3-Glukanase-Gen ist»

Die chemisch induzierbaren DNA-Polgen der bevorzugten PR- und verwandten Gene der Erfindung kommen offensichtlich in den nicht-codierenden Folgendes anliegenden 5'-Plankierungsbereichs zu den codierenden Polgen vor_e Als repräsentatives Beispiel sei angeführt, daß in einer Folge, die aus einem etwa 6500 Basenpaaren großen Fragment des Tabak-PR-1a-Gens isoliert wurde, welche einen Teil des codierenden Bereichs enthält, der Bereich mit etwa 900 bis etwa 1200 Basenpaaren, der natürlich an die Transkriptionsstartstelle anschließt, als chemisch induzierbar ermittelt wurde« Die Induzierbarkeit wird in einem Fragment davon erhalten, das etwa 500 bis etwa 700 Basenpaare enthält und sich natürlich an die Transkriptionsstartstelle anschließt« Am meisten bevorzugt werden daher die DNA-Folgen, die sich im 5'-Plankierungsbereich dieser PR- und verwandten Gene befinden, beispielsweise in dem 1200 Basenpaar, das sich an die Transkriptionsstartstelle anschließt,.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren für die Herstellung einer nicht-codierenden DNA-Folge, welche die Transkription einer assoziierten DNA-Folge in einer Pflanze oder in Pflanzengewebe regulieren kann, wobei diese Regulierung von einem chemischen Regler abhängig ist, und von DNA-Folgen mit einer wesentlichen Homologie zu. diesen nichtcodierenden Folgen-, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die DKA aus einem natürlich vorkommenden Gen in im wesentlichen reiner Form isoliert oder chemisch oder enzymatisch synthetisiert wird,,

Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer im wesentlichen reinen, chemisch regulierbaren DNA-Folge a.us einem chemisch regulierbaren Gen in einem natürlich vorkommenden System, welches das Gen enthält, wobei dieses Verfahren die nachfolgenden Schritte einschließt:

(a) Aktivierung der Expression der RKA aus dem chemisch regulierbaren Gen in diesem System;

(b) Isolierung dieser RKA;

(c) differentiertes Testen ("Screening") einer Genombibliothek nach RHA, die aus RIiA erzeugt wurde, welche aus diesem aktivierten System isoliert wurde, sowie nach RKA, die aus RKA erzeugt wurde, die von einem Kontrollsyatem, das nicht aktiviert wurde, isoliert worden ist;

(d) Isolierung eines genommenen Klons;

(e) Subklonieren des chemisch regulierbaren Gens aus diesem genomischen Klon und

(f) Isolierung der gewünschten, chemisch regulierbaren DHA-Folge.

Außerdem betrifft die Erfindung ein solches Verfahren, bei dem dieses System eine Pflanze ist, und es schließt folgende Schritte ein:

(a) Aktivierung der Expression einer PolyA+-RNA aus dem chemisch regulierbaren Gen in dieser Pflanze;

(b) Isolierung dieser PolyA+-RKA;

(c) Konstruktion einer cDHA-Bibiothek aus dieser PоIyA+-RKA;

(d) differentiertes "Screening" dieser сDIiA-Bibliothek mit der aus RIA erzeugten cDNA in einer Eontrollpflanze, die nicht aktiviert ist;

(e) Isolierung von сDNA-Klonen, die chemisch regulierbar sind;

(f) Isolierung eines genomfechen Klons aus einer genomischen Bibliothek dieser Pflanze unter Verwendung des cDNA-Klons aus Schritt (e) als Sonde;

(g) Sulklonieren des chemisch regulierbaren Gens aus diesem genomischen Klon und

(h) Isolierung der gewünschten, chemisch regulierbaren DNA-Polge_e

Bevorzugt wird ein Verfahren, bei welchem das chemisch regulierbare Gen ein chemisch induzierbares Gen ist, bei-

spielsweiae ein PR-Protein-Gen_s ζ« Β» ein Tabak-PR-Ia-, -PR-Ib-, -PR-Ic-, PR-V-, PR-Q- oder PR-R-Gen_s ein Gurken-Chitinase-Gen oder ein basisches oder saures ß-1,3-Glukanase-Gen des Tabaks« Außerdem wird ein Verfahren bevorzugt, bei welchem das PR-Protein-Gen im Schritt (a) durch ein chemisches Induziermittel oder ein Pathogen aktiviert wird«

Die Erfindung schließt außerdem im wesentlichen reine DNA ein, die nach den genannten Verfahren hergestellt wurde»

B_e Chemisch regulierbare DNA-Polgen mit Teilen von natürlich vorkommenden Codierungsfolgen

Neben den vollständig nicht-codierenden, chemisch regulierbaren DNA-FoIgen, die oben im Verfahren A beschrieben wurden, sieht die Erfindung auf die nicht-codierende DNA-Folge einer natürlich vorkommenden, chemisch regulierbaren DNA-Folge in Korabination mit einem Teil, nicht aber einer vollständigen Codierungsfolge vor, mit welche die regulierbare Folge in einem natürlich vorkommenden Gen assoziiert ist«, Insbesondere schließt die vorliegende Erfindung, vorzugsweise in einer im wesentlichen reinen Form, eine DNA-Folge ein, welche besteht aus einer ersten DNA-Komponentenfolge, die eine nichtcodierende, chemisch regulierbare DNA-Folge eines natürlich vorkommenden, chemisch regulierbaren Gens ist oder eine wesentliche Sequenzhomologie dazu aufweist, wobei diese erste Komponentenfolge die Transkription einer i.;ö_öo-assiziierten DNA-Folge in einer Pflanze oder in Pflanzengewebe regulieren kann, wobei diese Regulierung von einem chemischen Regler abhängig ist, und einer zweiten DNA-Komponentenfolge, die Teil einer, aber keine vollständige transkribierbare DNA-Folge ist oder eine wesentliche Sequenzho-

raologie dazu hat, welche mit der ersten Komponente in dem natürlich vorkommenden, chemisch regulierbaren Gen assoziiert ist_β Das natürlich vorkommende, chemisch regulierbare Gen kann pflanzlichen Ursprungs sein, beispielsweise in einer einkeimblättrigen oder zweikeimblättrigen Pflanze vorkommen, und es kann durch einen unterdrückenden oder einen induzierenden chemischen Regler reguliert werden.» Die zweite DNA-Komponentenfolge ist im typischen Pail eine codierende Folge« Eine bevorzugte zweite DNA-Folge für die vorliegende Erfindung ist eine Folge, welche das Signalpeptid eines Proteins codiert, das durch das natürlich vorkommende, chemisch regulierbare Gen expressiert wird«

Insbesondere betrifft die Erfindung eine DNA-Folge, die besteht aus einer ersten nicht-codierenden, chemisch regulierbaren DNA-Folge und einer zweiten codierenden DNA-Folge von einem PR-Protein-Gen, beispielsweise einem PR-Protein-Gen von einer zweikeimblättrigen Pflanze, vorzugsweise von Tabak oder Gurke, wie ein PR-Ia-, PR-Ib-, PR-Ic-, PR-V-, PR-Q- oder PR-R-Gen, ein Chitinase-Gen oder ein basisches oder saures ß-1,3-Glukanase-Gen_e Bevorzugt wird eine DNA-Folge von einem PR-Protein-Gen, bei welchem die Transkription durch einen induzierenden chemischen Regler reguliert wird. Insbesondere betrifft die Erfindung eine DNA-Folge, bei welcher sich die erste nicht-codierende DNA-Folge im 5'-Flankierungsbereich eines der genannten PR-Protein-Gene befindet, sich beispielsweise in den annähernd 2000 Basenpaaren neben der Transkriptionsstartstelle dieses PR-Protein-Gens befindet. Am günstigsten ist eine DNA-Folge, die aus einer bevorzugten ersten nicht-codierenden Folge, wie sie oben genannt wurde, und einer zweiten codierenden DNA-Folge, die für ein Signalpeptid codiert, wei oben erwähnt wurde, besteht.

Bevorzugt werden vor allem im wesentlichen reine DNA-Folgen , wie sie in "Sequenz 1", "Sequenz 2", "Sequenz 5" und "Sequenz 6" gezeigt werden, und im wesentlichen reine DNA-Folgen mit wesentlicher Sequenzhomologie mit diesen "Sequenzen" 1, 2, 5 und 6. Diese "Sequenzen" sind Beispiele für chemisch regulierbare DNA-Folgen, die aus einer ersten nicht-codierenden und einer zweiten codierenden DNA-Folge bestehen und von den PR-Protein-Genen des Tabaks PR-Ia, PR-1' und von zwei Formen der basischen Tabak-ß-1,3-Glukanase abgeleitet wurden. "Sequenz 1" zeigt die Folge des repräsentativen PR-1a-Gens von Tabak» Die Nukleotide 1 bis etwa 1150 sind die nicht-codierende, 5'-flankierende, chemisch induzierbare DNA-Folge und ein Teil der PR-1a-Codierungsfolge, die natürlich in der Tabakpflanze vorkommen. In diesem Fall liegt die chemisch induzierbare Komponentenfolge im Anschluß an die Codierungsfolge, Die Nucleotide, welche die Codierung für die ersten dreißig Aminosäuren haben, bilden die Codieningsfolge für das Signalpeptid des PR-1a-Proteins» Die Codierungsfolge kann von der nicht-codierenden Folge entfernt werden, um die nicht-codierende, chemisch induzierbare DNA-Folge, frei von jeder Codierungsfolge, zu schaffen, wie sie oben im Teil A beschrieben wurde. Diese Entfernung kann durch herkömmliche Techniken, beispielsweise Restriktionsenzymverdauung, vorgenommen werden.

Die Erfindung betrifft außerdem eine Methode zur Herstellung einer DNA-Folge, die besteht aus einer ersten DNA-Komponentenfolge, die eine nicht-codierende, chemisch regulierbare DNA-Folge eines natürlich vorkommenden, chemisch regulierbaren Gens ist oder wesentliche Sequenzhomologie dazu hat, wobei diese erste Komponentensequenz die Transkrip-

tion einer assoziierten DNA-Folge in einer Pflanze oder in Pflanzengewebe regulieren kann, wobei diese Regulierung von einem chemischen Regler abhängig ist, und einer zweiten DNA-Komponentenfolge, die Teil einer transkribierbaren DNA-Folge, diese aber nicht vollständig ist oder wesentliche Sequenzhomologie zu dieser hat, mit welcher die erste Komponente in dem natürlich vorkommenden, chemisch regulierbaren Gen assoziiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA aus einem natürlich vorkommenden Gen in im wesentlichen reiner Form isoliert oder chemisch oder enzymatisch synthetisiert wird. Bevorzugt werden die oben im Teil A genannten besonderen Verfahren und die dadurch gewonnenen, im wesentlichen reinen DNA-Folgen*

G_e Schimärische Gene, die chemisch regulierbare DNA-Polgen enthalten

Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist eine schimärische DNA-Folge (ein schimärisches Gen), die wenigstens eine chemisch regulierbare DNA-Folge enthält. Zwei Typen dieser schimärischen Folgen werden als Beispiel gegeben. Die einfachere oder aus zwei Teilen bestehende schimärische DNA-Folge besteht aus einer chemisch regulierbaren DNA-Folge und einer transkribierbaren DNA-Folge, so daß das schimärische Gen ist Pflanzengewebe unter geeigneten Bedingungen der chemischen Regulierung expressiert werden kann« Genauer formuliert, die Erfindung schließt eine chemisch regulierbare, schimärische DNA-Folge ein, die aus einer ersten nicht-codierenden, chemisch regulierbaren DNA-Komponentenfolge, welche die Transkritpion einer assoziierten DNA-Folge in einer Pflanze oder in Pflanzengewebe regulieren kann, wobei diese Regulierung von einem chemischen

Regler abhängig ist, und einer zweiten DNA-Komponentenfolge besteht, welche in eine Pflanze oder in Pflanzengewebe transkribiert werden kann· Die DNA-Komponentenfolgen können von natürlichen Quellen abgeleitet oder synthetisch hergestellt werden»

Die zweite DNA-Folge kann als eine RNA transkribiert werden, welche die Expression eines phänotypischen Merkmals durch einen "Anti-sense"-Mechanismus regulieren kann_e Als Alternative dazu kann die zweite DNA-Folge in der schimärischen DNA-Folge in das Pflanzengewebe transkribiert und translateriert, de h., codiert, werden, um ein Polypeptid zu erzeugen, das in einem phänotypischen Merkmal resultiert« Das schimärische Gen wird so konstruiert, daß die zweite DNA-Folge in geeigneter Weise mit der chmisch regulierbaren DNA-Folge assoziiert wird, im typischen Fall in einer angrenzenden Orientierung zu dieser, um die Transkription zu gewährleisten,, Die Assoziierung erfolgt mit herkömmlichen Methoden«

Bevorzugt wird eine schimärische DNA-Folge, die aus einer ersten nicht-codierenden, chemisch regulierbaren DNA-Komponente und einer zweiten, transkribierbaren DNA-Komponente besteht, wobei die erste nicht-codierende DNA-Folge eine der oben im Teil A genannten bevorzugten DNA-Folgen ist» Die erste DNA-Komponentenfolge kann durch Unterdrücken oder Induzieren mittels eines chemischen Reglers reguliert werden,, Eine besondere Folge der Erfindung ist eine schimärische DNA-Folge, bei welcher die erste DNA-Komponentenfolge wesentliche Sequenzhomologie mit einer chemisch regulierbaren DNA-Folge in einem natürlich vorkommenden, chemisch regulierbaren Gen von einer Pflanze hat»

Bevorzugt wird eine scfrmärische DNA-Folge, bei welcher die erste DNA-Komponentenfolge eine chemisch, regulierbare DNA-Folge in einem natürlich vorkommenden, chemisch regulierbaren Gen von einer Pflanze ist oder wesentliche Sequenzhomologie mit dieser hat, und die zweite DNA-Komponentenfolge eine codierende Folge ist, welche transkribiert und translateriert werden kann, um ein Polypeptid zu produzieren, das in einem phänotypischen Merkmal resultiert. Vorlzugsweise grenzt diese zweite DNA-Komponentenfolge an die erste codierende DNA-Folge an_e Besonders bevozugt wird eine solche schimärische DNA-Folge, bei welcher die erste DNA-Komponentenfolge die chemisch induzierbare DNA-Folge in einem PR-Protein-Gen, beispielsweise einem PR-Protein von einer zweikeimblätttigen Pflanze, wie Tabak oder Gurke, ist oder wesentliche Sequenzhomologie zu dieser hat«, Beispiele dafür werden oben in Teil A gegeften.

Ein zweiter, als Beispiel gegebener Typ einer schimärischen DNA-Folge enthält drei DNA-Komponentenfolgen, die ihren Ursprung in zwei oder mehr Quellen haben« Beim einfachsten Ausführungsbeispiel besteht diese schimärische DNA-Folge aus der zweiteiligen DNA-Folge, wie sie oben im Teil B beschrieben wurde, und einer dritten DNA-Folge, die von wenigstens einer unterschiedlichen Quelle stammte Genauer formuliert, dieser Typ der schimärischen DNA-Folge, die aus einer ersten DNA-Komponentenfolge besteht, welche eine nicht-codierende, chemisch regulierbare DNA-Folge eines natürlich vorkommenden, chemisch regulierbaren Gens ist oder wesentliche Sequenzhomologie zu dieser hat, wobei diese erste DNA-Komponentenfolge die Transkription einer assoziierten DNA-Folge in einer Pflanze oder in Pflanzengewebe regu-

lieren kann und diese Regulierung von einem chemischen Regler abhängig ist, und aus einer zweiten-DNA-Komponentenfolge, die Teil einer, aber keine vollständige transkribierbare DNA-Folge ist oder eine wesentliche Sequenzhomologie zu dieser ar, mit welcher die erste Komponente in dem natürlich vorkommenden, chemisch regulierbaren Gen. assoziiert ist, hat eine dritte DNA-Komponentenfolge, die· in eine Pflanze oder in Pflanzengewebe transkribiert werden kann. Vorzugsweise ist das natürlich vorkommende, chemisch regulierbare Gen ein Pflanzengen.

Die zweite und die dritte DHA-Komponentenfolge sind im typischen Pail codierende Polgen« Die dritte DNA-Komponente kann von mehr als einer natürlichen oder synthetischen Quelle abgeleitet werden» Die beiden ersten DNA-Komponenten haben im typischen Fall natürlichen Ursprung« Wenn, der Ursprung eine Pflanze ist, kann es eine einkeimblättrige, zweikeimblättrige oder nacktsamige Pflanze sein. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel beinhaltet die zweite DNA-Folge die Nukleotidfolge, welche das Signalpeptid des chemisch regulierbaren Gens codiert, in welchem die beiden ersten DNA-Folgen vorkommen. Wenn die chemisch regulierbare DNA-Folge einem Teil der Codierungsfolge des Gens zugeordnet ist,von der es abgeleitet wurde, muß die dritte DNA-Folge nicht nur die richtige Orientierung haben, sondern muß sich auch im richtigen Leseraster mit der zweiten DNA-Folge befinden« Diese Orientierung kann durch Techniken erreicht werden, die allgemein in Fankreisen bekannt sind«.

Bevorzugt werden schimärische DNA-Folgen, bei denen die erste und die zweite DNA-Folgenkomponente den oben im Teil B genannten entsprechen» Beispielsweise ist eine bevorzugte

schimärische DNA-Folge die, bei welcher die erste DNA-Komponentenfolge die chemisch induzierbare DNA-Folge in einem PR-Protein-Gen von einer zweikeimblättrigen Pflanze₉ beispielsweise Tabak oder Gurke, ist oder -wesentliche Sequenzhomologie zu dieser hat» Beispiele für PR-Protein-Gene werden oben genannt»

Die oben beschriebenen schimärischen Gene schließen eine Vielfalt möglicher Konstruktionen ein* Eine chemisch regulierbare, nicht-codierende Folge kann einem Gen zugeordnet werden, welches die Blütenbildung oder Fruchtreifung steuert; einem Gen, das die Toleranz oder Resistenz gegenüber Herbiziden oder vielen Typen von Schädlingen, beispielsweise Pilzen, Viren, Bakterien, Insekten, Nematoden oder Spinnentieren,bewirkt; einem Gen, das die Produktion von Enzymen oder sekundären StoffWechselprodukten steuert; die männliche oder weibliche Sterilität; den Zwergwuchs; den Geschmack! Nährwerteigenschaften und ähnliche» Unter Anwendung der vorliegenden Erfindung können solche Merkmale durch den Bauer oder Gärtner verstärkt werden, der damit nicht mehr ausschließlich von natürlichen Paktoren abhängig ist. Ein für die Steuerung besonders interessantes Merkmal phänotypischer Art ist die Produktion von Stoffwechselprodukten in Gewebekulturen oder im Bioreaktor»

Eine bevorzugte schimärische DNA-Folge ist eine Zwei- oder Dreikomponentenfolge, in welcher die codierende DNA-Komponentenfolge für ein phänotypisches Merkmal codiert, beispielsweise ein aus der folgenden Gruppe ausgewähltes Merkmal, wie Toleranz oder Resistenz gegenüber einem Herbizid, Pilz, Virus, Bakterium, Insekt, einer Nematode oder einem

Spinnentier; Produktion von !sekundären Stoffwechselprodukten; männliche oder weibliche Sterilität und Produktion eines Enzyms oder einer anderen Verbindung. Bevorzugt wird vor allem eine aus zwei oder drei Komponenten bestehende, schimärische DNA-Folge, bei welcher die codierende Komponentenfolge für Toleranz oder Resistenz gegenüber Herbiziden codiert, beispielsweise den Wildtyp von oder herbizidresistente Azetohydrozysäuresynthase (AHAS) codiert, oder bei welcher die codierende Komponentenfolge für Resistenz gegenüber Insekten codiert, beispielsweise für Bacillus thuringiensis'-Bndotozin (BT) codiert»

Wenn die schimärische Polge als Untersuchungsmittel für chemische Regler verwendet werden soll, ist das phänotypische Merkmal vorzugsweise ein analysierbarer Marker. Zu den geeigneten Markern gehören Luziferase (LUX), Chlorampheniklazetyltransferase (CAT), IIeomyzinphosphotransferase (NPT), Nopalinsynthase (NOS), Oktopinsynthase (OCS), Beta-1^-©lukuronidase (GUS), Azetohydroxysäuresynthase (AHAS) und Bacillus thuringiensis-Endotoxin (BT), wobei diese Aufstellung keine Einschränkung darstellt. Bevorzugte Marker sind Beta-1,3-Glukuronidase(GUS), Azetohydroxysäuresynthase (AHAS) und Bacillus thuringjgnsis-Bndotozin (BT).

j£Ln repräsentatives Beispiel für eine solche schimärische DNA-Folge, die in den Beispielen ausführlich beschrieben wird, ist eine zweiteilige schimärische DNA-Folge, welche die nicht-codierende 5'-Flankierungsfolge des PR-1a~Gens enthalte Zwar wird als eines der Beispiele für den Ыагкег die Codierungsfolge für das GUS-Gen gegeben, es könnte aber auch jeder andere der oben gegebenen Marker eingesetzt werden. Die analoge dreiteilige schimärische Folge enthält

einen Teil der Codierungsfolge des PR-Ia-Gens. Diese Konstruktionen sind besonders nützlich., da die Wirkung der chemischen Induzierung, d· h., die Beta-Glukuronidase-Enzymaktivität, in Pflanzenzellen oder deren Extrakten leicht feststellbar ist. Andere besondere Ausführungsbeispiele, beispielsweise die, welche die nicht-codierende Folge eines der Tabak-ß-1,3-Glukanase-Gene enthalten, und die, welche die Codierungsfolge für den Wildtyp von oder herbizidresistente Azetohydroxysäuresynthase oder für das Bacillus thuringiensis-Bndotoxin enthalten, werden im Teil L, Beispiele, beschrieben»

Bevorzugte schimärische DNA-Folgen sind aus zwei oder drei Komponenten bestehende, schimärische DNA-Folgen, bei denen die erste DNA-Komponentenfolge der 5'-Flankierungsbereich des Tabak-PR-ia-C-ens ist und mehr als etwa 30O₉ beispielsweise zwischen 300 und 2000, vorzugsweise zwischen 600 und 1000, Basenpaare neben der Transkriptionsstartstelle enthält*

Bevorzugt wird außerdem eine schimärische DNA-Folge, die aus drei Komponenten besteht, wobei die zweite DNA-Komponentenfolge für ein Signalpeptid codiert, worin beispielsweise die zweite DNA-Komponentenfolge für ein Peptid codiert, das ein Signalpeptid von einem PR-Prоtein-Gen, vorzugsweise dem PR-1a-Gen, ist oder wesentliche Sequenzhomologie zu diesem hat*

Die -Srfindung beinhaltet außerdem eine Methode zur Herstellung einer chemisch regulierbaren, schimärischen DNA-Folge, die besteht aus einer ersten nicht-codierenden, chemisch regulierbaren DNA-Komponentenfolge, welche die Transkription einer assoziierten DNA-Folge in einer Pflanze oder in Pflan-

zengewebe regulieren kann_s wobei diese Regulierung von einem chemischen Regler abhängig ist, und einer zweiten DNA-Komponentenfolge, die in eine Pflanze oder in Pflanzengewebe transkribiert werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Komponentenfolgen ligiert werden«, Ebenso beinhaltet die Erfindung eine Methode für die Herstellung einer schimärischen DNA-Folge, die besteht aus einer ersten DNA-Komponentenfolge, welche eine nicht-codierende, chemisch regulierbare DNA-Folge eines natürlich vorkommenden, chemisch regulierbaren Gens ist oder wesentliche Sequenzhomologie zu dieser hat, wobei die erste DNA-Komponentenfolge die Transkription einer assoziierten DNA-Folge in einer Pflanze oder in Pflanzengewebe regulieren kann und diese Regulierung von einem chemischen Regler abhängig ist, einer zweiten DNA-Коmponentenfolge, die Teil einer, aber keine vollständige transkribierbare DNA-Folge ist oder wesentliche Sequenzhomologie dazu hat, mit welcher die erste Komponente in dem natürlich vorkommenden, chemisch regulierbaren Gen assoziiert ist, und einer dritten DNA-Komponentenfolge, die in eine Pflanze oder in Pflanzengewebe transkribiert werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Komponentenfolgen gleichzeitig oder nacheinander ligiert werdenβ

De Vektoren

Vektoren, die nach Standardtechniken hergestellt wurden und entweder die chemisch regulierbaren DNA-Folgen, die im Teil A oder B beschrieben wurden, oder die schimärischen DNA-Folgen enthalten, die im Teil C beschrieben wurden, stellen ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung dar. Vektoren sind rekombinante DNA-Folgen, die für Isolierungs- und

Vervielfältigungszwecke der genannten DHA-FoIgen und für die Transformation von geeigneten Wirten mit diesen Polgen verwendet werden können» Bevorzugte Vektoren für Isolierung und Vervielfältigung sind Plasmide, die in einem geeigneten Wirtsmikroorganismus, beispielsweise in IS^ coli, vermehrt werden können. Bevorzugte Vektoren für .die Transformation sind die, welche für die Transformation von Pflanzenzellen oder von Agrobacteria geeignet sind» Genauer formuliert, wenn andere Pflanzenzellen als Protoplaste transformiert werden, ist der bevorzugte Vektor ein Ti-Plasmid-abgeleiteter Vektor» Für den direkten DNA-Transfer in Protoplaste kann jeder der genannten Vektoren verwendet werden* Geeignete Vektoren, die als Ausgangsmaterial verwendet werden können, sind in Fachkreisen bekannt» Geeignete Vektoren zur Transformation von Pflanzengewebe und Protoplasten wurden von deFramojid, A_e u„ a_e, Bio/Technology 1, 263 (1983); An₉ G. u. а., EMBO J« 4, 277 (1985); Potrykus, I. u„ a.,oben; Rothstein, S. J„ u. a., Gene 53, 153 (1987) beschrieben«. Weben diesen wurden in der Fachliteratr viele andere Vektoren beschrieben, die als Ausgangsmaterial in der vorliegenden Erfindung geeignet sind*

Die Vektoren, die nur die chemisch regulierbare DNA-Folge enthalten, wie das oben in den Teilen A oder Б beschrieben wurde, können als Zwischenprodukte für die Herstellung eines Vektors verwendet werden, der die schimärische DNA-Folge enthält, wie sie im Teil C beschrieben wurde« Die Einfügung einer geeigneten Folge, die zur Transkription fähig ist, in einen solchen Zwischenvektor ergibt einen Vektor, der eine schimärische DlIA-Folge nach der Erfindung enthält, die zur Transformation des gewünschten Pflanzengewebes, Praoplasten oder anderen Wirts verwendet werden kann» Als Alterna-

tive dazu kann eine schimärische DNA-PoIge hergestellt und in einen geeigneten Vektor eingefügt werden, der dann zur Transforamtion des gewünschten Pflanzengewebes oder anderen Wirts verwendet wird*

Die Konstruktion und Vervielfachung der Vektoren kann in einem geeigneten Wirt erfolgen, beispielsweise in E^ coli„ Zu den geeigneten E₁ coli-Stämmen gehören HB101, JM83, DH1, DHüJcA, L392 und ähnliche» Die Vektoren der Erfindung können als solche in einer direkten Gen-Transfer- oder einer Mikroinjektionsmethode eingesetzt werden_e Unter bestimmten Umständen kann es vorteilhaft sein, den Vektor vor der Anwendung zu linearisieren« Als Alternative dazu können die Vektoren auf einen Agrobacterium-Wirt transferiert werden. Dieser Transfer erfolgt nach herkömmlichen Techniken, ein. schließlich der biparenteralen Anpassung (mating) (Simon, R u. a_e, Bio/Technology 1, 74 (1983))» der triparenteralen Anpassung (Ditta, G. u. a., Proc. Natl. Acad«. Sei. USA 77, 7347 (1980)) oder der Transformation (Holsters, M. u. a„, Mol« Gen« Genet. 163, 181 (1978)). Zu den geeigneten Stämmen von Agrobacterium gehören die ,Stämme A^ tumefacines LBA4404, CIB542 und CB8Z707, sie sind aber nicht auf diese beschränkt.

Bevorzugt werden die Vektoren, welche die bevorzugten DM-Folgen enthalten, die oben in den Teilen A, B oder G genannt wurden. Außerdem ist ein bevorzugter Vektor einer, der in Pflanzenzellen oder in Agrobacterium funktional ist* Besonders bevorzugt werden die Vektoren, die im Teil L, Beispiele, beschrieben werden.

E„ Pflanzengewebe, Pflanzen und Samen

Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung sind Pflanzengewebe, Pflanzen oder Samen, welche die schimärischen DNA-Polgen enthalten, die oben beschrieben wurden. Bevorzugt werden die Pflanzengewebe, Pflanzen und Samen, welche die schimärischen DNA-Folgen enthalten, die als bevorzugt genannt werden»

Die Zellen von Pflanzengewebe werden mit den oben beschriebenen Vektoren nach jeder in Fachkreisen bekannten Methode transformiert, einschließlich der Methoden, die in den oben genannten Literaturangaben aufgeführt werden, und der Methoden, die in den nachfolgenden Beispielen detailliert beschrieben werden« Zu diesen Methoden gehören die direkte Infektion oder die Kokultivierung von Pflanzen oder Pflanzengewebe mit Agrobacterium. Ein sehr geeignetes Verfahren ist die Blattscheibentransformation, die von Horsch, R„ B. u. a., Science 225*, 1229 (1985), beschrieben wird« Als Alternative dazu kann der Vektor direkt transferiert werden, beispielsweise durch Elektroporation, durch Mikroinjektion oder durch Transformation von Protoplasten bei Vorhandensein von Polyethylenglykol (PSG), Kalziumchlorid oder in einem elektrischen Feld, wie das oben ausführlicher beschrieben worden ist»

Die transformierten Zellen können ihren Ursprung in einkeimblättrigen oder zweikeimblättrigen Pflanzen haben und können ein oder mehrere der chemisch regulierbaren, schimärischen Gene dieser Erfindung enthaltene So werden beispielsweise Gene in das Pflanzengewebe eingeführt, die auf Resistenz oder Toleranz gegenüber Herbiziden und einer

Vielzahl von Insektiziden, viruellen, bakteriellen, Pilzoder anderen Schädlingen, auf Sterilität, auf Größe, auf Blütenbildung und Fruchtreifung codieren, und diese Zellen oder Protoplaste werden schließlich wieder in Pflanzen regeneriert, in denen diese Merkmale durch Manipulation mit einem chemischen Regler gesteuert werden können» Als Alternative dazu können Zellen in Gewebekultur oder in einem Bioreaktor vermehrt werden, um Enzyme oder sekundäre Stoffwechselprodukte zu erzeugen. Wenn eine Snzymanalyse ausgeführt werden soll, weist der Codierungsschnitt des schimärischen Gens beispielsweise ein LUZ-, CAT-, ITPT-, WOS-, OCS-, GUS-, AHAS- oder BT-Gen auf, wie sie oben identifiziert wurden. Derartige schimärische Gene, die eine chemisch induzierbare Folge von einem PR-Gen enthalten, sind auf Grund ihrer leichten Anwendbarkeit und des einfachen Rachweises des Enzymproduktes ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung.

Nach der Transformation wird das transformierte Zeil- oder Pflanzengewebe nach herkömmlichen Techniken selektiert oder gesichtet» Das transformierte Zeil- oder Pflanzengewebe enthält die oben genannte schimärische DITA-Fo Ige und kann auf Wunsch nach den bekannten Techniken regeneriert werden, zu denen die in den oben genannten Literaturangaben aufgeführten und in den folgenden Beispielen genannten Techniken für ein- und zweikeimblättrige Pflanzen gehören. Zu den Spezies, die nach diesen Methoden regeneriert werden können, gehören Mais, Sonnenblume, Rübsamen, Klee, Tabak, Karotte, Baumwolle, Luzerne, Reis, Kartoffel, Aubergine und Gurke, sie sind aber nicht auf diese Spezies beschränkt. Die regenerierten Pflanzen werden nach Standardverfahren zur Transformation gesichtet. Die Nachkommenschaft der regenerierten

Pflanzen wird ständig auf das fortbestehende Vorhandensein der integrierten DNA-Folge gesichtet und selektiert, um verbesserte Pflanzen- und Samenstämme zu entwickeln. Die DNA-Folge kann durch eine Vielzahl von Techniken, einschließlich der klassischen Züchtung, der Protoplastfusion, der Kernübertragung und des Chromosomentransfers, in andere genetische Linien eingebracht werden.

F. Vorteile und Anwendungen

Vorliegende Erfidnung bietet eine Reihe von Vorteilen und nutzt die Abstammung von leicht steuerbaren, regulierbaren Expressionen in Pflanzen oder Pflanzengewebe für die schimärischen Gene, die chemisch regulierbare DNA-Folgen enthaltene Die Regulierung von Genen, die nach einem "Antisense"-Mechanismus wirken, oder von Genen, deren Expression zur Produktion eines phänotypschen Merkmals führt, ist möglich,. Besonders wichtig ist die Fähigkeit, Zeit und Rate der Gen-Expression zu steuern, ebenso wie die Leichtigkeit, diese Steuerung, gleichmäßig in der gesamten Pflanze oder in lokalisierten Teilen der Pflanze, vorzunehmen.

Die Steuerung kann einfach durch Anwendung des chemischen Reglers bei Pflanzengewebe oder bei der Pflanze oder bei einem Teil der Pflanze in einer Art und Weise und in einer Menge erfolgen, daß das (die) schimärische(n) Gen(e) reguliert wird (werden), dessen (deren) Expression in Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen gewünscht wird» Wenn das zu expressierende Merkmal beispielsweise vorzugsweise nur in den Blättern expressiert werden soll, dann kann dieses Ziel leicht und wirksam durch Besprühen oder Bestäuben der Blätter zu einem Zeitpunkt, zu welchem diese Expression

optimiert wird und bevor eine Wanderung auf andere Teile der Pflanze eintritt, erreicht werden. Als Alternative dazu kann die gleichmäßige Expression in dem Teil der Pflanze, der sich über der Erde befindet, dadurch erreicht werden, daß die Anwendung auf die vollständige Pflanze (d. h., den Stengel und beide Blattseiten) erfolgt« Wird eine Expression in den Wurzeln gewünscht, ist die Aufbringung auf den Samen oder den Boden um den Samen oder die Wurzeln eine mögliche Regulierungsmethode_β Die Expression in einem Bioreaktor ist leicht ausführbar, beispielsweise durch Aufbringung des chemischen Reglers auf das die Zellen .berührende Medium»

Die Fähigkeit, Zeitpunkt, Rate und/oder Gen-Expression von neuartigen phänotypischen Merkmalen in transgenene Pflanzen steuern zu können, bietet eine Reihe brauchbarer Vorteile» Wenn beispielsweise durch einen Snttoxifikationsmechanismus Toleranz gegenüber einem Herbizid oder anderen PestiSid in eine Pflanze eingeführt wird, kann dieses Merkmal durch die entsprechende Zeitwahl bei der Aufbringung des chemischen Reglers optimiert werden« So kann der Regler in Abhängigkeit von der Methode, die eine optimale Toleranz erbringt, vor, mit oder nach der Aufbringung eines Herbizids oder anderen Pestizids aufgebracht werden.

Außerdem ist es jetzt möglich, die Produktion von Verbindungen zu regulieren, deren Biosynthese durch endogene oder fremde Gene gesteuert wird. Nach der chemischen Induzierung kann die Produktion dieser Produkte zum gewünschten Zeitpunkt beginnen» Der induzierte Prozeß könnte eine mehrstufige Biosynthese oder eine einstufige Umwandlung eines Stoffwechselprodukts sein.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ergibt sich aus der Fähigkeit, Entwicklungsprozesse in Pflanzen zum gewünschten Zeitpunkt durch die Aufbringung einer regulierenden Chemikalie zu regulieren« Beispielweise kann die Synchronisation der PflanzenentWicklung (Keimung, Treiben von Schößlingen, Treiben von Knospen, Blütenbildung, Blütezeit, Fruchtreifung, Abtrocknen, Abszission usw.) erreicht werden» Außerdem kann die normale Pflanzenentwicklung verhindert werden. Dazu kann beispielsweise ein Toxin-Gen eingeführt werden, welches die gewünschte Entwicklungsstufe beeinträchtigen könnte, eine DliA-Folge, welche die Entwicklungsstufe durch einen "Anti-sense"-Mechanismus blockieren würde, oder ein Gen, dessen Expression den Übergang zu einer neuen Entwicklungsstufe blockiert und das chemisch unterdrückt werden kann, damit die Entwicklung weitergehen кашіо Eine mögliche Anwendung ist die Induzierung der männlichen oder weiblichen Sterilität, um die Früchte gesteuert hybridisieren zu können«

Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung sind neuartige Untersuchungsverfahren, vorzugsweise Enzymanalyseverfahren« Beispielsweise ist die Identifizierung neuer chemischer Regler jetzt ziemlich leicht möglich., Diese Analysemethoden beinhalten die Verwendung von transformierten Pflanzen oder Pflanzenzellen, die eine schimärische DNA-Folge dieser Erfindung enthaltene Auf den transformierten ί/irt wird eine Chemikalie aufgebracht, und die Transkription der transkribierbaren DNA-Folge wird anahnd einer Kontrolle gemessen; in der Regel wird die Transkription in Form eines Translationsproduktes oder als Wirkung eines solchen Produktes festgestellt. Die Analyse kann auf unterschiedliche Weise ausgeführt werden, im typischen Fall aber wird sie mit ganzen, re-

generierten Pflanzen (durch Aufbringung der Chemikalie auf die Pflanze) oder mit kultivierten Zellen oder Gewebe (durch Aufbringung der Chemikalie auf die Zellen oder das Gewebe) und anschließende Verwendung eines Substrats für die Enzymaktivität durchgeführt» Das Produkt der Enzymaktivität wird dann nach Standardmethoden, z. B. spektrofotometrische Messungen, festgestellt»

Insbesondere schließt die Erfindung ein Verfahren ein für Identifizierung eines chemischen Reglers, welches besteht aus der Transformation eines Wirts mit einer schimärischen DNA-Fo^ga, wie sie oben im Teil C beschrieben wurde, oder mit einem Vektor, der diese schimärische DNA-Folge enthält, der Aufbringung eines mutmaßlichen chemischen Reglers auf den transformierten Wirt und der Messung der Expression des phänotypischen Merkmals. Ein bevorzugtes Verfahren ist ein Verfahren, bei welchem der transformierte Wirt Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen ist« Bevorzugt wird außerdem ein Verfahren, bei welchem die schimärische DNA-Folge eine oben als bevorzugt genannte Folge ist, beispielsweise eine solche, bei der die erste DEA-Komponentenfolge dieser schimärischen DNA eine chemisch induzierbare Folge ist, die eine chemisch induzierbare Folge eines PR-Protein-Gens ist oder eine wesentliche Sequenzhomologie zu dieser hat, und bei welche das phänotypische Merkmal, das durch die schimärische DNA codiert wird, ein analysierbarer Enzym-Marker ist«

Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist die Entwicklung von neuartigen Methoden zur Identifizierung anderer chemisch regulierbarer DNA-Folgen* Es wird ein Vektor, der eine mutmaßliche chemisch regulierbare DNA-Folge enthält, hergestellt, beispielsweise aus einem wirt-selektrierbaren Marker und einem selektierbaren oder analysierbaren Marker« Zu den ge-

eigneten selektierbaren Markern gehören Antibiotika-Resistenz-Gene und Herbizid-Resistenz-Gene«, Repräsentative Antibiotika-Resistenz-Gene sind die für Hygromyzin_} Kanamyzin, Chloramphenikol, Bleomyzin, Puromyzin, Lincomyzin, G4I8 und Methotrexate Ein besonders geeignetes Gen zur Resistenz gegenüber Hygromyzin ist Aminoglykosidphosphotransferase IV* Geeignete Vektoren für die Transformation von Pflanzen, die das Hygromyzin-Resistenz-Gen enthalten, wurden von Rothstein, S« J. u. a., Gene 53, 153 (1987), beschriebene Beispiele für Herbizidresistenz-Gene codieren beispielsweise auf Sulfonylharnstoffe, Glyphosat, Phosphinotrizin und Atrazine

Zu den geeigneten analysierbaren Markern gehören Enzym-Gene, Gene für Antigene, Immunoglobuline und ähnliche sowie Antibiotikaresistenz-Gene_e Zu den geeigneten Enzym-Markern gehören LUX, CAT, NPT, NOS, OGS, GUS, AHAS und 3T. Ein besonders geeignetes Enzym ist Beta-1,3-Glukuronidase (GUS), weil es eine besonders einfache Enzymanalyse ermöglicht. Die DNA-Polgecodierung für die analysierbaren Marker kann unter Anwendung herkömmlicher Techniken in den Vektor eingefügt werden·

Die mutmaßliche regulierbare DIIA-Folge wird im typischen Fall neben dem analysferbaren Marker-Gen eingefügt, so daß die Expression des analysierbaren Markers unter der Steuerung durch die mutmaßliche DIIA-Polge geschieht» Dann wird der Vektor zur Transformation von Pflanzengewebe oder eines anderen geeigneten Wirts verwendet. Das transformierte Pflanzengewebe oder der Wirt werden auf der Grundlage des pflanzenselektierbaren Markers, im typischen Pail der antiebiotischen Resistenz ausgewählt. Dann wird auf das Pflan-

zengewebe oder den anderen Wirt ein chemischer Regler aufgebracht, gefolgt von der Selektion oder der Regeneration des transformierten Gewebes» Die Induzierung oder Unterdrückung des analysierbaren Markers nach der Aufbringung des chemischen Reglers identifiziert die mutmaßliche DNA-Folge als eine, welche die Transkription einer benachbarten DNA-Folge regulieren kann, wobei die Regulierung von einem chemischen Regler abhängig ist. Die Analyse kann an ganzen, regenerierten oder transformierten Pflanzen, beispielsweise durch Aufbringung des chemischen Reglers auf die Blätter oder anderes Pflanzengewebe und Messung der Expression des analysierbaren Markers,durchgeführt werden. Als Alternative dazu kann die Analyse an transformiertem GaI-lusgewebe oder einem anderen Wirt in Zellkultur durchgeführt werden, wozu die mutmaßliche chemischer Reglersubstanz auf die Callus- oder andere Kultur aufgebracht und die Expression des analysierbaren Markers gemessen wird.

Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Identifizierung einer chemisch regulierbaren DNA-Folge, das besteht aus den Schritten:

(a) Transformation eines Wirts mit einer mutmaßlichen chemisch regulierbaren DNA-Folge oder einem Vektor, der diese Folge enthält, einer zweiten DNA-Folge, die ein wirtselektiver Gen-Marker ist, und einer dritten DIIA-Polge, welche für ein phänotyisches Merkmal codiert;

(b) Aufbringung eines chemischen Reglers auf diesen transformierten Wirt und

(c) Messung der Expression oder Selektion zur Änderung der Jxpression des phänoxypischen Merkmals, das durch die drit-

te DNA-Folge codiert wird»

Bevorzugt wird dabei ein Verfahren, bei welchem diese dritte DNA-Folge ein wirtselektierbarer oder ein analysierbarer Gen-Marker ist, und ein Verfahren, bei welchem die zweite oder dritte -DNA-Folge ein Gen-Marker für Herbizidresistenz oder Antibiotikaresistenz ist, der beispielsweise ausgewählt wurde aus der Gruppe Hygromyzin, Kanamyzin, Chloramphenikol, Bleomyzin, Puromyzin, Linkomyzin und Methotrexat-Resistenz-Genen, z« B_e einem Aminoglykosidphosphotransferase-IV~Hygromyzinresistenz-Gen_e

Bevorzugt wird auch ein Verfahren, bei welchem die mutmaßliche chemisch regulierbare DNA-Folge der dritten DNA-FoI-ge zugeordnet ist und vorzugsweise neben dieser liegte Weiterhin bevorzugt wird ein Verfahren, bei welchem der transformierte Wirt Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen ist»

Außerdem wird ein Verfahren bevorzugt, bei welchem die dritte DNA-IOlge auf einen analysierbaren Enzym-Marker- codiert, der aus folgender Gruppe ausgewählt wurde: Luziferase (LUX), Ghloramphenikolazetyltransferase (CAT), Neomyzinphosphotransferase (NPT), Kopalinsynthase (KOS), Oktopinsynthase (OCS), Beta-1,3-glukuronidase (GUS), Azetohydroxysäuresynthase (AHAS) und Bacillus thuringiensis-Endotoxin (BT),

Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung sind im wesentlichen reine, chemisch regulierbare DNA-FoIgen,, .die durch die genannten Verfahren identifiziert werden*

Die vorliegende Erfindung sieht auch eine Methode für die Auswahl von. transformiertem Pflanzenmaterial vor. Pflanzen-

material wird einer exogenen DNA-Folge ausgesetzt_s die eine chemisch regulierbare DNA-Folge enthält, für welche ein chemischer Segler bekannt ist, und eine zweite DNA-FoIge für ein phänotypischea Merkmal wird mit dem Regler behandelt und die Expression des phänotypischen Merkmals angestrebt« Die Beobachtung des Merkmals bestätigt, daß die Transformation der mutmaßlichen Transformanten tatsächlich erfolgt ist. Zu den typischen phänotypischen Merkmalen für die Zwecke dieser Methode gehören die oben beschriebenen wirtselektiven Marker und die analysierbaren Marker«

Insbesondere schließt die Erfindung eine Methode ein zur Auswahl von transformierten Pflanzenzellen oder -gewebe, die einer transformierenden DNA-Behandlung unterzogen wurden, die aus einer ersten DIJA-Komponentenfolge besteht, welche durch einen bekannten chemischen Regler chemisch regulierbar ist , und einer zugeordneten zweiten DHA-FoIge, welche für ein phänotypisches Merkmal codiert, wobei diese Methode aus den folgenden Schritten besteht: (a) Behandlung von mutmaßlichen Transforxaanten mit dem bekannten chemischen Regler und (b) Auswahl von Transformanten nach der Expression des phänotypischen Merkmals, das durch die zweite DNA-Folge codiert wurde. Eine bevorzugte Methode ist eine solche Methode, bei der dieses phänotypische Merkmal antibiotische Resistenz ist, beispielsweise Resistenz gegen Hygromyzin, Kanomyzin, Chloramphenikol, Belomyzin, Puromyain, Linkomyzin, G418 und Kiethotrexat, oder ein analysierbarer Enzym-Marker, der beispielsweise aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus Luziferase (LUZ), Chloramphenikolazetyltransferase (CAT), Heomyzinphosphotransferase (UPT), Nopalinsynthase (LOS), Oktopinsynthase (OCS), Beta-1,3-Glukuronidase (GUS), Azetohydroxysäuresynthase (ArUb)

und Bacillus thuringiensis-Endotoxin (BT) besteht» G. SignaIpeptide

Ein Signalpeptid oder eine Signalfolge ist eine spezielle N-terminale Aminosäurefolge in einem Protein, die in das endoplasmische Netzwerk eintritt о Sine solche Folge enthält in eukaryotisehen Zellen im typischen Pail etwa 15 bis 40 Aminosäurereste, von denen viele hydrophob sind· Die Folge wird schließlich vom reifen Protein geschnittene

Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist das Signalpeptid eines chemisch regulierbaren Gens bei der Konstruktion der oben beschriebenen dreiteiligen schimärischen Konstruktionen von Nutzen» Diese schimärischen Konstruktionen enthalten eine erste, chemisch regulierbare Folge, eine zweite DNA-Folge, die für ein Signalpeptid in Proteinen codiert, und eine dritte Folge, die für ein phänotypisches Merkmal codiert. Das phänotypische Merkmal ist vorzugsweise ein leicht feststellbares, beispielsweise in einem Analyseoder Probeverfahren. Die Einbeziehung einer für ein Signalpeptid codierenden DNA-Folge in die schimärische Konstruktion ermöglicht es, daß das durch die dritte DNA-Folge expressierte Produkt vom endoplasmischen Netzwerk der Wirtszelle zur endgültigen Zielstelle hin weg gerichtet ist.

Ein zusätzliches Merkmal der Erfindung ist daher ein Signalpeptid vom Tabak-PR-la-Protein und ein Protein mit einer Aminosäurefolge, das eine wesentliche Sequenzhomologie zu diesem Peptid hat» Die Aminosäurefolge für dieses Peptid lautet:

MetGlyPheValLeuPheSerGlnLeuProSerPheLeuLeuVal-SerThrLeuLeuLeuPheLeuVallleSerHisSerCysArgAla.

Vorliegende Erfindung beinhaltet auch die DNA-Folge, die für dieses Peptid (Siehe Folge 1) codiert, und DNA-Folgen, die wesentliche Sequenzhomologie zu dieser Folge haben» Wie bereits ausgeführt, beinhaltet die Erfindung auch (1) DNA-Folgen, welche die chemisch regulierbare Folge in Kombination mit der für das Signalpeptid codierenden Folge enthalten, und (2) dreiteilige schimärische DNA-Folgen, welche die chemisch regulierbare Komponente, die Codierungssektion für ein Signalpeptid und eine DNA-Folge, die transkribiert wird, vorzugsweise mit Translation, enthaltene

H₉ Neuartige PR-Gene

Vorliegende Erfindung betrifft auch neu isolierte und identifizierte PR-genomische DNA- und cDNA-Folgen von Genen, die hier als PR-Ia, PR-V und PR-R von Tabak, die pathogeninduzierbare Chitinase von Gurke, PR-Q von Tabak, die basische ß-1,3-Glukanase 39-1 und 39.3 von Tabak, saure ß-1,3-Glukanase von Tabak bezeichnet werden, und DNA-Folgen mit wesentlicher Sequenzhomologie zu diesen Genen«, Die DNA-Folgen dieser Gene werden in den Folgen 1 bis einschließlich dargestellt. Die neuartigen Gene der Folgen 1, 2, 5 und 6 (PR-Ia, PR-V und ß-1,3-Glukanase 39*1 bzw, 39*3) stellen auch Ausführungsbeispiele der nicht-codierenden, chemisch regulierbaren DNA-Folgen nach der Erfindung, wie sie oben erwähnt wurden, darβ Die neuartigen Sequenzen 3, 4, 7 und codieren für die PR-Proteine Gurkenchitinase, Tabak-PR-R, Tabak-PR-Q und die saure Form von Tabak-ß-1,3-Glukanase, Einzelheiten zur Isolierung und Charakterisierung der Gene werden in den Beispielen gegeben*

Ι_β Chemische Regler

.Sin chemischer Regler ist als eine Substanz definiert, welche die Expression eines Gens durch eine chemisch regulierbare DNA-Folge unter bestimmten Bedingungen reguliert, wie das in der Definition des Begriffs angegeben wird. Die Substanz, in ionischer oder neutraler Form, mit oder ohne löslichmachende oder andere komplexbildende Moleküle(n) oder Anionen), ist in der Regel im "Verhältnis zu dem System, das das chemisch regulierbare Gen zum gewünschten Regulierungszeitpunkt enthält, exogen. Die Verwendung von exogenen chemischen Reglern wird auf Grund der Einfachheit und Leichtigkeit der Steuerung der Menge des Reglers im System bevorzugt» Die Erfindung schließt jedoch auch die Verwendung von endogenen Reglern ein, z. B₈ Chmikalien, deren Aktivität oder Pegel im System künstlich durch andere Komponenten im System oder auf das System wirkend gesteuert wird«

Zu den chemischen Reglern gehören Chemikalien, von denen bekannt ist, daß sie PR-Proteine in Pflanzen induzieren, oder deren enge Derivate. Dazu zählen Benoesäure, Salizylsäure, Polyakrylsäure und deren substituierte Derivate; geeignete Substituenten sind u. a, niedere Alkyl-, niedere Alkoxy-, niedere Alkylthio- und Halogengruppen* Bei der Aufbringung auf Pflanzengewebe, vorzugsweise auf die Blätter der ganzen Pflanze, entwickeln sich im Pflanzengewebe erhöhte Pegel an mRHA und PR-Proteinen«.

Eine weitere Gruppe von Reglern für die chemisch regulierbaren DHA-Polgen und die schimärischen Gene dieser Erfindung basiert auf der Benzo-1,2,3-thiadiazolstruktur und schließt die folgenden Typen von Verbindungen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Benzo-1,2,3-thiadiazolkarbonsäu-

re, Benzo-1,2,3-thiadiazolethiokarbonsäure, Zyanobenzo-1,2,3-thiazol, Benzo-1,2,3-thiadiazolkarbonsäureamid, Benzo-1,2,3-thiadiazolkarbonsäurehydrazid und deren Derivate*

bevorzugte Gruppe von Reglern schließt Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-karbonsäure, Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-thiokarbonsäure, 7-Zy.anobenzo-1,2,3-thiazol, Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-karbonsäureamid, Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-karbonsäurehydrazid und deren Derivate ein, ohne darauf beschränkt zu sein«

Zu den geeigneten Derivaten gehören, ohne auf die genannten beschränkt zu sein, Vertreter der genannten Typen von Verbindungen, bei denen die Benzo-1,2,3-Thiadiazolkomponente unsubstituiert oder substituiert ist durch kleine Substituenten,"wie sie normalerweise in aromatischen Ringsystemen von Agrochemikalien eingesetzt werden, wie niederes Alkyl, niedere Alkoxygruppe, niederes Haloalkyl, niedere Haloalkoxy-, niedere Alkylthio-, Zyano-, Nitrogruppe und Halogen» Zu den geeigneten Derivaten gehören außerdem, ohne auf die genannten beschränkt zu sein, Vertreter der genannten Benzo-1,2,3-thiadiazolverbindungen, bei denen entweder die karbonsäure-, die thiokarbonsäure-, die karbonsäureamid- oder die karbonsäurehydrazidfunktionelle Gruppe unsubstituiert oder substituiert sind durch aliphatische, araliphataische oder aromatische Reste« Zu den geeigneten Resten gehören, ohne auf diese beschränkt zu sein, Alkyl (vor allem niederes Alkyl), Alkozygruppe (vor allem niedere Alkoxygruppe), niederes Alkoxyalkyl, Alkoxyglkoxyalkyl, Zykloalkyl, Zykloalkylalkyl, Phenylalkyl (vor allem Benzyl), LTaphthylalkyl, Phenoxyalkyl, Alkenyl und Alkinyl, worin der Alkylteil des Substituenten unsubstituiert oder substituiert

ist durch eine Hydroxy-, Halogen-, Zyano- oder Nitrogruppe und der aromatische Teil des Substituenten unsubstituiert oder substituiert ist durch kleine Substituenten, wie sie normalerweise in aromatischen Ringsystemen in Agrochemika-Iien eingesetzt werden, wie niederes Alkyl, niedere Alkoxygruppe, niederes Haloalkyl, nieder Haloalkoxygruppe, niedere Alkylthiogruppe, Zyanogruppe, Nitrogruppe und Halogen»

Segler, die auf der Benzo-1₉2,3-thiadiazolstruktur basieren, schließen alle Molekularsysteme ein, die das tatsächlich als Regler wirkende Molekül freisetzen können.

Eine bevorzugte Gruppe von Reglern auf der Grundlage der Benzo-1,2,3-thiadiazolstruktur schließt Benzo-1,2,3-thiadiazolkarbonsäure, Alkylbenzo-1, 2,3-thiadiazolkarbo.xylat ein, bei denen die Alkylgruppe ein bis sechs Kohlenstoffatome hat, und die substituierten Derivate dieser "Verbindungen. Zu den geeigneten Substituenten gehören niederes Alkyl, niedere Alkoxy-, niedere Alkylthiogruppe und Halogen» Insbesondere sind Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-karbonsäure und deren Alkylester, z. B_e Methylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7-karboxylat, bevorzugte Induktoren für die schimärischen DNA-Polgen, die chemisch regulierbare DIIA-Polgen enthalten, welche von PR-Protein-Genen isoliert wurden. Die Synthese der genannten chemischen Regler und ihre Anwendung als Biozide kann der Br-PS 1 176 799 und Kirby, P, u. a., J. Chern. Soc. C 2250 (1970), entnommen werden.

Derivate von Benzo-1,2,3-Thiadiazol, die außerdem als Regler nach der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, werden in der US-Patentanmeldung, Serien-'J 234 241 vom 18. August 1988 beschrieben, die hier als Verweis einbezogen wird.

Von den bevorzugten Spezies auf der Grundlage der Benzo-1,2,3-thiadiazolstruktur können beispielsweise Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-karbonsäure, Methylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7-karboxylat, n-Propylbenzo-1, 2,3-thiadiazol-7-karbo.xylat, Benzylbenzo-1, 2,3-thiadiazol-7-karbo.xylat, Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-karbonsäuresecbutylhydrazid und ähnliche genannt werden»

Eine weitere Gruppe von Reglern für die chemisch regulierbaren DNA-Folgen dieser Erfindung basiert auf der Pyridinkarbonsäurestruktur, beispielsweise der Isonikotinsäurestruktur und vorzugsweise der Haloisonikotinsäurestruktur. Bevorzugt werden Dichloroisonikotinsäuren und deren Derivate, beispielsweise die niederen Alkylester« Geeignete Regler dieser Klasse von Verbindungen sind beispielsweise 2,6-Dichloroisonikotinsäure und deren niedere Alkylester, vor allem der Methylester.

Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist folglich ein Verfahren zur Regulierung der Transkription eines chemisch regulierbaren Gens, wobei dieses Verfahren darin besteht, auf Pflanzengewebe, eine Pflanze oder Samen einen solchen Regler aufzubringen, wenn in den genannten Pflanzenteilen eine chemisch regulierbare DNA-Folge enthalten ist, wie sie oben in den Teilen A, B oder C beschrieben wurde. Bevorzugt wird ein solches Verfahren, bei dem das Pflanzengewebe, die Pflanze oder der Samen eine chemisch regulierbare DNA-Folge enthält, die oben als bevorzugt genannt wurde.

Die chemischen Regler können in reiner Form, in Lösung oder Suspension, als Pulver oder Sxaube oder in anderen herkömmlichen Rezepturen, wie sie landwirtschaftlich oder in Bioreaktorverfahren eingesetzt werden, angewendet werden_e 3u

diesen Zusammensetzungen können flüssige oder feste Trägermittel gehören, d« h., Stoffe, mit denen der Regler kombiniert wird, um die Aufbringung auf die Pflanze, das Pflanzengewebe, die Zeil- oder Gewebekultur oder ähnliches zu erleichtern oder um die Langerungs-, Handhabungs- oder Transporteigenschaften zu verbessern« Zu den Beispielen für geeignete Trägermittel gehören Silikate, Tone, Kohlenstoff, Schwefel, Harze, Alkohole, Ketone, aromatische Kohlenwasserstoffe und ähnliches. Wenn die Reglerzusammensetzung als herkömmliches benetzbares Pulver oder wässrige Emulsion hergestellt wird, kann sie eines oder mehrere der herkömmlichen Benetzungsmittel, ionische oder nichtionische, enthalten, beispielsweise BefeuchiuEgs-, Emulgier- oder Dispergiermittel.

Die Regler können auf Pflanzen auch in "Verbindung mit einem anderen Mittel aufgebracht werden, das wünschenswert ist, um Vorteile für die Pflanze zu bringen, wobei dieser Vorteil mit dem durch das schimärische Gen, das durch den Regler reguliert wird, gesteuerte Merkmal im Zusammenhang stehen kann aber nicht muß. Beispielsweise kann ein Regler mit einem Düngemittel gemischt werden und unmittelbar vor der Expression eines transgenen Merkmals aufgebracht werden, das nicht mit der gewünschten Düngung im Zusammenhang steht о Oder er kann mit einem Herbizid gemischt und so aufgebracht werden, daß die Wirkung des Herbizids zu einem Zeitpunkt abgeschwächt wird, zu dem diese V/irkung sonst ein Maximum erreichen würde«

Als flüssige Zusammensetzung kann der Regler als Sprühmittel auf die Pflanzenblätter, -stengel oder -zweige, auf Samen vor der Aussaat oder auf den Boden oder ein anderes

Wachstumsmittel, das die Pflanze hält, aufgebracht werden» Regler können auch in Bioreaktorsystemen eingesetzt werden, wobei die Regulierung durch einen einzigen Zusatz der Reglerzusammensetzung zum Reaktionsmedium oder durch den allmählichen Zusatz über eine festgelegte Zeitspanne erfolgt.

Der Regler wird in einer Menge und über eine Zeitspanne eingesetzt, die ausreichend sind, um die gewünschte Regulierung zu erreichen«, Ein bevorzugter Regler weist keine oder nur minimale phytotoxisch^ oder andere schädliche Wirkungen auf die Pflanze, das Pflanzengewebe oder die Pflanzenzellen auf, auf welche er in der eingesetzten Menge aufgebracht wird.

Bevorzugte DNA-Polgen unter den oben im Teil A oder B beschriebenen und bevorzugte schimärische DNA-Folgen unter den oben im Teil C beschriebenen sind vor allem die, bei denen die Transkription durch einen chemischen Regler, wie er oben erwähnt wurde, reguliert wird, der beispielsweise ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Benzoesäure, Salizylsäure, Azetylsalizylsäure, Polyacrylsäure und deren substituierten Derivaten besteht, oder ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Benzo-1,2,3-thiadiazolkarbonsäure, Benzo-1,2,3-thiadiazolthiokarbonsäure, Zyanobenzo-1,2,3-thiadiazol, Benzo-1,2,3-thiadiazolkarbonsäureamid, Benzo-1,2,3-thiadiazolkarbonsäurehydrazid und deren Derivaten besteht, oder Dichloroisonikotinsäure oder einem seiner Derivate« Besonders bevorzugt werden die DITA-Folgen, bei denen die Transkription durch die genannten bevorzugten chemischen Regler regulier!; wird, beispielsweise durch Benzo-1,2,3-xhi3diazol-7-karbonsäure, Methylbenzo-I,2,3-thiadiazol-7-karboxylat, n-Propylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7-karboxylat,

Benzylbenzo-1, 2,3-thiadiazol-7-karbo:x:ylat, Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-karbonsäuresecbutylhydrazid, 2,6-Dichloroisonikotinsäure oder Methyl-2,6-dichloroisonikotinat, insbesondere Methylbenzo-1 ,2,3-th.Iadiazol-7-karboxylat_e

J₈ Deponierungen beim ATCC

Die folgenden Bakterien, Plasmide und Suspensionskultur wurden beim American Type Culture Collection hinterlegt:

Д. coli HB1O1/pTJS75-Km, ATCC-IS 67628, hinterlegt am 11. Februar 1988;

Plasmid pBS-ERIO^Cla, ATCC-K2 40426, hinterlegt am 11. Februar 1988;

Plasmid pBS-PRIO-19, ATCC-IS 40427, hinterlegt am 11. Februar 1988;

Zea mays-Suspensionskultur 6-2717-GC, ATCC-IS 40326,hinterlegt am 20. Mai 1937;

Plasmid pBS-Gluc39*1, ATCC-Ii 40526, hinterlegt am 29* Dezember 1988;

Plasmid pBS-Gluc39*3, АТСС-іЗ 40527, hinterlegt am 29· Dezember 1938;

Plasmid pBScucchi/Chitinase, ATCC-^ 40528, hinterlegt am 29. Dezember 1988;

Plasmid pBSGL6e, ATCC-Ki 40535, hinterlegt am 18. Januar 1989.

K. Zusammenfassung der experimentellen Protokolle

Die schimärischen Gene der vorliegenden Erfindung enthalten chemisch regulierbare DIiA-PoIgen von einer beliebigen Quelle, natürlich oder synthetisch, in Verbindung mit einer oder mehreren transkribierbaren DNA-Polgen; in der Regel wird wenigstens ein Teil der transkribierbaren Polge in ein phänotypisches Merkmal translateriert, obwohl die Erfindung auch schimärische Gene einschließt, die durch einen "Anti-sense"-Mechanismus wirken. Die folgende Beschreibung und viele der Beispiele beschäftigen sich zwar mit chemisch regulierbaren DHA-Polgen, die natürlich in einem Pflanzen-Genom vorkommen, die Erfindung betrifft aber gleichermaßen solche Polgen, die in anderen-natürlichen Systemen vorkommen, beispielsweise bakteriellen, viruellen und tierischen Systemen, da Techniken zur Isolierung solcher Polgen aus ihren natürlidsn Systemen allgemein bekannt sind. Außerdem sind Polgen, die von synthetischen oder anderen nicht-natürlichen Systemen abgeleitet wurden, ebenso eingeschlossen.

Sine chemisch regulierbare DiTA-PoIge wird aus der Quelle isoliert, in welcher sie natürlich oder synthetisch vorhanden ist, und, soweit erforderlich, nach herkömmlichen Methoden charakterisiert. Wenn die DiTA-Polge aus einem natürlich vorkommenden Gen isoliert wird, wird dieses Gen durch einen geeigneten Regler , entweder durch einen chemischen oder einen anderen bekannten Regler für das Gen, aktiviert. Die aus dieser Aktivierung resultierende REA wird isoliert und zur Konsxruktion einer сША-Bibliothek verwendet.Diese Bibliothek wird zur differentiellen "screening" unter Verwendung von radiomarkierter сDlTA verwendet, die

erzeugt wird sowohl aus (1) RWA, die vom aktivierten System isoliert wurde, als auch von (2) RNa, die von einem zweiten, nicht durch den Regler aktivierten System isoliert wurde. Dieses differentielle "screening" ist, wie bereits oben erwähnt wurde, ein besonderer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung» Die Klone, welche die chemisch regulierte cDNA enthalten, werden dann isoliert und vorzugsweise an diesem Punkt sequenzierte Anschließend werden die cDEA-Klone zur Identifizierung und Isolierung eines genorischen Klons aus einer genomischen Bibliothek verwendet, wobei dieser genomische Klon die chemisch regulierbare DMA-Folge enthält« Dieses Gen wird vorzugsweise sequenziert, und die chemisch regulierbare DHA-Folge wird funktionell kartiert durch Subklonierung von Fragmenten dieses Gens, ihre Ligation an ein Reporter-Gen und die Bewertung ihrer Aktivität in transgenem Pflanzenmaterial oder in einem transienten Pflanzenexpressionssysteme

Für die PR-Protein-Gene von Tabak wird unter Anwendung von Standardtechniken eine )w-genomische Bibliotehk konstruiert, und die Klone, welche die chemisch regulierbaren DNA-Folgen aufweisen, werden identifiziert und gereinigt. Siner dieser Klone wird charakterisiert* Es werden Restriktionsfragmente, welche die chemisch regulierbare DNA-Folge tragen, identifiziert; beim PR-1a-Gen schließen diese Gen-Fragmente ein Clal-Fragment von etwa 20 000 Basenpaaren, ein Hindlll-Fragment von 6'5OO Basenpaaren und ein EcoRI-Fragment von 3600 Basenpaaren ein» Das Hindill-Fragment enthält etwa 500 codierende Basenpaare und etwa 6000 nichfc-codierende Basenpaare im 5'-Flankierungsbereich im Anschluß an die Transi- -cionsstartstelle. Einige dieser Fragmente werden in Plasmide

subkloniert, um als ША-Quellen für das weitere Subklonieren und die volle Charakterisierung verwendet zu werden, d. h_a, die Restriktionskartierung, die DNA-Sequenzierung und Identifizierung der Transkriptionsstartstelle des G^ns· Beim PR-1a-Gen ist das 3600 Basenpaare umfassende EcoRI-Fragment direkt von einem A-g^e*iomischen Klon subkloniert und anschließend in einen Endklon von etwa 1200 Basenpaaren subkloniert, der von den Xhol- und Pstl-Stellen flankiert wird. Dieser Klon enthält eine chemisch induzierbare DNA-Folge vom PR-1a-Gen und einen Abschnitt des anschließenden Codierungsbereiches für dieses Gen; dieser Abschnitt schließt die Codierungssequenz für das Signalpeptid des PR-Ia-Protein-Gens ein.

Ebenso werden genomische Klone isoliert, die für die basische Form von Beta-1,3-Glukanase codieren» Es werden zwei als 39«1 und 39.3 bezeichnete Klone charakterisiert und Restriktionsfragmente, welche chemisch regulierbare DNA-Folgen aufweisen, identifiziert*

Unter Anwendung der Vektoren dieser Erfindung können diese Klone dann für die Herstellung von schimärischen Genen, welche die drei oben behandelten Teile enthalten, verwendet werden« Diese schimärischen DNA-Folgen enthalten die chemisch regulierbare Folge, einen Teil der transkribierbaren DNA und eine dritte DNA-Folge von einer Fremdquelle,, Als Alternative dazu können die Klone weiter manipuliert werden, z- B. durch gerichtete Mutagenese, um vollständig oder zum größten Teil ein mögliches Codierungsfragment vom Stammgen zu entfernen, bevor ein Codierungsfragment von einer Fremdquelle angefügt wird, um ein zweiteiliges schimärisches Gen herzustellen, wie das oben beschrieben wurde.

Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel stellt der Teil des schimärischen Gens, der die chemisch regulierbare Folge nicht ist, ein Reporter-Gen für ein leicht zu beobachtendes oder nachweisbares phänotypisches Merkmal dar« Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Gene für Beta-1,3-Glukuronidase, den Y/ildtyp von und herbizidresistente Azetohydroxysäuresynthase und Bacillus thuringiensis-Endotoxin, es ist aber eine Vielzahl anderer Reporter-Gene vorstellbar, wie das oben ausgeführt wurde« Bei einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel codiert die codierende Komponente der DNA-Folge des schimärischen Gens für Toleranz oder Resistenz gegenüber Herbiziden oder für Insektenresistenz. Dieses Ausführungsbej^iel wird veranschaulicht durch die genannten Gene für Azetohydroxysäuresynthase und Bacillus thuringiensis-» undo toxin.,

Die schimärischen Gexie und Vektoren, welche diese Gene enthalten, können in Pflanzenaellen durch eine Vielzahl von Techniken eingeführt werden, durch welche transformierte Zellen, Gewebe und Pflanzen entstehen, oder in Zellkulturen, wie sie in Bioreaktoren eingesetzt werden* Verschiedene Techniken werden in den anschließenden Beispielen detailliert beschrieben, sie beziehen sich auf einkeimblättrige wie auf zweikeimblättrige Pflanzen. Einige dieser Methoden, die hier zu Ausführungszwecken einbezogen werden, sind Gegenstand anderer Patentanmeldungen, insbesondere der US-Patentanmeldung, Reihen-i.2 056 506 vom 29. Mai 1987, und der US-Patentanmeldung, Reihen-!^ 165 665 vom 8. März 1988.

Anschließend kann das transformierte Pflanzenmaterial mit einem chemischen Regler behandelt und die Expression des phänotypischen Reporter-Gens beobachtet und/oder gemessen

werden.« Diese Art von System stellt ein einfaches "screenings "-Instrument zur Identifizierung der regulatorischen Aktivität von bestimmten Chemikalien dar. Die Erfindung betrifft auch eine verbesserte Untersuchung der beta-1,3-glukuronidase-(GUS)-enzymatischen Aktivität_s welche das "screening" einer großen Anzahl von Proben mit hoher Präzision und in kurzer Zeit ermöglicht» Insbesondere besteht diese Untersuchung in der Reaktion von Pflanzengewebeextrakten in Proben von weniger als 0,5 ml_s die 1,5 bis 3 mM 4-Methylumbelliferylglukuronid enthalten, bei etwa 37° C für die Dauer von 1 bis 5 Stunden und in der Bestimmung der Konzentration des freigesetzten fluoreszenten Indikators,

Die quantitative Bestimmung der stationären Werte von RNA ist ein wesentlicher Schritt bei der Analyse der Gen-Expression* Zu deisem Zweck wurde eine Starter-Extensionsuntersuchung entwickelt» Diese Methode der Erfindung beinhaltet die Markierung eines genspezifischen Oligonukleotids auf eine hohe spezifische Radioaktivität, die Hybridisierung des Oligonukleotids auf eine RNA-Probe und die Weiterführung des Hybrids mit Umkehrtranskriptase. Die Extensionsprodukte werden auf denaturierenden Akrylamidgelen getrennt und durch Autoradiografie sichtbar gemacht« Zu den Vorteilen dieser Methode gehören im Vergleich zu früheren Untersuchungen Leichtigkeit der Sondenherstellung, Einfachheit des Untersuchungsprotokolls und die zur Ausführung der Untersuchung benötigte Zeit,, Dieser Starter-Extensionsuntersuchung ist ebenso sensitiv und quantitativ wie die 31-Kartierung»

Die Starter-Extensionsuntersuchung, wie sie unter den unten in den Beispielen beschriebenen besonderen Reaktionsbedin-

gungen angewendet wird, ist für die Bestimmung des Pegels der PR-1-mRNA in der Gesamt-RNA optimiert, welche aus TMV-infizierten Tabakblättern extrahiert wird. Die PR-1-mRNA wird auf der Grundlage der quantitativen Analyse der Starter-Extensionsdaten und der Häufigkeit der сША-Klone in einer von dieser RNA abgeleiteten cDNA-Bibliothek als 1 % der mRNA in diesen Blättern ausgedrückte Zu den Verbesserungen der Methode der Erfindung gegenüber den vorher beschriebenen gehören die Markierung des Oligonukleotiden auf eine hohe spezifische Aktivität, die geringe Molarmenge der bei der Untersuchung verwendeten Sonde (im typischen Fall etwa 0,01 bis 0,05 pMol) ₉ die optimierte Hybridisierung und Zeitverlängerung und die optimierten Nukleotidtriphosphatkonzentrationen»

Die Erfindung schließt daher eine Methode zur Bestimmung der Menge einer spezifischen RNA in einer RNA-Lösung ein, die besteht aus

(a) der Markierung eines RNA-spezifischen Starter-01igonukleotiden mit einer Länge von 12 bis 18 Nukleotiden auf eine hohe spezifische Radioaktivität;

Cb) der Hybridisierung der RNA mit dem markierten Oligonukleotiden bei einer Konzentration zwischen 0,1 und 20 nM für die Dauer zwischen 2 Minuten und 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 37 G;

(c) der Verlängerung des Starter-Oligonukleotiden mit Umkehrtrnaskriptase bei Vorhandensein von Nukleotidtriphosphaten bei einer Konzentration zwischen 0,003 und 1 mM für die Dauer von 1 bis 120 Minuten und

(d) der Trennimg und Sichtbarmachung der Verlängerungsprodukte durch Autoradiografie.

Ausftihrungsbeispiele

Mt den folgenden Beispielen wird die vorliegende Erfindung weiter veranschaulicht. Sie sind in keiner Weise als Einschränkung des Rahmens und der Bedeutung der Patentansprüche zu betrachten«.

Enzymreaktionen werden entsprechend den vom Hersteller empfohlenen Verfahren ausgeführt, wenn nichts Gegenteiliges angegeben wird» Die schimärischen Gene und Vektoren der vorliegenden Erfindung werden unter Anwendung von Techniken konstruiert, wie sie in Fachkreisen bekannt sind« Geeignete Techniken wurden beschrieben von Maniatis, T. u, a., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, New York (1982); Methods of Enzymology, Bd- 68, 100, 101 und 118 (1979, 1983, 1983 und 1986), und ША-Cloning, Glover, D. M*, Hsgo IRL Press, Oxford (1985). Die Mediumzusammensetzungen wurden beschrieben bei Miller, J. H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972) sowie in den oben genannten Literaturangaben.

Abkürzungen;

ATP Adenosintriphosphat

bp Basenpaar

CETAB Hexade zyltrime thylammoniumbromid

2,4-D 2,4~Dichlorophenoxyessigsäure

dTT Dithiothreitol

Dicamba 3*6-Dichloro-2-methoxybenzoesäure

EDTA Ethylendiamin-$r,li,M'' ,N'-Tetraessigsäure

kb Kilobasenpaar

MBS 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure

Щ 4-Methylumbelliferylglukuronid

PEG Polyethylenglykol

Picloram 4-Amino-3 _f 5 , 6-trichloropikolinsäure

SDS Natriumdodekylsulfat

Ti¹A Trifluoroessigsaure

TMV Tabakmosaikvirus

Tris-HGl Tris(hydroxymethyl)methylaminhydrochlorid

Medien :

SH-O-Medium: Medium von Schenk, R. U₉ u* a., Can« J. Bot·», 50 (1972) 199 - 204; ohne Hormone. SH-Medium kann flüssig oder mit 0,8 % Agar oder mit 0,5 % GelRite verfestigt sein« Das Medium wird normalerweise durch Wärme bei 230° - 250° P (ca_e 110° - 121° C) für die Dauer von 15 bis 20 min sterilisierte

SH-30-Medium; SH-O-Medium, das 30 μπι Dicamba enthält»

SH-45-Medium; SH-O-Medium, das 45 /Am Dicamba enthält*- RY-2-Medium: Medium von Yamada, Y* u_e a., Plant Cell Reports, 5, 85 - 88 (1986).

QMS-Medium: Medium von Murashige, T₈ und Skoog* F,, Physiologie Plantarum 9, 473 (1968)_β Das Medium kann mit 0,8 % Agar oder Agarose oder mit 0,5 % GelRite' verfestigt sein*

Tabelle I - Zusammensetzung der verwendeten Medien Medien: KM-8p ^b'^c'^d ТТб

Makroelemente⁸, Mikroelemente⁸ und Pe-EDTA entsprechen den Angaben in der Literatur, KM-Medium nach Kao, K₈ N. u, a., Planta 126, 105 - 110 (1965); Ыб-Medium nach Chu u_e a_e, Scientia Sinica 18, 659 (1975)

Organische Stoffe und Vitamine (mg/1):

Biotin	0,01
Pyridoxin-HCl	1,00
Thiamin-HCl	10,00
Nikotinamid	1,00
Nikotinsäure	0,10
folsäure	0,40
D-Ca-Pantothenat	1 ,00
p-Aminobenzoesäure	0,02
Cholinchlorid	1,00
Riboflavin	0,20
Vitamin B12	0,02
GIyζin	0,10
Zucker und Zuckeralkohole (g/l):
Sukrose	0,25
Glukose	68,40
Mannitol	0,25
Sorbitol	0,25
Zellobiose	0,25
Pruktose	0,25
LIannose	0,25
Rhamnose	0,25

0,5 0,1

0,5

2,0

30,0

Ribose 0,25

Xylose 0,25

Myo-inositol 0,10

Abschließender pH-Wert 5,8 5,6

Sterilisation. Filter Autoklav

Fußnoten:

^aMakroe]anente werden in der Regel als 1Ofach. konzentrierte Lösung bereitgestellt j Ъеі Mikroelementen hat die Vorratslösung eine 100Ofache Konzentration.

Zitronen-, Pumar- und Malonsäure (jeweils mit einer Endkonzentration von 40 mg/1) und Natriumpyruvat (Endkonzentration 20 mg/1) werden als 10Ofach konzentrierte Vorratslösung, abgestimmt auf einen pH-Wert von 6,5 mit NH-OH, hergestellt und diesem Medium zugesetzt;*

^cAdenin (Endkonzentration 0,1 mg/1) und Guanin, Ihymidin, Urazil, Hypoxanthin und Zystosin (jeweils mit einer Sndkonzentration von 0,03 mg/1) werden als 100Ofach konzentrierte Vorratslösung hergestellt, abgestimmt mit NH-OH auf einen pH-Wert von 6,5, und diesem Medium zugesetzt»

Die folgenden Aminosäuren werden diesem Medium unter Verwendung einer 10fachen Vorratslösung,6,5 pH-Wert, IiH₁OH, zugesetzt, um die folgenden Endkonzentrationen zu erreichen: Glutamin (5,6 mg/1), Alanin, Glutaminsäure (je 0,6 mg/1), Zystein (0,2 mg/1), Asparagin, Asparginsäure, Zystin, Histidin, Isoleuzin, Leuzin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin (jeweils 0,1 mg/1).

^eVitaminvorratslösung wird normalerweise in 10Ofacher Konzentration hergestellt.

Materialien:

Agarose: Herstellung und Reinigung von Agarose werden von Guiseley und Renn, "The Agarose Monograph" (Agarose-Monografie), Marine Colloids Division FMC Corp., 1975, beschrieben. Agarose ist einer der Bestandteile von Agar. Kommerziell erhältliches Agar besteht normalerweise aus einer Mischung von neutraler Agarose und ionischen Agaropektin mit einer großen Zahl von Hebengruppen. In der Regel bleibt eine gewisse Zahl von Nebengruppen intakt und bestimmt die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Agarose, wie Gelbildung und Schmelztemperatur. Niedrigschmelzende Agarose, insbesondere SeaPlaque -Agarose, wird als Verfestigungsmittel bevorzugt.

Kaseinhydrolysat: Kaseinhydrolysat - enzymatisches Hydrolysat von Rindermilch, Typ 1, Sigma Co., PO Box 14508, St. Louis, MO 63178, USA.

Zellulose-RS: Zellulose-RS, Yakult Honsha Co., Ltd. 1.1.19 Higashi-Shinbashi, Minato-ku, Tokio, 105 Japan.

GelRite ; GelRite-Gellan-Gummi, Scott Laboratories Inc., Fiskerville, R. I., 02823, USA.

GeneScreen Plus ; Kat.-Ü2 Ν-ώΡ 976, LMI Research Products, Albany St., Boston, MA 02118, USA.

IBI Random primer kit: Zufallsstartergruppe "Prime Time", International Biotechnologies Inc., PO Зоя 1565, ITevj Hy ν en, ΰΤ 07606, USA.

Halgene -Filter: HaIge Co., Division of Sybron Corp», Rochester, N. Y. 14602, USA.

Pectolyase Y-23 : Seishin Pharmaceutical Co« Ltd., 4=13 Koarai-cho, Hihonbashi, Tokio, Japan»

"R T?

Parafilm : Parafilra -Laborfilm, American Can Co« Greenwich., CT 06830, USA..

SSC: 1,54 mM NaCl, 0,154 mM Katriumzitrat.

Spin-Kolonne: Sephadex -G25 vorgepackte Kolonne, Kat.-Di 100402, Boehringer Mannheim Biochemicals, Piscataway, HJ, USA,

ТАД-Pufxer und TB£-Puffer: Tris-Azetatpuffer und Tris-Borat-Puffer - gebräuchliche Puffer für Elektrophorese, sie Ыапіа-tis и, a_e, oben.

1 о Allgemeine Techniken

In dieser Gruppe von Beispielen werden allgemeine Manipulationen beschrieben, die zur Ausführung der folgenden detaillierten Beispiele angewendet werden,

Beispiel 1 - Ligation in Agarose

!lach der Restriktionverdauung von Plasmid-DIIA und der elektrophoretischen Trennung der Fragmente auf einem niedrigschmelzenden TAI]-GeI werden die Bänder, welche die entsprechenden Fragmente enthalten, .präzise herausgeschnitten und auf 65 C erhitzt, um die Agarose zu schmelzen.. Zu 15 al '.",'asser werden 2 bis 5 ul zugesetzt, und man hält die Lösung 10

Minuten lang bei 65° C. Diese Lösung wird auf 37 C abgekühlt und fünf Minuten lang stehengelassen, um die Temperatur zu äquilibrieren. Zusammen mit 1 μΐ T4-DNA-Ligase (New England Beiolabs) werden 2 μΐ lOfacher Ligasepuffer (200 mM Tris, pH-Wert 8,0, 100 mM MgGl₂, 100 mlvl DTT, 10 mM ATP) zugesetzt, und diese Lösung läßt man festwerden und bei 15° C über Nacht inkubieren»

Beispiel 2 - Transformation aus Agarose

Die Agarose, welche die entsprechende DNA enthält, wird durch zehnminütiges Inkubieren bei 65 C geschmolzen. Zu 30 μΐ TE-Puffer (10 mM Tr is, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA) werden 10 ul dieser Lösung gegeben, gemischt und bei Zimmertemperatur stehengelassen. Gefrorene kompetente Zellen (iJ^ coli-Stamm DH5pO werden auf nasses Eis zum Tauen gegeben. Die verdünnte DNA-Lösung wird 200 μΐ Zellen zugesetzt und 20 Minuten lang auf Sis stehengelassen. Die Zellen, welche die DNA enthalten, werden dann einer Wärmeschockbehandlung bei 41° C für die Dauer von 90 s unterzogen« Dann läßt man die Zellen bei Zimmertemperatur 10 min stehen. Es werden 0,8 ml SOC-Medium (Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557 - 580 (1983)), und die Kultur wird bei 37° C eine Stunde lang inkubiert. Einhundert Mikroliter der Kultur werden auf LB-PIatten (Miller, siehe oben) aufgebracht, die 100 .ug/ml Ampizillin (L-amp) enthalten, und die Platten werden über Nacht bei 37 C inkubiert. Es werden positive Kolonien herausgegriffen und wieder auf eine zweite L-amp-Platte aufgestrichen, und die Platten werden über Nacht bei 37 G inkubiert.

Beispiel 3 - Southern-Transfer

Mit verschiedenen Restriktionsenzymen werden unter den vom

Lief er er angegebenen Bedingungen 3 Mg von ТаЪак-ША verdaut» Die DlJA wird mit Phenol extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und dann in Gelbelastungspuffer (15 % Ficoll, 0,025 % Bromophenol Blau, 10 mM EDTA, pH-Wert 8) wieder zur Suspension gebracht. Proben werden belastet und mit 5 V/cm auf einem 0,5 %igen Agarosegel elektrophoretisiert, bis der Bromophenol-Blau-Farbstoff das Ende des Gels erreichte Die DNA wird auf Gene-Screen Plus (DuPont) unter Anwendung des alkalischen Transferverfahrens, das vom Lieferer beschrieben wird, übertragen. Vorhybridisierung, Hybridisierung und Waschen erfolgen nach den Empfehlungen des Herstellers« Hybridisierung wird durch Autoradiografie festgestellt»

Beispiel 4 - Molekularadapter Ein typischer Molekularadapter ist die Folge 5'-GGGATCCCTGCA-3'

für die Umwandlung einer Pstl-Stelle in eine BamHI-Stelle« Dieses Molekül wird auf einem Applied Biosystems Synthesizer unter Anwendung der B-Zyanoethylphosphoramididtchemie synthetisiert und durch Umkehrphasen-HPLC (Hochdruckflüssigkeitschromatografie) gereinigt. Etwa 2 ,ug dieses Oligonukleotiden werden nach Maniatis u. a., siehe oben, S„ 125, kinatisierto Die Oligonukleotidlösung wird im Wasserbad auf 65° C erhitzt und über 30 min auf Zimmertemperatur abkühlen lassen. Ein etwa zehnfacher Molüberschuß dieses hybridisierten Adapters wird zusammen mit zehnfachem Ligasepuffer, T4-DKA-Ligase und einer entsprechenden Yiassermenge verdauter DNA zugesetzt» Eine typische Reaktion ist:

Zu adaptierende DNA:	1	- 2	jul	(-1	pivlol)
Adapter:		1	ді	(•,/1	0 pMol)
10 Z Ligasepuffer:		1	/al
T4-DNA-Ligase:		1	^l
Wasser:	5	- 6

Diese Lösung wird 30 min bei 12 - 15 C inkubiert und für 30 min auf 65° C erhitzt, um die Ligase zu inaktivieren» Salzkonzentration und Volumen werden auf die entsprechende Restriktionsverdauung abgestimmt, und die adaptierte DNA wird verdaut, um das adaptierte "kohäsive Ende" zu exponieren» Nicht-einbezogene Adapter werden entweder durch Elektrophorese auf Agarosegel oder durch sequentielle Isopropanolausfällungen entfernt.

Beispiel 5 - Starterextensionskartierung

Α, Synthese und 5'-Endmarkierung von Startern zur Starter-Extension

Die folgenden Starter-Oligomere werden unter Anwendung eines Applied Biosystems-Synthesizer und der ß-Zyanoethylphosphoramiditchemie synthetisiert:

PR-1: 5'-ATAGTCTTGTTGAGAGTT-3'

GUS: 5'-TCACGGGTTGGGGTTTCTAc-O'

AHAS: 5'-AGGAGATGGTTTGGTGGA-3'

BT: 5'-ATACGTTCTACTATCATAGT-S'

Die Oligonukleotide werden durch Umkehrphasenhochdruckfliissigkeitschromatografie (HPLC) gereinigt. Fünf Pikomol jedes Oligonukleotiden werden kinatisiert (Maniatis, T. u, a., siehe oben, S₉ 125), wobei 200 ^C ³²P-ATP (6000 Ci/mMol,

10 μΰί/^Ι) verwendet werden» Nach einer dreißigminütigen Inkubation bei 37 C wurde die Reaktion mit 100 ді verdünnt, mit Phenol/Chloroform extrahiert und dann dreimal mit 50 jag Träger-RNA ausgefällt. Die abschließende Ausfällung wird in 1 X Umkehrtranskriptasepuffer (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 40 mM KCl, 3 mM MgC1_) bei einer Konzentration von 2 nM erneut zur Suspension gebracht. Die spezifische Aktivität des markierten Oligonukleotids wird mit etwa 3 x 10 Cvcpm/pMol ermittelt.

B. Herstellung von Total-RNA

Total-RNA wird im wesentlichen so hergestellt, wie das von Lagrimini, L. M. u. a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 7542 (1987) beschrieben wurde. Gewebe wird unter flüssigem Stickstoff in einem Mörser zermahlen. Das gemahlene Gewebe wird einem Schleifpuffer (Lagrimini u. a., siehe oben) unter Einsatz von 2,5 ml je Gramm Gewebe zugesetzt. Dann wird eine gleiche Menge Phenol zugesetzt, und die Emulsion wird in einem Brinkman-Polytron homogenisiert. Eine halbe Volumenmenge Chloroform wird zugesetzt, und die Emulsion wird 15 min lang vorsichtig gemischt. Die Phasen werden durch Zentrifugieren getrennt, und die wässrige Phase wird entfernt. RNA wird durch den Zusatz von Natriumazetat zu 0,3 M

und 2,5 Volumen Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren aufgefangen und in 2 ml sterilem Wasser wieder zur Suspension gebracht. Lithiumchlorid wird bis zu einer Endkonzentration von 3 M zugesetzt und bei 4° C über Nacht stehengelassen. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren aufgefangen und das Pellet mit eiskaltem, 80 %-igen Ethanol gewaschen. Das Pellet wird getrocknet und in 500 ul sterilem V/asser wieder zur Suspension gebracht. Die Konzentration dieses Total-RNA-Präparats wird spektrofoto-

metrisch, bestimmt» Als Alternative dazu wird RNA in der beschriebenen Weise aus Kallus extrahiert, mit der Ausnahme, daß das Kallusgewebe in Würfel von etwa 3 mm Größe geschnitten und zum Zermahlen in einen vorgekühlten Mörser gegeben und in flüssigem Stickstoff mit dem Pistill zerrieben wird, bevor die Behandlung im Polytron erfolgt«

Co Starterextension

In einem 500 μΙ-Eppendorf-Rohr werden 50 дg Gesamt-RNA lyo_ philisiert_e Die RNA wird in 30 ді radiomarkierter Sondenlösung wieder zur Suspension gebracht und 10 Minuten lang bei 70° C erhitzt. Das Rohr wird langsam auf 37° C abgekühlt und kann über Nacht inkubieren«, Ohne das Rohr aus dem 37° C-Wasserbad zu nehmen, werden 2 μΐ 10 X Umkehrtranskriptasepuffer (500 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5_S 400 ml KCl, 30 mM MgCl₂), 1 ul 5 mg/ml Rinderserumalbumin, 5 ДІ 100 mM Dithiothreitol, 5 ДІ TO Z dHTPs (10 mM jedes dNTP in H₂O)₅ 3 μΐ H₂O, 2 ul RNasin (80 Einheiten) und 2 ,ul Umkehrtranskriptase (400 Einheiten) zugesetzt, und die Reaktion wird bei 37° C 30 min lang inkubiert. Um die Reaktion zu stoppen, werden 5 .-ul 3 M Natriumazetat, pH-V/ert 5, und 150 jul absolutes Ethanol zugesetzt» Ыап läßt das Rohr 30 Minuten lang bei -20 C, der niederschlag wird durch Zentrifugieren aufgefangen, mit 80 %igem Ethanol gewaschen und an der Luft trocknengelassen» Der Niederschlag wird in 10 - 20 μΐ Belastungsfarbstoff (90 % Formamid, 0,05 % Bromophenol Blau, 0,05 io Xylenzyanol, 1 mM EDTA) wieder zur Suspension gebracht, und die Extensionsprodukte werden auf einem 6 ^igen Sequenzierungsgel abgetrennt (Maniatis, Ϊ. u_a a., siehe oben)β Die Extensionsprodukte werden durch Autoradiografie sichtbar gemacht.

Beispiel б - SI-Nukleasekartierung

Das Plasmid pBS-PR1013Cla wird mit Sfall verdaut, mit Phos-

32 phatase aus Kälberdarm dephosphoryliert und mit P-ATP kinatisiert. Nach, der Phenolextraktion und der Ethanolausfällung wird die DNA mit BstEII verdaut, und das 300 bp-Fragment von 750 bis 1035 in der Abb. 1 wird nach der Elektrophorese auf einem Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur isoliert« Die Sonde wird in Formamidhybridisationspuffer (Berk, A. J. u. a., Cell 12, 721 (1977)) in einer Konzentration von etwa 2 nM wieder zur Suspension gebracht,, Die spezifische Aktivität der Sonde beträgt etwa 5 x Ю Cvcpm/pMol·

Die lyophilisierte Total-RNA (50 ug) wird in 30 ді der Sondenlösung aufgelöst, und die Röhrchen werden 10 min lang auf 65° C erhitzt, anschließend werden sie über Nacht bei 48° C hybridisiert» Die SI-Nukleasebehandlung und die Gelelektrophorese erfolgen im wesentlichen wie beschrieben, wobei mit einer S1-Konzentration von 400 Einheiten/ml und einer Inkubationstemperatur von 30° C gearbeitet wurde. Die entsprechende S1-Nukleasekonzentration wird in Pilotexperimenten bestimmt»

Beispiel 7 - Kartierung der Tranakriptionsstartstelle

Die Transkriptionsstartstelle für das PR-1a-Gen wird durch eine Kombination von S1-LIukleasekartierung und Starterextensionsanalyse bestimmt« Untersucht wird ein Autoradiogramm eines Starterextensionsexperimentes unter Verwendung von entweder RITA, die aus ТІЛѴ-infizier ten Blättern isoliert wurde, oder eines mp19-Subklons des Shol-Pstl-Fragmentes als Matrize und eines ^-Basenoligonukleotiden, der korn-

plementär zu den Positionen 1025 bis 1042 der PR-Ia-Folge ist, als spezifischem Starter. Der Starter selbst ist am 5'-Phosphat markiert, daher ist die Größe des Extensionsproduktes identisch mit der Größe des entsprechenden Bandes in den Sequenzierungsbahnen,, Das Auftreten von zwei starken Bändern, die den Positionen 902 und 903 entsprechen, und eines schwachen Bandes in der Position 901 des genomischen Klons läßt darauf schließen, daß die Transkription an einer dieser Positionen beginnt. Es kann aber nicht allein mit der Starterextensionsanalyse gearbeitet werden, um das 5'-Ende einer mRNA zu bestimmen. Beispielsweise kann die mRlIA ein 5'-Ende enthalten, das von einer Plußaufwärtslokation gespleißt wurde.

Um das 5'-Ende schlüssig bestimmen zu können, wird in Verbindung mit der Starterextension eine SI-lTukleasekartierung mit hoher Auflösung angewendet. Am 5'-Ende wird ein Sfalll-Fragment markiert und mit BstEII verdaut, um eine strangspsif ische Sonde zu ergeben, die von Position 759 bis 1040 reicht» Diese Sonde wird dazu verwendet, das 5'-Ende von PR-1a-Transkripten in RiJä. zu kartieren, die von TMV-infizierten Tabakblättern isoliert wurde. Es wird ein Hauptband von 137 - 2 Basen gefunden, das den Positionen 901 bis 905 des genomischen Klons entspricht. Bei S1-Experimenten mit hoher Auflösung, bei denen die Verdauungsprodukte zusammen mit einem Größenstandard von Sequenzierungsreaktionen an der Sonde elektrophoretisiert werden, werden drei Bänder sichtbar, die den Postionen 901, 902 und 903 entsprechen. Diese Ergebnisse bestätigen die Siart er extensionsanalyse und bringen das 5'-Ende der PR-1-mRIJA an eine der Positionen 901, 902 oder 903. Was die Transkriptionseinleitung betrifft, so lautet eine mögliche Interpretation dieser

Ergebnisse, daß RNA-Polymerase mit mehr oder weniger gleicher Wahrscheinlichkeit die Transkription bei Base 90I, 902 oder 903 beginnt. Das die eukaryotische Transkription aber die Einleitmag oder Initiierung an einem A begünstigt, ist eine wahrscheinlichere Erklärung für die scheinbar vielfachen 5'-Enden, daß die PR-ia-mRMA an Position 903 (einem A) beginnt und die PR-Ib- und -ic-mRNA jeweils an einer der anderen Positionen bei den entsprechenden Genen beginnen*

2«. Proteinidentifikation und -charakterisierung;

Die für diese Beispiele relevanten PR-Proteine werden in einigen Fällen zum ersten Mal isoliert, gereinigt und sequenziert, während das in anderen Fällen nach den in der Literatur gegebenen Verfahren erfolgt, dabei ist es das Ziel, die Identitäten der chemisch induzierbaren Gene abschließend zu bestimmen..

Beispiel 8 - Reinigung von PR-Ia- und PR-Ib-Protein

Pflanzen von CTicotiana tabaccum cv. Xanthi werden in einem Gewächshaus gezogen und im Alter von acht Wochen durch vorsichtiges Reiben der Blätter mit einer Suspension einen gebräuchlichen Stammes (UI) von TkV (Tabakmosaikvirus) (0,5 Mikrogramm/Milliliter) infiziert. Sieben Tage nach der Infektion werden die Blätter geerntet, und die intrazelluläre Flüssigkeit (ICF) wird aus den Blättern ausgewaschen und nach Parent, J. G. u. a., Can. J* Bot., 62, 564 (1984) aufgefangen« 25O ml von ICF werden durch Lyophilisieren auf 50 ml konzentriert und in eine Ultragel-Kolonne ACA54 eingeführt, die mit Tris-HCl, pH-Wert 8,0, und 1 ml,4 EDTA äquilibriert worden war« Eluate werden durch Elektrophorese auf

10 %igem Polyakrylamidgel analysiert. Fraktionen, welche das PR-1-Protein enthalten, werden zusammengefaßt, lyophilisiert, in 3 ml 'Wasser wieder zur Suspension gebracht und dann über Nacht anhand von Wasser dialysiert. Dieses Präparat wird durch HPLC-Anionenaustauschchromatografie auf einer TSK-DEAS-5PN-Kolonne weiter gereinigt! die Kolonne wird mit einem NaCl-Gradienten von O - 0,6 M in 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA eluiert„ Fraktionen werden durch Polyakrylamidgelelektrophorese (PAGE) analysiert. Zuerst eluiert PR-Ib bei 0,18 M HaGl aus der Kolonne, während PR-Ia bei 0,28 M NaGl eluiert» Die Fraktionen, welche das jeweilige Protein enthalten, werden zusammengefaßt, anhand von Wasser dialysiert und lyophilisiert. Die Reinheit des PR-Ia- und PR-1b-Proteinfräparats wird durch Umkehrphasenhochdruckflüssigkeitschromatografie unter Verwendung einer Aquapore-Phenylkolonne (2,1 σ 100 mm, Brownlee) und Eluierung mit einem linearen Azetonitril/Isopropanolgradienten (1:1,5 bis 80 %) in 0,1 % TFA bestätigt.

Beispiel 9 - Proteinsequenzbestimmung;

Gereinigtes, lyophilisierte PR-1a-Protein wird in 6 M Guanidin-HCl, die 1 M Tris-HCl, pH-Jert 8,6, 10 mM EDTA enthält, aufgelöst. Auf 20 mM wird Dithiothreitol zugesetzt, und bis zu einer Endkonzentration von 50 mM wird 4-Vinylpyridin zugeben. Dann wird die Probe 1,5 Stunden unter Stickstoff inkubiert. Das pyridylethylierte Material wird durch Hochdruckflüssigkeitskolonnenchromatografie unter Verwendung einer Aquapore-Phenylkolonne (2,1 ζ 10 cm, Brownlee) entsalzt. Die EoLonne wird mit einem linearen Gradienten von bis 80 ^c,o von Azetonitril/Isopropanol (1:1) in 0,1 -Ό Trifluoroessigsäure (TFA) eluiert.

Mit einem Gasphasensequenzierungsgerät 47OA von Applied Biosystems wird ein automatischer EdEian-Abbau vorgenommen. LI it einem PTH-Analysegerät 120A von Applied Biosystems werden Phenylthiohydantoinaminosäuren (PTH-Aminosäuren) identifizierte

Das Zyanogenbromidschneiden wird in situ nach Simpson, R₈ J, Uo a«, Biochem. Intl. 8, 787 (1984) durchgeführt« Die Verdauung von PR-1 mit Pyroglutamataminopeptidase (Boehringer Mannheim) erfolgt nach Allen, G., Plant Sei* Lett. 26, 173 (1982).

PR-Ia wird mit Eindoproteinase Lys-G (Boehringer Mannheim) im 0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 8,5, 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur unter Anwendung eines Snzym-Substrat-Verhältnisses von 1 : 10 verdaut. Peptide werden durch HPLC unter Anwendung einer Aquapore-C-8-Kolonne (1 χ 22 cm, Bro.vüilee) durch einen linearen Azetonitril/Isopropanolgradienten (1 zu 1) (0 bis 60 %) in 0,1 % TPA isoliert.

Die Verdauung des N-Terminal-Lys-C-Peptids mit Trypsin (Cooper) erfolgt in 0,1 M Ammoniumbikarbonat, pH-Wert 8,2, das 0,1 M Kalziumchlorid enthält, über fünf Stunden bei 37° C und einem Enzym-Substrafc-Verhältnis von 1 : 100. Die beiden erzeugten Peptide werden auf HPLC unter Anwendung der gleichen Bedingungen wie bei den Lys-C-Peptiden getrennt.

Beispiel 10 - Proteinsequenz von PR-1a-Peptiden

Korrelation der DNA-PoIge von drei cDITA-Klonen mit den PR-Ia-, PR-Ib- und PR-1c-Proteinen wurde ursprünglich von Cornelissen, 3. J. u. a., oben, auf der Grundlage eines Ver gleichs der veröffentlichten Proteinsequenzdaten von drei

Peptiden, die von PR-Ia abgeleitet wurden (Lucas, J* u. a·, ELiBO J. 4, 2745 (1985)), und der Primärstruktur des Proteins, das von den сDNA-Klonen abgeleitet wurde, vorgenommene Der als PR-Ia bezeichnete cDNA-Klon ist jedoch am 5'-Ende verkürzt und kann nur mit zwei der drei Peptide bei einer Fehlanpassung von einem Rest verglichen werden. Die codierte Aminosäurefolge, die von сDNA abgeleitet wurde, wie es oben hergestellt und analysiert worden ist, und die PR-IacDNA-Folge von Pfitzner, U. M. u« a., siehe oben, weisen nicht nur eine Fehlanpassung zu der veröffentlichten Proteinfolge am Tryptophanrest auf, wie. das angegeben wurde, sondern auch an drei anderen Positionen der Aminoterminalproteinfolge, Diese Anomalie stellt die Identifizierung dieses Klons als PR-Ia in Frage* Daher wird die Identität des Klons tobchrPR1013 als PR-1a-Gen durch Bestimmung eines großen Abschnitts der Primärstruktur des gereinigten PR-Ia-Proteins durch Aminosäuresequenzierung verifiziert»

Die Aminosäurefolgedaten für das PR-1a-Proxein werden mit den Aminosäurenfolgen verglichen, die von cDNA-Klonen für PR-Ia, -1b und -1c abgeleitet wurden. Die bei der Analyse verwendeten cDNA-Sequenzdaten stammen von den cDNA-Klonen, die oben isoliert wurden, und Sequenzen von Pfitzner, U. M₉ и« a., siehe oben, die an allen Positionen übereinstimmen. Mehr als 80 % der reifen PR-1a-Proteinfolgen werden bestimmt, diese Sequenz stimmt mit der deduzierten Proteinsequenz für tobchrPR1013 überein« Beim Vergleich mit der deduzierten Aminofolge, die für mutmaßliche PR-Ib- und PR-1c-cDNA-Klone abgeleitet wurde (Cornelissen, B. J, C. u. a., siehe oben), werden sieben bzw. sechs Fehlanpassungen festgestellt. Die Beweise zeigen somit eindeutig, daß iix>chrPR1013 tatsächlich ein Klon des PR-1a-Gens ist.

3» Herstellung von Klonen

In dieser Gruppe von Beispielen werden Klone beschrieben, die im Ergebnis der Gen-Isolierung und -Identifizierung der chemisch regulierbaren Sequenzen und der schimärischen Gene, welche diese Sequenzen enthalten, hergestellt wurden«,

Beispiel 11 - Herstellung; von tobchrPR10i3

Aus den Blättern von Nicotiana ta ba с с um werden durch Gefrieren von 35 g des Gewebes in flüssigem Stickstoff und anschließendes Zerreiben mit Mörser und Pistill zu einem feinen Pulver Nuklei isoliert. Das Pulver wird 250 ml Schleifpuffer (0,3 M Sukrose, 50 mM Tris, pH-Wert 8,0, 5 mM Magnesiumchlorid, 5 mM Natriumbisulf it, 0,5 % IiP 40) zugesetzt und auf Eis 10 min lang gerührt,, Dieses Gemisch wird durch sechs Schichten Filtertuch gefiltert, und die Flüssigkeit wird in Zentrifugenflaschen gefüllt und bei 700 χ g 10 min lang zentrifugiert. Die Pellets werden erneut in Schleifpuffer zur Suspension gebracht und erneut zentrifugierte Diese Pellets werden wieder in Schleifpuffer zur Suspension gebracht, und diese Suspension wird auf eine kalte Sukrosekissenschicht von 20 ml gebracht, die 10 mM Tris, pH-Wert 8, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 140 mM Natriumchlorid, 24 % Sukrose, 1 % NP40 enthält« Diese Röhren werden bei 17 000 к g 10 Minuten lang zentrifugiert. Die Pellets in dieser Phase enthalten vor allem Nuklei und Stärkekörnchen» Aus den Nuklei wird DNA mit hohem Molekulargewicht im wesentlichen nach Maniatis, T. u. a_e, siehe oben, isoliert. Die DNA wird partiell mit IJbоI verdaut und in die BamHI-Stelle des EMBL3-Klonierungsvektors ligiert. Etwa 300 000 "Plaques" werden mit einer markierten PR-1b-сDNA-Sonde einem "Screening" un-

terzogen. Fünfzig positive Klone werden isoliert und charakterisiert. Positive "Plaques" werden gereinigt und durch Restriktionsanalyse charakterisierte Diese Klone werden nach acht unterschiedlichen Gruppen durch Restriktionskartierung klassiert. Einer der Klone wird als tobchrPR1O13 identifiziert« Eine partielle Restriktionskarte von tobchrPR1013 wird in der АТэЪ. 1 gezeigt * Die Isolierung der DNA und DHA-L'lanipulationen werden im wesentlichen so ausgeführt, wie das von Maniatis, T. u. a., siehe oben, beschrieben wurde«

Beispiel 12 - Herstellung von pBS-PRTO13Cla

Sin Clal-Fragment des Klons tobchrPR10l3 wird in das Bluescript-Plasmid (Stratagen-Klonierungssysteme) subkloniert, was pBS-PR1O13Cla ergibt (siehe Abb. 2). Das 2 kb-XhoI-BgIII-Pragment von pBS-PR1Oi3Cla wird sequenziert, und es wird festgestellt,* daß die Positionen 913 bis 1711 (Sequenz 1) perfekt mit der Sequenz eines cDNA-Klons für PR-Ia übereinstimmen, der von Pfitzner, U. M. u. a., siehe oben, isoliert wurde. Mögliche Umstellungen der Tabak-DNA während des Klonierungsverfahrens werden durch Analyse der vorhergesagten Restriktionsfragmente von genomischer DbIA ausgeschlossen» Auf der Grundlage der Sequenzinformation und einer Restriktionskarte von pBS-PR1O13Cla sollte die Verdauung von genomischer Tabak-DHA mit Eco RI, Hindill, ZHoI+Bglll oder Hindlll+Pstl Fragmente von 3₉2 kb, 6,7 kb, 2,0 kb bzw. 6,4 kb erbringen, die das PR-1a-Gen entha-lten. Um diese Vorhersage zu testen, werden 3 AS von Tabakchrornosomal-DHA mit den entsprechenden Enzymen verdaut und auf einem 0,7 %igen Agarosegel elektrophoretisiert. Die DHA wird auf eine Hylonmembran übertragen und mit einem markierten ZhoI-BetEII-Restriktionsfragment vom PR-1a-Gen geprüft. Als Kontrolle wird pBS-

PR1013GIa-DNA verdaut und auf dem gleichen Gel elektrophoretisiert« Wie vorhergesagt, erzeugen die ScoRI-, Hindlll-, Xhol+Bglll- und Hindlll+Pstl-Verdauung Bänder mit dem erwarteten Molekulargewicht, die zusammen mit den Kontrollbändern wandern_e Die im tobchrPR1013-Klon enthaltene DNA stellt folglich ein benachbartes Stück der DHA im Tabakgenom dar«

Beispiel 13 - Herstellung von PBS-PRIOI3BCO

А оDas Plasmid pBS-PR1013ßco wird durch Subklonierung des 3,6 kb-EcoRI-Pragmentes, das das PR-1a-Gen von tobchrPR10i3 enthält (Beispiel 9), in die einzigartige EcoRI-Stelle des Bluescript-Plasmids konstruierte Bluescript-Plasmid (Katalog-Si 21203) wird bei Stratagene Cloning Systems, La JoI-Ia, Kalifornien, bezogen« Die Struktur von pBS-PRi0133co wird sowohl durch Restriktionskartierung als auch durch DITA-Sequenzierung bestätigt. Diese Konstruktion des Plasmids wird in der Abbe 3 gezeigte

B. Als Alternative dazu wird das Plasmid pBS-PR1013Cla mit EcoRI verdaut, und es wird das 3,6 kb-Fragment isoliert, welches das PR-1a-Gen enthält« Das pBluescript wird mit EcoRI verdaut, mit dem vorher isolierten 3,6 EcoRI-Pragment gemischt und mit diesem ligiert* Diese Konstruktion des Plasmids wird in der АЪЪ„ 4 gezeigt«

3eispiel И - Herstellung von pBS-PR1013Eco_Pst

Das Plasmid pBS-PR1013Eco wird mit Pstl verdaut, und die DrlA-Pragmente werden auf einem 2,5 Obigen Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur getrennte Das große Fragment, welches den Bluescript-Yektor und ein 3,0 kb-Pragment der Tabak-

DNA enthält, wird präzis herausgeschnitten und auf 65° C erhitzt, um die Agarose zu schmelzen. Zu 15 Я-1 V/asser werden 2 ДІ zugesetzt, und die MA wird wie im Beispiel 1 beschrieben in Agarose ligiert. Nach der Inkubation über Nacht wird die Agarose, welche die DNA enthält, durch Inkubieren bei 65° G für die Dauer von 10 min geschmolzen und anschließend im wesentlichen nach der Beschreibung im Beispiel 2 aus der Agarose transformiert. JJin Abschnitt der Bakterienkultur von jeder von sechs mutmaßlichen positiven Konstruktionen wird in 5 ml LB-Medium (Miller, siehe oben), das 100 Mg/ml Ampizillin enthält, inokuliert, und diese Kultur wird bei 37° C über Nacht inkubiert» Zellen werden durch Zentrifugieren in einer klinischen Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit für die Dauer von 10 min geerntet.. Die obenauf schwimmende Schicht wird entfernt, und die Zellen werden wieder in 100 ді von 50 шІЛ Glukose, 25 mTJ Tris, pH-V/ert 7,5, 10 mM EDTA zur Suspension gebracht, und die Suspension wird in eine 1,5 mljSppendorf-Zentrifugalröhre übertragen, tts werden 25 ДІ" einer frisch hergestellten 10 mg/ml-Lysozymlösung zugesetzt, und man läßt die Suspension 10 min auf üis stehen. Dann werden 200 ді von 0,2 N Natriumhydroxid, 1 % Natrxumdodezylsulfafc zugesetzt, und die Suspension wird gemischt und zwei Minuten auf Sis stehengelassen«, Es werden 200 μΐ 2 M Natriumazetat (pH-V/ert 4,8) zugesetzt, und man läßt die Lösung 15 Minuten auf Eis stehen. Die resultierende Lösung wird bei voller Geschwindigkeit 10 min lang in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Die obenaufschwimmende Schicht wird in eine neue Zentrifugenröhre gegeben und mit 400 ді Phenol/Chloroform (1:1) extrahierte Die wässrige Phase wird in ein frisches Rohr gegeben und mit 400 ul Chloroform extrahiert» Die wässrige Phase .von dieser Extraktion wird in ein fri-

sches Rohr gegeben, und die DNA wird durch den Zusatz von zwei Volumen Ethanol und die Lagerung bei -20 G für die Dauer von 30 min ausgefällt. Die ausgefällte DNA wird durch Zentrifugieren in einer Eppendorf-Mikrofuge für die Dauer von 15 min bei voller Drehzahl aufgefangen. Das Ethanol wird entfernt, und die Pellets werden mit 80 %igem Ethanol gewaschene Das Ethanol wird wieder entfernt, und man läßt die Pellets an der Luft trocknen. Die DHA wird in 100 ді TE-Puffer wieder zur Suspension gebrachte Die Konstruktionen werden durch Verdauung mit Pstl verifiziert* Das Ausgangs_ plasmid pBS-PRi013Eco ergibt ein 6 kb- und ein «"650 bp-Band, das kleinere davon Salt in den neuen Konstruktionen. Eines dieser Plasmide wird als Plasmid pBS-PR1013Eco^Pst ausgewählt« Die Struktur dieses Subklons wird durch Sequenzanalyse verifiziert. Die Konstruktion dieses Plasmids wird in der Abb. 5 gezeigt.

Beispiel 15 - Herstellung von pBS-PR1013Eco^Pstj^XhoI

Es wird eine vorläufige Restriktionskarte von pBS-PRi013Sco erstellt. Eine Xhol-Restriktionsstelle wird-^OO bp flußaufwärts der Pstl-Stelle loziert. Das Plasmid pBS-PR1013EcoAPst wird mit Xhol verdaut, und die Fragmente werden auf 0,9 %igem Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur getrennt« Es werden zwei Fragmente mit einer Größe von 3,9 kb und 1,7 kb sichtbar» Das Band, welches das 3₅9 kb-Fragment enthält, wird sorgfältig aus dem Gel ausgeschnitten und im wesentlichen nach der obigen Beschreibung in Agarose ligiert. Die Agarose wird geschmolzen und die DIiA wie oben beschrieben in den kompetenten E₁^ coli-S'tamm HBI01 transformiert. Zellen werden auf LB-amp-Platten wie oben plattiert und inkubiert. Eine mutmaßliche positive Kolonie

wird in LB-amp-Medien inokuliert, und die DHA wird im wesentlichen entsprechend der Beschreibung isoliert» Die Struktur dieses neuen Subklons pBS-PRIO^-Eco^Pst^Xho wird durch Restriktionsanalyse und DHA-Sequenzierung verifiziert. Abb. 6 zeigt die Konstruktion dieses Plasmids.

Beispiel 16 - Herstellung von pOIB27O

Plasmid pBI1O1.3 (Katalog-l.i 6024.1) wird von den Clorsefcech Labs, PaIo Alto, Kalifornien, bezogen. Dieses Plasmid wird zuerst mit BamHI und dann mit Sail verdaut. Das Plasmid pBS-PRIO^-Eco^Ps^Xho wird mit Pstl verdaut. Das Plasmid pBS-PR1013-гісодРst/^Xho wird mit Pstl verdaut. Wie im Beispiel 4 wird ein Pstl/BamHI-Adapter mit der Folge

5'-GGGATCCCTGCA-3'

hergestellt und mit dem Pstl-verdauten рВЗ-РЕЮІЗ-ЗсодРз^ ligiert. Das resultierende Material wird zuerst mit BamHI und dann mit Zhol verdaut. Das BamHI/ihoI-^ragment wird iso liert, mit dem verdauten pBI101.3 gemischt und ligiert und transformiert. 3in mutmaßlicher positiver Klon von pCIB270 wird isoliert und durch Restriktions- und DliA-Sequenzanalyse verifiziert. Die Herstellung dieses Plasmids wird in der Abb. 7 gezeigx.

Beispiel 17 - Herstellung von IJ13mp18- oder mpi9-PRiO13-

Das Plasmid pBS-PRIO^^co^PstAlho wird mit Pstl und Asp71S verdaut. ITach der Elektrophorese auf einem 1 ;aigen, niedriggelierenden ÜAJv-Agarosegel wird das 1,1 lcb-AspTIS/Patl-

Pragment isoliert» Die replikative Porm (RP) von coli-Phag M13mp18 oder M13mp19 wird nach. Messing, J», Meth. Enzymol,, 101, 20 (1983) hergestellt» Als Alternative dazu können diese Vektoren bei Bethseda Research Labs», Gaithersburg, Maryland, bezogen werden» Jeder der Vektoren wird zuerst mit Asp718 und dann mit Pstl verdaut« Nach Entfernung des PoIylinkerstücks durch Elektrophorese auf 0,7 ^iger, niedriggelierender Agarose wird die resultierende Vektor-RP gemischt und in Agarase mit dem oben hergestellten 1,1 kb-Pragment ligiert. Die DlTA wird transformiert, mutmaßliche politive "Plaques" werden isoliert, und ihre Struktur wird durch Analyse der RP-DNA verifiziert. Die Konstruktionen von M13mp18- und M13mp 19-PR1013Eeo^Pst^₁XhO werden in der Abb. 8 gezeigt,

Beispiel 18* Herstellung von ГЛ13тр18- oder M13mp19-PR1013-EcOj&Pst$Qio.Nco und pCIB 268

Einzelsträngige M13mp18-PR1013Eco^Pst/^Xho-Phag-DNA wird nach Messing, siehe oben, isolierte Wie oben beschrieben, wird ein 18 bp-Oligonukleotidstarter mit der Polge

5'-AATCCCATGGCTATAGGA-3'

synthetisiert» Der Starter wird mit T4-Polynukleotidkinase (Lianiatis, T. u. a», siehe oben, S₀ 125) unter Verwendung von nichtmarkierter ATP phosphoryliert. !Jach einer sechzigminütigen Inkubation bei 37° C wird die Reaktion für 15 min auf 68° C erhitzt und dann auf Eis gegeben. Dieser Starter und der L¹II3 -40-Vorwärtssequenzierungsstarter (Hew England. Biolabs K° 1212) werden nach dem Mischen in einem Verhältnis von 1:1:1 (Molverhältnis) auf einzelsträngige Li13mp18-

-DEü durch langsames Abkühlen nach einer

zehnminütigen Erhitzung auf 68° C hybridisiert. Das hybridisierte Gemisch wird auf Eis gebracht und ein Zehntel Volumen von lOfachem Verlängerungspuffer (20 ml Tris-Puffer, pH-Wert 7,5, б mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM dATP, a mM dCTP, 1 mM dGTP und 1 mM dTTP) wird zugesetzt. Es werden 10 Einheiten des großen DNA-Polymerase-I-Fragmentes (Klenow-Fragment, Hew England Biolabs U 210) und 0,1 Einheiten von T4-DNA-Ligase (NEB Ki 202) zugesetzt, und man läßt die Reaktion bei 15° C 14 Stunden andauern. Zu diesem Zeitpunkt wird ein weiteres Aliquot jedes Enzyms zugesetzt, und die Reaktion wird bei 25° C weitere 2 Stunden fortgesetzt, bevor das Gemisch zur Transformation von kompetenten E*_ coli JM101 verwendet wird* Ein allgemeines Ablaufschema dieses Verfahrens wird in der Abb» 9 dargestellt.

Um das mutierte Phag zu identifizieren, werden die"Plaques" auf Gene Screen Plus (Dupont) gegeben und nach den Empfehlungen des Herstellers bearbeitet. Die Filter werden vier Stunden vorhybridisiert und über Nacht bei 42 C in der Hybridisierungslb'sung des Herstellers, die 0,9 Ы NaCl enthält, hybridisiert. D_arui werden die JiIt₁ er nacheinander mit einer NaCl-Konzentration von 0,9 M gewaschen und durch Autoradiograf ie überwacht, wobei die Waschtemperatur bei jedem Schritt um 5° C erhöht wurde. Die Phage, die durch Hybridisierung als mutiert identifiziert wurden, werden zur Bestätigung der Basenänderung sequenziert.

Die replikative Form eines dieser Kandidaten (LI13mp18-PR1013Eco/Pst/yQio.Hco) wird isoliert und mit Pstl und BstEII verdaut, um ein 394 bp-Fragment zu schaffen, das dazu verwendet wird, das nichtmutierte 394 bp-Fragment in

zu ersetzen, wie das in der Abb» 10

gezeigt wird» Das führt zur Herstellung von рСІБ2б8, das eine Ncol-Stelle in der Position 930 hat, gefolgt von 217 Basenpaaren der Kodierungssequenz für das PR-1a-Gen. Die Struktur dieses Plasmids wird durch Sequenzanalyse bestätigt.

Beispiel 19 - Herstellung von schimärischen Genen, die GUS und unterschiedliche Längen der PR-Promotersequenz enthalten

A. Konstruktion von рСІВ2б9

Ein !Fragment von 930 Ър wird nach der Elektrophorese von Xhol- und Ncol-verdautem pCIB268 auf einem 1,0 folgen Agarose-TAE-Gel mit niedriger Gelierungstemperatur isoliert» Dieses Fragment wird dann in pBS-GUS1_e2 ligiert (siehe Beispiel 19 B)₅ das mit Xhol und Ncol verdaut worden ist. Es werden Transformanten isoliert und durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung analysiert. Ein positiver Klon wird ausgewählt und als рСІВ2б9 bezeichnet. Die Konstruktion dieses Plasmids wird in der Abb, 11 gezeigt.

B. Konstruktion von pBS-GUS1.2

pBS-GUSI.2 wird durch dreiteilige Ligation eines 391 bp-umfassenden Sall/Snabl-Fragments von pRAJ265 (Jefferson, R. A, u. a., EMBO J. 6, 3091 - 3907 (1987) und GUS User Manual, Clonetech Labs., PaIo Alto, Kalifornien) mit einem 1707 bpumfassenden Snabl/EchoRI-Fragment von pBI22i (Jefferson, R. Α, u. a«, EMBO J», siehe oben) und pBS, das mit Sail und EcoRI verdaut wurde, geschaffen, siehe Abb. 12. Transformanten werden isoliert und durch Restriktionsvsrdauung und

ША-Sequenzierung analysiert. Ein verifizierter Klon wird als pBS-GUSI.2 bezeichnet.

C. Konstruktion von pCIB2OO

Zuerst wird TJS75Kan durch. Verdauung von pTJS?5 (Schmidhauser und Helinski, J. Bacteriol. 164, 446 - 455 (1985)) mit Narl geschaffen, um das Tetrazyklin-Gen auszuschneiden, gefolgt von der Einfügung eines Accl-Fragmentes von pUC4K (Messing, J. und Vierra, J., Gene I9, 259 - 268 (1982)), das ein Hptl-Gen trägt. Dann wird pGIB2OO durch Ligation von Xhol-Linkern an das EcoRV-Fragment von pCIB7 (das den linken und rechten T-DHA-Rand, ein pfLanzenselektierbares nos/nptll-schimärisches Gen und den pUC-Polylinker enthält, Rothstein, 8. J. u. a._t Gene 53, 153 - 161 (1987)) und KIonierung des Xhol-digerierten Fragmentes in das Sall-verdaute TJS75-Kan hergestellt.

D. Konstruktion von pGIB271

Das Plasmid рСІВ2б9 (Beispiel 19 A) wird mit Zh0I und EcoRI verdaut, und das 3023 bp-Fragment, welches den PR-1a~Promoter trägt, der mit einem nos-3'-Ende an das GUS-Gen gebunden ist, wird isoliert, worauf sich die Elektrophorese auf einem 1,0 ^igen, niedriggelierenden Agarose-TAE-Gel anschließt. Dieses Fragment wird dann in einen Vektor pCIB200 mit breitem Wirtsbereich ligiert, der mit Sail und EcoRI verdaut worden ist. Ез werden Transformanten isoliert und durch Restriktionsanalyse analysiert. Ein verifizierter Klon wird als pCIB271 bezeichnet» Die Konstruktion dieses Klons wird in der Abb. 13 gezeigt.

E. Konstruktion von yC±B272

рСІВ2б8 (Beispiel 18) wird mit AIuI plus Hcöl verdaut, und nach der Elektrophorese auf einem 1 X-TAE-Agarosegel von 0,7 % wird ein 833 bp-Fragment isoliert* Dieses Fragment wird mit dem ß«Glukuronidase-Gen mit dem nos-3'-Ende in pBS-GUSI.2 (Beispiel 19 B) ligiert. Der Promoter und GUS werden dann aus diesem Plasmid mit der Bezeichnung pCIB282 als Asp718I/BamHI-Fragment herausgeschnitten und in pCIB200 ligiert, das mit Asp718I und BamHI verdaut wurde, bevor die Transformation in den E^ coli-Stamm DH5c4 erfolgt. Ss werden Transformanten isoliert und durch Restriktionsanalyse analysiert. Ein verifizierter Klon wird als pCIB272 bezeichnet.

F. Konstruktion von pCIB273

рСІВ2б8 wird mit Haelll plus ІТсоІ verdaut, und nach der Elektrophorese auf einem 0,7 %igen 1 X-TAE-Agarosegel wird ein 603 bp-Fragment isoliert. Dieses Fragment wird vor das ß-Glukuronidase-Gen mit dem nos-3'-Ende in pBS-GUS1«2 gebracht. Der Promoter und GUS werden dann aus diesem Plasmid mit der Bezeichnung pCIB283 als ein Asp718I/BamHI-Fragment herausgeschnitten und in pCIB200 ligiert, das mit Asp7i8I und BamHI verdaut wurde, bevor die Transformation in den E^ coli-Stamm DH5v^erfolgt. Transformanten werden isoliert und durch Restriktionsanalyse analysiert. Ein verifizierter Klon wird als pCIB273 bezeichnet.

Beispiel 20 - Herstellung eines schimärischen Gens in einem Hygromycinvektor

pCIB269 wird mit Xhol und EcoRI verdaut, und nach der Elektrophorese auf einem 1,0 /algen niedriggelierenden Agarose-

ТАь'-Gel wird das 3023 bp-umfassende Fragment isoliert, das den PR-Ia-Promoter trägt, der mit dem nos-3'-Ende an das GUS-Gen gebunden ist. Dieses Fragment wird dann durch Ligation mit einem EcoRI/Sall-Adapter mit der Folge

in ein iüioI/Sall-Fragment umgewandelte Das Xhol/Sall-Fragment wird in Sall-verdautes pCIB712 (Rothsbein, S. J. u, a., siehe oben), ligiert, um pCIB219 au schaffen, siehe-Abb.

Beispiel 21 - Herstellung von pCIB200/PR1-BT ^Ä· Ligation mit pCIB2Q0

Das Plasmid pCIBKXH (siehe unten) wird mit Sphl verdaut, mit Phenol extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und wieder zur Suspension gebrachte Es wird ein Oligonukleotid mit der Folge

5·-CCGGTACCGGCATG-S'

synthetisiert, gereinigt, kinatisiert und an das Sphl-verdaute Plasmid pCIB1004 ligiert« !lach der Ligation wird die Liga se inaktiviert und die DNA mit Kpnl verdaut. Diese DLA wird auf einem O₅S ?oigen Agarosegel mit niedriger Gelierung stemperatür behandelt» Das Plasmid pCIB200 (Beispiel 19 C) wird mit Kpnl verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt und auf ein 0,8 7<?iges Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur gebracht. Das Band, welches den pCIB200-Vektor enthält;, und das Band, welches die PR-I-S'-Flankierungssequenz/BT-Pusion enthalt, //erden gemischt und die DHA ligiert, um das Piaamis pCI3200/PR1-3T zn bilden.

B. Herstellung von pCIB1OO4

Das Plasmid рСІВ1О/35ВѢ(бО7) wird mit Ncol und BamHI verdaut und auf 0,8 %iges Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur gebracht,, Das Plasmid pCIB269 (Beispiel I9 a) wird mit Ncol und Xtiol verdaut und auf ein 0,8 %iges Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur gebracht. Das Plasmid pCIB710 (Rothstein, S. J, U. a., siehe oben) wird mit Sail und BamHI verdaut und auf ein 0,8 /Siges Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur gebracht» Das Band mit dem Sail- und BamHI-verdau-ten "Vektor, der ein in pUC19 kloniertes CaMV-35S-Promoter-3'-.&ade enthält, das Band, welches das BT-Gen enthält, und das Band, das den PR-1-5'-Flankierungsbereich enthält, werden ausgeschnitten, gemischt und die DNA ligiert, um das Plasmid pCIB1004 zu bilden«

Go Herstellung von pCIB1O/35Bt(6O7)

pCIB1O/35Bt(6O7), ein deletiertes Protoxin-Gen, welches eine Sequenzkodierung für annähernd 607 Aminosäuren enthält, wird aus Plasmid pCIB1O/35Sbt hergestellt, einem Plasmid, das das Protoxin-Gen vom Bacillus thuringiensis-Endotoxin enthält * J-L· ^coli MCIO6I, der pCIB1O/35Sbt enthält, wurde bei der American Type Culture Collection, ATCC-ES 67329, am 27« Februar 1987 deponiert. Ein deletiertes Protoxin-Gen wird durch Einführung einer BamHI-Schneidestelle (GGATCC) nach dem Nukleotid 1976 in die GT-Gen-Sequenz hergestellt. Das geschieht durch IQonierung des BamHI-Fragmentes, welches die Protoxinsequenz von pCIB1O/35Sbt enthält, in mp'IS und Anwendung von Oligonukleotidmutagenese-Standardverfahren» rlach der Mutagenese wird die doppelsträngige replikative Form von DbIA aus dem 1.113-Klon hergestellt, die dann mit 3amill verdaut wird.

Das etwa 1,9 kb-große Fragment,welches das deletierte Protoxin-Gen enthält, wird in das BamHI-geschnittene рСІВЮ/710 eingefügt. Das resultierende Plasraid wird nach Kanamycin selektiert. Eine detaillierte Beschreibmag der Herstellung wird in US-Patentanmeldung, Reihen-Li 122 109 vom 18« November 1987 gegeben, die hier als Verweis einbezogen wird»

Beispiel 22 - Herstellung von pCIB1233 (pCIB200/PRI-AHAS) A. Ligation mit pCIB200

Das Plasmid wird mit Kpnl und Xbal verdaut und auf einem 0,8 folgen Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur behandelt (pCIB200). Das Plasmid рСІВ1216 wird mit Kpnl und. Xbal verdaut und auf einem 0,8 %igen Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur behandelt. Das etwa 4_S3 kb-umfassende Band, welche die mit der AHAS-Codierungssequenz verschmolzene PR-1-5'-Flankiemngsfolge enthält, und das Band, welches den pCIB200-Vektor enthält, werden ausgeschnitten, gemischt und die DUA ligiert, um pCIB1233 zu bilden.

3. Herstellung von рСІВ1216

Das Plasmid pCIB269 (Beispiel 19 A) wird mit Zbal und Ncol verdaut und auf einem 0,8 obigen Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur behandelt. Das Plasmid pCIB1207 (siehe unten) wird mit Xbal und IIcoI verdaut und auf einem Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur behandelt. Das Band, welches den Bleuscript-Vektor mit der PR-1-5'-Flankierungssequenz enthält, und das 3,3 kb-umfassende Band, welche die АНлЗ-Codierungssequenz enthält, werden ausgeschnitten, gemischt und die ΰΓ.^ ligiert, um das Plasmid PCIB1216 zu bilden»

C. Herstellung des Plasmids рСІВІ207, welches das Arabidop- ^ls-AHAS-Gen enthält

Die Gesaratpflanzen-DNA wird aus Arabidopsis thaliana, Ökotyp Columbia, entfernt und isolierte 250 Jig dieser DNA werden mit 4000 Einheiten des Restriktionsenzyms Xbal vier Stunden lang verdaut. Das Resultat wird durch Elektrophorese auf einem 0,8 ^igen Agarosegel fraktioniert« Die DNA-Fragmente zwischen 6,5 kb und 4,3б кЪ (auf der Grundlage von Hindlll-verdauten Larnbda-DNA-Größenmarkern) werden unter Verwendung von NA-45-DEAE-Membran (Schleicher und Schuell, Keene, NH, USA) nach den vom Hersteller empfohlenen Verfahren aus dem Gel isoliert. Zbal-vexdautes und phosphatasebehandeltes Lambda-ongC (longC-)-Armpräparat wird von Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA, USA) bezogen. Es werden 0,1 _ug der Arabidopsis-Xbal-Jnsert-DNA an 1,0 'ag der longC-Arme nach den von Strategne empfohlenen Verfahren Iigiert. 2,5 }xl der Ligationsreaktion werden in Lambda-Phagköpfen unter Verwendung des Gigapack-Plus-Satzes (Stratagene Cloning Systems) nach den vom Hersteller empfohlenen Verfahren gepackt. Die Aktivität der Bibliothek wird auf E. coli VCS257 (Strategene Cloning Systems) titriert.

werden 50 ^g von pEi6/8-c4-Plasmid-DKA (J. PoIaina, Carlsberg Res. Comm. 49 _} 577 - 534) mit EcoRI verdaut, und die Verdauungsprodukte werden auf einem 0,8 %igen Agarosegel aufgelöst. Das 2 kb-EcoRI-Fragment, welches die Codierungssequenz für das Hefe-AHAS-Gen enthält, wird aus dem Gel unter Einsatz von NA45-DEAE-Membran nach den vom Hersteller empfohlenen Verfahren isoliert. Radiomarkierte Sonden zum 2 kb-Fragment werden am Tag der Hybridisierungsreaktion nach der Zufallsstartreaktion unter Verwendung des

Prime Time-Satzes (international Biotechnologies Inc., Kew Haven, CT, USA) entsprechend den vom Hersteller empfohlenen Verfahren isoliert.

Es werden 250 000 rekombinante Phage auf VCS257 plattiert. Duplikatmembranelemente der Phagplaques werden unter Verwendung von Colony/Plaque Screen-Membranen (ЕШ Research Products, Du Pont, Boston, IvIA., USA) nach den vom Hersteller empfohlenen Verfahren ausgeführt. Die Membranen werden in LS-Hybridisationspuffer vorhybridisiert, dann auf 150 ml frischen LS-Hybridisationspuffer transferiert, der 0,25 Ug

der P-markieren Hefe,AHAS-Gen-Sonde enthält, die oben hergestellt wurde» Die Membranen werden bei 42 C 16 Stunden lang unter sanftem Schütteln inkubiert, zweimal bei Zimmertemperatur mit 2ZSSC für jeweils 15 min gewaschen, dreimal bei 42° C. in LS-Waschpuffer (25 % Formamid, 5ZSSC, 1 % SDS) für jeweils 2 Stunden gewaschen und zweimal mit einem Spülpuffer (0,1ZSSC, 0,1 % SDS) für jeweils 30 min gewaschen. Die Membranen werden eingerichtet und mit Cronex Lightening Plus Screens (DuPont, Wilmington, DJa, USA) und XAR-5-Film (Kodak) fluorografiert. Die "Plaques" von Bereichen der Platten, die positive Filmsignale auf beiden Liembranelernenten ergeben, werden herausgegriffen und mit einer geringen Dichte von 300 "Plaques" je 150 mm-Platte erneut plattiert, anschließend wird der "Screening"-Vorgang wiederholt, bis einzelne hybridisierende "Plaques" isoliert werden.

iine Minipräparation der Phag-DHA vom plaque-gereinigten Phag wird nach den Verfahren ausgeführt, die im LambdaSorb Phage Adsorbent-Satz (Promega, Madison, VI, USA) beschrieben werden, Die Phag-DL^rA wird mit Restriktioncenzym Zbel geschnitten, und das 5,8 kb-Insertionsfragment wird in die

ХТэаІ-Stelle des pBS(-)-Plasmids (Stratagene Cloning Systems) kloniert. Die Identität des klonierten Fragmentes mit dem Xbal-Fragment, welches das Arabidopsis-AHAS-Gen enthält, wird durch Vergleich seiner Restriktionskarte und seiner DNA-Folge mit denen verifiziert, die für das Gen von Haughn u. a., Mol. Gen. Gente« 211, 266 (1988), und Mazur u. a., Plant Phyiol. 85, 1110 (1987) veröffentlicht wurden. Dieses Plasmid wird als pCIB12O7 bezeichnet.

Beispiel 23 - Herstellung von pCIB1232 (pCIB200/PR1-AHAS-SuR) A_e Ligation mit pGIB20Q

Das Plasmid pCIB200 (Beispiel 19 C) wird mit Kpnl und Zbal verdaut und auf einem 0,8 folgen. Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur behandelt. Das Plasmin рСІВІ230 wird mit Kpnl und Zbal verdaut und auf einem 0,8 'folgen. Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur behandelt. Das etwa 4,3 kb-umfassende Band, welche die mit der AHAS-SuR-Codierungssequenz verschmolzene PR-1-5'-Flankierungssequenz enthält, und das Band, welches den pCIB200-Vektor enthält, werden ausgeschnitten, gemischt und die DbIA ligiert, um pC'131232 zu bilden.

B. Herstellung von pCIB123O

Plasmid pCIB1208 (siehe unten) wird mit Zbal und IIcoI verdaut, und die Fragmente werden durch Elektrophorese auf einem 0,8 %igen 1 X TAS-Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur getrennt. Das Plasmid рСІВ2б9 (Beispiel 19 A) wird mit IIcoI und Zbal verdaut und auf einem 0,8 ^igen 1 Σ Tr.J-Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur behandelt. Das

pCIB269-£¹ragment, welches den Bluescript-Vektor und den PR-1-Promoter enthält, und das 3,3 kb-Fragment, welches das mutierte AHAS-Gen enthält (identifiziert durch Querhomologie und durch Restriktionsxragmentanalyse mit dem von Hazur u. a., Plant Physiol. 85, 1110 - 1117 (1987) beschriebenen Gen) v/erden ausgeschnitten, geschmolzen und miteinander ligiert, um einen als pCIB123O bezeichneten Klon zu schaffen«

C. Herstellung; von pCIB1208

Wie im Beispiel 22 G beschrieben, wird eine genomische DNA-Bibliothek hergestellt unter Verwendung von DIIA, die aus Ärabidopsis-Pflanzen isoliert wurde, welche auf Resistenz gegenüber SuIfonylharnstoffherbizid selektiert worden waren, wie das von Haughn und Somerville, Mol» Gen. Genet. 204, 430 - 434 (1986), beschrieben wurde. "Plaques", die Gene mit der Codierung für Azetohydroxysäuresynthase (aHAS) enthalten, werden durch Querhybridisierung mit einer Hefe-Azetohydroxysäuresynthase-Gen-Sonde (siehe Beispiel 22 C) identifiziert. Die rekombinante DNA wird in Bluescript (Stratagene) subkloniert, wodurch ein als pCIB1208 bezeichneter Klon geschaffen wird. Dieses Plasmid enthält ein Gen, das eine mutierte Azetohydroxysäuresynthase codiert, die resistent gegen Hemmung durch SuIfany!harnstoffherbizide ist»

Beispiel 2A - Isolierung eines genomischen Klons, der die basische ?orrn von ß-1,3-Glukanase (Glukanindo-1,3-ß-glukosidase) von Nicotir.a Tabacurn codiert

DIlA mit einem hohen Molekulargewicht; .vird aus den blättern von IIicotiana tabacum cv. Havana 425 nach dem СЗТЛЗ-Уэгіah_ ren (Murray und Thompson, Nucleic AciJL. Ras» S, 43^1 (1SCO))

hergestellte Es werden 100 jag der DNA mit Sacl vollständig verdaut» Diese DNA wird durch Elektrophorese auf einem 0,8- %±g,en Agarosegel abgetrennt. Der Bereich des Gels, der einem Molekulargewichtsbereich von 3 bis 7 kb entspricht, wird in 6 Streifen gleicher Größe geschnitten, und die DNA wird aus diesen Streifen elektroeluiert und in Form getrennter Fraktionen ausgefällte Die DNA wird wieder zur Suspension gebracht, und ein Aliquot jeder Fraktion wird auf einem Agarosegel behandlet und durch Southern-Transfer analysiert* Die Fraktion, welche DNA enthält, die an eine ß-1,3-Glukanase-cDNA-Sonde hybridissrt (Shinshi., H. u„ a., Proc Natl. Acad. Sei. USA 85, 5541 - 5545 (1988), wird zusammengefaßt und zur Konstruktion von Bibliotheken verwendet.

Der Clonierungsvektor LambdaOngC, der von der Stratagene Corp» bezogen wurde, wird mit Sacl verdaut. Es werden 1 p.g dieser DNA mit 0,1 ^Ug der Sacl-verdauten Tabak-DNA gemischt, und die DNA wird mit T4-DNA-Ligase nach den Empfehlungen des Herstellers ligiert. Die ligierte DNA wird dann unter Anwendung eines jLn vitro-Verpackungsver fahr ens nach Stratagene in Phagteilchen verpackt. Die Phage werden mit Bakterien, wie sie in der Lambda-Vorschrift vorgeschlagen werden, plattiert, üs werden etwa 75 000 "Plaques" unter Anwendung einer P-markierten ß-1,3-Glukanase-cDNA-Sonde "gescreent". Elf positive "Plaques" werden identifiziert, Diese "Plaques" werden durch aufeinanderfolgende Runden von Plattierung und "Screening" gereinigt.

DNA wird aus den gereinigten Klonen isoliert, und die Klone werden durch Restriktionsverdauung unter Verwendung von Hindlll, EcoRI und Sacl analysiert« Es handelt sich um Klone zweiter Typen, der eine wird durch den Klon 39«1_s der

andere durch den Klon 39.3 repräsentiert. Die 4,5- und 4,7-kb-Inserte in Klon 39И bzw. 39»3 werden in das Bluescript-Plasmid, das mit Sacl verdaut wurde, subkloniert, und es werden die Subklone pBSGluc39*1 (SaсI-Fragment von Lambda-Klon 39.1 abgeleitet) und p_>BSGluc39.3 (Sad-Fragment von Lambda-Klon 39.3 abgeleitet) isoliert. Die Sequenz der DNA in den Sacl-Fragmenten, die in den Subklonen pBSGluc39»1 und j>B5Gluc39»3 enthalten ist, v/ird durch DNA-Sequenzierung bestimmt und in den Sequenzen 5 bzw. 6 gezeigt. Es wird die Codierungssequenz ermittelt und eine große intervenierende Seqaena in der Nähe des 5'--Endes der Codierungssequenz loziert.

Beispiel 25 - Identifizierung der Transkriptionsstartstel-Ie für das ß-1 , 3-Glukanase-Gen

A. Starterextensionskartierung

Es wird ein synthetischer DNA-Starter synthetisiert, der komplementär zu den Basen 2399 bis 2416 ist und in Starterext ens ions experiment en eingesetzt v/ird, wie sie im Beispiel 5 beschrieben werden. Die RITA für diese Experimente wurde aus Tabak isoliert, der mit Phytophthora Oarasitiea var. nicotiana infiziert war. Die Starterextensionsprodukte vverden gegea einen Molekulargewichtsstandard behandelt, bei dem der markierte Starter in Dideoxy-DNA-Sequenzierungsreaktionen mit dem Subklon pBSGluc39.1 als blatrize verwendet wird» Fach der Gelelektrophorese und dor Autoradiogrsfie, wie sie im Beispiel 5 beschrieben wurden, werden Extensionsprodukte identifiziert, die den Positionen 1432, 1446 und 1447 der ß-1,3-Glukanase-39·1»Sequenz, Sequenz 5, entsprachen» Da zwischen den Positionen 1554 und 2345 der p33Gluc39.1-Se-

quenz ein großes Intron vorhanden ist, kann es sein, daß die Molekulargewichtsskala nicht das korrekte Molekulargewicht der Eztensionsprodukte widerspiegelt. Es wird daher ein zweites Starterextensionskartierungsexperiment mit einem Starter durchgeführt, der komplementär zu den Positionen 1530 bis 1547 ist. Bei Anwendung dieses Starters werden drei 5'-Enden der Glukanase-mRMA als Α-Reste in den Positionen 1434, H48 und 1449 kartiert.

B_e SI-Hukleasekartierung;

Es wird ein synthetisches Oligrmukleotid synthetisiert, das komplementär zu den Positionen 1415 bis 1504 ist und als Sonde in der Si-IIukleasekartierung eingesetzt wird«, Das Oli-

32 gonukleotid wird am 5'-Ende unter Verwendung von P-ATP und T4-Polynukleotidkinase nach den Empfehlungen des Herstellers kinatisiert. Nach der Phenolextraktion und der Ethanolausfällung wird das markierte Oligonukleotid in Pormamidhybridisationspuffer (siehe Beispiel 6) mit einer Konzentration von etwa 2 nM wieder zur Suspension gebracht« Die bei diesen Experimenten eingesetzte RiIA wird wie im vorstehenden Beispiel aus Tabak isoliert, der mit Phytophthora parasitica infiziert war. Die S1-Kartierung wird auf dieser RNA unter Verwendung des markierten Oligonukleotiden so vorgenommen, wie das im Beispiel 6 beschrieben wurde. liach der .Gelelektrophorese werden drei Bänder festgestellt, die den Positionen 1434, 1448 und 1449 in der pBSGluc39· 1-DITA-Polge entsprechen«

C. Bestimmung der Transkriptionsstartstelle

Sowohl beim Starterextensions- als auch bei oi-Hukleasekar-

tierungsverfahren werden die 5'-Enden der mRNA in den Positionen 1434, H48 und 1449 loziert. Folglich entsprechen diese Stellen, die alle Adeninreste sind, der Transkriptionsstartstelle des ß-1,3-Glukanase-Gens»

Beispiel 26 - Herstellung von pBSGluc39.1«/GUS Oligonukleotide mit den Sequenzen

A) 5 ^f-GTTTATGTGAGGTAGCCATGGTGGGAAGACTTGTTGGG-3'

B) 5'-GATCGCGGTACCGAGCTCCTCTAGGGGGCCAAGG-3'

werden synthetisiert, gereinigt und in einer polymeresekatalysierten Reaktion (PCR) nach den Anweisungen des Herstellers (Perkin Eimer Cetus, DbTA-Warmezyklierelement, und Perkin Eimer Cetus, GeneAmp-Reagenziensatz) eingesetzt, um ein 1494-bp-I^lragment der DNA von pBSGluc39»1 zu amplifizieren, Die Oligonukleotide werden bezeichnet, um eine Kpnl-Stelle unmittelbar an die Sacl-Stelle am Basenpaar 1 der 39»1-Glukanasesequenz hinzuzufügen und eine neue Ncol-Steile am Basenpaar 1462 zu schaffen. Die aus dem PCR-Amplifikationsverfahren abgeleitete DlA wird mit Phenol und Chloroform eztrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die ΰϊϊΑ wird wieder zur Suspension gebracht urid mit Ncol und Kpnl verdaut und auf einem 0,8 /iigen Agarosegel mit nia driger Gelier ungstemp era tür behandelt» Das 1462bp-Bsnd wird ausgeschnitten Lind in der folgenden Ldgation eingesetzt. Das Plasmid pBS-GUSI.2 (Beispiel 19 3) wird mit Kcol und Kpnl verdaut und auf einem 0,8 ;jigen Agarosegel behandelt, und das den Vektor enthaltende Band wird ausgeschnitten. Das Band, das den рЗЗ-GUS'l „2-Vektor enthält, und das 1462 bp-3and aus

der PCR-Reaktion r/erden ligiert und zur Transformation von g. ooli verwendet. Positive Klone werden herausgegriffen und nach denen gesichtet, welche das I462 bp-Insert enthalten. Die Plasmide, welche Inserte enthalten, sind mutmaßliche Xlone von pBSGluc39»1/GUS, da jedoch die Mutationsrate bei diesem Verfahren verhältnismäßig hoch ist (.^1/1000 Basen), müssen mehrere Klone bis zu I462 bp-Fragment sequenziert werden. -3s V7ird ein Klon mit der erwarteten Sequenz ausgewählt und als Klon pBSGluc39«1/GUS bezeichnet.

Beispiel 27 - Herstellung von pBSGluc39.3/GUS Oligonukleotide mit den Sequenzen

A) 5' -GTTTATCTGAG-GTAGCCATGGTGAGAACtACTTGTTGGA-3 '

B) 5'-GATCGCGGTACCGAGCTCCCTTGGGGGGCAAG-3'

werden synthetisiert, gereinigt und in einer PCR-Reaktion eingesetzt, um ein 1677 bp-Fragment von pBCGluc39»3 zu amplifisieren. Die Oligonukleotide werden so aufgebaut, daß eine neue Kpnl-Stelle unmittelbar im Anschluß an die Saclsteile in Position 1 der Glukanase-39«3-3equenz und eine neue ITcoI-Stelle in der Position 1646 eingeführt werden. Die DlTA aus der PCR-Amplifikation wird mit Phenol und Chloroform extrahiert, mit Ehanol ausgefällt, wieder zur Suspension gebracht, mit Ncol und Kpnl verdaut und auf einem 0,8 ',jigen Agarosegel mit niedriger Gelierungsternperatur behandelt. Das Band bei 1c46 bp wird ausgeschnitten und in der folgenden Ligation eingesetzt. pBS-GUSI.2 wird mit ricol und I-pnl '•erdaut und auf einem 0,8 ^igen Agarosegel mit nieariger Oeiieriuasstemüeratur behandelt. Das den Vektor enthaltende

Band wird herausgeschnitten, mit dem I646 bp-Band aus der PCR-Reaktion gemischt und ligiert, um das Plasmid pBSGluc-39«3/GUS zu bilden» Wie oben werden verschiedene mutmaßliche Plasmide isoliert und sequenziert, und eines mit der erwarteten Sequenz wird als Plasmid pBSGluc39»3/GUS herausgegriffen.

Beispiel 28 - Herstellung von pCIB2OO/Gluc39H-ÜUS und pCIB200/Gluc 39.3-GUS

л„ pCIB200 (Beispiel I9 c) wird mit Kpnl und Xbal verdaut und auf einem 0,8 folgen Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatür behandelt« Das Plasmid pBSGluc39·1/GÜS (Beispiel 26) wird mit Kpnl und Xbal verdaut, und die Fragmente werden auf einem 0,8 %igen Gel mit niedriger GeIieKungstemperatur getrennt. Die Beänder, die den pCIB200-Vek"cor enthalten, und das Kpnl-Xbal-Band, welche die 5'-Flankierungssequenz des Glukanase-39H-Gens enthält, die mit dem GUS-Gen verschmolzen ist, werden herausgeschnitten und die DKa ligiert, um das Plasmid pGIB2OO/Gluc39«1-GUS zu bilden,

B, Ebenso wird Plasmid pBSGluc39.3/G^TJS (Beispiel 27) verdaut und mit dem verdauten pCIB200 ligiert, um das Plasmid pCIB2OO/Gluc39»3-GUS zu bilden.

Beispiel 29 - Herstellung von pCI3200/Gluc39»1Bf und aCIB2OO/Gluc39< 3-ΒΈ

iL. pCIB20Q/G1uc 39.1 -BT

Das Plasmid pBbGluc39.1/GUd wird mit Ilpnl und Ycol vardau- und auf einem 0,6 /Jigen --igarosegel mit niedriger Geliervj^zc- temperatur behandelt. Das Plasmid рСІЗЮОД (Зеізоіеі 21 2)

wird mit Kpnl und Ncol verdaut und auf einem 0,8 %igen Agarosegel mit niedriger Gelierungsteraperatur behandelt. Das Plasmid pCIB200 (Beispiel 19 C) wird mit Kpnl verdaut, unter Einsatz von alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert und auf einem 0,8 %igen Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur behandelt« Das Band, das den pCIB200-Vektor enthält, das Band, das den Glukanase-5'-Flankierungsbereich enthält, und das Band, welches das BT-Gen enthält, werden herausgeschnitten, miteinander vermischt und ligiert, um das Plasmid pCIB2OO/Gluc39·1-BT zu bilden«

3. pClB2OO/Gluc39.3-BT

Ebenso wird Plasmid pBSGluc39<>3/GUS verdaut und mit verdautem pCTB1004 und verdautem pCIB200 ligiert, um das Plasmid pCI3200/Gluc39.3-BT zu bilden«

Beispiel 30 - Herstellung von pGIB2OO/Gluc39.1-AHAS und PCIB2OO/G1UC39« 3-AHA.S

A. Libation mit pCIB200

Das Plasmid pBSGluc39.1/AHAS wird mit Kpnl und Zbal verdaut und auf einem 0,8 ^igen Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur behandelt. Das Plasrnid pCIB200 (Beispiel 19 C) .wird mit Kpnl und Xbal verdaut und auf einem 0,8 feigen Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur behandelt» Das Sand, welches die Glukanase/AHAS-FusLon enthält, und das Band das den pCIB200-Expressionsvektor enthält, werden herausgeschnitten, gemischt und die DNA ligiert, um das Plasmid pClB2OO/Gluc39.1-AHÄ3 au bilden.

Sbenso wird das Plasmid pBSGluc39«3/AHÄS verdaut und mit verdautem pCIB200 ligiert, um das Plasmid pCIB2OO/Gluc39.3-AHAS zu bilden«

B. Herstellung der Plasmide pBSGluc39.1/AHA.S und pBSGluc39o3/AHAS

Das Plasmid pBSGluc39.1/GUS (Beispiel 26) wird mit ITcoI und Zbal verdaut und auf einem 0,8 folgen Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur behandelt. Das Plasmid рСІВІ207 (Beispiel 22 G) wird mit Hcol und Zbai verdaut und auf einem 0,8 /Sigen Agarosegel mit nedriger Gelierungstemperatur behandelte Das Band, das die Glukanase-5'-Flankierungssequenz und den Vektor enthält, und das Band, das die AHAS-Codierungssetjuenz enthält, werden herausgeschnitten, gemischt und die DNA ligiert, um das Plasmid p3SGluc39.1 AHA.S zu bilden.

Ebenso wird Plasmid pBSGluc39.3/GUS (Beispiel 27) verdaut und mit dem verdauten pCIB1207 ligiert, um das Plasmid pB5Gluc39_e3/AHAS zu bilden.

Beispiel 31 - Herstellung von PCIB2OO/G1UC39. WJIAS-GuR una PCIB200/G1UO39. 3-aHAS-SuR

A. Libation mit pCIB200

Das Plasmid pBSGluc39« I/aH^G-SuR wird mit Kpnl und Xb a I verdaut und auf einem 0,8 ^igen Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur behandelt. Das Plasmid pCIB200 (Beispiel 19 C) wird mit Kpnl und Xbal verdaut und auf einem 0,8 ',jigen agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur behandeln, ^as Band, das die Glukanase/AlnUS-3uR-?ua.on enthält, und dac За.гі,

das den pCIB200-Sxpressionsvektor enthält, werden herausgeschnitten und die DNA ligiert, um das Plasmid pCIB200/ Gluc39.1-AHAS-SuR zu bilden.

Ebenso wird das Plasmid pBSGluc39.3/AHAS-SuR verdaut und mit verdautem pCIB200 ligiert, um das Plasmid pCIB2OO/Gluc39.3-AHAS-SuR zu bilden»

B, Herstellung der Plasmide pBSGluc39.1/AHAS-SuR und pBSG1uc39.3/AHAS-SuR

Die Plasmide pBSGluc39.1/GUS (Beispiel 26) und pBSGluc39.3/ GUS (Beispiel 27) werden mit Ncol und Xbal verdaut, und die Restriktionsfragmente werden auf einem 0,8 %igen 1 Σ ¹TAE-Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur getrennt« pCIB1208 (Beispiel 23 C) wird mit Xbal und Ncol verdaut, und das 3,3 kb-Pragment, welches das mutierte AHAS-Gen (SuI-fonylharnstoffherbizidresistent, SuR) enthält,.wird durch Agarosegelelektrophorese isoliert» Die Fragmente die den Glukuronidasepromoter und den pBS-Vektor enthalten, werden herausgeschnitten, geschmolzen und mit dem AHAS-Pragment ligiert, um Klone zu schaffen, die als pBSGluc39»1»AHAS-SuR bzw. pBSGluc39.3/AHAS-SuR bezeichnet werden.

4. Identifizierung;; der neuartigen Gene

In den folgenden Beispielen wird die Isolierung und die Charakterisierung der restlichen neuartigen PR-Protein-Gene der vorliegenden Erfindung offengelegt_β

Beispiel 32 - Isolierung von anderen genomischen und cDITA-Klonen

A. Isolierung' eines PR-1'-codierenden genomischen Klons

Ss wird eine genomische Bibliothek konstruiert und mit einer PR-1-cDNA-Sonde einem "Screening" unterzogen, wie da-s im Beispiel 11 beschrieben wurde» Ein Klon wird isoliert und als lambdtobchroPRIOI9 bezeichnet» Es wird eine vorläufige Restriktionskarte aufgestellt. In das Bluescript wird ein Clal-Fragment subkloniert, und dann wird eine Restriktionskarte des Plasmids, pBS-PR1019Cla, aufgestellt. Ein großes Xhol-Fragment wird aus pBS-PRiO19Cla deletiert, was das Plasmid pBS-PR1019Cla Xhо ergibt. Dieses Plasmid enthält etwa 2,7 kb der Tabak-DNA mit dem PR1O19-Gen. In diesem Plasmid werden Deletionen vorgenommen, und der Satz der Deletionen wird für die DHA-Sequenzierung verwendet.

Die DlTA-J¹O]^ für etwa 2100 bp dieses Gens wird in der Sequenz 2 gezeigt. Das in PR1910 codierte Protein ist zu etwa 65 /'ί homolog zu PR-Ia, PR-Ib oder PR-Ic, daher wird dieses neue Gen als PR-V bezeichnet.

3. Isolierung; eines Gurkenchitinase codierenden cDHA-Kions

Ein pathogeninduzierbares Chitinaseprotein wird aus infizierten Gurkenblättern isoliert, wie das von Metrauz, J. P. u. a., РЬлд-ological and Molecular Plant Pathology, 33, 1 bis 9 (1988) beschrieben wurde. Aus diesem homogenen Proteinpräparat werden Peptide hergestellt, wie das im wesentlichen in der Fachliteratur und in den Beispielen 9 und beschrieben wird. Es werden zwei Bereiche des Proteins ausgewählt, und es werden zwei Oligonukleotidsonden synthetisiert, die zu allen möglichen Kombinationen der Boten-RIIA

komplementär ist, die Peptide codieren können» Diese Sonden haben folgende Sequenzen:

GT A Sonde 1: 5¹-CCATTCTGNCCCCAGTA-3'

GGGGC Sonde 2: 5'-GGATTATTATAAAATTGNACCCA^'

Gufcenblätter werden mit dem Tabaknekrosevirus (TNV) infiziert, und 5 Tage nach der Infektion wird RNA isoliert, wie das im Beispiel 5 beschrieben wurdo Nach Standardverfahren wird Poly-A+-RNA isoliert, und im AZap-Elonierungsvektor (Stratagene) wird eine сDNA-Bibliothek konstruiert, wie das im wesentlichen von Gubler, U. und Hoffman, B. J., Gene 25, 203 (1983) beschrieben wurde. Es werden 300 000 "Plaques" plattiert und Duplikatplaque-Eletnente mit dem

32 mit P markierten Oligonukleotidgemisch 1 (Sonde 1) oder Gemisch 2 (Sonde 2) sondiert. Es werden die "Plaques" isoliert, die beim "Screening" mit einer der Sonden positive Ergebnisse zeigen» Die Isolierung des Phagen und das automatische Herausschneiden erfolgen nach den Anweisungen im Stratagene Lambda Zap-Laborhandbuch.

Wenn die Chitinase-cDNA-KIone im Bluescript-Plasmid isoliert sind, werden sie durch Dideoxysequenzierung sequenziert* Die Sequenz des Chitinase-Gens wird in der Sequenz 3 dargestellt.

C. Isolierung des сDI⁴IA-Klons zur Codierung der Hauptform von PR-R

Blätter von liicotinia tabaccum cv. Iianthi-nc werden rain lern

Tabakmosaikvirus infiziert und fünf Tage nach der Infektion geerntet. Die Gesamt-ffiTA wird wie im Beispiel 5 hergestellt, und Poly-A+-RNA wird nach Standardverfahren isoliert. Unter Verwendung dieser Poly-A+-R]tfA im Lambda-ongC-Klonierungsvektor (Stratagene) wird eine cDrlA-Bibliothek konstruiert. Mit einer Oligonukleotidsonde mit der Sequenz

5' -G^AGTTCCTiUlAAGCTTCCCGTTTTATGCC-3 ·

werden etwa 300 000 "Plaques" einem "Screening" unterzogen» Positive "Plaques" werden nach Standardverfahren gereinigt, und aus dem Phag wird DNA hergestellt, ilin Fragment des rekombinanten Phags, das die cDlTA enthält, wird in das Bluescrip t-?lasmid subkloniert. Die DlU-Jj¹O Ige der с DNA wird durch DNA-Sequenzierung bestimmt. Die Sequenz eines Klons, der die Hauptform von PR-R codiert (Pierpoint, V/, S. u. a«, Physiol. Plant Pathol. 31, 291 (1987)) wird in Sequenz 4 dargestellt. Dieses codierte Protein hat eine sehr starke Homologie zu einem bekannten Trypsin/Alpha-xlmylase-Inhibitor, der aus Mais isoliert wird (Richardson, LI. u. a., Mature 327, 432 (1987)). Die klonierte PR-R kann ein Inhibitor von Proteasen oder Alpha-Amylasen sein und überträgt als dieser insektizide, virizide oder fungizide Aktivität auf Pflanzen, wenn die Transgene;cpression erfolgt.

D₈ Isolierung der PR-Q-codierenden сDHA

Blätter von Nicotinia tabaccum cv. _Zanthi-nc ,'/erden ηιϊτ dem Tabakmosaikvirus infiziert und fünf Tage nach der Infektion geerniEl;. Die Gesa rat-RNa wie im Beispiel 5 wird hergestellt, und unter Standardverfahren wird Ро1у-А+-ГХл isoliere. Unter Verwendung dieser Poly-^-f-RFa im Lambda OngC-Slonierungsvektor (Sfcratagene) wird eine cDIu-Biblioxliel·: konstru-

iert. Etwa 300 000 "Plaques" werden einem "Screening" unter Verwendung einer markierten с DNA-Sonde- mit Codierung für das basische Tabakchitinase-Gen (Shinshi u. a., Proc. Hatl. Acad. Sei. USA 84, 89 - 93 (1987)) und Waschfiltern bei 50° C in 0,125 ml MaCl, 1 % SDS, 40 mM Natriumphosphat (pH-Wert 7,2), 1 mM EDTA, unterzogen» Es werden 24 positive "Plaques" gereinigt, und die DlTA-Fo Ige eines als pBScht15 bezeichneten Klons wird bestimmt. Diese Folge wird in Sequenz 7 dargestellt.

Das PR-Q-Protein wird teilweise von intrazellulärer Flüssigkeit der ТШГ-infizierten Tabakblätter gereinigt, wie das im Beispiel 8 beschrieben wurde» Fraktionen von der Ultragel-ACA54-Chromatografie, die PR-O, PR-P, PR-Q und PR-R enthalten, werden zusammengefaßt und durch Lyophilieren konzentriert. Die Protein ^werden weiter durch Polyakrylamidgelelektrophorese gereinigt. Das Proteinband, das PR-Q enthält, wird herausgeschnitten und nach dem Applied Biosystems User Bulletin 1*3 36 vom 21. März 1988 proteinelulert. Das Protein wird mit Pyroglutamataminopeptidase behandelt und durch automatisierten IMman-Abbau sequenziert, wie das im Beispiel 9 beschrieben wurde. Die Sequenz des Aminoterminus des PR-Q-Proteins wird bestimmt mit (2_x;c = unklar):

GlnGlylleGlySerlleValThrXxxAspLeuPheAsnGluIvIetLeu

Das im Klon in Sequenz 7 codierte Protein wird als das pathagonesebezogene Protein Q bestimmt auf der Grundlage von 1) begrenzter struktureller Homologie mit der basischen Tabakchitinase und 1) Identität mit der Aminoterminalproteinfolge von PR-Q, bestimmt durch Proteinsequenzierung,

E. Isolierung der cDNA zur Codierung der sauren Form von ß-1,3-Glukanase

Etwa 300 000 "Plaques" der in Beispiel 32 D (oben) beschriebenen сША-Bibliothek werden unter Einsatz einer markierten cDNA-Sonde zur Codierung der basischen Form von ß-1,3-Glukanase (Shinshi, H, u. a«, siehe oben) und Waschen der Filter bei 50° C in 0,125 M ITaCl, 1 % SDS,'40 mM Natriumphosphat (pH-Wert 7,2), 1 mM EDTA "screeniert". Es werden 15 positive "Plaques" isoliert und das Insert in das Bluescript-Plasmid subklonierte Die partielle DNA-Sequenzierung zeigt, daß Klon 5 und 6 identische cDNA codieren, die eine Homologie von etwa 55 % zur bekannten ША-Folge der basischen Form von ß-1,3-Glukanase haben. Die Folge der cDNA in Klon 5 und б wird bestimmt und in Sequenz 8 gezeigt» Es wird gefolgert, daß diese cDNA die saure Form von ß-a,3-Glukanase codiert, Grundlage für diese Schlußfolgerung bilden die begrenzte Aminosäurenfolgenhomologie und der stä:fer saure isoelektrische Punkt des codierten Proteins»

Fo Isolierung eines genomischen Klons mit der Codierung des Gurkenchitinase-Gens

^Von Cu-cumis sativus cv. Long Marketer werden Nuklei isoliert, und wie im Beispiel 11 wird die DNA isoliert« Es werden 3 ug dieser DNA mit EcoRV, EcoRI, BamHI oder Hlndlll verdaut, und die Fragmente werden auf einem 0,5 folgen Agarosegel getrennte Eine Southern-Transfer-Analyse unter Verwendung einer markierten Sonde der Gurkenchitinase-cDNA (Sequenz 3) zeigt, daß im ScoRI-Verdauungsprodukt ein einzelnes Band bei etwa 12 kb vorhanden ist. Es wird daher entschieden, das Gurkenchitinase-Gen unter Verwendung des gesamten EcoRI-Verdauungsproduktes zu isolieren und in einen Lambda-Klonierungsvektor des Austauschtyps zu ligieren*

Es werden 10 μ& der oben isolierten DNA vollständig verdarb, wozu EcoRI eingesetzt wird_e Diese DNA wird dann mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt und in die EcoRI-Stelle von EMBL 4 ligiert. Mit der markierten cDNA-Sonde von Gurkenchitianse, Sequenz 3, werden etwa 100 "Plaques" screeniert« Zehn positive "Plaques" werden herausgegriffen und gereinigt, und das DNA-Insert wird durch vorläufige Restriktionsverdauungskartierung analysiert» Alle Klone bringen das gleiche Ergebnis, für die weitere Analyse wird einer herausgegriffen. Das 12 kb-Insert in diesem Klon wird dann in das Bluescript-Plasmid subkloniert und ergibt Plasmid pBScucchi/Chitinase,, Pur diese klonierte DNA wird eine Restriktionskarte erstellt, die Fragmente werden subkloniert und die DNA-Folge bestimmt.

G» Isolierung eines genomischen Klons mit der Codierung von saurer ß-1,3-Glukanase

Wie im Beispiel 11 beschrieben, wird eine genomische Bibliothek konstruiert und mit einem cDNA-Klon auf die saure ß-1,3-Glukanase, Beispiel 32 E, "screeniert",, Es wird ein Lambda-Klon isoliert, und ein 1 kb-umfassendes EcoRI-Fragment dieses Lambda-Klons wird in das Bluescript-Plasmid subkloniert, wie das im Beispiel 32 A beschrieben wurde,, Der Bluescript-Klon hat die Bezeichnung pBSGL6e_e

5o Stabile Transformation und Regeneration von Pflanzen

Pflanzengewebe wird mit den oben beschriebenen Vektoren nach einer aus dem Fachgebiet bekannten Technik transformiert. Zu diesen Methoden für die Übertragung von DNA in Pflanzenzellen gehören beispielsweise die direkte Infektion oder Kokultivierung von Pflanzen, Pflanzengewebe oder

Zellen mit A^ tumefaciens (Horach, R„ B₉ u_e a_e, Science 225, 1229 (1985); Marton, L., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants (Zellkultur und,somatische Zellgenetik von Pflanzen), Bd* 1, 514 - 521 (1984)), die Behandlung von Protoplasten mit exogener DUA nach Methoden _s wie sie in den folgenden Publikationen beschrieben wurden: Paszkowski, J_e u_e a., EMBO J. 3, 2717 (1984); EP-A O 164 575; Shillito, R. D«, и, a_e, Bio/Technology 3_S 1099 (1985); Potrykus, I. u. a_e, siehe oben; Loerz, H* u* a., Mole Gen» Genet₉ 199, 178 (1985); Fromm, M* u. a·, siehe oben; GB-PS 2 140 822 und Negrutiu, I. u. a·, Plant Mol, Biol. 8, ЗбЗ (1987); die Inkubation mit Polyethylenglykol (PEG) (Negrutiu, I. Ue a„, siehe oben); die Mikroinjektion (Reich, T» J₉ u« a., Bio/Technology 4, 1001 - IOO4 (1986); Reich, T₀ J. u_e a·, Can. J, Bot, 64, 1259 - 1267 (1986)), Mikroprojektilbombardement (Klein, To M„ u. a., Nature 327, 70 (1987))«

Beispiel 33 - Transformation von Agrobaeterium

pCIB270- (Bei^iel 16), рС1В271-, pCIB272- und pCIB273-Plasmid-DNA (Mspiele 19 D, E und P) wird auf Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gradienten gereinigt und zur Transformation des λ± tumefaciens-Stammes AI36 verwendet, der das HeIferplasmid pGIB542 enthält, dazu wird das Verfahren von Holsters, M. u. a,, Mol. Gen« Genefc. 163, 181 - 187 (1978) angewendet. Dabei erhält man die Stämme CIB270, CIB271, CIB272 und CIB273*

Unter Anwendung desselben Verfahrens werden die Plasmide pCIB271s pCIB272 und pCIB273 in die virulenten Stämme von ѣл. tumefaciens 15955, A208, A281 und den A^ rhizog;enes-Stamm A4 transformiert, wobei die als pCIB271 X 15955,

pCIB271 X А208, рСІВ271 X А281, рСІВ271 X A4, рСІВ272 X 15955, рСІВ272 X А208, рСІВ272 X А281_s pCIB272 X A4, рОІВ272 2 15955, рСІВ272 X Δ208,, pGIB273 X А281 und рСІВ273 X A4 geschaffen werden»

Der Agrobacterium-Stamm GIB542 ist Stamm БНА1О1 (Hood, u* a_e, J₉ Bacteriol* 168, 1291 - 1301 (1986)), in welchem der Kanamycin-Marker des Plasmids durch den Spektinomycin/Streptomyzin-Abschnitt von Tn7 ersetzt wurde_e

Beispiel 34 - Blattscheibentransformation von Tabak

Agrobacterium-Stämme CIB270, CIB271_s GIB272 und CIB273 werden 18 bis 24 Stunden lang in Medien von Glutamatsalzen, die auf einen pH-Wert von 5,6 abgestimmt und mit 0,15 % Mannitol, 50 ug/ml Kanamycin, 50 jug/ml Spektinomyzin und 1 mg/ml Streptomyzin ergänzt wurden₉ gezogen, bevor sie auf einen ODgQQ-Wert von 0,2 in den gleichen Medien ohne die Antibiotika verdünnt werden» Die Bakterien werden dann drei bis fünf Stunden gezogen, bevor sie auf einen OD-Wert von 0,2 - 0,4 verdünnt werden, zur Inokulation von Scheiben von 5 bis 7 mm, die aus Blättern von Nicotinia tabaccum cv. Xanthi gestanzt wurden, die aseptisch in GA7-Containern gezogen worden sind, worauf sich еілр IIethoö-э von Horsch, B« u. a., Science 227, 1229 - 1232 (1985) beziehte

Die Blattscheiben werden auf einem 0,7-'%igen Agar gehalten,, das Haupt- und Nebensalze von Murashige und Skoogs (MS), 1 mg/1 Benzyladenin und 1 mg/ml ^-'-Naphthalenessigsäure enthält, bevor nach zwei Tagen die Übertragung auf das gleiche Medium erfolgt, das 50 jü.g/ml Kanamycin, 100 ,mg/ml Karbenizillin und 100 ug/ml Mefoxin enthält» Triebe, die sich auf den Scheiben bilden, werden herausgeschnitten und vermehrtj

"bis man durch Subkultivierung der Triebspitzen in GA7-Behältern auf MS-Medium (das 50 /ig/ml Kanamycin enthält) sechs Pflänzchen erhält«

Die Pflänzchen werden auf einem Medium bewurzelt, das keine Hormone und 50 /ig/ml Kanamycin enthält, in den Boden gebracht und in einem Phytotron abgehärtet, bevor die Übertragung ins Gewächshaus zur Induktionsbehandlung mit chemischen Reglern erfolgt,. Zur Blütezeit werden die Blüten zur Selbstbestäubung gebracht« Nach dem Reifen wird der Samen geerntete

Die Induzierungsexperimente und deren Ergebnisse werden in den Beispielen 63, 66 und in Tabelle-II beschrieben«.

Beispiel 35 - Produktion von transgenen Tabakkallus und -pflanzen

Der Agrobacterium-Stamm pCIB270 oder pCIB271 ist zur Transformation von Kallus eingesetzt worden, der sich aus den Blattscheiben entwickelt (Beispiel 34)β Kallus, der sich auf kanamyzinhaltigem MSNB-Selektionsmedium bildet, wird auf einem Kalluswachstumsmedium gehalten, das aus MS-Haupt- und Nebensalzen und Fe-EDTA (Gibco HS 500-1117; 4,3 g/l), MS-Vitaminen, 100 mg/ml Myoinositol, 20 g/l Sukrose, 2 mg/1 Naphthalenessigsäure und 0,3 mg/1 Kinetin besteht«

Der Kallus kann zur Regeneration von transgenen Pflanzen durch Übertragung von Kallusstückchen auf MSBN-Medium und Anwendung der im Beispiel 34 beschriebenen Methoden verwendet werdeno Der Kallus wird auch zum Messen der Gen-Induzierung nach dem Einsatz von induzierenden Chemikalien und zum "Screening" nach gen-induzierenden Chemikalien eingesetzt» -

Beispiel Зб - Transformation von Möhren

Die Affrobacterium-Stämme CIB27O, CTB271, CIB272, CIB273j PCIB271 X 15955, pCIB271 X A208, pCIB271 X A281, pCIB271 X A4, pCIB272 X 15955, pCIB272 X A208, pCIB272 X A281, PCIB272 X A4, pCIB273 x. 15955, pCIB272 X A208, pCIB273 X A281 and pCIB273 X A4 werden wie im Beispiel 34 gezogen» Die Bakterien, verdünnt auf einen ODg₀₀-Wert von 0,2 bis 0,4, werden dann zur Inokulation von Scheiben verwendet_s die aus oberflächensterilisierten Möhren geschnitten wurden*

Um die Möhren oberflächenzusterilisieren, wurden sie geschält und dann 20 min in einer 10 %igen Chlorox-Lösung getränkt» Dann werden die Möhren mit sterilem Wasser gespült, in 5 mm-Stücke geschnitten und mit der Basalseite nach unten auf Wasser-Agar gebracht« Anschließend werden auf die Oberflächen der Scheiben 20 - 50 μΐ Bakterien aufgebrachte Nach 7 Tagen werden die Scheiben auf 0,7 %iges Agar gebracht, das MS-Salze, 3 % Sukrose, 0,1 mg/1 2,4-D, 50 /ig/ml Kanamycin, 100 /ig/ml Karbenizillin und 100 Mg/ml Mefozin enthalte Der Kallus, der sich um den Kambiairing bildet, wird herausgeschnitten und auf 0,7 ^Siges Agar gebracht, das durch 3 % Sukrose, 0,1 mg/1 2,4-D, 50 ,ug/ml Kanamycin, 100 ,ug/ml Karbenizillin und 100 ,ug/ml Mefoxin ergänzt wurde_e Nachdem der Kallus gewachsen ist, wird er in kleine Stücke geschnitten und willkürlich auf vier Platten des gleichen Mediums gebracht« Wenn dieser Kallus die Platte gefüllt hat, werden drei der Platten mit V/asser, 50 mM Natriumsalyzilat, pH-Wert 5",6, oder 250 jug/1 Methylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7-karboxylat besprüht, um die Expression des schimärischen PR-1 a/GUS-Gens zu induzier en«,

Die Induzierungsexperimente und deren Ergebnisse werden in den Beispielen 63 und 66 beschriebene

Beispiel 37 - Transformation von Sonnenblumen

Agrobacterium-Stämme CIB27O, CIB271, CIB272, CIB273, pCIB271 X 15955, pCIB271 X A208, pCIB271 X A281, pCIB271 X A4, pCIB272 X 15955, pCIB272 X A208, pCIB272 XA281, PCIB272 X A4, pCIB272 я 15955, pCIB273 X A 208, pCIB273 X A281 und pCIB273 X A4 werden wie im Beispiel 34 gezogen* Dann werden die Bakterien, verdünnt auf einen ODg_QO-Wert von 0,2 - 0,4, für die Inokulation der Stengel von Sonnenblumenpüanzen verwendet, die 'folgendermaßen präpariert wurden:

Sonnenblumensamen wird 10 min in 10 %igem Kaptan getränkt, gefolgt von 10 min in 10 %igem Ghloroz und Spülen mit sterilem Wasser» Die Samenhüllen werden entfernt, und der Samen wird auf 0j7 %igem Was3er-Agar im Dunkeln drei Tage lang gekeimt, anschließend wird er in einen Laborinkubator gebracht, der auf 23° C und einen 12-Stundenwechsel von Tag und Nacht eingestellt ist* Die Sämlinge werden eine Woche gezogen, bevor sie gekappt und Bakterien auf die geschnittene Stengeloberfläche gebracht werden·

Nach einer Woche werden die mit CIB270, CIB271, CIB272 oder CIB273 inokulierten Stengel geschnitten und auf 0,7 %iges Agar gebracht, das MS-SaIze, 3 % Sukrose, 2 mg/ml ύς-lTaphthalenessigsäure, 1 mg/ml 6-Benzylaminopurin, 100 ^g/ml Karbenizillin, 100 ,ug/ml Mefoxin und 50 ag/ml Kanamycin enthält» Die mit pCIB27i X 15955? pCIB271 X A208, pCIB271 X A281, pGIB271 X A4, pCIB272 X 15955, pGIB272 X A208,

PCIB272 X А281, рСІВ272 X A4, рСІВ273 X 15955, pGIB273 X А208, рСІВ273 X 281 und рСІВ273 X A4 inokulierten Stengel werden geschnitten und auf 0,7 %iges Agar gebracht, das MS-Salze, 3 % Sukrose, 100 ,ug/ml Karbenizillin und 100. jag/ml Mefozin enthalte Der Kallus wird alle zwei Wochen auf frisches Medium übertragen, bis man eine ausreichende Menge für 4 Platten erhält« Die Hälfte des Kallus, der von den virulenten Ag;robact3?ium-Stämmen wächst, wird auf Medien ohne Hormone, die 50 jUg/ml Kanamycin enthalten, übertragene Nachdem man eine ausreichende Menge von Kallus, dar ohne oder mit Kanamycin gezogen wurde, erhalten hat, wird er wie oben bei der Transformation von Möhren-Kallus zur Induzierung behandelt«

Beispiel 38 - Transformation von Tomaten

^Die Agrobacterium-Stämme CIB270, CIB271, CIB272, CIB273, pCIB271 X 15955, pCIB27i X A208, pCTB271 X A281, pCIB271 X A4, pCIB272 X 15955, pCIB272 X A208, pCIB272 X A281, pCIB272 X A4_S pCIB273 X 15955, pCIB273 X A208, pCIB273 X A281 und pCIB273 X A4 werden wie im Beispiel 34 gezogene Dann werden die Bakterien, Verdünnung auf einen ODg₀₀-Wert von 0,2 - 0_s4, für die Inokulierung von Stengeln von Tomatensämlingen verwendet, die folgendermaßen präpariert wurden:

Tomantensamen werden 20 min in 10 %igem Chloros getränkt und mit sterilem Wasser gespülte Die Samen werden auf 0,7- $igem Wasser-Agar im Dunkeln drei Tage lang gekeimt, anschließend werden sie in einen Laborinkubajbor gebracht, der auf 23° C und einen 12-stündigen Tag» und Uachtwechsel eingestellt ist. Die Sämlinge werden eine Woche gezogen, bevor sie gekappt und Bakterien auf die geschnittene Stengelfläche inokuliert werden·

Nach einer Woche werden die mit CIB27O, OIB271_S CIB272 oder СГВ273 inokulierten Stengel geschnitten und auf ein 0,7 %-iges Agar gebracht, das MS-Salze, 3 % Sukrose, 2 mg/ml α-Naphthalenessigsäure, 1 mg/ml 6-Benzylaminopurin, 100 xig/ml Karbinizillin, 100 jig/ml Mefoxim und 50 μg/ml Kanamycin enthält» Die mit pGIB271 X 15955, pGIB271 X A208, pGIB27i X A281, pCIB271 X A4, pGIB272 X 15955, pCIB272 X A208, PCIB272 X A281, pCIB272 X A4, pCIB273 X 15955, pGIB273 X A208, pGIB273 X A281 und pCIB273 XA4 inokulierten Stengel werden geschnitten und auf 0,7 %iges Agar gebracht, das MS-Salze, 3 % Sukrose, 100 ,ug/ral Karbenizillin und 100 ,ug/ml Mefoxim enthält«, Der Kallus wird alle zwei Wochen auf frisches Medium übertragen, bis man eine für 4 Platten ausreichende Menge erhält« Die Hälfte des Kallus, der von den virulenten Agrobacterium-Stämmen wächst, wird auf Medien ohne Hormone übertragen, die 50 /ig/ml Kanamycin enthaltene nachdem man genügend Kallus erhalten hat, das bei Vorhandensein oder Fehlen von Kanamycin gezogen wurde, -wird die Behandlung zur Induzierung vorgenommen, wie sie oben für transformierten Mohr.enkallus beschrieben wurde,,

Beispiel 39 - Transformation von Baumwolle

Die Agrobacterium-Stämme pCIB271 X 15955, pCIB271 X A208, pCIB271 X A281, pCIB271 X 4A, pCIB272 X 15955, pGIB222 X A208, PCIB272 X A281, pCIB272 X A4, pGIB273 X 15955, PGIB273 X A208, pCIB273 X A281 und pCIB273 X A4 werden wie im Beispiel 34 gezogene Dann werden die Bakterien, verdünnt auf einen 0D/-₀₀-Wert von 0,2 - 0,4 für die Inokulation von Baumwollkeimblättern verwendet, welche folgendermaßen präpariert wurden:

Die BaumvoLlsamen wurden 20 min in 10 % Chlorox getränkt und mit sterilem Wasser gespült» Die Samen wurden im Dunkeln auf 0,7 %igem Wasser-Agar gekeimt« Die Sämlinge werden eine Woche gezogen, Ъеѵог die Bakterien auf die Keimblattoberfläche inokuliert werden*

Man läßt die inokulierten Keimblätter Kallus bilden, bevor sie geschnitten und auf 0_s7 %iges Agar gebracht werden, das MS_Salze, 3 % Sukrose, 100 jig/ml Karbenizillin und 100 jag/ral Mefoxim enthält« Der Kallus wird alle drei Wochen auf frisches Medium gebracht, bis eine für vier Platten ausreichende Menge vorhanden ist_e Die Hälfte des von den virulenten Agrobacterium-Stämmen wachsenden Kallus wird auf Medien ohne Hormone übertragen_s die 50 Mg/ml Kanamycin enthalt en* Nachdem man genügend KaIIuS₉ der bei Vorhandensein oder Fehlen von Kanamycin gezogen wurde, gewachsen ist, wird er zur Induzierung behandelt, wie das oben für transformierten Möhrenkallus beschrieben wurde_e

Beispiel 40 - Herstellung eines Kallusspezialtyps von Zea Mays, Inzucht-Elite-Stamm Punk 2717

Zea Mays-Pflanzen der Inzuchtlinie Punk 2717 werden bis zur Blüte im Gewächshaus gezogen und eigenbestäubt«. Unreife Ihren, die Fruchtkeime von etwa 2 - 2,5 mm Länge enthalten, werden von den Pflanzen entfernt und in 10 ^iger Chlorox-Lösung 20 min sterilisierte Die .Fruchtkeime werden aseptisch von den Körnern ent&rnt und mit der Fruchtkeimachse nach unten auf OMS-Mediura plattiert, das 0,1 mg/1 2,4-D, 6 % Sukrose und 25 mM L-Prolin, das mit 0,24 % Gelrite^R (Initiierungsmedium) verfestigt wurde, enthält· Wach einer zweiwöchigen Kultur bei 27° C in Dunkelheit wird der Kallus,

der sich am Skutellum (Schildchen) entwickelt, vom Fruchtkeim entfernt und auf B5-Medium plattiert (Gamborg, O₈ L₈ u_e a_e, Experimental Cell Research 50, 151 - 158 (I968) , welches 0,5 mg/1 2,4-D enthält und mit 0,24 % Gelrite verfestigt wurdeβ Der Kallus wird alle zwei Wochen auf frisches Medium übertragene Insgesamt acht Yiochen, nachdem die Fruchtkeime auf das Initiierungsmedium übertragen worden sind, wird der Kallusspezialtyp anhand seiner charakteristischen Morphologie identifiziert« Dieser Kallus wird auf demselben Medium weiter subkultivierte Nach einer weiteren Zeitspanne von 2 Moiafcen wird der Kallus auf N6-Medium, das 2 mg/1 2,4-D enthält und mit Gelrite verfestigt wurde, übertragen und serienmäßig subkultiviert„

Beispiel 4I - Herstellung einer Suspensionskultur von Zea Mays, Inzucht-El^ite-Stamm Punk 2717

Der im Beispiel 40 beschriebene Kallus wird insgesamt mindestens sechs Monate sublriLtiviert« Der für die Subkultur gewählte Kallus ist verhältnismäßig nicht-schleimig, körnig und sehr krümelig, so daß er bei der Einbringung in ein flüssiges Medium in kleine, einzelne Zellzusammenballungen getrennt wird» Kulturen, die Zusammenballungen mit großen, gestreckten Zellen enthalten, werden nicht beibehaltene Etwa 500 mg-Aliquote des Spezialkallus von Zea mav_s, Inzucht-Elite-Stamm Funk 2717, werden in 30 ml Nö-Medium gebracht, das 2 mg/1 2,4-D enthält und sich in 125 ml-Delong-Kolben befindete Wach einer Woche Kultur bei 2б° С im Dunkeln auf einer Kreiselschüttelmaschine (130 U/min, 2,5 cm Ausschlag) wird das Medium durch frisches Medium ersetzte Nach einer weiteren Woche werden die Suspensionen erneut auf diese Weise subkultiviert * Gleichzeitig werden

die Kulturen inspiziert, und es werden die zurückbehalten, welche keine große Anzahl von gestreckten Zellen aufweisen« Suspensionskulturen mit Zusammenballungen von großen_s gestreckten Zellen werden beseitigt« Das bevorzugte Gewebe besteht ausuicht zytoplasmischen, sich teilenden Zellzusammenballungen, die eine charakteristisch glattere Oberfläche als der übliche Typ von Zellzusammenballungen hatten«. Die zurückbehaltenen Kulturen wiesen wenigstens 50 % der Zellen auf, die in diesen kleinen Zusammenballungen (fergestellt waren. Das ist die gewünschte Morphologie_e Diese Suspensionen hatten auch eine schnelle Wachstumsrate mit einer Yerdopplungszeit von weniger als einer Woche.» Die Suspensionskulturen werden wöchentlich durch Übertragung von 0,5 ml PGV (gepacktes Zellvolumen : abgesetztes Zellvolumen in einer Pipette) in 25 ml frisches Medium subkultivierte Wach vier bis sechs Wochen Subkultur auf diese. Weise vergrößerten sich die Kulturen je wöchentlicher Subkultur auf das Zwei- bis Dreifache« Kulturen, bei denen mehr als 75 % der Zellen die gewünschte Morphologie aufweisen, werden für die weitere Subkultur zurückbehaltene Die Stämme werden dadurch erhalten_s daß für die Subkultur jeweils der Kolben gewählt wird, dessen Inhalt die beste Morphologie aufweist. In einigen Fällen erfolgt alle zwei Wochen ein periodisches Filtern durch Siebe aus rostfreiem Stahl mit einer Porengröße von 630 „um, um die Dispersion der Kulturen zu vergrößern, das ist aber nicht notwendig.

Beispiel 42 - Herstellung von Protoplasten aus Suspensionskulturen von Zea Mays

Es werden 1 - 1,5 ml PCV der Suspensionskulturseilen, wie sie im Beispiel 4I hergestellt wurden.in 10 - 15 ml eines

filter sterilisier ten Gemischs inkubiert, das aus 4 % Zellulase-RS mit 1 % Rhozyrae in KMC-Salzlösung (8,65 g/l KCl, 16,47 g/l MgCl₂*6H₂O und 12,5 g/l CaCIg.2HgO, 5 g/l MES₅ pH-Wert 5,6) bestellte Die Verdauung erfolgt bei 30° C auf einem langsam schaukelnden Tisch über eine Zeitspanne von drei bis vier Stunden_s Die Herstellung wird unter einem gestürzten Mikroskop auf die Freisetzung von Protoplasten überwacht« Die freigesetzten Protoplasten werden folgendermaßen aufgefangen; Das Präparat wird durch ein 100 jam-Mascheinsieb gefiltert, an das sich ein 50 um-Maschensieb anschließt* Die Protoplasten werden mit einer Menge du KMC-Salzlösung durch die Siebe gewaschen, die gleich dem ursprünglichen Volumen der Enzymlösung ist· In jedes von mehreren Wegwerfzentrifugenröhrchen aus Plaste werden 10 ml des Protoplastpräparats gegeben und 1,5 - 2 ml einer 0,6 M-Sukroselösung (auf einen pH-Wert von 5_S6 mit 0,1 % Morpholinoethansulfonsäure (MES und KOH) gepuffert) unterlegte Das Röhrchen wird bei 60 - 100 χ g 10 Minuten lang zentrifugiert, und die Protoplasten, die an der Grenflache ein Band bilden, werden mit einer Pipette aufgenommen und in ein frisches Röhrchen gegeben« Das Protplastpräparat wird wieder in 10 ml frischer KMC-SaIzlösung zur Suspension gebracht und 5 min bei 60 - 100 χ g zentrifugierte Die obenaufschwimmende Schicht wird entfernt und weggeworfen, und die Protoplasten vorsichtig in dem verbleibenden Tropfen wüer zur Suspension gebracht, worauf allmählich 10 ml einer KMC-Lösung mit 13/14 Stärke zugesetzt wird* TIach einem erneuten Zentrifugieren über fünf Minuten wird die obenaufschwimmende Schicht wieder entfernt, und die Protoplasten werden wieder in einem KMC-Lösung mit Stärke 6/7 zur Suspension gebracht„ Zum Zählen wird ein Aliquot ent-

nommen, die Protoplasten werden wieder durch Zentrifugieren abgesetzt« Die Protoplasten werden wieder zur Suspension gebracht mit einer Konzentration von 10 (zehn MiIl₀) je Milliliter in KM-8p~Medium (Tabelle I) oder in 0,5 M Mannitol, das б шМ MgC 1_? enthält, oder einem anderen Mittel, das für den Einsatz bei der Transformation geeignet ist und in den folgenden Beispielen beschrieben wird» Diese Protoplastsuspension wird für die Transformation eingesetzt und wird so gezüchtet, ѵйе das in den Beispielen 43 und 44 beschrieben wird«

Beispiel 43 - Transformation von Zea Mays-Protoplasten durch Elektroporieren

A„ Alle Schritte mit Ausnahme des Wärmeschocks werden bei Zimmertemperatur (22° - 28° G ausgeführt» Die Protoplasten werden im letzten Schritt von Beispiel 42 in 0,5 M Mannitol zur Suspension gebracht, das 0,1 % MSS und 6 mM MgCIp enthalte Die Resistenz dieser Suspension wird in der Kammer eines Dialog Electroporators (DIA-LOG GmbH, D-4000 Düsseldorf 13j Bundesrepublik Deutschland) gemessen und auf 1-1,2 kOhm unter Einsatz einer 300 mM MgClg-Lösung abgestimmte Die Protoplasten werden durch Eintauchen des Röhrchens, welches die Probe enthält, in ein Wasserbad von 45° C für die Dauer von fünf Minuten wärmegeschockt, anschließend erfolgt die Abkühlung auf Zimmertemperatur auf Eis« Aliquoten von 0,25 ml dieser Suspension werden 4 Ug linearisiertes Plasmid, das ein pflanzenselektierbares Hygromycinre-3istenz-Gen,wie es von Rothstein, S„ J₈ u« a_e, siehe oben, beschrieben wurde, oder schimärische Gen-Konstruktionen nach den Beispielen 19 bis 31 und 20 _ug Kälberthymus-Träger-DNA zugesetzt« Den Protoplasten werden O₉125 ml einer

24 %igen Polyethylenglykollösung (PEG-Lösung, Molekulargewicht 8000) in 0,5 M Mannitol, das 30 шМ MgCl₂ enthält, zugesetzte Das Gemisch wird gut, aber vorsichtig gemischt und 10 min lang inkubiert· Die Probe wird in die Kammer eines Elektroporiergerätes übertragen und die Proben werden in Intervallen von 10 s drei Impulsen bei Anfangsspannungen von 1500, 1800, 2300 oder 2800 Vcm" und einer exponentiellen Abfallzeit von 10 us ausgesetzte

Die Protoplasten werden folgendermaßen kultiviert» Die Proben werden in 6 cm-Petrischalen bei Zimmertemperatur plattiert* Wach 5 bis 15 min werden 3 ml KM-8p-Medium (Tabelle I, oben), das 1,2 % SeaPlaque-Agarose und 1 mg/1 2,4-D enthält, zugesetzte Die Agarose und die Protoplasten werden gut gemischt und man läßt das Medium gelieren_e

Bo Beispiel 43 A wird mit einer oder mehreren der folgenden Modifikationen wiederholt:

(1) Der Widerstand des Protoplastenpräparats wird auf 0,5 bis 0,7 kOhm abgestimmt«

(2) Die verwendete PEG-Lösung ist eine PEG-Lösung mit einem Molekulargewicht von 4000„

(3) Es wird kein PEG oder ein halbes Volumen einer 12 %igen PEG-Lösung zugesetzte

(4) Die Impulse werden in Intervallen von 3 s ausgeführt*

(5) Die Protoplasten werden nach dem Elektroporieren in Schalen, die auf eine auf 16° C gekühlte Platte gebracht wurden, plattiert.

(6) die Protoplasten werden nach dem Elektroporierungsschritt in Rohre gegeben, mit 10 ml KMC-Lösung mit der Stärke 6/7 oder mit W5-Lösung (die aus 380 mg/1 KCl, 18,375 g/l CaCIg.2HgO, 9 g/l NaCl; 9 g/l Glukose, pH-Wert 6,0 besteht) gewaschen, anschließend durch Zentrifugieren bei 60 g für die Dauer von 10 min aufgefangen, in 0,3 ml KM-Medium wieder zur Suspension gebracht und wie in A plattierte

(7) die Kälberthymus-Träger-DEA wird nicht zugesetzt*

Beispiel 44 - Transformation von Zea Mays-Protoplasten

durch Behandlung mit PоIyethy1engIyко1 (PEG)

Α_β Die Protoplasten werden im letzten Schritt von Beispiel 42 in einer 0,5 M Mannitol-Lösung wieder zur Suspension gebracht, die 12 - 30 mM MgCl₂ enthält« Es wird wie im Beispiel 43 beschrieben ein Wärmeschock von 45 C für die Dauer von 5 min gegeben« Die Protoplasten werden in Aliquoten zur Transformation in Zentrifugenröhrchen verteilt, 0,3 ml suspergierte Protoplaste je Röhrchen» In den nächsten 10 Minuten wird folgendes zugesetzt: DUA (wie im Beispiel 43) und PolyethylengSykollösung (PEG-Lösung, Molekulargewicht 600O₅ die 0,1 M Ca(HO₃)₂ und 0,4 M Mannitol enthält; pH-Wert 8-9 mit KOH), um eine Endkonzentration von 20 % PEG zu erreichen» Die Aliquote werden 30 min unter gelegentlichem sanften Schütteln inkuMert, anschließend werden die Protoplaste in Petrischalen (0,3 ml Originalprotoplastsuspension je Schale mit 6 cm Durchmesser) gegeben und so gezüchtet, wie das im Beispiel 43 beschrieben wurde_e

B_e Beispiel 44 A wird wiederholt, und die Protoplaste werden nach 30 min Inkubationszeit in der PEG-Lösung aus Bei-

spiel 44 A gewaschen, wozu in Intervallen von zwei bis drei Minuten fünfmal 0,3 ml W5-Lösung zugesetzt werden« Die Pro« toplastsuspension wird zentrifugiert, die obenaufschwimmende Schicht wird entfernt, und die Protoplaste werden wie im Beispiel 43 A gezüchtet«

C. Die Beispiele 44A und 44 B werden mit der Modifikation wiederholt, daß die Endkonzentration von PEG zwischen 13 % und 25 % liegtо

Beispiel 45 - Regeneration von Kallus aus Protoplasten

Die Platten mit den Protoplasten in Agarose werden ins Dunkle bei 26° C gehalten, lach 14 Tagen haben sich aus den Protoplasten Kolonien gebildet; die Agarose, welche die Kolonien enthält, wird auf die Oberfläche einer Petrischale mit einem Durchmesser von 9 cm gebracht, in der sich 30 ml Иб~ Medium (Tabelle I, oben) befinden, die 2 mg/1 2,4-D, verfestigt mit 0,24 % Gelrite , enthalten« Dieses Medium wird als 2Кб bezeichnet. Der Kallus wird im Dunkeln weiter bei 26° C gezüchtet, und alle zwei Wochen werden Kallusstücke auf frisches, festes 2U6-Mediura subkultiviert,

Beispiel 46 - Auswahl von transformiertem Kallus von Zea Ma у s

Beispiel 45 wird mit der Modifikation wiederholt, daß 100 mg je Liter oder 200 mg/1 Hygromycin B dem 2N6-Medium zugesetzt werden, um nach den transformierten Zellen zu selektieren.

Beispiel 47 - Regeneration von G-etreidepflanzen

A. Kallus wird zur Erhaltung auf 2N6-Medium gebracht und zur

Einleitung der Regeneration auf 0Ш6- (bestehend aus H6-Medium ohne 2,4-D) und N61-Medium (bestehend aus N6-Medium mit 0,25 mg/1 2,4-D und 10 mg/1 Kinetin)» KaTLus, der auf 0H6- und N61 -Medium wächst, viird im Licht gezogen (16 Stun-

den/Tag Licht von 10 - 100 /iEinst ein/m s von weißen Leuchtstofflampen)« Auf Ii61-Medium wachsender Kallus wird nach zwei Wochen auf ОІТб-Medium übertragen, da eine längere Zeit auf БГ61 -Medium schädlich ist* Der Kallus wird alle zwei Wochen subkultiviert, selbst wenn der Kallus auf dieselbe Mediumrezeptur gebracht werden muß_e Nach etwa vier bis acht Wochen erscheinen Pflänzchen« Sobald die Pflänzchen mindestens 2 cm hoch sind, werden sie auf ОНб-Medium in GA7-Behältern gebrachte In zwei bis vier Wochen bilden sich Wurzeln, und wenn die Wurzeln gut ausgebildet erscheinen, um das Wachstum zu fördern, werden die Pflänzchen in Boden in Torftöpfen mit Lichtschattierung während der ersten vier bis sieben Tage gebracht« Oft ist es nützlich, für zwei bis drei Tage durchsichtige Plastekappen über die Transplantate zu stülpen, um deren Abhärtung zu unterstützen» Sobald sich die Pflanzen stabilisiert haben, werden sie wie normale Getreidepflanzen behandelt und bis zur Reife im Gewächshaus gezogen» Um Nachkommenschaft zu erreichen, werden die Pflanzen eigenbestäubt oder mit dem Wildtyp gekreuzt«

B„ Beispiel 47A wird mit der Modifikation wiederholt, daß 100 mg/1 oder 200 mg/1 Hygromycin B dem Medium zugesetzt werden, das für die Erhaltung des Kallus verwendet wird*

Beispiel 48 - Herstellung von embryogenen Suspensionen von Gewebe von Dactylis Glomerata L«_ (Orchardgras)

A_a Embryogener Kallus wird aus Basalschnitten der jüngsten Blätter von im Gewächshaus gezogenen Orchardgraspflanzen

(Dactylis glomerata L_e) initiiert_s wie das von Harming, G„ Ε_β u, a_e, Theor« Арр1_в Genet_e бЗ, 155 - 159 (1982), beschrieben wurde,, Die Blätter wurden durch Eintauchen in eine 1 : 10-V er dünnung einer Clorojc-Lösung (5_?25 % Natriumhypochlorit; The Clorox Company, Oakland, Ca.) für die Dauer von etwa 10 min oberflächensterilisiert und dann aseptisch in kleine Segmente von 1 bis 5 mm Länge oder Durchmesser geschnittene Diese Segmente werden auf steriles SH-30-Medium plattiert, das 0,8 % Agarose als Gelierungsmittel enthält«, Innerhalb von 2 bis 6 Wochen nach dem Plattieren bei einer Kultur bei etwa 25° C erscheinen Kallus und/oder embryogene Strukturen_e Der embryogene Kallus wird durch Subkultivieren auf frisches SH-30-Medium im Abstand von 2 bis 4 Wochen und Kultivieren im Dunkeln bei 25 C erhalten»

B_e Embryogene Suspensionskulturen werden dadurch eingeleitet, daß etwa 0,5 g Frischgewicht an embryogenem Kallus in 50 ml flüssiges Medium gegeben werden, wie es von Gray, D. J* u„ a_e, Plant Cell Tissue Organ Cult« 4, 123 - 133 (1985), beschrieben wurde und das 45 p№ Dicamba und 4 g/l Kaseinhydrolysat enthält« Die Suspensionskulturen werden bei 27 C bei einem Photorhytmus von 16 Stunden Licht (40 ,uE/m s), 8 Stunden Dunkelheit auf einem Kreiselrüttler bei etwa 130 U/min in 125 ml-Delong-Kolben , die mit einer Metallkappe und Parafilm versiegelt sind, gezogen,, !lach etwa vier Wochen können sich die großen Klumpen für die Dauer von etwa 30 s absetzen, und es werden 10 ml-Aliquote des obenaufschwimmenden Mediums, das kleine Zelltrauben enthält, entnommen und auf 50 ml frisches Medium übertragen» Dieses Verfahren wird alle drei bis vier Wochen wiederholt, wobei die erfolgreichsten Kulturen verwendet werden, die anhand der kleineren Klumpengröße und der besseren Qualität auf der

Grundlage des Vorhandenseins kleiner, zytoplasmischer Zellen beurteilt werden« Nach 5 bis 8 Übertragungen sind die Suspensionen im wesentlichen von nichtembryogenen Zellen frei und die Mehrzahl der embryogenen Zelltrauben ziemlich klein (150 bis 2000 /im) _β

Beispiel 49 - Isolierung und Reinigung von Dactvlis Glomerate L.-Protoplasten

Protoplaste werden aus den embryogenen Suspensionskulturen des Beispiels 48 hergestellt durch aseptisches Filtern der

"p

Zellen auf einer Nalgene' -Gütereinheit von 0,2 дт und anschließende Zugabe von 0,5 g Frischgewicht an Zellen zu jeweils 12,5 ml des Protoplastenenzymgemischs in einer Petrischale_e Das Enzymgemisch besteht aus 2 % Cellulase RS, 7 mM CaCl₂ χ H₂O, 0,7 mM HaH₃PO₄ σ H₂O, 3 mM MES (pH-Wert 5,6), Glukose (550 mOs/taj H₂O mit pH-Wert 5,6) und ist filtersterilisierte Das Gemisch wird auf einem Orbitalrüttler mit etwa 50 U/min in Dämmerlicht (^ 5 μΕ/vPa) für die Dauer von 4 bis 5 Stunden verwirbelt_β Dann wird das Verdauungsprodukt durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl (Maschengröße 100 um) gesiebt und in 12 ml-Zentrifugenröhrchen verteilt, die etwa 5 min lang bei etwa 60 bis 100 g zentrifugiert werden_a Das protoplasthaltige Sediment wird dann dreimal mit Protoplastkulturmedium KM-8p gewaschen, das auf 550 raOs/kg H₃O mit Glukose abgestimmt worden war«, An dieser Stelle kann zur weiteren Reinigung der Protoplasten ein Flotationsschritt eingefügt werden· In diesem Fall lagern sich die gewaschenen Protoplaste oben auf 10 ml KM-Sp-Kulturmedium ab, das mit Sukrose auf 700 mOS/kg H₂O abgestimmt worden war_e Uaeh etwa zehnminütigem Zentrifugieren bei 60 - 100 σ g werden die Protoplaste, die an der Grenz-

fläche Bänder bilden, mit einer feinen Pipette aufgefangen* Abschließend werden die Protoplaste wieder in 1 bis 2 ml KM-8p-Kulturmedium zur Suspension gebracht und durch ein rostfreies Stahlsieb (Maschengröße 20 ,um) gesiebt« Die freigesetzten Protoplaste werden aufgefangen und gewaschen und erneut in KM-8p-Medium zur Kultur oder in einem osmotisch abgestimmten Medium, das für die Transformation nach den Beispielen 51 bis 53 geeignet ist, zur Suspension gebrachte

Beispiel 50 - Dactylis Glomerata !«-Protoplastkultur und Wachstum von Kallus

A_e Die gereinigten Protoplaste werden mit einer Dichte von etwa 5 x 10 Protoplaste je Milliliter in KM-ep-Kulturmedium plattiert j das 1,3 % SeaPlaque -Agarose (PMC Corp., Marine Colloids Division, Rockland, Maine, USA) und 30 bis 40 % konditioniertes Medium enthält (hergestellt aus 3 bis 4 Wochen alten embryogenen Dactylis glomerata L·-Suspensionskulturen durch Filtern des Mediums durch einen len NaIgene -Filter von 0,2 um, wobei das Medium durch den Zusatz von Glukose auf 550 mOs/kg H₂O gebracht wird, und erneutes Filtersterilisieren). Die Platten werden dann im Dunkeln bei einer konstanten Temperatur von 28° C aufbewahrt» Nach 10 bis 14 Tagen wird die Agarose in Keile geschnitten und diese in eine "Tröpfchenkultur" gebracht, wie sie von Shillito, R« D_e u_e a«, Plant Cell Reports 2, 244 bis 247 (1983) beschrieben wurde, wozu 20 ml SH-45-Suspensionskulturmedium mit 3 % Sukrose je 3 ml ursprünglicher, in Agarose eingebetteter Kultur verwendet werden. Die Platten werden auf einem Rüttler bei etwa 50 U/min in Licht von

8 uE/m s gerührte Neue Suspensionskulturen bilden sich, wenn die Koloaen aus der Agarose herauswachsen und Zellen

in das flüssige Medium freigesetzt werden. Die resultierenden suspensionskultivierten Zellen werden auf agar-verfest igt es SH-30-Medium plattiert -und Ъеі 25° C im Dunkeln aufbewahrt, bis sich Kallus bildet«

B. Protoplaste werden wie im Beispiel 50 A gezogen, wobei aber das Kulturmedium kein konditioniertes Medium enthalte

Beispiel 51 - Transformation von Dactylis Glomerata L_e-Protoplasten durch Elektroporieren

A₉ Sofort nach dem Reinigen der Protoplaste wird die Elektroporierung nach Shillito, R· D* u_e a., Bio/Technology 3₅ 1099 - 1103 (1985), unter Verwendung des linearisierten Plasmids durchgeführt, wie das im Beispiel 20 beschrieben wurde« Nach dem letzten Waschen werden die Protoplaste mit einer Dichte von etwa 7 χ 10 Protoplaste je Milliliter im Elektroporierungspuffer (0,4 M Mannitol, 6 mM MgCl₂) wieder zur Suspension gebracht« Die Protoplaste werden in Aliquoten von 0,7 ml in 10 ml-Plastezentrifugenröhrchen gegebene Plasmid-DNA aus Beispiel 20 und schallbehandelte Kälber» thymus-DHA (Sigma) werden den Röhrchen zugesetzt, um eine Endkonzentration von 10 ,.ug/ml bzw. 50 jug/ml zu erreichen* Dann werden 0,38 ml Polyethylenglykollo'sung (PEG-Lösung) (24 % PEG, Molekulargewicht 6000, in 0,4 M Mannitol, 30 mM MgCIp, 0,1 % MES, pH-\7ert 5,6) zugesefet, und die Lösung wird vorsichtig gemischt« Die Protoplastsuspension wird in die Kammer eines Dialog -Elektroporiergeräts gegeben, und in Intervallen von 30 s werden 10 Impulse mit einer Anfangsspannung von 325О V/cm und einer exponentieilen Abfallkonstante von 10 jjis angelegt« Die Probe wird der Kammer entnommen und in eine Petrischale mit 10 cm Durchmesser gegeben*

Es werden 10 ml KM-8p-Medium zugesetzt, das 1,2 % SeaPlaque¹ Agarose enthält, die Protoplaste werden gleichmäßig im Medium verteilt, und man läßt die Agarose gelieren«

Б. Beispiel 51 A wird mit der Ausnahme wiederholt, daß die angelegte Anfangsspannung 3500 V/cm, 4000 V/cm, 5000 V/cm, 3000 V/cm oder 2500 V/cm beträgt«

C* Die Beispiele 51 Aund B werden mit der Ausnahme wiederholt j daß PEG mit einem Molekulargewicht von 4000 bzw«, von 8000 verwendet wird«

D„ Die Beispiele 51 A bis C werden mit der Ausnahme wiederholt, daß die PSG-Endkonzentration zwischen 10 % und 30 % liegte

Beispiel 52 - Transformation von Dactvlis Glotnerata L*-Protoplasten durch Behandlung mit Polyethylenglykol (PEG)

Α_β Der PEG-vermittelte direkte Gen-Transfert wird nach Megrutiu I. u* a., siehe oben, durchgeführt» Als DNA wird der im Beispiel 20 beschriebene linearisierte Plasmid verwendet

Die Protoplaste werden nach dem letzten Waschen mit einer Dichte von etwa 2 σ 10 je Milliliter in 0,5 M Mannitol, das 15 mM MgGl₂ enthält, zur Suspension gebracht« Die Protoplastsuspension wird in Form von 1 ml-Aliquoten in 10 ml-Plastezentrifugalröhrchen verteilte Die DNA wird wie oben im Beispiel 51 zugesetzt, anschließend wird die PEG-Lösung in einer Menge von 0,5 ml (40 % PEG, Molekulargewicht 4000, in 0,4 M Mannitol, 0,1 M Ca(NOO₂, pH-Wert 7,0) zugesetzt

Die Lösungen werden vorsichtig gemischt und 30 min bei Zimmertemperatur (etwa 24° C) unter gelegentlichem Schütteln inkubierte Dann werden 1,4 ml der Waschlösung zugesetzt, und der Inhalt des Rohres wird vorsichtig gemischte Die Waschlösung besteht aus 87 mM Mannitol, 115 mM CaCl₂₅ 27 ml MgCl₂J 39 mM KCl, 7 mM Tris-HCl und 1,7 g/l Myoinositol, pH-Wert 9jO_e In Intervallen von 4 Minuten werden weitere vier Aliquote zu 1,4 nil der Waschlösung zugesetzt, wobei nach jeder Zugabe gemischt wird» Dann wird das Rohr bei etwa 60 χ g zehn Minuten zentrifugiert, und die obenaufschwimmende Schicht wird weggeworfen« Die sediraentierten Protoplaste werden in 1 ml KM-8p-Medium gegeben und in eine Petrischale mit 10 cm Durchmesser gebrachte Es werden 10 ml von KM-8p-Medium, das 1,2 % SeaPlaque -Agarose enthält, zugesetzt» Die Protoplaste werden gleichmäßig im Medium verteilt, und man läßt die Agarose gelieren*

B_e Beispiel 52 A wird mit einer oder mehreren der folgenden Modifikationen ?;iederholt :

(1) Der pH-Wert der Waschlösung wird auf 5,6 oder 7,0 abgestimmte

(2) Verwendet wird PSG mit einem Molekulargewicht von 6000, 2000 oder 8000«

(3) Das Waschmedium besteht aus 154 mM NaCl₉ 125 mM ₂ 5 mM KCl, 5 mM Glukose, pH-Wert mit KOH auf 6,0 abgestimmt, aus 0,2 M CaCl₂, 0,1 % MES, pH-Wert mit KOH auf 6,0 abgestimmt, oder aus 0,2 M CaCl₂, 7 mM Tris/HCl, pH-Wert rait KOH auf 9,0 abgestimmt»

Beispiel 53 - Transformation von Dactylis Glomerata L*-Protoplast en durch Elektroporieren oder PEG-Behandlung;

Die Transformation wird wie im Beispiel 51 oder 52 ausgeführt, wobei aber die Protoplasten vor der Verteilung der Aliquote in Röhrchen zur Transformation oder nach der Verteilung der Aliquote und vor dem Zusatz von PEG etwa fünf Minuten lang bei 45° C behandelt werden.

Beispiel 54 - Selektion von transformierten Kolonien

A_e Die Kulturplatten (Petrischalen) mit den Protoplasten aus den Beispielen 51 bis 53 werden 10 Tage lang im Dunkeln bei etwa 25° C inkubiert und dann in 5 gleiche Scheiben zur "Tröpfchenkultur" (Shillito, R. D. u. a., Plant Cell Reports 2, 244 - 247 (1983)) geschnitten* Vier der Scheiben werden jeweils in 20 ml SH-45-Kulturmedium mit 4 g/l Kaseinhydrolysat und 20 pg/ml Hygromyein B gegeben« Die fünfte Scheibe wird in 20 ml des gleichen Mediums, aber ohne Zusatz von Hygromyein B, als nichtselektierte Kontrolle gegeben« Hach 4 bis 5 Wochen werden die mutmaßlichen transformiertenj protoplastabgeleiteten Zellkolonien, die om Hygromyein B wachsen, aus der Agarose herausgeschnitten und in eine Petrischale von 19 mm Durchmesser mit 2 ml flüssigem SH-45-Medium gegeben, das 20 ug/ml Hygromyein B enthält, und auf einem Orbitalrüttler bei etwa 50 U/min gerührt« Nach weiteren vier bis fünf Wochen werden alle Kolonien, die bis zur Bildung neuer Suspensionen gewachsen sind, in 125 ml-Erlenmeyerkolben gegeben und auf gleiche Wjfese wie die Suspensionsgrundkultur gezogen, mit der Ausnahme, daß in das Medium 20^ug/ml Hygromyein B einbezogen werden_β

Die neuen Suspensionen werden alle ein bis drei Wochen unter Einsatz von SH-45-Medium subkultiviert, das 4 g/l Kaseinhydrolysat und 20 jig/ml Hygromycin B enthält« Zellen von diesen Suspensionen werden auGh auf verfestigtes SH-30-Medium plattiert, das 20 Mg/ml Hygroraycin B enthält, und bei etwa 25° C im Dunkeln inkubiert« Das aus den plattierten Zellen gewachsene Kallus wird alle zwei Wochen auf frisches Medium plattierte Die Zellen, die bei Vorhandensein von Hygromycin B wachsen, sind vermutlich Transformanten«

B₈ Die Selektion erfolgt wie im Beispiel 54 A, mit der Ausnahme, daß die protoplastabgeleiteten Zellkolonien, die in hygromycin-B-haligem Medium -wachsen, auf Agar-Platten des SH-30-Mediums gebracht werden, das 20 μ2/Ίη1 Hygromycin B enthält, und bei 25° C im Dunkeln inkubiert werden»

Beispiel 55 - Regeneration von transformierten Dactylis Crlomerata L»-Pflanzen

A·· Dactylis glomerata L₈-Kallus (der wie im Beispiel 54 gewonnen wurde), abgeleitet von Protoplasten, wi£d auf verfestigtem SH-30-Medium gezogen und alle zwei Wochen subkultiviert» Alle sich bildenden Fruchtkeime werden entfernt und auf Keimungsmedium (SH-O) plattiert und ans Licht (45 bis 55 yUE/m s) gebrachte Die Keimung dieser Fruchtkeime erfolgt in 1 bis 4 Wochen, und die resultierenden Pflänzchen werden auf SH-O-Medium im Licht gegeben, um Wurzelsysteme auszubilden,. Im Stadium von sechs bis zwölf Blättern werden sie ins Gewächshaus gebracht und allmählich abgehärtete

B. Kallus (der wie im Beispiel 54 gewonnen wurde), abgeleitet von Protoplaatan, wird auf SH-O-Medium gezogen₃ das mit

R 0,24 % Gelrite verfestigt wurde, die Lichtmenge betagt 45 bis 55 juE/m s, und alle zwei Wochen subkultiviert. Die resultierenden PflänzcJien werden auf einem 1 : 1-Gemisch, von SH-O- und OMS-Medium, verfestigt mit einer Kombination von 0,12 % GeIrite und o,4 % Agar, in Licht gezogen, um Wurzelsysteme zu entwickeln* Im Stadium von sechs bis zwölf Blättern werden sie ins Gewächshaus gebracht und allmählich abgehärtet»

G. Man erhält kleine Pflänzchen, wie das oben in 44 A und 44 B beschrieben wurde, und diese werden auf OMS-Medium, das mit 0,8 % Agar verfestigt wurde, in Licht gegeben, um Wurzelsysteme zu bilden« Im Stadium von sechs bis zwölf Blättern werden sie ins Gewächshaus gebracht und allmählich abgehärtete

De Man erhält kleine Pflänzchen₃ wie das oben in 44 A beschrieben wurde, und diese werden auf eine 1 ; 1-Mischung von SH-O- und OMS-Mediumj die mit einer Kombination von 0,12 % GelRite^R und 0,4 % Agar verfestigt wurde, in Licht gegeben, um Wurzelsysteme zu bilden« Im Stadium von sechs bis zwölf Blättern werden sie ins Gewäschshaus gebracht und allmählich abgehärtete

6. Transiente Gen-Expression

In den folgenden Beispielen wird beschrieben, wie die schimärischen Gene eingeführt und genutzt werden können, ohne daß das Gen notwendigerweise stabil in den Genom der Pflanze einbezogen wird_e

Beispiel 56 - Einführung von DNA in Protoplasten von N_e tabacum durch. Behandlung mit PEG

Α_β Die Herstellung von Protoplasten von N_2- taЪacum kann nach den Methoden erfolgen, die in den nachstehenden Publikationen genannt werden: Paszkowski, J_e u. a», EMBO J₀ 3, 2717 (1984); GB-PS 2 159 173; Europäische Patentanmeldung EP 0 129 668; Shillito, R₈ D„ und Potrykus, I. in "Methods in Enzymology" (Methoden in der Enzymologie), Hsg* Wu, R_e und Grossman, L., Acadmic Press, Orlando, Florida, Bd_e 153_S bis 306 (1987), oder nach anderen, in Fachkreisen bekannten Methoden* Die genannten Publikationen werden als Verweis einbezogene

Ba DlJA wird in Protoplasten durch eine Modifikation der Methode von Negrutiu, I_e u„ a_e, Plant Mol«, Biol· 8, 363 (1987), eingeführte Die Protoplaste, die nach Beispiel 56 A hergestellt wurden, werden nach dem letzten Waschvorgang in einer Lösung wieder zur Suspension gebracht, die aus 0,4 M Mannitol, 15 - 30 mM CaCl₉, 0,1 % MES besteht, die Dichte beträgt

1,6 - 2 χ 10 je Milliliter» Die Protoplastsuspension wird in Form von 0,5 ml-Aliquoten auf 10 ml-Plastezentrifugenröhrchen verteilt« Die DNA aus den Beispielen 19 bis 31 wird in 10 μΐ sterilem, destillierten Wasser zugesetzt, nach Paszkowski, J* u_e a., EMBO «J_e 3, 2727 (1984) sterilisiert, und anschließend werden 0,5 ml der PEG-Lösung (40 % PEG, Molekulargewicht 8000 in 0,4 M Mannitol, 0,1 M Ca(NOn)₂, pH-Wert 7,0) zugesetzt» Die Lösungen werden vorsichtig gemischt und 30 min bei Zimmertemperatur (etwa 24° C) inkubiert, dabei wird gelegentlich geschüttelte Dann werden 1 ml der Waschlösung zugesetzt und der Inhalt des Rohres sanit gemischt« Die Waschlösung besteht aus 154 mM NaCl, 125 mM

CaGl₂, 5 mM KCl₅ 5 тМ Glukose, pH-Wert шіѣ KOH auf 6,0 abgestimmt« Nacheinander werden in Intervallen von 5 Minuten weitere Aliquote von 2 ml, 3 ml und 4 ml der Wasohlösung zugesetzt und nach jedem Zusatz gemischt« Dann wird das Rohr Ъеі etwa 10 - 100 χ g etwa 10 min zentrifugiert, und die obenauf schwimmende Schicht wird weggegossen,, Die pelletierten Protoplaste werden in eine ausreichende Menge КЗ-Kulturmedium mit 0,3 M Glukose als Osmotikum und ohne Sukrose gebracht, um eine abschließende Dichte von 100 000 je Milliliter zu erreichen, und in einer Petrischale von 10 cm kultiviert«,

C. Beispiel 56 B wird mit einer oder mehreren der folgenden Modifikationen wiederholt:

(1) Der pH-Wert der Waschlösung wird auf 5_S6 oder 7_}0 abgestimmte

(2) Verwendet wird eine PEG mit einem Molekulargewicht von 4000.

(3) Das Waschmedium besteht aus 0,2 M CaCl₂, 0,1 % MES, mit KOH auf einen pH-Wert von 6,0 abgestimmt, oder aus 0,2 M CaCl₂, 7 mM Tris/HCl, mit KOH auf einen pH-Wert von 9,0 abgestimmt«

(4) Zusammen mit der Plasmid-DITA werden 50 μβ gescherte Kälberthymus-DITA in 25 ul sterilem V/asser zugesetzt«

(5) Die Plasmid-DITA wird vor dem Einsatz durch Behandlung mit einem geeigneten Restriktionsenzyra (a* B, BamHI) Iinearisierte

Beispiel 57 - Einführung von DUA in Protoplaste von He_- tabacum durch Elektroporieren

A₈ Die Einführung von DNA in Protoplaste von N^ frabacum erfolgt durch Behandlung der Protoplasten mit einem elektrisehen Impuls bei Vorhandensein der geeigneten DEA. in einer Modifikation der Methoden von Fromm, M. E_e, in: Methods in Enzymology (Methoden in der Enzymologie), Hsg* Wu, R₉ und Grossman, L„, Academic Press, Orlando, Florida, Bd* 153» 307 (1987); und Shillito, R_e D_e und Potrykus, L,, ebenda, S_e 283 - 3O6_e

Die Protoplaste werden wie im Beispiel 56 A isoliert. Nach dem letzten Waschen werden die Protoplaste in folgender Lösung erneut zur Suspension gebracht: 0,2 M Mannitol, 0₉1 % MES, 72 шМ Had, 70 mM GaCl₃₉ 2,5 шМ KCl, 2,5 тМ Glukose, mit KOH auf einen pH-Wert von 5,8 abgestimmt, bei einer Dichte von 1,6 - 2 χ 10 je Milliliter» Die Protoplastsuspension wird in Aliquoten von 1 ml in Wegwerfküvetten aus Plaste gegeben, und es werden 10 ,ug DlA zugesetzt, wie das in den Beispielen 56 B und C beschrieben wird_e Der Widerstand der Lösung beträgt zu diesem Punkt bei der Messung zwischen den Elektroden des 471-Elektrodensatzes des Elektroporationsgerätes, das unten beschrieben wird, etwa 6 0hm„

Die DHA der Beispiele 19 bis 31 wird in 10 jul sterilem, destillierten Wasser zugesetzt und sterilisiert, wie das von Paszkowski, J. u. a«, EMBO J„ 3,2717 (1984) beschrieben wurde. Die Lösung wird vorsichtig gemischt und dann bei Zimmertemperatur (24° - 28° C) einem Impuls von 400 V/cm bei einer exponenteillen Abfallkonstante von 10 ms von einem BTX-Transfector 300-Elektroporationsgerät unter Einsatz des 471-Elektrodensatzes ausgesetzt» Man läßt die Protoplaste

5 min ungestört, dann werden sie in eine Petrischale gegeben und КЗ-Medium т/іе im Beispiel 56 A zugesetzt, um die Dichte der Protoplaste auf 100 000 je Milliliter zu bringen«

B. Beispiel 57 A wird mit einer oder mehreren der folgenden Modifikationen wiederholt:

(1) Die verwendete Spannung beträgt 200 V/cm oder legt zwischen 100 V/cm und 800 V/cm.

(2) Die exponent!eile Abfallkonstante beträgt 5 ms, 15 ms oder 20 ms*

(3) Zusammen mit der Plasraid-ША werden 50 ug gescherte Kälberthymus-DITA in 25 ДІ sterilem Wasser zugesetzt.

(4) Die Plasmid-DNA wird vor dem Einsatz durch Behandlung mit einem geeigneten Restriktionsenzym (z„ B, BamHI) linearisiert«,

Beispiel 58 - Einführung von DNA in Protoplaste von Zea Ma^s-Stamm 2717

Protoplaste der Mais-Zuchtlinie Punk 2717 werden wie oben in den Beispielen 40 bis 47 hergestellt und in einer der Lösungen zur Suspension gebracht, die oben'für das erneute Suspergieren der Έ. tabaсum-Protoplaste in den Beispie-

len 56 und 57 beschrieben wurden, die Dichte beträgt 10 je Milliliter» Die Transformation erfolgt im wesentlichen wie in den Beispielen 56 und 57* Die Protoplaste werden nach der Transformation bei einer Dichte von 2 χ 10° je ml in KM-8p-Medium ohne den Zusatz eines Verfestigungsmittels₃ aber mit 1 mg/1 2,4-D kultivierte

Beispiel 59 - Einführung von DNA in Protoplasten von Sorghum Bicolor

Proirplaste der Sorghumsuspension PS 562 werden im wesentlichen so hergestellt_s wie das oben im Beispiel 40 für Zea mays beschrieben wurde, und in einer der Lösungen erneut zur Suspension gebracht, die für die Resuspension von N« tabacum-Protoplasten in den Beispielen 56 und 57 beschrie« ben wurden,, dabei beträgt die Dichte 10 je ml« Die Transformation erfolgt im wesentlichen wie im Beispiel 58_e lach der Transformation werden die Protoplaste mit einer Dichte von 2 χ 10 je ml in KM-8p-Medium ohne den Zusatz eines Verfestigungsmittels kultiviert*

Beispiel 60 - Einführung von Шк in Protoplasten von Nicotiana Plumbaginifolia, Petunia. Hybrida und Lolium Multiflorum

Protoplaste von IT₉ plumbaginifolia, P^ hybrida oder L₁ multiflorum werden so hergestellt, wie das von Shillito und Potrykus, siehe oben, beschrieben wurde, und wie in den Beispielen 56 und 57 behandelt«. Sie werden in dem von Shillito und Potrykus, siehe oben, beschriebenen Medium ohne den Zusatz von Agarose oder einem anderen Gelierungsmittel gezogen«

Beispiel 61 - Einführung von DNA in Protoplasten von Glycine Max.

Protoplaste von Glycine max werden nach den Methoden hergestellt, die von Tricoli, D₀ M_a u« a», Plant Cell Reports, 5, 334 - 337 (1986), oder von Chowchury, Y* K. und Widholm, Jo M., Plant Cell Reports, 4, 289 - 292 (19-35),oder Klein,

A, S* u_e a*₉ Ріапѣа 152, 105 - 114 (1981) beschrieben wurden« DNA wird in diese Protoplaste im wesentlichen so eingeführt, wie das in den Beispielen 56 und 57 beschrieben wurde. Die Protoplaste werden gezüchtet, wie das von Klein, A. S« u* a», siehe oben, Chowhury, V₉ K. und Widholm, J» M, siehe oben, oder Tricoli, D. M. u. a., siehe oben, beschrieben wurde, wobei kein Alginat zum Verfestigen des Mediums zugesetzt wurde«,

Ί» Chemische Regulierung; von transgenem Pflanzengewebe

In den folgenden Beispielen werden Verfahren für die chemische Regulierung von chemisch regulierbaren Genen in repräsentativen transgenen Pflanzengeweben beschriebene Die folgenden Beispiele sind zwar auf die Induzierung gerichtet, ähnliche Verfahren wären aber auch bei durch Repression wirksamen Systemen anwendbare

Für die Behandlung von transgenen Zellen mit einem chemischen Regler steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung, Beispielsweise können Zellen in einem flüssigen Medium suspergiert werden, das den Regler enthält» Kallus kann auf Medium gezogen oder transferiert werden, das den Regler enthält, oder der Regler kann mit einer sterilen Farbbürste oder einer anderen geeigneten Vorrichtung auf den Kallus aufgebracht werden« Sbenso werden Pflanzen oder Pflanzenteile mit einer Lösung oder Suspension des Reglers mit einer Farbbürste oder einem geeigneten Element behandelt.

Die Expression des phänotypischen Merkmals in transgenen Pflanzen, die ein chemisch regulierbares schimärisches Gen enthalten, ist der Menge des Reglers proportional, die auf die Pflanze oder das Pflanzengewebe aufgebracht wird«

Beispiel 62 - Chemische Induzierung in transgenen Kalluskulturen

A. Kallus, der nach den oben beschriebenen Verfahren gewonnen wurde, wird durch Aufbringung einer filtersterilisierten Lösung von. 0,1 bis 50 mSl Salizylsäure, die durch den Zusatz von HaOH auf einen pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0 gebracht worden war, mit einer sterilen Pflanzenbürste oder Farbbürste auf chemische Induzierung überprüft»

Nach der Induzierung läßt man den Kallus zwei Tage inkubieren, anschließend wird er geerntet, in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -80° G aufbewahrt, bis er zur Gen-Induzierungsuntersuchung verwendet wird, wie das im Beispiel 65 und/oder 66 beschrieben wird«

B_e Als Alternative werden für die Induzierung folgende Lösungen verwendet:

(1) 0,1 bis 50 mM Benzoesäure, die durch den Zusatz von UaOH auf einen pH-Wert zwischen 6₅O und 8,0 gebracht wurde.

(2) O₈1 bis 50 mM Polyakrylsäure, die durch den Zusatz von NaOH auf einen pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0 gebracht wurde«

(3) Me.tbylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7-karbojcylato Die Lösung wird durch Resuspension eines benetzbaren Pulvers, welches die Chemikalie enthält, über mehrere Minuten in sterilem Wasser bei einer Konzentration von 1 mg/ml hergestellt» Durch Filtersterilisieren werden unlösliche Feststoffe aus der Lösung entfernt.

(4) 0,1 bis 50 ml Beso-1,2,3-thiadiasol-T-karDonsäure, pH-

V7ert zwischen 6,0 und 8,0» Die Verbindung wird in einer Minimalmenge Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgelöst, dann bis zur gewünschten Konzentration mit sterilem Wasser verdünnte Die gewonnene Suspension wird ohne Filtern eingesetzte

(5) 0,1 bis 50 mM n-Propylbenzo-1,2,3-tb.iadxazol-7-karbo£ylat, hergestellt wie unter (4)*

(6) 0,1 bis 50 mM Benzylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7-karboxylat, hergestellt wie unter (4)«

(7) 0,1 bis 50 mM Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-karbonsäure-K-secbutylhydrazid, hergestellt wie unter (4).

(8) 0,1 bis 50 mU 2,6-Dichloroisonikotinsäure, pH-Tiert zwischen 6,0 und 8,0, hergestellt wie unter (4)*

(9) 0,1 bis 50 mM Methyl-2,6-dichloroisonikotinat, hergestellt wie unter (4)»

Beispiel 63 - Chemische Induzierung: von transgenen Pflanzen

A.. Die Genexpression wird in Pflanzen, die nach den oben beschriebenen Verfahren gewonnen wurden, durch Aufbringung eines feinen Sprühnebels einer Lösung von 0,1 bis 50 mf.1 Salizylsäure, die mit NaOH auf einen pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0 gebracht wurde, auf die Blätter mit einem Pflanzenbestäubungsgerät induziert«

Man läßt die Pflanzen zwei Tage weiterv/ahsen, dann werden sie geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 C aufbewahrt j bis sie wie im Beispiel 65 und/oder 66 untersucht und bestimmt

B₈ Als Alternative werden folgende Fösungen für die Induzierung verwendet:

(1) 0,1 bis 50 mM Benzoesäurej die durch den Zusatz von HaOH' auf einen pH-Viert von 6,0 bis 8,0 abgestimmt wurde«,

(2) 0,1 bis 50 mM Polyacrylsäure, die durch den Zusatz von NaOH auf einen pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0 abgestimmt wurde.

(3) Methylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7~karboxylat_e Die Lösung wird durch Resuspension eines benetzbaren Pulvers, das die Chemikalie enthält, für mehrere Minuten in sterilem Wasser bei einer Konzentration von 1 mg/ml hergestellt* Durch Filtersterilisation v/erden unlösliche Feststoffe aus der Lösung entfernte

(4) 0,1 bis 50 mM Benzo-1,2,3-thiadiazol-T-karbonsäure, pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0* Die Verbindung wird in einer Minimalmenge Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgelöst und anschließend mit sterilem Wasser auf die gewünschte Konzentration verdünnte Die gewonnene Suspension wird ohne Filtern eingesetzt.

(5) 0,1 bis 50 mM n-Propylbenzo-1,2,3~thiadiazol-7-karboxy~ Iat, hergestellt wie unter (4)«

(6) 0,1 bis 50 mM Benzylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7-karbozylat, hergestellt wie unter (4)«

(7) 0,1 bis 50 mM Benzo-1 ,гзЗ ,;, hergestellt wie unter (4)«

(8) Oj1 bis 50 ml 2,6-Dichloroisonikotinsäure, pH-Wert zwischen 6,0 und 8_?0, hergestellt wie unter (4)*

(9) 0,1 bis 50 mM Methyl-2_s6-dichloroisonikotinat, hergestellt wie unter (4)*

Beispiel 64 - Induzierung der Expression der in Protoplaste von H, Tabacum«, Zea Mays, ΪΤ_β Plumbaginifolia, P« Hybrida, L_e Multiflorum und Sorghum Bicolor eingeführten DlTA

Die Protoplaste, die nach den Beispielen 56 bis 61 behandelt wurden_s werden bei 26° C im Dunkeln 2 Tage lang kultiviert. Danach wird Salizylsäure bis zu einer Konzentration zwischen 0,1 und 50 mM als neutralisierte Lösung, pH-Wert zwischen 6,0 und 8jO, zugesetzt« Die Protoplaste werden v/eitere 2 Tage kultiviert, durch Zentrifugieren geerntet, schnell gefrostet und wie in den folgenden Beispielen beschrieben untersucht,

3_e Als Alternative dazu werden den Protoplasten folgende neutralisierte Lösungen oder Suspensionen zugesetzt, um eine Endkonzentration zwischen 0,1 und 50 mM zu erreichen;

(1) Benzoesäure

(2) Polyacrylsäure

(3) Methylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7-karboxylat

(4) Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-karboxylat

(5) n-Propyl-benzo-1,2,3-thMiazol-7~karbosylat

(6) Benzylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7-karboxylat

(7) Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-karbonsäure-iJ-secbutylhydrasid

(8) 2,6-Dichloroisonikotinsäure

(9) Llet;hyl-2,6-dichloroisonikotinat

C. Als Alternative wird die Induzierung so ausgeführt, wie das in den Beispielen 64 A und B beschrieben wurde, mit der Ausnahmej daß die Protoplaste einen Tag, drei oder fünf Tage vor der Induzierung gezogen werden*

D. Die Induzierung wird wie in den Beispielen 64 A, B oder C ausgeführt, mit der Ausnahme, daß die Protoplaste einen Tag, drei oder fünf Tage nach der Induzierung und vor dem Ernten kultiviert werden.

Beispiel 65 - Untersuchung auf eine chemisch induzierbare DNA-Folge: mKWA-Produktion

Pflanzenmaterial, das wie in den Beispielen 62 bis 64 induziert und geerntet wurde, wird auf Induzierung der mRHA-Spezies durch Isolierung der EWA und Starterextensionsuntersuchung, wie das im Beispiel 5 beschrieben wurde, untersucht»

Kallus oder regeneriertes Pflanzenmaterial, das von transgenen Pflanzen abgeleitet wurde, die chemisch regulierbare schimärische Gene mit der Codierung für GUS, AHAS oder BT enthalten und durch Salizylsäure, Methylbenzo-1,2_s3~benzothiadiazol-7-lcarboxylat, Benzo-1,2,3~thiadiazol-7-karbon~ säure, n-Propylbenzo-1_Э2_s3-thiadiazol-7-karboxylat, Benzyl» benzo-1,2,3-thiadiazol-T-karboxylat, Benzo-1,2,3-thiadia-зоі-7-karbonsäure-Ii-secbutylhydrazid, 2,6-Dichloroisonikotinsäure, Methyl-2₉6-Dichloroisonikotinat oder TMY induziert wurden, weisen einai erhöhten Pegel an mENA bei der Untersuchung mit dem GUS-, AHAS- oder BT-3tarter auf₉ wenn die Startere:ctensionsuntersuchung durchgeführt wird. Der Pegel an mEUA ist der Menge des zugeführten Reglers proportional*

Beispiel 66 - Untersuchung auf chemisch induzierbare DNA-Folgen; ß-Glukuronidaseenzymatische Aktivität

A_e ELISA-Test

Gefrorenes Blattgewebe wird in einem Mörser mit dem Pistill bei Vorhandensein von flüssigem Stickstoff zerstoßen, um ein feines Pulver herzustellen» Es werden Blattextrakte durch Mischen eines gegebenen Gewichts (g) mit einem gleichen Volumen (ml) eines GUS-Extraktionspuffers (50 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0, 0,1 % Triton-X 100, 0,1 % Sarkosyl, 10 mM ß-Merkaptoethanol) hergestellt, wobei die von Jefferson, R„ A., Proc» Natl. Acad. Sei USA 83, 8447 bis 8451 (1986), bossihriebene Methode angewendet wird*

Diese Reaktionen werden in den Vertiefungen von ELISA-Platten durch Mischen von 5 bis 25 p-1 Extrakt mit 120 bis 100 μΐ GUS-Analysepuffer (50 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0, 0,1 % Triton X-100, 10 mM ß-Merkaptoethanol), der 4-Methylumbelliferylglukuronid (MU) bei einer Bndkonzentration von 2 mM in einem Gesamtvolumen von 125 jul enthält, ausgeführt. Die Platte wird bei 37° C 1 bis 5 Stunden inkubiert, und die Reaktion wird durch den Zusatz von 150 ,ul 3 M Na₂CO^ gestoppt« Die Konzentration des freigesetzten fluoreszierenden Indikators wird durch Ablesen der Platte auf einem ELISA-PIatten-Lesegerät Flow Labs Fluoroskan bestimmt«

B* Ergebnisse

Tabelle II - Spezifische Aktivität, nKat MU/mg Protein

Pfl_e ^a A B C D E^b

H 1 5,39 -1,9 13,9 ±1,2 13,5 ±0,8 20,1 ±5,1 33,6 ±2,6

H 3 0,21 ±o,o2 6,92±0,88 11,95±O,85 1,66±O,O2 6,54±1,43

H 4 8,39 ±0,04 27,5 ±0,7 18,52±1,07 2,28±0,78 25,1 ±0,9 H 6 0,10 ±0,04 4,08±0,58 2,58±0,01 O,O9±O,O6 2,8 ±1,2

H 9 0,23 10,8 9,1 0,5 7,5

Alu 1 5,6 20,0 206,9 20,5 70,5

Alu 2 2,0 6,6 83,2 8,9 155,3

Alu 3 0,1 ±0,07 2,8 ±0,9 2,0 ±O₈9 2,0 ± 0,5 5,8 ±3,8

Alu 4 2,1 ±1 43,0 ±19 7,1 ±2,6 6,1 ±3,2 7,5 ±3,5

Alu 5 0,6 ±0,2 4,4 ±2,3 1,2 ±0,6 0,5 ±0,3 8,3 ±3,7

Alu 6 0,8 28,8 67,0 3,1 36,4

Alu 7 1,7 38,7 29,1 21,7 63,0

Alu 8 0,6 0,4 0,4 0,6 0,2

Alu 9 0,9 0,6 0,4 0,3 nd

Alu 10 4,0 39,2 52,0 8,1 37,9

Alu 11 1,6 ±0,8 1,9 ±0,9 2,8 ±1,3 2,2 ±2,6 2,8 ±2_Э9

Alu 12 0,7 ±0,4 57,1 ±22 73,4 2,3 ±1,2 78,0 ±41,4

19,1 13,2 1,9 10,6

1,6 2,6 1,7 3,9

8,8 11,8 0,4 0,8

11,1 11,2 3,0 1,6

8,1 10,8 1,7 0,82

59.4 132,5 36,6 14_s0 30,6 28,9 0,6 29₅O 63,9 129,7 12,5 55,2

70.5 98,2 13,5 94,5 81,8 58,5 3,9 46,0

Alu	13	0,1
Hae	1	0,6
Hae	2	2,3
HAe	3	1,7
Hae	4	2,0
Hae	5	18,1
Hae	8	0,4
Hae	9	2,6
Hae	10	1,6
Hae	11	2,6

Tabelle II, fortgesetzt

PfI₉ ⁸ ABC D E^b

Ha e	12	0,2	2,5	5,8	0,6	14,5
Ha e	13	0,01	0,7	0,1	nd	nd
Ha e	14	0,1	1,8	8,6	0,1	3,3
Ha e	15	0,1	6,4	7,2	3,4	7,4
Ha e	16	0,1	2,3	4,3	0,8	2,7

Fußnoten

a - H 1 - 9 Tabakpflanzen, die durch Transformation von Blatt»

scheiben durch Stamm CIB271 gewonnen wurden Alu 1-13 Tabakpflanzen, die durch Transforamtion von

Blattscheiben durch Stamm CIB272 gewonnen wurden

Hae 1-16 Tabakpflanzen, die durch Transformation von Blattscheinben durch Stamm CIB 273 gewonnen wurden Ь - A - Wasser

B - Salizylsäure

G - Methylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7-karboxylat D - Puffer

E - TMV

Transformierter Tabakkallus (Beispiel 23): Folgende GUS-Aktivitäten erhält man bei Proben von transformiertem Kallus, der 21 Stunden nach der Behandlung geerntet wurde_e Transformiert mit CIB271: HgO-Besprühung: 1,8 nKat MUOmg Protein; Besprühung mit 50 mM Natriumsalizylat: 3,8 nKat MU/mg Protein; transformiert mit CIB271 (anderes Experiment): HgO-Besjiprühung: 2,8 nKat MU/mg Protein; Besprühung mit 250 jag/1 Methylbenzo-1 ,2,3-thiadiazol-7-karbo.xylat·. 13 ₉7 nKat MU/mg Protein,, Transformiert mit CIB273: H₃O-Besprühung: 0,46 nKat Iv¹IU/mg Protein; 250 ug/1 Methylbenzo-1,2 _?3-thiadiazoi-7-karo-

oxylat zum Besprühen: 31,2 nKat MU/mg Protein*

Transformierte Möhren (Beispiel 36): Die folgenden GUS-Aktivitäten erhält man von Kallusproben, die durch pCIB271 transformiert wurden, wobei der Kallus 21 Stunden nach der Behandlung geerntet wurde. H₂O-Besprühung: 5,2 pKat MU/mg Protein* Besprühung mit 50 mM Natriumsalizylat: 11,6 pKat Щ/rag Protein» Besprühung mit 25OyUg/! Methylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7-karboxylat: 22,1 pKat MU/mg Protein,,

Transformierte Tomaten (Beispiel 38): die folgenden GUS-Aktivitäten erhält man von Proben von transformiertem Kallus, der 21 Stunden nach der Behandlung geerntet wurde. Transformiert mit CIB271: Besprühung mit H₂O: 17,2 pKat MU/mg Protein; Besprühung mit 250 p.g/1 Methylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7-karboxylat: 56,1 pKat MU/mg Protein« Transformiert mit CIB273 Σ A4: Besprühung mit H₃O: 4,6 pKat MU/mg Protein* Besprühung mit 250 /ug/1 Methylbenzo-1_s2,3-thiadiazol-7-karboxylat: 22,1 pKat MU/mg Protein«

Transiente Expression in Tabakprotoplasten (Beispiel 56), die mit pCIB269 behandelt wurden: H₂O: 30,6 t 13 pKat MU/mg Protein; Methylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7-karbo:cylat: 66,6 20 pKat MU/mg Protein«,

Beispiel 67 - Untersuchung auf chemische Induzierung des endogenen Gens

Im Kontrollverfahren werden Tabakpflanzen, die wie in den Beispielen 62 bis 64 mit Salizylsäure, Methylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7-karboxylat und TW induziert wurden, auf die Transkription der mRITA vom endogenen PR-1a-Gen durch die im Beispiel 5 beschriebenen Methoden untersucht« Sin er-

höhter Pegel an mEMA wird nach der Induzierung mit allen drei Induzierungsmitteln festgestellt»

Beispiel 68 - Untersuchung auf chemisch induzierbare DDJA-Folgen: Azetohydroxysäuresynthaseenzymaktivität (AHAS-Enzymaktivität)

A. Probenvorbereitung für die AHAS-Untersuchung

Es wird das Gewicht des Blatt- und/oder Wurzelgewebematerials, das untersucht werden soll, bestimmt₉ das Gewebe wird in flüssigen Stickstoff gegeben und zu einem feinen Pulver zerkleinert. Es wird ein Volumen (in ml) kalter Homogenisier ungsp uff er (50 raM UaH₃PO₄-Puffer, pH-Wert 7,0, 0,5 mM SDTA, pH-Wert 7,0, 0,5 mM MgCl₃₅-I mM Natriumpyruvat, pH-Wert 7,0, 10 pM Flavinadenindinukleotid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 % Glyzerol), das gleich dem Doppelten des Gewichts (in g) des Gewebes ist, zugesetzt, und das Gemisch wird in eine Französische Druckzelle gebracht«, Alle nachfolgenden Schritte werden so durchgeführt, daß das Material kalt (etwa 4° C) gehalten wird« Die Zellen werden

2 bei 16 000 psi (etwa 1125 lg/cm ) aufgebrochen, das Zellexudat wird auf einem Eisbett in einem Behälter aufgenommen» Als Alternative dazu wird das Gewebe mit Homogenisierungspuffer in einem Mörser mit dem Pistill zerrieben, dadurch entfällt die Behandlung in der Französischen Druckzeile« Das Ebmdat wird bei 10 000 U/min 5 min zentrifugiert, um die Zelltrümmer abzutrennen«, Das Volumen der obenauf schwimmenden Schicht wird gemessen, und bis zu einer Sättigung von 25 % wird Ammoniumsulfat von Enzymgüte (144 mg (ITH.) «SO der obenaufschwimmenden Schicht) zugesetzt» Da3 Gemisch wird 15 min auf Eis gerührt, dann 5 min bei 10 000 U/min zentrifugiert.

Das Pellet wird weggeworfen, und die obenaufschwimmende Schicht wird bis zu 50 % Sättigung mit Ammoniumsulfat (158 mg (NBL)₂SO ,/ml obenaufschwimmende Schicht) abgestimmte Nach einem fünfzehnminütigen Rühren auf Eis wird das Pellet durch Zentrifugieren aufgefangen, 5 min bei 10 000 U/rain_e Das so gewonnene Pellet wird in 1 ml Kolonnenpuffer auf jeweil 2 g Blatt- oder 5 g Wurzelmaterial aufgelöste Der Sbrfcrakt wird durch Aufbringung auf eine Sephadex G50-Kolonne entsalzt, die mit Kolonnenpuffer (50 mli HaHgPO^-Puffer, pH-Wert 7₅0, 0,1 шМ BDA, 0,5 шМ MgOl₂, 10 juM Plavinadenindinukleotid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 % Glyzerol) äquilibriert wird« Die Probe wird mit Kolonnenpuffer eluiert, und es werden 2 ml der Probe für jeweils einen Milliliter der der Kolonne zugeführten Probe aufgefangen«

B_e Röhrohenuntersuchung;

5 bis 50 μΐ eines Extrakts» der nach Beispiel 68 A hergestellt wurde, werden in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml des Reaktionsgemische (20 mM NaH₂PO₄-PUffer, pH-Wert 7_э0, 20 mM Natriumpyruvat, pH-Wert 7_s0, O₃5 mM Thiaminpyrophosphat, 5 mM MgCl₂, 10 /UM Plavinadenindinukleotid) aufgelöst. Das Gemisch wird bei 37 C 30 min inkubiert« Die Reaktion wird durch den Zusatz von 50 ді von 6N H₂SO, gestoppte Das Gemisch wird bei 60 C 15 min inkubiert, dann mit 625 ul Ш-Naphtholreagens (500 ді 5 %iges ς»-naphthol in 2,5 M iiaOH und 125 jal 25 mg/ml Kreatin) behandelt und weitere 15 min bei 60 C inkubierte Wenn sich ein Niederschlag gebildet hat, wird dieser ausgesponnen und bei 520 тд die Absorbanz gemessen«. Es wird berechnet, wieviel pMol Azetoin gebildet werden, wozu eine Standardkurve verwendet wird, die unter Einsatz von 0,4 ^Ug bis 10 ,ug Azetoin erstellt wird- Die spezifische Aktivität wird als pKat/mg Protein ausgedrückt«

С« ULISA-Pla11enuntersuchung

Ein bis 20 /al einer Probe werden in die Vertief ung einer ELISA-Platte mit einem Gesamtvolumen von 0,15 ml Reaktionsgemisch gegeben» Das Geraisch wird 30 min bei 37 C reagiert» Die Reaktion wird durch den Zusatz von 50 μΐ 2,4 M HpSO^, das Kreatin enthält, gestoppt» Das Gemisch wird 30 min bei 60 C inkubierte Jeder vorhandene Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt» Auf eine neue ELISA-Platte werden 150 μΐ des Untersuchungsgemischs gegeben, mit 100 _;ul von 10 %igem Qk-Naphthol in 5 M NaOH behandelt und weitere 20 min bei 60 G inkubiert« Die Absorbanz wird bei 520 np gemessen und die spezifische Aktivität wie im Beispiel 68 B ausgedrückt»

Beispiel 69 - Untersuchung auf chemisch induzierbare DNA-Folgen: Bacillus Thuringiensis-Endotoxin

A. Pflanzenextraktionsverfahren

Etwa 100 mg Pflanzengewebe werden in 0,1 ml Extraktionspuffer (50 ml Na₂CO₃, pH-Wert 9,5, 10 mM EDTA, 0,05 % Triton X-100, O₉O5 % Tween, 100 mM NaCl, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (vor der Verwendung zugesetzt) und 1 mM Leupeptin (unmittelbar vor der Verwendung zugesetzt)) homogenisierte Nach der Extraktion werden 2 M Tris, pH-Wert 7,0, zugesetzt j um den pH-Wert auf 8,0 - 8,5 abzustimmen» Dann wird der Extrakt 10 min in einer Beckman-Ivlikrofuge zentrifugiert, und die obenaufschwimmende Schicht wird für die ELISA-Analyse verwendet»

B, ELISA

Eine ELISii-Platte wird mit Ethanol vorbehandelt« Affini^äbs-

gereinigtes Kaninchen-anti-Bt-Antiserum (50 μΐ) mit einer Konzentration von 3 ,ug/ml in boratgepufferter Salzlösung (100 raM Borsäure, 25 mM Natriumborat_s 75 mM BaGl, pH-Wert S,4 - 8,5) wird der Platte zugesetzt, und diese läßt man über Nacht bei 4° G inkubieren«, Antiserum wird durch Immunisierung von Kaninchen mit gradientengereinigtem BT-(Bacillus thuringiensis-Endotoxin)-Kristallen (Ang, B„ J₈ und Nickerson_s K₈ W., Appl_e Environ* МіогоЪіоі. 36, 625 - б2б (1978)), die mit Natriumdodezylsulfat löslich gemacht wurden, hergestellt» Die Platte wird mit Waschpuffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 0,05 % Tween 20, 0,02 % Natriumazid) gewaschen, dann eine Stunde bei Zimmertemperatur mit einem Blockierungspuffer (10 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,4, 140 mM NaCl, 1 % Rinderserumalbumin, 0,02 % Natriumazid) behandelt und erneut'gewaschen* Der Pflanzenextrakt wird in einer Menge zugegeben, die 50 ,ug Protein ergibt (im typischen Fall etwa 5 jal des Extrakts; das Protein wird nach der Methode von Bradford, Μ·, Anal» Biochem« 72, 248 (1976) unter Anwendung eines kommerziell erhältlichen Satzes von Bio-Rad bestimmt), und über Nacht bei 4° C inkubierte Nach dem Waschen werden 50 μΐ affinitätsgereinigtes Ziegen-Anti-Bt-Aniiserum in einer Konzentration von 3 ul/ml Protein in SLISA-Verdünnungsmittel (10 mM Natriumphosphatpuffer, pH-7iert 7,4, 140 mM NaCl, 0,05 % Tween 20, 1 >j Rinderserumalbumin, 0,02 % Natriumazid) zugesetzt, und man läßt eine Stunde bei 37 C inkubieren« Nach dem Waschen werden 50 ul Kaninchen-Antiziegen-Antikörper, gebunden an alkalische Phosphatase (Sigma Chemicals, St» Louis, Mo», USA), in ELISA-Verdünnungsmittel 1 : 5OO verdünnt, zugesetzt und eine Stunde läßt man das Ganze bei 37 C inkubieren,, Nach dem V/a sehen werden 50 ul Substrat (0,6 mg/ml ρ-

Hitrophenylphosphat, 0,05 mg/ml MgCl₂, 10 % Diethanolamin, mit HCl auf einen pH-Wert von 9*8 abgestimmt) zugesetzt, und man läßt bei Zimmertemperatur 30 min inkubieren« Die Reaktion wird durch den Zusatz von 50 pX 3 M NaOH beendete Die Absorbana wird bei 405 nm in einem modifizierten ELISA-Gerät (Hewlett Packard, Stanford, Ca«, USA) abgelesen«

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Regulierung der Transkription eines chemisch regulierbaren Gens in pflanzlichem Material, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) innerhalb eines natürlich vorkommenden Systems eine im wesentlichen reine, nicht-kodierende, chemisch regulierbare DNA Sequenz, die in der Lage ist, die Transkription einer assoziierten DNA Sequenz innerhalb einer Pflanze oder eines pflanzlichen Gewebes zu regulieren, wobei besagte Regulation von der Gegenwart eines chemischen Regulators abhängig ist, aus einem chemisch regulierbaren Gen, das innerhalb dieses natürlichen Systems vorliegt, isoliert, indem man

(i) innerhalb dieses natürlichen Systems die Expression von RNA eines chemisch regulierbaren Gens aktiviert;

(ii) besagte RNA isoliert;

(iv) ein differentielles "Screening" einer genomischen Genbibliothek durchführt, die sowohl aus RNA erzeugt wurde, welche zuvor aus diesem besagten aktivierten System isoliert wurde als auch aus RNA, welche zuvor aus einem nicht aktivierten Kontrollsystem isoliert wurde;

(iv) einen genomischen Klon isoliert;

(v) ausgehend von diesem genomischen Klon das chemisch regulierbare Gen subkloniert; und

(vi) die gewünschte chemisch regulierbare DNA Sequenz isoliert;

(b) eine chimäre chemisch regulierbare DNA Sequenz herstellt, die aus einer ersten, gemäss Abschnitt (a) isolierten, nicht-kodierenden, chemisch regulierbaren DNA Sequenzkomponente zusammengesetzt ist, die in der Lage ist, die Transkription einer assoziierten DNA Sequenz innerhalb einer Pflanze oder eines pflanzlichen Gewebes zu regulieren, wobei besagte Regulation von der Gegenwart eines chemischen Regulators abhängig ist, sowie aus einer zweiten DNA-Sequenzkomponente, die innerhalb einer Pflanze oder eines pflanzlichen Gewebes transkribierbar ist, indem man die erste, nichtkodierende, chemisch regulierbare DNA-Sequenzkomponente mit der zweiten Sequenzkomponente verknüpft;

(c) pflanzliche Protoplasten, Zellen, Gewebe oder ganze Pflanzen mit der chimären

DNA-Sequenz gemäss Abschnitt (b) transformiert, unter Verwendung eines Transformationsverfahrens ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Agrobacteriumvermittelter Transformation, direktem Gentransfer, Mikroinjektion oder Mikroprojektil-Beschuss;

(d) transformierte Zellen oder Gewebe selektiert; und

(e) einen chemischen Regulator auf pflanzliche Zellen, Gewebe oder ganze Pflanzen und/oder deren Samen, welche die chimäre DNA-Sequenz gemäss Abschnitt (b) enthalten, appliziert.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man für die Isolierung einer im wesentlichen reinen, nicht-kodierenden, chemisch regulierbaren DNA Sequenz, die natürlicherweise in einer Pflanze vorliegt, die folgenden Verfahrens schritte anwendet:

(a) Aktivierung der Expression von PoIyA+ RNA in der Pflanze von besagtem chemisch regulierbarem Gen;

(b) Isolierung dieser PoIyA+ RNA;

(c) Konstruktion einer cDNA Bibliothek ausgehend von dieser PoIyA+ RNA

(d) "Differentielles Screening" dieser cDNA Bibliothek mit cDNA, die sich von RNA aus einer nicht aktivierten Kontrollpflanze ableitet;

(e) Isolierung von chemisch regulierbaren cDNA Klonen;

(f) Isolierung eines genomischen Klons aus einer genomischen Bibliothek dieser Pflanze unter Verwendung des cDNA Klons aus Schritt (e) als Sonde;

(g) Subklonierung des chemisch regulierbaren Gens aus diesem genomischen Klon; und

(h) Isolierung der gewünschten, chemisch regulierbaren DNA-Sequenz.
3. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Regulation von einem induzierenden chemischen Regulator abhängig ist.
4. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das chemisch regulierbare Gen, aus welchem eine im wesentlichen reine, nicht-kodierende, chemisch regulierbare DNA Sequenz isoliert werden kann, die als erste DNA-Sequenzkomponente in einem chimären Gen gemäss Abschnitt (b) fungieren kann, ein

PR-Proteingen ist.
5. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes PR-Proteingen ein Tabak PR-la-, PR-Ib-, PR-Ic-, PR-I'-, PR-Q- oder eine PR-R-Gen, ein Chitinasegen aus der Gurke oder aber ein basisches oder saures ß-l,3-Glucanasegen aus Tabak ist.
6. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes PR-Proteingen ein Tabak PR-la-, PR-Ib-, PR-Ic-, PR-Γ- oder eine PR-R-Gen oder ein Chitinasegen aus der Gurke ist.
7. Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes PR-Proteingen ein Tabak PR-la-Gen ist.
8. Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes PR-Proteingen ein Tabak PR-I '-Gen ist.
9. Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes PR-Proteingen ein ein basisches Tabak-ß-1.3-Glucanasegen ist.
10. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sich besagte nichtkodierende, chemisch regulierbare DNA-Sequenz in der 5'-flankierenden Region des besagten PR-Proteingens befindet.
11. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sich besagte nichtkodierende, chemisch regulierbare DNA-Sequenz in der 5'-flankierenden Region des PR-Ia Gens von Tabak befindet und etwa 300 oder mehr Basenpaare aufweist, die sich an die Transkriptionsstartstelle anschliessen.
12. Verfahren gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass sich besagte nichtkodierende, chemisch regulierbare DNA-Sequenz in der 5'-flankierenden Region des PR-Ia Gens von Tabak befindet und etwa zwischen 600 und 1000 Basenpaare aufweist, die sich an die Transkriptionsstartstelle anschliessen.
13. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Transkription durch einen Regulator, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Benzoe-

säure, Salicylsäure, Acetylsalicylsäure, Polyacrylsäure und substituierten Derivaten davon, reguliert wird.
14. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Transkription durch eine Regulator, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Benzo-1,2,3-thiadiazolcarbonsäure, Benzo-1,2,3-thiadiazolthiocarbonsäure, Cyanobenzo-1,2,3-thiadiazol, Benzo-1,2,3,-thiadiazolcarbonsäureamid, Benzo-1,2,3,-thiadiazolcarbonsäurehydrazid und Derivate davon, reguliert wird.
15. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Transkription durch eine Regulator, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Benzol,2,3-thiadiazol-7-carbonsäure, Benzo-^,S-thiadiazol-^-thiocarbonsäure, 7-Cyanobenzo-l,2,3-thiadiazol, Benzo-1,2,3,-thiadiazol^-carbonsäurearnid, Benzo-1,2,3,-thiadiazol-7-carbonsäurehydrazid und Derivate davon, reguliert wird.
16. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Transkription durch eine Regulator, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Benzo-1,2,3-thiadiazolcarbonsäure, Alkylbenzo-^^-thiadiazolcarboxylat, worin die Alkylgruppe ein bis sechs Kohlenstoffatome enthält, und den substituierten Derivaten dieser Verbindungen, reguliert wird.
17. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Transkription durch einen Regulator, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-carbonsäure, Methylbenzo-l^S-thiadiazol^-carboxylat, n-Propylbenzo-l,2,3-thiadiazol-7-carboxylat, Benzylbenzo-l,2,3-thiadiazol-7-carboxylat, Benzo-1 ^,S-thiadiazol^-carbonsäure-sec.butylhydrazid, 2.6-Dichlorisonicotinsäure und Methyl^o-dichlorisonicotinat reguliert wird.
18. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Transkription durch Methylbenzo-l,2,3-thiadiazol-7-carboxylat reguliert wird.
19. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Transkription durch Dichloroisonikotinsäure oder Derivate davon reguliert wird.
20. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass besagte nicht-kodierende, chemisch regulierbare DNA Sequenz gemäss Abschnitt (a) aus

einer ersten DNA-Sequenzkomponente besteht, welche die nicht-kodierende, chemisch regulierbare DNA Sequenz eines natürlich vorkommenden, chemisch regulierbaren Gens ist oder aber wesentliche Sequenzhomologien zu dieser aufweist, wobei besagte erste DNA-Sequenzkomponente in der Lage ist, die Transkription einer assoziierten DNA Sequenz innerhalb einer Pflanze oder eines pflanzlichen Gewebes zu regulieren und diese Regulation von der Gegenwart eines chemischen Regulators abhängig ist, sowie einer zweiten DNA-Sequenzkomponente, die einen Teil einer transkribierbaren, aber keine vollständige DNA-Sequenz darstellt, mit der die erste DNA-Sequenzkomponente in dem natürlich vorkommenden, chemisch regulierbaren Gen assoziiert ist oder aber zumindest wesentliche Sequenzhomologien zu dieser Sequenz aufweist.
21. Verfahren gemäss Ansprach 20, dadurch gekennzeichnet, dass das natürlich vorkommende, chemisch-regulierbare Gen in einer Pflanze vorkommt und besagte zweite DNA-Sequenzkomponente eine kodierende Sequenz ist.
22. Verfahren gemäss Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Gen ein PR-Proteingen ist.
23. Verfahren gemäss Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass besagte kodierende Sequenz ein Signalpeptid kodiert.
24. Verfahren gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass besagte kodierende Sequenz ein Signalpeptid kodiert, welches die folgende Aminosäuresequenz aufweist: MetGlyPheValLeuPheSerGlnLeuProSerPheLeuLeuVal-SerThrLeuLeuPheLeuVallleSerHisSerCysArgAla

oder aber ein Peptid, das eine wesentliche Sequenzhomologie zu diesem Signalpeptid aufweist.
25. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass besagte nicht-kodierende, chemisch regulierbare DNA Sequenz gemäss Abschnitt (a) die in "Sequenz 1" wiedergegebene DNA-Sequenz aufweist oder aber eine DNA-Sequenz, die dieser im wesentlichen homolog ist
26. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass besagte nicht-kodierende, chemisch regulierbare DNA Sequenz gemäss Abschnitt (a) die in "Sequenz 2" wiedergegebene DNA-Sequenz aufweist oder aber eine DNA-Sequenz, die

dieser im wesentlichen homolog ist
27. Verfahren gemäss Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, dass besagte nicht-kodierende, chemisch regulierbare DNA Sequenz gemäss Abschnitt (a) die in "Sequenz 3" wiedergegebene DNA-Sequenz aufweist oder aber eine DNA-Sequenz, die dieser im wesentlichen homolog ist
28. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass besagte nicht-kodierende, chemisch regulierbare DNA Sequenz gemäss Abschnitt (a) die in "Sequenz 4" wiedergegebene DNA-Sequenz aufweist oder aber eine DNA-Sequenz, die dieser im wesentlichen homolog ist
29. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass besagte nicht-kodierende, chemisch regulierbare DNA Sequenz gemäss Abschnitt (a) die in "Sequenz 5" wiedergegebene DNA-Sequenz aufweist oder aber eine DNA-Sequenz, die dieser im wesentlichen homolog ist
30. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass besagte nicht-kodierende, chemisch regulierbare DNA Sequenz gemäss Abschnitt (a) die in "Sequenz 6" wiedergegebene DNA-Sequenz aufweist oder aber eine DNA-Sequenz, die dieser im wesentlichen homolog ist
31. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass besagte nicht-kodierende, chemisch regulierbare DNA Sequenz gemäss Abschnitt (a) die in "Sequenz 7" wiedergegebene DNA-Sequenz aufweist oder aber eine DNA-Sequenz, die dieser im wesentlichen homolog ist.
32. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass besagte nicht-kodierende, chemisch regulierbare DNA Sequenz gemäss Abschnitt (a) die in "Sequenz 8" wiedergegebene DNA-Sequenz aufweist oder aber eine DNA-Sequenz, die dieser im wesentlichen homolog ist.
33. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite DNA Sequenzkomponente innerhalb der gemäss Abschnitt (b) hergestellten chimären, chemisch regulierbare DNA Sequenz in der Lage ist, die Expression eines phänotypischen Merkmals über einen "anti-sense"- Mechanismus zu regulieren.
34. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite DNA Sequenzkomponente innerhalb der gemäss Abschnitt (b) hergestellten Chimären, chemisch regulierbare DNA Sequenz eine kodierende Sequenz ist, welche transkribiert und translatiert werden kann und in der Folge zur Herstellung eines Polypeptides führt, das in einem phänotypischen Merkmal resultiert.
35. Verfahren gemäss Ansprach 34, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite DNA-Sequenzkomponente an die erste DNA-Sequenzkomponente angrenzt.
36. Verfahren gemäss Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass die erste DNA-Sequenzkomponente durch einen reprimierenden chemischen Regulator reguliert wird.
37. Verfahren gemäss Ansprach 34, dadurch gekennzeichnet, dass die erste DNA-Sequenzkomponente durch einen induzierenden chemischen Regulator reguliert wird.
38. Verfahren gemäss Ansprach 34, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei besagtem phänotypischen Merkmal um ein Merkmal, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Toleranz oder Resistenz gegenüber einem Herbizid, einem Pilz, einem Virus, einem Bakterium, einem Insekt, einem Nematoden oder einem Arachniden; Herstellung von Sekundärmetaboliten; männliche oder weibliche Sterilität; sowie Herstellung eines Enzyms oder einer anderen Reporterverbindung, handelt.
39. Verfahren gemäss Ansprach 38, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei besagtem phänotypischen Merkmal um Toleranz oder Resistenz gegenüber einem Herbizid oder Resistenz gegenüber Insekten handelt.
40. Verfahren gemäss Ansprach 39, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Toleranz oder Resistenz gegenüber Herbiziden durch eine DNA-Sequenz verursacht wird, die für die Wildtyp-Form oder die Herbizid-resistente Form der Acetohydroxysäuresynthase (AHAS) kodiert.
41. Verfahren gemäss Ansprach 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Resistenz gegenüber Insekten durch eine DNA-Sequenz verursacht wird, die für das Bacillus thuringiensis Endotoxin (Bt) kodiert.
42. Verfahren gemäss Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes phänotypisches Merkmal eine Reporterverbindung ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Luziferase (LUX), Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), Neomycinphosphotransferase (NPT), Nopalinsynthase (NOS), Oktopinsynthase (OCS), ß-1,3-Glucuronidase (GUS), Acetohydroxysäuresynthase (AHAS) und Bacillus thuringiensis Endo toxin (Bt).
43. Verfahren gemäss Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes phänotypisches Merkmal eine Reporterverbindung ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ß-l,3-Glucuronidase (GUS), Acetohydroxysäuresynthase (AHAS) und Bacillus thuringiensis Endo toxin (Bt).

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