PL162822B1 - Sposób wytwarzania stabilnych, biologicznie czynnych somatotropin PL PL PL PL PL - Google Patents
Sposób wytwarzania stabilnych, biologicznie czynnych somatotropin PL PL PL PL PLInfo
- Publication number
- PL162822B1 PL162822B1 PL28138089A PL28138089A PL162822B1 PL 162822 B1 PL162822 B1 PL 162822B1 PL 28138089 A PL28138089 A PL 28138089A PL 28138089 A PL28138089 A PL 28138089A PL 162822 B1 PL162822 B1 PL 162822B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- loop
- somatotropin
- small
- derivatized
- rpst
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 35
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims abstract description 20
- -1 oligomers Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 31
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 31
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 31
- 229960004532 somatropin Drugs 0.000 claims description 31
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N sulfanyl Chemical class [SH] PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 claims 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 14
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract description 10
- 239000000539 dimer Substances 0.000 abstract description 9
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 21
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 15
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 9
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 8
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 8
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 8
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 4
- JJVXHDTWVIPRBZ-VKHMYHEASA-N (2r)-2-[carboxy(methyl)amino]-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)N(C)[C@@H](CS)C(O)=O JJVXHDTWVIPRBZ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101000664737 Homo sapiens Somatotropin Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000007623 carbamidomethylation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropane-1,3-dithiol Chemical group SCC(N)CS DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124325 anabolic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003263 anabolic agent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001944 cysteine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009645 skeletal growth Effects 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania stabilnych, biologicznie czynnych somatotropin, w których wiazanie dwusiarczkowe malej petli zredukowane jest przy uzyciu organicznego merkapto- zwiazku, a tak otrzymane dwie grupy merkapto podstawione sa grupa karbamoiloalkilo- wa, znamienny tym, ze selektywnie redukuje sie wiazanie dwusiarczkowe malej petli somatotropiny organicznym merkapto-zwiazkiem o ogólnym wzorze R-SH, w którym R oznacza grupe alkilowa o 1-6 atomach wegla, ewentualnie podstawiona grupa hydroksylowa lub merkapto i tak otrzymane dwie grupy merkapto poddaje sie reakcji z halogenkiem karbamoiloalkilu o 1-7 atomach wegla. PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzonio stabilnych, biologicznie czynnych soinototropin. Izolowanie, oczyszczanie i właściwości somatotropin są dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie. Zasadniczo sornototropina, nazywana czasami hormonem wzrostu, wytwarzana jest w ciągu życia zwierzęcia przez przysadkę mózgową. Wiadomo, że somatitriplna pobudza wzrost szkieletu, zatrzymywania ozotu i syntezę białek oraz wpływa na metabolizm glikozy i lipidów. Skutkiem tego simatitropinę uznaje się za czynnik anaboliczny o działaniu ogólnym.
Simatitriplnę możno wyizolować z wyciętej tkanki przysadki mózgowej; patrz np. Li, J. Biol. Chem. 211, 55 (1954). Somatitripinę możno otrzymać także metodami inżynierii genetycznej z mikroorganizmów zawierających rekombinowony ONA, który koduje wytwarzanie somatotropiny; patrz np. Soeburg i inni, Nature, 276, 795 - 798 (1978); Soeburg i inni, Noture 270, 486 - 494 (1978); Martiol, Science, 205, 602 - 607 (1979); i Soeburg i inni, ONA, 2, 37 - 45 (1983).
Zbadano i scharakteryzowano somototropiny z poszczególnych gatunków. Na przykład, wiadomo, że simatotropina bydlęca jest polipeptydem syntetyzowanym i ulegającym sekrecji z przedniego płata przysadki. Nukleotydową sekwencję kodującą oraz sekwencję amlnikwasową natywnej somatotropiny bydlęcej przedstawiono przez np. Miller i inni, J. Biol. Chem., 255, 7521-24 (1980); i Wallis, FEBS Lett., 35, 11-14 (1973). Somototropina bydlęca jest białkiem o długości 191 aminokwasów i wydoje się, że jest syntetyzowana początkowo jako presimatotropina o długości 217 aminokwasów; sekwencja sygnałowi o długości 26 aminokwasów jest usuwano z części N-końcowej podczas syntezy i sekrecji, np. Lingopa i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 2432-36 (1977).
Preparotyka somatotropiny jest dobrze znono fachowcom w tej dziedzinie. Na przykład somatotropinę bydlęcą ekstrahuje się z przysadki bydło, lub wytwarza się stosując technologię rekombinacji ONA w odpowiednich gospodarzoch np. Miller i inni, J. Biol. Chem., 255, 7521-24
162 822 (1980). Opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 443 539 ujawnia sposób wytwarzania somatotropiny bydlęcej przez wykorzystanie metodyki rekombinowanego DNA do umieszczenia genu strukturalnego somatotropiny bydlęcej w komórkach drożdży. Opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 371 462 ujawnia metodę oczyszczania peptydów z przedniego płata przysadki. Europejskie zgłoszenie patentowe nr 83304574.3, zgłoszone 8 sierpnia 1983 roku, opublikowane pod numerem
103 395; 823044880.6, zgłoszone 16 września 1982 roku, opublikowane pod numerem 075 444 i 81303824.7, zgłoszone 21 sierpnia 1981 roku, opublikowane pod numerem 047 600; oraz brytyjskie zgłoszenie patentowe nr 2 073 245A ujawniają metody rekombinacyjne wytwarzania z dużymi wydajnościami somatotropiny bydlęcej. Szczepy E.coli wytwarzające somatotropinę bydlęcą dostępne są w American Type Culture Collection pod numerami ATCC 31826, 31840, 31841, 31842 i 31843.
Podobnie dobrze znana jest preparatyka naturalnej i wytwarzanej metodami rekombinacyjnymi somatotropiny świńskiej i ludzkiej. Metody otrzymywania somatotropiny świńskiej i ludzkiej ujawniają: opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 604 359, w którym przedstawiono metody ekspresji somatotropiny ludzkiej w mikroorganizmach; opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 332 717, w którym przedstawiono metody oczyszczania somatotropiny ludzkiej i europejskie zgłoszenie patentowe nr 83305717.7, zgłoszone 26 września 1983 roku, opublikowane pod numerem
104 920, w którym przedstawiono metody rekombinacyjne wytwarzania somatotropiny świńskiej z duZą wydajnością. Opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 604 359 ujawnia metody syntetyzowania aktywnej biologicznie somatotropiny ludzkiej, włącznie z metodami syntetyzowania aktywnej biologicznie pochodnej tetra-S-karboamidometylowej. Znane są też inne publikacje jak na przykład opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 645 755, który ujawnia metodę wytwarzania somatotropiny rybiej.
Chociaż metody wytwarzania somatotropiny są dobrze znane, metody jej przechowywania podczas, często długich, okresów pomiędzy wytworzeniem, a użyciem somatotropiny nie są dobrze rozwinięte. Somatotropiny mają tendencję do tworzenia, podczas przechowywania, nieaktywnych biologicznie dimerów, oligomerów i nierozpuszczalnych agregatów. Te nieaktywne biologicznie formy somatotropiny obniżają jej ilość dostępną do użycia i powodują problemy podczas podawania, szczególnie jeśli nierozpuszczalne agregaty tworzą osady w roztworach somatotropiny.
Potrzebne są dlatego metody wytwarzania stabilnej, aktywnej biologicznie somatotropiny, która nie będzie tworzyć podczas przechodzenia nieaktywnych biologicznie dimerów, oligomerów i agregatów.
Celem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania stabilnej i aktywnej biologicznie somatotropiny, która nie będzie tworzyć podczas przechowywania nieaktywnych biologicznie dimerów, oligomerów i agregatów.
Stabilną i aktywną biologicznie somatotropinę, która nie będzie tworzyć podczas przechowywania nieaktywnych biologicznie dimerów, oligomerów i agregatów można podawać zwierzętom hodowlanym w postaci odpowiednio spreparowanej kompozycji w celu poprawy ich wzrostu, polepszenia wydajności mięsa i mleka i polepszenia wykorzystania paszy. Kompozycja powinna być odpowiednia do długoterminowego przechowywania oraz łatwego przygotowywania do dawkowania i podawania.
Cele te osiąga się stosując sposób obejmujący specyficzną redukcję wiązań dwusiarczkowych małej pętli somatotropiny w celu utworzenia grup tiolowych i przeprowadzenia w pochodne grup tiolowych małej pętli. Przeprowadzenie w pochodne grup tiolowych małej pętli zapobiega przed tworzeniem przez nie międzycząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych, które powodują tworzenie dimerów, oligomerów i agregatów somatotropiny oraz inaktywują ją. Somatotropina wytwarzana tym sposobem jest stabilna oodczas długiego przechowywania i posiada aktywność biologiczną równą lub większą od aktywności somatotropiny nie przeprowadzonej w pochodne.
162 822
Przeprowadzoną w pochodne somatotropinę odzyskuje się i, jeśli zachodzi potrzeba, dalej przetwarza w celu otrzymania formy somatotropiny odpowiedniej do długoterminowego przechowywania i następnie podawania zwierzętom.
Inne korzyści i nowe cechy ninujszego wynalazku staną się oczywiste po zapoznaniu się z następującym szczegółowym opisem wynalazku.
Somatotropiny wyizolowane z różnych gatunków zwierząt posiadają duży stopień homologii sekwencyjnej (około 96%); jednakże różnią się one liczbą i sekwencją aminokwasów obecnych w łańcuchu somatotropiny. Na przykład, natywna ludzka somatotropina (nhST) jest polipeptydem składającym się z 188 aminokwasów. Cząsteczka somatotropiny posiada dwa wiązania dwusiarczkowe, jedno pomiędzy aminokwasami w pozycjach 179 i 186 i jedno pomiędzy aminokwasami w pozycjach 68 i 162. Te wiązania dwusiarczkowe tworzą, odpowiednio, sześcioaminokwasową małą pętlę i dziewięćdziesięcioczteroaminokwasową dużą pętlę. Całkowitą sekwencję i strukturę somatotropiny ludzkiej, przedstawiając małą pętlę i dużą pętlę zilustrowano w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 3 853 832.
Podobnie natywna somatotropina świni (npST) jest 190-cio aminokwasowym polipeptydem, posiadającym dwa wiązania dwusiarczkowe, tworzące charakterystyczne małą pętlę i dużą pętlę; odpowiednio jedną pomiędzy aminokwasami w pozycjach 180 i 188 i jedną pomiędzy aminokwasami w pozycjach 163 i 52. Także natywna somatotropina bydlęca (nbST) jest 191-aminokwasowyn polipeptydem posiadającym dwa wiązania dwusiarczkowe, tworzące charakterystyczne małą pętlę i dużą pętlę; odpowiednio jedną pomiędzy aminokwasami w pozycjach 181 i 189 i jedną pomiędzy aminokwasami w pozycjach 53 i 164. Liczne somatotropiny syntetyczne i otrzymane metodami rekombinacyjnymi posiadają różną liczbę i sekwencję aminokwasów. Jednakże, somatotropiny aktywne biologicznie posiadają strukturę trzeciorzędową z charakterystycznymi małą pętlą i dużą pętlą.
Użyty tutaj termin somatotropina obejmuje wszystkie somatotropiny posiadające małą pętlę i dotyczy me tylko somatotropin natywnych, lecz także somatotropin syntetycznych i somatotropin wytworzonych metodami rekombinacyjnymi, posiadających sekwencję aminokwasową natywnej somatotropiny, sekwencje aminokwasowe zasadniczo do niej podobne, lub jej sekwencje skrócone, oraz ich analogów i sekwencji zmodyfikowanych w wyniku mutacji, posiadających sekwencje z przedstawieniami, z delecjami, wydłużone, z zastąpieniami i w inny sposób zmodyfikowane. W szczególności użyty tutaj termin somatotropina obejmuje uzyskane metodami rekombinacyjnymi białko o tej samej sekwencji co natywna somatotropina, lecz posiadające delecje aminokwasów przy końcu aminowym i karboksylowym. Przykłady takich białek obejmują, lecz nie są ograniczone do uzyskanej metodami rekombinacyjnymi delta-7, somatotropiny świni, uzyskanej metodami rekombinacyjnymi delta-4 sonatotroplny bydlęcej (natywne somatotropiny posiadające delecje, odpowiednio, reszty 7 i 4 do końca aminowego) i podobne.
Użyty tutaj termin somatotropina z wprowadzoną pochodną w małej pętli opisuje somatotropiny posiadające dużą pętlę utworzoną przez wiązanie dwusiarczkowe, lecz nie posiadające małej pętli; grupy tiolowe małej pętli są przeprowadzone w pochodne w celu zapobieżenia tworzeniu wiązań dwusiarczkowych małej pętli. Somatotropina z wprowadzoną pochodną w małej pętli pod względem sekwencji aminokwasowej jest identyczna z somatotropiną me przeprowadzoną w pochodną, z tym wyjątkiem, że obecne grupy tiolowe cystern, które normalnie tworzą wiązanie dwusiarczkowe odpowiedzialne za małą pętlę są przeprowadzone w pochodne.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania stabilnej i aktywnej biologicznie somatotropiny, polegający na tym, że selektywnie redukuje się wiązanie dwusiarczkowych małej pętli somatotropiny organicznym związkiem merkapto o ogólnym wzorze R-SH, w którym R oznacza grupę alkilową o 1 - 6 atomach węgla, ewentualnie podstawioną grupą hydroksylową lub merkapto i
162 822 tak otrzymane dwie grupy merkapto poddaje się reakcji z halogenkiem karbamoiloalkilu o 1 - 7 atomach węgla. Przeprowadzanie w pochodne grup tiolowych małej pętli zapobiega tworzeniu przez grupy tiolowe międzycząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych powodujących powstawanie dimerów, oligomerów i agregatów somatotropiny oraz inaktywacji somatotropiny. Somatotropina wytworzona sposobem według wynalazku jest stabilna podczas długoterminowego przechowywania i posiada aktywność biologiczną równą lub większą od aktywności biologicznej somatotropiny nie przeprowadzonej w pochodną. Somatotropinę przeprowadzoną w pochodną odzyskuje się i, jeśli zachodzi potrzeba, dalej przetwarza w celu otrzymania formy somatotropiny odpowiedniej do długoterminowego przechowywania i następnie podawania zwierzętom.
Używaną tutaj somatotropinę można otrzymać z każdego odpowiedniego źródła. Metody wytwarzania, izolowania i oczyszczania natywnych, syntetycznych i otrzymanych metodami rekombinacyjnymi somatotropin są dobrze znane w tej dziedzinie. Może tu być użyta somatotropina z każdego gatunku zwierzęcego, somatotropiny te obejmują, lecz nie są ograniczone do somatotropin ludzkiej, bydlęcej, świni, psa, kota, a także końskiej, ptasiej, rybiej i owczej.
Wiązanie dwusiarczkowe małej pętli redukuje się selektywnie drogą reakcji somatotropiny z odpowiednim środkiem redukującym w warunkach, w których redukcji ulegają wiązania dwusiarczkowe małej pętli, lecz nie ulegają reakcji wiązania dwusiarczkowe dużej pętli. Zastosować można każdy odpowiedni środek redukujący, który reaguje z grupami tiolowymi białek. Typowo, środkiem redukującym jest każdy merkaptan organiczny o wzorze ogólnym R-SH, w którym R ma wyżej podane znaczenie. Korzystnie redukcję przeprowadza się 2-merkaptoetanolem i ditiotreitolem (treo-2,3-dihydroksybutano-1,4-ditiol).
Ogólnie, roztwór zawierający około 1-20 miligramów na mililitr (mg/ml) somatotropiny miesza się z odpowiednim środkiem redukującym, doprowadzając stężenie środka redukującego do około 15 - 300 milimolowego (mM). pH roztworu doprowadza się do około 6 - 10 i roztwór pozostawia się na około 0,5 - 3 godzin w temperaturze około 15 - 50C w celu umożliwienia zajścia reakcji środka redukującego z somatotropinę. Nadmiar środka redukującego usuwa się każdą odpowiednią metodą, korzystnie przez dializę i w rezultacie otrzymuje się somatotropinę ze zredukowanymi dwiema grupami tiolowymi małej pętli; grupy tiolowe małej pętli przeprowadza się w pochodne jak opisano poniżej.
Jeden z korzystnych sposobów jest następujący. Wystarczającą ilość somatotropiny rozpusz cza się w buforze węglanowym (CB-KCB- zawiera 25 mM NHCO3, 18 mM Na2CO3, pH około 9,5) w celu uzyskania roztworu o stężeniu 5 mg/ml. Dodaje się ditiotreitol w ilościach dostatecznych do otrzymania roztworu 20 mM, pH doprowadza się do wartości około 8,0 i przeprowadza się redukcję w ciemności przez około 1 godzinę w temperaturze około 37°C.
W innym z korzystnych sposobów roztwór somatotropiny o stężeniu około 5 mg/ml w buforze węglanowym (CB~ pH około 9,8) zawierającym 2-merkaptoetanol w stężeniu około 50 mM, poddaje się reakcji w ciemności przez około 1 godzinę, w temperaturze około 20 - 37°. Usuwa się nadmiar środka redukującego i przeprowadza w pochodną somatotropinę tworząc stabilną i aktywną biologicznie somatotropinę.
Grupy tiolowe małej pętli, które powstają na skutek redukcji przeprowadza się w pochodne poprzez reakcję somatotropiny ze zredukowanymi grupami tiolowymi z czynnikiem przeprowadzającym w pochodne. Takim czynnikiem użytym w celu przeprowadzenia zredukowanych grup tiolowych małej pętli w pochodne może być każdy odpowiedni czynnik przeprowadzający w pochodne, który reaguje z grupami tiolowymi Fachowcy w tej dziedzinie znają wiele klas grup przeprowadzających w pochodne, które reagują z grupami tiolowymi. Najkorzystniej czynnikiem przeprowadzającym w pochodne jest halogenek karbamoiloalkilu o 1 - 7 atomach węgla w grupie alkilowej.
162 822
Ogólnie, roztwór somatotropiny ze zredukowanymi grupami tiolowymi małej pętli o stężeniu 1 - 200 mg/ml miesza się z odpowiednim czynnikiem przeprowadzającym w pochodne, doprowadzając jego stężenie do około 50 - 880 milimolowego (mM). pH roztworu doprowadza się dd wartości około 6 - 10 i ΓOPZwΰr pozostaną się na około 0,5 - 3 ggdzin w twmppΓttuΓze oociło 15 - 50’C w celu umożliwienia zajścia reakcji czynnika przeprowadzającego w pochodne z tomatotΓoplną. Nadmiar czynnika usuw- się ka2d- dPoaęldOę^ - metodą, koprzylnle p^zz dualią i somaWpttPręnę zawierającą dwie podstawione grupy tulowe w małej pętli przetwarza się w celu wytworzenia spmaWoWrpriny w formie odpowiedniej do długoterminowego przechowywania i podawania zwierzętom, zazwyczaj w formie liofilizowanej.
W korzystnym sposobie, przeprowadza się reakcję roztworu sperWpWrpriny, ze zredukowanymi grupami tlęPowymi małf^;) ppttl, o ttężeiiu oPoPo - rn/mm - w C8~ , zawi^sąccm^ po0rzewreęld w stężeniu około 200 mM, w pH około 8,0 - 9, w ciemności, przez około 0 godzinę, w temperaturze około 20 - 37°. Nadmiar jodoaceWamęOu usuwa się poprzez dializę wobec 2% OB— Otrzymaną somatoWrorint z ortpoadzpną pochodną jeśli zachodzi potrzeba oczyszcza się dalej, sposobami konwencjonalnymi i liofilizuje w celu wytworzenia somatpWrpriπy stabilnej podczas długoterminowego przechowywania i posiadającej aktywność biologiczną równą, lub większą od aktywności biologicznej somaWpttorlny bez wprowadzonej pochodnej.
SomaWoWropina z wprowadzoną pochodną w małej pętli wytwarzana według wynalazku jest stabilna podczas długoterminowego przechowywania i posiada aktywność biologiczną równą lub większą od aktywności biologicznej somatptropęny bez wprowadzonej pochodnej. SomaWptropęna z wprowadzoną pochodną różni się od tomaWottorioy bez wprowadzonej pochodnej tym, że grupy tiolom cystern, które normalnie tworzą wiązanie dwusiarczkom małej pętli są przeprowadzone w pochodne , a grupy tęplooe które normalnie ttorzą wiązanie doauięaoztopw dd^e pętli nie są przeprowadzone w rochpOne. Dlatego spmaWpWropęna z wprowadzoną pochodną w małej pętli, posiada dużą pętlę charakterystyczną dla somaWpWtpriny nie przeprowadzonej w pochodną, lecz nie posiada małej pętli, ponieważ przeprowadzone w pochodne grupy WioIowi nie mogą tworzyć wiązań Oousęatzzkpoych.
Jest zaskakujące, że somatoWtopęna z wprowadzoną pochodną w małej pętli posiada aktywność biologiczną równą lub większą od aktywności biologicznej soeatptrppęny bez wprowadzonej pochodnej. Ponadto somaWptrorlna z wprowadzoną pochodną w małej pętli posiada tę dodatkową zaletę, że mie może ona tworzyć mlędtyztąsWeztkpoych wiązań dwlsęarczkowych pomiędzy grupami Wlolowyml małej pętli, powodujących powstawanie dimerów, oligomerów i agregatów somatottoplny i ^kwkalpuzyzyuh j -. Dzięki ternu somaWotrorlna z wprowadzoną pochodną w iumlee P^tl jjet bardziej stabilna podczas długoterminowego przechowywania.
SomatoWropęny z wprowadzoną pochodną w małej pętli mogą być stosowane w połączeniu z fizjologicznie akceptowalnymi nośnikami, takimi jak różne rozcieńczalniki i podłoża. Nośnikiem może być każdy nośnik odpowiedni ze względów biologicznych i odpowiedni dla tomaWoWropiny z wprowadzoną pochodną w małej pętli, korzystnie sól fizjologiczna zblfptpoana fotfptanee, Tris-HCl, arginina, histydyna i podobne. Ogólnie, każdy odpowiedni ze względów biologicznych roztwór lub nośnik o wartości pH pomiędzy 6 a 11 może funkcjonować w niniejszym wynalazku jako nośnik dla spmatpWroplny z wprowadzoną pochodną w małej pętli. S^ma^t^^hę z wprowadzoną pochodną w małej pętli nes-a s- ę z i z pj o 1 o g i c z n - e ^t^Cf^f^^t^w^lnim i nośnikim i w celu utworzenia kompρtycpl, która pest stabilna podczas długoterminowego przechowywania i umożliwia łatwe przygotowanie do dawkowania i podawania. Korzystne jest peśli kompozycja pest w formie liofilizowanej spmaWottPrlOl z aptoaadtoną pochodną w małep pętli i nośnika.
Wynalazek zzotał ggllu - Doiimy, a naatwęrljcc prrtkCedy ppoano jpkk stzzzegllιe oomiany oęoiżpttego wynalazku w celu wykazania pego tWotooania w praktyce oraz jego zalet
162 822
Uzyskaną metodami rekombinacyjnymi somatotropinę świni (rpST) użytą w poniższych przykładach wytworzono przy użyciu mikroorganizmów E. coli zdeponowanych w American Type Culture Collection, Rockville MO, pod numerem 53031. Całkowity opis mikroorganizmu podany jest w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 656 655. Jest zrozumiałe, że przykłady podaje się w culu zilustrowania wynalazku, i że nie jedt iitenncj autooów, aby ogaanlczaoy oni w JznlJodwlak sposób opis lub zastrzeżeni o.
Przykład I. Selektywna redukcja wiązań dwmsaaócukowych małej pętli 2-mer0aptoetanolem.
W roztworze somaeoeóopatn świni uzyskanej metodami rekombinucyjnymi (rpST) o stężeniu pięć (5) mg/ml w buforze węglanowym (25 mN NuHCO3, 18 mM I^COj, pH 9,8) przeprowadzono reakcję redukcji w ciągu 1 godziny, w temperaturze pokojowej, w obecności 0, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 i 100 mM 2-mnrkapeoetanolu (ME). Po redukcji przeprowadzono reakcję każdej próbki z 200 mM dodoacntamadm (IA) w temperaturze pokojowej, w caemtośca, w ciągu 1 godziny w celu przeprowadzeni a w pochodne grup taolownch pochodzących ze zredukowanych cystern. Próbki analizowano przez elektroforezę na żeże ppZlaOΓónaolaowym z obecniśce nos.
Analiza żeli, uzyskanych w wyniku eeeetrooorózy nn żelu oθloaónyOlalZonlJ w oobcności sOS, wykazała, ze całkowitą redukcję wiązań dwutlarczkowych małej pętli osiągano przez inkubację z 50 mM ME, podczas gdy, w tych warunkach, wiązania dwtslαrcztowe dużej pętli pozostawały nietknięte. Gdy w małej pętli zajdzie redukcja, występuje niewielkie (1-2 mm) obniżenie ruchliwości neetrooOoreryczndj rpST z powodu rozciągnięcia pętli c^w^^j i O takich zmianach ruchliwości nenkrroOorntycunej białek usiecaowαtych w stosunku do nieutieciowatnch w elektroforezie na żelu poeaakryeamadowym w obecności SOS donosił uprzednio Graffarh, Blochem e., 126, 553-560 (1972). eeśli dodo się więcej środka redukującego redukcjo zaczynu zachodzić także w dużej pętli, co powoduje nawet większe oataZetan ruchliwości nlnttóo0oóetycznej (10 - 12 mm). Materiał ze zredukowanymi grupami holowymi w dużej pętli jest zasadniczo nierozpuszczalny, ponieważ jeśli wiruje się materiał redukowany 30 mM ME w tupnrnaratcie pozostaje tylko marnraoł z nietkniętą dużą pętlą. Wyniki te pokazują, ze ME w stężeniu około 40 - 50 mM pozwala uzyskać optymalną wydajność rpST ze zredukowanymi i przeprowadzonymi w pochodne 0aozamadzmntylown grupami holowymi małej pętli.
P o z y k 1 z d II . e^ykna zna ^ccOzji zor zeń siarczkowych j cO ej Jeę li Zli io- iotrnitoee(l.
W roztworze somatotropann świni utykanej metodami Γónkmblnacydtyma (rpST) o stężeniu pięć (5) mg/ml w bbrozru wJslennoJn ((2 mM Nn HCO3, 18 mM pH 9,25) przeprowadzono reakcję redukcji w ciągu 1 godziny, w obecności 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 i 100 mM (ΙιΟ^rreaeoeu (DTT), w atmosferze azotu, w temperaturze 37°. Po redukcji przeprowadzono reakcję każdej próbki z 150 mM IA w temperaturze 37°, w pH pomiędzy 0,5 - 9,0, w ciemności, w ciągu 1 godziny w celu przeprowadzenia w pochodne grup raoloJych ze zredukowanych cystern. Nadmiar tieprueóeagowotngo IA zablokowano niewielkim nadmiarem molowym DTT w stosunku do IA, i dializowano przez noc wobz c 0,1 M NH4HC3j, JH 7,8 - 8,2. Oddiolizowaną opST analizowano przez mapoJanan peptydów po 2 godzinach hydrolizy trypsyną traktowaną TPCK. Wyniki przedstawiono w Tablicy I.
Dane w Tablicy I, wskazują, że caU^ok^wit^ redukcję wiązań dwus 1 acczkowych małej pętli osiągnięto przez inkubację z 20 mM DTT podczas gdy, w tych warunkach, wiązaniu dwusaαraz0oJn dużej pętli pozostały nietknięte Zostało to niżej potwierdzone w Przykładzie III.
Przykład III . chαoaoreonsrnka somotoróopany z pochodną w małej pętli.
opST bez wprowadzonej poanocnnc i opST z wprowadzoną pochodną w małej pętli, przygotowaną zgodnie z Przykładem I, trawiono przez 2 godziny toypsnną. Preparaty trawione trypsyną analizowano stosując wysokzspooJną anooMarzgraOlę cieczową z odwróconymi fazami (RP-UPLC)
162 822
Wyniki pokazują piki HPLC o czasach retencji 40,4 i 98 minut, reprezentujące odpowiednio małą pętlę i dużą pętlę. Jednakże po selektywnej redukcji i karbamidometylacji w małej pętli, pik HPLC o czasie retencji 40,4 minuty całkowicie zanikał, czemu towarzyszyło pojawienie się dwóch pików o czasach retencji 3,6 i 50,9 minut. Analizy nowych pików HPLC poprzez automatyczną degradację Edmana potwierdziły, że modyfikowana próbka rpST zawierała rpST z pochodną wprowadzoną w małej pętli, tak jak przewidywano. Dane dotyczące sekwencji aminokwasowej peptydów trypsynowych bez wprowadzonej pochodnej i z wprowadzoną pochodną w małej pętli przedstawiono w Tablicy 2. Dodatkowy dowód na karbamidometylację dwóch cystern modyfikowanej rpST otrzymano dzięki analizie aminokwasów. Uzyskano wartość 1,6 karboksymetylocystein (CMC) na dwie teoretycznie wprowadzone pochodne jednej pętli. Dane te przedstawiono w Tablicy III.
Przykład IV. Aktywność biologiczna somatotropiny z wprowadzoną pochodną.
Aktywność biologiczną rpST bez wprowadzonej pochodnej i rpST z wprowadzoną pochodną w małej pętli, przygotowanej według metody z Przykładu I, oznaczano w próbie wiązania pST, 125 stosując błony wątroby królików w ciąży i znakowaną izotopem J rpST. Zastosowano zmodyfikowaną wersję oznaczenia opisanego przez Tsushima i innych, w Radioreceptor Assay for Growth
Hormone, J. Clin. Endocrinol. Metab , 37:334-337 (1973): próbkę rpST inkubowano w temperatu125 rze 30’C przez 3,5 godziny z 16000 cpm J-rpST. Do wyznaczenia krzywej zastosowano zakres stężeń standardu rpST i rpST z wprowadzoną pochodną w małej pętli pomiędzy 0,38 - 200 ng/ml. Dodatkowe informacje o oznaczeniu wiązania pST opisane są w pracy Tsushima i innych, Radioreceptor Assay for Growth Hormone, J. Clin. Endocrinol. Metab., 37:334-337 (1973). Wyniki wykazują, ze obliczone stężenie jodu przy 50% (IC-50) pST z wprowadzoną pochodną karbamidonetylową w małej pętli wynosiło 1,24 ng/0,5 ml równoważnika wiązania, podczas gdy próbki nie przeprowadzone w pochodne i dializowane dawały, odpowiednio, wartość 3 ng/ml i 2,9 ng/0,5 ml, Standard dawał IC50 równe 2,35 ng/0,5 ml. Z danych tych obliczono procent aktywności pST z wprowadzoną pochodną w małej pętli na 181%, w przeciwieństwie do wartości około 75% dla somatotropiny nie przeprowadzonej w pochodną.
Przykład V . Aktywność biologiczna somatotropiny z wprowadzoną pochodną.
Aktywność biologiczną rpST bez wprowadzonej pochodnej i rpST z wprowadzoną pochodną w małej pętli, przygotowanej według metody z Przykładu I, oznaczano stosując aktywność wiązania do błon wątroby świni według modyfikacji Haro i innych, Homologous Somatotropin Radio Receptor Assay Utilizing Recombinant Bovine Growth Hormone, Mol. Cell Endocrinol., 38:109-116 (1985). Wyniki wykazują, że obliczone IC-50 dla pST z wprowadzoną pochodną karbamidometylową w małej pętli wynosiło 1,29 ng/0,5 ml w porównaniu z 1,61 ng/0,5 ml dla pST bez wprowadzonej pochodnej i standardu rpST. Wyniki wykazują, że rpST z wprowadzoną pochodną posiada 125% aktywności w porównaniu ze 100% dla rpST niemodyfikowanej. Wyniki te wskazują zupełnie nieoczekiwanie, że somatotropiny wytworzone według niniejszego wynalazku są nie tylko bardziej stabilne, lecz także bardziej aktywne biologicznie niż ich niezmodyfikowane prekursorowe somatotropiny.
Przykład VI. Aktywność biologiczna i siła działania biologicznego somatotropiny z wprowadzoną pochodną.
Względną aktywność biologiczną i siłę działania biologicznego rpST bez wprowadzonej pochodnej i rpST z wprowadzoną pochodną w małej pętli, przygotowaną według metody z Przykładu I, oznaczano poprzez pomiar przyrostu wagi ciała szczurów z usuniętą przysadką mózgową. Cztery (4) grupy po 10 szczurów z usuniętą przysadką mózgową w grupie otrzymywało przez 9 dni 24 pg pST na dobę, standardu pST, dializowanej Zn-rpST, Zn-rpST z wprowadzoną pochodną w małej pętli lub Zn-rpST bez wprowadzonej pochodnej Szczury kontrolowano codziennie i rejestrowano ich przyrosty wagi ciała przez okres 10 dni. Mierzono przyrost wagi i obliczano
162 822 procent względnej aktywności biologicznej jako procent przyrostu dla standardu. Wyniki przedstawiono w Tablicy IV.
Dane w Tablicy IV wykazują, że rpST z wprowadzoną pochodną wywoływała średni procent przyrostu wagi 13,5%, w porównaniu z 14,4% dla rpST bez wprowadzonej pochodnej. Ponadto, dane wykazują, że mała pętla z końca karboksylowego nie jest wymagana do zwiększania wzrostu przez somatotropinę.
Przykład VII . Stabilność roztworu somatotropiny z wprowadzoną pochodną.
Przygotowano roztwory rpST bez wprowadzonej pochodnej i rpST z wprowadzoną pochodną w małej pętli (przygotowanej z IA według Przykładu I) o stężeniu 8 mg/ml w 46 mM buforze węglanowym (pH 9,8) albo w soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanem (pH 7,4) zawierające 0,5% azydku sodowego. Próbki o objętości 1,25 ml inkubowano w probówkach Eppendorfa do mikrowirówki przez 0,6; 4,6; 8,8; 22 i 120 dni w temperaturze 37°C.
Przy końcu każdego okresu inkubacji próbki usuwano z probówek i poddawano analizie stosując chromatografię wykluczania na Superose 12, z 46 mM buforem węglanowym jako fazą ruchomą, (pH 9,8). Względne ilości monomerów, dimerów i utworzonych agregatów o wyższej masie cząsteczkowej wykazują, że odzyskiwano wyższy procent monomerów, jeśli w małej pętli przeprowadzona była redukcja i wprowadzona pochodna.
Przykład VIII . Stabilność somatotropiny z wprowadzoną pochodną w stanie zwilżonym .
rpST bez wprowadzonej pochodnej i rpST z wprowadzoną pochodną w małej pętli (przygotowaną z IA według Przykładu I) o stężeniu 5 mg/ml dializowano wobec 0,46 mM buforu węglanowego i liofilizowano w celu wytworzenia suchych próbek rpST do dalszego testowania. Pięć mg suchych rpST z wprowadzoną pochodną w małej pętli i rpST bez wprowadzonej pochodnej zwilżono 0,01 ml 50 mM buforu Tris-HCl, pH 7,4, 0,5% azydku sodowego lub 46 mM buforu węglanowego pH 9,8 i 0,05% azydku sodowego. Pastę pozostawiono do inkubacji na 14 dni w temperaturze 37° Przy końcu tego okresu, rpST rozcieńczono do końcowego stężenia około 1,8 mg/ml 46 mM buforem węglanowym, pH 9,8 i poddawano przez kilka minut działaniu ultradźwięków w sonifikatorze Branisonic 220, a następnie wirowano przy 15000 x G przez 5 minut·. Zawartość monomerów w supernatancie analizowano poprzez procedurę chromatograficzną opisaną w Przykładzie VI. Wyniki wykazują, że odzysk monomerów rpST był znacznie większy dla rpST z wprowadzoną pochodną w małej pętli w porównaniu z rpST bez wprowadzonej pochodnej, bez względu na pH roztworu użytego do zwilżania.
Oczywiście, w świetle powyższych danych możliwe są modyfikacje i odmiany niniejszego wynalazku. Dlatego jest zrozumiałe, że w zakresie załączonych zastrzeżeń, wynalazek można stosować w praktyce inaczej niż szczegółowo opisano.
162 822
Tablica I
Czasy retencji peptydów trypsynowych pochodzących z małej i dużej pętli pST
| Próbka | Mała pętla /RT min./ | Duża pętla /RT min./ |
| Niezmodyfikowana [T-5 + T-18] | 40,4 [ T-23+T-25 ] | 98,0 |
| Zredukowana /tylko mała pętla/ [T-5+T-18 ] | 3,6 [ T-23 ] 45,0 [ T-25 ] | 98,0 |
| Zredukowana /mała i duża pętla/ | 3,6 [ T-23] | 80,6X |
| [ r-5j, [ r-ie ] | 45,0 [ T-25] | 60,0 |
| X X Przeprowadzona w pochodną /tylko mała pętla/ [ T-5+T-18] | 3,6 [T-23 ] 50,9 [ T-25] | 98,0 |
| X X Przeprowadzona w pochodną | 3,6 [ T-23] | 85,6 |
| /mała i duża pętla/ [ T-5], [ T-18] | 50,9 [ T-25] | 74,3 |
Zastosowane skróty: Czas retencji /RT/ każdego piku HPLC podano w minutach.
[ T-X ] = Każdy pik analizowano i oznaczano jako peptyd trypsynowy zgodnie z pozycją rozpoczynając od sekwencji aminokońcowej.
[ T-X+T-Y] = Dwa peptydy trypsynowe połączone kowalencyjnie wiązaniem dwusiarczkowym.
W niezmodyfikowanej pST, mała pętla składa się z dwóch peptydów trypsynowych T-23 i T-25, które są połączone kowalencyjnie wiązaniem dwusiarczkowym. Podobnie, w dużej pętli, połączone są peptydy T-5 i T-18.
x = Pik odpowiadający peptydowi T-1 również ulega elucji w tym miejscu. xx = Zredukowane cysteiny przeprowadzono w pochodne IA.
Rozdział 100 pg trawionej trypsyną rpST osiągnięto na kolumnie Aquapore C-8 RP-HPLC /Brown-Lee/, zrównoważonej wstępnie 0,1% kwasem trifluorooctowym /TFA/ i eluowanej 50% 2-propanolem w 0,1% TFA przy szybkości przepływu 0,5 ml/min.
Tablica II
Skład aminokwasowy* niezmodyfikowanej i zmodyfikowanej rpST
| Aminokwas | Próbka niezmodyflkowana /mole/mol/ | Próbka zmodyfikowana /mole/mol/ | Wartość teoretyczna |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| ASP | 16,5 | 17,0 | 16 |
| THR | 7,6 | 7,7 | 8 |
| SER | 12,3 | 12,6 | 14 |
| GLU | 26,8 | 27,7 | 25 |
| PRO | 6 , 1 | 5,7 | 5 |
| GLY | G , 0 | 8,0 | 8 |
| ALA | 17,0 | 15,7 | 16 |
| CYSX | 3,8 | 2,4 | 4 |
162 822
Tablica II ciąg dalszy
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| VAL | 7,6 | 5,3 | 8 |
| MET | 1,8 | 1,7 | 2 |
| ILE | 5,5 | 5,5 | 24 |
| LEU | 23,3 | 23,2 | 24 |
| TYR | 6,7 | 6,8 | 7 |
| PHE | 11,6 | 11,7 | 12 |
| LYS | 10,3 | 12,6 | 11 |
| HIS | 5,0 | 5,0 | 3 |
| ARG | 12,6 | 12,6 | 13 |
| CMCXX | 0 | 1,6 | patrz CYS |
| łącznie | 182 | 182 | 182 |
+ = Oznaczone przez analizę aminokwasów po 24-godzinnej hydrolizie
CYSX = Tę wartość otrzymano jako cysteinę i pomnożono przez współczynnik 2 w celu otrzymania ilości cystern /wyrażono jako mole/mol/.
CMCXX = liczbę karboksymetylowanych cystern wyliczono stosując odpowiedni standard.
Tablica III
Analizy sekwencji aminokwasów pików HPLC odpowiadających peptydom małej pętli i karbamidometylowanym peptydom T-23.
/A/ RT piku HPLC: 40,5 z mapy peptydu niezmodyfikowanej rpST
| Numer cyklu | PTH-aminokwas | Ilość /pMol/ | PTH-aminokwas | Ilość /pMol/ |
| 1 | PHE | 609 | brak | - |
| 2 | VAL | 638 | ARG | 113 |
| 3 | GLU | 243 | ARG | 109 |
| 4 | SER | 223 | brak | - |
| 5 | SER | 154 | brak | - |
| 6 | CYSTYNA /-S-S-/ | /++/x | brak | - |
| 7 | ALA | 214 | brak | - |
| 8 | PHE | 116 | brak | - |
| 9 | brak | brak | - |
x - cysteina-PTH ulega elucji przy 14,8 minutach. Dokładnej ilości nie obliczono z powodu niedostępności standardu cysteiny-PTH. Ponieważ podczas drugiego i trzeciego cyklu Edmana uwalniały się dwa PTH-aminokwasy, ustalono także, że po 2 godzinach hydrolizy trypsyną karboksylokońcowe aminokwasy Arg-Arg nie ulegały rozszczepieniu. Trypsyna nie może hydrolizować tych wiązań. Okazało się także, że wiązanie Cystyna-Arg jest oporne na hydrolizę trypsyną.
162 822 /B/ RT piku HPLC: 50,9 z mapy peptydu rpST ze zmodyfikowaną małą pętlą
| Numer cyklu | PTH-aminokwas | Ilość /pMol/ |
| 1 | PHE | 114 |
| 2 | VAL | 54 |
| 3 | GLU | 44 |
| 4 | SER | + + |
| 5 | SER | + + |
| 6 | CAfM-CYSTEINAx | / /XX /++/ |
| 7 | ALA | 56 |
| 8 | PHE | 37 |
| 9 | brak | - |
- Pojawienie się nowego piku PTH przy RT 9,24 spowodowane jest karbamidometylowaną cysteiną .
- Ilości nie wyliczono z powodu niedostępności standardu CAM-Cys-PTH.
Tablica IV
Oznaczanie aktywności biologicznej somatotropiny świni
| Somatotropina /ST/ | Dawka pg | % przyrostu średnia | wagi SD | % względnej aktywności biologicznejx |
| standard pST | 24 | 23,1xx | 2,9 | 55xxx |
| Dializowana Zn-rpST | 24 | 14,4 *x | 2,5 | 62 |
| Zn-rpST z wprowadzoną pochodną w małej pętli | 24 | 13,5XX | 2,8 | 58 |
| Zn-rpST bez wprowadzonej pochodnej | 24 | 17,1xx | 2,2 | 74 |
Względem standardu pST otrzymanej z przysadki mózgowej, testowanego w podobnym stężeniu. xx Znacząco wyzsza /P<.0,01/ niż kontrola negatywna /4,6%, odchylenie standardowe /SD/ 3,4/ xxx Jeśli ST rozcieńczono buforem o pH wyższym niż 9,5 jej względna aktywność biologiczna przy równoważnej dawce wynosiła 51%.
Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 eg7 Cena 10 000 zł
Claims (1)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania stabilnych, biologicznie czynnych somatotropin, w których wiązanie dwusiarczkowe małej pętli zredukowane jest przy użyciu organicznego merkapto-związku, a tak otrzymane dwie grupy merkapto podstawione są grupą karbamoiioolkiiową, znamienny tym, że selektywnie redukuje się wiązanie dwusiarczkowe małej pętli somotitriplny organicznym rnierkapto-związkiem o ogólnym wzorze R-SH, w którym R oznacza grupę alkilową o 1 - 6 atomach węgla, ewentualnie podstawioną grupą hydroksylową lub merkapto i tak otrzymane dwie grupy merkapto poddaje się reakcji z halogenkiem Ιο^ομ^^οΙ^^ o 1 - 7 atomach węgla.
się 2. Sppoób wwdług zastrz. 1, simαtitriplnę świńską. Z n a m 1 e n n y t y m, że jako somatotropinę stosuje się 3. Spposó weeduu zastrz. 1, óimatitΓoplnę rekombinowaną. z n a m i. e n n y t y m, te jako óimatitriplnę stosuje się 4. Epposó weełuu zastrz. 3, z n o ^kombinowaną simatitroplnę świńską. m 1 e n n y t y m, że jako somototropinę stosuje 5. Spoosó wwed^^ zastrz. 1, z n a m 1 e n n y t y m, że wiązanie deuslarczkiee mo- łej pętli simatitropiny redukuje się ditiotreitolem lub 2-merlaptoetani0em.6. Sposób według zostrz. 1, znamienny tym, że grupy merkapto powstałe z wiązania dwusiarczkowego małej pętli somatotropiny poddaje się reakcji z jodoacetamidem.* * *
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/242,542 US5079230A (en) | 1988-09-12 | 1988-09-12 | Stable bioactive somatotropins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL162822B1 true PL162822B1 (pl) | 1994-01-31 |
Family
ID=22915193
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL28138089A PL162822B1 (pl) | 1988-09-12 | 1989-09-12 | Sposób wytwarzania stabilnych, biologicznie czynnych somatotropin PL PL PL PL PL |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5079230A (pl) |
| EP (1) | EP0433395A1 (pl) |
| JP (1) | JPH04500519A (pl) |
| CN (1) | CN1037845C (pl) |
| AU (1) | AU4330889A (pl) |
| CA (1) | CA1339759C (pl) |
| DD (1) | DD289544A5 (pl) |
| ES (1) | ES2018397A6 (pl) |
| GR (1) | GR1002144B (pl) |
| HU (2) | HU206375B (pl) |
| NZ (1) | NZ230610A (pl) |
| PL (1) | PL162822B1 (pl) |
| RU (1) | RU2073686C1 (pl) |
| UA (1) | UA26853C2 (pl) |
| WO (1) | WO1990002758A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA896914B (pl) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0355460B1 (en) * | 1988-08-24 | 2000-12-27 | American Cyanamid Company | Stabilization of somatotropins by modification of cysteine residues utilizing site directed mutagenesis or chemical derivatization |
| US5849694A (en) * | 1990-07-16 | 1998-12-15 | Synenki; Richard M. | Stable and bioactive modified porcine somatotropin and pharmaceutical compositions thereof |
| US5169834A (en) * | 1990-11-30 | 1992-12-08 | American Cyanamid Company | Compositions and method for reducing vial breakage during lyophilization |
| US5567620A (en) * | 1993-01-26 | 1996-10-22 | Eli Lilly And Company | Non-denaturing potency assay for somatotropin |
| ZA94169B (en) * | 1993-01-26 | 1994-09-07 | Lilly Co Eli | Non-denaturing potency assay for bovine somatotropin |
| DE4303744A1 (de) * | 1993-02-09 | 1994-08-11 | Univ Autonoma De Nuevo Leon Mo | Hundewachstumshormon |
| DK44593D0 (da) * | 1993-04-20 | 1993-04-20 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af et polypeptid |
| ZA9711731B (en) * | 1996-12-31 | 1998-07-01 | Monsanto Co | Aqueous glycerol formulations of somatotropin |
| AU7493198A (en) * | 1997-05-15 | 1998-12-08 | Geoffrey J Schmidt | Method of reducing immunological tolerance to malignancy |
| ATE335000T1 (de) * | 1997-06-25 | 2006-08-15 | Applied Research Systems | Disulfid-vernetzte glycoprotein-hormone, ihre herstellung und verwendung |
| AU2001273388B2 (en) * | 2000-09-08 | 2005-01-13 | Gryphon Therapeutics, Inc. | "Pseudo"-native chemical ligation |
| US6811777B2 (en) * | 2002-04-13 | 2004-11-02 | Allan Mishra | Compositions and minimally invasive methods for treating incomplete connective tissue repair |
| CA2498319A1 (en) * | 2002-09-09 | 2004-03-18 | Nautilus Biotech | Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules |
| US7998930B2 (en) | 2004-11-04 | 2011-08-16 | Hanall Biopharma Co., Ltd. | Modified growth hormones |
| EP1871795A4 (en) | 2005-04-08 | 2010-03-31 | Biogenerix Ag | COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE |
| CN106139158B (zh) | 2010-01-22 | 2024-06-21 | 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 | 体内功效延长的生长激素 |
| EP2446898A1 (en) | 2010-09-30 | 2012-05-02 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Use of growth hormone to enhance the immune response in immunosuppressed patients |
| EP2981282B1 (en) | 2013-04-05 | 2020-11-04 | Novo Nordisk Health Care AG | Growth hormone compound formulation |
| CN108828237B (zh) * | 2018-08-24 | 2021-04-02 | 浙江理工大学 | 一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3853832A (en) * | 1971-04-27 | 1974-12-10 | Harmone Res Foundation | Synthetic human pituitary growth hormone and method of producing it |
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| JPS5630925A (en) * | 1979-08-21 | 1981-03-28 | Sumitomo Chem Co Ltd | Purification of human growth hormone |
| EP0103395A3 (en) * | 1982-08-17 | 1985-05-22 | Biogen N.V. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield |
| CA1341012C (en) * | 1982-09-27 | 2000-06-06 | Biogen, Inc. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing swine growth hormone-like polypeptides |
| FI82266C (fi) * | 1982-10-19 | 1991-02-11 | Cetus Corp | Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein. |
| US4620948A (en) * | 1982-12-22 | 1986-11-04 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US6916914B1 (en) * | 1985-06-26 | 2005-07-12 | Pharmacia & Upjohn Co. | Purification of somatotropin from transformed microorganisms |
| US4766205A (en) * | 1985-11-13 | 1988-08-23 | Beatrice Companies, Inc. | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms |
| US4816568A (en) * | 1986-05-16 | 1989-03-28 | International Minerals & Chemical Corp. | Stabilization of growth hormones |
| EP0355460B1 (en) * | 1988-08-24 | 2000-12-27 | American Cyanamid Company | Stabilization of somatotropins by modification of cysteine residues utilizing site directed mutagenesis or chemical derivatization |
-
1988
- 1988-09-12 US US07/242,542 patent/US5079230A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-08-09 CA CA000607863A patent/CA1339759C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-07 WO PCT/US1989/003871 patent/WO1990002758A1/en not_active Ceased
- 1989-09-07 HU HU895729A patent/HU206375B/hu not_active IP Right Cessation
- 1989-09-07 JP JP1510357A patent/JPH04500519A/ja active Pending
- 1989-09-07 RU SU4895049/04A patent/RU2073686C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1989-09-07 UA UA4895049A patent/UA26853C2/uk unknown
- 1989-09-07 AU AU43308/89A patent/AU4330889A/en not_active Abandoned
- 1989-09-07 EP EP89911168A patent/EP0433395A1/en not_active Withdrawn
- 1989-09-08 GR GR890100562A patent/GR1002144B/el not_active IP Right Cessation
- 1989-09-11 NZ NZ230610A patent/NZ230610A/en unknown
- 1989-09-11 ZA ZA896914A patent/ZA896914B/xx unknown
- 1989-09-11 DD DD89332530A patent/DD289544A5/de unknown
- 1989-09-11 CN CN89107230A patent/CN1037845C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-12 PL PL28138089A patent/PL162822B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1989-09-12 ES ES8903103A patent/ES2018397A6/es not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-03-26 HU HU91787A patent/HU910787D0/hu unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5079230A (en) | 1992-01-07 |
| NZ230610A (en) | 1991-12-23 |
| CN1037845C (zh) | 1998-03-25 |
| HU206375B (en) | 1992-10-28 |
| AU4330889A (en) | 1990-04-02 |
| WO1990002758A1 (en) | 1990-03-22 |
| GR1002144B (en) | 1996-02-16 |
| ES2018397A6 (es) | 1991-04-01 |
| HUT56856A (en) | 1991-10-28 |
| HU910787D0 (en) | 1991-09-30 |
| EP0433395A1 (en) | 1991-06-26 |
| UA26853C2 (uk) | 1999-12-29 |
| GR890100562A (el) | 1990-10-31 |
| RU2073686C1 (ru) | 1997-02-20 |
| CN1041160A (zh) | 1990-04-11 |
| ZA896914B (en) | 1990-10-31 |
| CA1339759C (en) | 1998-03-17 |
| DD289544A5 (de) | 1991-05-02 |
| JPH04500519A (ja) | 1992-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL162822B1 (pl) | Sposób wytwarzania stabilnych, biologicznie czynnych somatotropin PL PL PL PL PL | |
| RU2205836C2 (ru) | Усовершенствованный способ получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками | |
| EP0607297B1 (en) | Hormone analogs with multiple ctp extensions | |
| US6908897B2 (en) | Covalently bridged insulin dimers | |
| EP0418230B1 (en) | Method for potentiating and inhibiting insulin-like growth factor activity | |
| Wetzel et al. | Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for a “mini-C” analog of human proinsulin | |
| Chance | Amino acid sequences of proinsulins and intermediates | |
| CZ342492A3 (en) | Derivatives of tri-arginine insulin, process of their preparation and a pharmaceutical composition in which said derivatives are comprised | |
| AU616131B2 (en) | Superactive human insulin analogues | |
| US6605706B1 (en) | Method for producing a correctly folded, biological active recombinant protein | |
| PL167810B1 (pl) | Sposób enzymatycznej hydrolizy lancucha aminokwasu przedproinsuliny PL PL | |
| Acher | Molecular evolution of the polypeptide hormones | |
| EP0490249B1 (en) | Process for the enzymatic preparation of GRF(1-44)NH2 | |
| Liberti | Isolation and somatomedin activity of bovine growth hormone fragment 87–124 | |
| EP0736040A1 (en) | Use of igf-bp for refolding of igf | |
| CA2120358C (en) | Hormone analogs with multiple ctp extensions | |
| AU667489C (en) | Hormone analogs with multiple CTP units from HCG | |
| CRAIG et al. | Characterization of growth hormone releasing factor analog expression in Saccharomyces cerevisiae | |
| HK1023781B (en) | Method for producing a correctly folded, biological active recombinant protein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20060912 |