PL164991B1 - Sposób wytwarzania przeciwcial poliklonalnych reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego Inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania przeciwcial poliklonalnych reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu, przez immunizacje zwierzat, znam ienny tym , ze do immunizacji stosuje sie polipeptyd odpowiadajacy fragmentowi o wzorze (Y )a-A-(Z)b, w którym Y oznacza sekwencje aminokwasów kodowana przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser; a = 0 lub 1; Z oznacza sekwencje Glu, Ser i/lub sekwencje kodowana przez fragment polilinkera; b = 0, 1 lub 2; natomiast A oznacza sekwencje odpowiadajaca fragmentowi A sn1 72-Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora pla- zminogenu, pobiera sie krew i izoluje przeciwciala. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu (PAI-1) przez immunizację zwierząt, pobranie krwi i izolację przeciwciał.

Aktywatory plazminogenu (PAI-1) pełnią ważną rolę podczas procesu fibrynolizy, a także w różnych innych procesach fizjologicznych, włączając proces regeneracji, owulacji, implantacji embrionu, różnicowania tkanek, transformacji nowotworowej. Precyzyjna regulacja aktywności

164 991 aktywatorów plazminogenu stanowi krytyczny element wielu biologicznych systemów. Taka regulacja może odbywać się na poziomie tworzenia i rozpuszczania skrzepu lub na poziomie interakcji aktywatorów plazminogenu z komórkami, czy też przez działanie specyficznych inhibitorów.

Większość oznaczeń aktywności PAI jest dwuetapowa, zależy od obecności plazminy i nie odróżnia odmiennych rodzajów inhibitorów. Określenie inhibitorowej aktywności PAI mierzy się ilościowo przez zdolność do hamowania lizy włóknika znakowanego ^l75J, pośredniczonej aktywacją plazminogenu przez urokinazę (Loskutoff and Edington, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 74, 3903- 3909, 1977). W tej metodzie jedną jednostkę aktywności PAI okreśła się jako ilość białka wymaganą do zredukowania aktywności 21U UK do 50%. W celu oznaczenia ilości PAI używa się metody wiązania aktywatora plazminogenu do inhibitora (Schleef R. R., Wagner N. V., Loskkutoff D. J., J. of Cellular Physiology, 134, 269-274, 1989). Aktywność PAI można oznaczyć również posługując się metodą Verheijena, w której używa się wzrastających stężeń tPA (0-25 IU/ml), 1 (iM plazminogenu, oraz 1 μΜ fibrynogenu degradowanego bromocyjanem. W tych warunkach 1 IU PAI-1 określa ilość inhibitora, która hamuje 1 IU tPA (Verheijen J. H., Mullast D., Chang G. T. G., Kluft C., Wijngards G., Thromb. Haemostasis, 48, 266-269, 1982). W niektórych badaniach określających poziom PAI we krwi stosuje się oznaczenia, w których podstawą jest neutralizacja tPA dodanego do próbek osocza, a mierzy się pozostałą aktywność tPA. Metody te są metodami pośrednimi i nie pozwalają precyzyjnie określić poziomu tego inhibitora.

Ostatnio opracowano metodę enzymoimmunologicznego oznaczania ludzkiego PAI-1 w tekście ELIS A z wykorzystaniem przeciwciał dla tego białka. Test ten polega na tym, że inkubuje się przeciwciała dla PAI-1 z badaną próbką, w której oznacza się ten antygen i po odmyciu nieswoiście związanych białek, inkubuje się kompleks antygen-przeciwciało z przeciwciałami dla PAI-1 związanymi z peroksydazą chrzanową, po czym oznacza się antygen wykrywając znacznik.

Wszystkie te metody wymagają zastosowania rodzimego białka PAI-1, zarówno do uzyskania krzywej wzorcowej, jak i swoistych przeciwciał. PAI-1 występuje w ilościach śladowych w płynach ustrojowych i komórkach, a uzyskanie tego białka metodami klasycznymi przez wyodrębnienie w ilościach wystarczających do przygotowania testu Elisa jest niezwykle skomplikowane i czasochłonne. Z drugiej strony otrzymywane dotychczas ludzkie białko PAI-1 jest niezwykle drogie i niezbyt dostępne.

Wszystkie omówione metody otrzymania i oznaczania rodzimego PAI-1 są bardzo skomplikowane, pracochłonne i kosztowne, co zawyża w znacznym stopniu koszty całego testu.

Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest oznaczenie białka rodzimego PAI-1, w oparciu o metodę, w której stosuje się przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku. Stwierdzono, że można wykorzystać pełną reakcję krzyżową w teście immunologicznym przeciwciał otrzymanych dla fragmentu białka oraz rodzimej cząsteczki PAI-1.

W odróżnieniu od znanych metod oznaczania PAI-1, nieoczekiwanie okazało się, że jeśli zastosuje się przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku, fragment peptydowy, a nie całe białko służy do produkcji swoistych przeciwciał rozpoznających w ten sam sposób zarówno fragment peptydowy, jak i rodzime białko PAI-1. Fragment ten również stosuje się do uzyskania krzywej wzorcowej.

Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu, przez immunizację zwierząt, polega według wynalazku na tym, że do immunizacji stosuje się polipeptyd odpowiadający fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym Y oznacza sekwencję aminokwasów kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser; a = 0 lub 1; Z oznacza sekwencję Glu, Ser i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera; b = 0, 1 lub 2; natomiast A oznacza sekwencję odpowiadającą fragmentowi Asn172-Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu, pobiera się krew i izoluje przeciwciała.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się polipeptyd odpowiadający fragmentowi cząsteczki PAI-1 od 172 do 232 aminokwasu od N-końca o sekwencji:

164 991

172 177 198

Asn-Gly-Gln-T rp-Lys—Thr—Pro—Phe—Pro—Asp-Ser Ser-Thr-His-Arg187 192 177

Arg-Leu-Phe—His—Lys—Ser—Asp—Gly-Ser Thr-Val-Ser—Val—Pro—Met— 202 207 212

Met-Ala-Glu-Thr-Asn-Lys-Phe-Asn-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Thr-ProAsp—Gly—His—Tyr—Tyr—Asp—Ile—Leu-Glu—Leu-Pro—Tyr—His—Gly—Asp—

Thr.

W sposobie według wynalazku stosuje się polipeptyd otrzymany przez ekspresję zrekombinowanego DNA, korzystnie zsyntetyzowanego chemicznie cDNA o sekwencji:

( X ) n AACGGCCAGTGGAAGACACCATTCCCAGACAGTAGCACCCACCGCCGCCTCTT CCACAAATCAGACGGAAGCACTGTCTCTGTGCCAATGATGGCTGAGACCAACAAATT

CAACTATACTGAATTCACCACGCCAGATGGACATTACTACGAGATCCTGGAACTGCC

ATACCACGGAGACACT(X)m, gdzie X oznacza GAATCT, n przyjmuje wartość 1 lub 0, a m przyjmuje wartość 0, 1 lub 2.

Polipeptyd stosowany w sposobie według wynalazku, otrzymuje się korzystnie przy użyciu zrekombinowanego wektora do klonowania, wytworzonego przez łączenie znanymi metodami wektora z fragmentem DNA kodującym polipeptyd o wzorze (Y)_a-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie. Wytworzoy w ten sposób fragment polipeptydowy zawiera epitopy antygenowe rozpoznawane przez przeciwciała również w rodzimej cząsteczce PAI-1.

Stosowany do wytworzenia polipeptydu gen kodujący fragment polipeptydowy odpowiadający fragmentowi ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu można na przykład otrzymać z oligonukleotydowych fragmentów ligowanych in vitro.

Oligonukleotydowe fragmenty można zsyntetyzować chemicznie na nośniku poprzez kolejne przyłączanie nukleozydów z zablokowanymi grupami czynnymi. Korzystnie do ochrony funkcji aminowej stosuje się grupę izopropoksyacetylową, co przedstawiono w opisie patentowym RP nr 159 234.

Fragmenty oligonukleotydowe zsyntetyzowane chemicznie poddaje się enzymatycznej reakcji kinazowania, w trakcie której wprowadza się fosforan na końcach 5' za pomocą kinazy polinukleotydowej i ATP. Kinazowane oligonukleotydy liguje się in vitro w dwuniciowe odcinki ograniczone sekwencjami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne. Zligowane odcinki klonuje się w wektorze pomocniczym, stosując właściwe miejsce restrykcyjne polilinkera. Poprawność sekwencji produktów ligowania i klonowania tych fragmentów sprawdza się poprzez sekwencjonowanie metodą Maxama- Gilberta. Można stosować różne wektory pomocnicze, np. plazmidowe lub fagowe, przy czym korzystne są plazmidy, np. pUC19. Sklonowane w wektorze odcinki DNA namnaża się w komórkach gospodarza, którymi mogą być bakterie, drożdże i inne. Wektory z wklonowanymi odcinkami izoluje się, a następnie odcinki odzyskuje się po trawieniu restryktazami na drodze elektroforezy w żelu poliakryloamidowym. Odzyskane odcinki włącza się do wektora ekspresyjnego po trawieniu odpowiednimi enzymami restrykcyj164 991 nymi. Na tym etapie stosuje się różne wektory ekspresyjne, korzystnie plazmidowe lub fagowe. Przykładowo plazmid ekspresyjny pWR450.1. zawiera gen kodujący β-galaktozydazę. Komórki gospodarza, korzystnie bakterii, transformowane zrekombinowanym wektorem, są po namnożeniu źródłem fragmentu białka ludzkiego PAI-1.

Wytworzony tą metodą fragment białka PAI-1 można stosować do otrzymywania przeciwciał sposobem według wynalazku, a także różnymi znanymi metodami oraz do wykreślenia krzywej wzorcowej niezbędnej do ilościowego oznaczania PAI-1.

Otrzymane sposobem według wynalazku przeciwciała można zastosować do oznaczania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu oraz do otrzymania testu diagnostycznego do oznaczania tego antygenu.

Przykładowy sposób oznaczania antygenu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu polega na tym, że badaną próbkę, korzystnie materiału biologicznego kontaktuje się z otrzymanymi sposobem według wynalazku przeciwciałami dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, po czym oznacza się wytworzony kompleks antygen-przeciwciało.

W innej przykładowej metodzie najpierw wytwarza się kompleks dwuskładnikowy antygenu PAI-1 w próbce z pierwszym przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, po czym wytwarza się kompleks trójskładnikowy przez skontaktowanie kompleksu dwuskładnikowego z drugim przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, przy czym jako jedno z tych przeciwciał stosuje się otrzymane sposobem według wynalazku przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie. Obecność kompleksu trójskładnikowego wykrywa się za pomocą sygnału tworzonego przez odczynnik dający się oznaczyć analitycznie lub wyznakowanego przeciwciała przeciwimmunoglobulinowego.

Badaną próbkę, w której wykrywa się i oznacza antygen PAI-1, kontaktuje się i inkubuje z przeciwciałami reagującymi specyficznie z tym antygenem. Utworzenie kompleksu dwuskładnikowego antygen-przeciwciało wykrywa się i oznacza za pomocą środka wykrywającego i sygnalizującego reakcję immunologiczną, jak na przykład przeciwciało reagujące specyficznie z PAI-1 znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie.

Środek wykrywający i sygnalizujący reakcję immunologiczną może być obecny podczas inkubowania antygenu z przeciwciałem. Na przykład można bezpośrednio wyznakować przeciwciała kontaktowane z badaną próbkąj po przemyciu produktu reakcji uzyskać sygnał. Środkiem jest wówczas sam znacznik. Środek wykrywający można też dodać dopiero po wytworzeniu kompleksu dwuskładnikowego i usunięciu nieprzereagowanego materiału. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się wówczas następująco.

Dwuskładnikowy kompleks antygen-przeciwciało po odmyciu kontaktuje się z drugim przeciwciałem reagującym specyficznie z PAI-1, przy czym jako jedno z tych przeciwciał stosuje się przeciwciało dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie. Pozostałym (pierwszym lub drugim) przeciwciałem może być przeciwciało dla całej cząsteczki PAI-1. Otrzymuje się wówczas kompleks trójskładnikowy przeciwciało-antygen-przeciwciało. Drugie przeciwciała mogą być bezpośrednio znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie. Alternatywnie, jako środek stosuje się układ dwuskładnikowy zawierający drugie przeciwciała tworzące kompleks trójskładnikowy, który wykrywa się za pomocą przeciwciała przeciwimmunoglobulinowego.

Do znakowania można stosować enzym, biotynę, izotop promieniotwórczy, przykładowo ¹²⁵J lub inne znane odczynniki. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się za pomocą sygnału wytwarzanego przez znacznik.

W tak prowadzonym procesie oznaczania lub wykrywania badaną próbkę, oznaczamy antygen lub jedno z przeciwciał, korzystnie pierwsze, unieruchamia się na stałym nośniku, takim jak płytka plastikowa, bibuła nitrocelulozowa lub inne.

Wykrywanie i oznaczanie dogodnie jest prowadzić za pomocą testu diagnostycznego. Przykładowy test diagnostyczny zawiera przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, ewentualnie

164 991 unieruchomione na stałym nośniku lub rozpuszczone w fazie ciekłej. Przeciwciała są związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie.

Alternatywnie test diagnostyczny zawiera pierwsze przeciwciała reagujące specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu oraz układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawierający drugie przeciwciała zdolne do specyficznego reagowania z ludzkim inhibitorem tkankowego aktywatora plazminogenu i ewentualnie przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe, przy czym jednez tych przeciwciał stanowią przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)_a-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie. Korzystnie pierwsze przeciwciała są związane z fazą stałą lub ciekłą.

Test może dodatkowo zawierać nośnik stały lub ciekły dla związania próbki zawierającej antygen.

Układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawiera drugie przeciwciała bezpośrednio związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie albo też układ ten zawiera trzecie przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe związane ze znacznikiem.

W sposobie i testach do oznaczania ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu można stosować przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie wytworzone różnymi metodami.

Celem uproszczenia w opisie i przykładach używane są następujące skróty:

A: adenina

C: cytozyna

G: guanina

T: tymina

Ala: alanina

Arg: arginia

Asn: asparagina

Asp: kwas asparaginowy

Cys: cysteina

Gin: glutamina

Glu: kwas glutaminowy

Gly: glicyna

His: histydyna

Ile: izoleucyna

Leu: leucytyna

Lys: lizyna

Met: metionina

Phe: fenyloalanina

Pro: proiina

Ser: seryna

Thr: treonma

Trp: rryptoann

Tyr: yy/rozyna

Val: waHna

DNA: kwas deoksyrybonukleinowy cDNA: komplementarny DNA

Tris-HCl: chlorowodorek trójhydroksymrtrloaminometanu

EDTA: kwas etylenodwuaminocztrrooctowy

10xbufor Eco R1 100 mM Tris-HCl pH 7,5

M NaCI mM β- merkaptoetanol

10xbufor do kinazowania 0,7 M Tris HCl pH 7,6

0,1 MMgCl2 50 mM ditiotreitol

164 991

10xbufor ligacyjny:	660 mM Tris-HCl pH 7,6 50 mM MgCl2 50 mM ditiotreitol 10 mM ATP
Bufor do ekstrakcji:	50 mM Tris-HCl pH 8,0 300 mM octan sodu 0,2% SDS 4 mM EDTA
Pożywka LB	10 g Bacto Trypton 5 g Yeast Extract 5 g NaCl na 1 litr roztworu
Bufor TE	10 mM Tris-HCl pH 8,0 1 mM EDTA
Bufor z SDS	10 g Tris-HCl pH 8,0 77 g glicyny 1 g SDS na 1 litr roztworu
Bufor do lizy komórek	150 mg Tris 400 mg SDS 1 ml β- merkaptoetanol 2 ml gl ic^i^c^lu 7 ml wody
Bufor R I	50 mM glukoza 10 mM EDTA 25 mM Tris-HCl pH 8,0 4 mg/ml lizozymu (Pharmacia)
Bufor R II	0,2 M NaOH 1<% SDS
Bufor R III	60 ml 5 M octan potasu 11.5 ml kwas octowy lodowaty 28.5 ml H20

DDT: ditiotreitol

PMSF: fluorek kwasu fenylometylosulfonowego

SDS: siarczan dodecylu sodu

BSA: albumina surowicy wołu (Bovine Serum Albumin)

PBS: zbuforowany roztwór soli fizjologicznej

ATP: trójfosforan adeozyny

HPLC: wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa

EDTA: etylenodiaminotetraoctan

Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia wykres hydrofobowości łańcucha polipeptydowego PAI-1. Fig. 2 przedstawia sekwencję fragmentu genu ludzkiego PAI-1 podzieloną na fragnenty syntetyzowane chemmicznie. Fig. 3 przedstawia schemat konstrukcji fragmentu genu dla PAI-1 sklonowanego w wektorze rekombinacyjnym pUC-19 oraz ekspresyjnym pWR 450. Fig. 4 przedstawia elektroforezę w żelu poliakryloamidowym zawierającym SDS ekstraktów białkowych otrzymanych z komórek E. coli oraz oczyszczonego kompleksu białkowego PAI-1 z β- galaktozydazą: 1 - ciałka inkluzyjne rozpuszczone w zbuforowanym roztworze 6-molowego mocznika, 2 - oczyszczone białko hydrofobowe β-galaktozydaza-fragment peptydowy PAI-1. Fig. 5 przedstawia schemat rozbicia kompleksu białkowego i oczyszczania fragmentu Asn172-Thr232 PAI-1. Przedstawione odcinki β- galaktozydazy przypadają na długość od 4 do 182 aminokwasów. Fragment PAI-1 po rozbiciu kompleksu składa się z 61 aminokwasów.

Wynalazek jest bliżej wyjaśniony w przykładach wykonania nieograniczających jego zakresu.

164 991

Przykład I.

Etap 1.

A. Synteza oligonukleotydów.

Syntezę 10 oligonukleotydowych fragmentów (fig. 2) przeprowadza się metodą amidofosforynową na stałym nośniku. Jako nośnik stosuje się szkło o kontrolowanej porowatości, typu LCA-CPG, ze związaną pierwszą jednostką nukleozydową. Jednostka ta ma przyłączoną na końcu 5’-OH deoksyrybozy blokującą grupę kwasolabilną - dimetoksytrityl (DMT), którą usuwa się w środowisku kwaśnym. Odsłonięta w ten sposób grupa 5'-OH jednostki nukleozydowej przyłącza prekursor kolejnej jednostki: 3’-amidofosforyn odpowiedniego nukleozydu. Za pomocą jodu w obecności wody dokonuje się utlenienia grupy fosforynowej do fosforanu. Następnie usuwa się DMT z przyłączonej jednostki - tym samym cykl rozpoczyna się na nowo. W celu usunięcia nieprzereagowanych jednostek z wolnymi grupami 5'-OH stosuje się t. zw. capping, tj. zablokowanie pomyłkowych sekwencji przez acetylowanie bezwodnikiem octowym w obecności aktywatorów. Po utworzeniu żądanego oligonukleotydu odcina się go od złoża i usuwa inne grupy wodnym roztworem amoniaku, oczyszcza elektroforetycznie, następnie odsala metodą HPLC. (Waters C-18 RP, 10 gm). Oligonukleotydy przechowuje się w porcjach po ok. 0,5 OD.

B. Proces kinazowania i ligacji.

Poszczególne fragmenty nici DNA rozpuszcza się w wodzie destylowanej, tak aby w 5 gl znajdował się 1 gg fragmentu. Miesza się po 5 gl roztworu fragmentów od 1 do 5 (I nić DNA) i od 5 do ΊΟ (II nić DNA). Do mieszaniny fragmentów dodaje się 0,1 objętości buforu do kinazowania (50 mM Tris-HCl, 5 gM MgCk), 5 gl 20 gM ATP, 1 gl kinazy polinukleotydowej B (T4 polinukleotide kinase). Reakcję prowadzi się przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Miesza się obie nici i inkubuje przez 20 min. w temperaturze 100°C. Po powolnym ostudzeniu dodaje się do każdej próbki po 0,1 objętości buforu do ligacji, po 1 g l 200 mM ATP, 1 gl ligazy T4. Po dokładnym wymieszaniu reakcję prowadzi się przez 12 godzin w temperaturze 4°C.

C. Hydroliza enzymami.

Do rozpuszczonego DNA (80 gl) dodaje się 10x 10 gl buforu EcoRi, 2U restryktazy EcoRi (firmy Pharmacia) oraz wody do objętości 100 gl. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Po tym czasie DNA strąca się etanolem, dodając 3 objętości alkoholu etylowego (99,8%), wymraża się w -20°C przez 5 minut, a następnie odwirowuje się przy 15 tys. obr., przez 5 minut. Osad rozpuszcasięw20 gl buforu TE. W ten sam sposób postępuje się podczas hydrolizy restryktazą Pst I.

D. Rozdział elektroforetyczny.

W celu sprawdzenia czy zligowane fragmenty DNA mają odpowiednią długość, rozdziela się je w 8% żelu poliakryloamidowym z SDS w TBE. Rozdział prowadzi się przy napięciu 130 V w ciągu 3 godzin. Żel zabarwia się bromkiem etydyny (o,5 gl/ml - firmy Serva) przez 20 minut w temperaturze pokojowej, następnie płucze się 2x wodą destylowaną. Rozdzielone produkty obserwuje się pod lampą UV. W celu oceny wielkości fragmentów DNA podczas elektroforezy używa się następujących wzorców: pUC trawiony Msp, pUC trawiony Bsp RI. Zligowane fragmenty posiadają oczekiwaną długość. Po elektroforezie sprawdzającej wykonuje się elektroforezę preparatywną i uzyskuje się tą drogą fragment, który następnie liguje się z plazmidem pUC trawionym Eco RI i Pst I w sposób wyżej opisany.

E. Przygotowanie kompetentnych komórek.

Z płytki z wysianymi bakteriami DH5, pobiera się jedną kolonię, którą szczepi się na 5 ml pożywki Lb. Bakterie hoduje się w temperaturze 37°C przez 18 godzin. Do 100 ml pożywki LB dodaje się 2 ml otrzymanej hodowli i prowadzi się hodowlę do gęstości optycznej OD 600 = 0,3. Zawiesinę bakterii zwirowuje się (5 tys. obr. 20 min.), a osad bakteryjny schładza się i zawiesza w 50 ml buforu SB i umieszcza w temperaturze 0°C. Zwirowuje się jak wyżej, a osad zawiesza w 1/12 objętości wyjściowej buforem SB. Inkubuje się 20 minut w temperaturze 0°C. Po tym czasie z zawieszonych komórek pobiera się do sterylnych probówek po 200 gl zawiesiny komórek i inkubuje 30 minut w 0°C. Dodaje się 7 gl DTT i plazmidy (20 gl). Inkubuje się w lodzie (0°C) 30 minut, a następnie 45 sekund w 45°C. Ochładza się w lodzie i dodaje 800 gl

164 991 pożywki LB, a następnie inkubuje 1 godzinę w 37°C. Po tym czasie posiewa się na płytki. Wylewa się 200 μΐ mieszaniny ligacyjnej na płytkę i inkubuje się w 37°C przez 18 godzin.

F. Analiza otrzymanych transformantów.

Po 18 godzinach na płytce z wysianą mieszaniną transformacyjną obserwuje się pojedyncze kolonie. Do dalszej analizy wybiera się 10 kolonii. 5 ml pożywki szczepi się pojedynczymi koloniami i hoduje w 37°C przez 18 godzin, a następnie izoluje plazmidowy DNA. Preparatyka plazmidowego DNA z 5 ml pożywki przebiega w następujący sposób.

Bakterie zawirowuje się (5 minut 5 obr./min.). Osad bakteryjny zawiesza się w 200 μΐ buforu RI i przetrzymuje 5 minut w temperaturze 0°C. Dodaje się 400 μΐ RII (0°C), a następnie 300 μΐ RIII (0°C). Całość zawirowuje się (15 tys. obr./min., 5 minut). Supematant przenosi się znad osadu do nowej probówki i dodaje się 2,5 objętości izopropanolu. Wymraża się w -20°C, zawirowuje, osad płucze 70% etanolem i suszy nad próżnią. Osad rozpuszca się w 200 μΐ TE i dodaje 20 pl roztworu RNazy o stężeniu 1 mg/ml. Inkubuje się 30 minut w 37°C. Dodaje się 200 fil fenolu. Zbiera się fazę wodną i dodaje 200 μ l mieszaniny chloroform/alkohol izoamylowy (24 : 1, v/v). Zawirowuje się, zbiera supematant, czynność powtarza się jeszcze raz. Do fazy wodnej dodaje się 0,1 objętości 3 M octanu sodu (pH = 5,2) oraz 2,5 objętości etanolu i wymraża 30 minut w -20°C. Zawirowuje się (15 tys. obr./min.), a osad przemywa 70% etanolem i suszy. Osad plazmidowego DNA rozpuszcza się w 40 |il buforu TE.

W celu wybrania klonu zawierającego plazmid pUC 19 z wklonowanym dwuniciowym fragmentem, przeprowadza się analizę otrzymanych dNa plazmidowych przy użyciu enzymów restrykcyjnych EcoRI i Pst I, a produkty trawienia rozdziela się w żelu poliakryloamidowym. Trawienie przeprowadza się jak w punkcie C, a rozdział elektroforetyczny jak w D.

G. Sprawdzenie sekwencji sklonowanych fragmentów.

W celu upewnienia się czy sekwencja sklonowanego fragmentu jest prawidłowa, fragmenty sekwencjonuje się metodą Maxama i Gilberta (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 1980, 65).

H. Konstrukcja wektora ekspresyjnego.

Sprawdzony dwuniciowy fragment DNA kodujący polipeptyd Asnm- Thr232, liguje się z wektorem ekspresyjnym pWR.450 trawionym enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Pst I. Uzyskuje się zrekombinowany plazmid ekspresyjny pW-PAI-1. Transformowanie komórek bakteryjnych prowadzi się jak w punkcie E.

I. Oczyszczanie ciałek inkluzyjnych.

Bakterie z kolonii bakteryjnej zawierającej zrekombinowany plazmid przenosi się do probówki zawierającej 1 ml pożywki LB + 5 μ l ampicyliny o stężeniu 100 pg/ml i inkubuje przez

2-5 godzin w temperaturze 37°C, z ciągłym wytrząsaniem. Zawiesinę bakterii namnożonych w tej probówce przenosi się do kolby zawierającej 1 l pożywki LB + 1 ml ampicyliny o stężeniu 100 μg/ml. Hodowlę prowadzi się 14 godzin, w temperaturze 37°C z ciągłym wytrząsaniem. Następnie bakterie zwirowuje się (15 min., 5000 obr./min.) i osad zawiesza się w 200 ml 0,1 M CaCl2 (buforowanym Trisem, pH = 7,5). Po inkubacji przez 20 minut w łaźni lodowej, zawiesinę wiruje się przez 20 minut przy 12000 obr./min. w temperaturze +4°C i osad ponownie zawiesza się w 200 ml 0,1 M CaCl2. Po kolejnej inkubacji przez 2 godziny w łaźni lodowej zawiesinę wiruje się ( w dwóch probówkach wirowniczych) j.w. Osad zawiesza się w 20 ml (do obu probówek dodaje się po 20 ml) buforu fosforanowego, pH 6,2, a następnie dodaje się po 200 μΐ 1 M glicerolu i 400 μΐ 1 % glicerolu do obu probówek. Ogrzewa się je do temperatury pokojowej, dodaje po 40 p1 0,5 M EDTA, pH 8,0 i po krótkiej inkubacji schładza w łaźni lodowej do temperatury około 0°C. Następnie probówki wstawia się na 1 minutę do łaźni o temperaturze 42°C (szok termiczny). Wiruje jak wyżej. Osad po schłodzeniu zawiesza się w 100 ml 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, zawierającym 10 mM EDTA, inkubuje przez 5 minut w temperaturze 0°C i odwirowuje. Osad zawiesza się w 35 ml 100mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1 θ0 mM β-ME, 1 mM PMSF, 1% Triton Χ-100, pH 8,0. Poddaje się go działaniu ultradźwięków - 10 razy po 30 sek., po czym odwirowuje się (20000 obr./min., 30 min., temp. +4°C) otrzymując w ten sposób osad ciałek inkluzyjnych, które następnie przemywa się zawieszając je w 35 ml buforu 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM PMSF, 1mM EDTA. Po ponownym ich żwirowaniu rozpuszcza się je w 9 M moczniku. W celu pozbycia się reszty zanieczyszczeń (nierozpuszczonych ciałek

164 991 inkluzyjnych) zawiesinę ponownie wiruje się (20000 obr./min., 30 min., temp. +4°C). W supernatancie winna znajdować się główna część białka. Dalsze oczyszczania białka hybrydowego zawierającego fragment PAI-1 przeprowadza się na kolumnie chromatograficznej DEAESephacel. Białka zawarte w ciałkach inkluzyjnych rozpuszczone w 9 M moczniku dializuje się do roztworu 6 M mocznika, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, zawierającego 10 mM EDTA, 1 mM PMSF. Tym samym buforem równoważy się dwie kolumny wypełnione złożem DEAE-Sephacel (o wymiarach 2,5 x 10 cm). Na jedną z nich nanosi się roztwór białek. Część białka, która po przejściu przez kolumnę nie zwiąże się ze złożem, nanosi się (po 2-3-krotnym rozcieńczeniu tym samym buforem) na drugą kolumnę. Czysty koniugat wymywa się ze złoża 0,1 M NaCl.

J. Rozbicie kompleksu na drodze reakcji chemicznej.

Oczyszczone białko hybrydowe złożone z fragmentu β-galaktozydazy oraz fragmentu Asnr72-Thr232 PAI-1 dializuje się wobec buforu 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 w celu usunięcia mocznika, a następnie liofilizuje. Rozszczepienie wiązania Asn-Gly przeprowadza się stosując

M hydroksyloaminę w 6 M chlorowodorku guanidyny, pH 9,3. Reakcję prowadzi się w temperaturze 45°C. Rozbicie koniugatu sprawdzano elektroforetycznie.

Produkty powstałe w wyniku tej reakcji analizuje się w żelu poliakryloamidowym po elektroforezie.

K. Sposób wyodrębniania fragmentu Asnn2-Thr232 (PAI-1) ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu za pomocą HPLC.

Fragment polipeptydowy odpowiadający fragmentowi AsnmOTh^ (PAI-1) ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu izoluje się z hydrolizatu otrzymanego w sposób, jak opisano w punkcie I, za pomocą HPLC. Rozdział chromatograficzny przeprowadzono na kolumnie semipreparatywnej TSK G3000SW firmy LKB, Szwecja.

Etap 2.

A. Otrzymanie przeciwciał sposobem według wynalazku, przy wykorzystaniu fragmentu polipeptydowego.

W celu otrzymania surowicy poliklonalnej dla fragmentu białka ludzkiego PAI-1, immunizuje się tym białkiem króliki. Sródskórnie podaje się na drodze 30-40 iniekcji dawki 50 ig antygenu w 0,5 ml PBS i wymieszanego z 0,5 ml kompletnego adiuwantu Freuda. Po 7 dniach od każdego szczepienia pobiera się krew z żyły usznej królików. Po wykrzepieniu w temperaturze 37°C przez 0,5-1,0 godziny, skrzep oddziela się od ścianek probówki i całość pozostawia w temperaturze 4°C na 12-24 godziny. Następnie surowicę odciąga się do jałowych probówek wirówkowych i wiruje przy 3000 obr/min przez 20 minut. Surowicę inaktywuje się podczas inkubacji przez 30 minut w temperaturze 56°C. Miano poszczególnych próbek surowic określa się metodą radioimmunologiczną, oznaczając ich zdolność do wiązania znakowanego antygenu. Surowice o najwyższym mianie przeciwciał przechowuje się w temperaturze -20°C.

B. Oczyszczanie przeciwciał.

Przeciwciała dla fragmentu PAI-1 oczyszcza się z surowicy odpornościowej za pomocą chromatografii powinowactwa. Immunoadsorbent zawiera fragment białka PAI-1 związany ze złożem CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia). W celu przygotowania immunoadsorbentu 1 g złoża przemywa się 200 ml roztworu 0,001 mol/l HCl i następnie zawiesza w buforze boranowym (pH 8,3). Natychmiast dodaje się 20 mg fragmentu białka PAI-1 rozpuszczonego w PBS i delikatnie miesza w temperaturze 4°C przez 2 godz. Po odwirowaniu sprawdza się stężenie białka w supernatancie. Złoże zawiesza się następnie w roztworze glicyny (2 mol/l) w buforze boranowym o pH 8,3. Po 1 -godzinnej inkubacji odwirowuje się je (10 min. 4000 obr/min) i przemywa się je x buforem boranowym (pH 8,3), 1 x wodą destylowaną, 3 x buforem boranowym (pH 8,3). Z otrzymanym w ten sposób złożem inkubuje się 15 ml surowicy otrzymanej po immunizacji fragmentem białka PAI-1, delikatnie mieszając przez 12-14 godzin w temperaturze 4°C. Do mieszaniny dodaje się 1 mM PMSF (Sigma) oraz 1 mM chlorku benzamidyny (Biochemical). Po odwirowaniu (10 min., 3000 obr/min) złoże przemywa się buforem (PBS z 1 % Tween 20), a następnie 4 x buforem 1 M ( 1 NaCl 21 % Tween 20 w PBS). Po każdym wirowaniu sprawdza się zawartość białek w supernatancie poprzez pomiar adsorpcji światła przy 400 nm. Następnie złoże umieszcza się w kolumnie (0,7 x 10 cm). Przeciwciała specyficznie związane z unierucho164 991 mionym na złożu białkiem eluuje się roztworem 0,5 mol/l kwasu octowego i zbiera się do probówek zawierających 100 μΐ roztworu 2 mol/l Tris. Frakcje o dużej zawartości białka łączy się i dializuje wobec PBS przez 24 godziny w 4°C.

C. Sprzęganie przeciwciał z peroksydazą.

Uzyskane w ten sposób przeciwciała dla fragmentu białka PAI-1 sprzęga się z peroksydazą. W tym celu rozpuszcza się 5 mg HRPO w 1 ml świeżo przygotowanego 0,3 M kwaśnego węglanu sodu (NaHCO3). pH 8,1. Następnie dodaje się 0,1 ml 1% FDNB w alkoholu absolutnym. Delikatnie wytrząsa się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodaje się 0,04-0,08 M NaJO 4 (rozpuszcz. w wodzie destyl.), delikatnie miesza przez 30 min. w temperaturze pokojowej. Kolor tego roztworu winien stać się zielonożółty. Następnie dodaje się 1,0 ml 0,16 M glikolu etylenowego (rozp. w wodzie dest.) i delikatnie miesza w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po zakończeniu inkubacji roztwór dializuje się wobec 0,01 M węglanu sodu, pH 9,5, temperatura 4°C (co najmniej 3 1- litrowe zmiany). Do 3 ml roztworu tak przygotowanego aldehydu peroksydazy (HRPO) dodaje się 5 mg IgG i delikatnie miesza przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej.IgG rozpuszcza się w 1 ml buforu węglanowego przed zmieszaniem lub dodaje w postaci zliofilizowanego proszku wolnego od soli. Po dodaniu IgG wprowadza się 5 mg NaBH4 i pozostawia w 4°C od 3 do 12 godzin. Następnie roztwór dializuje się w 4°C wobec PBS. Jeśli powstaje precypitat, usuwa się go przez wirowanie. Próbkę nanosi się na kolumnę (85 x 1,5 cm), Sephadex G-100, zrównoważoną PBS. Zbiera się frakcje po 1,5 ml i poziom białka w poszczególnych frakcjach oznacza spektrofotometrycznie. Frakcja IgG znakowanych HRPO schodzi w pierwszym szczycie. Roztwory tego koniugatu przechowuje się w obecności albuminy aurowicy wołowej o stężeniu 10 mg/ml w temperaturze -20°C.

Etap 3.

Opłaszczanie płytki przeciwciałami i wykonanie testu ELISA.

Studzienki w płytce do testu ELISA opłaszcza się przeciwciałami poliklonalnymi dla fragmentu polipeptydowego Asni72-Thr232 białka PAI-1 o stężeniu 10 μg/ml, zawieszonymi w 50 mM buforze fosoforanowym o pH 7,5. Niezwiązane białko odmywa się, a powierzchnię studzienek opłaszcza albuminą surowiczą. Testowane próbki osocza rozcieńcza się przed oznaczeniem 50 mM buforem fosforanowym, pH 7,5, zawierającym 0,15 M NaCl, 10 mM EDTA, 1% Tween 20 i 1% BSA i dodaje się po 200 μl/dołek. Inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji płytki 5-krotnie przemywa się 0,15 M NaCl zawierającym 0,1% Tween 20. Następnie dodaje się 200 μl koniugatu IgG-HRP (przeciwciała poliklonalne dla całej cząsteczki PAI-1 związane z peroksydazą) o stężeniu 5 μg/ml. Inkubuje 2 godziny w tempemaurze pokoóowee i ponowme 5-kromńe przemywa. W celu wy wooama reakqj enzymatycznej dodaje się po 200 μl roztworu substratu (0,4 mg/ml ortofenylodiaminy w 0,05 M buforze cytrynianowym, pH 5,0, zawierającym 0,02% H2O2). Po 6 minutach inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 50 μl 3 M kwasu siarkowego. Adsorbancję mierzy się przy 490 nm.

Przykład II.

Detekcja antygenu PAI-1 w badanej próbce za pomocą przeciwciał dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego fragmentowi Asn 72- Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu.

Do unieruchomionego antygenu dodaje się wyznakowane peroksydazą przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego fragmentowi Asnr72-Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu i inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Do wywołania reakcji enzymatycznej stosuje się roztwór substratu - ortofenylodiaminę w 0,05 M buforze cytrynianowym, pH 5,0, zawierającym 0,02% H 2O2. Po 15 minutach inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 50 μΐ 3 M kwasu siarkowego. Adsorbancję mierzy się przy 490 nm. Wynik odczytuje się z krzywej wzorcowej dla standartowego roztworu PAI-1.

Przykład III.

Diagnostyczny zestaw testowy dla oznaczania poziomu ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu składa się z: pojemnika zawierającego zbuforowany roztwór soli

164 991 fizjologicznej (PBS), pH 7,5, EDTA, Tween 20; pojemniczka z albuminą surowiczą; pojemniczka z przeciwciałami dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego fragmentowi AsnmThr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu; pojemniczka z wyznakowanymi peroksydazą przeciwciałami dla PAI-1; pojemniczka z substratem (ortofenylodiaminą); pojemniczka z buforem cytrynianowym, pH 5,0 i pojemniczka z 3 M kwasem siarkowym.

GAATCTAACGGCCAGTGGAAGACACCATTCCCAGACAGTAGCACCCACCGCCGCCTCTTCCA

GATTGCCGGTCACCTTCTGTGGTAAGGGTCTGTCATCGTGGGTGGCGGCGGACAAGGT

CAAATCAGACGGAAGCACTGTCTCTGTGCCAATGATGGCTGAGACCAACAAATTCAACTATA

GTTTAGTCTGCCTTCGTGACAGAGACACGGTTACTACGGACTGTGGTTGITTAAGTTGATAT

CTGAATTCACCACGCCAGATGGACATTACTAC(}ACATCCTGGAACTGCCATACCACGGAGAC

GACTTAAGTGGTGCGGTCTACCTGTAATGATGCTGTAGGACCTTGACGGTATGGTGCCTCTG

ACT

TCAA7CT

3' 5'

1. CGGTCACCTTCTGTGGTAAGGGTCTGTC

2. AlCGTGGGTGGCGGCGGAGAAGGTGTTTAGTCTGCCTTCG dolna nić

3. TGACAGAGACACOGTTACTACCGACTCTGGTTG

4. TTTAACTTGATATGACTTAAGTGGTGCGGTCTAC.CTGTAA

5. TGATGCTGTAGGACCTTG4CGGTATGGTGCCTCTGTGAATCT

6. TCACAGAGGCACCATACCGTCAAGGTCCTACAGCATCĄTTAC

7. AGGTAGACCGCACCACTTAAGTCATATCAACT

Θ.TAAACAACCAGAGTCGGTAGTAACCGTGTCTCTGTCACGA górno nić

9. AGCCAGACTAAACACCTTCTCCGCCGCCACCCAC

10. GATGACAGACCCTTACCACAGAAGGTGACCGGCAATCTAAG.

Fig. 2

164 991

Eco RI

Pst

Fig.3

164 991

Fig.4

164 991

BETA - CALAKTGZYDAZA : BIAŁKO PAI

produkty degradacji beta-galaktozydazy białko PAI

oczyszczenie produktów hydrolizy

Fig.5

164 991

C —ΟΛΛζ-WWW-wwi 1-\w

Fig.1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu, przez immunizację zwierząt, znamienny tym, że do immunizacji stosuje się polipeptyd odpowiadający fragmentowi o wzorze (Y)a-A-(Z)b, w którym Y oznacza sekwencję aminokwasów kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Glu, Ser; a = 0 lub 1; Z oznacza sekwencję Glu, Ser i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera; b = 0, 1 lub 2; natomiast A oznacza sekwencję odpowiadającą fragmentowi Asn 172-Thr232 ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu, pobiera się krew i izoluje przeciwciała.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd o sekwencji: Asn-Gly-Gln-Trp-Lys-Thr—Pra-Phe-Pro-Asp-Ser-Ser-Thr—His-ArgArg-Leu-Phe-His-Lys-Ser—Asp-Gly-Ser—Thr-Val -Ser-Val-Pro-MetMet-Ala-Glu-Thr—Asn-Lys-Phe-Asn-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Thr—ProAsp-Gly-His-Tyr-Tyr-Asp-I le-Leu-Glu-Leu-Pro-Tyr-His-Gly-AspThr.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd otrzymany przez ekspresję zrekombinowanego DNA.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się zsyntetyzowany chemicznie cDNA.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się zsyntetyzowany chemicznie cDNA o sekwencji:

   ( X ) nAACGGCCAGTGGAAGACACCATTCCCAGACAGTAGCACCCACCGCCGCCTCTT

   CCACAAATCAGACGGAAGCACTGTCTCTGTGCCAATGATGGCTGAGACCAACAAATT

   CAACTATACTGAATTCACCACGCCAGATGGACATTACTACGACATCCTGGAACTGCC

   ATACCACGGAGACACT(X)_m, gdzie X oznacza GAATCT, n przyjmuje wartość 1 lub 0, a m przyjmuje wartość 0, 1 lub 2.