PL164952B1

PL164952B1 - Sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego Inhibitora tkankowego aktywatora plazmlnogenu i test diagnostyczny do oznaczania l/lub wykrywania antygenu ludzkiego Inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu PL

Info

Publication number: PL164952B1
Application number: PL30054390A
Authority: PL
Inventors: Maria Swiatkowska; Czeslaw Cierniewski; Andrzej Plucienniczak; Grazyna Plucienniczak; Wojciech J Stec; Andrzej Wilk
Original assignee: Akad Medyczna; Pan
Priority date: 1990-04-25
Filing date: 1990-04-25
Publication date: 1994-10-31

Abstract

1. Sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazmi- nogenu w próbce zawierajacej ten antygen, przez wytworzenie kompleksu dwuskladnikowego antygenu w próbce z pierwszym przeciwcialem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, wytworzenie kompleksu trójskladnikowego przez skontaktowanie kompleksu dwuskladnikowego z drugim przeciwcialem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem i wykrywanie obecnosci kompleksu trójskladnikowego za pomoca sygnalu tworzonego przez odczynnik dajacy sie oznaczyc analitycznie lub wyznakowane przeciw ciala przeciwimmunoglobulinowe, znamienny tym, ze jako jedno z tych przeciwcial stosuje sie przeciwciala dla polipeptydu odpowiadajacego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym Y oznacza sekwencje amino kwasów kodowana przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser, Z oznacza sekwencje Glu, Ser i/lub sekwencje kodowana przez fragment polilinkera, a = 0 lub 1, b = 0, 1 lub 2, natomiast A oznacza fragment Asn1 72 - Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu. 5. Test diagnostyczny do oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu, z zastosowaniem przeciwcial i odczynnika dajacego sie oznaczyc analitycznie, znamienny tym, ze zawiera pierwsze przeciwciala reagujace specyficznie z bialkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu oraz uklad do oznaczania i/lub wykrywania kompleksu antygen-prze- ciwcialo zawierajacy drugie przeciwciala zdolne do specyficznego reagowania z ludzkim inhibitorem tkanko wego aktywatora plazminogenu oraz ewentualnie przeciwciala przeciwimmunoglobulinowe, przy czym jedne z tych przeciwcial stanowia przeciwciala dla polipeptydu odpowiadajacego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym Y oznacza sekwencje aminokwasów kodowana przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser, Z oznacza sekwencje Glu, Ser l/lub sekwencje kodowana przez fragment polilinkera, a = 0 lub 1, b = 0, 1 lub 2, natomiast A oznacza fragment Asni72 - Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu, ewentualnie unieruchomione na stalym nosniku lub rozpuszczone w fazie cieklej. (62) Numer zgloszenia, z którego nastapilo wydzielenie: 284929 (43) Zgloszenie ogloszono: 04.11.1991 BUP 22/91 (45) O udzieleniu patentu ogloszono: 31.10.1994 WUP 10/94 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu (PAI-1) i test diagnostyczny do oznaczania i/lub wykrywania inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu.

Aktywatory plazminogenu (PAI-l) pełnią ważną rolę podczas procesu fibrynolizy, a także w różnych innych procesach fizjologicznych, włączając proces regeneracji, owulacji, implantacji embrionu, różnicowania tkanek, transformacji nowotworowej. Precyzyjna regulacja aktywności aktywatorów plazminogenu, stanowi krytyczny element wielu biologicznych systemów. Taka regulacja może odbywać się na poziomie tworzenia i rozpuszczania skrzepu lub na poziomie interakcji aktywatorów plazminogenu z komórkami czy też przez działanie specyficznych inhibitorów.

Większość oznaczeń aktywności tkankowego aktywatora plazminogenu jest dwuetapowa, zależy od obecności plazminy i nie odróżnia odmiennych rodzajów inhibitorów. Określenie inhibitorowej aktywności PAI mierzy się ilościowo przez zdolność do hamowania lizy włóknika

164 952 znakowanego ^l25J, pośredniczonej aktywacją plazminogenu przez urokinazę (Loskutoff and Edington, Proc. Nat.Acad.Sci. USA, 74, 3903-3909, 1977). W tej metodzie jedną jednostkę aktywności PAI określa się jako ilość białka wymaganą do zredukowania aktywności 21U UK do 50%. W celu oznaczenia ilości PAi używa się metody wiązania aktywatora plazminogenu do inhibitora (Schleef R.R., Wagner N.V., Loskutoff D.J., J.of Cellular Psysiology, 134, 269-274, 1989). Aktywność PAI można oznaczyć również posługując się metodą Verheijena, w której używa się wzrastających stężeń ŁPA (0-25 IU/ml), 1gM plazminogenu, oraz lgM fibrynogenu degradowanego bromocyjanem. W tych warunkach 1 IU PAI-1 określa ilość inhibitora, która hamuje 1 IU tPA (Verheijen J.H., Mullast D., Chang G.T.G., Kluft C., Wijngards G., Thromb. Haemostasis, 48,266-269, 1982). W niektórych badaniach określających poziom PAI we krwi stosuje się oznaczenia, w których podstawą jest neutralizacja ŁPA dodanego do próbek osocza, a mierzy się pozostałą aktywność ŁPA. Metody te są metodami pośrednimi i nie pozwalają precyzyjnie określić poziomu tego inhibitora.

Ostatnio opracowano metodę enzymoimmulogicznego oznaczania ludzkiego PAI-1 w teście ELIS A z wykorzystaniem przeciwciał dla tego białka. Test ten polega na tym, że inkubuje się przeciwciała dla PAI-1 z badaną próbką, w której oznacza się ten antygen i po odmyciu nieswoiście związanych białek, inkubuje się kompleks antygen-przeciwciało z przeciwciałami dla PA--1 związanymi z peroksydazą chrzanową, po czym oznacza się antygen wykrywając znacznik.

Wszystkie te metody wymagają zastosowania rodzimego białka PAI-1, zarówno do uzyskania krzywej wzorcowej, jaki i swoistych przeciwciał. PAI-1 występuje w ilościach śladowych w płynach ustrojowych i komórkach, a uzyskanie tego białka metodami klasycznymi przez wyodrębnienie w ilościach wystarczających do przygotowania testu Elisa jest niezwykle skomplikowane i czasochłonne. Z drugiej strony otrzymywane dotychczas ludzkie białko PAI-1 jest niezwykle drogie i niezbyt dostępne.

Wszystkie omówione metody otrzymania rodzimego PAI-1 są niezwykle skomplikowane, pracochłone i kosztowne, co zawyża w znacznym stopniu koszty całego testu.

Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest oznaczanie białka rodzimego PAI-1, w oparciu o metodę, w której stosuje się przeciwciała dla odpowiedniego fragmentu peptydowego. Stwierdzono, że można wykorzystać pełną reakcję krzyżową w teście immunologicznym przeciwciał otrzymanych dla fragmentu oraz rodzimej cząsteczki PAI-1.

W odróżnieniu od znanych metod oznaczania PAI-1, odpowiedni fragment peptydowy, a nie całe białko, może służyć do produkcji swoistych przeciwciał stosowanych w sposobie według wynalazku, rozpoznających w ten sam sposób zarówno fragment peptydowy, jak i rodzime białko PAI-1. Fragment ten również stosuje się do uzyskania krzywej wzorcowej.

Sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu w próbce zawierającej ten antygen, przez wytworzenie dwuskładnikowego antygenu w próbce z pierwszym przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, wytworzenie kompleksu trójskładnikowego przez skontaktowanie kompleksu dwuskładnikowego z drugim przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem i wykrywanie obecności kompleksu trójskładnikowego za pomocą sygnału tworzonego przez odczynnik dający się oznaczyć analitycznie lub wyznakowane przeciwciała przeriwimmunoglobulinowe, polega według wynalazku na tym, że jako jedno z tych przeciwciał stosuje się przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym Y oznacza sekwencję aminokwasów kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser, Z oznacza sekwencję Glu, Ser i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, a = 0 lub 1, b = 0, 1 lub 2, natomiast A oznacza fragment Asnm - Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu.

W sposobie według wynalazku stosuje się przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego, korzystnie otrzymanego przez ekspresję zrekombinowanego DNA.

W sposobie według wynalazku stosuje się przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego, korzystnie otrzymanego przez ekspresję zsyntetyzowanego chemicznie DNA o sekwencji:

164 952 (X)AAA6GeCCAGTGGAAGACCCCATTCCCAGACAGTAGCACCCACCGCCGCCTCTΤ

CCACAAATCAGACGGAAGCACTGTCTCTGTGCCAATGATGGCTGAGACCAACAAATT

TTTTTTTTTTTA/TTTlTTTTTTTTTTTTTTTTTATT ATTATGATATTTTTTAATTTTT

AT ACC AClbGAG AC ACT ( X ) _m, gdzie X oznacza GAATTT, n przyjmuje wartość 1 lub 0, a m przyjmuje wartość 0, 1 lub 2.

Zrekombinowany wektor można otrzymać łącząc znanymi metodami wektor z fragmentem DNA kodującym polipeptyd o wzorze (Y)a-A- (Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie.

W sposobie według wynalazku stosuje się przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego zawierającego epitopy antygenowe rozpoznawane przez przeciwciała również w rodzimej cząsteczce PAI-1.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi cząsteczki PAi-1 od 172 do 232 aminokwasu od N-końca o sekwencji:

172 177 192

Asn-Gl y-Gln-Trp-Lys-Thr-Pro-Phe-Pro-Asp-Ser-Ser-Thr-His-Ar g137 192 197

Arg-Leu-Phe-Ha s-Lys-S^r—Asp-Gly-Ser—Thr-Va1-Ser-Val-Pro-Met202 207 212

Met- Ala-Glu-Thr-Asn-Lys-Phe-Asn-T yr—Thr-GlLi-Phe-Thr-Thr-Pro2 1 7 2 17

Asp-Gly-His-Tyr-Tyr-Asp-I l e-Len-G lu-Leu-Pro-T yr-His-Gly-AspThr.

Badaną próbkę, w której wykrywa się i oznacza antygen PAI-1 kontaktuje się i inkubuje z przeciwciałami reagującymi specyficznie z tym antygenem. Utworzenie kompleksu dwuskładnikowego antygen-przeciwciało wykrywa się i oznacza za pomocą środka wykrywającego i sygnalizującego reakcję immunologiczną, jak na przykład przeciwciało reagujące specyficznie z t-PAjnakowane odczynikiem dającym się oznaczyć analitycznie.

Środek wykrywający i sygnalizujący reakcję immunologiczną może być obecny podczas inkubowania antygenu z przeciwciałem. Na przykład można bezpośrednio wyznakować przeciwciała kontaktowane z badaną próbkąJ po przemyciu produktu reakcji uzyskać sygnał. Środkiem jest wówczas sam znacznik. Środek wykrywający można też dodać dopiero po wytworzeniu kompleksu dwuskładnikowego i usunięciu nieprzereagowanego materiału. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się wówczas następująco: dwuskładnikowy kompleks antygenprzeciwciało po odmyciu kontaktuje się z drugim przeciwciałem reagującym specyficznie z PAI-1, przy czym jako jedno z tych przeciwciał stosuje się przeciwciało dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie. Pozostałym (pierwszym lub drugim) przeciwciałem może być przeciwciało dla całej cząsteczki PAI-1. Otrzymuje się wówczas kompleks trójskładnikowy przeciwciało-antygenprzeciwciało. Drugie przeciwciała mogą być bezpośrednio znakowane odczynnikiem dającym

164 952 się oznaczyć analitycznie. Altanatywnie, jako środek stosuje się układ dwuskładnikowy zawierający drugie przeciwciała tworzące kompleks trójskładnikowy, który wykrywa się za pomocą przeciwciała przeciwimmuglobulinowego.

Gen kodujący fragment polipeptydowy odpowiadający fragmentowi ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu można na przykład otrzymać z oligonukleotydowych fragmentów ligowanych in vitro.

Oligonukleotydowe fragmenty można zsyntetyzować chemicznie na nośniku poprzez kolejne przyłączanie nukleozydów z zablokowanymi grupami czynnymi. Korzystnie do ochrony funkcji aminowej stosuje się grupę izopropoksyacetylową, co przedstawiono w opisie patentowym RP nr 159 234.

Fragmenty oligonukleotydowe zsyntetyzowane chemicznie poddaje się enzymatycznej reakcji kinazowania, w trakcie której wprowadza się fosforan końcach 5' za pomocą kinazy polinukleotydowej i ATP. Kinazowane oligonukleotydy liguje się in vitro w dwuniciowe odcinki ograniczone sekwencjami rozpoznawanymi przez enzymy restiykcyjne. Zligowane odcinki klonuje się w wektorze pomocniczym, stosując właściwe miejsce restrykcyjne polilinkera. Poprawność sekwencji produktów ligowania i klonowania tych fragmentów sprawdza się poprzez sekwencjonowanie metodą Maxama- Gilberta. Można stosować różne wektory pomocnicze, np. plazmidowe lub fagowe, przy czym korzystne są plazmidy, np. pUC19. Sklonowane w wektorze odcinki DNA namnaża się w komórkach gospodarza, którymi mogą być bakterie, drożdże i inne. Wektory z wklonowanymi odcinkami izoluje się, a następnie odcinki odzyskuje się po trawieniu restrykttozami na drodze elektroforezy w żelu poliakryloamidowym. Ozyskane odcinki włącza się do wektora ekspresyjnego po trawieniu odpowiednimi enzynami resttykcyjnymi. Na tym etapie stosuje się różne wektory ekspresyjne, korzystnie plazmidowe lub fagowe. Przykładowo plazmid ekspresyjny pWR 450.1. zawiera gen kodujący β-galaktozydazę. Komórki gospodarza, korzystnie bakterii transformowane zrekombinowanym wektorem, są po namnożeniu źródłem fragmentu białka ludzkiego PAI-1.

Wytworzony w ten sposób fragment białka PAI-1 można używać do otrzymywania stosowanych w sposobie według wynalazku przeciwciał, różnymi znanymi metodami, a także do wykreślenia krzywej wzorcowej niezbędnej do ilościowego oznaczania PAI-1.

Przykładowy sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu polega na tym, że immunizuje się zwierzęta polipeptydem odpowiadającym fragmentowi o wzorze (Y)_a-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, pobiera się krew i odzyskuje przeciwciała.

Otrzymane w ten sposób przeciwciała można zastosować w sposobie według wynalazku, do oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu oraz do otrzymania testu diagnostycznego według wynalazku.

Wykrywanie i oznaczanie sposobem według wynalazku dogodnie jest prowadzić za pomocą testu diagnostycznego według wynalazku.

Test diagnostyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera pierwsze przeciwciała reagujące specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu oraz układ do oznaczania i/lub wykrywania kompleksu antygen- przeciwciało zawierający drugie przeciwciała zdolne do specyficznego reagowania z ludzkim inhibitorem tkankowego aktywatora plazminogenu oraz ewentualnie przeciwciała przeccwimmunoglobulinowe, przy czym jedne z tych przeciwciał stanowią przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)_a-A-(Z)b, w którym Y oznacza sekwencję aminokwasów kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser, Z oznacza sekwencję Glu, Ser i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, a = 0 lub 1, b=0, 1 lub 2, natomiast A oznacza fragment Asm - Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu, ewentualnie unieruchomione na całym nośniku lub rozpuszczone w fazie ciekłej.

Test według wynalazku, korzystnie zawiera przeciwciała związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie.

Test według wynalazku zawiera przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego, korzystnie otrzymanego przez ekspresję zrekombinowanego DNA.

164 952

Test według wynalazku zawiera przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego, korzystnie otrzymanego przez ekspresję zsyntetyzowanego chemicznie DNA o sekwencji:

( X ) „AACGGCCAGTGGAAGACACCAT TCCCAGACAGTAGCACCCACCGCCGCCTCT T

CCACAAATCAGACGGAAGCACT GTCTCTGTGC.CAATGATGGCTGAGACCAACAAATT

CAACTATACTGAATTCACCACGCCAGATGGACATTACTACGACATCCTGGAACTGCC

ATACCACGGAGACAGT(X)m, gdzie X oznacza GAATCT, n przyjmuje wartość 1 lub 0, a m przyjmuje wartość 0, 1 lub 2.

Zrekombinowany wektor, stosowany do ekspresji fragmentu polipeptydowego służącego do wytworzenia zawartych w teście według wynalazku przeciwciał, otrzymuje się łącząc znanymi metodami wektor z fragmentem DNA kodującym polipeptyd o wzorze (Y)_a-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie.

Korzystnie test według wynalazku zawiera przeciwciała dlapolipeptydu odpowiadającego fragmentowi cząsteczki PAI-1 od 172 do 232 aminokwasu od N-końca o sekwencji:

172 177 182

Asn-Gl y-Gln-Trp-Lys-Thr -Pro--Phe-Pro-Asp-Ser-Ser-Thr—His-Arq -187

192

197

Arg-Leu-Phe-His-Lys-Ser-Asp-G l y-Ser—Thr—Va 1 -Ser-Va l -Pro-Met202 207 212

Met-Al a-Glu-Thr-Asn-Lys-Phe-Asn-Tyr—Thr—Glu-Phe-Thr—Thr—Pro217 222 227

Asp-Gly-His-Tyr-Tyr—Asp-I le-Leu-Glit-Leu-Pro-Tyr—His-Gly-AspThr.

Test według wynalazku zawiera przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego zawierającego epitopy antygenowe rozpoznawane przez przeciwciała również w rodzimej cząsteczce PAI-1.

Do znakowania można stosować enzym, biotynę, izotop promieniotwórczy, przykładowo ’2j lub inne znane odczynniki. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się za pomocą sygnału wytwarzanego przez znacznik.

W tak prowadzonym procesie oznaczania lub wykrywania badaną próbkę, oznaczany antygen lub przeciwciało, unieruchamia się na stałym nośniku takim jak płytka plastikowa, bibuła nitrocelulozowa lub inne.

W sposobie i testach do oznaczania ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu można stosować przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, wytworzone różnymi metodami.

Celem uproszczenia w opisie i przykładach używane są następujące skróty:

A: adenina

C cytozyna

G: guanina

T: tymina

164 952

Ala: alanina

Arg: arginina

Asn: asparagina

Asp: kwas asparaginowy

Tys: cysteina

Gin: glutamina

Glu: kwas glutaminowy

Gly: glicyna

His: histydyna

Ile: izoleucyna

Leu: leucyna

Lys: lizyna

Met: metionina

Phe: fenyloalanina

Pro: prolina

Ser: seryna

Thr: treonina

Trp: tryptofan

Tyr: tyrozyna

Val: walina

DNA: kwas deoksyiybonukleinowy cDNA: komplementarny DNA

Tris-HO: chlorowodorek trójhydroksymetyloaminometanu EDTA: kwas etylenodwuaminoczterooctowy

10xbufor Eco R1 100 mM Tris-HO pH 7,5

M NaTl mM β-merkaptoetanol

10xbufor do kinazowania 0,7 M Tris HO pH 7,6 0,1 M MgOi 50 mM ditiotreitol

10xbufor ligacyjny: 660 mM Tris-HO pH 7,6 mM MgO2 50 mM ditiotreitol 10 mM ATP

Bufor do ekstrakcji

Pożywka LB

Bufor TE Bufor z SDS

Bufor do lizy komórek

Bufor R I mM Tris-HO pH 8,0 300 mM octan sodu 0,2% SDS mM EDTA g Bacto Trypton g Yeast Extract g NaO na 1 litr roztworu 10 mM Tris-HO pH 8,0 1 mM 10 g Tris-HT pH 8,0 77 g glicyny g SDS na 1 litr roztworu 150 mg Tris 400 mg SDS ml β-merkaptoetano l ml glicerolu 7 ml wody mM glukoza 10 mM EDTA 25 mM Tris-HO pH 8,0 4 mg/ml lizozymu (Pharmacia)

164 952

Bufor R II 0,2 M NaOH

1% SDS

Bufor R III 60 ml 5 M octan potasu

11.5 ml kwas octowy lodowaty

28.5 ml H2O

DTT: ditiotreitol

PMSF: fluorek kwasu fenylometylosulfonowego

SDS: siarczan dodecylu sodu

BSA: albumina surowicy wołu (Bovine Serum Albumin)

PBS: zbuforowany roztwór soli fizjologicznej

ATP: trójfosforan adenozyny.

HPLC: wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa.

EDTA: etylenodiaminotetraoctan

Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia wykres hydrofobowości łańcucha polipeptydowego PAI-1. Fig. 2 przedstawia sekwencję fragmentu genu ludzkiego PAI-1 podzieloną na fragmenty syntetyzowane chemicznie. Fig. 3 przedstawia schemat konstrukcji fragmentu genu dla PAI-1 sklonowanego w wektorze rekombinacyjnych pUC-19 oraz ekspresyjnym pWR 450. Fig. 4 przedstawia elektroforezę w żelu poliakryloamidowym zawierającym SDS ekstraktów białkowych otrzymanych z komórek E.coli oraz oczyszczonego kompleksu białkowego PAI-1 z β-galaktozydazą: 1 - ciałka inkluzyjne rozpuszczone w zbuforowanym roztworze 6 molowego mocznika, 2 - oczyszczone białko hydrobowe p-galaktozydaza - fragment peptydowy PAI-1. Fig. 5 przedstawia schemat rozbicia kompleksu białkowego i oczyszczania fragmentu Asnn2Thr232 PAI-1. Przedstawione odcinki β-gaaaktozydazy przypadają na długość od 4 do 182 aminokwasów. Fragment PA--1 po rozbiciu kompleksu składa się z 61 aminokwasów.

Wynalazek jest bliżej wyjaśniony w przykładach wykonania nie ograniczających jego zakresu.

Przykład I.

Etap 1.

A. Synteza oligonukleotydów.

Syntezę 10 oligonukleotydowych fragmentów (fig.2) przeprowadza się metodą amidofosforynową na stałym nośniku. Jako nośnik stosuje się szkło o kontrolowanej porowatości, typu LCA-CPG, ze związaną pierwszą jednostką nukleozydową. Jednostka ta ma przyłączoną na końcu 5’-OH deoksyrybozy blokującą grupę kwasolabilną - dimetoksytrityl (DMT), którą usuwa się w środowisku kwaśnym. Odsłonięta w ten sposób grupa 5’-OH jednostki nukleozydowej przyłącza prekursor kolejnej jednostki: 3’- amidofosforyn odpowiedniego nukleozydu. Za pomocą jodu w obecności wody dokonuje się utlenienia grupy fosforynowej do fosforanu. Następnie usuwa się DMT z przyłączonej jednostki - tym samym cykl rozpoczyna się na nowo. W celu usunięcia nieprzereagowanych jednostek z wolnymi grupami 5’-OH stosuje się t.zw. 'capping, tj. zablokowanie pomyłkowych sekwencji przez acetylowanie bezwodnikiem octowym w obecności aktywatorów. Po utworzeniu żądanego oligonukleotydu odcina się go od złoża i usuwa inne grupy wodnym roztworem amoniaku, oczyszcza elekroforetycznie następnie odsala metodą HPLC. (Waters C-18 RP, 10 gm). Oligonukleotydy przechowuje się w porcjach po ok. 0,5 OD.

B. Proces kinazowania i ligacji.

Poszczególne fragmenty nici DNA rozpuszcza się w wodzie destylowanej, tak aby w 5 μ1 znajdował się 1 μ g fragmentu. Miesza się po 5 μΐ roztworu fragmentów od 1 do 5 (I nić DNA) i od 5 do 10 (II nić DNA). Do mieszaniny fragmentów dodaje się 0,1 objętości buforu do kinazowania (50 mM Tris-HCl, 5 iM MgCh), 5 il 20 mM ATP, 1 il kinazy polinukleotydowej B (T4 polinukleotide kinase). Reakcję prowadzi się przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Miesza się obie nici i inkubuje przez 20 minut w temperaturze 100°C. Po powolnym ostudzeniu dodaje się do każdej próbki po 0,1 objętości buforu do ligacji, po 1 pl 200 mM ATP, 1 μΐ ligazy T4. Po dokładnym wymieszaniu reakcję prowadzi się przez 12 godzin w temperaturze 4°C.

164 952

T Hydroliza enzymami.

Do rozpuszczonego DNA (80 gl) dodaje się 10χ10μΐ buforu EcoRi, 2U restryktazy EcoRI (firmy Pharmacia) oraz wody do objętości 100 μΐ. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37°T przez 2 godziny. Po tym czasie DNA strąca się etanolem, dodając 3 objętości alkoholu etylowego (99,8%), wymraża się w -20°T przez 5 minut, a następnie odwirowuje się przy 15 tys. obr., przez 5 minut. Osad rozpuszcza się w 20 gl buforu TE. W ten sam sposób postępuje się podczas hydrolizy resttykttatą Pst I.

D. Rozdział elektroforetyczny.

W celu sprawdzenia czy zligowane fragmenty DNA mają odpowiednią długość, rozdziela się je w 8% żelu poliakrylotamidowym z SDS w TBE. Rozdział prowadzi się przy napięciu 130 V w ciągu 3 godzin. Żel zabarwia się bromkiem etydyny (0,5 pg/ml - firmy Serva) przez 20 minut w temperaturze pokojowej, następnie płucze się 2 x wodą destylowaną. Rozdzielone produkty obserwuje się pod lampą UV. W celu oceny wielkości fragmentów DNA podczas elektroforezy używa się następujących wzorców: pUT 19 trawiony Msp, pUT 19 trawiony Bsp RI. Zligowane fragmenty posiadają oczekiwaną długość. Po elektroforezie sprawdzającej wykonuje się elektroforezę preparatywną i uzyskuje się tą drogą fragment, który następnie liguje się z plazmidem pUT 19 trawionym Eco Ri i Pst I w sposób wyżej opisany.

E. Przygotowanie kompetentnych komórek.

Z płytki z wysianymi Bakteriami DHS, pobiera się jedną kolonię, którą szczepi się w 5 ml pożywki LB. Bakterie hoduje się w temperaturze 37°T przez 18 godzin. Do 100 ml pożywki LB dodaje się 2 ml otrzymanej hodowli i prowadzi się hodowlę do gęstości optycznej OD 600=0,3. Zawiesinę bakterii zwirowuje się (5 tys. obr. 20 min), a osad bakteryjny schładza się i zawiesza w 50 ml buforem Sb i umieszcza w temperaturze 0°T. Zwirowuje się jak wyżej, a osad zawiesza w 1/12 objętości wyjściowej buforem SB. Inkubuje się 20 minut w temperaturze 0°T. Po tym czasie z zawieszonych komórek pobiera się do sterylnych próbek po 200 μΐ zawiesiny komórek i inkubuje 30 minut w 0°C Dodaje się 7 gl DTT i plazmidy (20 μl). Inkubuje się w lodzie (0°ϋ) 30 minut, a następnie 45 sekund w 45°C Ochładza się w lodzie i dodaje 800 μ l pożywki LB, a następnie inkubuje 1 godzinę w 37°G. Po tym czasie posiewa się na płytki. Wylewa się 200 μl mieszaniny ligacyjnej na płytkę i inkubuje się w 37°T przez 18 godz.

F. Analiza otrzymanych transformantów.

Po 18 godzinach na płytce z wysianą mieszaniną transformacyjną obserwuje się pojedyncze kolonie. Do dalszej analizy wybiera się 10 kolonii. 5 ml pożywki szczepi się pojedynczymi koloniami i hoduje w 37°T przez 18 godzin, a następnie izoluje plazmidowy DNA. Preparatyka plazmidowego DNA z 5 ml pożywki przebiega w następujący sposób: Bakterie zwirowuje się (5 minut 5 obr./min.). Osad bakteryjny zawiesza się w 200 μl buforu RI i przetrzymuje 5 minut w temperaturze 0°T. Dodaje się 400 pl RH (0°T), a następnie 300 μΐ RUI (0°T). Tałość zwirowuje się (15 tys.obr./min., 5 minut), supernatant przenosi się znad osadu do nowej probówki i dodaje się 2,5 objętości izopropanolu. Wymraża się w -20°G, zwirowuje, osad płucze 70% etanolem i suszy pod próżnią. Osad rozpuszcza się w 200 μΐ TE i dodaje 20 μΐ roztworu RNazy o stężeniu 1 mg/ml. Inkubuje się 30 minut w 37°ϋ. Dodaje się 200 μΐ fenolu. Zbiera się fazę wodną i dodaje 200 μΐ mieszaniny chloroform/alkohol izoamylowy (24; 1, v/v). Zwirowuje się, zbiera supernatant, czynność powtarza się jeszcze raz. Do fazy wodnej dodaje się 0,1 objętości 3 M octanu sodu (pH=5,2) oraz 2,5 objętości etanolu i wymraża 30 minut w -20°T. Zwirowuje się (15 tys. obr./min.), osad przemywa 70% etanolem i suszy. Osad plazmidowego DNA rozpuszcza się w 40 μΐ buforu TE.

W celu wybrania klonu zawierającego plazmid pUT 19 z wklonowanym dwuniciowym fragmentem, przeprowadza się analizę otrzymanych dNa plazmidowych przy użyciu enzymów resttykcyjnych EcoRI i Pst I, a produkty trawienia rozdziela się w żelu poliakryloamidowym. Trawienie przeprowadza się jak w punkcie T, a rozdział elektroforetyczny jak w D.

G. Sprawdzenie sekwencji sklonowanych fragmentów.

W celu upewnienia się czy sekwencja sklonowanego fragmentu jest prawidłowa, fragmenty sekwencjonuje się metodą Maxama i Gilberta (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 1980, 65).

164 952

U

H. Konstrukcja wektora ekspresyjnego.

Sprawdzony dwuniciowy fragment DNA kodujący polipeptyd Asnn22 Thr232, liguje się z wektorem ekspresyjnym pWR,450 trawionym enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Pst.I. Uzyskuje się zrekombinowany plazmid ekspresyjny Pw-PAI-1. Transformowanie komórek bakteryjnych prowadzi się jak w punkcie E.

I. Oczyszczanie ciałek inkluzyjnych.

Bakterie z kolonii bakteryjnej zawierającej zrekombinowany plazmid przenosi się do probówki zawierającej 1 ml pożywki LB + 5 gl ampicyliny o stężeniu 100 gg/ml i inkubuje przez 2 - 5 godzin w temperaturze 37°C, z ciągłym wytrząsaniem. Zawiesinę bakterii namnożonych w tej probówce przenosi się do kolby zawierającej 1 1 pożywki LB + 1 ml ampicyliny o stężeniu 100 μ g/ml. Hodowlę prowadzi się 14 godzin, w temperaturze 37°C z ciągłym wytrząsaniem. Następnie bakterie zwirowuje się (15 min., 5000 ob./min) i osad zawiesza się w 200 ml 0,1 M CaCh (buforowanym Trisem, pH=7,5). Po inkubacji przez 20 minut w łaźni lodowej, zawiesinę wiruje się przez 20 minut przy 12000 obr./min. w temperaturze +4°C i osad ponownie zawiesza się w 200 ml 0,1 CaCh. Po kolejnej inkubacji przez 2 godziny w łaźni lodowej zawiesinę wiruje się (w dwóch probówkach wirowniczych) j.w.. Osad zawiesza się w 20 ml (do obu probówek dodaje się po 20 ml) buforu fosforanowego, pH 6,2, a następnie dodaje się po 200 gl i M glicerolu i 400 gl 1% glicerolu do obu probówek. Ogrzewa się je do temperatury pokojowej, dodaje do 40 gl 0,5 M EDTA, pH 8,0 i po krótkiej inkubacji schładza w łaźni lodowej do temperatury około 0°C. Następnie probówki wstawia się na 1 minutę do łaźni o temperaturze 42°C (szok termiczny). Wiruje jak wyżej. Osad po schłodzeniu zawiesza się w 100 ml 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, zawierającym 10 mM EDTA, inkubuje przez 5 minut w temperaturze 0°C i odwirowuje. Osad zawiesza się w 35 ml 100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 100 mM β-ME, 1 mM PMSF, 1% Triton Χ-100, pH 8,0. Poddaje się go działaniu ultradźwięków - 10 razy po 30 sek., po czym odwirowuje się (20 000 obr./min., 30 min., temp. +4°C) otrzymując w ten sposób osad ciałek inkluzyjnych, które następnie przemywa się zawieszając je w 35 ml buforu 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA. Po ponownym ich żwirowaniu rozpuszcza się je w 9 M moczniku. W celu pozbycia się reszty zanieczyszczeń (nierozpuszczonych ciałek inkluzyjnych) zawiesinę ponownie wiruje się (20 000 obr./min., 30 min., temp. +4°C). W supernatancie winna znajdować się główna część białka. Dalsze oczyszczania białka hybrydowego zawierającego fragment Asnt72-Thr232 PAI-1 przeprowadza się na kolumnie dEaESephacel.

Białka zawarte w ciałkach inkluzyjnych rozpuszczone w 9 M moczniku dializuje się do roztworu 6 M mocznika, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, zawierającego 10 mM EDTA, 1 mM PMSF. Tym samym buforem równoważy się dwie kolumny wypełnione złożem DEAE-Sephacel (o wymiarach 2,5 x 10 cm). Na jedną z nich nanosi się roztwór białek. Część białka, która po przejściu przez kolumnę nie zwiąże się ze złożem, nanosi się (po 2 -3 krotnym rozcieńczeniu tym samym buforem) na drugą kolumnę. Czysty koniugat wymywa się ze złoża 0,1 M NaCl.

J. Rozbicie kompleksu na drodze reakcji chemicznej.

Oczyszczone białko hybrydowe złożone z fragmentu β- galaktozydazy oraz fragmentu Asni72-Thr232 PAI-1 dializuje się wobec buforu 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 w celu usunięcia mocznika, a następnie liofilizuje. Rozszczepienie wiązania Asn-Gly przeprowadza się stosując 2M hydroksyloaminę w 6M chlorowodorku guanidyny, pH 9,3. Reakcję prowadzi się w temperaturze 45°C. Rozbicie koniugatu sprawdzano elektroforetycznie.

Produkty powstałe w wyniku tej reakcji analizuje się na żelu poliakryloamidowym po elektroforezie.

K. Sposób wyodrębniania fragmentu Asni72-Thr232 (PAI-1) ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu za pomocą HPLC.

Fragment polipeptydowy odpowiadający fragmentowi Asni72-Thr223 (PAI-1) ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatoraplazminogenu izoluje się z hydrolizatu otrzymanego w sposób jak opisano w punkcie I za pomocą HPLC. Rozdział chromatograficzny prze prowadzono na kolumnie semipreparatywnej TSK G3000SW firmy LKB, Szwecja.

164 952

Etap 2.

A. Otrzymanie przeciwciał przy wykorzystaniu wytworzonego fragmentu polipeptydowego.

W celu otrzymania surowicy poliklonalnej dla fragmentu białka ludzkiego PAI-1 immunizuje się tym białkiem króliki. Śródskóriie podaje się na drodze 30 - 40 iniekcji dawki 50 |g antygenu w 0,5 ml PBS i wymieszanego z 0,5 ml kompletnego adiuwantu Freuda. Po 7 dniach od każdego szczepienia pobiera się krew z żyły usznej królików. Po wykrzepieniu w temperaturze 37°C przez 0,5 -1,0 godziny, skrzep oddziela się od ścianek probówki i całość pozostawia w temperaturze 4°C na 12 -24 godziny. Następnie surowicę odciaga się do jałowych probówek wirówkowych i wiruje przy 3000 obr/min przez 20 minut. Surowicę inaktywuje się podczas inkubacji przez 30 minut w temperaturze 56°C. Miano poszczególnych próbek surowic określa się metodą radioimmunologiczną, oznaczając ich zdolność do wiązania znakowanego antygenu. Surowica o najwyższym mianie przeciwciał przechowuje się w temperaturze -20°C.

B. Oczyszczanie przeciwciał.

Przeciwciała dla fragmentu PA--1 oczyszcza się z surowicy odpornościowej za pomocą chromatografii powinowactwa. Immunoadsorbent zawiera fragment białka PAI-1 zwiazany ze złożem CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia). W celu przygotowania immunoadsorbentu 1 g złoża przemywa się 200 ml roztworu 0,001 mol/l HCI i następnie zawiesza w buforze boranowym (pH 8,3). Natychmiast dodaje się 20 mg fragmentu białka PAI-1 rozpuszczonego w PBS i delikatnie miesza w temperaturze 4°C przez 2 godz. Po odwirowaniu sprawdza się stężenie białka w supematancie. Złoże zawiesza się następnie w roztworze glicyny (2 ml/l) w buforze boranowym o pH 8,3. Po 1 -godzinnej inkubacji odwirowuje się je (10 min. 4000 obr/min) i przemywa się je 3% buforem boranowym (pH 8,3), 1% wodą destylowaną, 3% buforem boranowym (pH 8,3). Z otrzymanym w ten sposób złożem inkubuje się 15 ml surowicy, otrzymanej po immunizacji fragmentem białka PAI- 1, delikatnie mieszając przez 12-14 godzin w temperaturze 4°C. Do mieszaniny dodaje się 1 mM PMSF (Sigma) oraz 1 mM chlorku benzamidyny (Biochemical). Po odwirowaniu (10 min., 3000 obr/min) złoże przemywa się buforem (PBS z 1% Tween 20), a następnie 4% buforem (1 M/l NaCl z 1% Tween 20 w PBS). Po każdym wirowaniu sprawdza się zawartość białek w supemantancie poprzez pomiar adsorpcji światła przy 400 nm. Następnie złoże umieszcza się w kolumnie (0,7% 10 cm). Przeciwciała specyficznie związane z unieruchomionym na złożu białek eluuje się roztworem 0,5 mol/l kwasu octowego i zbiera się do probówek zawierajacych 100 μ l roztworu 2ml/I Tris. Frakcje o dużej zawartości białka łączy się i dializuje wobec PBS przez 24 godziny w 4°C.

C. Sprzęganie przeciwciał z peroksydazą.

Uzyskane w ten sposób przeciwciała dla fragmentu białka PAI-1 sprzęga się z peroksydazą. W tym celu rozpuszcza się 5 mg HRPO w 1 ml świeżo przygotowanego 0,3 M kwaśnego węglanu sodu (NaHCO3), pH 8,1. Następnie dodaje się 0,1 ml 1% FDNB w alkoholu absolutnym. Delikatnie wytrząsa się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodaje 0,04 - 0,08 M NaJO4 (rozpuszcz. w wodzie destyl.), delikatnie miesza przez 30 min. w temperaturze pokojowej. Kolor tego roztworu winien stać się zielonożółty. Następnie dodaje się 1,0 ml 0,16 m glikolu etylenowego (rozp. w wodzie dest.) i delikatnie miesza w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po zakończeniu inkubacji roztwór dializuje się wobec 0,01 M węglanu sodu, pH 9,5, temperatura 4°C (conajmniej 3 l- litrowe zmiany). Do 3 ml roztworu tak przygotowanego aldehydu peroksydazy (HRPO) dodaje się 5 mg IgG i delikatnie miesza przez 2-3 godzin w temperaturze pokojowej. IgG rozpuszcza się w 1 ml buforu węglanowego przed zmieszaniem lub dodaje w postaci zliofilizowanego proszku wolnego od soli. Po dodaniu IgG wprowadza się 5 mg NaBH4 i pozostawia w 4°C od 3 do 12 godzin. Następnie roztwór dializuje się w 4°C wobec PBS. Jeśli powstaje precypitat, usuwa się go przez wirowanie. Próbkę nanosi się na kolumnę (85 x 1,5 cm). Sephadex G-100, zrównoważoną PBS. Zbiera się frakcję po 1,5 ml i poziom białka w poszczególnych frakcjach oznacza spektrofotometrycznie. Frakcja IgG znakowanych HRPO schodzi w pierwszym szczycie. Roztwory tego koniugatu przechowuje się w obecności albuminy surowicy wołowej o stężeniu 10 mg/ml w temperaturze -20°C.

164 952

Etap 3.

Opłaszczanie płytki przeć cwciałami i wykonanie testu ELISA.

Studzienki w płytce do testu ELISA opłaszcza się przeciwciałami poliklonalnymi dla fragmentu polipeptydowego Asnn2-Thr232 białka PAI-1 o stężeniu 10 |gml, zawieszonymi w 50 mM buforze fosforanowym o pH 7,5. Niezwiązane białko odmywa się, a powierzchnię studzienek opłaszcza albuminą surowiczą. Testowane próbki osocza rozcieńcza się przed oznaczeniem 50 mM buforem fosforanowym, pH 7,5, zawierającym 0,15 M Nad, 10 mM EDTA, 1 % Tween 20 i 1 % BSA i dodaje się po 200 μΐ/dołek. Inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji płytki 5-krotnie przemywa się 0,15 M Nad zawierającym 0,1% Tween 20. Następnie dodaje 200 μΐ koniugatu IgG-HRP (przeciwciała poliklonalne dla całej cząsteczki PAI-1 związane z peroksydazą) o stężeniu 5 μg/mΐ. Inkubuje się 2 godziny w temperaturze pokojowej i ponownie 5-krotnie przemywa. W celu wywołania reakcji enzymatycznej dodaje się po 200 μΐ roztworu substratu (0,4 mg/ml ortofenylodiaminy w 0,05 M buforze cytrynianowym, pH 5,0, zawierającym 0,02% H2O2). Po 15 minutach inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 50 μΐ 3 M kwasu siarkowego. Absorbancję mierzy się przy 490 nm.

Przykład II.

Detekcja antygenu PAI-1 w badanej próbce za pomocą przeciwciał dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego fragmentowi Asni72- Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu.

Do unieruchomionego antygenu dodaje się wyznakowane peroksydazą przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego fragmentowi Asni72-Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu i inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Do wywołania reakcji enzymatycznej stosuje się roztwór substratu - 0,4 mg/ml ortofenylodiaminy w 0,05 M buforze cytrynianowym, pH 5,0, zawierającym 0,025 H2O2). Po 6 minutach inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 50 μΐ 3 M kwasu siarkowego. Absorbancję mierzy się przy 490 nm. Wynik odczytuje się z krzywej wzorcowej dla standartowego roztworu PAI-1.

Przykład III.

Diagnostyczny zestaw testowy dla oznaczania poziomu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu składa się z: pojemnika zawierającego zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS), pH 7,5, EDTA, Tween 20; pojemniczka z albuminą surowiczą; pojemniczka z przeciwciałami dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego fragmentowi Asni72Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu; pojemniczka z wyznakowanymi peroksydazą przeciwciałami dla PAI-1; pojemniczka z substratem (ortofenylodiaminą); pojemniczka z buforem cytrynianowym, pH 5,0 i pojemniczka z 3 M kwasem siarkowym.

164 952

GAATCTAACGGCCAGTGGAAGACACCATTCCCAGACAGTAGCACCCACCGCCGCCTCTTCCA

GATTGCCGGTCACCTTCTGTGGTAAGGGTCTGTCATCGTGGGTGGCGGCGGAGAAGGT

CAAATCAGACGGAAGCACTGTCTCTGTGCCAATGATGGCTGAGACCAACAAATTCAACTATA

GTTTAGTCTGCCTTCGTGACAGAGACACGGTTACTACCGACTGTGGTTGTTTAAGTTGATAT

CTGAATTCACCACGCCAGATGGACATTACTACGACATCCTGGAACTGCCATACCACGGAGAC

GACTTAAGTGGTGCGGTCTACCTGTAATGATGCTGTAGGACCTTGACGGTATGGTGCCTCTG

ACT

TGAATCT

3'

5’

1. CGGTCACCTTCTGTGGTAAGGGTCTGTC

2. AlCGTGGGTGGCGGCGGAGAAGGTGTTTAGTCTGCCTTCG dolna nić

3. TGACAGAGACACGGTTACTACCGACTCTGGTTG

4. TTTAAGTTGATATGACTTAAGTGGTGCGGTCTACCTGTAA

5. TGATGCTGTAGGACCTTGACGGTATGGTGC.CTCTGTGA/.TCT

6. TCACAGAGGCACCATACCGTCAAGGTCCTACAGCATCĄTTAC

7. AGGTAGACCGCACCACTTAAGTCATATCAACT

0.TAAACAACCAGAGTCGGTAGTAACCGTGTCTCTGTCACGA górno nić

9. AGGCAGACTAAACACCTTCTCCGCCGCCACCCAC

10. GATGACAGACCCTTACCACAGAAGGTCACCGGCAATCTAAG.

Fig. 2

164 952

Eco RI

Fig. 3

164 952

r :

2

Fig.4

164 952

BETA - CALAKIOZYUAZA : BIAŁKO PAŁ

produkty degradacji beta-galaklozydazy białko PAI

oczyszczenie produktów hydrolizy

Fig-5

164 952

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu w próbce zawierającej ten antygen, przez wytworzenie kompleksu dwuskładnikowego antygenu w próbce z pierwszym przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, wytworzenie kompleksu trójskładnikowego przez skontaktowanie kompleksu dwuskładnikowego z drugim przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem i wykrywanie obecności kompleksu trójskładnikowego za pomocą sygnału tworzonego przez odczynnik dający się oznaczyć analitycznie lub wyznakowane przeciwciała przei^ćwimmunoglobulinowe, znamienny tym, że jako jedno z tych przeciwciał stosuje się przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)₂-A-(Z)b, w którym Y oznacza sekwencję aminokwasów kodowaną przez fragment polilinkcra, korzystnie Glu, Ser, Z oznacza sekwencję Glu, Ser i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, a = 0 lub 1, b = 0, 1 iub 2, natomiast A oznacza fragment Asnm - Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego, otrzymanego przez ekspresję zrekombinowanego DNA.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego otrzymanego przez ekspresję zsyntetyzowanego chemicznie DNA o sekwencji:

(X^r,AC.CGGCAGTGGAAGAAAACATTTCCCAGACAGTGGAACCCACCGCCSCCTCTT

CCACAAATCAGi^l^t^l^^i^i^C^C^I^CTGTCTCTGTGCCAATGATGGCTGAGACCAACAAATT

TAATThTATTGAATTCACCACGCTAGATGGATATT ATT^(^(^»^(^^iATiTTTGGAATTGTT

ATACCACGGASACACT(X gdzie X oznacza GAATCT, n przyjmuje wartość 1 lub 0, a m przyjmuje wartość 0, 1 lub 2.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego o sekwencji aminokwasów:

Asn-Bly-Gln-Trp-Lys-Thr—Pro-Phe-Pro-Asp-Ser—Ser-Thr-His-ArgArg-Leu-Phe-His-Lys-Ser-Asp-Gly-Ser-Thr-Val -Ser -Val-Pro-MetMet-Ala-Glu-Thr-Asn-Lys-Phe-Asn-Tyr-Thr -Glu-Phe-Thr -Thr-FroAsp-Gly-His-Tyr-Tyr-Asp-I le-Leu-Glu-Leu-Pro-Tyr-His-Gly-AspThr.
5. Test diagnostyczny do oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu, z zastosowaniem przeciwciał i odczynnika dającego się oznaczyć analitycznie, znamienny tym, że zawiera pierwsze przeciwciała reagujące specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu oraz układ do oznaczania i/lub wykrywania kompleksu antygen-pi zecćwci ało zawierający drugie przeciwciała

164 952 zdolne do specyficznego reagowania z ludzkim inhibitorem tkankowego aktywatora plazminogenu oraz ewentualnie przeciwciała przedwimmunoglobulinowe, przy czym jedne z tych przeciwciał stanowią przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym Y oznacza sekwencję aminokwasów kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser, Z oznacza sekwencję Glu, Ser i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, a = 0 lub 1, b = 0, 1 lub 2, natomiast A oznacza fragment Asni2 - Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu, ewentualnie unieruchomione na stałym nośniku lub rozpuszczone w fazie ciekłej.
6. Test według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego, otrzymanego przez ekspresję zrekombinowanego DNA.
7. Test według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego otrzymanego przez ekspresję zsyntetyzowanego chemicznie DNA o sekwencji;

(X) „AACGGCCAGTGGAAGACACCATTCCCAGACAGTASCACCCACCGCCGCCTCTT

CCACAAATCAGACGGAAGCACTGTCTCTGTGCCAATGATGGC7GAGACCAACAAA7T

CAACTATACTGAATTCACCACGCCAGATGGACATTACTACGACATCC f GGAACTGCC

ATACCACGGAGACACT( X)„, gdzie X oznacza GAATCT, n przyjmuje wartość 1 lub 0, a m przyjmuje wartość 0, 1 lub 2.
8. Test według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego o sekwencji:

Asn-G 1 y-Gln-T r ρ-L <s-Thr-Pro-Phe-F'ro-Aę p-Ser-Ser—Thr-His-ArgArg-Leu-Phe-His-Lys-Ser-Asp-G 1 y-Ser-Thr--Va 1 -Ser -Va 1 -Pro-Me tMet-Ala-Glu-Thr-Asn-Lys-Phe-Asn-Pyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Thr-ProAsp-Gl y-His-Tyr—T yr—A=p-I le-Leu-Glu -Leu-Pro-Ty r—Hie-Gly -AspThr .
9. Test według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera przeciwciała związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie.
10. Test według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera dodatkowo nośnik stały dla związania próbki zawierającej antygen.