PL171131B1 - S p o s ó b w y tw a rz a n ia n o w y ch g lik o zy lo w an y ch p o c h o d n y c h ste ro id o w y c h1 . Sposób wytwarzania nowych glikozylowanych pochodnych steroidowych o wzorze (I ) PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1 . Sposób wytwarzania nowych glikozylowanych pochodnych steroidowych o wzorze (I ) w którym A oznacza O, OH, O R 6, N R7R 8, N 3, N H C O R 7, O CO Ar, OC(=O )O R9 , O C O R 9, N C H 2 C6H 5, A r oznacza fenyl lub fenyl podstaw iony 1 -3 grupami wybranym i z grupy skladajacej sie z chlorow ca, C 1-C 12 alkilu lub C 1-C3alkoksylu, a oznacza pojedyncze w iazanie konfiguracji alfa lub beta z tym ze, a oznacza podw ójne w iazanie gdy A = O , R 1 oznacza H, który jest w polozeniu cis lub trans w stosunku do R2, R2 oznacza CH3, R 3 oznacza H, O H lub O R 6, R4 oznacza H, O H lub O R 6, R 5 oznacza C O 2R 10 , C H 2 O R 9, CON H 2, CON H R 7, C O N R 7R 8 , C(=O)S-R10 , C H 2 S(O )p -S -R 10 , CH2NH2, CH 2NHR7, C H 2 N R 7R 8 , C H 2-S(O )p-S -R 10, R6 oznacza ugrupowanie m onosacharydu, w którym wiazanie glikozydow e przy anom erycznym atomie w egla w w ym ienionym ugrupowaniu monosacharydu jest alfa lub beta w zglednie oznacza ugrupowanie oligosacharydu o 2-10 ugrupowaniach monosacharydu, w których w iazanie glikozyd ow e przy którym kolw iek z anom erycznych atom ów w egla w kazdym ugrupowaniu m onosacharydu ugrupowania oligosacharydu jest alfa lub beta, R 7 i R8 niezaleznie oznaczaja H. C 1-C4alkil, C3-C7cykloalkil, C4-C 10 alkilocyklo alkil, fenyl, benzyl, w zglednie lacznie oznaczaja grupe o w zorze (CH2)f, w którym f=3 -6 , R 9 oznacza H lub C 1 -C 3alkil, R 10 oznacza H, C 1- C 10 alkil, C 1- C 1 0 alkenyl, C 1-C 1 0 alkinyl. C 6H5 lub CH2C6H5, przy czym ugrupowanie monosacharydu stanowi ugrupowanie zabezpieczonej lub odbezpieczonej heksozy lub dezoksyheksozy wybranej z grupy obejmujacej D-alloze, L-alloze, D-altroze, L-altroze, D-glukoze, L-glukoze, D-mannoze, L-mannoze, D-guloze, L-guloze, D-idoze, L-idoze, D-galaktoze, L-galaktoze, D-taloze i L-taloze wzglednie ugrupowanie zabezpieczonej lub odbezpieczonej furanozy lub dezoksyfuranozy wybranej z grupy obejmujacej D-ryboze, L-ryboze, D-arabinoze, L-arabinoze, D -ksyloze, L-ksyloze, D -liksoze i L-liksoze, przy czym wymienione grupy zabezpieczajace grupy hydroksylowe w ugrupowaniach heksoz lub furanoz wybrane sa z grupy obejmujacej benzyl, trójmetyloacety), trójmetylosilil, III-rzed-butylodwumetylosilil, III-rzed. butylodwufenylosilil, trójizopropylosilil, acetyl, tetrahydropiranyl, benzoil, C 1-C3alkil, izopropyhdenyl, benzyliden, (2 -metoksyetoksy)metyl1 ortoester, parametoksybenzyl i alhl, p oznacza 0, 1 lub 2, n oznacza 0, I lub 2, lub farm aceutycznie odpow iedniej soli tego zw iazku, znam ienny tym , ze (a) zabezpieczony glikozyd , w którym atomy tlenu w e w szystkich pozycjach cukru za w yjatkiem pozycji anom erycznej sa zab ezpieczon e takimi samymi lub róznym i grupami w ybranym i z grupy obejm ujacej estry i etery, takie ja k alkilow e, sililow e, fenylow e lub benzylow e poddaje sie reakcji ze (b) zwiazkiem S-R, w warunkach standardowych, w którym to zwiazku R oznacza C 1-C 10 alkil, pirydyl, furyl, denyl, fenyl podstawiony 1 -3 grupami wybranymi z grupy obejmujacej chlorowiec, C 1 -C3alkil, NO2, C 1 -C 3 alkoksyl, z wytworzeniem zabezpieczonego tioglikozydu, który nastepnie poddaje sie reakcji z (c) kwasem m eta-chloronadbenzoesow ym z w ytworzeniem odpowiedniej pochodnej sulfotlenkow ej, (d) przeprowadza sie j a w posredni, aktyw ow any srodek glikozylujacy stosujac zw ia zek zaw ierajacy trójfluorom etanosulfonian, taki ja k b ezw odnik trójfluorom etanosulfonowy, trójfluorom etanosulfom an m etylow y lub trójfluorometanosulfoman trójm etylosililow y w temperaturze -7 8 n C i kontaktuje sie ten aktyw ow any srodek glik o zylu jacy z (e) steroidem, w którym w szystkie atomy tlenu, które me maja byc glikozylowane sa zabezpieczone w znany sposób wobec 2,6-dwu-III-rzed butylo-4-mety- lopirydyny w toluenie, w cehi utworzenia wiazan glikozylowych a , a albo wobec nitrylu kwasu propionowego w celu utworzenia wiazan ß , ß który nastepnie (f) odbezpiecza sie standardowym i procedurami z w ytworzeniem glukozylow anych steroidów o w zorze (I) P L 1 7 1 1 3 1 B 1 ( 3 0 ) Pierwszenstwo: 13.12.1991 ,U S,07/806985 ( 7 3 ) Uprawniony z patentu: The Trustees of Princeton University, Princeton, US ( 4 3 ) Zgloszenie ogloszono: 23.01.1995 BU P 02/95 ( 7 2 ) Twórcy wynalazku: Daniel E. Kahne, Princeton, US Suzanne W. Kahne, Princeton, US ( 4 5 ) O udzieleniu patentu ogloszono: 28.02.1997 W UP 03/97 ( 7 4 ) Pelnomocnik: Ostrowska Elzbieta, PHZ POLSERVICE PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych glikozylowanych pochodnych steroidowych ułątwiających transport cząsteczek przez błony biologiczne i przez barierę krew-mózg. Nowy sposób glikozylacji zapewnia wydajną syntezę tych glikozylowanych pochodnych steroidowych.

Dla wywołania żądanej odpowiedzi biologicznej, cząsteczka podana w celach diagnostycznych, profilaktycznych lub leczniczych (zwana w dalszej części opisu cząsteczką ważną leczniczo lub związkiem ważnym leczniczo) musi być dostępna w miejscu reakcji w stężeniu wywierającym efekt. Na stężenie związku ważnego leczniczo osiągającego w końcu miejsce swego działania wpływa wiele czynników, między innymi podana ilość związku oraz wielkość i szybkość jego absorpcji, dystrybucji, biotransformacji i wydalania (Goodman i Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, wyd. VI; MacMillan Publishing Co., Inc., New York, 1980, str. 1-39). Czynniki te z kolei zależą od drogi podania tego związku ważnego leczniczo.

Najbardziej powszechnymi drogami podawania związków ważnych leczniczo są drogi pozajelitowe czyli parenteralne (dożylna, podskórna i domięśniowa) oraz dojelitowe (doustna), jakkolwiek znane są również drogi podawania związków ważnych leczniczo przez skórę lub przez błony śluzowe (doustnie, donosowo, doodbytniczo, dopochwowo i inne). W zasadzie, podawanie parenteralne uważa się za najbardziej skuteczne, pozwalające na szybki wzrost poziomu we krwi szerokiego spektrum związków ważnych leczniczo. Parenteralne metody podawania są korzystne również z tego względu, że w metaboliźnie leku w organizmie, pozwalają na ominięcie pierwszego przejścia przez wątrobę. Jednakże, podanie parenteralne związku ważnego leczniczo może powodować ból, podrażnienie, możliwość uszkodzenia tkanki przy długotrwałym podawaniu i niesie ryzyko infekcji. Parenteralne drogi podawania są poza tym kłopotliwe w stosowaniu, zwłaszcza te, których wykonywanie jest ograniczone do wyszkolonego personelu (np. iniekcje dożylne).

Metody dojelitowe są bardziej dogodne w stosowaniu niż metody parenteralne, na ogół są bardziej ekonomiczne i łatwiej akceptowane przez pacjentów. Jednakże związki ważne leczniczo podane doustnie mogą być słabo, niewydajnie absorbowane i czas upływający od pobrania do absorpcji może zniweczyć skuteczność jego użycia w sytuacjach wymagających szybkiego ratunku. Ponadto, wielu związków ważnych leczniczo nie można podawać doustnie, gdyż są rozkładane przez enzymy trawienne, kwasy i lipidy aktywne powierzchniowo w przewodzie pokarmowym przed tym, nim dotrą do miejsca swego działania. Inne związki ważne leczniczo podlegają wyczerpującemu metabolizmowi pierwszego przejścia przez wątrobę, co sprawia, że są nieskuteczne przy podawaniu doustnym.

Od dawna prowadzone są badania nad nie-parenteralnymi metodami podawania, które omijałyby problemy wiązane z nietrwałością preparatów leczniczych w przewodzie pokarmowym i w procesie pierwszego przejścia przez wątrobę. Podawanie transdermalne, doustne, przez błony śluzowe, doodbytnicze i donosowe, są to możliwości szeroko już przebadane. Do takich rozwiązań alternatywnych należy również podawanie związków ważnych leczniczo doustnie, ale zakapsułkowanych w ochronnym układzie dostarczania, zaprojektowanym tak, aby wytłoczyć zawartość związku ważnego leczniczo w określonym miejscu niższych partii przewodu pokarmowego. Wydajność tych alternatywnych dróg dostarczania leku jest jednak często ograniczona przez słabą absorpcję związków ważnych leczniczo w miejscu dostarczenia lub aplikacji. Efektywne strategie zwiększania absorpcji związków ważnych leczniczo przez błony komórkowe powinny zwiększyć skuteczność wielu znanych leków, które są słabo absorbowane niezależnie od metody ich podania. Takie strategie, zmierzające w kierunku zwiększenia absorpcji trans-błonowej powinny być szczególnie użyteczne dla tych związków ważnych leczniczo, które podaje się przez skórę i błony śluzowe, w tym przez tkankę śluzówki układu trawiennego, moczowo-płciowego i oddechowego.

Podstawową jednostką strukturalną błon biologicznych jest dwuwarstwowa fosfolipidowa, w której znajdują się białka o różnej wielkości i o różnym składzie. Powierzchnie tej dwuwarstwy fosfolipidowej od strony wodnego środowiska komórkowego składają się z hydrofilowych główek fosfolipidowych; wnętrze jest złożone z hydrofobowych ogonów reszt acylowych kwasów tłuszczowych. Białka błonowe mogą być zangażowane w procesy transportu, jak również, mogą służyć jako receptory w komórkowych mechanizmach regulacyjnych.

Do naturalnych mechanizmów przechodzenia przez błony biologiczne należą: dyfuzja bierna, dyfuzja ułatwiona, transport aktywny oraz endocytoza i pinocytoza, w których pośredniczą receptory. Dyfuzja bierna jest procesem przebiegającym najlepiej w przypadku małych cząsteczek rozpuszczalnych w tłuszczach. Jednakże błony biologiczne są zasadniczo nieprzepu171131 szczalne dla większości cząsteczek rozpuszczalnych w wodzie, takich jak nukleozydy, aminokwasy, białka i inne cząsteczki hydrofilowe ważne leczniczo. Cząsteczki te wchodzą do komórek dzięki pewnemu systemowi transportu, w którym pośredniczy nośnik, co oznacza, że określone, specyficzne cząsteczki ułatwiają przejście przez błonę. Jednakże, nośniki naturalne, ułatwiające przejście przez błonę mają ograniczone zastosowanie, ponieważ nośniki te rozpoznają jedynie substraty o określonej konfiguracji cząsteczki. Wiele związków ważnych leczniczo nie absorbuje się wystarczająco wydajnie, gdyż albo nie są one wystarczająco lipofilowe, aby przejść przez błonę komórkową drogą dyfuzji biernej ani nie są rozpoznawane przez naturalne systemy transportu.

Strategie zwiększania wychwytu związków ważnych leczniczo przez błony biologiczne były opracowywane poprzednio. Dzielą się one na dwie szerokie kategorie. Do pierwszej kategorii należą wszystkie strategie, w których zmienia się strukturę związku ważnego leczniczo albo przez zmianę lipofilności samego związku albo przez koniugowanie tego związku z innymi jednostkami chemicznymi, o których wiadomo, że wchodzą w reakcję z błonami fosfolipidowymi. Podstawowym celem w tych strategiach jest zwiększenie absorpcji biernej przez błonę na drodze obniżenia bariery energetycznej procesu dyfuzji i/lub przez zwiększenie miejscowego stężenia tego związku na powierzchni błony. Do pierwszej kategorii zalicza się również strategie polegające na koniugowaniu związków ważnych leczniczo z jednostkami wchodzącymi w reakcję z układem transportującym znajdującym się w tych błonach biologicznych. Celem takich strategii jest wykorzystanie tego układu (na drodze aktywnego bądź ułatwionego transportu albo endocytozy zachodzącej za pośrednictwem receptora) do zwiększenia transportu związku przez błonę.

Prowadzono wiele badań nad wykonalnością projektów zakładających zwiększenie skuteczności związków hydrofilowych przez koniugowanie tych związków z jednostkami, o których było wiadomo, że wchodzą w reakcje z błonami fosfolipidowymi. Spośród technik opisanych w literaturze można wymienić technikę polegającą na zastosowaniu koniugatów oligonukleotyd - cholesterol, opisaną przez Letsingera R.L. i wsp. [Cholesteryl - conjugated oligonucleotides: Synthesis, properties and activity as inhibitors of replication of human immunodeficiency virus in cell culture, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:6553-6556 (wrzesień 1989)] i przez Steina C.A. i wsp. (Mode of Action of 5’-Linked Cholesteryl Phosphorothioate Oligodeoxynucleotides in Inhibiting Syncytia Formation and Infection by HIV-1 and HIV-2 in Vitro, Biochemistry, 30: 2439-2444, 1991).

Kierowanie cząsteczek do mózgu wymaga przekroczenia bariery krew-mózg, układu kapilarnego o unikalnych cechach morfologicznych, działającego w całym układzie podobnie jak błona komórkowa, oddzielającego przestrzeń śródmiąższową mózgu od krwi. Tak jak błony biologiczne, bariera krew-mózg jest stosunkowo nieprzepuszczalna dla wielu hydrofilowych związków ważnych leczniczo. Spośród opracowywanych strategii kierowania związków do mózgu można wymienić dostarczanie bezpośrednie metodami inwazyjnymi, przez infuzję dotętniczą hipertonicznych roztworów substancji i przez konwersję związków hydrofilowych do związków rozpuszczalnych w lipidach. Ostatnie prace w kierunku ułatwienia transportu, takie jak ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4 902 505, polegają na sprzęganiu żądanego peptydu hydrofilowego z nośnikiem peptydowym wykazującym zdolność przechodzenia przez barierę w wyniku transcytozy za pośrednictwem receptora.

Do drugiej kategorii strategii zwiększania poboru związków ważnych leczniczo należą te, w których te związki ważne leczniczo kieruje się do specyficznych powierzchni w postaci mieszanek w innymi cząsteczkami zwiększającymi przepuszczalność błon. Jako przykład, można podać prace polegające na mieszaniu insuliny z adiuwantami, takimi jak sole kwasów żółciowych, co mogłoby zwiększyć nosową absorpcję insuliny (Hirai i wsp., Int. J. Pharmaceutics 9: 165-184, 1981: Hirai i wsp., Diabetes, 27: 296-299, 1978: opis patentowy Wielkiej Brytanii nr 1 527 506: opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4 153 689 oraz Pontiroli i wsp., Br.Med.J. 284: 303-386, 1982). W opisie patentowym Europejskim EP 0 444 778 ujawnione jest zastosowanie alkilosacharydów do zwiększenia przenikania leków podawanych miejscowo przez pokryte błoną śluzową tkanki nabłonka, a zwłaszcza nabłonka rogówki. Cheng i wsp. w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 865 848 wydanym 12 września 1989 ujawnia zastosowanie estrów sacharozy, zwłaszcza monolaurynianu sacharozy do zwiększenia przepływu przez skórę leków transdermalnych. Carey i wsp. w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 746 508 wydanym 24 maja 1988 donoszą o zastosowaniu kwasu fusydynowego i pochodnych cefalosporyny do zwiększania przepuszczalności dla leków ludzkich i zwierzęcych powierzchni ciała.

Wiadomo, że glikozylowane pochodne steroidowe wchodzą w reakcje z błonami fosfolipidowymi, dzięki czemu zwiększają przenikanie związków ważnych leczniczo przez te błony, w tym przez błony biologiczne. Podobnie jak poprzednio stosowane adiuwanty i wzmacniacze (np. pochodne kwasu cholowego i fusydynowego), nowe pochodne wytworzone sposobem według wynalazku są amfifilowe na powierzchni czołowej. Jednak nowe pochodne steroidowe posiadają znacząco odmienne struktury, ponieważ są zglikozylowane na ich powierzchniach hydrofitowych: jest to cecha, której nie posiadają żadne znane dotychczas czołowo amfifilowe steroidy. Stwierdzono, że glikozylacja na powierzchniach hydrofilowych znacznie zmienia zarówno właściwości rozpuszczalności tych steroidów jak i sposób, w jaki ulegają one asocjacji. Ponadto wykazano, że wiele tych glikozylowanych steroidów jest bardziej efektywnych pod względem zwiększania przepuszczalności zarówno błon sztucznych jak i biologicznych niż wyjściowe steroidy niezglikozylowane. Te nowe glikozylowane pochodne steroidowe mogą zatem być stosowane do ułatwienia przechodzenia związków ważnych leczniczo przez błony komórkowe albo w mieszaninie z tymi związkami albo jako koniugaty tych związków.

Przed dokonaniem niniejszego wynalazku nie znano sposobu syntetyzowania tych wszystkich glikozylowanych pochodnych steroidowych. Opisanych jest wiele reakcji glikozylacji z użyciem tioglikozydów (Ferrier R.J. i wsp.: A Potentially Versatile Synthesis of Glycosides Carbohydrate Research 27: 55-61,1973; Garegg P.J. i wsp.: A reinvestigation of glycosidation reactions using 1-thioglycosides, as glycosyl donors and thiophilic cations as promoters, Carbohydrate Research 116; 162-5, 1983; Nicolaou K.C. i wsp.: A Mild and General Method for the Synthesis of O-Glycosides, J. Am. Chem. Soc. 105:2430-2434, 1983: Lonn H., Synthesis of a tri- and hepta-saccharide which contain α-L-fucopyranosyl groups and are part of the complex type of carbohydrate moiety of glycoproteins, Carbohydrate Research 139: 105-113,1985: Andersson F. i wsp.: Synthesis of 1,2-cis-linked glycosides using dimethyl(methylthio)sulfonium triflate as promoter and thioglycosides as glycosyl donors, Tetrahedron Letters, str. 3919-3922, 1986: Brown D.S. i wsp.: Preparation of cyclic ether acetals from 2-benzenesulphonyl derivatives: a new mild glycosidation procedure, Tetrahedron Letters 29/38: 4873-4876, 1988: Ito Y. i wsp.: Benzeneselenenyl triflate as a promotor of thioglycosides: a new method for O-glycosidation using thioglycosides Tetrahedron Letters, str. 1061-4, 1988: Dasgupta F. i wsp.: Alkyl sulfonyl triflate as activator in the thioglycoside-mediated formation of β-glycosidic lonkages during ologosaccharide synthesis Carbohydrate Research 177: c13-c17, 1988). Jednakże, w żadnym z tych opisanych sposobów nie wspomina się o stosowaniu glikozylosulfotlenku jako środka glikozylującego.

Zastosowanie aktywowanego glikozylosulfotlenku jako półproduktu w procesie glikozylacji steroidów zostało opisane (J. Am. Chem. Soc. 111: 6881-2, 1989) i zawartość tej publikacji jest włączona do niniejszego opisu jako stan techniki. Jednakże, w opisanym sposobie podane są jedynie wstępne wyniki badań nad glikozylacją steroidów o wzorze (I). Dalsze badania eksperymentalne nad tą serią związków ujawniły, że dla uzyskania wydajnej, stereoselektywnej syntezy glikozylowanych związków o wzorze I, niezbędne są unikalne warunki reakcji. Rozpuszczalnik użyty do reakcji pełni kluczową rolę w stereoselektywności glikozylacji. Stosowanie niepolarnego rozpuszczalnika aprotycznego zwiększa selektywność powstawania wiązania glikozydowego (α) podczas gdy użycie polarnego rozpuszczalnika aprotycznego, takiego jak propionitryl zwiększa selektywność powstawania wiązania glikozydowego (β). Typ sulfotlenku użytego do reakcji glikozylacji ma również wpływ na powstawanie produktów reakcji. Przykładowo, w nowym sposobie ujawnionym w niniejszym opisie istotną sprawąjest użycie para-metoksyfenylo-sulfotlenku jako grupy łatwo odszczepialnej, dzięki której powstaje selektywnie i z dużą wydajnością wiązanie glikozydowe beta (β). Wydajność reakcji glikozylacji w kierunku powstawania wiązań glikozydowych alfa (α) lub beta (β) również można zwiększyć przez użycie poniżej jednego równoważnika bezwodnika trójfluorometanosulfonowego.

W końcu, grupy ochronne w donorze grupy glikozylowej mają również znaczenie w stereochemicznym przebiegu tej reakcji glikozylacji. Jeśli jako grupę ochronną w donorze grupy glikozydowej stosuje się resztę kwasu trójmetylooctowego to w procesie glikozylacji powstają tylko wiązania glikozydowe beta (β), niezależnie od tego, czy do reakcji zastosowano aprotyczny rozpuszczalnik niepolarny, czy też aprotyczny rozpuszczalnik polarny. Powyższe czynniki razem wzięte wskazują, że wynalazek nie może być praktycznie stosowany bez przeprowadzenia dalszych szczegółowych doświadczeń.

Wynalazek dotyczy nowych, czołowo amfifilowych glikozylowanych pochodnych steroidowych, które okazały się rozpuszczalne zarówno w środowisku wodnym jak w środowisku błono-podobnym. Ta unikalna rozpuszczalność umożliwia tym glikozylowanym pochodnym steroidowym ułatwienie transportu innych cząsteczek przez błony biologiczne i przez barierę krew-mózg. Tak więc, te glikozylowane pochodne steroidowe mogą być stosowane albo w mieszance z cząsteczką ważną leczniczo lub mogą być z nimi skoniugowane, wzmagając dostarczanie tych cząsteczek przez ułatwianie przechodzenia przez powierzchnie ciała, których nieograniczającymi przykładami są powierzchnie błon policzkowych, podjęzykowych, spojówkowych, odbytniczych, przewodu pokarmowego, jelit, macicy, szyjki macicy, pochwy lub nabłonka okrężnicy, nosogardzieli, kanału ucha, układu oddechowego, moczowodu, pęcherza moczowego i błony bębenkowej. Alternatywnie, dla jeszcze większego ułatwienia transportu trans-powierzchniowego i trans-błonowego, te nowe glikozylowane pochodne steroidowe można podawać w postaci koniugatu: glikozylowana pochodna steroidowa/cząsteczka ważna leczniczo (zwanym w dalszej części opisu koniugatem pochodna-lek).

Uważa się też, że te nowe glikozylowane pochodne steroidowe można będzie stosować do systemów dostarczania środków przeciwwirusowych, systemicznych środków owadobójczych i herbicydów, opartych na zasadzie przechodzenia przez powierzchnie roślin oraz do systemów dostarczania kontaktowych środków owadobójczych i roztoczobójczych przez powierzchnie ciała stawonogów.

Sposobem według wynalazku wytwarza się pochodne steroidowe o ogólnym wzorze (I)

gdzie A oznacza O, OH, OR6, NR⁷r8, N₃, NHCOR7, OCOAr, OCOOR9, OCOR9, NCH2C6H5;

Ar oznacza fenyl lub fenyl podstawiony jedną do trzech grup oznaczających chlorowiec, grupę alkilową C1-C12 lub alkoksylową C1-C3;

a oznacza pojedyncze wiązanie w konfiguracji alfa lub beta, przy czym jeśli A oznacza O to a oznacza wiązanie podwójne;

Ri oznacza H w położeniu cis lub trans w stosunku do R²; r2 oznacza CH3; r3 oznacza H, OH lub OR⁶;

R⁴ oznacza H, OH lub OR6;

r5 oznacza CO2Ri°, CH₃Or9, CONH2, CONHR7, CONR7r8, C(O)SR^K), CH2S(O)p-S-R^w, CH2NH2, CH2NHR7, CH2Nr7r8, CH2-S(O)p-S-Ri0

R⁶ oznacza monosacharyd, gdzie wiązanie glikozydowe przy anomerycznym atomie węgla w tym monosacharydzie jest alfa lub beta albo oligosacharyd złożony z 2 do I0 monosachary8 dów, gdzie wiązanie glikozydowe przy jakimkolwiek anomerycznym atomie węgla w każdej reszcie monosacharydowej tego oligosacharydu jest alfa lub beta;

R⁷ i R⁸ oznaczają niezależnie H, grupę CrCą-alkilową, C3-C7-cykloalkilową, C4-C1o-alkilocykloalkilową, fenylową, benzylową albo łącznie tworzą grupę (CH2)f, gdzie f oznacza liczbę 3 do 6;

R⁹ oznacza H lub grupę Cp-C3alkilową;

R10 oznacza H, grupę CrCm-alkilową, C1-Cu)-alkenylową, CrCio-alkinylową, C6H5 albo CH2C6H5;

monosacharyd oznacza chronioną lub niechronioną heksozę lub dezoksyheksozę wybraną spośród związków takich jak D- lub L-alloza, D- lub L-altroza, D- lub L-glukoza, D- lub L-mannoza, D- lub L-guloza, D- lub L-idoza, D- lub L-galaktoza i D- lub L-taloza albo chronioną lub niechronioną furanozę albo dezoksyfuranozę wybraną spośród związków takich jak D- lub L-ryboza, D- lub L-arabinoza, D- lub L-ksyloza i D- lub L-liksoza, przy czym grupy ochronne przy grupach hydroksylowych znajdujących się w tych heksoacch fob furnnoacch są wybrane z grup takich jak grupa benzylowa, trójmetylnnctnwa, trójmetylnsililnwa, teut-butylodimetylokililowa, teut-bftylodifenylnsililowa, trójizopropylosililowa, acetylową, tetuahyduopiuany-owa, benzoi^wa, Cl-C3-alkilnwa, iznprnpylidennwr, yenoylidenowa, (2-metoekyetneky)metylowa, para-metoksy benzylowa i allilowa; p oznacza liczbę 0, 1 lub 2; n oznacza liczbę 0, 1 lub 2;

lub dopuszczalne farmaceutycznie sole tych związków.

Sposób wytwarzania związków o wzorze (I) według wynalazku polega na tym, że (a) zabezpieczony glikozyd, w którym atomy tlenu we wszystkich pozycjach cukru za wyjątkiem pozycji anomerycznej są zabezpieczone takimi samymi lub różnymi grupami wybranymi z grupy obejmującej estry i etery, takie jak alkilowe, sililnwe, fenylowe lub benzylowe poddaje się reakcji ze (b) związkiem S-R, w warunkach standardowych, w którym to związku R oznacza C1-Cioalkil, pirydyl, furyl, tienyl, fenyl podstawiony 1-3 grupami wybranymi z grupy obejmującej chlorowiec, C1-C3alkil, NO2, C1-C3alkoksyl, z wytworzeniem zabezpieczonego tiogliknzydu, który następnie poddaje się reakcji z (c) kwasem meta-chlnrnnadbenonesnwym z wytworzeniem odpowiedniej pochodnej sulfotlenkowej, i (d) przeprowadza się ją w pośredni, aktywowany środek glikozylujący stosując związek zawierający trójflunrnmetanosulfonian, taki jak bezwodnik trójfluouometannsulfnnowy, trójfluounmntannsulfonian metylowy lub trójflunrnmetanokulfonian tuójmetylnsililnwy w temperaturze -78°C i kontaktuje się ten aktywowany środek glikozylujący z (e) steroidem, w którym wszystkie atomy tlenu, które nie mają być glikooylnwane są zabezpieczone w znany sposób wobec 2,6-dwu-Π-rzęd.yutylo-4-metylopiuydyny w toluenie, w celu utworzenia wiązań glikozylnwych α, α albo wobec nitrylu kwasu propionowego w celu utworzenia wiązań β, β, który następnie (f) odbezpiecza się standardowymi procedurami z wytworzeniem glukooylnwanycC steroidów o wzorze (I).

Reakcję zabezpieczonego glikozydu ze związkiem S-R prowadzi się w obecności rozpuszczalnika, przy czym jako rozpuszczalnik stosuje się niepolarny rozpuszczalnik aprotyczny, albo polarny rozpuszczalnik aprotyczny.

Korzystnie jako rozpuszczalnik stosuje się paua-metoksyfenylnsulfntlenek.

Bezwodnik trójfluorometanosulfonowy stosuje się w ilości mniejszej niż jeden równoważnik.

W sposobie według wynalazku stosuje się zabezpieczony glikozyd zawierający Ceksnoę lub deznkkyCeksooę wybraną z grupy zasadniczo obejmującej D-allozę, D-altrozę, D-glukozę, D-idozę, D-galaktozę lub D-talozę.

W sposobie tym stosuje się zabezpieczony glikozyd zawierający furanozę lub dezoksyfuranozę wybraną z grupy zasadniczo obejmującej D-rybozę, D-arabinozę, D-ksylozę lub D-liksozę.

Korzystnie stosuje się zabezpieczony glikozyd, w którym grupy zabezpieczające są takie same lub różne, wybrane z grupy obejmującej estry alkilowe, estry sililowe, etery alkilowe, etery sililowe, etery fenylowe lub etery benzylowe.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się zabezpieczony glikozyd, w którym grupy zabezpieczające są takie same lub różne, wybrane z grupy obejmującej benzyl, trójmetyloacetyl, trójmetylosilil, III-rzęd.butylodwumetylosilil, III-rzęd.butylodimetylosilil, trójizopropylosilil, acetyl, tetrahydropiranyl, benzoil, C]-C3alkil, izopropyliden, benzyliden, (2-metoksyetoksy)metyl, orto-ester, para-metoksybenzyl lub allil.

Szczególnie korzystnie, jako grupę zabezpieczającą w donorze grupy glikozylowej stosuje się trójmetyloacetyl.

Jednakże, jeśli jako grupę ochronną stosuje się ester trójmetylooctowy, to utworzone wiązanie glikozydowe będzie się znajdować w konfiguracji beta, beta, niezależnie od rozpuszczalnika użytego w reakcji. Strukturę związków wytworzonych sposobem według wynalazku oznacza się metodami protonowego NMR, Cⁿ-NMR, spektroskopii masowej o dużej rozdzielczości, krystalografii rentgenowskiej i chromatografii cienkowarstwowej.

Ważne znaczenie mają również koniugaty związku ważnego leczniczo ze związkiem o wzorze (I), które przyłączone są poprzez R⁵, przy czym nieograniczającymi przykładami związków ważnych leczniczo występujących w tych koniugatach są środki przeciwbakteryjne, takie jak antybiotyki polienowe (np. erytromycyna), antybiotyki beta-laktamowe lub antybiotyki o budowie peptydowej albo steroidowej; środki przeciwgrzybicze takie jak kwas 10-tiastearynowy i 24-tiacholestanol; peptydy lub białka, takie jak czynniki regulacyjne, enzymy, przeciwciała, hormony i toksyny; nukleotydy, nukleozydy i kwasy nukleinowe oraz sacharydy; w reszcie steroidowej związków o wzorze (I) pierścienie A i B mogą się znajdować w stosunku do siebie w położeniu cis lub trans; wiązania O-glikozydowe przy C-7 i C-12 mogą niezależnie od siebie znajdować się w konfiguracji alfa lub beta.

Nowe związki znajdują zastosowanie do sporządzania środków farmaceutycznych zawierających (1) skuteczną ilość związku o wzorze (I) oraz odpowiedni nośnik farmaceutyczny; (2) skuteczną ilość związku o wzorze (I), skuteczną ilość związku ważnego leczniczo i odpowiedni nośnik farmaceutyczny; (3) skuteczną ilość koniugatu: pochodna/lek oraz odpowiedni nośnik farmaceutyczny; albo (4) skuteczną ilość związku o wzorze (I), skuteczną ilość koniugatu: pochodna/lek oraz odpowiedni nośnik farmaceutyczny.

Korzystnymi, ze względu na zdolność zwiększania przepuszczalności błon biologicznych są związki o wzorze (I), w którym:

A oznacza OH, OCOOR? OCOC6H5, OCOC6H5-pOMe, NH2; a oznacza wiązanie pojedyncze; r3 oznacza OR⁶;

R⁴ oznacza OR6;

R5 oznacza CO2R¹⁰ i CONR7R⁸;

R⁶ oznacza monosacharyd, gdzie wiązanie glikozydowe przy anomerycznym atomie węgla w tym monosacharydzie jest w położeniu alfa lub beta;

R*0 oznacza H lub grupę C-Cio-alkilową;

monosacharyd oznacza chronioną lub niechronioną heksozę, taką jak D- lub L-glukoza, gdzie jako grupy ochronne występują grupa benzylowa lub trójmetylooctanowa.

Związkami korzystnymi ze względu na zdolność zwiększania przepuszczalności błon biologicznych są:

(a) ester metylowy kwasu 3a-O-benzoilo-trans-5,10-bis-e,p-7,12-glukozylo-cholowego;

(b) kwas 3 a-hydroksy-cis-5,10-bis-a ,a-7,12-glukozylo-cholowy;

(c) ester metylowy kwasu 3 α-hydroksy-cis-5,10-bis-a ,a-7,12-glukozylo-cholowego;

(d) kwas 3 a-hydroksy-cis-5,10-bis-a ,a-7,12-glukozylo-25-tryptofanylo-cholowy;

(e) ester metylowy kwasu 3 a-etylowęglano-cis-5,10-bis-a ,a-7,12-glukozylo-cholowego;

(f) ester metylowy kwasu 3 a-O-benzoilo-cis-5,10-bis-a ,a-7,12-glukozylo-cholowego;

(g) ester metylowy kwasu 3a-O-p-metoksybenzoilo-cis-5,10-bis-a,a-7,12-glukozylocholowego;

(h) ester metylowy kwasu 3 a-O-benzoilo-cis-5,10-bis-e, β-742-glukozylo-cholowego;

(i) kwas 3 α-hydroksy-eis-5,10-bis-3,3-7,12-glukozylo-cholowy;

(j) ester metylowy kwasu 3 a-O-benzoilo-trans-5,10-bis-a ,a-7,12-glukozylo-cholowego;

(k) kwas 3 a-hydroksy-trans-5,10-bis-e,P-7,12-glukozylo-cholowy.

Szczególnie korzystny jest związek (g), ester metylowy kwasu 3 a-O-p-metoksybenzoilocis-5,10-bis-a,a-7,12-glukozylo-cholowego; i jego forma kwasowa, czyli kwas 3a-O-pmetoksybenzoilo-cis-5,10-bis-a ,a-7,12-glukozylo-cholowy.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na rysunku, na którym na fig. 1 podano wykres przedstawiający działanie CMe, nowej glikozylowanej pochodnej steroidowej otrzymanej sposobem według wynalazku, zwiększające skuteczność kwasu tiastearynowego, środka przeciwgrzybiczego;

na fig. 2 podany jest wykres przedstawiający działanie CME, nowej glikozylowanej pochodnej steroidowej, zwiększające skuteczność tiacholestanolu, środka przeciwgrzybiczego;

na fig. 3 podany jest wykres przedstawiający brak wzmacniającego wpływu CDE, niezglikozylowanej wersji związku CME na skuteczność tiacholestanolu, środka przeciwgrzybiczego.

Przeprowadzenie cząsteczek o znaczeniu diagnostycznym, profilaktycznym lub terapeutycznym przez powierzchnie ciała i/lub do komórek wymaga pokonania poprzecznych przegród w postaci jednej lub większej ilości pół-przepuszczalnych błon biologicznych. Związki według wynalazku są użyteczne jako środki zwiększające przepuszczalność błon biologicznych, dzięki czemu ułatwiają przejście związków ważnych leczniczo przez powierzchnie ciała i/lub błony. W jednym rozwiązaniu wynalazku, związek ważny leczniczo podaje się w formie mieszaniny z glikozylowaną pochodną steroidową według wynalazku. W następnym rozwiązaniu, transport przez powierzchnie i/lub przez błony ułatwia się przez podanie związku ważnego leczniczo w formie koniugatu: pochodna/związek, w którym żądany związek jest sprzężony ze zglikozylowanym steroidem, to znaczy takim, w którym podstawnik R⁵ jest połączony ze związkiem ważnym leczniczo. Alternatywnie, taki koniugat: pochodna/związek może być podany w mieszaninie z nową glikozylowaną pochodną steroidową według wynalazku, która to pochodna może być taka sama lub inna niż pochodna występująca w koniugacie.

Można oczekiwać, że te nowe glikozylowane pochodne steroidowe otrzymane sposobem według wynalazku będą zwiększać skuteczność leczniczą wielu różnych związków. Można zatem uznać, że związki te znajdą wiele zastosowań leczniczych. Środki lecznicze przechodzące przez błony powinny być stosowane w leczeniu wielu różnych chorób, takich jak AIDS i inne przewlekłe infekcje wirusowe, nowotwory, infekcje bakteryjne i grzybicze oraz choroby metaboliczne, takie jak toczeń, cukrzyca i reumatoidalne zapalenie stawów.

Sądzi się, że zdolność nowych glikozylowanych pochodnych steroidowych otrzymanych sposobem według wynalazku, do wchodzenia w reakcje i/lub zwiększania przepuszczalności błon biologicznych wynika z czołowej amfifilowości tych związków. Glikozylowana powierzchnia tych pochodnych jest hydrofilowa; nie-glikozylowana powierzchnia jest natomiast hydrofobowa. Taka czołowo amfifilowa struktura nadaje cząsteczkom niezwykłe właściwości, zwłaszcza zdolność do samo-asocjacji zarówno w środowisku hydrofobowym jak i hydrofilowym i do organizowania się na amfifilowej powierzchni międzyfazowej. Obecnie okazało się, że niektóre glikozylowane pochodne steroidowe otrzymane sposobem według wynalazku krystalizują w warstwach, na przemian w warstwie hydrofobowej i hydrofilowej. Nie-zglikozylowane steroidowe związki macierzyste, aczkolwiek posiadają w pewnym stopniu amfifilowość to jednak nie krystalizują w sposób uporządkowany, w kolejnych warstwach, jak steroidy zglikozylowane. Poza tym, rozpuszczalność tych glikozylowanych pochodnych steroidowych znacznie się różni od rozpuszczalności odpowiednich związków macierzystych. Te nowe glikozylowane pochodne steroidowe, pomimo tego, że są bardziej niż związki macierzyste rozpuszczalne w środowisku wodnym, nie są znacząco słabiej rozpuszczalne w środowisku organicznym. W oparciu o te obserwacje, uważa się, że te nowe glikozylowane pochodne steroidowe zwiększają przepuszczalność błon przez samo-asocjację, tworząc małe, odwrotne micele, z powierzchniami hydrofobowymi wystawionymi w kierunku lipidów znajdujących się w tych błonach. Takie odwrotne micele mogą działać jak napełnione wodą pory, co pozwala na przechodzenie związków ważnych leczniczo albo, obecność takich odwrotnych miceli w błonie może zaburzać strukturę błony.

Ponadto, związki wytworzone sposobem według wynalazku ułatwiają transport protonów lub innych jonów, takich jak Ca⁺², Na+ lub K+ przez błony biologiczne, co wskazuje na ich zastosowanie jako potencjalnych środków przeciwgrzybiczych lub antybiotyków.

Koniugat: pochodna glikozylowana/lek może być stosowany in vivo, jako składnik kompozycji farmaceutycznej, w sposób podobny do znanych środków leczniczych. Podanie takiego koniugatu: pochodna/lek osobnikowi z przewlekłą infekcją wirusową może inaktywować wirusa albo koniugat ten może zawierać antysensowną sekwencję oligonukleotydową będącą inhibitorem dla genu wirusowego lub hamującą aktywność onkogenu. Dla osób z defektem genetycznym, związkiem ważnym lecznięzo może być uzupełniające białko, które nie jest wytwarzane w organizmie lub białko z defektem.

Koniugat: pochodna/lek można podawać w postaci środka farmaceutycznego wieloma drogami obejmującymi drogę podskórną, dożylną, domięśniową, domostkową, donosową i injekcję lub infuzje doczaszkowe. Taki środek farmaceutyczny można podawać również miejscowo albo przez inhalacje.

Nowe związki o wzorze (I) i koniugaty: pochodna glikozylowana/lek, można zwłaszcza stosować do leczenia przewlekłych infekcji wirusowych takich jak AIDS (Zespół nabytego braku odporności) lub herpes simplex; chorób autoimmunologicznych, takich jak toczeń, reumatoidalne zapalenie stawów, cukrzyca, zwłóknienie torbielowate, niedobory hormonu wzrostu i nowotwory w dowolny sposób, który zapewnia kontakt środków aktywnych z odpowiednim miejscem działania w organizmie zwierzęcia. Można je podawać w dowolny dogodny sposób możliwy do stosowania jako farmaceutyk, albo jako pojedyncze środki lecznicze względnie w połączeniu z kilkoma środkami leczniczymi. Możnaje podawać jako takie, ale zasadniczo podaje się je z nośnikiem farmaceutycznym, dobranym stosownie do drogi podania i na podstawie standardowej praktyki farmaceutycznej.

Podawana dawka będzie oczywiście zmienna i zależna od znanych czynników, takich jak właściwości farmakodynamiczne konkretnego środka, sposób i droga podania, wiek, stan zdrowia i waga osoby przyjmującej, rodzaj i ciężkość objawów, rodzaj konkurencyjnego leczenia, częstość podawania leku i pożądany efekt. Na ogół, dawka dzienna związku ważnego leczniczo będzie wynosić od około 0,1 mg do 100 mg/kg wagi ciała. Zazwyczaj, dla uzyskania pożądanych wyników będzie się stosować od 0,5 mg do 50 mg, a korzystnie od 1 mg do 10 mg/kg wagi ciałą/dzień w dawkach podzielonych, ordynowanych od 1 do 6 razy dziennie albo w postaci o przedłużonym uwalnianiu.

Formy dawkowania (kompozycje) odpowiednie do podawania wewnętrznego zawierają od około 1 mg do koło 500 mg związku ważnego leczniczo na jednostkę. W tych kompozycjach farmaceutycznych związek ważny leczniczo będzie na ogół występował w ilości od około 0,5% do 95% w przeliczeniu na całkowitą wagę kompozycji.

Kompozycje te można podawać doustnie w postaci stałych form dawkowania, takich jak kapsułki, tabletki i proszki albo w ciekłych formach dawkowania, takich jak eliksiry, syropy i zawiesiny. Można je również podawać parenteralnie, w postaci sterylnych ciekłych form dawkowania, przez inhalację, w postaci spray'u donosowego lub inhalacji do płuc lub też miejscowo w postaci maści, kremów lub płynów.

Kapsułki żelatynowe mogą dodatkowo zawierać nośniki sproszkowane, takie jak laktoza, sacharoza, mannitol, skrobia, pochodne celulozy, stearynian magnezowy, kwas stearynowy i substancje podobne. Podobne rozcieńczalniki można stosować przy wytwarzaniu tabletek prasowanych. Zarówno tabletki jak i kapsułki można wytwarzać w formach o przedłużonym uwalnianiu, uzyskując ciągłe uwalnianie związku ważnego leczniczo w czasie wielu godzin. Tabletki prasowane można powlekać powłoczką cukrową lub bezcukrową w celu zamaskowania nieprzyjemnego smaku i ochrony tej tabletki przed wpływami atmosferycznymi albo powłoczką jelitową dla zapewnienia selektywnego rozpadu w przewodzie pokarmowym.

Ciekłe formy dawkowania do stosowania doustnego mogą zawierać środki barwiące i zapachowe zwiększające komfort dla pacjenta.

W zasadzie, nośnikami odpowiednimi dla roztworów parenteralnych są takie nośniki jak woda, odpowiedni olej, sól fizjologiczna, wodny roztwór glukozy i roztwory pokrewnych cukrów, a także glikole, takie jak glikol propylenowy lub glikole polietylenowe. Roztwory parenteralne mogą doatkowo zawierać środki stabilizujące i o ile to potrzebne, substancje buforowe. Odpowiednimi środkami stabilizującymi są tu antyutleniacze, takie jak kwaśny siarczyn sodu, siarczyn sodu lub kwas askorbinowy, pojedynczo lub w mieszaninie tych substancji. Stosuje się również kwas cytrynowy i jego sole i sól sodową EDTA. Roztwory parenteralne powinny ponadto zawierać środki konserwujące, takie jak chlorek benzalkoniowy, metyloparaben lub propyloparaben i chlorobutanol).

SYNTEZA

Związki o wzorze (I) można wytwarzać sposobem przedstawionym na schemacie I.

.m-CPBA

SCHEMAT I

RO —.

RO

RO A-— RO

MUC

Chroniony tioglikozyd utlenia się kwasem m-chloronadbenzoesowym w warunkach standardowych uzyskując odpowiedni sulfotlenek. Do roztworu chronionego glikozylosulfotlenku w toluenie w temperaturze -78°C dodaje się bezwodnik kwasu trójfluorometanosulfonowego (Aldrich) i następnie substancję wychwytującą kwas, taką jak 2,6-di-tert-butylo-4-metylopirydynę (Aldrich Chemical Co.) w toluenie oraz nukleofil rozpuszczony w toluenie, w tempreaturze -78°C. Po mieszaniu w czasie 15-30 minut, mieszaninę reakcyjną wyjmuje się z kąpieli ziębiącej i miesza przez następne 10 minut, po czym wylewa się tę mieszaninę do wodnego roztworu dwuwęglanu sodowego i wyodrębnia się chroniony addukt metodą chromatografii. Po odblokowaniu tego adduktu w standardowych warunkach wytwarza się związki o wzorze (I). Odpowiedni tioglikozyd uzyskuje się przez standardowe zablokowanie wybranego cukru i następne wytworzenie tioglikozydu w sposób opisany powyżej. Bis-glikozylacja tym sposobem pochodnej steroidowej o wzorze (I), w którym R³ i R⁴ oznaczają OH prowadzi do selektywnego wytworzenia wiązań glikozydowych α,α z donorem reszty glikozylowej, za wyjątkiem przypadków, w których jako grupę ochronną stosuje się piwaloil (trójmetyloacetyl), gdzie powstają tylko wiązania glikozydowe β,β, niezależnie od rodzaju rozpuszczalnika użytego do reakcji.

Alternatywnie, chroniony glikozylosulfotlenek, nukleofil i zasadę pirydynową rozpuszcza się w propionitrylu w temperawturze -78°C, po czym dodaje się bezwodnik kwasu trójfluorometanosulfonowego w temperaturze -78°C i izoluje się produkt w sposób opisany powyżej. Tym sposobem, glikozylacja pochodnej steroidowej o wzorze (I), w którym R' i r4 oznaczają OH, prowadzi do selektywnego wytworzenia wiązań glikozydowych β,β z donorem grupy glikozydowej. W celu uzyskania selektywności wiązania β,β w tej glikozylacji, najważniejszą rzeczą jest użycie jako grupy łatwo odszczepialnej p-metoksyfenylosulfotlenku.

Nowe związki i sposób ich wytwarzania są zilustrowane w poniższych przykładach. Wszystkie temperatury są podane w stopniach Celsjusza, a części i procenty odnoszą się do wagi. O ile nie podano inaczej, w przykładach tych wszystkie reakcje prowadzono w atmosferze suchego argonu; określenie: izolacja przez ekstrakcję odnosi się do ekstrakcji typu ciecz-ciecz, mieszaniny zawierającej wodę wskazanym rozpuszczalnikiem, wysuszenia fazy organicznej nad siarczanem sodowym, odfiltrowania i odparowania rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem. Określenie; chromatografia odnosi się do chromatografii kolumnowej śardniociśnirniowej opisanej przez W.C. Still’a i wsp. w J. Org. Chem. 43:2923 (1978).

Przykład I.

Część A: Ester metylowy perbenzylowanego kwasu 3a-etylowęglano-cis-5,10-bis-a,aglukozylocholowego.

Kolbę okrągłodenną o pojemności 100 ml wyposażoną w teflonowe mieszadło prętowe suszy się w płomieniu, po czym oziębia do temperatury -78°C (łaźnia aceton/suchy lód) w atmosferze argonu. Każdy z reagentów, a mianowicie sulfotlenek 2,3,4,6-tetra-O-benzyloglukozy (2.97 g 4,57 milimole, 4.0 równoważniki), C3-etylowęglan kwasu cholowego (0,563 g, 1,14 milimola, 1.0 równoważnik) i 2,6-di-tert-butylo-4-metylopirydynę (0.936 g, 4.57 milimola, 4.0 równoważnika) suszy się oddzielnie przez destylację azeotropową, 3 razy z toluenem (15.0 ml). Do tego glikozylosulfotlenku rozpuszczonego w toluenie (5.0 ml) dodaje się w temperaturze -78°C bezwodnik kwasu trójfluorometanosulfonowego (824 pl, 4,57 milimole, 4.0 równoważniki). Do tej mieszaniny dodaje się zasadę pirydyny w toluenie. Po 5 minutach dodaje się pochodną kwasu cholowego rozpuszczoną w mieszaninie chlorku metylenowego (1.0 ml) i toluenu (5.0 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się w tempreaturze -78°C przez 30 minut, po czym wyjmuje się ją z łaźni z suchym lodem. Po 10 minutach do mieszaniny reakcyjnej dodaje się nasycony roztwór dwuwęglanu sodowego i wyodrębnia się produkt przez ekstrakcję chlorkiem metylenowym i oczyszcza go metodą szybkiej chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym. Uzyskuje się tytułowy związek z wydajnością 60% w postaci oleju. Rf = 0.3 (20% eter w chlorku metylenowym).

CzęśćB: Ester metylowy kwasu 3a-etylowęglano-cis-5,10-bis-a,a-glukozylocholowego.

Do mieszaniny produktu w części A (0,220 g, 0.014 milimola, 1.0 równoważnik) rozpuszczonego w benzenie (4.0 ml) i metanolu (32.0 ml) dodaje się w temperaturze pokojowej wodorotlenek palladu (0.030 g, 15% wagowych). Mieszaninę poddaje się uwodornieniu przy ciśnieniu 3,45 hPa (50 funtów/cal²) w czasie 48 godzin. Produkt filtruje się przez Celit (ziemia okrzemkowa firmy Johns-Manville Corp.) pod azotem. Rozpuszczalnik odparowuje się, a pozostały olej poddaje się chromatografii rzutowej stosując do eluowania 10% metanol w chlorku metylenowym. Dla usunięcia żelu krzemionkowego, który rozpuszcza się w warunkach eluowania, produkt przepuszcza się przez kolumnę LH-20 z odwróconymi fazami stosując metanol jako eluent. Rozpuszczalnik odparowuje się, uzyskując tytułowy związek z wydajnością 65% w postaci proszku o barwie białej. Rf = 0.3 (15% MeOH/CH2Ch); NMR (CDCb 500 MHz) 8: 5.04 (m, Lh, anomeryczny β-H), 4.82 (m, Lh/anomeryczny β-H).

Przykład II. Ester metylowy kwasu 3a-benzoilo-cis-5,10-bis-e,e-glukozylocholowego.

Sulfotlenek 2,3,4,6-tetra-O-benzylo-p-metoksyglukozy (1.012 g, 1.45 milimola, 4.0 równoważniki), ester metylowy kwasu C3-O-benzoilocholowego (0.191 g, 0.364 milimola, 1.0 równoważnik) i 2,6-di-tert-butylo-4-metylopirydynę (0.179 g, 0.874 milimola, 2.4 równoważnika) poddaje się łącznie destylacji azeotropowej trzy razy z toluenu (20 ml). Po usunięciu po raz ostatni toluenu pod zmniejszonym ciśnieniem, mieszaninę rozpuszcza się w świeżo destylowanym propionitrylu i oziębia w atmosferze argonu w łaźni: suchy lód/aceton, w temperaturze -78°C. Następnie dodaje się bezwodnik kwasu trójfluorometanosulfonowego (244 pl, 1.45 milimola, 4.0 równoważniki) i mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze -78°C w czasie 40 minut. Naczynie reakcyjne usuwa się z łaźni z lodem i miesza się przez dodatkowe 10 minut. Następnie mieszaninę wylewa się do nasyconego roztworu dwuwęglanu sodowego i izoluje się produkt przez ekstrakcję chlorkiem metylenowym i oczyszcza metodą rzutowej chromatografii na żelu krzemionkowym. W celu usunięcia benzylowych grup ochronnych, prowadzi się katalityczne uwodornienie w sposób opisany powyżej, uzyskując tytułowy związek z wydajnością 60% w postaci oleju: Rf = 0.3 (15% MeOH/CH2Cb), NMH (CDCb 500 MHz) δ: 4.36 (d. 1H, J = 7.92 Hz, anomeryczny α-H)), 4.37 (d, 1H, J = 7.92 Hz, anomeryczny α-H).

Związki z przykładu I i II oraz związki, które zostały wytworzone lub mogłyby być wytworzone sposobami analogicznymi do wyżej opisanych są przedstawione w tabeli 1.

Ta b e 1 a

Tabela 1 (ciąg dalszy)

RI

CM

CM CM CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

ιη I Pil

<D g CM O CJ

<D φ g a a CM IM CM O O O U U U

Φ g CM O U

a CM O U

a CM O u

a CM O U

Φ g CM O O

Φ g CM O O

a CM O u

a CM O CJ

a CM O CJ

a CM O CJ

* * Pi

5 rt N o 24 3 r—ł en 1 o

-? 5L 5Ł 3 3 3 N N N 0 0 0 24 24 24 3 3 3 rH rH rH en tn Cn 1 1 1 o o o

3 3 N 0 24 3 rH en 1 O

3 3 N 0 24 3 rH en 1 O

3 3 N 0 24 3 rH en 1 o

3 3 N 0 24 3 rH en 1 o

g- 3 N O 24 3 rH en 1 o

3 3 N 0 24 3 rH Cn 1 o

3 3 N 0 24 3 r—1 tn 1 o

g 3 N O 24 3 rH Cn 1 o

5 3 N 0 24 3 rH tn 1 O

3 3 N 0 24 3 rH Cn 1 O

* * ro Pi

3 id N 0 24 rH en 1 o

2 T A id 3 id N N N O 0 o 24 24 24 3 3 3 r—ł r—) i—1 en en en 1 1 1 o o o

5 3 N O 24 3 rH en 1 o

5 3 N o 24 3 i—) en 1 O

3 3 N 0 24 3 rH Cn 1 O

3 3 N o 24 3 rH en 1 o

§_ 3 N 0 24 3 rH Cn 1 O

3 3 N 0 24 3 t-H Cn 1 o

3 3 N O 24 3 rH Cn 1 o

3 3 N 0 24 3 rH en 1 o

3 3 N O 24 3 rH Cn 1 o

3 3 N O 24 3 rH Cn 1 o

CO W u

ro co en ffi W a U CJ CJ

co a u

co a o

co a u

co a u

co a u

co a u

co a CJ

Γ0 a CJ

ro a CJ

ro a o

* rH Pi

2L w

Σ. 2 T a a a

3 a

5 a

5 a

a

3 a

3 a

5 a

5 a

3 a

3 a

%l

3 ω

3 5 5 tn cn tn

3 Έή

3 tn

3

3 Ίή

3 w

3 w

Ό

Ό

Ό

Ό

-<1

a Ρι O U O

OCOPh-OMe OCOPh OH

a a o u o

a o

a o

CM a a

o —

-3 W o ej o

o —

-u w o cj o

O

O

O

O

Ό 3 rM 24 > N 1-1 Pr

tn r-

•ro Λ Ή o oo σι i-i

24 rH rH

CM i—1

rH ro rH

i-i

LT) tH

kO i—1

r- i-i

00 rH

t—

O CM

Tabela 1 (ciąg dalszy)

Cl	fNC4<N(N<NCNCNCNC4<NfNfMCN
m I tó|	φφφφ φφφφ SSSSWKKffiSSSSW OlC^CNtNCNCSCNfMCNfMCNCMCN OOOOOOOOOOOOO uouoouoooouoo
-łc •K tó	V Sr 1 J ΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΟ NNNNNNNNNNNN+J OOOOOOOOOOOOO OOOOOOOOOOOO Φ dCCCCCd3Cd3C>-i r—I r-1 ' t—ł r—) fM rM I—ł 1—1 I—1 rM rM r—) Φ ζρξρϋ'ΐξρφϋϊφίζρφίζχίζρϋ'ΐζτΐ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OOOOOOOOOOOOO
* * m tó	3 B· 3 3 ϊ ł < 33333^ (ΟΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΟ NNNNNNNNNNNN+J OOOOOOOOOOOOO OOOOOOOOOOOO Φ dccccd33cccc--i i—) r—ll—Ir—) r—ł r—1 rM fM rM rM r—| i—t (0 tPtPtPtPtJitPtPtPtPtrtPlPO1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OOOOOOOOOOOOO
CN I «I	fomromfomcomfocororofo HM HM HM HM HM KH HM KH HM HM HM HM Mm Mm Mm Mm Mm Mm hm hm hm pm Mm H-, Mm ououuuuouoooo
* i-H tó	33 3 3 3 3 3 3 5 3333 Η-,Η-,Η-,^Γ,Ι-1-ΙΗ-,Ι-|-«ΗΜΗΜΗΜΗΜΙ-ι-,Η-Ι Mm Mm Mm Mm Mm Mm Mm Mm Mm Mm Mm Mm Mm
* 1 ml	533333333 OOOOwwwtnwwwww
<1	OrC-C-GrCOOrC rufLiCMeLiCiCifiiCi +> (NCNCNCMCNCNCNiN W WEffiKffiEKffi O O O O O U U O O 0 — 0 OOOOOOOOOOOO o
Przykład	^HCMfnM*in<or*oo(T\o<-io4n CNCNCMCNCNCNCNCNCNmcOCnrO

Tabela 1 (cigg dalszy)

Cl	CNCNfNCNCMCNCMCM
tn I	(U (U (U (U mccassasw CNCNCNCNtNCNCNCN OOOOOOOO ouoooooo
* *	5- 5 5- 5 2- 3 5- <ΰ(0(ΰ<ΰπ3(0(ΰ—, NNNNNNNTS OOOOOOO — P -P -P -P -P -P -P 10 44 44 44 44 44 44 44 N ίΰ<β(ΰ<ΰ(βίβίΰθ i—ł r—1 r—1 Γ—1 —li—Ii—1 43 rd<flreaJiOiti«J>i -tri tri tr> tr> tr> Cn tn H 1 1 1 1 1 1 1 1 OOOOOOOO
* * m	S- S 5-3 5- 5 3 ιθ(θσίιΰ(θιβίϋ^- ΝΝΝΝΝΝΝ'Χ' OOOOOOO'-' -P -P -P -P -P -P -P Π5 44 44 44 44 44 4444 N ίύ(ΰ<ΰ(ΰίΟ(Όίϋθ i—łr-li—Ii—I i—1 i—l i-H 33 nj nj <ϋ ro nj >i Ói&itPGiCPtPłTLl 1 1 1 1 1 1 1 1 OOOOOOOO
CN I «1	commmmmmco HM HM HM HM HM HM HM HM HM HM HM HM HM HM HM HM OOOOOOOO
* 1 r-d | tó|	5 3-55 5 5-5-3
%l	55355552 tncnwcncncncncn
<1	-P -P -P -P +J -P -P 44 W H w W w W W CM O O O O O o oo 0 — 0 0—0 0—0 0—0 0—0 0—0 0—0 o o o o o o o oo
Przykład	Tj*mk0r*000>OrH

Tabela 1 (ciąg dalszy)

cl	<NCNCN<NCN<NCNCN CN CN CN
m I «1	Φ Φ Φ Φ Φ φ φ Φ aaasaaaa a a a CNCNCNCNCNCNCNCN CN CN CN OOOOOOOO O O O ooooouoo U u u
* *	(tictiaJcOrtlaJitlN N N N NNNNNNNO 0 0 0 OOOOOOO44 44 44 44 43 43 43 42 43 4343 3 3 3 3 >ί>ί>ί>ί>ι>ι>ίι-Η H 1-1 1-1 tn Cr> Cn 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OOOOOOOO o o o
* * co	5Ł --------(0 CO rO fO (3<0<0<0<0<0(βΝ Ν Ν N NNNNNNNO 0 0 0 000000044 44 44 44 424243X14343433 3 3 3 >1 >1 >Ί >1 >Ί >1 >Ί I”1 H rH 1-1 H MHMHCiMCn tn Cn Cn 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OOOOOOOO o o o
CN I «1	cocococococococo co co co M hH K-» *τ· HH »τ· H|H t-H ^T* ·τ· •Τ* )X| |X< HM U-t 3-1 M-t H-ł HM HM HM HM ouoouuoo u o o
* rH	2 ś- ©2 5 s 2- 3- © 2 5 aaaaaaaa a a a
%l	22222222 2 2 2 cocococococococo co co co
Cl	43 42 42 43 42 43 42 4-> +J -U -U cm a a a a a a a a a a ooooooo o o o o o o u u u u u 0 — 0 0—0 0 — 0 0 — 0 oooo ooo o o o o
Ti rt) W 44 N M Λ	cNcn^incoc^oocri o ,-i cn LD ID LO

Cd <Ζ

Χ3 $

Φ Φ

•Η

•Η

rd

β

β

Γ

φ

φ

Γ-

-Η

•Η

ϋ

ϋ

II

'φ

'Φ

Η

Η

Φ

Φ

Φ

•Η

•Η

g

a

a

rd

φ

>1

ί>Ί

-Η

β

β

Ρί

β

φ

Ν

Ν

Φ

Φ

Η

ί>Ί

ί>1

—

N

Ν (tf

β Φ

Ν ϋ

Ν ϋ

<

tc ł~\

0

-Η

Ν

Ν

Ν

Uz

β

£

Φ1

φ

Φ

r-j

•Η

Φ

Φ

tr>

Φ

£

rM

rM

Ν

CU

CU

W

1

rd

rd

rd

rd

Ο

Φ

ο— c

^y

m

r-

00

ID

C

β

•ο

•π

00

Γ

00

00

>1

•η

Φ

Φ

z-\

τ3 Φ ·|—1

Ό £ -ΰ

•Ν •Η β

•Ν £

χο m

U> ffi

Φ £

II Φ

II Φ

II Φ

II Φ

0

0

0

0

0

CU

cu

CU

CU

Φ

g

g

g

g

Φ

II

II

II

II

II

g

φ

Ό

Ί?

0

G Ό

*

-H

*

*

£

Φ

Ό

Λ

•rd

II II φ φ g g

-η Λί

771

>> N		K
CO			KI	rH
			1
’Ό			<£L	N K	K| 1
.2*	ki	K|	Φ fi N	co
	1 £L-	1 «Α-	σι n	<£L·
oj	Φ	Φ	O	II	φ
'o	fi	fi	>1	1-3	fi
	N	N			N
03 (_,	ϋ	ϋ	Φ	Ό	ϋ
	>1	>1	g	•—	>1
	S-l	Al	0	o	S-l
	Φ	(U	fi	co	Φ
	g	g	fi	00	g
	O	0	·.	»k	0
	c	fi	K	'φ	fi
	fi	fi	|—i		fi
	M.		»k
	K	K	_g
	rH			KI
		K	'S'	1
	g	ε	ł-1	2©
			Ti*
	CM	CN	O
	00	00		Φ
	·.	»k	LO	fi
	Tj*	'φ		N
				U
	*			>1
			K] 1
	K| 1	K| 1	Φ
	<£L	g
		<£L	Φ	0 fi
			fi	fi
	Φ	φ	N
	c	fi	U	Κ-
	N	N	>1	ι—1
	u	U		·.
	>1	>1	Φ	N
	n	Al	g	K
	Φ	(U	0	CO
	g	g	fi	σ
	O	0	fi
	fi	fi	».	m
	fi	fi	K	II
	te	*»	rH	H)
	K	K	K	»k
	r—ł	i—H	g	T3
	te
	g	g		m
	·—·		kO	CN
	'ł*	Tt*	in	in
	o	O	o	o
	*	K		*.
	in	LD	in	in

to	to	Vo	VD
N	N	N	N
K	K	K	K
a	a	a	a
o	o	O	o
o	o	o	o
m	in	m	m
		*.
en	ro	ro	en
1	r—1	r-1	«—1
u	o	u	u
Q	Q	Q	Q
U	U	U	U

Κ

S .

a w ........

Zastosowanie

Wykazano, że związki otrzymane sposobem według wynalazku oddziaływują wzajemnie z błonami biologicznymi i nadają im przepuszczalność, a także wzmagają skuteczność działania antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych na żywe komórki. Ponieważ wykazano, że związki te nadają błonom przepuszczalność, a same z siebie w zastosowanych stężeniach nie wywierają wpływu na wzrost komórek, przyjmuje się, że wzmożona skuteczność związana jest ze zwiększeniem ilości związków ważnych terapeutycznie dostarczanych do komórek.

Użyteczność związków pod względem nadawania błonom przepuszczalności wykazano w teście [D.W. Hoyt i in. Biochemistry, tom 30,10155 (1991)], w którym pochodna fluoresceiny zostaje zmikrokapsułkowana wewnątrz pęcherzyków w stężeniach samowygaszających. Wzrost zatężenia fluorescencji po dodaniu badanego związku wskazuje na wyciek pochodnej fluoresceiny z pęcherzyka, a tym samym oznacza, że doszło do przerwania błony. Związki otrzymane sposobem według niniejszego wynalazku powodowały szybki i znaczny wzrost natężenia fluorescencji przy stężeniach bardzo niskich (0,05 mM - 0,5 mM), co wskazuje na nadanie błonie przepuszczalnośc i.

Oprócz tego, wyniki pomiarów zarówno rozpraszania światła jak i zmętnienia, przeprowadzonych z udziałem pęcherzyków potraktowanych wybranymi glikozylowanymi pochodnymi steroidowymi (w stężeniach wywołujących 1θ0% wyciek karboksyfluoresceiny) wykazały, że średnia wielkość tych pęcherzyków nie była znacząco różna od wielkości pęcherzyków nie poddanych działaniu. Co więcej, wykonane pod mikroskopem elektronowym fotografie pęcherzyków poddanych działaniu wybranych glikozylowanych pochodnych steroidowych (w stężeniach wywołujących 100% wyciek karboksyfluoresceiny), nie wykazały wyraźniejszych zmian w morfologii w porównaniu z pęcherzykami nie poddanymi działaniu.

Tak więc, glikozylowane pochodne steroidowe otrzymane sposobem według niniejszego wynalazku nadająbłonom przepuszczalność bez niszczenia pęcherzyków lub wywoływania fuzji w poważniejszym stopniu.

Uważa się, w oparciu o wyniki badań metodą NMR nad agregacją w roztworze oraz na podstawie danych eksperymentalnych z dziedziny krystalografii, że glikozylowane steroidy otrzymane sposobem według niniejszego wynalazku ulegają samoasocjacji i wbudowują się w błony w postaci zasocjowanej, i że właśnie z tym procesem związane jest zjawisko nadawania błonom przepuszczalności. Aczkolwiek czyste pęcherzyki fosfolipidowe stosowane w tych badaniach nie mają całej złożoności błon biologicznych, twórcy wynalazku wykazali, że związki dobrze działające w trakcie badania także wzmagają czynność związków terapeutycznie ważnych (na przykład środków przeciwbakteryjnych i środków przeciwgrzybiczych) w odniesieniu do żywych komórek. Odkrycie to podtrzymuje pogląd, że zdolność glikozylowanych pochodnych steroidowych do wzajemnego oddziaływania z podwójnymi warstwami fosfolipidowymi związana jest ze zdolnością tych pochodnych do potęgowania skuteczności terapeutycznej. Dalej, wskazuje na to, że test karboksyfluoresceinowy jest racjonalnym wyjściowym układem modelowym dla rozpoznawania potencjalnych kandydatów na środki do nadawania przepuszczalności błonom biologicznym.

Odmianę powyższego testu [V.E. Carmichael i in., J. Amer. Chem. Soc., tom III, 767 (1989)] wykorzystano w celu określenia, czy związki nadają błonie przepuszczalność dla protonów przy krańcowo niskich stężeniach (0,01 mM - 0,005 mM). W celu zbadania tego, pochodną fluoresceiny zmikrokapsułkowano wewnątrz pęcherzyków w stężeniach niewygaszających, w buforze pH 6,6. Pęcherzyki rozcieńczono do buforu o pH 5,5, po czym dodano związek o wzorze (I) w stężeniu niższym od tego stężenia, które jest potrzebne do nadania błonie przepuszczalności dla pochodnej fluoresceiny. Po dodaniu związków o wzorze (I) natężenie fluorescencji zmniejszało się, wskazując na to, że błona stała się przepuszczalna dla protonów.

Użyteczność glikozylowanych pochodnych steroidowych pod względem nadawania błonom fosfolipidowym przepuszczalności zasugerowała przydatność tych pochodnych do wzmagania przepuszczalności błon komórkowych, które złożone są w dużej części z fosfolipidów i innych lipidów, dla cząsteczek związków ważnych terapeutycznie. Użyteczność tę zademonstrowano w testach, w których badano skuteczność dwóch różnych środków przeciwgrzybiczych w

171 131 zabijaniu Crithidia fasciculata. Przydatność tę wykazano, dalej, w badaniu skuteczności erytromycyny jeśli chodzi o zabijanie komórek E. coli ATCC 25922.

TEST I: Wyciek karboksyfluoresceiny z pęcherzyków.

Do 25 ml kolby okrągłodennej wprowadzono 20,5 mg żółtka jaja (Sigma, średnia masa cząsteczkowa 770,4) rozpuszczonego w CHCb/CHaOH, 5,0 mg fosfatydylogliceryny (Sigma, masa cząsteczkowa 772) rozpuszczonej w CHCb/CH}OH i 12,7 mg powtórnie oczyszczonego cholesterolu (Aldrich, masa cząsteczkowa 386,66). Stosunek molowy żółtko jaja : fosfatydylogllcery na: cholesterol wynosił 4:1:5 (66 pmoli lipidu całkowitego). Rozpuszczalnik usunięto przy użyciu wyparki obrotowej. Wysuszoną mieszaninę lipidów umieszczono następnie w atmosferze argonu i dodano 3 ml świeżo przedestylowanego eteru dietylowego. Po rozpuszczeniu lipidu dodano 1 ml karboksyfluoresceiny rozpuszczonej w wodzie (pH doprowadzone do 7,4) do uzyskania stężenia 180 mM (stężenie karboksyfluoresceiny oznaczono metodą UV; współczynnik ekstynkcji przy pH 7,4 wynosi 5,6 x 1Ó4; λ,_η:ΐχ = 492). Mieszaninę lipidów zawierającą karboksyfluoresceinę poddano nadźwiękawianiu w atmosferze argonu w sonikatorze typu łaźniowego, w temperaturze 5-15°C, w ciągu 15-30 min. Następnie mieszaninę umieszczono w wyparce obrotowej i usunięto rozpuszczalnik organiczny. W celu oddzielenia pęcherzyków zawierających karboksyfluoresceinę od karboksyfluoresceiny niezmikrokapsułkowanej, pozostałą wodną mieszaninę pęcherzyków wprowadzono na kolumnę Sephadex G-25 zrównoważoną buforem 145 mM NaCl/10 mM Hepes o pH 7,4. Pęcherzyki zawierające karboksyfluoresceinę zostały wyeluowane w pierwszej frakcji po objętości zerowej, podczas gdy karboksyfluoresceina, która nie uległa zmikrokapsułkowaniu, pozostała w kolumnie. Oczyszczone pęcherzyki rozcieńczono buforem 145 mM NaCl/10 mM Hepes (pH 7,4), aż do osiągnięcia zmierzonego natężenia fluorescencji mieszaniny pęcherzyków około 10.

Ponieważ karboksyfluoresceina jest zmikrokapsułkowana w pęcherzykach w stężeniach samowygaszających, wzrost natężenia fluorescencji z upływem czasu wskazuje na to, że fluorofor wycieka z pęcherzyków do buforu. Do próbki roztworu pęcherzyków dodano 5% Triton X199 w 50 pl CH3OH w celu oznaczenia możliwego do uzyskania maksimum wzrostu fluorescencji. (Triton X100 jest to detergent niejonowy, który, przy zastosowaniu go w wysokim stężeniu, powoduje rozerwanie pęcherzyków przez solubilizowanie lipidów). Zdolność każdego spośród glikozylowanych steroidów do wywoływania uwalniania karboksyfluoresceiny z pęcherzyków określano za pomocą kontroli wzrostu natężenia fluorescencji po dodaniu glikosteroidu. W każdym eksperymencie do kuwety wprowadzano 50 pl glikosteroidu w metanolu (początkowe stężenia mieściły się w zakresie od 0,6145 do 2,458 mM) i w ciągu 10 minut śledzono natężenie fluorescencji. Kontrola, w przypadku której użyto 50 pl czystego metanolu, wykazała, że sam metanol nie powoduje znaczniejszego wzrostu natężenia fluorescencji. Jednakże, szereg glikosteroidów skutecznie nadawał przepuszczalność błonom pęcherzyków przy stężeniach bardzo niskich, umożliwiając wyciekanie karboksyfluoresceiny do buforu. Wyniki podsumowano w tabeli 2.

Jeżeli przyjąć jako miarę skuteczności działania stężenia potrzebne do wywołania wycieku znaczniejszego (to znaczy >50%), wtedy związki 7, 8 i 11 okazują się najbardziej skutecznymi glikozylowanymi steroidami badanymi w tym teście pod względem nadawania błonom fosfolipidowym przepuszczalności. Związki 7 i 8 mają pierścienie A i B skondensowane cis i dwie α-związane glukozowe jednostki cukrowe, przyłączone do hydrofilowej strony cząsteczki. Również związek 11 zawiera dwie α-związane glikozowe jednostki cukrowe przyłączone do hydrofilowej strony cząsteczki. Kwas cholowy, kwas dezoksycholowy i kwas chenodezoksycholowy, związki znane z tego, że nadają błonom biologicznym przepuszczalność w innych zastosowaniach [G.S. Gordon i in., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 82, 7419-7423 (1985)] także czynią błony przepuszczalnymi w tym teście, aczkolwiek w stężeniach o wiele wyższych niż liczne związki otrzymane sposobem według niniejszego wynalazku. Z obserwacji tych można wyciągnąć wniosek, że glikozylacja powoduje zmiany chemicznych właściwości steroidów, czyniąc je skuteczniejszymi pod względem nadawania błonom przepuszczalności.

TABELA 2

PRZYKŁAD	STĘŻENIE (mM)*	% ZWIĘKSZENIA SIĘ FLUORESCENCJI
Kwas cholowy	0,117	0,0
	2,341	59,1
Cholan metylu	0,117	25,4
Kwas chenodezoksycholowy	0,117	17,7
	1,17	80,9
Triton-X 100	4,04	100,0
	1,17	46,4
	0,117	18,6
Kwas dezoksycholowy	0,117	0,0
	1,1 17	82,7
1	0,117	0,0
2	0,117	10,0
3	2,34	0,0
4	0,117	0,0
5	0,117	57,3
7	0,117	89,1
8	0,117	89,1
9	0,117	24,5
10	0,11 7	0,0
11	0,117	98,0
13	0,117	0,0

* Stężenie końcowe po rozcieńczeniu

TEST II. Transport protonów przez błony lipidowe

Test ten zastosowano do oceny zdolności protonów do przechodzenia przez błony pęcherzyków poddanych działaniu glikosteroidów. Pęcherzyki zawierające karboksyfluoresceinę w stężeniach niesamowygaszających wytworzono dokładnie tak, jak to opisano powyżej, z tą różnicą, że karboksyfluoresceinę dodano do mieszaniny lipidów 1 ml wody (pH 6,5) w stężeniu 1 mM. Po maiźwiękowieniu w atmosferze argonu i odparowaniu przy użyciu wyparki obrotowej w celu usunięcia eteru dietylowego, pęcherzyki zawierające karboksyfluoresceinę poddano oczyszczaniu na kolumnie Sephadex-G25 w sposób powyżej opisany. Stężenie roztworu pęcherzyków po oczyszczeniu na kolumnie G-25 doprowadzono do poziomu, przy którym natężenie fluorescencji wynosi 100 po 100-krotnym rozcieńczeniu do buforu 80 mM NaCl/5 mM Hepes o pH 5,5.

100-krotnego rozcieńczenia wyjściowych pęcherzyków do buforu o pH 5,5 dokonywano bezpośrednio przed każdym eksperymentem i do kuwety wprowadzano 1 ml rozcieńczonego roztworu. W celu dokonania oceny zdolności glikosteroidów do ułatwiania transportu protonów przez podwójną warstwę lipidową, do 1 ml roztworu pęcherzyków w kuwecie fluorescencyjnej dodano 50 μΐ 0,245 M roztworu danego glikosteroidu w metanolu i w ciągu 10 minut kontrolowano zmiany natężenia fluorescencji. Wyraźny spadek fluorescencji wskazuje na to, że dany glikosteroid ułatwia transport protonów przez błonę. Test ten oparty jest na fakcie, że natężenie fluorescencji karboksyfluoresceiny jest o wiele większe przy pH 6,5 niż przy pH 5,5. Jeżeli pęcherzyki wytworzone przy pH 6,5 rozcieńczy się do buforu o pH 5,5, wtedy natężenie fluorescencji będzie zmniejszać się z upływem czasu, gdy gradient pH poprzez błonę opada. Jako kontroli użyto 50 gl czystego CH3OH i stwierdzono, że w tym przypadku natężenie fluorescencji nie zmieniało się w sposób wyraźny. Tak więc, dodanie CH3OH przy niższych stężeniach nie nadaje pęcherzykom przepuszczalności dla protonów. Wyniki podsumowane są w tabeli 3.

TABELA 3

PRZYKŁAD	STĘŻENIE (mM)*	% ZMNIEJSZENIA SIĘ FLUORESCENCJI
Trilm-K 100	4,04	100,00
	0,0116	2,43
Gramicydyna	0,00579	87,20
	0,000579	81,60
Kwas cholowy	0,0116	1,00
Oholm metylu	0,0116	5,40
Kwas ęheondecnkyzęhzlzwz	0,0116	8,20
Kwas dezoksycholowy	0,0116	5,39
1	0,0116	7,60
	0,00579	4,30
2	0,0116	8,60
	0,00579	1,70
3	0,0116	35,40
	0,00579	21,00
4	0,0116	12,30
	0,00579	7,89
5	0,0116	26,10
	0,00579	19,40
7	0,0116	19,80
	0,00579	15,20
8	0,0116	32,20
	0,00579	20,60
9	0,0116	43,00
	0,00579	21,40
11	0,0116	22,00
	0,00585	14,70
13	0,0116	70,60
	0,00579	35,20
	0,000579	2,80

* Stężenie końcowe po rozcieńczeniu

TEST III: Skuteczność antybiotyczna erytromycyny z udziałem wzmacniaczy i bez nich

Erytromycyna jest antybiotykiem, o którym wiadomo, że jej skuteczność ulega zwiększeniu w wyniku działania związków nadających błonom komórkowym przepuszczalność [P. Kubesch i in., Biochemistry, 26.2139-2149 (1987)]. Oceny erytromycyny, w obecności nowych glikozylowanych pochodnych steroidowych otrzymanych sposobem według niniejszego wynalazku, dokonano w teście płytkowym. Komórki DH2 (mutantowy szczep E. coli K-12, otrzymany w Cold Spring Harbor Laboratories) hodowano w bulionie hodowlanym aż do osiągnięcia gęstości optycznej (O.D.) około 0,5 i zmieszano z 2,5 ml stopionego górnego agaru (górny agar otrzymany w sposób następujący: 10 g tryptonu (DIFCO), 5 g ekstraktu drożdżowego (DIFCO), 10 g NaCl, 7 g agaru (DIFCO) i 1 ml 1 M NaOH rozpuscczono w 1 litree zzystej wddy i wyjałowiono z agarem (płytki z agarem proygntowann w sposób następujący: 10 g tryptonu, 5 g drożdży, 10 g NaCl, 15 g agaru i 1 ml 1 M NaOH rozpuszczono w 1 litrze czystej wody, po czym wyjałowiono w autoklawie i ochłodzono). Po ochłodzeniu w ciągu 15-30 minut każdą płytkę podzielono na wzór kratki i na każdy jej sektor skroplono 4 μ l roztworu testowego zawierającego erytromycynę (0,5 mM lub 1,0 mM) w metanolu, albo erytromycynę i związek badany (20 mM) w metanolu. Płytki inkubowano w ciągu szesnastu (16) godzin w temperaturze 37°C, po czym zbadano je pod względem stref zahamowania (to znaczy przezroczystych obszarów w sektorach kratki, gdzie roztwór testowy zahamował wzrost komórek bakteryjnych). Każdy sektor kratki punktowano. Jako standardu przy ocenie skuteczności użyto sektora kratki, który zawierał samą erytromycynę w stężeniu 1,0 mM, przy czym pozostałe sektory punktowano w odniesieniu do niego. Wyniki, podsumowane w tabeli 4 poniżej, uwidaczniają, że w teście tym najlepszym wzmacniaczem okazał się ester metylowy kwasu 3 α-O-p-metoksybenzoilo-cis5,10-bis-a,a-7,12-glukozylocholowego (w dalszej części niniejszego opisu określany skrótowo CME). Spośród nieglikozylowanych pochodnych kwasów żółciowych, jedynie kwas dezoksycholowy i jego sól sodowa wykazywały jakieś działanie. Kwas chenodezoksycholowy i kwas cholowy oraz ich sole nie wywierały w tych badaniach dającego się wykryć wpływu na antybiotyczną skuteczność erytromycyny. Jest rzeczą interesującą, że jak to wykazano, sole kwasu dezoksycholowego także są bardziej skuteczne niż sole kwasu chenodezoksycholowego i sole kwasu cholowego, jeśli chodzi o wzmaganie pobierania insuliny poprzez błony nosowe [G.S. Gordon i in., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 82, 7419-7423 (1985)].

TABELA 4

ZWĄZEK /20 mM/	ERYTRO/TCYNA /m/	SKUTEK
Kwas cholowy	1,0 mi	—
Kwas cholowy	0,5 m/	—
Chlan sodowy	1,0 m/	—-
Chlan sodowy	0,5 m/	—
Ciolan metylu	1,0 m/	__
Ciolam metylu	0,5 m/	—
Kwa chenodezoksycholowj	f 1,0 mli	—
Kwas chenodezoksycholowy 0,5 m/	—
Kwa dezoksycholowy	1,0 m/
Kwa dezoksycholowy	0,5 mil	+
Dezoksycholan sodowy	1,0 mM	+
Dezoksycholan sodowy	0,5 m	+
C/E	1,0 m/	+++
CHE	0,5 m/	+++
Ester metylowy kwasu 3C O-benzoilo-trams-5,10~ld , C*C-7,12-gliktozyloc lowego /BU/	ź - 1,0 m La - ho -	+
BT/E	0,5 m	+

Tabela 4 (ciąg dalszy)

ZWIĄZEK /20 mM/	ERYTROMYCYNA /mM/	SKUTEK
Kwas 3 O· -OH-cis-5,10 bis- oi , oć-glukozylo cholowy K+	1,0 mM	+
Kwas 3 O -OH-cis-5,10 bis- © , οΖ-glukozylo cholowy K+	0,5 mM	+

— : sama erytromycyna w stężeniu 1,0 mM (poziom odniesienia) i wszystkie pomniejsze skutki + : wzmożenie względem poziomu odniesienia +++ : wyraźne wzmożenie względem poziomu odniesienia

Powyższy test płytkowy powtórzono z zastosowaniem niższych stężeń CME i porównano skuteczność tego związku jako wzmacniacza ze skutecznością nieglikozylowanego związku macierzystego, a mianowicie estru metylowego kwasu 3a-O-p-metoksybenzoilo-cis-5,10-cholowego (w dalszej części niniejszego opisu określanego skrótowo CME). Wyniki, podsumowane w poniższej tabeli 5, pokazują, że podczas gdy CME przejawia działanie jako wzmacniacz już w bardzo niskich stężeniach, nieglikozylowany związek macierzysty nie wykazuje czynności wzmacniacza. Unaocznia to, że dla uzyskania efektu wzmagającego decydująca jest obecność cukrów.

TABELA 5

ZWIĄZEK (mM)	ERYTROMYCYNA (mM)	SKUTEK
1,0 mM CDE	1,0 mM	——
0,1 mMCDE	0,1 mM	—
0,1 mM CME	0,1 mM	+
0,1 mM CME	0,01 mM	+
0,01 mM CME	0,01 mM	+
0,001 mM CME	0,01 mM	+
0,001 mM CME	0,001 mM	—--

— : brak dającego się wykryć sklarowania/strefy zahamowania +: widoczne sklarowanie

TEST IV: Skuteczność działania środków przeciwgrzybiczych na pierwotniaki, z dodaniem i bez dodania glikozylowanych pochodnych steroidowych

CME, związek zidentyfikowany tak w powyżej opisanym teście I (związek 8 w teście karboksyfluoresceinowym) jak i w powyżej opisanych testach II i III, jako dobry środek nadający błonie przepuszczalność, przebadano pod względem jego zdolności do zwiększania skuteczności dwóch różnych środków przeciwgrzybiczych w działaniu na pierwotniaka Crithidia fasciculata. Badano także zdolność nie glikozylowanego steroidu macierzystego zwiększania skuteczności tego rodzaju. Badania te przeprowadzono w sposób opisany przez R.A. Pascala i in. [Biochemistry,22,171-178 (1983)] orazM.D. Rahmanai in. [J.Med. Chetm.31.1656-1659(1988)]. Kolby zawierające 25 ml podłoża wzrostowego [otrzymywanie: 1,5 g sacharozy, 0,5 g ekstraktu drożdżowego, 0,4 g tryptonu i 0,25 ml trietanoloaminy rozpuszcza się w 100 ml wody i doprowadza pH do 8,0 przy użyciu 10 M HCl, po czym roztwór wyjaławia w autoklawie i po ochłodzeniu dodaje się 100 μl heminy (SIGMA) [2 mg heminy (1 ml 0,1 N NaOH) i 20 mg siarczanu streptomycyny (SIGMA)] oraz środek przeciwgrzybiczy i/lub glikozylowane lub nieglikozylowane pochodne steroidowe, posiano porcjami hodowli C. fasciculata (250 μΐ hodowli z zawartością około ΙχΙΟ⁶ - 1 x 10⁷ komórek) [sporządzenie hodowli: C. fasciculata w glicerynie dodaje się do podłoża wzrostowego i prowadzi się hodowlę, przy wstrząsaniu, w ciągu trzech (3) dni, w temperaturze 26°C, po czym przechowuje w temperaturze 0-4°C], Hodowle inkubowano, przy wstrząsaniu, w temperaturze 25°C i wzrost kontrolowano przez zmiany absorbancji przy 535 nm (względem podłoża, którego nie posiano).

Do badań użyto dwóch różnych środków przeciwgrzybiczych. Jednym z nich był kwas 10-tiastearynowy /10-TSA; patrz: M.D. Rahman i in. [J. Med. Chem., 31, 1656-1659], wykazujący IC50 ΙΟμΜ; a drugim 24-tiacholestanol/24-TC; patrz: M.D. Rahman i in. [J. Lipid Research, 29, 1543-1548 (1988)], M.D. Rahman i R.A. Pascal [J. Biol. Chem. , 265. 4989-4996 (1990)], wykazujący IC50 0,32 μΜ. Wyniki, przedstawione na figurach ł, 2 i 3 pokazują, że obecność CME wzmaga skuteczność 10-TSA w sposób drastyczny, co umożliwia stosowanie go w stężeniach od 10- do 100-krotnie niższych od stężeń, które w innym przypadku byłyby niezbędne dla uzyskania 50% zahamowania wzrostu (fig. 1). Wykazano także, że obecność CME podwyższa skuteczność działania 24-TC (fig. 2). Nie zaobserwowano, aby nieglikozylowany steroid macierzysty (CDE) działał jako wzmacniacz w tym teście (fig. 3).

TEST V: Skuteczność działania koniugatu pochodna-związek na pierwotniaki Crithidia fasciculata

Nową glikozylowaną pochodną steroidową o wzorze (1) skoniugowano ze związkiem terapeutycznie ważnym w sposób znany w tej dziedzinie techniki, a mianowicie za pomocą sprzęgnięcia grupy kwasowej z aminą. Zdolność koniugatu pochodna-związek do hamowania wzrostu Crithidia fasciculata ocenia się tak, jak to opisali R.A. Pascal i in. [Biochemistry, 22. 171-178 (1983)] oraz M.D. Rahman i in. [J. Med. Chem., 31, 1656-1659 (1988)]. Kolby zawierające 25 ml podłoża wzrostowego samego, podłoża wzrostowego z dodatkiem 24-TC w stężeniu 0,32 μΜ (poziom IC50) i podłoża wzrostowego z dodatkiem koniugatu pochodna glikozylowana-lek w stężeniu 0^32 μΜ, posiewa się porcjami C. fasciculata (250 μΐ hodowli z zawartością około 1x10 - lxl0⁷ komórek). Hodowle inkubuje się, przy wstrząsaniu, w temperaturze 25°C i wzrost kontroluje przez zmiany absorbancji przy 535 nm (względem podłoża, którego nie posiano). Wzmożona skuteczność koniugatu pochodna glikozylowana-lek w porównaniu z nieskoniugowanym związkiem terapeutycznie ważnym odzwierciedla się mniejszą szybkością wzrostu (to znaczy niższą absorbancją z upływem czasu). Poziom IC50 koniugatu można zmierzyć przez powtórzenie eksperymentów z zastosowaniem różnych stężeń koniugatu w celu ustalenia stężenia powodującego 50% zahamowanie wzrostu względem hodowli zawierającej samego tylko pierwotniaka C. fasciculata.

W innej serii eksperymentów, kolby z podłożem wzrostowym zawierają koniugat w stężeniu odpowiadającym jego wartości IC50, jak to określono w opisanych powyżej badaniach, z dodatkiem glikozylowanego steroidu otrzymanego sposobem według niniejszego wynalazku, takiegojak CME, o którym wiadomo, że wzmaga skuteczność 24-TC w stanie nieskoniugowanym ( w dalszej części niniejszego opisu określany jako wzmacniacz). Wzmacniacz obecny jest w następujących stosunkach ilościowych w odniesieniu do koniugatu pochodna glikozylowana-lek : 0:1, 0,1:1, 1:1, 10:1, 100:1, 1000:1 lub w jakimkolwiek stężeniu w tym zakresie. Podłoże posiewa się porcjami hodowli C. fasciculata w sposób powyżej opisany i wzrost kontroluje się przez zmiany absorbancji przy 535 nm względem podłoża, którego nie posiano. Zwiększona skuteczność koniugatu w obecności wzmacniacza odzwierciedla się w mniejszej szybkości wzrostu w stosunku do szybkości wzrostu w obecności samego tylko koniugatu. Optymalny stosunek ilościowy wzmacniacz : koniugat określa się jako taki stosunek, przy którym szybkość wzrostu jest najmniejsza.

FIG. 2

-o_ kanórki w podłożu (pr.kontr.,

-a— kanórki w podłożu+0,01mMCME _kanórki wpodłożu+0,32uM TC . --j— komórki w podłożu + 0,32uMTC+0,01mMCME

-o— kanórki w podłożu +0,032uMTC

-·— kanórki w podłożu +0,032uMTC+0,01mMCME

FIG. 3

—o— komórki w podłożu (próba kontrola)

-·— komórki w podłożu + 0,01 mM CDE

-ώ— komórki w podłożu + 0,32 uM TC

-*— komórki w podłożu + 0,32 uM TC + 0,01 mM CDE

FIG. 1

-o·

-o•Akomórki w podłożu komórki w podłożu komórki w podłożu komórki w podłożu (próba kontrolna) + lOuM TSA + 1 uM TSA + 0,01 mm + 0,1 uM TSA + 0,01m

CME

CME

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania nowych glikozylowanych pochodnych steroidowych o wzorze (I) w którym

   A oznacza O, OH, OR⁶, NR⁷R⁸, N₃, NHCOR⁷, OCOAr, OC(=O)OR⁹, OCOR⁹, NCH2C6H5;

   Ar oznacza fenyl lub fenyl podstawiony 1-3 grupami wybranymi z grupy składającej się z chlorowca, Ci-Ci2alkilu lub C1-C 3 alkoksylu;

   a oznacza pojedyncze wiązanie konfiguracji alfa lub beta z tym że, a oznacza podwójne wiązanie gdy A=0;

   R¹ oznacza H, który jest w położeniu cis lub trans w stosunku do R²;

   R² oznacza CH 3; r3 oznacza H, OH lub OR6;

   R4 oznacza H, OH lub OR6;

   R5 oznacza CO2R¹⁰, CH2OR9, CONH2, CONHR7, CONr7r⁸, C(=O)S-R¹⁰, CH2S(O)p-S-R¹⁰, CH2NH2, CH2NHR7, CH2NR7R⁸, CH2-S(O)p-S-R10 r6 oznacza ugrupowanie monosacharydu, w którym wiązanie glikozydowe przy anomerycznym atomie węgla w wymienionym ugrupowaniu monosacharydu jest alfa lub beta względnie oznacza ugrupowanie oligosacharydu o 2-10 ugrupowaniach monosacharydu, w których wiązanie glikozydowe przy którymkolwiek z anomerycznych atomów węgla w każdym ugrupowaniu monosacharydu ugmpowania oligosacharydu jest alfa lub beta;

   r7 i r8 niezależnie oznaczają H, Ci-C4alkil, C 3-C7 cykloalkil, C4-Cioalkilocykloalkil, fenyl, benzyl, względnie łącznie oznaczają grupę o wzorze (CH2)f, w którym f=3-6;

   r9 oznacza H lub Ci-C 3 alkil;

   Rio oznacza H, Ci-Cioalkil, Ci-Cioalkenyl, Ci-Cioalkinyl, C6H5 lub CH2C6H5;

   przy czym ugrupowanie monosacharydu stanowi ugrupowanie zabezpieczonej lub odbezpieczonej heksozy lub dezoksyheksozy wybranej z grupy obejmującej D-allozę, L-allozę, D-altrozę, L-altrozę, D-glukozę, L-glukozę, D-mannozę, L-mannozę, D-gulozę, L-gulozę, Didozę, L-idozę, D-galaktozę, L-galaktozę, D-talozę i L-talozę względnie ugrupowanie zabezpieczonej lub odbezpieczonej furanozy lub dezoksyfuranozy wybranej z grupy obejmującej D-rybozę, L-rybozę, D-arabinozę, L-arabinozę, D-ksylozę, L-ksylozę, D-liksozę i L-liksozę, przy czym wymienione grupy zabezpieczające grupy hydroksylowe w ugrupowaniach heksoz lub furanoz wybrane są z grupy obejmującej benzyl, trójmetyloacetyl, trójmetylosilil, IIIrzęd.butylodwumetylosilil, III-rzęd.butylodwufenylosilil, trójizopropylosilil, acetyl, tetrahydropiranyl, benzoil, Ci-C3alkil, izopropylidenyl, benzyliden, (2-metoksyetoksy)metyl, ortoester, parametoksybenzyl i allil;

   p oznacza 0, i lub 2; n oznacza 0, i lub 2;

   lub farmaceutycznie odpowiedniej soli tego związku, znamienny tym, że (a) zabezpieczony glikozyd, w którym atomy tlenu we wszystkich pozycjach cukru za wyjątkiem pozycji anomerycznej są zabezpieczone takimi samymi lub różnymi grupami wybranymi z grupy obejmującej estry i etery, takie jak alkilowe, sililowe, fenylowe lub benzylowe poddaje się reakcji ze (b) związkiem S-R, w warunkach standardowych, w którym to związku R oznacza C1-C10alkil, pirydyl, furyl, tienyl, fenyl podstawiony 1-3 grupami wybranymi z grupy obejmującej chlorowiec, C1-C3alkil, NO2, C1-C3alkoksyl, z wytworzeniem zabezpieczonego tioglikozydu, który następnie poddaje się reakcji z (c) kwasem meta-chloronadbenzoesowym z wytworzeniem odpowiedniej pochodnej sulfotlenkowej, i (d) przeprowadza się ją w pośredni, aktywowany środek glikozylujący stosując związek zawierający trójfluorometanosulfonian, taki jak bezwodnik trójfluorometanosulfonowy, trójfluorometanosulfonian metylowy lub trójfluorometanosulfonian trójmetylosililowy w temperaturze -78°C i kontaktuje się ten aktywowany środek glikozylujący z (e) steroidem, w którym wszystkie atomy tlenu, które nie mają być glikozylowane są zabezpieczone w znany sposób wobec 2,6-dwu-III-rzęd.butylo-4-metylopirydyny w toluenie, w celu utworzenia wiązań glikozylowych α, α albo wobec nitrylu kwasu propionowego w celu utworzenia wiązań β, β, który następnie (f) odbezpiecza się standardowymi procedurami z wytworzeniem glukozylowanych steroidów o wzorze (I).
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję zabezpieczonego glikozydu ze związkiem S-R prowadzi się w obecności rozpuszczalnika.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik stosuje się niepolarny rozpuszczalnik aprotyczny.
4. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik stosuje się polarny rozpuszczalnik aprotyczny.
5. 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik stosuje się para-metoksyfenylosulfotlenek.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bezwodnik trójfluorometanosulfonowy stosuje się w ilości mniejszej niż jeden równoważnik.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się zabezpieczony glikozyd zawierający heksozę lub dezoksyheksozę wybraną z grupy zasadniczo obejmującej D-allozę, D-altrozę, D-glukozę, D-idozę, D-galaktozę lub D-talozę.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się zabezpieczony glikozyd zawierajacy furanozę lub dezoksyfuranozę wybraną z grupy zasadniczo obejmującej D-rybozę, D-arabinozę, D-ksylozę lub D-liksozę.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się zabezpieczony glikozyd, w którym grupy zabezpieczające są takie same lub różne, wybrane z grupy obejmującej estry alkilowe, estry sililowe, etery alkilowe, etery sililowe, etery fenylowe lub etery benzylowe.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się zabezpieczony glikozyd, w którym grupy zabezpieczające są takie same lub różne, wybrane z grupy obejmującej benzyl, trójmetyloacetyl, trójmetylosilil, III-rzęd.butylodwumetylosilil, III-rzęd.butylodimetylosilil, trój-izopropylosilil, acetyl, tetrahydropiranyl, benzoil, CuCsalkil, izopropyliden, benzyliden, (2-metoksyetoksy)metyl, ortoester, para-metoksybenzyl lub allil.
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako grupę ochronną w donorze grupy glikozylowej stosuje się trójmetyloacetyl.