PL168023B1

PL168023B1 - Sposób elektrochemicznego oznaczania analitu i uklad elektrod czujnikowych do elektrochemicznego oznaczania analitu PL

Info

Publication number: PL168023B1
Application number: PL91288920A
Authority: PL
Inventors: Joachim Hoenes; Juergen Schaeffler
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1990-02-03
Filing date: 1991-02-01
Publication date: 1995-12-30
Also published as: CS26191A2; IL97121A; FI910498A0; BG60694B1; AU2108692A; FI910498L; PL168285B1; KR940008083B1; DE4003194A1; ZA91757B; EP0441222A2; IE910343A1; CN1026248C; NZ236931A; IL97121A0; DE59108414D1; ES2097767T3; EP0441222A3; YU17191A; MX24356A

Abstract

1. Sposób elektrochemicznego oznaczania ana- litu w obecnosci oksydoreduktazy i ulegajacej redukcji substancji, która otrzymywane podczas przebiegu re- akcji oznaczania, elektrony przenosi od oksydoredukta- zy n a elektrode i tak prowadzi do sygnalu, który jest m iara oznaczanego analitu, przy czym ulegajaca redu- kcji substancja je st redukow ana enzymatycznie, a utle- niana n a elektrodzie, znam ienny tym, ze powstajaca n a elektrodzie przez utlenienie substancja jest rózna od pierwotnie uzytej substancji ulegajacej redukcji. 6. Uklad elektrod czujnikowych do elektro- chemicznego oznaczania analitu w cieklej próbie, zawie- rajacy co najm niej dw a elektrycznie przewodzace srodki, które kazdorazowo wystepuja odizolowane od siebie i które kazdorazowo za pomoca elektrycznie prze- wodzacych powierzchni sa ewentualnie doprowadzane do elektrycznego kontaktu z badana próba, przy czym co najmniej jedna z elektrycznie przewodzacych powie- rzchni kontaktuje oksydoreduktaze i ulegajaca redukcji substancje, która jest w stanie przeniesc elektrony po- miedzy oksydoreduktaze i elektrycznie przewodzaca powierzchnia, znam ienny tym , ze jako ulegajaca redu- kcji substancje stosuje sie zwiazek, który po redukcji przez oksydoreduktaze zostaje utleniony n a elektrycz- nie przewodzacej powierzchni do substancji, która jest rózna od pierwotnie uzytej substancji ulegajacej re- dukcji. X— R WZÓR 1 HO-N = Y WZÓR 2 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób elektrochemicznego oznaczania analitu (substancji oznaczanej analitycznej) w obecności oksydoreduktazy i ulegającej redukcji substancji, która otrzymywane podczas przebiegu reakcji oznaczania elektrony przenosi od oksydoreduktazy na elektrodę i tak prowadzi do sygnału, który jest miarą oznaczanego analitu, przy czym ulegająca redukcji substancja redukowana jest enzymatycznie, a utleniana na elektrodzie.

Przedmiotem wynalazku jest poza tym układ elektrod czujnikowych do elektrochemicznego oznaczania analitu w ciekłej próbie zawierający co najmniej dwa przewodzące elektrycznie środki, które każdorazowo występują odizolowane od siebie i które za pomocą elektrycznie przewodzących powierzchni można doprowadzać do elektrycznego kontaktu z

168 023 badaną próbą, przy czym co najmniej jedna z elektrycznie przewodzących powierzchni kontaktuje oksydoreduktazę i ulegającą redukcji substancję, która jest w stanie przenieść elektrony pomiędzy oksydoreduktazą i elektrycznie przewodzącą powierzchnią.

Wobec kolorymetrycznych metod oznaczania analitu w cieczy, którą ocenia się wizualnie albo fotometrycznie, odpowiednie elektrochemiczne oznaczanie wykazuje tę korzyść, że elektrochemiczna reakcja bezpośrednio dostarcza prąd, który można przeliczyć na stężenie. Natomiast w kolorymetrycznych sposobach występuje obieg bateria —> prąd —> światło —> światło resztkowe (remisja albo transmisja) —> prąd —> wartość mierzona.

Dla elektrochemicznych sposobów oznaczania należy oznaczany analit utlenić albo za pomocą chemicznych lub enzymatycznych metod przeprowadzić w substancję, która może utlenić. Bezpośrednie elektrochemiczne utlenienie analitu albo pochodzącej od niego substancji na powierzchni elektrody wymaga wysokich nadnapięć, to znaczy potencjałów. Sposób ten jest bardzo nieselektywny. Wiele innych substancji, które mogą być także obecne w badanej próbie, również zostaje utlenionych. Z tego względu taki sposób praktycznie nie nadaje się do stosowania analitycznego.

Zazwyczaj dlatego utlenialny analit albo pochodzącą od analitu utlenialną substancję poddaje się reakcji z odpowiednią oksydoreduktazą i ulegającą redukcji substancją, której zredukowana postać ponownie może zostać utleniona na elektrodzie. Przy tym utlenialny analit względnie pochodząca od analitu utlenialna substancja zostaje selektywnie utleniona przez enzym. Zredukowany przez to enzym zostaje utleniony przez obecną ulegającą redukcji substancję, a zredukowana substancja ulegająca redukcji zostaje utleniona na elektrodzie. Ulegająca redukcji substancja służy zatem jako przenośnik elektronów od enzymu na elektrodę. Warunkiem jest zatem, żeby ulegającą redukcji substancję wybrać tak, żeby była ona szybko i właściwie przekształcona przez enzym i przez elektrodę.

P.W. Carr i współpracownicy w Theory and applications of enzyme elektrodes in analytical and clinical chemistry, wydawnictwo Wiley, Nowy Jork /1980/, strony 197 - 310 opisują reakcję glukozy z tlenem jako ulegającą redukcji substancją przy enzymatycznej katalizie przez oksydazę glukozową i wykrycie utworzonego nadtlenku wodoru na elektrodzie. Ale niedogodnością są tu reakcje uboczne nadtlenku wodoru, który sam jest silnym środkiem utleniającym, oraz reakcje uboczne na powierzchni elektrody z powodu zastosowanego wysokiego potencjału dodatniego. Dlatego sposób ten wymaga specjalnych rozdzieleń wstępnych w celu wykluczenia zakłócających składników w badanych próbach. Niedogodnością jest tu poza tym zapotrzebowanie tlenu. Specjalnie w przypadku wysokich stężeń glukozy dyfuzja tlenu z powietrza do próby i w czasie oznaczania szybkości próby ewentualnie fałszuje wyniki metody.

W europejskim opisie patentowym nr EP-A-O 125 137 opisany jest układ elektrod czujnikowych do oznaczania składnika w mieszaninie substancji, który wykazuje co najmniej dwa elektrycznie przewodzące środki, które występują każdorazowo odizolowane od siebie i które można za pomocą elektrycznie przewodzącej powierzchni doprowadzić do kontaktu elektrycznego z badaną próbą, przy czym jedna z elektrycznie przewodzących powierzchni kontaktuje oksydoreduktazę i tak zwany związek pośredniczący, który przenosi elektrony pomiędzy enzymem i elektrycznie przewodzącą powierzchnią. Jako związek pośredniczący stosuje się substancję metaloorganiczną, która wykazuje co najmniej dwa organiczne pierścienie, z których każdy posiada co najmniej dwa sprzężone podwójne wiązania i przy czym atom metalu dzieli swoje elektrony z każdym z tych pierścieni. Jako wyróżniające się związki pośredniczące stosuje się również jak w europejskim opisie patentowym Nr EP-A-O 078 636 ferrocen albo pochodne ferrocenu. Należy przy tym zwracać uwagę na to, że takie związki muszą być najpierw utlenione, na przykład do jonu ferrocyniowego zanim będą one gotowe do przejęcia elektronów od oksydoreduktazy. To prowadzi do tak zwanych prądów rozruchowych, które występują już bez obecności analitu, co działa oczywiście zakłócająco w sposobie amperometrycznym, w którym występujący prąd jest miarą ilości oznaczanego analitu. Dalej niedogodnościąjest trudna rozpuszczalność takich metaloorganicznych związków, gdyż to prowadzi do wyróżnienia tlenu, na przykład przy użyciu oksydaz, jak oksydazy glukozowej, jako oksydoreduktazy i zatem specjalnie przy niskich stężeniach substratów enzymów do małego prądu i do zależności od tlenu. Trudna rozpuszczalność i/albo użycie małych stężeń w przypadku tych przenośników elektro4

168 023 nów stosowanych w zredukowanej postaci są podstawą dla jeszcze akceptowalnych prądów rozruchowych.

Znane ze stanu techniki przenośniki elektronów dla elektrochemicznych sposobów oznaczania charakteryzują się tym, że w obecności oznaczanego analitu zostają zredukowane przez oksydoreduktazę i na elektrodzie zostają ponownie utlenione do związku wyjściowego. Jeżeli stężenie służącej jako przenośnik elektronów substancji ulegającej redukcji jest znacznie niższe niż stężenie oznaczanego analitu, można przeprowadzić tylko kinetyczne metody. Dla oznaczenia punktu końcowego potrzeba, aby służąca jako przenośnik elektronów substancja ulegająca redukcji występowała rozpuszczona w nadmiarze wobec oznaczanego analitu i wówczas oznaczany analit reaguje całkowicie. Przy tym ulegająca redukcji substancja reaguje w ilości proporcjonalnej do oznaczanego analitu. Korzyścią wobec kinetycznego pomiaru są szczególnie rozszerzony zakres liniowości stosunku prąd/stężenie w sposobie amperometrycznym oraz lepsza konkurencyjność wyżej stężonej ulegającej redukcji substancji wobec tlenu przy użyciu okydazjako oksydoreduktaz. Niedogodnościąjestjednak, w celu całkowitej reakcji, konieczność stosowania ulegającej redukcji substancji, to znaczy środka utleniającego jako przenośnika elektronów o potencjale wyraźnie wyższym od potencjału substratu enzymu i dodatkowo przy elektrochemicznym oznaczaniu praca w obecności nadmiaru środka utleniającego, co jeszcze dalej zwiększa potrzebny potencjał. Wysokie potencjały robocze sprzyjająjednak niewłaściwym reakcjom elektrodowym, szczególnie wówczas, gdy należy badać próby zawierające dużą liczbę składników poza oznaczanym analitem.

Dla elektrochemicznego oznaczania analitu na drodze enzymatycznej reakcji redoks nie ma dotychczas jeszcze zadowalających rozwiązań. Brakuje odpowiednich do uniwersalnego stosowania jako przenośniki elektronów substancji ulegających redukcji, które wykazują zarówno szybką reakcję z oksydoreduktazami, jak również niehamowaną reakcję na powierzchniach elektrod przy niskim potencjale.

Zadaniem omawianego wynalazku było rozwiązanie tego zagadnienia. Należało zwłaszcza wynaleźć ulegające redukcji substancje, które mogą spełniać rolę przenośników elektronów pomiędzy oksydoreduktazę i elektrodą w elektrochemicznym układzie.

Przedmiotem wynalazku jest sposób elektrochemicznego oznaczania analitu w obecności oksydoreduktazy i ulegającej redukcji substancji, która otrzymywane podczas przebiegu reakcji oznaczania elektrony od oksydoreduktazy przenosi na elektrodę i tak prowadzi do sygnału, który jest miarą oznaczanego analitu, przy czym ulegająca redukcji substancja zostaje enzymatycznie zredukowana, a na elektrodzie utleniona, który to sposób charakteryzuje się tym, że powstająca na elektrodzie przez utlenienie substancja jest różna od pierwotnie użytej substancji ulegającej redukcji.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto układ elektrod czujnikowych do oznaczania analitu w ciekłej próbie, zawierający co najmniej dwa elektrycznie przewodzące środki, które występują odizolowane od siebie i które każdorazowo za pomocą elektrycznie przewodzących powierzchni mogą być doprowadzone z badaną próbą do elektrycznego kontaktu, przy czym co najmniej jedna z przewodzących elektrycznie powierzchni kontaktuje oksydoreduktazę i ulegającą redukcji substancję, która jest w stanie przenieść elektrony pomiędzy oksydoreduktazą i elektrycznie przewodzącą powierzchnią, który to układ charakteryzuje się tym, że jako ulegającą redukcji substancję stosuje się związek, który po redukcji przez oksydoreduktazę zostaje utleniony na elektrycznie przewodzącej powierzchni do substancji, która jest różna od pierwotnie użytej substancji ulegającej redukcji.

Okazało się, że niedogodności znanych ze stanu techniki sposobów elektrochemicznego oznaczania analitu w obecności oksydoreduktazy i ulegającej redukcji substancji, które spowodowane są przez wymagany wysoki potencjał, zwłaszcza przy stosowaniu nadmiaru służącej jako przenośnik elektronów ulegającej redukcji substancji wobec oznaczanego analitu, można uniknąć w większej części przez nieodwracalną reakcję. Przez to, że na elektrodzie tworzy się inna utleniona substancja niż użyta pierwotnie ulegająca redukcji substancja, można elektrochemiczne oznaczanie przeprowadzić przy szczególnie niskim potencjale i przez to bez niebezpieczeństwa reakcji zakłócających. Korzyść niskiego potencjału można również wykorzystać wówczas, gdy służącą jako nośnik elektronów ulegającą redukcji substancję stosuje się

168 023 w porównaniu do oznaczanego analitu tylko w małej ilości, a mianowicie wówczas, gdy zarówno pierwotnie użytą ulegającą redukcji substancję, jak też substancję powstającą na elektrodzie przez utlenianie redukuj cię potrzebną dla elektrochemicznego sposobu oksydnreduktaza Cłdv zarówno pierwotnie użytą ulegającą redukcji substancję, jak też substancję powstającą przez utlenienie na elektrodzie zredukuje się oksydoreduktazą do takiej samej substancji, pierwotnie użyta ulegająca redukcji substancja działa jako postać zapasowa dla drugiej prowadzonej w obiegu pomiędzy elektrodą i enzymem ulegającej redukcji substancji, która jest różna od pierwotnie użytej ulegającej redukcji substancji.

Korzyści sposobu według wynalazku uwarunkowane są tym, że jako ulegającą redukcji substancję wybiera się substancje takie, w przypadku których przez enzymatyczną redukcję powstaje związek, który można utlenić na elektrodzie przy niskim napięciu. Mianowicie przy utlenianiu na elektrodzie nie występuje jeszcze żadne znaczne stężenie tej nowej utlenionej substancji. Dotychczas musiano enzymatycznie zredukowany związek z powrotem utlenić na elektrodzie do pierwotnie użytej ulegającej redukcji substancji, która występowała już w wysokim stężeniu. Do tego był potrzebny zwiększony potencjał dodatni.

W sensie wynalazku odpowiednie do stosowania jako ulegające redukcji substancje są takie związki, które przejmują od enzymu elektrony otrzymywane przy utlenianiu substratu odpowiedniego do uzyskania oksydoreduktazy i przy tym tworzy się bogata w elektrony aromatyczna amina. Jako bogatą w elektrony aromatyczną aminę rozumie się przy tym związek, który jest bogatszy w elektrony niż anilina i z powodu bogactwa elektronów na elektrodzie może być utleniony przy niskim potencjale. W rachubę wchodzą, na przykład wszystkie pochodne aniliny, które w pierścieniu aromatycznym albo przy atomie azotu aniliny zawierają jeden albo więcej podstawników +I albo /i +M, takich jak grupy hydroksylowe, alkilowe, alkoksylowe, aryloksylowe, alkilotio, arylotio, aminowe, monoalkiloaminowe i dialkiloaminowe.

Grupami alkilowymi, ałkoksylowymi, alkilotio, monoalkiloaminowymi i dialkiloaminowymi są grupy, w których część alkilowa oznacza grupę węglowodorową o 1 - 6 atomach węgla, która ze swej strony jest ewentualnie podstawiona przez grupę hydroksylową, przez ewentualnie jedno- albo kilkakrotnie podstawioną przez grupę alkilową o 1 - 6 atomach węgla grupę aminową, przez grupę PO3H2, SO3H albo CO2H. Reszty kwasowe PO3H2, SO3H i CO2H mogą występować jako takie albo w postaci soli jako sole amonowe, sole metali alkalicznych albo metali ziem alkalicznych.

Grupy aryloksylowe i arylotio są grupami aromatycznymi o 6 - 10 atomach węgla, przy czym szczególnie wyróżniają się grupy fenoksylowe i fenylotio.

Sole amonowe zawierają jon amonowy NH/ albo występują jako jedno- lub kilkakrotnie podstawione grupami alkilowymi, arylowymi albo aryloalkilowymi kationy amoniowe. Alkil w grupach alkilowych i aryloalkilowych oznacza grupę węglowodorową o 1 - 6 atomach węgla. Aryl w grupach arylowych i aryloalkilowych jest aromatycznym układem pierścieniowym o 6 - 10 atomach węgla, przy czym wyróżnia się fenyl. Wyróżniającą się grupą aryloalkilową jest grupa benzylowa.

Solami metali alkalicznych są przeważnie sole litu, sodu albo potasu, a solami metali ziem alkalicznych są przeważnie sole magnezu i wapnia.

Jako pochodne aniliny rozumie się także związki, które przy aromatycznym układzie pierścieniowym zawierają niepodstawioną albo podstawioną jedno- lub kilkakrotnie przez podstawniki +I albo/i +M, jak na przykład przez grupę alkilową, grupę aminową, przy czym aromatyczny układ pierścieniowy jest skondensowany z jednym albo kilkoma aromatycznymi albo/i alicyklicznymi pierścieniami. Jako aromatyczne pierścienie wchodzą przy tym w rachubę zarówno układy węglowodorów aromatycznych jak też związki heteroaromatyczne. Przykładami są skondensowane pierścienie benzenowy albo naftalenowy, albo skondensowany pierścień pirydynowy.

Jako alicykliczne pierścienie rozumie się nasycone albo nienasycone związki cykloalifatyczne o 5 - 7 atomach węgla, przeważnie o 5 albo 6 atomach węgla.

Możliwymi podstawnikami alkilowymi grupy aminowej mogą być grupy węglowodorowe o 1 - 6 atomach węgla, które ze' swej strony ewentualnie mogą być podstawione przez grupę hydroksylową, przez ewentualnie jedno- albo kilkakrotnie podstawioną przez grupę alkilową o

168 023

- 6 atomach węgla grupę aminową, PO3H2, SO3H i CO2H. Reszty kwasowe PO3H2, SO3H i CO2H występują jako takie albo w postaci soli jako sole amonowe, sole metali alkalicznych albo metali ziem alkalicznych, których również dotyczy wyżej podana definicja.

Wyżej podanych przykładów podstawników +I albo/i +M nie należy rozumieć jako pełnego wyliczenia. Fachowiec w poszczególnym przypadku będzie wiedział, czy podana grupa jest podstawnikiem +I albo/i +M i jak dalece wszystkie te grupy powinny być możliwymi podstawnikami w bogatych w elektrony aromatycznych aminach, które mogą być stosowane według omawianego wynalazku.

Jako ulegające redukcji substancje, które przy przyjmowaniu elektronów od oksydoreduktazy prowadzą do bogatej w elektrony aromatycznej aminy, która potem na elektrodzie zostaje utlenionaprzy niskim potencjale, wyróżniają się szczególnie związki z grupy związków o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza bogatą w elektrony aromatyczną grupę, a X oznacza grupę NO albo NHOH, oraz związki o wzorze ogólnym 2, w którym Y oznacza chinoidowy układ, który po redukcji w aromatycznym stanie może być określony jako bogaty w elektrony.

Pod bogatą w elektrony aromatyczną grupą rozumie się przy tym możliwości podane wyżej dla bogatych w elektrony aromatycznych amin.

Takie, ulegające redukcji substancje stosowane w sposobie według wynalazku przy przyjmowaniu elektronów od oksydoreduktazy zostają zredukowane do aromatycznych amin, a przy utlenianiu na elektrodzie nie zostają utlenione do pierwotnych ulegających redukcji substancji. Jak wiadomym jest fachowcowi, przy elektrochemicznym utlenianiu bogatych w elektrony aromatycznych amin elektrony usuwane są z grupy arylowej, tak że otrzymuje się rodniki albo chinoidowe układy. Jednak nie powstają chinoidowe oksymy, hydroksyloaminy i związki nitrozowe.

Elektrochemicznie utleniane związki często ze swej strony mogą znowu przyjmować elektrony od oksydoreduktazy i tak ulegać znowu redukcji do bogatych w elektrony aromatycznych amin. Dlatego możliwe jest również stosowanie ulegających redukcji substancji według wynalazku w małym stężeniu, to znaczy w nadmiarze, w stosunku do oznaczanego -analitu. Działają one jako postać zapasowa dla bogatych w elektrony aromatycznych amin tworzonych przy przyjmowaniu elektronów od oksydoreduktazy, które mogą być prowadzone w obiegu jako przenośniki elektronów pomiędzy oksydoreduktazą i elektrodą.

Wyróżniającymi się przykładami dla przenośników elektronów według wynalazku są następujące związki:

N-/2-hydroksyetylo/-N’-p-nitrozofenylopiperazyna,

N,N-bis-/2-hydroksyetylo/-p-nitrozoanilina, o-metoksy-[N,N-bis-72-hydroksyetylo/]-p-nitrozoanilina, p-hydroksynitrozobenzen,

N-metylo-N’74-nitrozofenylo/-piperazyna, p-chinonodioksym,

N,N-dimetylo-p-nitrozoanilina,

N,N-dietylo-p-nitrozoanilina,

HN-/4-nitrozofenylo/-morfolina,

N-benzylo-N-/5’-karboksypentylo/-p-nitrozoanilina,

N,N-dimetylo-4-nitrozo-:ł-naftyloamina,

N,N,3-trimetylo-4-nitrozoanilina,

N-/2-hydroksyetylo/-5-nitrozoindoliria,

N,N-bis72-hydroksyetylo/-3-chloro-4-nitrozoanilina,

2,4-dimetoksynitrozobenzen,

N,N-bis72-metoksyety'lo/-4-nitiOz.oanilina,

3-metoksy-4-nitrozofenol,

N-/2-hydroksyetylo/-6-nitrozo-1,2,3,4-tetrahydrochinolina,

N,N-dimetylo-3-chloro-4-nitrozoanilina,

N,N-bi,s72-hydlroksyetylo/-3-fluoro-4--nitrozoanilina,

N,N-bis-/2-hydroksyetylo/-3-metylotio-4-nitrozoanilina,

N-/2-hydroksyetylo/-N-[2-/2-nletoksyetoksy/-etylo]-4-nitrozoarilina,

168 023

N-/2-hydroksyetylo/-N-/3-metoksy-2-hydroksy-1-propylo/-4-nitrozoanilina,

N-/2-hydroksyetylo/-N-[3-/2-hydroksyetoksy/-2-hydroksy-1-propylo]-4-nitrozoanilina,

NT_/9_h'ł,r)rnVcv<»tx;ln/-M-r9_/9_hvHm1<'cvetnVcv/-ptv1'>T-<l_nitrr>’7nQni lino

X 5 / NJ /U —hvu J Ό ike y o /> [ tij J sy eto j · ^vvj^r « n^n tr ozonnA juw·

Szczególnie wyróżniającą się według wynalazku substancją ulegającą redukcji jest N,Nbis-/2-hydroksyetylo/-p-nitrozoanilina. Całkiem szczególnie wyróżnia się N-/2-hydroksyetylo/N-[2-/2-hydroksyetoksy/-etylo]-4-nitrozoanilina.

Wiele związków o wzorze ogólnym 1 odpowiednich do stosowania według wynalazku jest znanych. Nowymi związkami są pochodne nitrozoaniliny o wzorze ogólnym 3, w którym R¹ oznacza atom wodoru albo chlorowca, grupę alkoksylową albo alkilotio, R² oznacza grupę alkilową, a R³ grupę hydroksyalkilową albo R² i R³ są jednakowe albo różne i oznaczają każdorazowo grupę dialkiloaminoalkilową, ewentualnie podstawioną w części alkilowej przez grupę hydroksylową grupę hydroksyalkoksyalkilową albo alkoksyalkilową, albo grupę poliakoksyalkilową, która ewentualnie w części alkilowej jest podstawiona przez grupę hydroksylową, albo r2 i R3 tworzą grupę alkilenową poprzerywaną przez siarkę lub azot, przy czym atom azotu jest podstawiony przez grupę alkilową, hydroksyalkilową, hydroksyalkoksyalkilową, alkoksyhydroksyalkilową, dioksanyliloalkilową albo przez grupę polialkoksyalkilową, która ze swej strony każdorazowo ewentualnie w części alkilowej jest podstawiona przez grupę hydroksylową, albo gdy Ri znajduje się w pozycji orto do grupy NR²r3, r2 także razem z R' oznacza grupę alkilenową, przy czym r3 oznacza wtedy grupę hydroksyalkilową albo gdy grupa alkilenowa zawiera 3 atomy węgla, R3 oznacza także grupę alkilową, albo gdy R' jest różne od atomu wodoru, r2 i r3 , które są jednakowe albo różne, oznaczają każdorazowo grupę hydroksyalkilową, albo sole tych pochodnych.

Przy tym chlorowiec oznacza fluor, chlor, brom albo jod, a zwłaszcza wyróżnia się fluor i chlor.

Grupy alkilowe, alkoksylowe albo alkilotio wykazują 1 - 6 atomów węgla, a szczególnie korzystnie 1 - 3 atomów węgla. Podane wyżej określenia dla grupy alkilowej dotyczą również części alkilowej w grupach hydroksyalkilowych, dialkiloaminoalkilowych, hydroksyalkoksyalkilowych, alkoksyalkiiowych, polialkoksyalkilowych, alkoksyhydroksyalkilowych i grup dioksanyliloalkilowych. Grupa dioksanyliloalkilowa jest grupą, w której układ pierścieniowy dioksanu przyłączony jest do grupy alkilowej. Przeważnie chodzi o układ pierścieniowy 1,4-dioksanu o wzorze 5. Grupą polialkoksyalkilową jest grupa -alkilo-/alkoksy/_n-alkoksylowa, przy czym n = 1 - 10, korzystnie n = 1- 4, a zwłaszcza n = 1 - 3. Grupa alkilenowa jest prostym albo rozgałęzionym, zwłaszcza prostym, nasyconym albo nienasyconym, zwłaszcza nasyconym łańcuchem węglowodorowym zawierającym 2-5, przeważnie 2-4 atomów węgla, z dwoma wolnymi wiązaniami. W przypadku, gdy r2 i r3 tworzą poprzerywaną przez siarkę albo azot grupę alkilenową, wyróżnia się utworzona przez włączenie atomu azotu o wzorze ogólnym 3 grupa tiomorfolinowa względnie piperazynowa, przy czym szczególnie wyróżnia się grupa piperazynowa.

Gdy R1 i R2 tworzą grupę alkilenową, wyróżnia się utworzona przez włączenie aromatycznego pierścienia o wzorze ogólnym 3 grupa indolinowa albo 1,2,3,4-tetrahydrochinolinowa.

Jako sole wytwarzanej pochodnej nitrozoaniliny o wzorze ogólnym 3 wyróżniają się zwłaszcza sole silnych kwasów, szczególnie kwasów mineralnych, jak kwasu solnego, siarkowego, azotowego i fosforowego. Całkiem szczególnie wyróżniają się chlorowodorki, to znaczy sole kwasu solnego.

Z nowych pochodnych nitrozoaniliny wyróżniają się przede wszystkim następujące związki:

a/2,2’-[/3-fluoro-4-nitrozofenylo/-imino]bis-etanol, b/2,2’-[/3-chloro-4-nitrozofenylo/-imino]bis-etanol, c/2,2’-[/3-metoksy-4-nitrozofenylo/-imino]bis-etanol, d/2,2’-[/3-metylomerkapto-4-nitrozofenylo/-imino]bis-etanol, e/2-[22-hydroksyetoksy/-etylo-/4-nitrozofenylo/-amino]-etanol, f/2-[/2-metoksyetoksy/-etylo-/4-nitrozofenylo/-amino]-etanol, g/ l-[N-/2-hydroksyetylo/-/4-nitrozoanilino/]-3-metoksy-2-propanol, h/ l-[N-/2-hydroksyetylo/-/4-nitrozoanilino/]-3-/2-hydroksyetoksy/-2-propanol,

168 023 i/ 1 -metylo-4-/4-nitrozofenylo/-piperazyna, j/4-/4-nitrozofenylo/-1-piperazynoetanol, k/ 5-n'itrozo-1-indolinoetanol, l/ 1 -metylo-6-nitrozo-1,2,3,4-tetrahydrochinolina, m/ 6-nitrozo-3,4-dihydro-1/2H/chinolinoetanol oraz ich sole.

Z powyższych związków szczególnie wyróżniają się związki a/, d/, e/, f/, g/ i h/ oraz ich sole, a całkiem szczególnie wyróżnia się związek e/ względnie jego sole, zwłaszcza chlorowodorek.

Związki o wzorze ogólnym 3 można wytwarzać przez reakcję związku o wzorze ogólnym 4, w którym r1 R² i R³ mają takie samo znaczenie jak w związkach o wzorze ogólnym 3, z azotynem. Analogiczny sposób znany jest z J.J. D’Amico i współpracownicy, J. Amer. Chem. Soc. 81, 5957/1959/.

Jako azotyn stosuje się przede wszystkim azotyn metalu alkalicznego, przy czym jako metal alkaliczny w rachubę wchodzi lit, sód, potas, rubid albo cez. Korzystnie stosuje się azotyn sodu i potasu, a zwłaszcza azotyn sodu. Reakcję prowadzi się korzystnie w środowisku kwaśnym w niskiej temperaturze, korzystnie poniżej 10°C, a zwłaszcza w temperaturze -10 - +5°C. Reakcję związku o wzorze ogólnym 4 z azotynem prowadzi się korzystnie w środowisku wodnym, przy czym pH powinno wynosić korzystnie poniżej 3, a zwłaszcza poniżej 2.

Korzystnie postępuje się w ten sposób, że związek o wzorze ogólnym 4 albo jego sól, zwłaszcza sól mineralnego kwasu, jak kwasu solnego, siarkowego, azotowego albo fosforowego umieszcza się w wodnym kwaśnym środowisku i chłodzi. Przy utrzymywaniu niskiej temperatury mieszaniny reakcyjnej dodaje się azotyn, korzystnie w rozpuszczonej postaci. Jako rozpuszczalnik azotynu stosuje się korzystnie środowisko wodne. Po dodaniu azotynu aż do zakończenia reakcji utrzymuje się mieszaninę reakcyjną w niskiej temperaturze. Następnie mieszaninę reakcyjną ekstrahuje się organicznym rozpuszczalnikiem i produkt reakcji wyodrębnia z ekstraktu.

Związki odpowiednie do stosowania w sposobie według wynalazku jako przenośniki elektronów mogą być składowane i stosowane.w utlenionej postaci. Przez to unika się prądu rozruc howego, a oznaczania punktu końcowego można przeprowadzić z nadmiarem przenośnika elektronów. Stosowane w sposobie według wynalazku jako przenośniki elektronów związki są trwałe podczas składowania i mogą wchodzić w szybką reakcję z oksydoreduktazą. Są one konkurencyjne wobec tlenu przede wszystkim przy użyciu oksydaz i można je stosować także w nadmiarze wobec najwyższego stężenia oznaczanego analitu. Szczególnie wymieniona na końcu właściwość jest możliwa dzięki dobrej rozpuszczalności w środowisku wodnym przenośnika elektronów stosowanego w sposobie według wynalazku. Szczególną korzyścią związków odpowiednich do użycia w sposobie według wynalazku jako przenośnik elektronów jest ich właściwość polegająca na tym, że przy elektrochemicznym oznaczaniu analitów w płynach ustrojowych w ogóle nie albo tylko w nieznacznej mierze występuje nieenzymatyczna redukcja przez działające redukująco substancje w płynach ustrojowych. Nośniki elektronów stosowane w sposobie według wynalazku na powierzchni elektrod zostają szybko utlenione, a w zredukowanej postaci nie są wrażliwe na tlen. Przy zastosowaniu tych związków utlenianie na elektrodzie zachodzi przy niskim potencjale.

Odnośnie analitu zwykle chodzi o składnik mieszaniny substancji. Zgodnie z tym sposób według wynalazku wykazuje korzyści przede wszystkim przy oznaczaniu analitu w płynie ustrojowych, jak we krwi, osoczu, surowicy albo moczu, ponieważ przy tym bardzo mocno zależy na specyficznej reakcji tylko jednego składnika biologicznego wieloskładnikowego układu.

Sposób według wynalazku elektrochemicznego oznaczania analitu polega na tym, że analit sam zostaje utleniony przez oksydoreduktazę, a więc stanowi odpowiedni substrat enzymu, albo analit w jednej lub kilku wstępnych reakcjach, przeważnie w reakcjach enzymatycznych, przeprowadza się w związek, który może być utleniony przez oksydoreduktazę. Otrzymywane przy takim utlenianiu elektrony są proporcjonalne do ilości oznaczanego analitu. Jeżeli te elektrony zostaną przeprowadzone na elektrodę przez stosowaną w sposobie według wynalazku

168 023 ulegającą redukcji substancję, wówczas prowadzi to do sygnału, który jest miarą oznaczanego analitu. Możliwe są sposoby amperometryczne, przy czym mierzy się prąd, albo potencjometria, to znaczy nomiar naniecia

Dla sposobu według wynalazku jako oksydoreduktazy wyróżniają się oksydazy, niezależnie od NAD/P/ dehydrogenazy albo diaforazy. Sposobem według wynalazku można oznaczać na przykład glukozę oksydazą glukozową, mleczan oksydazą mleczanową, glicerynofosforan za pomocą oksydazy glicerynofosforanowej albo cholesterol za pomocą oksydazy cholesterolowej. Jako niezależną od NAD/P/ dehydrogenazę można stosować na przykład układ glukoza-barwnik-oksydoreduktaza do oznaczania glukozy. Diaforazę, którą można określać również jako NADH:barwnik-oksydoreduktaza, można korzystnie stosować do oznaczania NADH.

W przypadkach, w których należy oznaczyć analit, który nie sam służy jako substrat dla oksydoreduktazy, można ten analit drogą jednej lub kilku wstępnych reakcji, zwłaszcza reakcji enzymatycznych, przeprowadzić w związek, który akceptowany jest jako substrat oksydoreduktazy. Na przykład triglicerydy można oznaczać tak, że rozszczepia się je esterazą na reszty glicerynowe i kwasowe, glicerynę za pomocą kinaz glicerynowych i ATP przeprowadza się w glicerynofosforan i ten następnie utlenia się za pomocą oksydazy glicerynofosforanowej, i otrzymywane przy tym elektrony oddane zostają przez przenośnik elektronów stosowany w sposobie według wynalazku na elektrodę, przy czym wytwarza się prąd, który jest proporcjonalny do ilości triglicerydów w oznaczanej próbie.

Analogicznie można oznaczyć na przykład również całkowity cholesterol w ten sposób, że ester cholesterolowy rozszczepia się esterazą cholesterolową i tak otrzymany cholesterol można oznaczyć za pomocą oksydazy cholesterolowej. Również tu ilość tak utworzonego choresterolu oraz ilość uwolnionych przy utlenianiu za pomocą oksydazy cholesterolowej elektronów, które przenosi na elektrodę ulegająca redukcji substancji stosowana w sposobie według wynalazku i tak powstaje prąd, jest proporcjonalna do oznaczanej ilości całkowitego cholesterolu.

Do oznaczania NADH odpowiedni jest enzym diaforaza. Za pomocą ulegających redukcji substancji stosowanych w sposobie według wynalazku można przenosić elektrony również od diaforazy na elektrodę. Ze względu na to, że wiele biologicznych substancji może reagować enzymatycznie z utworzeniem NADH, można tą drogą wiele analitów przez enzymatyczne sekwencje reakcji przekształcić w NADH i ten potem oznaczyć na elektrodzie poprzez diaforazę i zastosowaną w sposobie według wynalazku substancję ulegającą redukcji.

Na podstawie powyższych rozważań rozumie się, że sposobem według wynalazku można oczywiście oznaczać także oksydoreduktazy, gdy stosuje się odpowiedni związek, który przyjmuje się jako substrat enzymu, i zgodną ze sposobem według wynalazku substancję ulegającą redukcji. Tak można elektrochemicznie oznaczać na przykład oksydazę glukozową, gdy glukozę i zgodny ze sposobem według wynalazku przenośnik elektronów skontaktuje się z oznaczaną próbą w obecności układu elektrod czujnikowych.

Sposób według wynalazku odznacza się przede wszystkim tym, że stosowana do przenoszenia elektronów od oksydoreduktazy na elektrodę ulegająca redukcji substancja w postaci utlenionej jest trwała podczas składowania i poza tym dobrze rozpuszczalna w wodzie, co jest bardzo ważne dla oznaczania analitów w płynach ustrojowych, jak we krwi, osoczu, surowicy i moczu. Odpowiednie do stosowania według wynalazku ulegające redukcji substancje wykazują szybką reakcję z oksydoreduktazami i są szczególnie konkurencyjne wobec tlenu, zwłaszcza przy reakcji z oksydazami. Na podstawie swej rozpuszczalności można je stosować bardzo dobrze dla amperometrycznych sposobów punktu końcowego, gdzie wymagany jest nadmiar wobec najwyższego stężenia oznaczanego analitu. Ze względu na to, że odpowiednie do stosowania według wynalazku ulegające redukcji substancje w płynach ustrojowych są tylko w pomijalnej mierze redukowane nieenzymatycznie przez obecne tam substancje redukujące, zostają szybko utlenione na powierzchni elektrody, a w zredukowanej postaci są nieznacznie wrażliwe na tlen, substancje te nadają się bardzo dobrze do specyficznych, wolnych od zakłóceń elektrochemicznych oznaczeń analitu. Możliwość wolnych od zakłóceń i specyficznych elektrochemicznych oznaczeń analitu uwarunkowana jest poza tym przede wszystkim tym, że odpo10

168 023 wiednie do stosowania według wynalazku ulegające redukcji substancje wymagają tylko małego potencjału elektrod.

Sposób według wynalazku elektrochemicznego oznaczania analitu nie jest ograniczony do pewnych elektrochemicznych urządzeń. Można tu stosować na przykład układy elektrod czujnikowych ze stanu techniki. Do oznaczania analitu w ciekłej próbie odpowiednie są zasadniczo układy elektrod czujnikowych, które jako elektrody zawierają co najmniej dwa elektrycznie przewodzące środki, które występują odizolowane od siebie i które każdorazowo można doprowadzić do elektrycznego kontaktu z badaną próbą za pomocą elektrycznie przewodzącej powierzchni. Przy tym możliwe jest także stosowanie dwu elektrod, a mianowicie elektrody roboczej i elektrody odniesienia. Możliwe jest także urządzenie pomiarowe bez elektrody odniesienia, to znaczy tylko z elektrodą roboczą i przeciwelektrodą. Przy tym należy jedynie na zewnątrz utrzymać stałe napięcie. Ale możliwe jest również zastosowanie trzech elektrod, a mianowicie elektrody odniesienia, roboczej i przeciwelektrody. Odpowiednie układy elektrod czujnikowych znane są ze stanu techniki, na przykład z G. Henze i R. Neeb, Elektrochemische Analytik, wydawnictwo Springer/1986/.

Ważne jest, że dla elektrochemicznego oznaczania analitu /co najmniej/ jedna elektroda, to znaczy elektrycznie przewodząca powierzchnia kontaktuje oksydoreduktazę i ulegającą redukcji substancję, którajest w stanie przenosić elektrony pomiędzy oksydoreduktazą i elektrycznie przewodzącą powierzchnią. Przy tym możliwa jest taka sytuacja, że wszystkie potrzebne odczynniki znajdują się razem z badaną próbą w roztworze, albo że część odczynników, przeważnie oksydoreduktaza i/albo przenosząca elektrony substancja ulegająca redukcji są unieruchomione na jednej elektrodzie, a reszta znajduje się w roztworze, albo że wszystkie potrzebne do‘ oznaczania odczynniki są unieruchomione na jednej elektrodzie. Zasadniczo dla funkcji układu elektrod czujnikowych nie jest decydujące, czy elektroda robocza kontaktuje oksydoreduktazę i służącą jako przenośnik elektronów ulegającą redukcji substancję jako substancje rozpuszczone, albo czy te substancje nanoszone są na elektrodę jako stałe substancje i ewentualnie przy skontaktowaniu z oznaczoną ciekłą próbą rozpuszczają się, albo także po skontaktowaniu z oznaczaną ciekłą próbą pozostają unieruchomione na elektrodzie.

Powyższy opis dotyczy analogicznie oznaczania oksydoreduktazy. Ale wówczas należy zwrócić uwagę na to, że układ elektrod czujnikowych kontaktuje substrat oksydoreduktazy i stosowaną w sposobie według wynalazku ulegającą redukcji substancję. Poza tym dla tego przypadku odpowiednio ważne są opisane wykonania oznaczania analitu.

Załączone figury objaśniają bliżej wynalazek, przy czym:

Figura 1 przedstawia w części a/ schemat funkcjonalny odpowiednich do stosowania według wynalazku ulegających redukcji substancji w sposobie i układach elektrod czujnikowych według wynalazku, gdy stężenie nośnika elektronów jest większe albo równe stężeniu oznaczanego analitu.

Figura 1 w części b/ przedstawia schemat funkcji substancji przenoszących elektrony w sposobie i układach elektrod czujnikowych stanu techniki.

Figura 2 w części a/ przedstawia schemat funkcji odpowiednich do stosowania w sposobie według wynalazku ulegających redukcji substancji w zgodnym z wynalazkiem sposobie i układach elektrod czujnikowych, gdy stężenie substancji przenoszącej elektronyjest bardzo dużo mniejsze niż stężenie oznaczanego · analitu.

Figura 2 w części b/ przedstawia schemat funkcji substancji przenoszących elektrony w sposobie i układach elektrod czujnikowych stanu techniki.

Figura 3 przedstawia.układ elektrod czujnikowych dla przeprowadzenia sposobu według wynalazku, w którym potrzebne substancje występują w roztworze.

Figura 4 przedstawia układ elektrod czujnikowych do przeprowadzenia sposobu według wynalazku, który pomyślany jest jako czujnik jednorazowy.

Figura 5 przedstawia wykres, z otrzymanymi z cykiowoltanimogramu wartościami dla maksimów gęstości prądu anodowego przy różnych stężeniach glukozy z N,N-bis-/2-hydroksyetylo/-p-nitrozoanilinąjako substancją przenoszącą elektrony w zgodnym z wynalazkiem elektrochemicznym teście glukozowym.

168 023

Figura 6 przedstawia wykres stosunku między gęstością prądu i stężeniem NADH w zgodnym z wynalazkiem teście NADH.

Figura 7 przedstawia cyklowoltammogram dla N-/2-hydroksyetylo/-N’-p-nitrozofenylopiperazyny i N,N-bis-/2-hydlroksyetylo/-p-nitrozoaniliny.

Figura 8 przedstawia wykres zależności gęstości prądu od stężenia glukozy według sposobu zgodnego z wynalazkiem z N-metylo-N’-/4-nitrozofenylo/-piperazyną jako substancją przenoszącą elektrony w obecności i nieobecności tlenu powietrza.

Figura 9 przedstawia wykres zależności gęstości prądu od stężenia glukozy według sposobu stanu techniki z tetratiafulwalenem jako substancją przenoszącą elektrony w obecności i w nieobecności tlenu powietrza.

Figura 10 przedstawia wykres zależności gęstości prądu do stężenia LDH według sposobu zgodnego z wynalazkiem z N,N-bis-/2-hydroksyetylo/-p-nitrozoanilinąjako substancją przenoszącą elektrony przy różnych czasach po rozpoczęciu reakcji oznaczania przez dehydrogenazę mleczanową. ,

Figura 11 przedstawia krzywe prąd-czas dla sposobu według wynalazku z jednorazową elektrodą według fig. 4 po 10 sekundach reakcji.

Figura 12 przedstawia wykres zależności prądu od stężenia glukozy według sposobu zgodnego z wynalazkiem przy użyciu jednorazowej elektrody według fig. 4 po 10 minutach reakcji.

Na figurach 1 i 2 przedstawione są różnice pomiędzy sposobem według wynalazku a/ i sposobem ze stanu techniki b/ przy zastosowaniu nadmiaru substancji przenoszącej elektrony powyżej oznaczany analit /fig. 1/i przy użyciu substancji przenoszącej elektrony w ilości bardzo małej w porównaniu ze stężeniem analitu /fig. 2/. Według sposobu stanu techniki zgodnie z fig. 1 b/ substancja przenosząca elektrony /Eox 1/ w obecności oznaczanego analitu albo pochodzącej od analitu substancji /S_red/, która jest utleniana enzymatycznie do /Sox/, jest przeprowadzana w postać zredukowaną /Ered/. Na elektrodzie zredukowany nośnik elektronów /Ered/ zostaje przez oddanie elektronów utleniony znowu do pierwotnie użytej ulegającej redukcji substancji /Eox 1/.

Natomiast w sposobie według wynalazku zgodnie z fig. 1 a/ służąca jako przenośnik elektronów ulegająca redukcji substancja /Eox 1/ przy enzymatycznym utlenianiu oznaczanego analitu względnie pochodzącej od analitu aubstancji /Sred/ do /Sox/ zostaje przeprowadzona w zredukowaną postać /E_red/. Przy anodowym utlenianiu na elektrodzie tworzy się wówczas utleniona postać przenośnika elektronów /Eox //, która jest różna od pierwotnie zastosowanej ulegającej redukcji substancji /Eox 1/. Ze względu na całkowitą nieobecność Eox 2 na początku elektrochemicznego utleniania można utleniać Ered przy szczególnie niskim potencjale. Stosowaną w sposobie według wynalazku przenoszącą elektrony ulegającą redukcji substancję /Eox 1/ można wybrać tak, że dla anodowego utleniania enzymatycznie utworzonej zredukowanej postaci /Ered' wystarcza względnie niski potencjał. Przez to można uniknąć zakłócających reakcji ubocznych, które powstają, gdy przy przyłożeniu wysokiego potencjału do elektrod zostają utlenione występujące w badanej próbie substancje towarzyszące, co prowadzi do przepływu prądu, a zatem do fałszywie dodatniego wyniku. W przypadku sposobu według stanu techniki zgodnie z fig. 1 b/ do ponownego utlenienia enzymatycznie utworzonej zredukowanej postaci przenośnika elektronów /E_red/ z powodu nadmiaru Eox 1 wymagany jest wyższy potencjał niż potencjał pierwotnie stosowanej ulegającej redukcji substancjj /Eox 1/.

Jeżeli służącą jako przenośnik elektronów ulegającą redukcji substancję /Eox 1/ stosuje się w niedomiarze w stosunku do oznaczanego analitu względnie pochodzącej od oznaczanego analitu substancji /Sred/, wówczas w sposobie według stanu techniki /fig. 2 b/ ulegającą redukcji substancję można prowadzić w obiegu pomiędzy elektrodą i enzymem, ponieważ zredukowana postać /Ered/ zostaje znowu anodowo utleniona napierwotnie użytą ulegającą redukcji substancję /Eox 1/Sposobem według wynalazku /fig. 2 a/, gdy utworzona na elektrodzie utleniona postać przenośnika elektronów /Eox2/jest redukowana przez zredukowany enzym równie jak pierwotnie użyta ulegająca redukcji substancja /Eox 1/, wówczas Eox 1 może służyć na przykład jako trwała postać zapasowa dla układu przenoszenia elektronów Eox 2/Ered.

168 023

Dla sposobu według wynalazku można stosować zasadniczo wszystkie układy elektrod czujnikowych, które odpowiednie są również do przeprowadzania sposobów stanu techniki. Tak można stosować układ elektrod czujnikowych według fig. 3. jaki znany jest na przykład z G. Henze i R. Neeb Elektroehemische Analytik, wydawnictwo Springer/1986/.

Elektrodę roboczą 1, przeciwelektrodę 2 i elektrodę odniesienia 3 zanurza się w oznaczanej ciekłej próbie 4. Na elektrody można stosować zwykłe materiały. Elektrodę roboczą 1 i przeciwelektrodę 2 mogą stanowić korzystnie metale szlachetne albo wytwarza się je przy współstosowaniu takich metali. Wyróżniającymi się materiałami na elektrodę roboczą 1i przeciwelektrodę 2 jest na przykład złoto i platyna. Elektrodę odniesienia 3 można wykonać również ze stosowanych do tego układów, korzystnie na przykład z układu srebro/chlorek srebra. Elektroda odniesienia 3 jest w kontakcie z pozostałym układem elektrod /1, 2/ w oznaczanej ciekłej próbie 4 korzystnie przez klucz elektrolityczny na przykład roztwór chlorku potasu.

Potrzebna dla sposobu według wynalazku oksydoreduktaza względnie układ oksydoreduktazy / w zależności od tego, czy ma być oznaczany analit czy oksydoreduktaza/ i służąca jako przenośnik elektronów ulegająca redukcji substancja mogą występować w oznaczanej próbie 4 w postaci rozpuszczonej albo mogą one w całości albo częściowo znajdować się na elektrodzie roboczej 1. Dla fachowca jest oczywiście zrozumiałe jak należy elektrody elektrycznie łączyć ze sobą i regulować, zależnie od mierzonego sygnału elektrycznego.

Na fig. 4 przedstawiona jest konstrukcja jednorazowej elektrody, jaką stosuje się na przykład do oznaczania glukozy. Na izolowany nośnik 8, na przykład folię poliwęglanową, można nanieść odpowiednimi metodami potrzebne elektrody i przynależne doprowadzenia. Odpowiednimi metodami są np. sposób sitodruku, sposób wstrzykiwania, naparowywania albo technika cienkowarstwowa. Na fig. 4, 5 oznacza elektrodę roboczą, 55 oznacza przynależne elektrycznie przewodzące doprowadzenia, 6 oznacza elektrodę odniesienia z doprowadzeniem 66, a 7 oznacza przeciwelektrodę z odpowiednią szyną przewodzącą 77. Na elektrody i szyny przewodzące można stosować znane elektrycznie przewodzące materiały; na przykład do wytworzenia elektrycznie przewodzących doprowadzeń do elektrod można stosować handlowe pasty grafitowe do druków. Elektrody zawierają przeważnie szlachetne metale, jak srebro, złoto albo platynę. W zgodnym z wynalazkiem układzie elektrod czujnikowych według fig. 4 elektroda robocza zawiera odczynniki potrzebne do przeprowadzenia elektrochemicznego oznaczenia analitu względnie oksydoreduktazy. W celu oznaczenia glukozy na przykład oksydazą glukozową, miesza się stosowaną w sposobie według wynalazku przenoszącą elektrony substancję ulegającą redukcji, substancję buforową, która optymalizuje wartość pH badanej próby dla enzymatycznej reakcji, oraz ewentualnie detergent i środek spęczniający, aby z materiałem tworzącym przewodzącą mieszaninę uzyskać konsystencję potrzebną do wytworzenia elektrody i otrzymać mieszaninę w postaci przerabialnej pasty. Jako materiał czyniący mieszaninę przewodzącą dodaje się na przykład proszek grafitowy. Elektrodę odniesienia 6 i przeciwelektrodę 7 można wytwarzać jak i odpowiednie doprowadzenia 66 i 77 na przykład ze znajdujących się w handlu srebrowych past przewodzących, które zawierają sproszkowany chlorek srebra. Układ elektrod czujnikowych według fig. 4 wytwarza się o wymiarach około 10 x 30 mm. Badany roztwór można nanieść na powierzchnie elektrod albo w badanym roztworze zanurza się tak testowy nośnik, że powierzchnie elektrod pokryte są cieczą. W przypadku pomiaru amperometrycznego można do elektrod przyłożyć potencjał i zmierzyć prąd, który jest proporcjonalny do ilości oznaczanego analitu.

Do tego pomiędzy przeciwelektrodą 7 i elektrodą roboczą 5 prąd jest mierzony i regulowany tak, żeby pomiędzy elektrodą odniesienia 6 i elektrodą roboczą 5 utrzymać podane wyżej napięcie. Pomiar napięcia pomiędzy elektrodą roboczą 5 i elektrodą odniesienia 6 następuje bezprądowo, tak że oporności szyny przewodzącej nie odgrywają żadnej roli. W przypadku mniejszego wymagania odnośnie dokładności potencjałów elektrodowych można zrezygnować również z bezprądowego pomiaru napięcia albo elektrodę odniesienia 6 eksploatować jednocześnie jako przeciwelektrodę 7.

168 023

Poniższe przykłady objaśniają bliżej wynalazek.

Przykład I. Próba glukozowa

Stosuje się tu układ elektrod czujnikowych według fig 3 . Elektroda robocza 1 wykonana jest ze złotego drutu o powierzchni 0,1 cm². Przeciwelektroda 2 wykonana jest z platynowego drutu o powierzchni 0,1 cm2, a elektrodę odniesienia 3 stanowi układ srebro/chlorek srebra firmy Orion Research Inc. /Boston, Massachusetts, Stany Zjed. Am./.

W naczyniu reakcyjnym znajduje się roztwór złożony z 0,1 mola/l buforu fosforanu potasu i 0,1 mola/l chlorku potasu, pH 7,0; 10mmoli/l N,N-bis-/2-hydroksyetylo/-p-nitrozoaniliny i glukozy w stężeniu 0-100 mmoli/l.

Reakcję oznaczania wywołuje się przez dodanie do mieszaniny reakcyjnej oksydazy glukozowej /EC . 1.1.3.4/ i następnie mieszanie. Oksydazy glukozowej dodaje się tyle, żeby stężenie jej w mieszaninie reakcyjnej wynosiło 0,5 mg/ml 125 U/ml/. Minutę po dodaniu oksydazy glukozowej za pomocą potencjostatu /Mod. 273 EG & G, Princeton Applied Research, Princeton, New Jersey, USA/ mierzy się cyklowoltammogram przy szybkości badania 100 mV/s. Ocenia się prądy pierwszego maksimum utleniania przy 150 mV. Otrzymane wyniki przedstawione są na fig. 5. Odpowiednie pomiary po upływie 5 minut do dodania oksydazy glukozowej albo przy wykluczeniu tlenu /pod argonem/ nie dają żadnej znacznej zmiany.

Jak wydać na wykresie według fig. 5, aż do stężenia glukozy wynoszącego około 30 mmoli/1 okazuje się liniowa zależność maksimum gęstości prądu anodowego od stężenia glukozy. Przy stężeniu glukozy wyższym niż 30 mmoli/l zastosowana jako substancja przenosząca elektrony N,N-bis-/2-hydroksyetylo/-p-nitrozoanilina przereagowuje całkowicie do odpowiedniej fenylenodiaminy. Dlatego stężenia glukozy wyższe niż 30 mmoli/l nie prowadzą do dalszego podwyższenia prądu. Ze względu na to, że dla wytworzeniajednej cząsteczki fenylenodiaminy potrzebne są dwie cząsteczki glukozy, a tylko około dwie trzecie całkowitej glukozy występuje w odmianie β i zatem jest do dyspozycji dla reakcji przemiany za pomocą oksydazy glukozowej, znaleziona całkowita przemiana 10 mmoli/l substancji przenoszącej elektrony przez 30 mmoli/1 glukozy odpowiada dokładnie teoretycznej stechiometrii.

W przypadku zastosowania układu glukoza-barwnik-oksydoreduktaza /EC 1.1..99.17/ zamiast oksydazy glukozowej /EC 1.1.3.4./ w 0,1 mola/1 buforu tris, 0,1 mola/l chlorku potasu, pH 7 przy dodaniu 1% albuminy surowicy bydlęcej otrzymuje się porównywalne wyniki.

Przykład II. Oznaczanie NADH

Budowa i układ pomiarowy, jak opisane w przykładzie I.

Naczynie reakcyjne zawiera

0,1 mola/l buforu fosforanu potasu, 0,1 mola/l chlorku potasu, pH 7,0;

mmoli/l N,N-bis-/2-hydroksyetylo/-p-nitrozoaniliny i NADH w stężeniach 0-10 mmoli/l.

Pomiar rozpoczyna się przez dodanie i wymieszanie diaforazy /NADH:barwnik-oksydoreduktaza/ z mikroorganizmów i wymieszanie enzymu z mieszaniną reakcyjną. Enzymu dodaje się tyle, żeby stężenie jego w mieszaninie reakcyjnej wynosiło 0,2 mg/ml /3 U/ml/. Pomiar gęstości prąciu po czasie reakcji wynoszącym 1 minutę daje przedstawioną na fig. 6 liniową zależność gęstość prądu-stężenie.

Przykład III. Oznaczanie mleczanu

Mleczan można oznaczać za pomocą takiego samego doświadczalnego układu i takiego samego przenośnika elektronów jak w przykładzie I. Jako enzym stosuje się oksydazę mleczanową /EC 1.1.3.2/, a 'jako bufor 0,1 mola/l buforu cytrynianowego, 0,1 mola/l chlorku potasu, pH 5,5. ~

Przykład IV. Oznaczanie glicerynofosforanu

Jeżeli w przykładzie I enzym oksydazę glukozową zastąpi się oksydazą glicerynofosforanową /EC 1.1.3.21/, a bufor zastąpi się przez 0,1 mola/l buforu tris, 0,1 mola/l chlorku potasu, pH 8,0, można analogicznie oznaczyć glicerynofosforan.

Przykład V. Oznaczanie cholesterolu

Jeżeli w przykładzie I oksydazę glukozową zastąpi się przez oksydazę cholesterolową ze Streptomyces /EC 1.1.3.6/, akceptor elektronów zastąpi się przez 10 mmoli/l N-metylo-N’-/4nitrozofenylo/-piperazynę, zaś bufor zastąpi się przez 0,1 mola/l buforu fosforanu potasu, 0,1

168 023 mola/1 chlorku potasu, pH 5,5 z 2% Triton X 100^R, można analogicznie do przykładu I oznaczyć cholesterol.

Przykład VT. Stosowane w sDOSobie według wynalazku nrzenoszace elektrony substancje ulegające redukcji

Wymienione w poniższej tabeli I związki poddaje się reakcji w stężeniu wynoszącym 10 mmoli/1 w 0,1 mola/l buforu fosforanu potasu, 0,1 mola/1 chlorku potasu, pH 7,0, z 50 mmolami/1 glukozy i 0,5 mg/ml oksydazy glukozowej /125 U/ml/. Stosuje się przy tym układ pomiarowy jak opisany w przykładzie I. Odpowiednie cyklowoltammogramy podają piki potencjałów w mV, wobec normalnej elektrody wodorowej, przenośnika elektronów redukowanego przez oksydazę glukozową i glukozę.

Jako miara szybkości reakcji podany jest w tabeli I stosunek prądu utleniającego przy potencjale najwyższego piku utleniania po jednej i 10 minutach.

Tabela I

Przenośnik elektronów	Piki potencjałów²	Szybkość reakcji^b
N72-hydroksyetylo/-N’-p-nitrozo-fenylopiperazyna	340	97
N,N-bis-/2-hydroksyetylo/-p-nitrozoanilina	210	94
o-metoksy-[N,N-bis-/2-hydroksyetylo/]-p-nitrozoanilina	170	35
p-nitrozofenol	220	62
p-chinonodioksym^c	250	35
N,N-dimetylo-4-ni trozo-1 -naftylo-amina	175	25
N,N,3-trimetylo-4-nitrozoanilina	220	56
N-/2-hydroksyetylo/-5-nitrozoindolina	80	86
N,N-bis-/2-hydroksyetylo/-3-chloro-4-nitrozoaniIina	315	72
2,4-dimetoksynitrozobenzen	130	95
N,N-bis-/2-metoksyetylo/-4-nitrozoanilina	245	68
3-metoksy-4-nitrizofenol	140	30
N-/2-hydroksyetylo/-6-nitrozo-1,2,3,4-tetrahydrochinolina	95	82
N,N-dimetylo-3-chloro-4-nitrozoandina	275	27
N,N-bis-/2-hydroksyetylo/-3-fluoro-4-mtrozoanilina	260	74
N,N-bis-/2-hydroksyetylo/-3-metylotio-4-nitrozoanilina	195	21
N-/2-hydroksyetylo/-N-2-/2-metoksyetoksy/-etylo-4-nitrozoanilina	210	59
N-/2-hydroksyetylo/-N-/3-metoksy-2-hydroksy-1-propylo/-4-nitrozoanilina	225	65
N-/2-hydroksyetylo/-N-/3-/2-hydroksyetoksy-2-hydroksy-1-pronyIo/-
-4-nitrozoanilina	210	54

a: Pierwszy pik potencjału zredukowanego oksydaza glukozowa i glukoza przenośnika elektronów w mV wobec Ag/AgCl.

b: Prad pierwszego maksimum w cyklowoltammogramie przy czasie reakcji 1 minuta: prad przy 10 minutach w %.

c: stężenie 5x10’⁴ mola/l.

Na fig. 7 przedstawione są cyklowoltammogramy dla N-/2-hyd^^k^;^i^i^^]^(^^-N’-p-nitrozofenylopiperazyry i N,N-bis-/2-hydroksyetylo/-p-nitrozoariliry. Cyklowoltammogramy mierzono za pomocą 10 mmoli/l glukozy, aby uniknąć wpływów przez reakcję resztkowej glukozy podczas ustalania cyklowoltammogramu.

Przykład VII. Porównanie nośnika' elektronów stosowanego w sposobie według wynalazku z nośnikiem elektronów według stanu techniki a/W układzie doświadczalnym jaki opisany jest w przykładzie I stosuje się N-metylo-N’i4-nitrozoferyloi-piperazyrę w stężeniu 10⁴ mola/l w buforze fosforanowym o pH 7,0. Pomiar cyklowoltammogramu przy stężeniu glukozy 0 -3 mmoli/l daje zależność gęstości prądu od stężenia glukozy, jak przedstawione jest na fig. 8. Przy ' małych stężeniach stwierdza się wpływ tlenu powietrza, który można uniknąć przez pomiar pod argonem. Taki sam wynik jak przy stosowaniu argonu jako gazu ochronnego uzyskuje się przez zastosowanie przenośnika elektro168 023 nów w wyższym stężeniu /10' mola/l. Wpływu tlenu na pomiar można również uniknąć przez użycie dehydrogenazy glukozowej zamiast oksydazy glukozowej.

b/ Jeżeli zamiast N-metylo-N’-/4-nitrozofenylo/-piperazyny jako stosowanego w· sposobie według wynalazku przenośnika elektronów użyje się tetratiafulwalen jako przenośnik elektronów stanu techniki, zależność gęstości prądu od stężenia glukozy przedstawia się, jak to jest pokazane na fig. 9. Tetratiafulwalen wykazuje znacznie większe zakłócenia tlenem niż w przypadku przenośnika elektronów stosowanego w sposobie według wynalazku. Poza tym mierzy się znacznie mniejsze gęstości prądu. Tetratiafulwalen jest rzeczywiście trudno rozpuszczalny. Aby uzyskać stężenie jego wynoszące W⁴ mola/l w buforze fosforanowym o pH 7,0, należy dodać 2,5% Tween 20R jako detergentu. Ustawienie znacznie większych stężeń tetratiafulwenu w celu zmniejszenia zakłócenia tlenem, jak to jest możliwe w przypadku przenośnika elektronów stosowanego w sposobie według wynalazku, nie wchodzi tu w rachubę z powodu trudnej rozpuszczalności.

Przykład VIII. Oznaczanie enzymu. a/ Próba dehydrogenazy mleczanowej

Analogicznie do układu testowego według przykładu I stosuje się następujące roztwory;

0,1 mola/l buforu fosforanu sodu, 0,1 mola/l chlorku potasu, pH 9,0 mmoli/l N,N-bis-/2-hydroksyetylo/-p-nitrozoaniliny

0,1 mola/l D,L-mleczanu /sól sodowa/

U/ml diaforazy z mikroorganizmów mmoli/l NaD+.

Podczas silnego mieszania/mieszadło magnetyczne, 1000 obr./minutę/ przy stałym potencjale wynoszącym 75 mV mierzy się prąd wobec srebro/chlorek srebra. Doświadczenie rozpoczyna się przez dodanie dehydrogenazy mleczanowej /EC 1.1.1.27/. Dodaje się różne ilości dehydrogenazy mleczanowej i wykonuje pomiar każdorazowo po 100,200, 300,400, 500 i 600 sekundach. Otrzymane krzywe prąd/czas przedstawione są na fig. 10. Podane na rzędnej aktywności dehydrogenazy mleczanowej ustalono według zwykłego testu redukcji pirogronianu.

b/ Próba dehydrogenazy glukozowej

Analogicznie jak opisano pod a/, w 0,1 mola/l buforu fosforanu potasu, 0,1 mola/l chlorku potasu, pH 7,0 można przeprowadzić próbę na zależną od NAD dehydrogenazę glukozową z 10 mmolami/l NAD+, 10 mmolami/l przenośnika elektronów stosowanego w sposobie według wynalazku, 1 U/ml diaforazy i 0,1 mola/l glukozy.

Odpowiednio można oznaczać oksydazy, diaforazy albo niezależne od NAD dehydrogenazy.

Przykład IX. Układ jednorazowej elektrody do oznaczania glukozy.

Układ elektrod czujnikowych według fig. 4 wytwarza się tak, że na folię poliwęglanową 8 nanosi się za pomocą sitodruku przy użyciu odpowiednich past drnkarrkich elektrodę roboczą 5, elektrodę odniesienia 6, przeciwelektrodę 7 i szyny przewodzące 55, 66, 77. Szyny przewodzące wykonane są ze znajdującej się w handlu drukarskiej pasty grafitowej /Acheson 421 SS, Deutsche Acheson Colloids, Ulm, RFN/. Elektroda odniesienia 6 i przeciwelektrodę 7 wykonane są ze znajdującej się w handlu srebrowej pasty przewodzącej, która zawiera 20% wagowych sproszkowanego chlorku srebra /Acheson Ss 24566, Deutsche Acheson Colloids, Ulm, RFN/.

Dla elektrody roboczej 5 w spęcznionych 2% wagowych hydroksyetylocelulozy /Natrosol 250 G, Hercules BV, Rijswijk, Niderlandy/ w 0,05 mola/l buforu fosforanu sodu /pH 7,0/ homogenizuje się 3 mmole/l N,N-bis-hydroksyetylo-p-nitrozoaniliny, 500 KU oksydazy glukozowej /oksydaza glukozowa, stopień czystości II, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, RFN/ na 100g mieszaniny, 30% wagowych proszku grafitowego (UF 296/97 Graphitwerke Kropfmiihl, RFN/ i 4% wagowe glikolu etylenowego.

Wielkości powierzchni elektrod są następujące; elektroda robocza 5; 4x6 mm2 = 24 mm⁷, elektroda odniesienia 6: 1 x 1,5 mm = 1,5 mm , a przeciwelektroda 7: 1 x 1,5 mm = 1,5 mm .

Wytworzony za pomocą sitodruku układ elektrod czujnikowych zanurza się w badanym roztworze, zawierającym 0,05 mola/l buforu fosforanu sodu /pH 7,0/, 0,1 mola/l chlorku sodu i

168 023

0-45 mmoli/l glukozy, tak żeby powierzchnie elektrod były przykryte przez badaną ciecz. Przy potencjale 200 mV wobec zintegrowanej elektrody odniesienia srebro/chlorek srebra 6 sporządza się krzywe prąd/czas, które przedstawione są na fig. 11. Naniesienie wartości prądu po 10-sekundowym czasie pomiaru daje pokazaną na fig. 12 krzywą wzorcowania, które podaje zależność przepływu prądu od stężenia glukozy.

R³

R²

WZÓR 1

WZÓR 4

HO-N=Y

0-Alkil

R~

WZÓR 5

CH_nCH_n0CH_nCH_oÓH ch₂ch₂oh

WZÓR 3

WZÓR 6

168 023

a) ^ox¹

Sred Enzym ^^Sox red

Elektroda

b)

Sred Enzym S ox ^;red

Elektroda

Εοχ1

Fig.1

168 023

Fig- 4

Fig. 6

2.0-10-³ 4,0-10-3 6.0-10^-3 β.Ο-ΙΟ’³ 10,0-10' stęzenie NADH w mol/l

168 023

Fig. 7

Fig. 8

O

E >>

N

O σ>

<9 o N Ctf' «♦—* in

Eg

C9 O

CD Π3 □ +·

N

J8

Fig. 9

ωο/\/π m npfejd ?5Q}sź>6

Fig 10

tn (Λ θ9 oo σι to o t>

tn tn oo oo

CsILO + X tn tn a <

168 023

Fin 11

Fig. 12

[VQJ>l!Lu]i

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób elektrochemicznego oznaczania analitu w obecności oksydoreduktazy i ulegającej redukcji substancji, która otrzymywane podczas przebiegu reakcji oznaczania, elektrony przenosi od oksydoreduktazy na elektrodę i tak prowadzi do sygnału, który jest miarą oznaczanego analitu, przy czym ulegająca redukcji substancja jest redukowana enzymatycznie, a utleniana na elektrodzie, znamienny tym, że powstająca na elektrodzie przez utlenienie substancja jest różna od pierwotnie użytej substancji ulegającej redukcji.
2 .Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zarówno pierwotnie użyta substancja ulegająca redukcji jak też substancja powstająca na elektrodzie przez utlenienie są redukowane przez oksydoreduktazę.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako ulegającą redukcji substancję stosuje się taki związek, który przyjmuje otrzymywane podczas przebiegu reakcji oznaczania, elektrony od oksydoreduktazy z utworzeniem bogatej w elektrony aromatycznej aminy.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako ulegającą redukcji substancję stosuje się związek z grupy związków o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza bogatą w elektrony aromatyczną grupę, a X oznacza grupę NO albo NHOH, oraz związków o wzorze ogólnym 2, w którym Y oznacza układ chinoidowy, który w powstającym przez redukcję stanie aromatycznym ewentualnie określa się jako bogaty w elektrony.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako oksyreduktazę stosuje się oksydazę, niezależną od NAD(P) dehydrogenazę albo diaforazę.
6. Układ elektrod czujnikowych do elektrochemicznego oznaczania analitu w ciekłej próbie, zawierający co najmniej dwa elektrycznie przewodzące środki, które każdorazowo występują odizolowane od siebie i które każdorazowo za pomocą elektrycznie przewodzących powierzchni są ewentualnie doprowadzane do elektrycznego kontaktu z badaną próbą, przy czym co najmniej jedna z elektrycznie przewodzących powierzchni kontaktuje oksydoreduktazę i ulegającą redukcji substancję, którajest w stanie przenieść elektrony pomiędzy oksydoreduktazę i elektrycznie przewodzącą powierzchnią, znamienny tym, żejako ulegającą redukcji substancję stosuje się związek, który po redukcji przez oksydoreduktazę zostaje utleniony na elektrycznie przewodzącej powierzchni do substancji, która jest różna od pierwotnie użytej substancji ulegającej redukcji.
7. Układ elektrod czujnikowych według zastrz. 6, znamienny tym, że zarówno pierwotnie użyta ulegająca redukcji substancja jak też substancja powstająca na elektrycznie przewodzącej powierzchni przez utlenienie są redukowane przez oksydoreduktazę.