PL170146B1 - Sposób wykrywania obecnosci danej sekwencji oligonukleotydowej PL - Google Patents
Sposób wykrywania obecnosci danej sekwencji oligonukleotydowej PLInfo
- Publication number
- PL170146B1 PL170146B1 PL91298545A PL29854591A PL170146B1 PL 170146 B1 PL170146 B1 PL 170146B1 PL 91298545 A PL91298545 A PL 91298545A PL 29854591 A PL29854591 A PL 29854591A PL 170146 B1 PL170146 B1 PL 170146B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- reagent
- formula
- nucleic acid
- polynucleotide
- zero
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 84
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 121
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 57
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 57
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 54
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 33
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 50
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 50
- -1 2-nitrobenzyl Chemical group 0.000 claims description 49
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 49
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 49
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 30
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 21
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 20
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 19
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 19
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 18
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 17
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 claims description 16
- 230000015843 photosynthesis, light reaction Effects 0.000 claims description 16
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 14
- 102100033072 DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Human genes 0.000 claims description 13
- 101000927313 Homo sapiens DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Proteins 0.000 claims description 13
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 12
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 12
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 11
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 claims description 10
- 125000006353 oxyethylene group Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde Diethyl Acetal Natural products CCOC(C)OCC DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 abstract description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 13
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 abstract description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 9
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 abstract 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 abstract 1
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 75
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 22
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 22
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 20
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 20
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 16
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 13
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 13
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 11
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 11
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 11
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 9
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 9
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 9
- LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro(diphenyl)methyl]-2,3-dimethoxybenzene Chemical compound COC1=CC=CC(C(Cl)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1OC LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 4-toluenesulfonyl chloride Chemical compound CC1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1 YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 8
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium fluoride Chemical compound [F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- JOOXCMJARBKPKM-UHFFFAOYSA-N 4-oxopentanoic acid Chemical compound CC(=O)CCC(O)=O JOOXCMJARBKPKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- MNKYQPOFRKPUAE-UHFFFAOYSA-N chloro(triphenyl)silane Chemical compound C=1C=CC=CC=1[Si](C=1C=CC=CC=1)(Cl)C1=CC=CC=C1 MNKYQPOFRKPUAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- BCNZYOJHNLTNEZ-UHFFFAOYSA-N tert-butyldimethylsilyl chloride Chemical compound CC(C)(C)[Si](C)(C)Cl BCNZYOJHNLTNEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 6
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 6
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 6
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 6
- RMVRSNDYEFQCLF-UHFFFAOYSA-N thiophenol Chemical compound SC1=CC=CC=C1 RMVRSNDYEFQCLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 5
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 5
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 4
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 4
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 4
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 4
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N propylamine Chemical compound CCCN WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 4
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 4
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 3
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 3
- 229940040102 levulinic acid Drugs 0.000 description 3
- 125000005524 levulinyl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000003017 phosphorus Chemical class 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 125000001981 tert-butyldimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([H])(C([H])([H])[H])[*]C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 3
- BWRBVBFLFQKBPT-UHFFFAOYSA-N (2-nitrophenyl)methanol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O BWRBVBFLFQKBPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical group [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical class [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical class OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 150000003003 phosphines Chemical class 0.000 description 2
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical group [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HJZAIMHRCPGGNJ-UHFFFAOYSA-N (2-hydroxy-1-phenylethyl) nitrate Chemical compound [O-][N+](=O)OC(CO)C1=CC=CC=C1 HJZAIMHRCPGGNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000000180 1,2-diols Chemical class 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYVFQXVSRJXIDT-UHFFFAOYSA-N 1-(2-nitrophenyl)ethane-1,2-diol Chemical compound OCC(O)C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O AYVFQXVSRJXIDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro-(4-methoxyphenyl)-phenylmethyl]-4-methoxybenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSDXVAOHEOSTFZ-UHFFFAOYSA-N 2-Pentylpyridine Chemical compound CCCCCC1=CC=CC=N1 HSDXVAOHEOSTFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-methylpyridine Natural products CC1=CC=C(C)N=C1 XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDECRAPHCDXMIJ-UHFFFAOYSA-N 2-methylbenzenesulfonyl chloride Chemical compound CC1=CC=CC=C1S(Cl)(=O)=O HDECRAPHCDXMIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDHWBEHZLFDXCU-UHFFFAOYSA-N 3-[2-cyanoethoxy-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxypropanenitrile Chemical compound N#CCCOP(N(C(C)C)C(C)C)OCCC#N LDHWBEHZLFDXCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 3-[chloro-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxypropanenitrile Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(Cl)OCCC#N QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 1
- NSPMIYGKQJPBQR-UHFFFAOYSA-N 4H-1,2,4-triazole Chemical compound C=1N=CNN=1 NSPMIYGKQJPBQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUTWPJHCRAITLU-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexan-1-ol Chemical compound NCCCCCCO SUTWPJHCRAITLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101150051010 BNA1 gene Proteins 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMHTUHZQDJLUSJ-UHFFFAOYSA-N Cl.OP(O)O Chemical class Cl.OP(O)O XMHTUHZQDJLUSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000005189 alkyl hydroxy group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N benzoyl chloride Chemical compound ClC(=O)C1=CC=CC=C1 PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000012230 colorless oil Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical group O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 1
- VNEBWJSWMVTSHK-UHFFFAOYSA-L disodium;3-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(O)=CC2=C1 VNEBWJSWMVTSHK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000001033 ether group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000816 ethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009998 heat setting Methods 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- RXMBKOPBFXCPDD-UHFFFAOYSA-N methoxyphosphonamidous acid Chemical compound COP(N)O RXMBKOPBFXCPDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- VOVWQRQDSCYAEA-UHFFFAOYSA-N n-[chloro(methoxy)phosphanyl]-n-propan-2-ylpropan-2-amine Chemical compound COP(Cl)N(C(C)C)C(C)C VOVWQRQDSCYAEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006501 nitrophenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007248 oxidative elimination reaction Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N phosphite(3-) Chemical class [O-]P([O-])[O-] AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N phosphoramidic acid Chemical compound NP(O)(O)=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 125000003107 substituted aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QXJQHYBHAIHNGG-UHFFFAOYSA-N trimethylolethane Chemical compound OCC(C)(CO)CO QXJQHYBHAIHNGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XOFLBQFBSOEHOG-UUOKFMHZSA-N γS-GTP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=S)[C@@H](O)[C@H]1O XOFLBQFBSOEHOG-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1 Sposób wykrywania obecnosci danej sekwencji oligonuldeotydowej w badanym kwasie nuklei- n owym obecnym w próbce kwasu nukleinowego, znamienny tym, ze laczy sie w warunkach hybrydyzacji te próbke kwasu nukleinowego z reagentem polmukleotydowym o wzorze w którym DNA1 oznacza pierwszy segment DNA, DNA2 oznacza drugi segment DNA, a jeden z symboli x i y oznacza zero, podczas gdy drugi z nich oznacza liczbe calkowita 1-12 wlacznie, przy czym, albo próbke albo reagent osadza sie uprzednio na nosniku, i w wyniku hybrydyzacji badanego kwasu nukleinowego z reagentem polinukleotydowym tworzy sie znacznik zwiazany z nosnikiem poprzez miejsce rozszczepialne a nastepnie zasadniczo uwalnia sie ten nosnik od znacznika zwiazanego z nosnikiem inaczej niz poprzez to miejsce selektywnie rozszczepialne, po czym rozszczepia sie to miejsce rozszczepialne na drodze fotolizy stosujac swiatlo o dlugosci fali co najmniej 350 nm i wykrywa sie znacznik uwolniony od nosnika. PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania obecności danej sekwencji oligonukleętydowej.
Wykrywanie obecności danej sekwencji oligonuklpoiydowej jest możliwe dzięki wprowadzeniu miejsc rozszczepialnych selektywnie do łańcuchów oligonukleoiydowych i polinuklρętydowych. Techniki te są opisane w opisie zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki, numer seryjny 251.152 oraz wcześniejszym opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.775.619, którego ujownienio są cytowane w niniejszym opisie. Miejsca rozszczepialne selektywnie są użyteczne w wielu różnych typach technik hybrydyzacji. Przykładowo, w jednym z typów, w którym hybrydyzacja prowadzi do osadzonego na stałym nośniku dupleksu znakowanej sondy i próbki DNA, miejsce rozszczepialne selektywnie zawarte w strukturze hybrydowej umożliwia bezpośrednie oddzielenie znakowanej sondy od stałego nośnika. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.775.619 jest w głównej mierze poświęcony użyciu w tego typu próbach miejsc rozszczepialnych endonukleazą restrykcyjną. Można również stosować miejsca rozszczepialne chemicznie, tadiejud wiązania dwusiardzdowe,
I, 2-diole i podobne. Miejsca takie wprowadza się w trakcie syntezy olieonudleotydu. Rozszczepia się je odpowiednimi reagentami chemicznymi, np. tiolami, nadjodanami lub podobnymi.
Możliwe jest także wprowadzanie miejsca, które można rozszczepiać przez fotolizę, jak również miejsca rozszczepialnego innymi sposobami, między innami stosując reagenty chemiczne lub enzymatyczne, np. środki redukujące. Miejsca rozszczepialne tworzy się przez wprowadzenie reszt chemicznych, korzystnie reszt wrażliwych na światło do łańcuchów oligonudleotydonach lub pnlinudleotyeowych.Tadie nowe reszty wrażliwe na światło są użyteczne w wielu różnych typach prób hybrydyzacji, łącznie z tymi, które są opisane w cytowanych powyżej zgłoszeniach patentowych, jak również w próbie amplifikacji i hybrydyzacji kwasów nukleinowych ujawnionej w opisie europejskiego zgłoszenia patentowego nr 88.309697.6 dokonanego przez zgłaszających niniejszy wynalazek.
Innym zastosowaniem tych podanych powyżej jak i innych reagentów jest w ogólnych zarysach tworzenie niezasadowach miejsc wewnątrz struktury oligonukleotydów. Termin miejsce niezasadowe oznacza tu resztę eterową -OR w położeniu, w którym normalnie występuje grupa hydroksylowa -OH albo zasada nukleinowa.
Jeszcze innym zastosowaniem takich reagentów jest chemiczna fosforylacja. W wielu różnych aspektach chemii oligonukleotydów niezbędnajest chemiczna fosforylacja grup hydroksylowych. Przykładem jest synteza oligonukleotydów, gdzie po etapach syntezy i usunięcia grup ochronnych należy przeprowadzić fosforylację wolnej grupy 5'-hydroksylowej oligonudleotadu, aby nadawał się on do stosowania w większości procesów biologicznych. Konieczna jest również fosforylacja funkcyjnej grupy 3'-hadrodsalowej dla/1/zapobieżenia przedłużeniu końca 3' przez polimerazę i 2 w chemicznej ligacji DNA, gdzie na ogół wymaganajest obecność reszty 3/-fosforanowej podczas sprzęgania oligonukleotydów metodami chemicznymi.
Reakcję 5'-fosforalacji na ogół prowadzi się z zastosowaniem kinazy polinukleotydowej T4 i ATP. Reakcja ta ani nie jest zbyt dokładna ani wydajna. Znanych jest również szereg sposobów chemicznej 5'-fosforylacji. Są one opisane m.in. przez Nadeaux'a i wsp. w Biochemistry 23, 6153-6159 /1984/, van der Marel'a i wsp. w Tetrahedron Lett. 22. 1463-1466 /1981/, Himmelsbach'a i Pfleiderer'a w Tetrahedron Lett. 23, 4793-4796 /1982/, Marugg'a i wsp. w Nucleic Acids Research 12,8639-8651 /1984/ oraz przez Kondo i wsp. w Nucleic Acids Research Symposium Series 16,161-164/1985/. Większość tych sposobów wamαgαjednαdZe stosowania niestabilnych reagentów albo skomplikowanej modyfikacji standardowych procedur usuwania grup ochronnych i oczyszczania. Podobne trudności występują z monofunkcyjnymi i bifynddyjnymi reagentami do 3'-fosforalαcji /patrz Sonveaux, poprzednia pozycja, str. 297/.
Tak więc, poza przydatnością w procesach wprowadzania miejsc rozszczepialnych i/lub niezasadowych do łańcuchów olieonudleotydowych lub polinudkeotadowych jako reagenty do fosforylacji można stosować wiele związków, dzięki którym można przezwyciężyć ograniczenia dotychczasowych procedur fosforylacji /mogą one być również użyteczne w reakcjach fosforylacji, które się stosuje w powszechnie przyjętych schematach oczyszczania poprzez pochodne dimetodsytratylone /DMT/. Pozycje literaturowe odnoszące się ogólnie do sposobów syntetyzowania oligonudleotadów obejmują te, w których opisane są syntezy 5' do 3' oparte na stosowaniu ochronnych grup β-dajanoetalofosforanonach. Należą do nich np.: de Napoli i wsp., Gazz.Chim.Ital. 114,65 /1984/, Rosenthal i wsp., Tetrahedron Letters 24,1691 /1983/, Belagaje i Brush, Nukleic Acids Research 10,6295 /1977/. Syntezy 5' do 3' w roztworze opisane są przez Hayatsu i Khorana'ę w J.Am.Chem.Soc. 89, 3880 /1957/, Gait'a i Sheppard'a w Nucleic Acids Research 4, 1135 /1977/, Cramer'a i Koster'a w Angew.Chem.Int.Ed.Engl., 7, 473 /1968/ i Blackbum'a i wsp. w J.Chem.Soc.Part C, 2438 1X9611.
Poza cytowanym powyżej stanem techniki, Matteucci i Caruthers opisują w
J. Am.Chem.Soc. 103, 3185-3191 /1981/ użycie fosforynochlorków do wytwarzania oligonudleotydów. Zastosowanie fosforynoamidón do wytwarzania oligonukleotydów jest opisane przez Beaucage'go i Caruthers'a w Tetrahedron Letters 22, 1859-1862 /1981 oraz w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.415.732. Smith w ABL 15-24 /grudzień 1983/ opisał automatyczną syntezę oligodezoksyrybonukleotydu w fazie stałej. Jest ona również przedmiotem wyżej cytowanych publikacji oraz publikacji Warner'a i wsp. w DNA, 3, 401-411 /1984/, ujawnienia której są cytowane w niniejszym opisie.
Horn i Urdea opisali w DNA, 5, 5: 421-425 /1986/ fosforylację osadzonych na stałym nośniku fragmentów DNA z zastosowaniem bis/cyjanoetoksy/-N,N-diizopropyloaminofosfmy. Metoda ta jest również podana przez Horn'a i Urdea'ę w Tetrahedron Letters 27, 4705-4708 /1986/.
Technikom hybrydyzacji poświęcone są następujące publikacje: Meinkoth i Wahl /Anal.Biochemistry 138, 267-284 /1984/ podają doskonały przegląd technik hybrydyzacji. Leary i wsp. w Proc.Natl.Acad.Sci. /USA/ 80, 4045-4049 /1983/ opisują zastosowanie biotynylowanego DNA w połączeniu z konjugatem awidyny-enzym do wykrywania specyficznych sekwencji oligonukleotydowych. Ranki i wsp. w Gene 21, 77-85, opisują technikę nazwaną przez nich hybrydyzacją typu kanapkowego do detekcji sekwencji oligonukleotydowych. Pfeuffer i Helmrich w J.Biol. Chem. 250, 867-876 !X)~I5I, donoszą o sprzęganiu guanozyno-5'-0-/3-tiotrójfosforanu/ z sefarozą 4B. W J.Histochem.and Cytochem. 29,227-237, Bauman i wsp. opisują znakowanie 3'-RNA fluoroforami.
W opisie zgłoszeniapatentowego PCT, WO/8302277 ujawnionajest addycjamodyfikowanych rybonukleotydów do fragmentów DNA w celu znakowania oraz sposoby analizowania takich fragmentów DNA. Renz i Kurz w Nucl.Acids Res. 12, 3435-3444 opisują kowalencyjne wiązanie enzymów do oligonukleotydów. Wallace w DNA Recombinant Technology /wyd.Woo S. CRC Press, Boca Raton, Floryda, dokonuje ogólnego przeglądu stosowania sond w diagnostyce. Chou i Merigan w N.Eng.J.of Med. 308, 921-925, referują zastosowanie sondy znakowanej radioizotopem do detekcji wirusa cytomegalii. Inman w Methods in Enzymol.,34B, 24, 77-102 /1974/ opisuje procedury wiązania do połiakiyloamidów a Parikh i wsp. w Methods in Enzymol, 34B, 24,77-102 I)) 4 opisują reakcje sprzęgania z agarozą, Alwine i wsp. w Proc.Natl.Acad.Sci. /USA/, 74, 5350-5354 /1977/ donoszą o sposobie przenoszenia oligonukleotydów z żeli na stały nośnik do hybrydyzacji. Chu i wsp. w Proc.Natl.Acad.Sci /USA 11,6513-6529, opisują technikę derywatyzacji końcowych nukleotydów. Ho i wsp. w Biochemistry 20, 64-67 /1981/ referują derywatyzację końcowych nukleotydów poprzez fosforany z utworzeniem estrów. Ashley i MacDonald w Anal.Biochem. 140, 95-103 /1984/ donoszą o sposobie preparowania sond na związanej powierzchniowo matrycy.
Hebert i Gravel w Can J.Chem. 52,187-189 /1974/ oraz Rubinstein i wsp. w Tetrahedron Latters 17, str. 1445-1448 /1975/ opisują zastosowanie związków zawierających grupę 2-nitrofenylową jako wrażliwych na światło grup ochronnych.
Publikacja K.Groebke'go i wsp. w Helvetica Chim.Acta 73,608-617 /I))0/ jest związana o tyle, że dotyczy zastosowania reszty tertbutylodimetylosililowej do zablokowania grupy funkcyjnej.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania danej sekwencji oligonukleotydowej w badanym kwasie nukleinowym polegający na tym, że łączy się w warunkach hybrydyzacji tę próbkę kwasu nukleinowego z reagentem polinukleotydowym o wzorze
OH
OH w którym DNA1 oznacza pierwszy segment DNA, DNA2 oznacza drugi segment DNA, a jeden z symboli x i y oznacza zero, podczas gdy drugi z nich oznacza liczbę całkowitą 1-12 włącznie, przy czym albo próbkę albo reagent osadza się uprzednio na nośniku, i w wyniku hybrydyzacji badanego kwasu nukleinowego z reagentem polinukleotydowym tworzy się znacznik związany z nośnikiem poprzez miejsce rozszczepialne
-O-/CH2/a-CH-/CH2/b-O-,
I-N02 a następnie zasadniczo uwalnia się ten nośnik od znacznika związanego z nośnikiem inaczej niż poprzez to miejsce selektywnie rozszczepialne, po czym rozszczepia się to miejsce rozszczepialne na drodze fotolizy stosując światło o długości fali co najmniej 350 nm i wykrywa się znacznik uwolniony od nośnika. Korzystnie w sposobie tym stosuje się reagent polinukleotydowy o wzorze 1, w którym symbol x oznacza zero, symbol y oznacza liczbę całkowitą 1-4 włącznie lub symbol y oznacza 1 albo zero. Korzystnie stosuje się reagent o wzorze 1, w którym symbol x oznacza liczbę całkowitą 1-4 włącznie lub w którym symbol x oznacza 1.
W innym wariancie wynalazku sposób wykrywania danej sekwencji oligonukleotydowej w badanym kwasie nukleinowym obecnym w próbce kwasu nukleinowego polega na tym, że łączy się w warunkach hybrydyzacji, w środowisku wodnym tę próbkę kwasu nukleinowego z reagentem polinukleotydowym o wzorze
0.
S' V II He' 3
-HO5 /DNA-j/5 -0-P-0-/CH2/x-CH -/CH2/y-0-P-0-5 /DHA2/5
OH
J
OH tor
HO,
I
OH w którym DNA1 oznacza pierwszy segment DNA, DNA2 oznacza drugi segment DNA a jeden z symboli x i y oznacza zero, podczas gdy drugi z nich oznacza liczbę całkowitą 1-12 włącznie, przy czym albo próbkę albo komponent reagenta osadza się uprzednio na nośniku i w wyniku hybrydyzacji badanego kwasu nukleinowego z reagentem polinukleotydowym tworzy się znacznik związany z nośnikiem poprzez miejsce rozszczepialne,
-0-/0H2/a-CH-/CH2/b-0-
ho2 a następnie wydziela się nośnik ze związanym reagentem polinukleotydowym i badanym kwasem nukleinowym ze środowiska wodnego, po czym przemywa się ten nośnik medium o odmiennej sile hybrydyzacji niż to środowisko wodne w celu usunięcia znacznika związanego z nośnikiem inaczej niż poprzez miejsce rozszczepialne, z kolei rozszczepia się to miejsce rozszczepialne na drodze fotolizy stosując światło o długości fali co najmniej 350 nm i wykrywa się znacznik uwolniony od nośnika. W rozwiązaniu tym korzystnie stosuje się reagent polinukleotydowy o wzorze 2, w którym symbol x oznacza zero a symbol y oznacza liczbę całkowitą 1-4 włącznie lub symbol y oznacza 1 albo zero.
W innym korzystnym rozwiązaniu stosuje się reagent, w którym w powyższym wzorze symbol x może oznaczać liczbę całkowitą 1 -4 włącznie. Korzystnie w powyższym wzorze y oznacza liczbę całkowitą 1-4 włącznie, zwłaszcza 1. Korzystnie, y oznacza liczbę 1.
Inny wariant sposobu wykrywania danej sekwencji oligonukleotydowej w badanym kwasie nukleinowym obecnym w próbce kwasu nukleinowego polega na tym, że łączy się w warunkach hybrydyzacji tę próbkę kwasu nukleinowego z reagentem polinukleotydowym o wzorze , 3' 3 11
-HO9 /DNA-,/9 -0-P-0
-1 l
OH
I S ' 3 ' H0-p—— O-9 /DNAO/9 -OH
II 2 o w którym DNA1 oznacza pierwszy segment DNA, DNA2 oznacza drugi segment DNA, a R oznacza grupę 2-nitrobenzylową, 4-penten-1-ylową,
170 146 gdzie R' oznacza wodór, grupę arylową albo orylęolkilową, podstawniki Rt mogą być takie same lub różne i oznaczać grupę aminową, nitrową, chlorowiec, hydroksylową, niższą grupę alkilową, lub niższą grupę alkoksylową, podstawniki Rj mogą być takie same lub różne i oznaczać grupę aminową, nitrową, chlorowiec, hydroksylową, niższą grupę alkilową albo niższą grupę alkoksylową, i oznacza zero, 1, 2 albo 3, j oznacza zero, 1, 2, 3 lub 4, Rin oznacza zawierający 1-16 atomów węgla oligomer alkilenowy albo oksyetylenowy -/CH2CH2OĄ - gdzie z oznacza liczbę całkowitą 1-16 włącznie a Rn oznacza grupę
albo ch3o-ch2ch2-o-ch2- .
przy czym albo próbkę albo reagent osadza się uprzednio na nośniku i w wyniku hybrydyzacji badanego kwasu nukleinowego z reagentem polinukleotydowym tworzy się znacznik związany z nośnikiem poprzez miejsce rozszczepialne o wzorze
w którym R oznacza grupę 2-nitrobenzylową, 4-penten-1-ylową,
-ch2ch2s-/ Q
CH2CH2Si/CH3/3 ,
gdzie R' oznacza wodór, grupę arylową albo aryloalkilową, podstawniki Ri mogą być takie same lub różne i oznaczać grupę aminową, nitrową, chlorowiec, hydroksylową, niższą grupę alkilową lub niższą grupę alkoksylową, podstawniki Rj mogą być takie same lub różne i oznaczać grupę aminową, nitrową, chlorowiec, grupę hydroksylową, niższą grupę alkilową albo niższą grupę alkoksylową, i oznacza zero, 1, 2 albo 3, j oznacza zero, 1, 2, 3 albo 4, Rm oznacza zawierający 1-16 atomów węgla oligomer alkilenowy albo oksyetylenowy -/CH2CH2O/Z - gdzie z oznacza liczbę całkowitą 1-16 włącznie a Rn oznacza grupę o wzorze
0
II II
CH2-C-CH2CH2-C- ,
170 146
Ο
0Η30-0Η2-σΗ2-0-σΗ2 a następnie zasadniczo uwalnia się ten nośnik od znacznika związanego z nośnikiem inaczej niż poprzez to miejsce selektywnie rozszczepialne, po czym rozszczepia się to miejsce rozszczep^ne na drodze fotolizy stosując światło o długości fali co najmniej 350 nm i wykrywa się znacznik uwolniony od nośnika. Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się reagent według podanego wzoru, w którym R oznacza grupę 2-nitrobenzylową lub grupę
-0H20H2S-<(O/ ’ lub w którym R oznacza
lub w którym R oznacza 2-mgtdlgur-9,10antrachinruracgtal, lub R oznacza grupę 4^οten-1-dlową, lub R oznacza grupę 4-pgntgn-1-dlową, lub w którym R oznacza
-ch2ch2 —Z Q \— no2 lub też R oznacza
I
P o
I o**
W kolejnym wariancie sposób wykrywania danej sekwencji oliornuę|gotydrwgj w badanym kwasie nuę|grurwym obecnym w próbce kwasu uuklginrwegr polega na tym, że łączy się w warunkach hybrydyzacji, w środowisku wodnym tę próbkę kwasu nuę|giuowgoo z reagentem prliuuęlgotddowdm o wzorze
170 146 gdzie DNA1 oznacza pierwszy segment DNA, DNA2 oznacza drugi segment DNA a R oznacza grupę 2-nitrobenzylową, 4-penten- 1-ylową,
gdzie R' oznacza wodór, grupę arylową albo aryloalkilową, podstawniki R1 mogą być takie same lub różne i oznaczać grupę aminową, nitrową, chlorowiec, hydroksylową, niższą grupę alkilową, lub niższą grupę alkoksylową, podstawniki Rj mogą być takie same lub różne i oznaczać grupę aminową, nitrową, chlorowiec, hydroksylową, niższą grupę alkilową albo niższą grupę alkoksylową, i oznacza zero, 1, 2 albo 3, j oznacza zero, 1, 2, 3 albo 4, Rm oznacza zawierający 1-16 atomów węgla ligomer alkilenowy albo oksyetylenowy -/CH2CH2O/Z - gdzie z oznacza liczbę całkowitą 1-16 włącznie a Rn oznacza grupę
0
II II
GH2-C-GH2OH2-C- , o
02N—,
V /
S-CHoCHo-O-Cc c.
Q \-s-ch2ch2-o-c-
lub
CH30-CH2CH2-0-CH2przy czym albo próbkę albo komponent reagenta osadza się uprzednio na nośniku i w wyniku hybrydyzacji badanego kwasu nukleinowego z reagentem polinukleoiydowym tworzy się znacznik związany z nośnikiem poprzez miejsce rozszczepialne o wzorze
w którym R oznacza grupę 2-niirobenzylęwą, 4-ppnten-1-ylową, grupy o wzorach:
-P-0
L o
albo
CH2CH2Si/CH3/3
-R
0-R,
CH2CH2
no2
170 146 gdzie R' oznacza wodór, grupę arylową albo aryloalkilową, podstawniki R, mogą być takie same lub różne i oznaczać grupę aminową, nitrową, chlorowiec hydroksylową, niższą grupę alkilową, lub niższą grupę alkoksylową, podstawniki Rj mogą być takie same lub różne i oznaczać grupę aminową, nitrową, chlorowiec, grupę hydroksylową, niższą grupę alkilową albo niższą grupę alkoksylową, i oznacza zero, 1, 2 albo 3, j oznacza zero, 1, 2, 3 lub 4, Rm oznacza zawierający 1-16 atomów węgla oligomer alkilenowy albo oksyetylenowy -/CH2CH2O4 - gdzie z oznacza liczbę całkowitą 1-16 włącznie a Rn oznacza grupę o wzorze
λγ\ 11 11 / f) \-S-CHoCK,-0-C2 2 albo
a następnie wydziela się nośnik ze związanym reagentem polinukleotydowym i badanym kwasem nukleinowym ze środowiska wodnego, po czym przemywa się ten nośnik medium o odmiennej sile hybrydyzacji niż to środowisko wodne w celu usunięcia znacznika związanego z nośnikiem inaczej niż poprzez miejsce rozszczepialne, z kolei rozszczepia się to miejsce rozszczepialne na drodze fotolizy stosując światło o długości fali co najmniej 350 nm i wykrywa się znacznik uwolniony od nośnika. W korzystnych wariantach stosuje się reagent polinukleotydowy i podanym wzorze, w którym R oznacza grupę 2-nitrobenzylową, lub
CH2CH2S
lub R oznacza 2-metyleno-9,10-antrachinono-acetal lub R oznacza grupę 4-penten-1-ylową lub R oznacza
Istnieją różne metody i reagenty do włączania miejsc rozszczepialnych selektywnie i/lub niezasadowych do łańcuchów oligonukleotydowych, przy czym stosuje się często te miejsca rozszczepialne selektywnie, które są rozszczepialne na drodze chemicznej, albo pod wpływem światła. Może to być także wprowadzanie przy pomocy różnych metod i reagentów miejsc niezasadowych do łańcuchów oligonukleotydowych.
Reagenty, o których mowa wyżej nadają się także jako reagenty do chemicznej fosforylacji. Ponadto, reagenty do włączania miejsc niezasadowych do łańcuchów oligonukleotydowych, mogą być użyte do tworzenia rozgałęzionego multimeni kwasu nukleinowego.
Stosowane są także reagenty, w których miejsca niezasadowe nie są nukleotydami.
Dodatkowe zalety wynalazku przedstawiono częściowo w dalszej części opisu a częściowo staną się oczywiste dla specjalistów z tej dziedziny po zbadaniu wynalazku lub będzie można je poznać poprzez praktyczne wykonanie wynalazku.
Nowe reagenty stosowane w sposobie według wynalazku są wrażliwymi na światło związkami chemicznymi o wzorze ogólnym
2 gdzie R , R , x i y są zdefiniowane poniżej. Związki te wprowadza się do łańcuchów oligonukleotydowych dla umożliwienia rozszczepienia pod wpływem światła.
Inne nowe stosowane reagenty są związkami o wzorze ogólnym:
gdzie r1 R2i R są zdefiniowane poniżej. Takie związki są użyteczne do tworzenia miejsc niezasadowych w łańcuchach oligonukleotydowych. Miejsca te są rozszczepialne lub nierozszczepialne.
Jeszcze inne stosowane, nowe reagenty są związkami o wzorze ogólnym
CHO - 0 - R1
I 2 '
CH-, - C - CHO - 0 - R‘ 3 I 2
ĆH2 — 0 — R^
2 gdzie R , R i Rn mają niżej podane znaczenie. Takie związki stosuje się do tworzenia punktów rozgałęzień podczas syntezy multimerów kwasów nukleinowych.
Sposób realizacji wynalazku.
A. Definicje.
Termin miejsce rozszczepialne selektywnie oznacza miejsce funkcyjne albo wielofunkcyjne, dające się selektywnie rozszczepić. Jak wspomniano powyżej, istotne w wynalazku są przede wszystkim miejsca, które są specyficznie rozszczepialne przez fotolizę.
Stosowane w opisie terminy oligonukleotyd i polinukleotyd są określeniami ogólnymi, obejmującymi polidezoksyrybonukleotydy /zawierające 2'-dezoksy-D-rybozę lub jej zmodyfikowane formy/, polirybonukleotydy /zawierające D-rybozę lub jej zmodyfikowane formy/ i każdy inny typ polinukleotydu będącego N-glukozydem zasady purynowej lub pirymidynowej albo zmodyfikowanej zasady purynowej lub pirymidynowej. Podobnie, termin nukleozyd jest określeniem ogólnym w stosunku do rybonukleozydów, dezoksyrybonukleozydów i do każdego innego nukleozydu będącego N-glukozydem zasady purynowej lub pirymidynowej albo zmodyfikowanej zasady purynowej lub pirymidynowej. Nie wprowadza się z góry ustalonego rozgraniczenia co do długości między terminami, oligonukleotyd i polinukleotyd i w niniejszym opisie terminy te są wzajemnie wymienialne. Te oligonukleotydy i polinukleotydy mogą być jednoniciowe i dwuniciowe, zwykle jednoniciowe. Oligonukleotydy stosowane w niniejszym wynalazku składają się na ogół z od około 2 do około 2000 jednostek monomerycznych, a zwykle, dla większości zastosowań jako sondy, od około 2 do około 100 jednostek monomerycznych.
Określenie próbka kwasu nukleinowego oznacza próbkę, w której podejrzewa się obecność badanej sekwencji kwasu nukleinowego. Analizowany kwas nukleinowy oznacza, że DNA lub RNA w próbce kwasu nukleinowego zawiera badaną sekwencję.
Termin reagenty do fosforylacji oznacza związki, które w reakcji albo z serii reakcji ze związkiem zawierającym grupę hydroksylową dają monoester kwasu fosforowego.
Niższa grupa alkilowa i niższa grupa alkoksylowa oznaczają odpowiednio podstawniki alkilowe i alkoksylowe zawierające 1-8 atomów węgla, na ogół 1-6 atomów węgla.
Pod pojęciem podstawników aromatycznych rozumie się każdy pierścień aromatyczny, ewentualnie podstawiony przy jednym lub więcej niż jednym atomie węgla resztami, które nie zmieniają w sposób istotny jego funkcji lub reaktywności.
B. Struktura chemiczna nowych reagentów wrażliwych na światło:
Stosowane nowe reagenty są wrażliwymi na światło związkami o wzorze:
R1 - 0 - /0Η2/χ - CH - /CH2/y - 0 - R2 gdzie R1 oznacza grupę ochronną trwałą w środowisku zasadowym i nietrwałą w środowisku kwaśnym, R2 oznacza pochodną fosforową umożliwiającą addycję reagenta do pozycji 5' łańcucha uuęlgrzydowgor lub oligonuęlgotddrwgoo, jeden z symboli x i y oznacza zero podczas, gdy drugi oznacza liczbę całkowitą w zaęrguig 1 do 12 włącznie. Powyższym wzorem ogólnym objęte są dwie podstawowe typy struktur: (1) struktury, w których x oznacza liczbę inną niż zero a y oznacza zero 1nieęigdy nazywane w niniejszym opisie reagentami typu NP1) i (2) struktury, w których x oznacza zero a y oznacza liczbę inną niż zero (nazwane reagentami Typu NP2). Te dwa typy struktur, jak można łatwo wnosić z powyższego wzoru ogólnego, są dość podobne. Obydwa typy nadają się do wprowadzania specyficznych miejsc w łańcuchach rligonuę|gotydrwych. Ze względu na obecność reszty nitrrfgnylowgj miejsca te są łatwo rozpuszczalne na drodze fotolizy. Jednakże, jak to jest bardziej szczegółowo opisane w dalszej części opisu, te dwie rodziny reagentów chemicznych różnią się od uigblg tym, że są stosowane w nieco różnych kontekstach.
Bardziej dokładne znaczenie poszczególnych podstawników w nowych wrażliwych na światło magentac^e^ następujące: R1 jak podano powyżej, oznacza grupę ochronną, stabilną w środowisku zasadowym a wrażliwą w środowisku kwaśnym. Takie grupy ochronne są znane w syntezie rligrnuę|gotddów. Obejmują one uigprdutawirug lub podstawione grupy arylowe albo aryloalkllw we, gdzie aryl oznacza np. fenyl, naftyl, furanyl, ^fenyl albo grupę podobną, w których to grupach podstawniki w liczbie od 0 do 3, zwykle od 0 do 2, oznaczają dowolne, nie oddziaływujące ze sobą wzajemnie stabilne grupy uigpolarue albo polarne, pobierające albo oddające elektron. Przykładami takich grup są grupa dimetokuytrdtylowa (DMT), monomgtokuytrytylowa (MMT), trytylowa i 9-feuylo-9-ksatenylowa1pięuylowa).
Resztą, której użycie jest tu szczególnie preferowane jest grupa dimgtokuytrdtylowa 1DMT).2
Rp oznacza pochodną fosforową tak dobraną, aby ułatwić kondensację reagenta z grupą 5'-hydroksylową łańcucha nuę|gozydowego albo oligonuęleotydowggo. Do tego typu grup należą fouforduoamidy, fosfotrigstrd, foufodigstrd, fosforyny, wodorofosfoniauy, tiofouforauy i podobne (patrz m.in. publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego nr 0225807, twórca : Urdea i wsp., tytuł: Prowadzona w roztworze próba kanapkowa kwasu nukleinowego i stosowane w niej sondy polinuę]eotydowg. Ujawuieuig zawarte w tej publikacji jest cytowane w niniejueym opisie). Grupami szczególnie korzystnymi jako podstawniki r2 są fosforynoamidy o wzorze:
N(lPr)2 gdzie Y oznacza grupę metylową albo β-cyjauogtdlową a iPr oznacza grupę izopropylową. NajęoredstuigJ, Y oznacza grupę β-cyjanrgtylową.
Z podanych powyżej definicji można łatwo wnosić, że podstawniki R1 i r2 są tak dobrane, aby umożliwić wprowadzenie reagenta wrażliwego na światło do fragmentu DNA, wykorzystując standardową technikę fosforduoamidową. Oznacza to, że do syntezy ollgouukleotydu podstawnik r2 dobiera się tak, aby reagował z grupą 5'-hddroksylową łańcucha uuklgozydowggr lub oligonukleotydowego a resztę R1 dobiera się tak, aby umożliwić reakcję z grupą 3'-hydroksylową łańcucha uukleozydowego lub ollgouuklgotddowggo.
W odniesieniu do symboli x i y, jeden z nich oznacza zero, podczas gdy drugi oznacza liczbę całkowitą od 1 do 12 włącznie, korzystniej od 1 do 4 włącznie a najbardziej korzystnie -1.
Przykładami reagentów objętych powyższą ogólną kategorią są następujące związki:
170 146
”ΝΡ1”
Jak widać, te specyficzne struktury, [2-(2-nitrofenylo)-2-(O-dimetoksytrytyloksy)etoksy]N,N-diizopropyloamino-2-cyjanoetoksyfosfna i [2-(2-nitrofenylo)-1 -(O-dimetoksytrytyloksy)etoksy]-N,N-diizopropyloamino-2-cyjanoetoksyfosfina, oznaczono odpowiednio jako związki NP1 i NP2. Są to specyficzne reagenty, których synteza jest opisana w przykładach 1 i 2.
C. Synteza powyższych reagentów:
Reagenty typu NP1, to znaczy takie, w których x oznacza liczbę inną niż zero a y oznacza zero syntetyzuje się w ciągu reakcji przedstawionych na schemacie 1. Reagenty typu NP2 syntetyzuje się w ciągu reakcji przedstawionych na schemacie 2.
Schemat 1
HO - CH_ 2
CH - OH
DMT - 0 -
DMT-Cl pirydyna ?H2
^N(iPr)2
Cl - P ^0CH2CH2CN
DiPEA ch2oił
Z
OCH.CH.CN
170 146
Schemat 2
HO - OH,
TBDMS - O - CH2
CH - OH
0Γ'
TBDMS-Cl _ dmap/tea ch2ci2
DMT-C1 ~ dmap/tea oh2ci2
TBDMS
TBAF
THF~
- DMT
NO,
Cl - P yi(iPr).
OCH2CH2CN
DiPEA ch2ci2 (iPr)9Nx ncch2ch2o
Na schematach 1 i 2 skróty mają następujące znaczenie:
DMT” = dimetodsaeratyl ; dMT-C1 = chlorek eimetodsatratalnny ; iPr = izopropyl ; DiPEA = diizopropylreiyjo^αmna; TBDMS-Cl = chlorek t-yutalndimetalosilllowa ; dMAp = 4-dimetylo^mnopiiydyna; TEA = trietyloamina ; TBAF = fluorek tetrαyytaloαmoniony.
Synteza reagentów typu NP1 polega na blokowaniu końcowej grupy hydroksylowej 2-(O-nitrofenaln)-1,2-etanndiolu związkami z grupą R\ np. DMT lub podobnym i następnej reakcji pozostałej grupy hydroksylowej z odpowiednią pochodną fosforową, wystawiając resztę R“. Na schemacie 1 przykładowym reagentem do tego ostatniego celu jest chloro-N,N-diizopropaloαmino-2-dylαnoetndsyfosfma. Można łatwo wyprowadzać narianta tego podstawowego schematu. Przykładowo, do wprowadzenia innych podstawników R\ jako alternatywę chlorku dimetodsytratałowego można użyć chlorek monometodsatratalowa, chlorek tratalowa, 9-dhloro-9-fenaloksanten lub podobny.
170 146
Podobnie, w celu wprowadzenia innych podstawników R2, w drugim etapie reakcji stosuje się alternatywne, podstawione fosfiny. Dla zmiany x, substancja wyjściowa powinna zawierać dodatkowe grupy metylenowe.
W celu zsyntetyzowania reagentów typu NP2, rn jest takich, w których x oznacza zero a y oznacza liczbę inną niż zero, prowadzi się podobny ciąg reakcji, z tym, że kolejność wprowadzania podstawników R1 i R2 jest odwrócona. Tak więc, początkowo, końcową grupę hydroksylową w wyjściowym 2-(o-nitrofenylo)-1,2-etanodiolu poddaje się reakcji z chlorkiem tert-butylodimetylosililowym (TBDMS-C1) w celu zablokowania tej grupy hydroksylowej podczas następnego etapu reakcji, w którym pozostałą wolną grupę hydroksylową poddaje się reakcji ze stabilną w środowisku zasadowym i nietrwałą w środowisku kwaśnym grupą blokującą, np. chlorkiem dimetoksytrytylowym (DMT-Cl) wprowadzając podstawnik R1. Następnie odblokowuje się końcową grupę hydroksylową, np. fluorkiem tetrabutyloamoniowym i tak jak na schemacie 1, prowadzi się reakcję z odpowiednio podstawioną pochodną fosfinową, wprowadzając resztę R2.
D. Zastosowanie wyżej opisanych reagentów do tworzenia miejsc rozszczepialnych selektywnie.
Nowe, wrażliwe na światło reagenty stosowane w sposobie według wynalazku, łatwo wprowadza się do łańcucha oligonukleotydowego lub polinukleotydowego, stosując standardową technikę fosforynoamidową, dobrze znaną i opisaną w wielu cytowanych powyżej pozycjach literaturowych.
Najogólniej, wprowadzenie tego nowego reagenta do fragmentu DNA wymaga utworzenia wiązania grupy 5'-hydroksylowej przy r2 i wiązania grupy 3'-hydroksylowej przy R1.
Tak więc, po wprowadzeniu reagentu wrażliwego na światło, hybrydowy łańcuch oligonukleotydowy będzie miał następującą strukturę:
'“HO5 /DNA^3 /DNA2/3 - OH
p - o I
OH gdzie DNA1 oznacza pierwszy segment DNA, DNA2 oznacza drugi segment DNA, a x i y mają wyżej podane znaczenie. DNA1 i DNA2mogą być liniowe lub rozgałęzione, Taki reagent polinukleotydowy może być użyty w próbach hybrydyzacji, takich jak opisane w publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego nr 88.309203.3 dokonanego przez niniejszych zgłaszających i w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr. 4.775.619. W tych próbach stosuje się liniowe reagenty polinukleotydowe zawierające miejsca rozszczepialne selektywnie, to znaczy takie, w których DNA1 i DNA2 są liniowe. Reagent polinukleotydowy zawierający resztę wrażliwą na światło może być również użyty w próbach amplifikacji ujawnionych w opisach zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr seryjny 07/252.638 i 07/340.031 włączonych do niniejszego opisu /patrz również publikacja PCT nr W089/03891/. Jak podano w tych zgłoszeniach, rozszczepialne cząsteczki łącznikowewprowadza się do multimerów amplifikacyjnych w określonych miejscach, w celu analizowania struktury multimeru albo jako sposób uwalniania określonych segmentów /takich jak część multimeru, która wiąże się ze znakowanym oligonukleotydem/. W tego typu zastosowania DNA1 i/lub DNA2 są rozgałęzionymi segmentami polinukleotydowymi. Po syntezie i oczyszczaniu multimeru można specyficznie rozszczepiać rozgałęzioną strukturę polinukleotydową tego multimeru bez dodatkowej degradacji struktury nukleotydowej. Korzystne jest, gdy miejsca rozszczepialne wprowadza się w miejscu lub w pobliżu miejsc łącznika multimeru, umożliwia to bowiem ilościowe oznaczenie poszczególnych odgałęzień multimeru.
Zależnie od tego, czy reagent wrażliwy na światło wprowadzony do oligonukleotydu lub polinukleotydu należy do typu NP1 /to znaczy takiego, w którym x oznacza liczbę mną niż 0 a y oznacza 0/ czy do typu NP2 /to znaczy takiego, w którym x oznacza zero a y oznacza liczbę inną niż zero/, po rozszczepieniu powstają dwaróżne typy fragmentów. Jak tojest przedstawione na schemacie 3, w wyniku rozszczepienia oligonukleotydu zawierającego resztę typu NP1 powstaje pierwszy fragment posiadający końcową grupę 5'-fosforanową i drugi fragment zawierający na końcu 3' resztę 2-nitrozofenylową.
Odwrotnie, co jest przedstawione na schemacie 4, po rozszczepieniu polinukleotydu zawierającego resztę typu NP2 powstaje pierwszy fragment zawierający resztę 2-nitrozofenylową na końcu 5' i drugi fragment z końcową grupą 3'-fosforanową.
fotoliza (światło UV >350 nm ; lampa rtęciowa)
5'-HO5 (DNA.)5 -O-P-(CH) 1 IX
OH 0=0 w
cz xz
5'-H0-P-0- (DNA-)9 -OH
OH
NO
17(0 146
Schemat 4
5'-HO-5\BNA1)3,-0-i>-0-CH-(CH2)y-0-P-0-5 -(DNAg) -OH
OH
OH .NO, fotoliza ( światło UV > 350 nm lampa rtęciowa)
Ponieważ rozszczepienie zachodzi na drodze fotolizy pod wpływem ultrafioletu o długości fali co najmniej około 350 nm, nie są potrzebne odczynniki enzymatyczne ani chemiczne. Procedura postępowania jest zatem bardziej czysta i uzyskuje się produkt wolny od zanieczyszczeń wprowadzonymi z zewnątrz odczynnikami rozszczepiającymi. Ponadto, sam reagent polinukleoiydęwy jest jako taki bardziej stabilny, rozszczepialny jedynie przez działanie światłem UV o odpowiedniej długości fali.
E. Fosforylacja z zastosowaniem opisanych powyżej reagentów.
Opisane powyżej reagenty, poza użytecznością w procedurze włączania wrażliwych na światło miejsc rozszczepialnych nadają się również jako reagenty do chemicznej fosforylacji. Fosforylacja z użyciem tych reagentów polega na ich kondensacji ze związkiem zawierającym grupę hydroksylową i następnym rozszczepieniu fotochemicznym z uwolnieniem grupy nitrofenylowej. Pod tym względem te nowe reagenty są dość uniwersalne, gdyż można je stosować zarówno do 5' - jak i 3'-fodforylacji nuklpodydu lub łańcucha ęligonuklpotydowego.
Do 5'-fodforylacji stosuje się reagent typu NP1, to jest reagent, w którym x oznacza liczbę inną niż zero a y oznacza zero. Jak to jest przedstawione na schemacie 3, w wyniku rozszczepienia reagentu polinukleoiydowpgo zawierającego cząsteczkę typu NP1 powstaje nukleozyd albo fragment DNA zawierający grupę 5'-fosforanową.
Do 3'-fędforylacji stosuje się reagent typu NP2, co jest zilustrowane na schemacie 4. W wyniku rozszczepienia reagentu polinukleęiydowpgo zawierającego cząsteczkę typu NP2 powstają fragmenty rozszczepienia, z których jeden zawiera grupę3'-fodforanową a drugi fragment zawiera resztę niirozęfenylową.
170 146
F. Wprowadzanie miejsc niezasadowych i miejsc służących do syntetyzowania drugorzędowych łańcuchów oligonukleotydowych.
Przedstawione poniżej reagenty przydatne są do wprowadzania miejsc niezasadowych do łańcuchów oligonukleotydowych, przy czym miejsca te mogą być rozszczepialne lub nierozszczepialne. Reagenty te mają strukturę przedstawioną wzorem
gdzie R1 i R2 są zdefiniowane powyżej, w części A niniejszej sekcji a R oznacza grupę 2-nitrobenzylową, 4-penten-1-ylową oraz grupy o wzorach:
-ch2ch2s-Z Q
-CH2CH2Si/CH3/3 ,
w których to wzorach R' oznacza wodór, resztę arylową lub aryloalkilową, gdzie reszta arylowa lub aryloalkilową zawiera korzystnie 1-8 atomów węgla, podstawniki R, mogą być takie same lub różne i oznaczać grupy: aminową, nitrową, chlorowiec, hydroksylową, niższą grupę alkilową i niższą grupę alkoksylową, podstawniki Rj mogą być takie same lub różne i oznaczać grupy: aminową, nitrową, chlorowiec, hydroksylową, niższą grupę alkilową i niższą grupę alkoksylową, i oznacza zero, 1, 2 albo 3, j oznacza zero, 1, 2, 3 lub 4.
Rn oznacza grupę lewulinylową - (CO)CH2CH2(CO)CH3 albo dowolną inną grupę blokującą lub ochronną, która może być usunięta lub wymieniona na wodór bez naruszania podstawnika R1 taką, jak grupy przedstawione wzorami:
170 146
Ο
CM =ν»ΑCH3-O-CH2CH2-O-CH2a Rm oznacza albo oligomer alkilenowy zawierający 1 do 16 atomów węgla, bardziej korzystnie 2 do 12 atomów węgla albo oligomer oksyetylenowy -(CH2CH2O )z-, gdzie z oznacza liczbę całkowitą 1 do 16, częściej 2 do 12 włącznie. W rozwiązaniu aptymalnym, jeśli R oznacza resztę -Rm-O-Rn, wówczas Rn oznacza grupę lewulinylową a Rm oznacza -(CH2CH2O)4-.
Te reagenty bazujące na dezoksyrybozie nie tylko wprowadzają miejsca niezasadowe do łańcucha oligonukleotydowego albo polinukleotydowego lecz również, podobnie jak reagenty opisane powyżej, są użyteczne do wprowadzania miejsc rozszczepialnych.
Jeśli R oznacza resztę przedstawioną wzorem:
wówczas korzystne jest aby R' oznaczał wodór albo fenyl. Jak podano powyżej, Ri i Rj mogą oznaczać każdy z wielu różnych podstawników. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, powyższa struktura jest estrem węglanowym 2-metyleno-9,10-antrachinonu, to jest grupą, w której Ri i Rj jak również R' oznaczają wodór.
Reagenty o wzorze
170 146
łatwo syntetyzuje się z dezoksyrybozy i pochodnej alkoholowej zawierającej resztę R, to jest z R-OH. Przykładowo, w przypadku 2-nitrobenzylu, dezoksyrybozę poddaje się reakcji z alkoholem 2-nitrobenzylowym otrzymując pochodną !-O-(2-nitrobenzylową). Ten związek przejściowy łatwo przeprowadza się w 5'- i 3'-chroniony analog standardowymi metodami, np. wprowadzając grupę dimetoksytrytylową (DMT) albo grupę anologiczną w pozycji -5'fR1) i pochodną fosforową, taką jak fosforynoamid, fosfotrójester lub podobną w pozycji-3' (R2).
Jak podano w części D niniejszej sekcji, reagenty te łatwo wprowadza się do łańcucha oligonukleotydowego albo polinukleotydowego stosując standardową metodę fosforynoamidową. Po wprowadzeniu tych opartych na dezoksyrybozie reszt rozszczepialnych do łańcucha oligonukleotydowego albo polinukleotydowego, taki rozszczepialny łańcuch zawierający miejsca niezasadowe -OR będzie miał strukturę przedstawioną wzorem
w którym DNA1 i DNA2 oznaczają opisane wyżej pierwszy i drugi segment DNA. Taki reagent polinukleotydowy nadaje się do stosowania w wielu rodzajach prób hybrydyzacji.
Rozszczepianie łańcuchów oligonukleotydowych lub polinukleotydowych zawierających te reagenty prowadzi się następująco. Jeśli R oznacza grupę 2-nitrobenzylową, rozszczepienie prowadzi się na drodze fotolizy światłem ultrafioletowym o długości fali co najmniej około 350 nm, po czym prowadzi się hydrolizę zasadową, np. wodorotlenkiem amonowym lub podobnym odczynnikiem.
Jeśli R oznacza -CH2CH2-S- φ /gdzie φ oznacza fenyl/, rozszczepienia dokonuje się przez utlenienie atomu siarki do -SO- albo -SO2- za pomocą np. nadjodanu sodowego i następne traktowanie zasadą. Jeśli R oznacza -CH2CH2-Si/CH3/3, wówczas oligonukleotyd rozszczepia się przez działanie, np. jonem fluorkowym i następnie zasadą. W związkach, w których R oznacza:
170 146 na przykład 2-metyleno-9,10-antrachinono-acetal, rozszczepienie prowadzi się przez utlenianie za pomocą NA2S2O41 następne traktowanie zasadą. Tam, gdzie R oznacza
-ch2ch2—
rozszczepienie zachodzi pod działaniem DBU /1,8-diazabicyklo[5.4.0]undecenu-7/. Jeśli R oznacza fosforan, grupę tę usuwa się przez traktowanie alkaliczną fosfatazą i następnie zasadą a jeśli R oznacza 4-penten-1-yl, wówczas rozszczepienie prowadzi się na ogół N-bromosukcynimidem i następne traktowanie zasadą.
Jak wspomniano powyżej, reagenty, które umożliwiają rozszczepienie łańcucha oligonukleotydowego albo polinukleotydowego nadają się do użycia w próbach amplifikacji ujawnionych w opisie europejskiego zgłoszenia patentowego nr 88.309697.6 dokonanego przez niniejszych Zgłaszających i cytowanego powyżej. Za pomocą opisanych w niniejszej sekcji reagentów opartych na dezoksyrybozie, można tworzyć punkty rozgałęzienia multimeru kwasu nukleinowego, stosując wielofunkcyjne monomery kwasu nukleinowego o budowie
gdzie: R1 oznacza stabilną w środowisku zasadowym i nietrwałą w środowisku kwaśnym grupę blokującą;
r2 oznacza pochodną fosforową umożliwiającą addycję kwasu nukleinowego do pozycji -5' łańcucha oligonukleotydowego podczas syntezy chemicznej;
R3 oznacza wodór, metyl, jod, brom lub fluor;
R oznacza wodór lub metyl;
R5 oznacza grupę lewulinylową,
170 146 albo
gdzie:
R', Ri i Rj mają wyżej podane znaczenie, k oznacza zero, 1, 2, 3 albo 4 a podstawniki Ri mogą być takie same lub różne i oznaczać grupę aminową, nitrową, chlorowiec, grupę hydrokuylrwą, niższą grupę alkilową i niższą grupę alkoksylową;
Z oznacza grupę wybraną spośród następujących wzorów:
(2) (2) (2) (2) (2) (0Η2)χ - NH - i - O (1) (CH2)x - NH - C - (CH2)y - 0 (D (CH2)x - NH - C - (CH?)v -S-S - (CH2)v - O (1) e
2'y A2'y (CHJ„ - NH --(Π)- Wy ~ 0 (1) (1) (CH2 - CH2 - 0 )x - oraz (2) (1) , - (ch2)x - 0 w których x i y mogą być takie same lub różne i oznaczać liczby całkowite w zakresie od 1 do 8.
Następnie, tak jak to zostało opisane powyżej, do łańcucha oligouukleotydowego lub polinukleotydowggo wprowadza się takie monomery kwasu nukleinowego, z rozszczepialną lub dającą się łatwo usunąć resztą R5 określającą miejsce, przy którym syntetyzuje się drugorzędowe łańcuchy oligonukleotydowe.
Miejsca rozgałęzień multimerów kwasów nukleinowych tworzy się również stosując wielofunkcyjne związki nie-nukleotydowe o wzorze ogólnym:
CHO - 0 - R1 l 2 9
CH, - C - CH? - O - R 5 I 2
CH2 - 0 - Rn gdzie:
R , R i Rn mają wyżej podane znaczenie. W szczególnie korzystnym wykonmiu, R oznacza DMT, R2 oznacza β-cyjanoetylo-fodfęrynoamid a Rn oznacza resztę lewulinylową. Takie związki syntetyzuje się z tris-hydroksymptyloetanu przez: (1) zablokowanie jednej z grup hydroksylowych w reakcji z np. trójfenylochlorosilanem albo chlorkiem tosylu, (2) reakcję tak chronionego związku z solą R, np. z chlorkiem dimeioksyir'yiylowym, w taki sposób, aby jedną z dwu wolnych grup hydroksylowych przekształcić w -OR2 (3) reakcję uzyskanego związku z Rn-OH albo z solą Rn, np. z kwasem lewulinęwym lub jego solą, z jednoczesnym wyparciem grupy blokującej z etapu (1) i (4) reakcję pośredniego związku o wzorze
CHO - 0 - H I 2 ,
CH3 - C - CH2 -o -r‘
CH2- 0 - Rn z reagentem, za pomocą którego przeprowadza się pozostającą wolną grupę hydroksylową w -OR1, np. z β-cyjanoeiokdy-N,N-dlizopropyloamenochlorofosieną.
Takie nlezadadowe miejsca są szczególnie użyteczne zarówno jeśli chodzi o możliwości rozszczepiania łańcucha oligonukleoiydowego w określonym miejscu jak również do innych celów, na przykład do syntezy rozgałęzionych multimerów kwasów nukleinowych.
G. Dodatkowe selektywnie rozszczepialne reszty łącznikowe.
Jeszcze innym reagentem użytecznym przy włączaniu selektywnie rozszczepialnego miejsca w łańcuchu oligonukleotydowym jest związek przedstawiony wzorem
iPr
170 146 w którym DMT oznacza dimetoksytrytyl, Bz oznacza benzyl, iPr oznacza izopropyl a R6 oznacza albo metyl albo β-cyjanoetyl. Tak jak w przypadku reagentów opisanych powyżej, tę resztę również łatwo się wprowadza do łańcucha oligonukleotydowego znanymi sposobami. Rozszczepienie w miejscu zawierającym tę resztę prowadzi się na drodze chemicznej, dwuetapowo: (1) przez utlenianie wodnym roztworem nadjodanu sodowego przez godzinę i następnie (2) traktowanie wodnym roztworem n-propyloaminy.
Jest zrozumiałe, że wynalazek został opisany w odniesienu do jego korzystnych, konkretnych rozwiązań i powyższy opis jak i przykłady podane poniżej mają na celu ilustrację a nie ograniczenie zakresu wynalazku.
Przykład I. Synteza [2-/2-nitrofenylo/-2-/O-dimetoksytrytyloksy/etoksy]-N,N-diizopropyloamino-2-cyjanoetoksyfosfiny /BP1/:
2-/0-nitrofenylo/-1,2-etanodiol /2,5 g, 13,6 milimola/ wysuszono przez jednorazowe odparowanie wraz z pirydyną. Pozostałość rozpuszczono w 50 ml pirydyny i dodano 13,6 milimola chlorku 4,4'-dimetoksytrytylowego /DMT-Cl/. Mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu 18 godzin w temperaturze 20°C. Następnie oddestylowano prawie całą zawartość pirydyny a olejową pozostałość rozpuszczono w 250 ml octanu etylowego. Warstwę organiczną przemyto 5% roztworem NaHCCO /2 razy po 250 ml/ i 80% nasyconym, wodnym roztworem NaCl 9/raz, 250 ml/ i wysuszono nad stałym Na2SO4. Po przesączeniu, rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem; pozostałość odparowano raz z 200 ml toluenu i raz z 200 ml CH3CN. Produkt oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym /elując chlorkiem metylenowym CH2Cl2 z dodatkiem 0,5% trójetyloaminy/, uzyskując 6.5 g /13.6 milimola/ czystego produktu /100 procentowa wydajność/.
Oczyszczony produkt, 1-O-DMT-2-/O-nitrofenylo/-1,2-etanodiol, przeprowadzono w βcyjanoetylofosforynoamid w reakcji z 15 milimolami chloro-N,N-diizopropyloamino-2-cyjanoetoksyfosfiny w 50 ml CH2Cl2, w obecności diizopropyloetyloaminy /30 milimoli/, którą prowadzono w temperaturze 10°C w ciągu 30 minut. Następnie dodano 200 ml octanu etylowego i połączoną warstwę organiczną przemyto 80% nasyconym wodnym roztworem NaCl /2 x 250 ml/ po czym wysuszono nad stałym Na2SO4. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem pozostałość odparowano wraz z toluenem /100 ml/ i CH3CN /100 ml/, otrzymując
9,5 g 2,O-fosforynoamidu 1-O-dimetoksytrytylo-2-/O-nitrofenylo/-1,2-etanodiolu /100 procent wydajności/.
Przykład IL Synteza [2-/2-nitrofenylo/-1-/O-dimetoksytrytyloksy/etoksy]-N,N-diizopropyloamino-2-cyjanoetoksyfosfiny /NP2/:
2-/O-nitrofenylo/-1,2-etanodiol /2,5 g, 13,6 milimola/ wysuszono przez odparowanie z CH3CN. Wysuszony związek rozpuszczono w mieszaninie CH2Cl2 /100 ml/ i CH3G /10 ml/, po czym dodano N,N-dimetyloaminopirydynę /100 mg/ i trójetyloaminę /3,6 ml, 26 milimola/ i podczas mieszania dodano stałego chlorku tertbutylodimetylosililowego /TBDMS Cl/ /2,6 g, 15 milimola/. Mieszanie kontynuowano 18 godzin w temperaturze 20°C. Następnie dodano jeszcze TBDMS-Cl /200 mg/. Po godzinie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono ilością 400 ml octanu etylowego. Fazę organiczną przemyto 5% NaHCCb /2 x 250 ml/ i 80% nasyconym wodnym roztworem NaCl /1 x 250 ml/ i wysuszono nad stałym Na2SO4. Po usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem pozostałość odparowano z toluenem/200 ml/ i CH3CN /200 ml/, uzyskując 2,5 g surowego 1-O-TBDMS-2/O-nitrofenylo/-1,2-etanodiolu. Surowy produkt odparowano z pirydyną, a pozostałość rozpuszczono w pirydynie /50 ml/. Dodano DMT-Cl /30 milimoli/ i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 20°C w ciągu 48 godzin. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem pozostałość rozpuszczono w octanie etylowym /250 ml/. Fazę organiczną przemyto 5% NaHCO3 /2 x 250 ml/ i 80% nasyconym wodnym roztworem NaCl /1 x 250 ml/ i wysuszono nad stałym Na2SO4. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość odparowano z toluenem i CH3CN. Pozostałość rozpuszczono w THF /100 ml/ i dodano 10 ml 1M roztworu fluorku tetrabutyloamoniowego w THF. Usuwanie grupy 1-O-TBDMS zakończono po 30 minutach. Produkt oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym, otrzymując czysty 2-O-DMT-2-/O-nitrofenylo/-1,2-etano170146 diol /2,4 g, 4,5 milimola/. Tę substancję przeprowadzono w 2-cajanoetalofosforynoamie w sposób opisany wyżej z ilościową wydajnością.
Przykład ΙΠ. Stosując standardową procedurę syntezy metodą fosforynoαmidoną przygotowano testowy fragment.
5' - T15 - 3' - p - NP1 - p - 5' - T20 - 3' - OH /gdzie p oznacza fosforan/. Po całkowitym odblokowaniu, oczyszczony oligomer DNA rozpuszczono w wodzie i poddano fotolizie w ciągu 15 minut /lampa rtęciowa, λ > 350 nm/. Analiza metodą elektroforezy w żelu poliadryloamldnwym /PAGE/ próbki po dolanej fotolizie wykazała, że nastąpiło całkowite rozszczepienie testowanego fragmentu na nowe fragmenty, które migrowały z szybkością spodziewaną dla segmentów T20 i Ti 5.
Przykład IV. Synteza 5'-DMT-1 A)-/2-^tnrobenzyjo/2-dezoksyryb0/.o-3'“C>-!Tlet.alofosίnrannαrsidy:
Dezndsyryynzę /10 milimnli/, alkohol 2-nitrobenzylony /30 milimnli/ i kwas dldhlornodtowy /DCA, 100 ml/ w 100 ml suchego acetonitrylu utrzymywano w stanie łagodnego wrzenia w ciągu 2 godzin. Po schłodzeniu do temperatury 20°C dodano pirydynę w celu neutralizacji DCA i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 500 ml octanu etylowego, a fazę organiczną przemyto 400 ml 5% NaHCC3, 400 ml 80% nasyconego, wodnego roztworu NaCl i suszono nad stałym Na2SOą. Po odsączeniu rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem a pozostałość odparowano z toluenem i acetonitrylem. Surową mieszaninę reakcyjną rozpuszczono w CH2CL2 i produkt wyizolowano metodą chromatografii na żelu krzemiondonam, eluując w gradiencie metanolu od 0 do 6 %. Zebrano frakcje zawierające produkt /mieszanina izomerów α - i β- w stosunku 1:1/ i usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 2,5 g osadu o barwie jasnożółtej. /5,2 milimola, wydajność 52%/.
Pozostałość O-nitrobenzylowej pochodnej dezoksyrybozy rozpuszczono w 25 ml CH2CI2 zawierającego 200 mg dimetylnamlnopirydyny /DMAP/ i 1.4 ml trójetyloaminy. Do tego roztworu dodano kroplami DMT-Cl /1.7 g, 5 milimoli/ rozpuszczonego w 25 ml CH2CI2. Po przereagnnaniu wszystkich składników wyjściowych, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono octanem etylowym /250 ml/ ekstrahowano, następnie wysuszono i odparowano w sposób opisany powyżej. Surową mieszaninę reakcyjną poddano chromatografii na żelu drzemiondonym, eluując izomery 5'-DMT-Γ-0-2-nitrobenzylo-2'-dezodsyraboza w gradiencie 0-3% metanolu. Otrzymano 2,3 g produktu w postaci piany o barnie żółtej /2,65 milimola/.
3-Metylofosforynoamid przygotowano w znany sposób.
5'-DMT-1'-0-/2-nitroyenzylo/-2'-dezodsyryyozę rozpuszczono w 40 ml CH2CI2 zawierającego 2.8 ml DiPEA i w temperaturze 0°C dodano N,N-diizopropyloaminometalochlnrofosflnę /2,0 milimola/. Po 30 minutach mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 200 ml octanu etylowego i przemyto 3 razy, 200 ml 80% nasyconego, wodnego roztworu NaCl, wysuszono nad stałym N2SO4 i przesączono. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość odparowano wraz z toluenem i acetonitrylem. Produkt ten stosowano bez dalszego oczyszczania.
Taki zablokowany, niezasadowy nukleotyd fosforynoamidowy wprowadzono w standardowych warunkach do oligomeru 3 '-T20-[1'-C-/2-nitroyenzylo/-2'-dezodsyrayozo]-Tlo na stałym nośniku. Ten fragment odblokowano za pomocą DCA /aby usunąć resztę-5'-DMT/, następnie działano tiofenolem /mieszanina tiofenolu, trietyloaminy i dioksanu, 1: 1:2 objętościowo, w ciągu jednej godziny w temperaturze 20°C w celu usunięcia grupy· metylowej /oraz NH4OH/ wodny roztwór wodorotlenku amonowego w ciągu jednej godziny w temperaturze 20°C, w celu rozszczepienia wiązania 3'-yursztanianowego/. Supernatant ogrzewano w temperaturze 60°C w ciągu 18 godzin. W próbie stabilności reszty 5'-DMT-r-0-/2-nitrobenzylo/-2'dezoksyrybozy w zasadzie nie zaobserwowano rozpadu. Próbkę tego materiału w wodzie poddano fotolizie trwającej 2C minut, działając światłem lampy rtęciowej o wysokiej intensywności w celu usunięcia grupy 0-nitroyenzylowej z reszty 5'-DMT-Γ-0-/2-nitroyenzylo/-2'-dezodsyraboza. Nie zaobserwowano rozszczepienia tego oligomeru podczas tego etapu fotolizy. Próbkę tego oligomeru uprzednio poddaną fotolizie inkubow-ano w NH4OH w temperaturze 60°C w ciągu 2 godzin. Traktowanie zasadą spowodowało całkowite rozszczepienie oligomeru na dwa oligomery składowe, Tio-3'-p i 5 '-p-T20.
Reakcje te przedstawiono na schematach 5 i 6.
Schemat 5
Schemat 6 τ~
Ć η+1 m
o
I
Rozszczepienie fragmentów DNA związanych poprzez 2-nltrobenzylo-2 -dezoksyrybozyd.
Przykład V. Wytwarzanie N-4-/0-N,N-diizopropyloaminometoksyfosfinylo-6-oksyheksylo/-5'-DMT-2', 3'-dibenzoilocytydyny.
Urydynę /24,5 g, 100 milimoli/ wysuszono przez odparowanie z pirydyną/2x150ml/. Pozostałość rozpuszczono w 150 ml pirydyny i dodano kroplami, podczas mieszania, chlorku dimetoksytrytyiowego /34 g, 100 milimoli/. Mieszanie kontynuowano 48 godzin. Dodano metanolu /100 ml/ i po 30 minutach odparowano rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 800 ml octanu etylowego i warstwę organicznąprzemyto trzy razy 800 ml 5% NalłCO., 3 razy 800 ml 80% nasyconym, wodnym roztworem NaCl, wysuszono nad stałym N2SO4, odsączono i odparowano do suchej pozostałości, którą to pozostałość następnie odparowano z toluenem i acetonitrylem. Po chromatografii surowego produktu na żelu krzemionkowym, z zastosowaniem do eluowania gradientu 0-7% metanolu i 1% trietyloaminy otrzymano 46.36 g, 84.9 milimola, 5'-DMT-rybourydyny, którą wysuszono przez odparowanie z pirydyną, a pozostałość rozpuszczono w 250 ml pirydyny. Do pirydynowego roztworu, w temperaturze 0°C dodano chlorku benzoilu /20 ml, 170 milimoli./ w 100 ml chlorku metylenowego, wkraplając. Po dwugodzinnym mieszaniu w temperaturze 20°C rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość odparowano z toluenem. Pozostałość tę rozpuszczono w octanie etylowym i poddano takiej samej obróbce wodnej jak opisano powyżej dla 5'-DMT-urydyny.
Surową 5'-DMT-2-, 3'-dibenzoilo-urydynę, którą stosowano bez dalszego oczyszczania, rozpuszczono w 150 ml acetonitrylu. 1,2,4-Triazol /88,19 g/ zawieszono w 400 ml acetonitrylu w temperaturze 0°C i podczas szybkiego mieszania dodano POCb /27,53 ml/. Następnie, do mieszanej zawiesiny w temperaturze 0°C dodano kroplami, w czasie 15 minut trójetyloaminę /106.7 ml/. Po 30 minutach do powyższej mieszanej zawiesiny dodano w temperaturze 0°C 5'-DMT-2', 3'-dibenzoilourydynę rozpuszczoną w 150 ml acetonitrylu. Odstawiono łaźnię wody z lodem i kontynuowano mieszanie przez godzinę w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 1400 ml octanu etylowego, ekstrahowano i wysuszono jak powyżej. Rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, odparowano z toluenem, a następnie z acetonitrylem otrzymując 4-/triazo!o/-1b-D-5'-0-DMT-2', 3--dibenzoilorybofuranozylo/-2/1H/-pirymidynon w postaci piany o barwie białej z ilościową wydajnością.
Do mieszanego roztworu tego związku w 350 ml acetonitrylu dodano bezpośrednio 11.89 g /101.5 milimola/ 6-aminoheksanolu. Mieszanie kontynuowano przez 18 godzin. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 700 ml octanu etylowego i ekstrahowano jak powyżej. Po wysuszeniu warstwy organicznej nad NaiSO4 rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym 60H, eluując w gradiencie stężeń od 0 do 50% octanu etylowego w CH2Cl2, otrzymując 35.4 g /41.5 milimola/ N-4-/6-hydroksyheksylo/-5'-0-DMT-2-, 3'-dibenzoilocytydyny w postaci piany o barwie żółtej.
Odpowiedni metylofosforynoamid przygotowano stosując standardowe procedury. Modyfikowany nukleotyd, N-4-/6-hydroksyheksylo-5'-DMT-2', 3--dibenzoilocytydynę /8.7 g, 10.2 milimola/ rozpuszczono w 50 ml chlorku metylenowego zawierającego 8.8 ml /50 milimola/ diizziprooyloetylenoaminy, po czym w temperaturze 0°C dodano powoli 1.94 ml /10 milimoli/ N,N-diizopropyloaminometoksychlorofosfiny. Po 30 minutach mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 250 ml octanu etylowego, po czym warstwę organiczną przemyto dwa razy 250 ml 5% roztworu NaHCCb, dwa razy 80% nasyconym, wodnym roztworem NaCl, wysuszono nad Na2SO4 i odsączono. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem a pozostałość odparowano z toluenem i acetonitrylem. Surowy fosforynowany materiał oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym, eluując w gradiencie 50-70% octanu etylowego w chlorku metylenowym zawierającym 2% trójetyloaminy, otrzymując 7.25 g N-4-/0,N,N-duzopropyloaminometoksyfosfmylo-6-oksyheksylo/-5/-DMT-2', 3--dibenzoilocytydyny.
Przykład VI. W końcowym rybonukleozydzie cząsteczek RNA łatwo przebiega utleniające rozszczepienie układu cis-diolowego pod działaniem nadjodanu sodowego. W obecności amin powstający dialdehyd łatwo eliminuje zarówno resztę zasadową jak i resztę fosforanową przy węglu 5'. W niniejszym przykładzie opisano wykorzystanie tego zjawiska do zbudowania cząsteczki z miejscem rozszczepialnym, w której to cząsteczce dwa oligomery DNA są powiązane poprzez koniec 5' i grupy hydroksylowe łańcucha bocznego cząsteczki N-4-/6-hydroksyheksylo/-cytydyny.
Modyfikowany rybonukleozyd R zawierający egzocykliczną grupę alkilohydroksylową zsyntetyzowano z urydyny. Chroniony fosforynoamid rybonukleozydu R wprowadzono w standardowych warunkach do oligomeru 5 '-Tio-R-Ti5-3' na stałym nośniku. Próbki oczyszczonego produktu poddano działaniu serii odczynników chemicznych, po czym analizowano metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym /PAGE/. Nie obserwowano rozszczepienia oligomeru po traktowaniu wodorotlenkiem amonowym w temperaturze 60°C w ciągu 18 godzin. W wyniku traktowania nadjodanem sodowym w wodzie w temperaturze 4°C w ciągu 30 minut następowało częściowe rozszczepienie. Dalsze działanie na traktowany uprzednio nadjodanem oligomer n-propyloaminą w octanie trójetyloamoniowym w temperaturze 60°C w ciągu 90 minut spowodowało całkowite rozszczepienie oligomeru na fragmenty T w-3'-p i na T15, modyfikowane na końcu 5'.
Na schemacie 7 przedstawiono rozszczepienie związanych poprzez rybonukleozyd R fragmentów DNA.
Schemat 7 dna2-o
B n+1
LiTA2 —O
N
B.
o / dna2-o
N -^0
CHO CHO n-PrNH2
TEAA 1 godz. 60°C n-1 p
n+1
ΗΟζ^Χν^^ΟΗ'
Propyl
170 146
Powyższy schemat rozszczepienia zastosowano w stosunku do szeregu rozgałęzionych oligomerów dNa, gdzie zablokowany fosforynoamid rybonukleozydu R wprowadzano podczas pierwszego cyklu drugorzędowej syntezy osadzonych na stałym nośniku liniowych oligomerów zawierających 10, 201 30 punktów rozgałęzienia. W każdym przypadku drugorzędową syntezę prowadzono z zastosowaniem oligomeru T10, wytwarzając rozgałęzione oligomery o następującej strukturze: 3'-T2o-En-5'/punkt rozgałęzienia -3'-R-Rio-5'/n n = 10, 20, 30. Te cząsteczki poddawano warunkom, w których zachodzi rozszczepianie. Analiza metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym wykazała, że wszystkie oligomery stanowiące rozgałęzienia /ramiona boczne/ zostały rozszczepione i we wszystkich przypadkach głównym produktem był Tn)-3'-p. Analiza ta wykazała również, że rozrzut produktów rozszczepienia zależy od ilości rozgałęzień w rozgałęzionej cząsteczce DNA, przy czym ilość krótszych oligomerów wzrasta wraz ze wzrostem ilości rozgałęzień w cząsteczce. Obniżenie homogeniczności wydaje się wynikać głównie z jonowych sił przestrzennych w obrębie stałego nośnika podczas syntezy chemicznej.
Przykład VII. W mniejszym przykładzie opisano wytwarzanie wielofunkcyjnego łącznikowego DMT-E' /Lev/BCE- fosforynoamidu w ciągu reakcji przedstawionych na schemacie 8.
Schemat 8
| Cff20H CH^ - C - ch2oh CHgOH E' | chlorek toluenosulfonylu /TsCl/ . | CHo0H 1 <- | |
| CH, - C 1 Ci | -CHgOH S2 - 0 - Ts E 7Ta/ | ||
| <jH20H | kwas lewuli- | > | DKTtCI t h2oh |
| CH, - C - CH„-0-DHT 3 1 2 CH2-0- Lev | ^owy, sól cezowa | ob3 -0 | - CHg - 0-DMT |
| CH2 - 0 - Ts | |||
| DOT-E7Lev/ | DHT-E7TS/ | ||
| CNCHoCHoO-P^^1 2 2 \n/1Pt/2 |
<N/lPrĄ I - 0CH2CH2CN
CH, - C - CHo0DMT 3 | 2
CH2-0-Lev
DMT-E' /Lev/BCE fosforynoamid
Tris-hydroksymetyloetan/E', 200 milimoli/ odparowano z 250 ml pirydyny, a pozostałość rozpuszczono w 125 ml pirydyny. Do tego roztworu, schłodzonego do temperatury 0°C dodano kroplami roztwór chlorku toluenosulfonylu /TsCl 50 milimoli/ w 125 ml CH2Cl2.
Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej kontynuowano mieszanie łącznie przez 5 godzin. Następnie odparowano rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 500 ml octanu etylowego i warstwę organiczną przemyto dwa razy 500 ml 5% roztworu NaHCO3, raz 500 ml 80% nasyconego, wodnego roztworu NaCl i w końcu wysuszono nad stałym Na2SOą. Po odsączeniu rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano 13.7 g surowego E' /Ts/. Ten produkt stosowano bez dalszego oczyszczania. Całą ilość E' /Ts/ rozpuszczono w 250 ml CH2G2 i dodano trietyloaminę /14 ml; 100 milimoli/ i N,N-dlmgtyloamiuopirydyuę /100 ml/. Do tego roztworu dodano DMT-Cl /13,6 g; 40 milimoli/ rozpuszczonego w 125 ml CH2O2. Po 18 godzinach utrzymywania w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 500 ml octanu etylowego i poddano takiej samej obróbce wodnej jak opisano powyżej.
Surowy produkt reakcji oczyszczono na standardowej kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym /800 ml silica/, eluując w gradiencie metanolu w mieszaninie CH2G2 i 0.5% metyloaminy. Otrzymano 14.8 g /25 milimoli/ czystego DMT-E' /Ts/. Całą ilość tego produktu traktowano 50 milimolami świeżo przygotowanej soli cezowej kwasu lewulmowego /według przepisu podanego przez M.Bodanszky i A.Bodauszky w The Practice of Peptide Sduthesiu, str. 37, wyd. Springer Verlag /1984/ w 50 ml DMF. Roztwór ogrzano na gorącej płytce w zatopionej fiolce /ustawienie grzania na pozycję 3, temperatura około 100°C/ w ciągu 18 godzin. Analiza wykazała, że po tym czasie reakcja przebiegła do końca. DMF odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem a pozostałość rozpuszczono w octanie etylowym. Fazę organiczną przemyto w sposób opisany powyżej. Surowy produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym. Czysty produkt eluowano chlorkiem metylenowym z dodatkiem 0,5% trójetyloaminy, otrzymując 2.5 g/4.8 milimola/czystego produktu DMT-E'/Lev/, który przeprowadzono w 2-cyjauoetylo-fouforynoamid w sposób następujący:
DMT-E' /Lev/ rozpuszczono w 20 ml CH2Cl2 zawierającego 2.6 ml /15 milimoli/ N,Ndlizopropdloetyloaminy i schłodzono do 0°C; do tego roztworu dodano w atmosferze argonu, strzykawką, 1.1 ml/5 milimoli/ 2-cyjauoetoksy-N,N-diizopropyloamluochlorofosfiud. Po około 30 minutach reakcję zakończono; wówczas mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 150 ml octanu etylowego. Fazę organiczną przemyto dwa razy 150 ml 5% NaHCO3 i dwa razy 150 ml 80% nasyconego roztworu NaCl. Po wysuszeniu nad stałym Na2SOą roztwór przesączono i odparowano do suchej pozostałości, otrzymując 3.6 g produktu w postaci piany o barwie białej. Surowy produkt, DMT-E' /Lev/ BCE fosforynoamid, oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym i eluowano mieszaniną chlorku metylenowego, octanu etylowego i trójetyloamluy /45:45:10, objętościowo/, uzyskując 3.24 g /4.5 milimola/ czystego DMT-E'' /Lev/ BCE fouforyuoamldu w postaci piany o barwie białej. NMR^P/ó = 148.5 ppm; Wydajność sprzęgania: 98%.
Przykład VIII. W niniejszym przykładzie opisano i przedstawiono na schemacie 9, alternatywną syntezę wielofunkcyjnego łącznika: DMT-E' /Lev/ BCE fouforduoamidu.
170 146
Schemat 9
CH, CH,OH I 2
C - CH?OH I
CH2OH się63ci
CH.
C - CH, - O 2 CH2 - O - Lev
DMT
4r
CIUCH
CH, - C ch2oh ch2 - O - Si{b5 E*(TPS)
DMT-C1
DMT-E'(lev)
CHO - OH I 2
CH, - C - CHO - O - DMT 5 I 2
CH2-0-Lev kwas lewulinowy
EDIC *
CH,
CHo0H I 2
-C - CH2 - O - DMT ch2 - O - si<£>5 dmt-e'(tps)
X cnch_choc-p^ 2 2 xN(iPr), ch2- O - P
N(iPr)2
CH, - C - CHo0-DMT 5 i T
CH2- o - Lev och2ch2cn
DMT-E' /Lev/ BCE fosforynoamid
EDIC = chlorowodorek l-etylo-3-/3-dimetyloaminopropylo/karbodiimidu. 0 oznacza fenyl
170 146
Tris-/hydroksymetylo/etan /200 milimoli/ odparowano z 250 ml pirydyny, a pozostałość rozpuszczono w 125 ml pirydyny, Do tego roztworu oziębionego do temperatury 0°C dodano kroplami roztwór 50 milimoli trójfenylochlorosilanu /TPS/ w 125 ml CH2Cl2· Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej kontynuując mieszanie łącznie przez 18 godzin.
Następnie odparowano rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszczono w 500 ml octanu etylowego i roztwór przemyto 2 razy 500 ml 5% NaHCO.3, raz 500 ml 80% nasyconego wodnego roztworu NaCl i wysuszono nad stałym Na2SO4. Po odsączeniu rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 18 g surowego E' /TPS/, który stosowano bez dalszego oczyszczania Całą ilość /46 milimoli/ E' /TPS/ rozpuszczono w 250 ml CH2G2 i dodano 14 ml /100 milimoli/ trietyloaminy i 100 mg N,N-dimetyloaminopirydyny. Do tego roztworu dodano 50 milimoli DMT-Cl rozpuszczonego w 125 ml CH2G2. Po 18 godzinach utrzymywania w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 500 ml octanu etylowego i poddano takiej samej obróbce wodnej j aką opisano powyżej, otrzymując 35.8 g produktu piany o barwie żółtej.
Ten surowy produkt oczyszczono na standardowej kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym /800 ml silica/ eluując w gradiencie metanolu w mieszaninie CH2Cl2 i 0,5% trójetyloaminy. Otrzymano 14.8 g /25 milimola/ czystego DMT-E' /TPS/. Dość 10 milimoli DMT-E7TPS/ rozpuszczono w 50 ml zawierającego 10 mg N,N-dimetyloaminopirydyny i dodano 2.3 ml /20 milimoli/ 2,6-lutydyny i 2.3 g /20 milimoli/ kwasu lewulinowego.
Następnie, do tego roztworu dodano kroplami 3.83 g /20 milimoli/ chlorowodorku 1-etylo-3-/3-dimetyloaminopropylo/karbodiimidu rozpuszczonego w 50 ml CH^Ck Po 18 godzinach reakcja przebiegła do końca /analiza metodą chromatografii cienkopłytkowej /tlc/. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono ilością 500 ml octanu etylowego i poddano takiej samej obróbce wodnej jaką opisano powyżej. Pozostałość z tej obróbki rozpuszczono w 50 ml THF i dodano na początku 40 ml pirydyny a potem 10 ml stężonego kwasu octowego i w końcu 20 ml 1 m fluorku tetrabutyloamoniowego w THF /Aldrich/.
Chromatografia cienkowarstwowa wykonana po 30 minutach wykazała, że wszystkie substancje wyjściowe zostały zużyte. Wówczas większą część rozpuszczalnika odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość poddano następującej obróbce wodnej: dodano 250 mg octanu etylowego w celu rozpuszczenia większości materiału organicznego, po czym powoli dodano 250 ml 5% wodnego roztworu dwuwęglanu sodowego /wydzielał się CO2/.
Następnie dodano stały NaHCCb, mieszając i rozpuszczając go, do czasu aż zacznie pozostawać osad soli i przestanie wydzielać się CO2. Połączony roztwór wodno-organiczny przeniesiono do rozdzielacza i przemyto warstwę organiczną w sposób podany powyżej. Po usunięciu rozpuszczalnika otrzymano 5.96 g surowego DMT-E' /Lev/ w postaci przezroczystego oleju. Produkt ten wyizolowano metodą chromatografii w żelu krzemionkowym stosując około 500 g krzemionki, a do eluowania mieszaninę CH2CI2 i 0.25% trójetyloaminy z dodatkiem C % i 1% metanolu. Otrzymano 2.7 g /5.2 milimola/ DMT-E' /Lev/ w postaci przezroczystego, bezbarwnego oleju.
Czysty DMT-E' /Lev/ przeprowadzono w 2-cyjanoetylo-fosforyno-amid w sposób następujący: DMT-E' /Lev/ rozpuszczono w 20 ml CH2G2 zawierającym 2.6 ml /15 milimola/ N,N-diizopropyloetyloaminy i oziębiono do temperatury 0°C. Do tego roztworu dodano w atmosferze argonu, strzykawką, 1.1 ml /5 milimoli/ 2-cyjanoetoksy-N,N-diizopropyloaminochlorofosfiny. Po około 30 minutach reakcja przebiegła do końca. Wówczas mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 150 ml octanu etylowego i warstwę wodną przemyto 2 razy 150 ml 5% NaHCO2 i dwa razy 150 ml 80% nasyconego NaCl.
Po wysuszeniu nad stałym Na2SO4, roztwór odsączono i odparowano do suchej pozostałości Otrzymano 3.4 g DMT-E' /Lev/ BCE fosforynoamidu w postaci piany o barwie białej. Ten surowy fosforynoamid oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym, eluując mieszaniną rozpuszczalników CH^Cb/octan etylowy/trójetyloamina/45:45:10, objętościowo/. Otrzymano
2.4 g/3.3 milimola/ czystego DMT-E'/Lev/BCE fosforynoamidu w postaci piany o barwie białej.
NMR /3*P/ δ : 148.5 ppm. Wydajność sprzęgania : 98%.
170 146
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz
Cena 6,00 zł
Claims (29)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wykrę wania obtn:nościda.nejsekweneji olinonokleotydowejwbadanym kwasie nukleinowym obecnym w próbce dwasy nukleinowego, znamienny tym, że łączy się w warunkach hybrydyzacji tę próbkę kwasu nukleinowego z reagentem pnlinydleotyenwym o wzorzeOII5'-HO5 (DNA1)3 -O-P-O-(CH2)x-CH-(CH2)y-O-P-O-5 (DNA2)3 -OHOHOH w którym DNAi oznacza pierwszy segment DNA, DNA2 oznacza drugi segment DNA, a jeden z symboli x i y oznacza zero, podczas gdy drugi z nich oznacza liczbę całkowitą 1-12 włącznie, przy czym, albo próbkę albo reagent osadza się uprzednio na nośniku, i w wyniku hybrydyzacji badanego kwasu nukleinowego z reagentem polinudkeotadowym tworzy się znacznik związany z nośnikiem poprzez miejsce rozszczepialne-0-(CH2)a-CH-(CH2)b-0-, rorN°2 a następnie zasadniczo uwalnia się ten nośnik od znacznika związanego z nośnikiem inaczej niż poprzez to miejsce selektywnie rozszczepialne, po czym rozszczepia się to miejsce rozszczepialne na drodze fotolizy stosując światło o długości fali co najmniej 350 nm i wykrywa się znacznik uwolniony od nośnika.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się reagent polinudleotydnwy, o wzorze według zastrz. 1, w którym symbol x oznacza zero.
- 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się reagent pnhnudlentyeowa o wzorze według zastrz. 1, w którym symbol y oznacza liczbę całkowitą 1-4 włącznie.
- 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się reagent polinudkeotaenwa o wzorze według zastrz. 1, w którym symbol y oznacza 1.
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się reagent pnlinudłeotydowy o wzorze według zastrz. 1, w którym symbol y oznacza zero.170 146
- 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się reagent polinukleotydowy o wzorze według zastrz. 1, w którym symbol x oznacza liczbę całkowitą 1-4 włącznie.
- 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje się reagent polinukleotydowy o wzorze według zastrz. 1, w którym symbol x oznacza 1.
- 8. Sposób wykrywania obecności danej sekwencji oligonukleotydowej w badanym kwasie nukleinowym obecnym w próbce kwasu nukleinowego, znamienny tym, że łączy się w warunkach hybrydyzacji, w środowisku wodnym tę próbkę kwasu nukleinowego z reagentem polinukleotydowym o wzorze5' 3' ° « 5' 3'5'-HO5 (DNA© -C-P-O-(CH2)x-CH - (CH2) -0-P-0- (DNA© -OHOHNO,OH w którym DNA1 oznacza pierwszy segment DNA, DNA2 oznacza drugi segment DNA, a jeden z symboli x i y oznacza zero, podczas gdy drugi z nich oznacza liczbę całkowitą 1-12 włącznie, przy czym albo próbkę albo komponent reagenta osadza się uprzednio na nośniku i w wyniku hybrydyzacji badanego kwasu nukleinowego z reagentem polinukleotydowym tworzy się znacznik związany z nośnikiem poprzez miejsce rozszczepialne,-O- ( CH 2) a-CH- (CH,) b-0- no2 a następnie wydziela się nośnik ze związanym reagentem polinukleotydowym i badanym kwasem nukleinowym ze środowiska wodnego, po czym przemywa się ten nośnik medium o odmiennej sile hybrydyzacji niż to środowisko wodne w celu usunięcia znacznika związanego z nośnikiem inaczej niż poprzez miejsce rozszczepialne, z kolei rozszczepia się to miejsce rozszczepialne na drodze fotolizy stosując światło o długości fali co najmniej 350 nm i wykrywa się znacznik uwolniony od nośnika.
- 9. Sposób według zestrz. z, znamienny tjern,żestosuje się reegent polinukleotydowy y wzorze według zastrz. 8, w którym symbol x oznacza zero.
- 10. Sposób według zasta. 9, znamienny tym, że stosuje się reagent polinukleotydowy o wzorze według zastrz. 8, w którym symbol y oznacza liczbę całkowitą w zakresie 1-4 włącznie.
- 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się reagent polinuklpoiydowy o wzorze według zastrz. 8, w którym symbol y oznacza liczbę jeden.
- 12. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się reagent polinukleotydęwy o wzorze według zastrz. 8, w którym symbol y oznacza 0.
- 13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stosuje się reagent polinukleotydowy o wzorze według zastrz. 8, w którym symbol x oznacza liczbę całkowitą w zakresie 1 -4 włącznie.
- 14. Sposób wykrywania obecności danej sekwencji oligonukleotydowej w badanym kwasie nukleinowym obecnym w próbce kwasu nukleinowego, znamienny tym, że łączy się w warunkach hybrydyzacji tę próbkę kwasu nukleinowego z reagentem polinukleotydowym o wzorze5'-H05 (DNAj )3 -0-P-0OHHO-p—O-5 (DNA,)3 -OHII w którym DNAi oznacza pierwszy segment DNA, DNA2 oznacza drugi segment DNA, a R oznacza grupę 2-nitrobenzylową, 4-penten-l-ylową,-ch2ch2s-CH2CH2Si(CH3)3, gdzie R' oznacza wodór, grupę arylową albo aryloalkilową, podstawniki R, mogą być takie same lub różne 1 oznaczać grupę aminową, nitrową, chlorowiec, hydoksylową, niższą grupę alkilową, lub niższą grupę alkoksylową, podstawniki Rj mogą być takie same lub różne i oznaczać grupę aminową, nitrową, chlorowiec, hydroksylową, niższą grupę alkilową albo niższą grupę alkoksylową, i oznacza zero, 1, 2 albo 3, j oznacza zero, 1, 2, 3 lub 4, Rm oznacza zawierający 1-16 atomów węgla oligomer aikilenowy albo oksyetylenowy -(CH2CH2O )z - gdzie z oznacza liczbę całkowitą 1-16 włącznie a Rn oznacza grupęΘ OCH ^-C-CH ^CH 2-C- ,02N oIICH2CH2-0-C-S-CH2CH2 o-c·S-CH?CHII alboCH30-CH2CH2-0-CH2- .przy czym albo próbkę albo reagent osadza się uprzednio na nośniku i w wyniku hybrydyzacji badanego kwasu nukleinowego z reagentem polinukleotydowym tworzy się znacznik związany z nośnikiem poprzez miejsce rozszczepialne o wzorze _ R-0-i 00.w którym R oznacza grupę 2-nitrobenzylową, 4-penten-1-ylową.-CH2CH2S' ~CH2CH2Si(CH5)3 ,-R -O-R m nO gdzie R' oznacza wodór, grupę arylową albo aryloalkilową, podstawniki Ri mogą być takie same lub różne i oznaczać grupę aminową, nitrową, chlorowiec, hydroksylową, niższą grupę alkilową lub niższą grupę alkoksylową, podstawniki Rj mogą być takie same lub różne i oznaczać grupę aminową, nitrową, chlorowiec, grupę hydroksylową, niższą grupę alkilową albo niższą grupę alkoksylową, i oznacza zero, 1, 2 albo 3, j oznacza zero, 1, 2, 3 albo 4, Rm oznacza zawierający 1-16 atomów węgla oligomer alkilenowy albo oksyetylenowy -(CH2CH2O )z - gdzie z oznacza liczbę całkowitą 1-16 włącznie a Rn oznacza grupę o wzorzeOIICH2-C-CH2CH2-CO170 146CH3O-CH2-CH2-O-CH2a następnie zasadniczo uwalnia się ten nośnik od znacznika związanego z nośnikiem inaczej niż poprzez to miejsce selektywnie rozszczepialne, po czym rozszczepia się to miejsce rozszczepialne na drodze fotolizy stosując światło o długości fali co najmniej 350 nm i wykrywa się znacznik uwolniony od nośnika.
- 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się reagent polinukleotydowy o wzorze według zastrz. 14, w którym R oznacza grupę 2-nitrobenzylową.
- 16. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się reagent polinukleotydowy o wzorze według zastrz. 14, w którym R oznacza-CH2CH2S'
- 17. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się reagent polinukleotydowy o wzorze według zastrz. 14, w którym R oznaczaO
- 18. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się reagent polinukleotydowy według zastrz. 14. w którym R oznacza 2-meiyleno-9,10-antrachinono-acetal.
- 19. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się reagent według zastrz. 14, w którym R oznacza grupę 4-penten-1-ylową.
- 20. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się reagent według zasta. 14, w którym R oznacza-ch2ch2_/ Q •no2
- 21. SposóSwdółuz essrrz.l4,znamizImo tyin że sto siej s oisje agęntwedłuzestUrz .14, w którym R oznaczaII- P 0’I
- 22. Sposóbwóbrywania oneonośei danej olieonukloyrydpwejweaZanym kwasie nukleinowym obecnym w próbce kwasu nukleinowego, znamienny tym, że łączy się w warunkach hybrydyzacji, w środowisku wodnym tę próbkę kwasu nukleinowego z reagentem pęlinukleotydowym o wzorze-HO (DNA.,)-O-P-0-rIOH0'-CH2CH2S-ę Q-CH2CH2Si(CH3)3I et' z'HO —P — O-9 (DNA^9 -OHII • ( ogdzie DNA1 oznacza pierwszy segment DNA, DNA2 oznacza drugi segment DNA o R oznacza grupę 2-niirobenzylową, 4-penten-1-ylęwą,170 146Ο gdzie R' oznacza wodór, grupę arylową albo aryloalkilową, podstawniki Ri mogą być takie same lub różne i oznaczać grupę aminową, nitrową, chlorowiec, hydroksylową, niższą grupę alkilową, lub niższą grupę alkoksylową, podstawniki Rj mogą być takie same lub różne i oznaczać grupę aminową, nitrową, chlorowiec, hydroksylową, niższą grupę alkilową albo niższą grupę alkoksylową, i oznacza zero, 1, 2 albo 3, j oznacza zero, 1, 2, 3 albo 4, Rm oznacza zawierający 1-16 atomów węgla ligomer alkilenowy albo oksyetylenowy -(CH2CH2O)Z - gdzie z oznacza liczbę całkowitą 1-16 włącznie a Rn oznacza grupęO oII II ch2-c-ch2ch2-c- , °2N_aO oΠCH2CH2-O-CoIłS-CH^CH^-O-C170 146CH3O-CH2CH2-O-CH2Ο ί» lub przy czym albo próbkę albo komponent reagenta osadza się uprzednio na nośniku i w wyniku hybrydyzacji badanego kwasu nukleinowego z reagentem polinukleotydowym tworzy się znacznik związany z nośnikiem poprzez miejsce rozszczepialne o wzorze w którym R oznacza grupę 2-nitrobenzylową, 4-penten-1-ylową, grupy o wzorach:gdzie R' oznacza wodór, grupę arylową albo aryloalkilową, podstawniki Rj mogą być takie same lub różne i oznaczać grupę aminową, nitrową, chlorowiec, hydroksylową, niższą grupę alkilową lub niższą grupę alkoksylową, podstawniki Rj mogą być takie same lub różne i oznaczać grupę aminową, nitrową, chlorowiec, grupę hydroksylową, niższą grupę alkilową albo niższą grupę alkoksylową, i oznacza zero, 1, 2 albo 3, j oznacza zero, 1, 2, 3 albo 4, Rm oznacza zawierający 1-16 atomów węglaoligomer alkilenowy albo oksyetylenowy -(CH2CH2O )z-, gdzie z oznacza liczbę całkowitą 1-16 włącznie a Rn oznacza grupę o wzorze0 O1' JJ ch3-c-ch2ch2-c- ,O tl s-ch2ch2-o-c- o o « 11S-CH9CH9-O-C- albo oCH3-0-CH2-CK2“0-CH2a następnie wydziela się nośnik ze związanym reagentem polinukleotydowym i badanym kwasem nukleinowym ze środowiska wodnego, po czym przemywa się ten nośnik medium o odmiennej sile hybrydyzacji niż to środowisko wodne w celu usunięcia znacznika związanego z nośnikiem inaczej niż poprzez miejsce rozszczepialne, z kolei rozszczepia się to miejsce rozszczepialne na drodze fotolizy stosując światło o długości fali co najmniej 350 nm i wykrywa się znacznik uwolniony od nośnika.
- 23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że stosuje się reagent polinukleotydowy o wzorze według zastrz. 22, w którym R oznacza grupę 2-nitrobenzylową.
- 24. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że stosuje się reagent polinukleotydowy o wzorze według zastrz. 22, w którym R oznacza-ch2ck2s170 146
- 25. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że stosuje się reagent polinukleęiydowy o wzorze według zastrz. 22, w którym R oznacza
- 26. Sposób według zastrz, 22, znamienny tym, że stosuje się reagent polinukleoiydowy o wzorze według zastrz. 22, w którym R oznacza 2-mptyleno-9,10-onironhinono-anpial.
- 27. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że stosuje się reagent o wzorze według zastrz. 22, w którym R oznacza grupę 4-penien-1-ylową.
- 28. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że stosuje się reagent o wzorze według zos^z. 22, w którym R oznacza-ch2ch2-no2
- 29. Sposób wdółuzesłUrz.22,zn2miznno tym, żż Oożpj s oię eeagęnłapvzoękz wedłuw zastrz. 22, w którym R oznaczaII _ -P —0L o
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/559,961 US5430136A (en) | 1984-10-16 | 1990-07-27 | Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites |
| US07/736,445 US5367066A (en) | 1984-10-16 | 1991-07-24 | Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites |
| PCT/US1991/005287 WO1992002528A1 (en) | 1990-07-27 | 1991-07-25 | Incorporation of selectably clevable and/or abasic sites into oligonucleotide chains and reagents therefor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL170146B1 true PL170146B1 (pl) | 1996-10-31 |
Family
ID=27072214
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL91298545A PL170146B1 (pl) | 1990-07-27 | 1991-07-25 | Sposób wykrywania obecnosci danej sekwencji oligonukleotydowej PL |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| CA (1) | CA2088257A1 (pl) |
| IE (1) | IE912661A1 (pl) |
| PL (1) | PL170146B1 (pl) |
| PT (1) | PT98488B (pl) |
-
1991
- 1991-07-25 CA CA 2088257 patent/CA2088257A1/en not_active Abandoned
- 1991-07-25 PL PL91298545A patent/PL170146B1/pl unknown
- 1991-07-29 PT PT9848891A patent/PT98488B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-07-29 IE IE266191A patent/IE912661A1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT98488A (pt) | 1992-05-29 |
| PT98488B (pt) | 1998-04-30 |
| IE912661A1 (en) | 1992-01-29 |
| CA2088257A1 (en) | 1992-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2552048B2 (ja) | ヌクレオチド鎖合成用試薬 | |
| US5367066A (en) | Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites | |
| US5258506A (en) | Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains | |
| KR101028980B1 (ko) | 포스페이트 모방체를 함유하는 폴리뉴클레오티드 | |
| JPH06500107A (ja) | オリゴ（α―アラビノフラノシル・ヌクレオチド）およびそれらのα―アラビノフラノシル前駆体 | |
| US7858772B2 (en) | Compounds and methods for synthesis and purification of oligonucleotides | |
| AU665174B2 (en) | Synthesis of oligonucleotides | |
| US5071974A (en) | Compositions and methods for the synthesis of oligonucleotides having 5'-phosphorylated termini | |
| CA2118153A1 (en) | Use of nucleosides and nucleoside derivatives provided with enzymatically cleavable protecting groups in the synthesis of oligonucleotides | |
| Fearon et al. | An improved synthesis of oligodeoxynucleotide N3′→ P5′ phosphoramidates and their chimera using hindered phosphoramidite monomers and a novel handle for reverse phase purification | |
| Fidanza et al. | Functionalization of oligonucleotides by the incorporation of thio-specific reporter groups | |
| PL170146B1 (pl) | Sposób wykrywania obecnosci danej sekwencji oligonukleotydowej PL | |
| KR20240131337A (ko) | 폴리뉴클레오티드 제조 방법 | |
| JPH0613545B2 (ja) | ヌクレオシドホスホロチオイットおよびその合成法 | |
| US20040230047A1 (en) | Novel phosphorylation reagents for improved processes to convert terminal hydroxyl groups of oligonucleotides into phosphate monoesters | |
| HK1134295B (en) | Compounds and methods for synthesis and purification of oligonucleotides | |
| HK1000191A1 (en) | Modified oligodeoxyribonucleotides, their preparation and their therapeutic use | |
| HK1000191B (en) | Modified oligodeoxyribonucleotides, their preparation and their therapeutic use |