PL164992B1

PL164992B1 - Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza bakteryjnego do wytworzenia polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwcial reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego inhibitora tkankowegoaktywatora plazminogenu PL

Info

Publication number: PL164992B1
Application number: PL30054590A
Authority: PL
Inventors: Maria Swiatkowska; Czeslaw Cierniewski; Andrzej Plucienniczak; Grazyna Plucienniczak; Wojciech J Stec; Andrzej Wilk
Original assignee: Akad Medyczna; Pan
Priority date: 1990-04-25
Filing date: 1990-04-25
Publication date: 1994-10-31

Abstract

1. Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza bakteryjnego do wytworzenia polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwcial reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu i tym polipeptydem i/lub reagujacego specyficznie z przeciwcialami dla inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu oraz z przeciwcialami dla tego polipeptydu, przez laczenie fragmentów DNA, znamienny tym, ze wektor laczy sie z DNA kodujacym polipeptyd odpowiadajacy fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym Y oznacza sekwen- cje aminokwasów kodowana przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser; a = 0 lub 1; Z oznacza sekwencje Glu, Ser i/lub sekwencje kodowana przez fragment polilinkera; b = 0,1 lub 2; natomiast A oznacza sekwencje odpowiadajaca fragmentowi Asn1 72-Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza bakteryjnego do wytworzenia polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu (PAI-l).i tym polipeptydem; i/lub reagującego specyficznie z przeciwciałami dla tego inhibitora oraz z przeciwciałami dla tego polipeptydu. Aktywatory plazminogenu (PAI-1) pełnią ważną rolę podczas procesu fibrynolizy, a także w różnych innych procesach fizjologicznych, włączając proces regeneracji, owulacji, implantacji' embionu, różnicowania tkanek, transformacji nowotworowej. Precyzyjna regulacja aktywności aktywatorów plazminogenu stanowi krytyczny element wielu biologicznych systemów. Taka regulacja może odbywać się na poziomie tworzenia i rozpuszczania skrzepu lub na poziomie interakcji aktywatorów plazminogenu z komórkami czy też przez działanie specyficznych inhibitorów.

Większość oznaczeń aktywności tkankowego aktywatora plazminogenu jest dwuetapowa, zależy od obecności plazminy i nie odróżnia odmiennych rodzajów inhibitorów. Określenie inhibitorowej aktywności PAI mierzy się ilościowo przez zdolność do hamowania lizy włóknika znakowanego ¹²⁵J, pośredniczonej aktywacją plazminogenu przez urokinazę (Loskutoff and Edington, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 3903-3909, 1977). W tej metodzie jedną jednostkę aktywności PAI określa się jako ilość białka wymaganą do zredukowania aktywności 2IU UK do 50%. W celu oznaczenia ilości PAI używa się metody wiązania aktywatora plazminogenu do inhibitora (Schleef R. R., Wagner N. V., Loskutoff D. J., J. of CellularPhysiology, 134,269-274, 1989). Aktywność PAI można oznaczyć również posługując się metodą Verheijena, w której używa się wzrastających stężeń tPA (0-25 IU/ml), 1 μΜ plazminogenu oraz 1 μΜ fibrynogenu degradowanego bromocyjanem. W tych warunkach 1IU PAI-1 określa ilość inhibitora, która hamuje 1IU tPA (Verheijen J. H., Mullast D., Chang G. T. G., Kluft C., Wijngards G., Thromb. Haemostasis, 48,26(^^-^(36^, 1982). W niektórych badaniach określających poziom PAI we krwi stosuje się oznaczenia, w których podstawą jest neutralizacja tPA dodanego do próbek osocza, a mierzy się pozostałą aktywność tPA. Metody te są metodami pośrednimi i nie pozwalają precyzyjnie określić poziomu tego inhibitora.

Ostatnio opracowano metodę enzymoimmunologicznego oznaczania ludzkiego PAI-1 w teście ELISA z wykorzystaniem przeciwciał dla tego białka. Test ten polega na tym, że inkubuje się przeciwciała dla PAI-1 z badaną próbką, w której oznacza się ten antygen i po odmyciu nieswoiście związanych białek, inkubuje się kompleks antygen-przeciwciało z przeciwciałami dla PAI-1 związanymi z peroksydazą chrzanową, po czym oznacza się antygen wykrywając znacznik.

Wszystkie te metody wymagają zastosowania rodzimego białka PAI-1, zarówno do uzyskania krzywej wzorcowej, jak i swoistych przeciwciał. PAI-1 występuje w ilościach śladowych w płynach ustrojowych i komórkach, a uzyskanie tego białka metodami klasycznymi przez wyodrębnienie w ilościach wystarczających do przygotowania testu Elisa jest niezwykle skomplikowane i czasochłonne. Z drugiej strony otrzymywane dotychczas ludzkie białko PAI-1 jest niezwykle drogie i niezbyt dostępne.

W szystkie omówione metody otrzymania rodzimego PAI-1 są niezwykle skomplikowane, pracochłonne i kosztowne, co zawyża w znacznym stopniu koszty całego testu.

Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest oznaczanie białka rodzimego PAI-1 metodą, w której stosuje się fragment peptydowy otrzymany przy pomocy zrekombinowanego wektora skonstruowanego sposobem według wynalazku. Stwierdzono, że można wykorzystać pełną reakcję krzyżową w teście immunologicznym przeciwciał otrzymanych dla fragmentu białka oraz rodzimej cząsteczki PAI-1.

W odróżnieniu od znanych metod oznaczania PAI-1, wytworzony przy pomocy zrekombinowanego wektora skonstruowanego sposobem według wynalazku, fragment peptydowy, a nie całe białko służy do produkcji swoistych przeciwciał rozpoznających w ten sposób zarówno fragment peptydowy, jak i rodzime białko PAI-1. Fragment ten również stosuje się do uzyskania krzywej wzorcowej.

Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza bakteryjnego do wytworzenia polipeptydu zdolnego do wytwarzania przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu (PAI-1) i tym polipeptydem, przez łączenie fragmentów DNA, polega według wynalazku na tym, że wektor łączy się z DNA kodującym polipeptyd odpowiadający fragmen4 towi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym Y oznacza sekwencje aminokwasów kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser, Z oznacza sekwencję Glu, Ser i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, a = 0 lub 1, b = 0, 1 lub 2, natomiast A oznacza fragment Asnr72 - Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu.

W sposobie według wynalazku zrekombinowany wektor otrzymuje się korzystnie przez łączenie wektora z zsyntezowanym chemicznie DNA odpowiadającym cDNA o sekwencji:

( X ) „AACGGCCAGTGGAAGACACCATTCCCAGACAGTAGCACCCACCGCCGCCTCTT

CCACAAATCAGACGGAAGCAGTGTCTCTGTGCCAATGATGGCTGAGACCAACAAATT

CAACTATACTGAATTCACCACGCCAGATGGACATTACTACGACATCCTGGAACTGCC

ATACCACGGAGACACT(X)_m, gdzie X oznacza GAATCT, n przyjmuje wartość 1 lub 0, a m przyjmuje wartość 0, 1 lub 2.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się zsyntezowany chemicznie DNA kodujący fragment cząsteczki PAI-1 od 172 do 232 aminokwasu od N-końca o sekwencji:

172 177 182

Asn-Gly-Gln-Trp-Lys-Thr-Pro-Phe-Pro-Asp-Ser-Sef—Thr—Hi s-Arg187 192 197

Arq-Leu-Phe-Hi s-Lys-Ser-Asp-Gl y-Ser-Thr-'7«* l -Ser-Va l -Pro-Met202 207 212

Met-Ala-Glu-Thr-Asn-Lys-Phe-Asn-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Thr-Pro217 r—,

-Gly-AspAsp-Gly-His-Tyr-Tyr-Asp-Ile-Leu-Glu-Leu-Pro-Tyr-His

Zrekombinowany sposobem według wynalazku wektor służy do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza bakteryjnego do wytworzenia fragmentu polipeptydowego zawierającego epitopy antygenowe rozpoznawane przez przeciwciała również w rodzimej cząsteczce PAI-1.

Stosowany w procesie prowadzonym sposobem według wynalazku gen kodujący fragment polipeptydowy odpowiadający fragmentowi ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu można na przykład otrzymać z oligonukleotydowych fragmentów ligowanych in vitro.

Oligonukleotydowe fragmenty można zsyntetyzować chemicznie na nośniku poprzez kolejne przyłączanie nukleozydów z zablokowanymi grupami czynnymi. Korzystnie do ochrony funkcji aminowej stosuje się grupę izopropoksyacetylową, co przedstawiono w opisie patentowym RP nr 159 234.

Fragmenty oligonukleotydowe zsyntetyzowane chemicznie podaaje się enzymatycznej reakcji kinazowania, w trakcie której wprowadza się fosforan na końcach 5’ za pomocą kinazy polinukleotydowej i ATP. Kinazowane oligonukleotydy liguje się in vitro w dwuniciowe odcinki ograniczone sekwencjami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne. Zligowane odcinki klonuje się w wektorze pomocniczym, stosując właściwe miejsce restrykcyjne polilinkera. Poprawność sekwencji produktów ligowania i klonowania tych fragmentów sprawdza się poprzez sekwencjonowanie metodą Maxama-Gilberta. Można stosować różne wektory pomocnicze, np. plazmidowe lub fagowe, przy czym korzystne są plazmidy, np. pUC19. Sklonowane w wektorze odcinki DNA namnaża się w komórkach gospodarza, którymi mogą być bakterie, drożdże i inne. Wektory z wklonowanymi odcinkami izoluje się, a następnie odcinki odzyskuje się po trawieniu restryktazami na drodze elektroforezy w żelu poliakryloamidowym. Odzyskane odcinki włącza się do wektora ekspresyjnego po trawieniu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Na tym etapie stosuje się różne wektory ekspresyjne, korzystnie plazmidowe lub fagowe. Przykładowo plazmid ekspresyjny pWR 450.1. zawiera gen kodujący β-galaktozydazę. Komórki gospodarza, korzystnie bakterii, transformowane zrekombinowanym wektorem są po namnożeniu źródłem fragmentu białka ludzkiego PAI-1.

Wytworzony sposobem według wynalazku zrekombinowany wektor służy do otrzymania fragmentu białka PAl-1, który można stosować do otrzymywania przeciwciał różnymi znanymi metodami, a także do wykreślenia krzywej wzorcowej niezbędnej do ilościowego oznaczania PAI-1.

Przykładowy sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu polega na tym, że immunizuje się zwierzęta polipeptydem odpowiadającym fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, pobiera się krew i odzyskuje przeciwciała.

Otrzymane przy pomocy zrekombinowanego wektora wytworzonego sposobem według wynalazku przeciwciała można zastosować do oznaczania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu oraz do otrzymania testu diagnostycznego do oznaczania tego antygenu.

Przykładowy sposób oznaczania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu polega na tym, że badaną próbkę, korzystnie materiału biologicznego, kontaktuje się z przeciwciałami dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)_a-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, po czym oznacza się wytworzony kompleks antygen-przeciwciało.

W innej przykładowej metodzie najpierw wytwarza się kompleks dwuskładnikowy antygenu PAT-1 w próbce z pierwszym przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, po czym wytwarza się kompleks trójskładnikowy przez skontaktowanie kompleksu dwuskładnikowego z drugim przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, przy czym jako jedno z tych przeciwciał stosuje się przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)_a-A-(Z)t,, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie. Obecność kompleksu trójskładnikowego wykrywa się za pomocą sygnału tworzonego przez odczynnik dający się oznaczyć analitycznie lub wyznakowanego przeciwciała przeciwimmunoglobulinowego.

Badaną próbkę, w której wykrywa się i oznacza antygen PAI-1 kontaktuje się i inkubuje z przeciwciałami reagującymi specyficznie z tym antygenem. Utworzenie kompleksu dwuskładnikowego antygen-przeciwciało wykrywa się i oznacza za pomocą środka wykrywającego i sygnalizującego reakcję immunologiczną, jak na przykład przeciwciało reagujące specyficznie z PAI-1 znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie.

Środek wykrywający i sygnalizujący reakcję immunologiczną może być obecny podczas inkubowania antygenu z przeciwciałem. Na przykład można bezpośrednio wyznakować przeciwciała kontaktowane z badaną próbką i po przemyciu produktu reakcji uzyskać sygnał. Środkiem jest wówczas sam znacznik. Środek wykrywający można też dodać dopiero po wytworzeniu kompleksu dwuskładnikowego i usunięciu nieprzereagowanego materiału. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się wówczas następująco: dwuskładnikowy kompleks antygenprzeciwciało po odmyciu kontaktuje się z drugim przeciwciałem reagującym specyficznie z

164 992

PAI-1, przy czym jako jedno z tych przeciwciał stosuje się przeciwciało dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie. Pozostałym (pierwszym lub drugim) przeciwciałem może być przeciwciało dla całej cząsteczki PAI-1. Otrzymuje się wówczas kompleks trójskładnikowy przeciwciało-antygenprzeciwciało. Drugie przeciwciała mogą być bezpośrednio znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie. Alternatywnie, jako środek stosuje się układ dwuskładnikowy zawierający drugie przeciwciała tworzące kompleks trójskładnikowy, który wykrywa się za pomocą przeciwciała przeciwimmunoglobulinowego.

Do znakowania można stosować enzym, biotynę, izotop promieniotwórczy, przykładowo ¹²⁵J lub inne znane odczynniki. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się za pomocą sygnału wytwarzanego przez znacznik.

W tak prowadzonym procesie oznaczania lub wykrywania badaną próbkę oznaczany antygen lub jedno z przeciwciał, korzystnie pierwsze, unieruchamia się na stałym nośniku, takim jak płytka plastikowa, bibuła nitrocelulozowa lub inne.

Wykrywanie i oznaczanie dogodnie jest prowadzić za pomocą testu diagnostycznego. Przykładowy test diagnostyczny zawiera przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z),, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, ewentualnie unieruchomione na stałym nośniku lub rozpuszczone w fazie ciekłej. Przeciwciała są związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie.

Alternatywnie test diagnostyczny zawiera pierwsze przeciwciała reagujące specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu oraz układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawierający drugie przeciwciała zdolne do specyficznego reagowania z ludzkim inhibitorem tkankowego aktywatora plazminogenu i ewentualnie przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe, przy czym jedne z tych przeciwciał stanowią przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z), w którym symbole mają wyżej podane znaczenie.

Korzystnie pierwsze przeciwciała są związane z fazą stałą lub ciekłą.

Test może dodatkowo zawierać nośnik stały lub ciekły dla związania próbki zawierającej antygen.

Układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawiera drugie przeciwciała bezpośrednio związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie albo też układ ten zawiera trzecie przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe związane ze znacznikiem.

W sposobie i testach do oznaczania ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu można stosować przeciwciła dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, wytworzone różnymi metodami.

Celem uproszczenia w opisie i przykładach używane są następujące skróty:

A: adenina

C: cytozyna

G: guanina

T: _ tymina

Ala: alanina

Arg: arginina

Asn: asparagina

Asp: kwas asparaginowy

Cys: cysteina

Gin: glutamina

Glu: kwas glutaminowy

Gly: glicyna

His: histydyna

Ile: izoleucyna

Leu: leucyna

Lys: lizyna

Met: metionina

Phe: fenyloalanina

Pro: prolina

Ser: seryna

Thr: treonina

Trp: tryptofan

Tyr: tyrozyna

Val: walina

DNA: kwas dezoksyrybonukleinowy cDNA: komplementarny DNA

Tris-HCl: chlorowodorek trójhydroksymetyloaminometanu

EDTA: kwas etylenodwuaminoczterooctowy x bufor Eco R1 100M Tris-HCl pH 7,5

MNaCl x bufor do kinazowania x bufor ligacyjny:

Bufor do ekstrakcji

Pożywka LB

Bufor TE

Bufor z SDS

Bufor do lizy komórek

Bufor RI

Bufor R Π

Bufor R III mM β-merkaptoetanol OT M Tris-HCl pH 7,6 0.1MMgCl2 50 mM ditiotreitol 660 mM Tris-HCl pH Ifi 50 mM MgCl2 50 mM ditiotreitol 10 mM ATP 50mMTris-HCl pH 8,0 300 mM octan sodu 0.2% SDS 4 mM EDTA 10g Bacto Trypton 5g Yeast Extract 5g NaCl na 1 litr roztworu mM Tris-HCl pH 8,0 1 mM EDTA 0 OglCri-HCCl pH 8,0 77g glicyny

1g SDS na 1 litr roztworu 15 mg TriT

400 mg SDS ml β-merkaptoetanol ml glicerolu ml wody

M mM EDTA mM Tris-HCL pH 8,0 4 mg/ml lizozymu (Pharmacia) 0,2 M NaOO

1% SDS ml 5 M octan potasu

11.5 ml kwas octowy lodowaty

28.5 ml H2O

DTT: ditiotreitol

PMSF: fluorek kwasu fenylometylosulfonowego SDS: siarczan dodecylu sodu

BSA: albumina surowicy wołu (Bovine Serum Albumin) PBS: zbuforowany roztwór soli fizjologicznej ATP: trójfosforan adenozyny

HPLC: wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa

164 992

EDTA: etylenodiaminotetraoctan

Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia wykres hydrofobowości łańcucha polipeptydowego PAI-1. Figura 2 przedstawia sekwencję fragmentu genu ludzkiego PAI-1 podzieloną na fragmenty syntetyzowane chemicznie. Figura 3 przedstawia schemat konstrukcji fragmentu genu dla PAJ-1 sklonowanego w wektorze rekombinacyjnym pUC-19 oraz ekspresyjnym pWR 450. Figura 4 przedstawia elektroforezę w żelu poliakryloamidowym zawierającym SDS ekstraktów białkowych otrzymanych z komórek E.coli oraz oczyszczonego kompleksu białkowego PAI-1 z β-galaktozydazą: 1 - ciałka inkluzyjne rozpuszczone w zbuforowanym roztworze 6molowego mocznika, 2 - oczyszczone białko hydrobowe β-galaktozydaza - fragment peptydowy PAI-1. Figura 5 przedstawia schemat rozbicia kompleksu białkowego i oczyszczania fragmentu Asn172-Thr232 PAI-1. Przedstawione odcinki β-galaktozydazy przypadają na długość od 4 do 182 aminokwasów. Fragment PAI-1 po rozbiciu komplesku składa się z 61 aminokwasów.

Wynalazek jest bliżej wyjaśniony w przykładach wykonania nie ograniczających jego zakresu.

Przykład L

Etap 1.

A. Synteza oligonukleotydów.

Syntezę 10 oligonukleotydowych fragmentów (fig. 2) przeprowadza się metodą amidofosforynową na stałym nośniku. Jako nośnik stosuje się szkło o kontrolowanej porowatości, typu LCA-CPG, ze związaną pierwszą jednostką nukleozydową. Jednostka ta ma przyłączoną na końcu 5’ -OH deoksyrybozy blokującą grupę kwasolabilną - dimetoksytrityl (DMT), którą usuwa się w środowisku kwaśnym. Odsłonięta w ten sposób grupa 5’-OH jednostki nukleozydowej przyłącza prekursor kolejnej jednostki 3’-amidofosforyn odpowiedniego nukleozydu. Za pomocą jodu w obecności wody dokonuje się utlenienia grupy fosforynowej do fosforanu. Następnie usuwa się DMT z przyłączonej jednostki - tym samym cykl rozpoczyna się na nowo. W celu usunięcia nieprzereagowanych jednostek z wolnymi grupami 5’-OH stosuje się t.zw. capping, tj. zablokowanie pomyłkowych sekwencji przez acetylowanie bezwodnikiem octowym w obecności aktywatorów. Po utworzeniu żądanego oligonukleotydu odcina się go od złoża i usuwa inne grupy wodnym roztworem amoniaku, oczyszcza elektroforetycznie następnie odsala metodą HPLC, (Waters C-18 RP, 10 gm). Oligonukleotydy przechowuje się w porcjach po około 0,5 OD.

B. Proces kinazowania i ligacji.

Poszczególne fragmenty nici DNA rozpuszcza się w wodzie destylowanej, tak aby w 5 gl znajdował się 1 gg fragmentu. Miesza się po 5 gl roztworu fragmentów od 1 do< 5 (I nić DNA) i od 5 do 10 (Π nić DNA). Do mieszaniny fragmentów dodaje się OJ objętości bufom do kinazowania (50 mM Tris-HCl, 5 gM MgCh), 5 gl 20mM ATP, 1 gl kinazy polinukleotydowej B (T4 polinukleotide kinase). Reakcję prowadzi się przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Miesza się obie nici i inkubuje przez 20 minut w· temperaturze 100°C. Po powolnym ostudzeniu dodaje się do każdej próbki po 0,1 objętości buforu do ligacji, po 1 gl 200 mM ATP, 1 gl ligazy T4. Po dokładnym wymieszaniu reakcję prowadzi się przez 12 godzin w temperaturze 4°C.

C. Hydroliza enzymami.

Do rozpuszczonego DNA (80 gl) dodaje się 10x10 gl buforu EcoRi, 2U restryktazy EcoRI (firmy Pharmacia) oraz wody do objętości 100 gl. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Po tym czasie DNA strąca się etanolem, dodając 3 objętości alkoholu etylowego (99.8%), wymraża się w -20°C przez 5 minut, a następnie odwirowuje się przy 15 tys. obr., przez 5 minut. Osad rozpuszcza się w 20 gl buforu TE. W ten sam sposób postępuje się podczas hydrolizy restryktazą Pst I.

D. Rozdział elektroforetyczny.

W celu sprawdzenia czy zligowane fragmenty DNA mają odpowiednią długość, rozdziela się je w 8% żelu poliakryloamidowym z SDS w TBE. Rozdział prowadzi się przy napięciu 130V w ciągu 3 godzin. Żel zabarwia się bromkiem etydyny (0,5 gg/ml - firmy Serva) przez 20 minut w temperaturze pokojowej, następnie płucze się 2 x wodą destylowaną. Rozdzielone produkty obserwuje się pod lampą Uv. W celu oceny wielkości fragmentów DNA podczas elektroforezy używa się następujących wzorców: pUC 19 trawiony Msp, pUC 19 trawiony Bsp RI. Zligowane

164 992 fragmenty posiadają oczekiwaną długość. Po elektroforezie sprawdzającej wykonuje się elektroforezę preparatywną i uzyskuje się tą drogą fragment, który następnie liguje się z plazmidem pUC 19 trawionym Eco RI i PstI w sposób wyżej opisany.

E. Przygotowanie kompetentnych komórek.

Z płytki z wysianymi bakteriami DH5, pobiera się jedną kolonię, którą szczepi się na 5 ml pożywki LB. Bakterie hoduje się w temperaturze 37°C przez 18 godzin. Do 100 ml pożywki LB dodaje się 2 ml otrzymanej hodowli i prowadzi się hodowlę do gęstości optycznej OD 600=0,3. Zawiesinę bakterii zwirowuje się (5 tys. obr. 20 min.), a osad bakteryjny schładza się i zawiesza w 50 ml buforu SB i umieszcza w temperaturze 0°C. Zwirowuje się jak wyżej, a osad zawiesza w 1/2 objętości wyjściowej buforem Sb. Inkubuje się 20 minut w temperaturze 0°C. Po tym czasie z zawieszonych komórek pobiera się do sterylnych probówek po 200 pl zawiesiny komórek i inkubuje 30 minut w 0°C. Dodaje się 7 pl DTT i plazmidy (20 pl). Inkubuje się w lodzie (0°C) 30 minut, a następnie 45 sekund w 45°C. Ochładza się w lodzie i dodaje 800 pl pożywki LB, a następnie inkubuje 1 godzinę w 37°C. Po tym czasie posiewa się na płytki. Wylewa się 200 pl mieszaniny ligacyjnej na płytkę i inkubuje się w 37°C przez 18 godzin.

F. Analiza otrzymanych transformantów.

Po 18 godzinach na płytce z wysianą mieszaniną transformacyjną obserwuje się pojedyncze kolonie. Do dalszej analizy wybiera się 10 kolonii. 5 ml pożywki szczepi się pojedynczymi koloniami i hoduje w 37°C przez 18 godzin, a następnie izoluje plazmidowy DNA. Preparatyka plazmidowego DNA z 5 ml pożywki przebiega w następujący sposób.

Bakterie zwirowuje się (5 minut 5 obrJmin.). Osad bakteryjny zawiesza się w 200 pl buforu RI i przetrzymuje 5 minut w temperaturze 0°C. Dodaje się 400 pl RII (0°C), a następnie 300 pl RUI (0°C). Całość zwirowuje się (15 tys. obr./min., 5 minut). Supernatant przenosi się znad osadu do nowej probówki i dodaje się 2,5 objętości izopropanolu. Wymraża się w -20°C, zwirowuje, osad płucze 70% etanolem i suszy pod próżnią. Osad rozpuszcza się w 200 pl TE i dodaje 20 pl roztworu RNazy o stężeniu 1 mg/ml. Inkubuje się 30 minut w 37°C. Dodaje się 200 pl fenolu. Zbiera się fazę wodną i dodaje 200 pl mieszaniny chloroform/alkohol izoamylowy (24:1, v/v). Zwirowuje się, zbiera supematant, czynność powtarza się jeszcze raz. Do fazy wodnej dodaje się 0,1 objętości 3 M octanu sodu (pH=5,2) oraz 2,5 objętości etanolu i wymraża 30 minut w -20°C. Zwirowuje się (15 tys. obr./min.), a osad przemywa 70% etanolem i suszy. Osad plazmidowego DNA rozpuszcza się w 40 pl buforu TE.

W celu wybrania klonu zawierającego plazmid pUC 19 z wklonowanym dwuniciowym fragmentem, przeprowadza się analizę otrzymanych DNA plazmidowych przy użyciu enzymów restrykcyjnych EcoRI i Pst I, a produkty trawienia rozdziela się w żelu poliakryloamidowym. Trawienie przeprowadza się jak w punkcie C, a rozdział elektroforetyczny jak w D.

G. Sprawdzenie sekwencji sklonowanych fragmentów.

W celu upewnienia się czy sekwencja sklonowanego fragmentujest prawidłowa, fragmenty sekwencjonuje się metodą Maxama i Gilberta (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 1980, 65).

H. Konstrukcja wektora ekspresyjnego.

Sprawdzony dwuniciowy fragment DNA kodujący polipeptyd Asnm- Thr232, liguje się z wektorem ekspresyjnym pWR.450 trawionym enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Pst.I. Uzyskuje się zrekombinowany plazmid ekspresyjny pW-PAI-1. Transformowanie komórek bakteryjnych prowadzi się jak w punkcie E.

I. Czyszczenie ciałek

Bakterie z kolonii bakteryjnej zawierającej zrekombinowany plazmid przenosi się do probówki zawierającej 1 ml pożywki LB + 5 pl ampicyliny o stężeniu 100 g/ml i inkubuje przez

2-5 godzin w temperaturze 37°C, z ciągłym wytrząsaniem. Zawiesinę bakterii namnożonych w tej probówce przenosi się do kolby zawierającej 11 pożywki LB + 1ml ampicyliny o stężeniu 100 pg/ml. Hodowlę prowadzi się 14 godzin, w temperaturze 37°C z ciągłym wytrząsaniem. Następnie bakterie zwirowuje się (15 min., 5000 obr./min.) i osad zawiesza się w 200 ml 0,1 M CaCl2 (buforowanym Trisem, pH=7,5). Po inkubacji przez 20 minut w łaźni lodowej, zawiesinę wiruje się przez 20 minut przy 12000 obr./min. w temperaturze +4°C i osad ponownie zawiesza się w 200 ml 0,1 M CaCl2. Po kolejnej inkubacji przez 2 godziny w łaźni lodowej zawiesinę wiruje się (w dwóch probówkach wirowniczych) j.w. Osad zawiesza się w 20 ml (do obu probówek dodaje się po 20 ml) buforu fosforanowego, pH 6.2, a następnie dodaje się po 200 gl i 1 M glicerolu i 400 μΐ 1% glicerolu do obu probówek. Ogrzewa się je do temperatury pokojowej, dodaje po 40 gl 0,5 M EDTA, pH 8,0 i po krótkiej inkubacji schładza w łaźni lodowej do temperatury około 0°C. Następnie probówki wstawia się na 1 minutę do łaźni o temperaturze 42°C (szok termiczny). Wiruje jak wyżej. Osad po schłodzeniu zawiesza się w 100 ml 100 mM Tris-Hcl, pH 8.0, zawierającym 10 mM EDTA, inkubuje przez 5 minut w temperaturze 0°C i odwirowuje. Osad zawiesza się w 35 ml 100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 100 mM β-ΜΕ, 1 mM PMSF, 1% Triton Χ-100, pH 8.0. Poddaje się go działaniu ultradźwięków -10 razy po 30 sek., po czym odwirowuje się (20 000 obr./min., 30 min., temp. +4°C) otrzymując w ten sposób osad ciałek inkluzyjnych, które następnie przemywa się zawieszając je w 35 ml buforu 50 mM Tris-HCl, pH 7,4,1 mM PMSF, 1 mM EDTA. Po ponownym ich żwirowaniu rozpuszcza się je w 9 M moczniku. W celu pozbycia się reszty zanieczyszczeń (nierozpuszczonych ciałek inkluzyjnych) zawiesinę ponownie wiruje się (20 000 obr./min., 30 min., temp. +4°C). W supematancie winna znajdować się główna część białka. Dalsze oczyszczania białka hybrydowego zawierającego fragment PAI-1 przeprowadza się na kolumnie chromatograficznej DEAESephacel.

Białka zawarte w ciałkach inkluzyjnych rozpuszczone w 9 M moczniku dializuje się do roztworu 6 M mocznika, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, zawierającego 10 mM EDTA, 1 mM PMSF. Tym samym buforem równoważy się dwie kolumny wypełnione złożem DEAE-Sephacel (o wymiarach 2,5 x 10 cm). Na jedną z nich nanosi się roztwór białek. Część białka, która po przejściu przez kolumnę nie zwiąże się ze złożem, nanosi się (po 2-3 krotnym rozcieńczeniu tym samym buforem) na drugą kolumnę. Czyste białko hybrydowe wymywa się ze złoża 0,1 M NaCl.

J. Rozbicie kompleksu na drodze reakcji chemicznej.

Oczyszczone białko hybrydowe złożone z fragmentu β-galaktozydazy oraz fragment Asn172-Thr232 PAI-1 dializuje się wobec buforu 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 w celu usunięcia mocznika, a następnie liofilizuje. Rozszczepienie wiązania Asn-Gly przeprowadza się stosując 2M hydroksyloaminę w 6M chlorowodorku guanidyny, pH 9.3. Reakcję prowadzi się w temperaturze 45°C. Rozbicie koniugatu sprawdzano elektroforetycznie.

Produkty powstałe w wyniku tej reakcji analizuje się w żelu pcliakryloamidowym po elektroforezie.

K. Sposób wyodrębniania fragmentu Asn172-Thr232 (PAI-1) ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu za pomocą HPLC.

Fragment polipeptydowy odpowiadający fragmentowi Asn172-Thr232 (PAI-1) ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu izoluje się z hydrolizatu otrzymanego w sposób opisany w punkcie I za pomocą HPLC. Rozdział chromatograficzny przeprowadzono na kolumnie semipreparatywnej TSK G3000SW firmy LKB, Szwecja.

Etap 2.

A. Otrzymanie przeciwciał.

W celu otrzymania surowicy poliklonalnej dla fragmentu białka ludzkiego PAI-1 immunizuje się tym białkiem króliki. Śródskórnie podaje się na drodze 30 - 40 injekcji dawki 50 gg antygenu w 0,5 ml PBS i wymieszanego z 0,5 ml kompletnego adiuwantu Freuda. Po 7 dniach od każdego szczepienia pobiera się krew z żyły usznej królików. Po wykrzepieniu w temperaturze 37°C przez 0,5 -1.0 godziny, skrzep oddziela się od ścianek probówki i całość pozostawia w temperaturze 4°C na 12 - 24 godziny. Następnie surowice odciąga się do jałowych probówek wirówkowych i wiruje przy 3000 obr/min przez 20 minut. Surowicę inaktywuje się podczas inkubacji przez 30 minut w temperaturze 56°C. Miano poszczególnych próbek surowic określa się metodą radioimmunologiczną, oznaczając ich zdolność do wiązania znakowanego antygenu. Surowice o najwyższym mianie przeciwciał przechowuje się w temperaturze -20°C.

B. Oczyszczanie przeciwciał.

Przeciwciała dla fragmentu PAI-1 oczyszcza się z surowicy odpornościowej za pomocą chromatografii powinowactwa. Immunoadsorbent zawiera fragment białka PAI-1 związany ze złożem CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia). W celu przygotowania immunoadsorbentu 1g złoża

164 992 przemywa się 200 ml roztworu 0,001 mol/l HCl i następnie zawiesza w buforze boranowym (pH 8.3). Natychmiast dodaje się 20 mg fragmentu białka PAI-1 rozpuszczonego w PBS i delikatnie miesza w temperaturze 4°C przez 2 godziny. Po odwirowaniu sprawdza się stężenie białka w supematancie. Złoże zawiesza się następnie w roztworze glicyny (2 mol/l) w buforze boranowym o pH 8.3. Po 1-godzinnej inkubacji odwirowuje się je (10 min. 4 000 obi./min.) i przemywa się je 3 x buforem boranowym (pH 8.3), 1 x wodą dest., 3 x buforem octanowym (pH 4.0), 1 x wodą dest. i 2 x buforem boranowym (pH 8.3). Z otrzymanym w ten sposób złożem inkubuje się 15 ml surowicy otrzymanej po immunizacji fragmentem białka PAI-1, delikatnie mieszając przez 12-14 godzin w temperaturze 4°C. Do mieszaniny dodaje się 1 mM PMSF (Sigma) oraz 1 mM chlorku benzamidyny (Biochemical). Po odwirowaniu (10min., 3000 obrJmin.) złoże przemywa się 4% buforem (PBS z 1% Tween 20), a następnie 4xbuforem (1 M/1 NaCl z 1% Tween 20 w PBS). Po każdym wirowaniu sprawdza się zawartość białek w supemantancie poprzez pomiar adsorpcji światła przy 400 nm. Następnie złoże umieszcza się w kolumnie (0.7 x 10 cm). Przeciwciała specyficznie związane z unieruchomionym na złożu białkiem eluuje się roztworem 0,5 mol/l kwasu octowego i zbiera się do probówek zawierających 100 l roztworu 2 mol/l Tris. Frakcje o dużej zawartości białka łączy się i dializuje wobec PBS przez 24 godziny w 4°C.

C. Sprzęganie przeciwciał z peroksydazą.

U zyskane w ten sposób przeciwciała dla fragmentu białka PAI-1 sprzęga się z peroksydazą. W tym celu rozpuszcza się 5 mg HRPO w 1ml świeżo przygotowanego 0.3 M kwaśnego węglanu sodu (NaHCO3), pH 8.1. Następnie dodaje się 0,1 ml 1% FDNB w alkoholu absolutnym. Delikatnie wytrząsa się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodaje 0.04 - 0.08 M NaJO4 (rozpuszcz. w wodzie destyl.), delikatnie miesza przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Kolor tego roztworu winien stać się zielonożółty. Nstępnie dodaje się 1,0 ml 0,16 M glikolu etylenowego (rozp. w wodzie dest.) i delikatnie miesza w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po zakończeniu inkubacji roztwór dializuje się wobec 0.01 M węglanu sodu, pH 9.5, temperatura 4°C (co najmniej 3 1-litrowe zmiany). Do 3 ml roztworu tak przygotowanego aldehydu peroksydazy (HRPO) dodaje się 5 mg IgG i delikatnie miesza przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej. IgG rozpuszcza się w 1 ml buforu węglanowego przed zmieszaniem lub dodaje w postaci zliofilizowanego proszku wolnego od soli. Po dodaniu IgG wprowadza się 5 mg NaBH4 i pozostawia w 4°C od 3 do 12 godzin. Następnie roztwór dializuje się w 4°C wobec PBS. Jeśli powstaje precypitat, usuwa się go przez wirowanie. Próbkę nanosi się na kolumnę (85 x 1,5 cm), Sephadex G-100, zrównoważoną PBS. Zbiera się frakcje po 1,5 ml i poziom białka w poszczególnych frakcjach oznacza spektrofotometrycznie. Frakcja IgG znakowanych HRPO schodzi w pierwszym szczycie. Roztwory tego koniugatu przechowuje się w obecności albuminy surowicy wołowej o stężeniu 10 mg/ml w temperaturze -20°C.

Etap 3.

Opłaszczanie płytki przeciwciałami i wykonanie testu ELISA.

Studzienki w płytce do testu ELISA opłaszcza się przeciwciałami poliklonalnymi dla fragmentu polipeptydowego Asn172-Thr232 białka PAI-1 o stężeniu 10 gg/ml, zawieszonymi w 50 mM buforze fosforanowym o pH 7.5. Niezwiązane białko odmywa się, a powierzchnię studzienek opłaszcza albuminą surowiczą. Testowane próbki osocza rozcieńcza się przed oznaczeniem 50 mM buforem fosforanowym, pH 7.5, zawierającym 0.15 M NaCl, 10 mM EDTA, 1% Tween 20 i 1% BSA i dodaje się po 200 gl/dołek. Inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji płytki 5-krotnie przemywa się 0,15 M NaCl zawierającym 0,1% Tween 20. Następnie dodaje 200 gl koniugatu IgG-HRP (przeciwciała poliklonalne dla całej cząsteczki PAI-1 związane z peroksydazą) o stężeniu 5 fig/ml. Inkubuje 2 godziny w temperaturze pokojowej i ponownie 5-krotnie przemywa. W celu wywołania reakcji enzymatycznej dodaje się po 200 gl roztworu substratu (0,4 mg/ml ortofenylodiaminy w 0,05 M buforze cytrynianowym, pH 5,0, zawierającym 0.02% H2O2). Po 15 minutach inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję jamuje się przez dodanie 50 gl 3 M kwasu siarkowego. Adsorbancję mierzy się przy 490 nm.

Przykład II. Detekcja antygenu PAI-1 w badanej próbce za pomocą przeciwciał dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego fragmentowi Asn172-Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu.

164 992

Do unieruchomionego antygenu dodaje się wyznakowane peroksydazą przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego fragmentowi Asnr72-Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu i inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Do wywołania reakcji enzymatycznej stosuje się roztwór substratu - ortofenylodiaminy w 0,05 M buforze cytrynianowym pH 5,0, zawierającym 0,02% H2O2). Po 6 minutach inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 50 μΐ 3M kwasu siarkowego. Adsorbancję mierzy się przy 490 nm. Wynik odczytuje się z krzywej wzorcowej dla standardowego roztworu PAI-1.

Przykład DI. Diagnostyczny zestaw testowy dla oznaczania poziomu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu składa się z: pojemnika zawierającego zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS), pH 7.5, EDTA, Tween 20; pojemniczka z albuminą surowiczą; pojemniczka z przeciwciałami dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego fragmentowi Asnr72-Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu; pojemniczka z wyznakowanymi peroksydazą przeciwciałami dla PAI-1; pojemniczka z substratem (ortofenylodiaminą); pojemniczka z buforem cytrynianowym, pH 5.0 i pojemniczka z 3 M kwasem siarkowym.

164 992

GAATCTAACGGCCAGTGGfiAGACACCAATCCGAGACAClAGCACCCACCGCCGCCTCTiCCA

GAUGCCGGTCACCTTCTGTGGT.A AGGGTCTGT<CATCGT.JGGIGGCGGCGGAGAAGGI

CAAAICAGΛCGGΛΛGCCCCITCTCTGTGCCAATGAIGGCIGAGΛCCAAC/tAAIICAACIAIA

GIIIAGICIGCCIICGIGACA,GAGΛCΛCGGTTΛCTΛCCGACTGTGGIIGIIIAAGIIGAIAI

CIGAAIICACCACGCCAGATGGACATTACIACGACAICCIGGAACIGCCAιIACCACGGAQAC

GACTIAAGTGGTGCGGTCTΛCCTGTAATGATGCTGTAGGACCIIGACGGIΛIGGIGCCICTG

ACT ^AATCT

3' 5'

1. CGGICACCIICIGIGGIAAGGGICIGIC

2. AICGIGGGIGGCGGCCGAOAAAGTITITΛA^;TCTGCCIICG dddna nić;

3.IGACAGAGACΛCGGTTΛCTACCG.ACTCIGGIIG

4.IIIAAGIIGAIAIGACIIAAGIGGIGCGGTCIACCIGIAA

5. IGAIG.CIGIA.GGACCTIGACGGTΛTGGTGCCCτCTGIGAAICI

6. ICACAGAGGCA.CCAI.ACCGICAA^GGTCCTACAGCAICAιΊIAC

7. A^GGIAGACCGCACCACTIAAGICAIAICAACI

9. IAAACΛΆCCAGAGTCGGΪ/ΰTΛΛCCGTG7C7CIGIΓACGA górne nić

9. AGGCAGACTΛA.ACACCTTCICCGCCGCCACCC.AC

10. GAIGACAGACCCIIACCACAGAAGGTGACCGGCAAICIAAG.

Fig. 2

Eco RI

Pst I

pWR450

EcoRi, Pst I »4 ~

Fig.3

164 992

PAI-1

. 4 BCTA - GALAKTOZYDAZA : BIAŁKO PAI

produkty degradacji bela-galaktozydazy białko PAI

oczyszczenie produktów hydrolizy

Fig.5

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza bakteryjnego do wytworzenia polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu i tym polipeptydem i/lub reagującego specyficznie z przeciwciałami dla inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu oraz z przeciwciałami dla tego polipeptydu, przez łączenie fragmentów DNA, znamienny tym, że wektor łączy się z DNA kodującym polipeptyd odpowiadający fragmentowi o wzorze (Y)_a-A-(Z)b, w którym Y oznacza sekwencję aminokwasów kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser; a = 0 lub 1; Z oznacza sekwencję Glu, Ser i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera; b = 0, 1 lub 2; natomiast A oznacza sekwencję odpowiadającą fragmentowi Asn172-Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujący polipeptyd o sekwencji:

Asn-Gl y-Gln-Trp-Lys-Thr-Fro-Phe-Pro-Asp-Ser- -Ser-Thr-His-Arg Arg-L eu-Fhe-His-Ly=-Ser-Asp-Gl y -Ser-Thr-b-Sprl-Fro-MetMet-A la-Glu-Thr-Asn-Lvs-Fhe-Asn-T yr-Thr-G l u-Fhe-Thr-Thr-Fro Asp-Gly-His-Tyr—T yr-Asp-1le-Leu-Glu-Leu-Pro-Tyr-Ηχ s-G1y-AspThr.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się zsyntezowany chemicznie DNA.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się zsyntezowany chemicznie DNA o sekwencji:

f O^AACGGCCAGTGGAAGACACCATTCCrAGACAGTAGCACCCACCGCCGCCTCTT

CCACAAATCAGACGGAAGCACTGTCTCTGTGCCAATGATGGCTGAGACCAACAAAT T

CAACTATACTGAATTCACCACGCCAGATGGACATTACTACGACATCCTGGAACTGCC

ATACCACGGAGACACT ι X) _m, gdzie X oznacza GAATCT, n przyjmuje wartość 1 lub 0, a m przyjmuje wartość 0,1 lub 2.