PL171810B1

PL171810B1 - Sposób przeprowadzania manipulacji na sekwencji kwasu nukleinowego PL PL PL PL

Info

Publication number: PL171810B1
Application number: PL92304247A
Authority: PL
Inventors: Stephen Minter
Original assignee: Tepnel Medical Ltd
Priority date: 1991-12-24
Filing date: 1992-12-23
Publication date: 1997-06-30
Also published as: GB9127415D0; US5910406A; ZA9210008B

Abstract

1. Sposób przeprow adzania m anipulacji na sekwencji kwasu nukleinow ego obejmujacy: a) otrzym anie w naczyniu przeplywowym, stalego ukladu nosnikowego ze zwia- zanym z nim jednoniciowym oligonukleotydem kom plem entarnym do specyficznej sekwencji docelowego kwasu nukleinowego, dluzszej niz wspomniany oligonukleotyd b) dodanie do stalego ukladu nosnikowego zródla jednoniciowego docelowego kwasu nukleinowego c) hybrydyzacje docelowego kwasu nukleinowego z oligonukleotydem d) przemyciu po hybrydyzacji dla usuniecia niezhybrydyzowanego docelowego kwasu nukleinowego e) przeprowadzenie manipulacji na sekwencji kwasu nukleinowego docelowego, unieruchomionego na nosniku, znamienny tym, ze manipulacja obejmuje wytwarzanie kopii oraz denaturacje lub hybrydyzacje jej z docelowym kwasem nukleinowym.Sposób przeprowadzania manipulacji na sekwencji kwasu nukleinowego PL PL PL PL

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu przeprowadzania manipulacji na sekwencjach kwasu nukleinowego przy użyciu stałego układu nośnikowego.

Znane są rozmaite sposoby manipulowania sekwencjami kwasu nukleinowego. I tak, na przykład, w EP-A-0 200 362 (Cetus) opisano proces prowadzony w fazie ciekłej, obejmujący amplifikację, detekcję i/lub klonowanie sekwencji kwasu nukleinowego. Proces ten obejmuje następujące etapy:

(i) poddanie oddzielnych komplementarnych nici sekwencji kwasu nukleinowego działaniu dwóch oligonukleotydowych starterów, z których każdy hybrydyzuje z jedną z nici;

(ii) wydłużenie starterów z utworzeniem sekwencji dwuniciowego kwasu nukleinowego;

(iii) denaturacja produktu pochodzącego z (ii) z utworzeniem pojedynczych nici kwasu nukleinowego, oraz (iv) użycie pojedynczych nici pochodzących z (iii) w powtórzeniu etapów (i) - (iii), przy czym całą tę procedurę powtarza się tyle razy, ile jest to potrzebne.

Cechą znamienną dotychczasowego stanu techniki w tej dziedzinie jest to, że obu komplementarnych nici używa się jako matryc w następnym i w dalszych etapach procesu amplifikacji. Dalej, w sposobie opisanym w EP-A-0 200 362, mieszanina substratów reakcji zawiera niezhybrydyzowany docelowy kwas nukleinowy, niezhybrydyzowaną kopię celu i niezhybrydyzowany starter, co czyni cały ten układ bardzo niewydajnym. Oprócz tego, jakikolwiek błąd, który może zdarzyć się przy replikowaniu w jakimkolwiek stadium, daje w rezultacie błąd replikowany w 'reakcję łańcuchową.

Techniki amplifikacji z zastosowaniem układów nośnikowych w fazie stałej także są znane, na przykład polegające na wykorzystaniu magnetycznych kuleczek DYNAL (znak towarowy), jak ujawniono w EP-A-0 091 453 i w EP-A-0 106 873. W przypadku użycia tego rodzaju kuleczek, DNA syntetyzowany jest na kulce magnetycznej, a następnie odszczepiany od niej działaniem wodorotlenku amonowego. Następnie kulki można oddzielić od zsyntetyzowanego DNA przy użyciu magnesu. Alternatywnie, do jednego z końców sekwencji syntetyzowanego lub naturalnego DNA można dodać biotynę i sekwencję odzyskać przy użyciu kulki magnetycznej uprzednio skoniugowanej ze streptawidyną (skłaniając przez to biotynę do odzyskania DNA). Problemem w przypadku tego rodzaju nośnika stałego jest to, że wiązanie biotyna-streptawidyna ulega degradacji w ustroju.

Do innych znanych stałych układów nośnikowych należą porowate krzemionki. Obecność porów może stwarzać problemy, ponieważ wzrost łańcucha nukleotydu odbywa się wewnątrz porów; co oznacza w rezultacie nieskuteczność przemycia i pozostawienie wewnątrz porów resztek, znów ze zmniejszeniem wydajności i doprowadzeniem do względnie niewydajnego sprzęgania.

W EP-A-0 184 056 opisano sposób wytwarzania w dużej skali sond DNA przy użyciu stałego podłoża. Sposób według tego wcześniejszego opisu obejmuje kowalencyjne wiązanie ze stałym podłożem polinukleotydu komplementarnego do sondy, którą ma się wytworzyć, a następnie hybrydyzację polinukleotydu z oligonukleotydem, który działa jako starter. Następnie oligonukleotyd wydłuża się w kierunku od substratu (przy użyciu polinukleotydu jako matrycy), w wyniku czego otrzymuje się wydłużoną sekwencję komplementarną do związanego polinukleotydu. Zhybrydyzowany polinukleotyd i wydłużony oligonukleotyd poddaje się następnie denaturacji, tak, by uwolnić wydłużony oligonukleotyd ze stałego podłoża w celu nagromadzenia. Wydłużonego oligonukleotydu można używać jako sondy analitycznej. I tak, na przykład, polinukleotydem pierwotnie związanym z nośnikiem może być gen, a oligonukleotydu wydłużonego można użyć jako sondy do wykrywania obecności tego genu w próbce biologicznej.

Istnieje jednak szereg wad związanych ze sposobem opisanym w EP-A-0 184 056. W szczególności, jeżeli polinukleotyd mający być związany z nośnikiem nie jest czysty i

171 810 zawiera inne polinukleotydy, wtedy zostaną one także związane z nośnikiem. W rezultacie, oligonukleotyd może hybrydyzować także z tymi innymi polinukleotydami tak, że ostatecznie otrzymany oligonukleotyd może w rzeczywistości stanowić mieszaninę różnych produktów. Stąd też, sposób ten nie jest szczególnie przydatny do wytwarzania czystych próbek kwasu nukleinowego.

Dlatego też, celem niniejszego wynalazku jest zapobieżenie zaistnieniu wyżej wspomnianych niekorzyści lub ich złagodzenie.

Przedmiotem obecnego wynalazku jest sposób przeprowadzania manipulacji na sekwencji kwasu nukleinowego obejmujący:

a) otrzymanie w naczyniu przepływowym, stałego układu nośnikowego ze związanym z nim jednoniciowym oligonukleotydem komplementarnym do specyficznej sekwencji docelowego kwasu nukleinowego, dłuższej niż wspomniany oligonukleotyd

b) dodanie do stałego układu nośnikowego źródła jednoniciowego docelowego kwasu nukleinowego

c) hybrydyzację docelowego kwasu nukleinowego z oligonukleotydem

d) przemycie po hybrydyzacji i usunięcie niezhybrydyzowanego docelowego kwasu nukleinowego

e) przeprowadzenie manipulacji na sekwencji kwasu nukleinowego docelowego, unieruchomionego na nośniku, przy czym istotą wynalazku jest że manipulacja obejmuje wytwarzanie kopii oraz denaturację lub hybrydyzację jej z docelowym kwasem nukleinowym.

Manipulację korzystnie stanowi replikowanie co najmniej części sekwencji docelowego nukleinowego unieruchomionego na nośniku. Korzystnie z nośnikiem wiąże się koniec 5'-oligonukleotydu. Korzystnie replikację prowadzi się z wytworzeniem kopii celu związanej z nośnikiem. Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje etapy denaturacji docelowego kwasu nukleinowego z celu i przemywanie dla usunięcia docelowego kwasu nukleinowego. Dodatkowo prowadzi się co najmniej jedną reakcję replikacji na kopii celu związanej z nośnikiem. Korzystnie z nośnikiem wiąże się koniec 3'-oligonukleotydu. Korzystnie replikacja obejmuje sekwencjonowanie docelowego kwasu nukleinowego. Korzystnie manipulacja obejmuje hybrydyzację znakowanej sondy, z docelowym kwasem nukleinowym hybrydyzowanym z nośnikiem. Sposób według wynalazku dodatkowo obejmuje etapy przemywania układu stałego nośnika dla usunięcia niezhybrydyzowanej sondy, obróbkę nośnika w warunkach, w których sonda będzie usuwana z nośnika i testowanie na obecność znacznika. Sposób obejmuje także przemywanie nośnika dla usunięcia niehybrydyzowanej sondy, prowadzenie co najmniej jednej reakcji replikacji docelowego kwasu nukleinowego z użyciem znakowanej sondy jako startera i testowanie na obecność znakowanego amplifikowanego produktu.

W sposobie według wynalazku stosuje się układ nośnika w postaci cząstek stałych, korzystnie nieporowatych. Korzystnie stosuje się nośnik zawierający cząstki o wielkości 100-200 /^m.

Korzystnie jako nośnik stosuje się krzemionkę, zwłaszcza nośnik o usieciowanej matrycy siloksanowej z którą związany jest oligonukleotyd.

Powyższym sposobem otrzymuje się docelowy kwas nukleinowy selektywnie zhybrydyzowany z oligonukleotydem na nośniku. Jakiekolwiek zanieczyszczenia., które obecne są w układzie (na przykład wprowadzone w próbce zawierającej docelowy kwas nukleinowy) usunąć można za pomocą przemywania, z pozostawieniem czystej próbki docelowego kwasu nukleinowego, na której można przeprowadzać manipulację. Przemycie można wykonać w temperaturze, w której docelowy kwas nukleinowy nie wytapia oligonukleotydu.

Docelowym kwasem nukleinowym może być, na przykład, oczyszczony lub nie oczyszczony, natywny lub zsyntetyzowany kwas nukleinowy. Celem może być dowolna sekwencja DNA lub RNA, pochodzenia wirusowego, bakteryjnego, zwierzęcego lub roślinnego.

Oligonukleotyd związany z nośnikiem zawiera, na ogół, co najmniej 8 nukleotydów. Typowo, polinukleotyd, który ma być poddany hybrydyzacji z nośnikiem, zawiera 100o - 200θ zasad i jest znacznie dłuższy niż oligonukleotyd.

171 810

Oligonukleotyd można związać z nośnikiem na drodze reakcji zachodzącej między odpowiednimi grupami chemicznie czynnymi obecnymi w nośniku i w oligonukleotydzie. Alternatywnie, oligonukleotyd można syntetyzować in situ na nośniku.

Oligonukleotyd można związać ze stałym nośnikiem w orientacji 3' - 5' lub 5' - 3'.

Jakiekolwiek grupy zabezpieczające występujące w oligonukleotydzie usuwa się przed etapem hybrydyzacji (c).

W sposobie według wynalazku jednoniciowy docelowy kwas nukleinowy hybrydyzuje się z oligonukłeotydem związane z nośnikiem. Sekwencja oligonukleotydów jest wysoce specyficzna wobec celu, który ma być zhybrydyzowany. W wyniku tego, hybrydyzację prowadzi się w temperaturze, która jest wybitnie specyficzna dla procesu hybrydyzacji zachodzącej między oligonukleotydem a celem. Hybrydyzacja docelowego kwasu nukleinowego z oligonukleotydem na nośniku w sposób idealny dokonywana jest w temperaturze poniżej (na przykład 1 - 3°C poniżej) temperatury (Tm), w której docelowy kwas nukleinowy wytapia oligonukleotyd. Ogólną zasadą jest, że Tm można obliczyć z następującego podstawowego wzoru, znanego w tej dziedzinie technild :

Tm = 2 (A + T) + 3 (G + C) w którym A, T, G i C oznaczają, odpowiednio, liczbę reszt adeniny, tyminy, guaniny i cytozyny obecnych w oligonukleotydzie związanym z nośnikiem. Zazwyczaj, wzór ten nadaje się do wykorzystania w przypadku sekwencji zawierających nie więcej niż około 30 nukleotydów. Po etapie hybrydyzacji, nośnik można przemyć w temperaturze nieco niższej niż Tm, w wyniku czego usuwa się jakąkolwiek ilość niezłączonego celu i zanieczyszczeń (na przykład białek lub niepożądanych sekwencji kwasu nukleinowego). Tak więc możliwe jest dodanie do stałego układu nośnikowego mieszaniny polinukleotydów (takiej, jaka może się znajdować w próbce biologicznej), jednakże tylko konkretny polinukleotyd, o który w danym przypadku chodzi (to znaczy cel) zostaje zatrzymany na nośniku. Stąd też, po przemyciu, manipulacje na polinukleotydzie przeprowadzić można przy użyciu jego czystej próbki.

Kolejne manipulacje przeprowadzić można na zhybrydyzowanym docelowym kwasie nukleinowym. Alternatywnie, dokonać można manipulacji wstępnej w celu wytworzenia kopii celu związanego z nośnikiem. Kopii tej można następnie użyć do dalszych operacji manipulowania.

Między każdymi manipulacjami nośnik można przemyć, w miarę potrzeby, w celu usunięcia zanieczyszczeń, po czym, jeżeli jest to wymagane, produkt można nagromadzić. Po dalszym przemyciu nośnika (jeśli jest to potrzebne) powtórzyć można manipulację.

Manipulacja może obejmować, na przykład, replikowanie, amplifikowanie sekwencji docelowego kwasu nukleinowego, in vitro transkrypcję lub oczyszczanie białek wiążących DNA. Manipulacja także może służyć wykrywaniu obecności celu za pomocą badania pod względem hybrydyzacji znakowanego startera z celem.

Manipulacje na sekwencji polinukleotydu przeprowadzać można z wykorzystaniem sposobów postępowania znanych w tej dziedzinie techniki. I tak, na przykład, do użycia w procesach manipulacji (opisanych w poniższej części niniejszego opisu) nadaje się polimeraza DNA I, otrzymane z niej fragmenty Klenowa, polimeraza termostabilna lub odwrotna transkryptaza, wraz z trifosforanami deoksynukleotydów i/lub trifosforanami dideoksynukleotydów. Jeżeli jest to pożądane, nukleotydy mogą być znakowane, na przykład przy użyciu takich znaczników jak ³⁵S, ³²P, chromofory, biotyna, peroksydaza, fosfataza czy jakikolwiek inny znacznik biologiczny z wyboru.

Sposób według wynalazku jest szczególnie użyteczny w przypadku analizy próbek (na przykład próbek medycznych) pod względem wykrycia obecności (czy w innym sensie) konkretnego kwasu nukleinowego. Jeżeli, na przykład, próbkę poddaje się badaniu pod względem takiego stanu zdrowia, w którym występuje względnie duża ilość konkretnego kwasu nukleinowego (celu), wtedy detekcji docelowego kwasu nukleinowego dokonać można w sposób następujący. Po zhybrydyzowaniu celu (jeżeli jest obecny) z nośnikiem i po przemyciu tego ostatniego w celu pozostawienia czystej próbki celu, do nośnika dodaje się znakowany starter oligonukleotydowy, o którym wiadomo, że jest komplementarny do

171 810 sekwencji w celu, w warunkach, w których starter będzie hybrydyzował z celem. Znacznikiem może być w tym przypadku znacznik promieniotwórczy, chromofor lub enzymatycznie związany substrat reakcji. Następnie nośnik przemywa się w celu usunięcia niezłączonego startera, przy czym przemywania dokonuje się w temperaturze niższej od tej temperatury, w której starter zhybrydyzowany z docelowym kwasem nukleinowym zostaje wytopiony z celu. Następnie temperaturę nośnika można podwyższyć tak, aby wytopić zhybrydyzowany starter (albo z docelowym DNA, albo bez niego). Następnie można posłużyć się detektorem w celu wykrycia obecności startera. Jeżeli zostanie wykryty starter, to fakt ten potwierdza obecność docelowego kwasu nukleinowego w próbce.

Jeżeli, natomiast, przypuszcza się, że próbka zawiera jedynie względnie niewielką ilość docelowego kwasu nukleinowego, wtedy można przeprowadzić powtórne reakcje amplifikacji (przy czym każda z nich daje znakowane kopie amplifikowanego produktu, jeżeli początkowo przewidywany cel rzeczywiście był obecny). Następnie można przeprowadzić operację detekcji w celu ustalenia, czy doszło do utworzenia znakowanego produktu amplifikacji. Jeżeli tak, stanowi to potwierdzenie, że początkowo przewidywany cel był obecny. Należy oczywiście zaznaczyć, że wykonać można każdą pożądaną ilość amplifikacji, tak, że test ten można uczynić bardzo czułym w sensie zdolności do ustalania obecności bardzo małych ilości celu w próbce pierwotnej.

Znaczącą cechą znamienną wynalazku jest to, że detekcję obecności celu w pierwotnej próbce uzyskać można bez potrzeby stosowania rozdzielania produktów na żelach.

Szczególnie korzystne w niniejszym wynalazku jest wprowadzanie nośnika do naczynia przepływowego (takiego jak, na przykład, kolumna), które ułatwia przemywanie nośnika jak również późniejszą manipulację, jak będzie można zdać sobie z tego sprawę na podstawie następującego dalej opisu.

Zastosowanie naczynia przepływowego stanowi ważną cechę wynalazku. Naczynie przepływowe posiada wlot i wylot i zawiera stały układ nośnikowy ze związanym z nim jednoniciowym oligonukleotydem komplementarnym do specyficznej sekwencji docelowego kwasu nukleinowego.

Omawiane naczynie może mieć wielkość, na przykład, 150 - 250 μΐ.

Manipulację można przeprowadzić z zastosowaniem aparatu (w którym umiejscowione jest naczynie przepływowe) przeznaczonego do dostarczania roztworów substratów reakcji do naczynia przepływowego i do nagromadzania i detekcji produktu manipulacji.

Aparat do przeprowadzania manipulacji na sekwencji kwasu nukleinowego, składa się z :

- naczynia przepływowego,

- urządzenia zbiornikowego do przechowywania roztworów, usuwanych z naczynia podczas przemywania lub innych czynności, przed zawróceniem ich do kolumny,

- urządzenia do wykrywania produktów otrzymywanych w rezultacie manipulowania kwasem nukleinowym, oraz

- urządzenia sterującego do kierowania roztworów do naczynia i z naczynia, do miejsc zbierania odpadów lub przechowywania oraz do urządzeń detektorowych.

W korzystnym rozwiązaniu konstrukcji aparatu, wylot z naczynia może w sposób selektywny komunikować się z (i) miejscem przechowywania odczynników, (ii) miejscem detekcji produktu manipulacji oraz (iii) ujściem odpadów. Obecność miejsca gromadzenia odczynnika umożliwia roztworowi odczynnika, początkowo wprowadzonemu do naczynia przez jego wlot, przemieszczenie się do niego w celu następującego potem zawrócenia tego roztworu do naczynia, w przypadku gdy mają być przeprowadzone powtórzenia manipulacji na tym samym docelowym kwasie nukleinowym (lub na jego kopii). Produkt pochodzący z każdej operacji manipulacji można następnie przepuścić do miejsca detekcji w celu wykonania detekcji. Jeżeli jest to pożądane, aparat można tak skonstruować, że produkty pochodzące z kolejnych manipulacji można gromadzić przed przepuszczeniem ich do detektora.

171 810

Oczywiście, aparat wyposażony jest w stosowny układ zaworów (takich jak, na przykład, zawory elektromagnetyczne) dla umożliwienia ruchu roztworów, produktów itd. (korzystnie pod ciśnieniem gazu) w aparacie.

Stały nośnik może zawierać nieporowate cząstki o wielkości 100 do 200 μ m. Zastosowanie materiału nieporowatego jest szczególnie korzystne z tego względu, że dzięki niemu unika się niektórych problemów związanych z użyciem nośników porowatych, stosowanych w dotychczasowym stanie techniki. Chodzi tu mianowicie o to, że wzrost łańcucha nukleotydu odbywa się wewnątrz porów', co prowadzi do nieskuteczności przemycia i do pozostawiania wewnątrz porów resztek, co oznacza obniżenie wydajności i daje w wyniku względnie niewydajne sprzęganie. Nośnik mogą stanowić kalcynowane cząstki kuliste o średnicy 100 do 200 μ m. I tak, na przykład, nośnikiem może być nieporowaty żel krzemionkowy.

Nośnik może zawierać grupy chemicznie czynne (takie jak, na przykład, grupy epoksy) przeznaczone do unieruchamiania na nim sekwencji oligonukleotydów.

Korzystnie, nośnik posiada usieciowaną matrycę siloksanową z grupami chemicznie czynnymi, które można wykorzystać do otrzymania unieruchomionego oligonukleotydu na nośniku. Tego rodzaju nośnik także stanowi ważną cechę znamienną wynalazku i zgodnie ze swą czwartą cechą charakterystyczną, wynalazek dotyczy stałego układu nośnikowego przeznaczonego do unieruchamiania sekwencji kwasu nukleinowego, w którym wspomniany nośnik posiada usieciowaną matrycę siloksanową z grupami chemicznie czynnymi, które można wykorzystać do otrzymania unieruchomionego kwasu nukleinowego na nośniku.

Sposób wytwarzania, nośnika przeznaczonego do unieruchamiania sekwencji kwasu nukleinowego, polega na tym, że poddaje się stały nośnik zawierający wolne grupy hydroksylowe reakcji z prekursorem matrycy siłoksanowej, który reaguje ze wspomnianymi wolnymi grupami hydroksylowymi, a także zawiera grupę, którą można wykorzystać do unieruchomienia na nośniku sekwencji kwasu nukleinowego, i ogrzewa się otrzymany produkt reakcji z utworzeniem matrycy siloksanowej.

Zastosowanie matrycy siloksanowej jest szczególnie korzystne, a to ze względu na jej stabilność w warunkach kwasowych i zasadowych. Stanowi to kontrast z nośnikami z dotychczasowego stanu techniki, w przypadku których występuje włączenie wiązania biotyna-streptawidyna, ulegającego degradacji w ustroju. Matryca siloksanowa umożliwia przeprowadzanie manipulacji w szerokim zakresie, przy czym nie dochodzi do usuwania oligonukleotydu z nośnika. I tak, na przykład, do odblokowania oligonukleotydu użyć można amoniaku jako stosownego odczynnika, przy czym oligonukleotyd pozostaje na nośniku. Normalnie stosowane wiązania z udziałem kwasu bursztynowego, używane do unieruchamiania oligonukleotydu, są nietrwałe w warunkach zasadowych, co powoduje, że oligonukleotyd opuszcza nośnik.

Korzystną grupą chemicznie czynną, której można użyć do unieruchamiania sekwencji kwasu nukleinowego, jest grupa epoksy.

Jeżeli jest to pożądane, wolne grupy hydroksylowe obecne w nośniku można zasłonić, na przykład z wykorzystaniem chlorosilanu, po reakcji z prekursorem matrycy siloksanowej, ale przed utworzeniem usieciowanej matrycy siloksanowej.

Korzystnie, prekursorem matrycy siloksanowej jest związek glicydoksy o wzorze : (RO )₃ - Si - R¹ - o - CH2 - CH - CH2

H / o

w którym R oznacza grupę alkilową o 1 do 4 atomów węgla, a R1 oznacza grupę alkilenową. Najkorzystniej R oznacza grupę metylową, a R1 oznacza -(CH2) 3-.

Oligonukleotyd syntetyczny może być kowalencyjnie związany z nośnikiem poprzez grupę epoksy. Alternatywnie, z nośnikiem można związać sól sodową nukleotydu w sposób kowalencyjny i syntezę oligonukleotydu (przy użyciu fosfoamidytu /1-cyjjinoetylu) prowadzić w dalszym ciągu.

Wynalazek zostanie w poniższej części opisu opisany przykładowo tylko w odniesieniu do załączonych rysunków, które przedstawiają co następuje:

171 810

Figura 1 jest diagramem przedstawiającym zasadę wynalazku.

Figura 2 przedstawia przekrój wzdłużny przepływu przez kolumnę zawierającą układ oligo-stały nośnik.

Figura 3 objaśnia drogę reakcji prowadzącej do otrzymania stałego nośnika przeznaczonego do unieruchamiania oligonukleotydu.

Figura 4a i Figura 4b pokazują diagramy przedstawiające stały układ nośnikowy i reakcje zaangażowane w wiązaniu z nim oligonukleotydu.

Figura 5a - 5d pokazuje diagramy przedstawiające etapy amplifikacji docelowego kwasu nukleinowego.

Figura 6 objaśnia konstrukcję aparatu przeznaczonego do przeprowadzania manipulacji według wynalazku, oraz

Figura 7 jest autoradiogramem przedstawiającym wyniki otrzymane w przykładzie 3.

Odnośnie do fig. 1, przedstawiono na niej (w bardzo powiększonej skali) dużą ilość cząstek 1 z których składa się materiał stałego nośnika, przy czym każda z nich ma unieruchomioną na sobie pewną liczbę identycznych sekwencji oligonukleotydów 2, które są specyficzne dla sekwencji jednoniciowego docelowego kwasu nukleinowego 3 zawartej w próbce 4, która także obejmuje niepożądane zanieczyszczenia (takie jak, na przykład, inne sekwencje kwasu nukleinowego, białka itd.), jak to przedstawiono trójkątami 5.

Próbkę 4 dodaje się do nośnika 1 w warunkach hybrydyzacji tak, że część sekwencji kwasu nukleinowego 3 wiąże się z oligonukleotydem, pozostawiając niezhybrydyzowany kwas 3 razem z zanieczyszczeniami 5 w fazie ciekłej. W trakcie następującego potem przemywania, niezhybrydyzowany kwas 3 łącznie z zanieczyszczeniami 5 zostaje usunięty z nośnika 1, jak pokazano, pozostawiając czystą próbkę docelowego kwasu nukleinowego 3 związaną z nośnikiem.

Szczególnie korzystne jest to, że cząstki 1 utrzymywane są w obrębie przepływu przez kolumnę 6 (patrz fig. 2) wyposażoną w zawory wlotowy i wylotowy 7 i 8, jak pokazano, jak również w grzejnik 9. Cząstki można utrzymać wewnątrz kolumny przez zastosowanie elementów porowatych 10. Dla wygody, cząstki narysowane na fig. 2 przedstawiono tak, jak gdyby miały unieruchomioną na sobie tylko jedną sekwencję oligonukleotydu.

Docelowy kwas nukleinowy wprowadza się do przepływu przez kolumnę poprzez zawór wlotowy 7, w stosunku ilościowym, na przykład, oligonukleotyd : cel 1000 : 1, w stosownym buforze, takim jak, na przykład, wysokosolny bufor do hybrydyzacji i hybrydyzację prowadzi się w warunkach specyficznych dla oligonukleotydu związanego z nośnikiem i docelowego kwasu nukleinowego. W przypadku, gdy źródłem docelowego kwasu nukleinowego jest dwuniciowy DNA, wpierw rozdziela się go na pojedyncze nici zwykłymi metodami, albo przed wprowadzeniem go do kolumny, albo gdy już się w niej znajduje.

Próbkę 4 utrzymuje się w kolumnie dzięki temu, że zawór wylotowy 8 jest zamknięty. Po etapie hybrydyzacji, niepożądane zanieczyszczenia 5 (które nie są unieruchomione na nośniku) można usunąć za pomocą przemycia (przy otwartym zaworze 8), z pozostawieniem czystej próbki docelowego kwasu nukleinowego na nośniku.

Sposób, w jaki wytwarza się stały nośnik (wraz z unieruchomionym oligonukleotydem), pokazano na figurach 3-5. Odnosząc się wpierw do fig. 3, przedstawia ona jeden z wariantów drogi reakcji prowadzącej do otrzymania nośnika z grupami chemicznie czynnymi, na którym można unieruchomić oligonukleotyd.

Proces rozpoczyna się od cząstek żelu krzemionkowego (I) z grupami hydroksylowymi na powierzchni, jak pokazano. W pierwszym stadium reakcji, cząstki poddaje się działaniu 3-glicydoksypropylotrimetoksysilanu (II), na przykład w temperaturze nie przekraczającej 95°C w ciągu 2 godzin w atmosferze azotu. W wyniku, zachodzi reakcja kondensacji, w której reszty związku (II) zostają związane z cząstką krzemionki (I) z utworzeniem produktu przedstawionego jako (III). Aczkolwiek rysunek pokazuje jedynie dwie reszty związane z cząstką krzemionki, jest to uproszczenie wprowadzone wyłącznie dla przejrzystości i w praktyce z cząstką krzemionki związanych będzie znacznie więcej reszt. Typowo, poziom wiązania (I) wynosi około 40 - 45 mikromoli (I) na gram krzemionki.

171 810

Następnie produkt (III) przemywa się kolejno suchym toluenem, suchym metanolem i suchym eterem.

Następny etap obejmuje ogrzewanie produktu w celu spowodowania usieciowania reszt. Typowo reakcję sieciowania przeprowadza się w temperaturze 110°C w ciągu co najmniej 2 godzin. Otrzymany produkt wygląda tak, jak to pokazano przy (IV) i z rysunku widać, że atomy krzemu łączą się ze sobą poprzez atomy tlenu.

Wolne grupy hydroksylowe pozostające na powierzchni cząstki krzemionki można, jeżeli jest to pożądane, zasłonić chlorosilanem. Środkiem zasłaniającym może być, na przykład, trimetylochlorosilan, przy czym reakcję prowadzi się w środowisku pirydyny w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej. Po zasłonięciu, nośnik można poddać powyżej opisanej operacji przemywania.

Tak otrzymany nośnik ma wolne grupy epoksy, które można wykorzystać do unieruchomienia oligonukleotydu.

Jest rzeczą możliwą, na przykład z zastosowaniem znanych sposobów postępowania, syntetyzowanie oligonukleotydu in situ na nośniku, przy czym oligonukleotyd jest komplementarny do specyficznej sekwencji na docelowym kwasie nukleinowym. I tak, sól sodową zabezpieczonego grupą dimetoksytritylową (DMT) nukleotydu można poddać reakcji z nośnikiem, przy czym ugrupowanie -O' w pozycji 3' nukleotydu reaguje z wolną grupą epoksy, w wyniku czego tworzy się produkt (V). Sól sodową można wytworzyć z DMT-nukleotydu (wysuszonego nad P2O5) za pomocą rozpuszczenia w suchym DMF, z utrzymywaniem roztworu w atmosferze bezwodnej, a następnie dodania wodorku sodowego. Następnie wodorek sodowy odsącza się z pozostawieniem soli sodowej.

Po usunięciu grupy zabezpieczającej DMT przeprowadza się syntezę pożądanego oligonukleotydu z pojedynczych nukleotydów z zastosowaniem znanych sposobów postępowania w syntezie oligonukleotydów.

Alternatywnie, możliwe jest związanie z nośnikiem uprzednio zsyntetyzowanego oligonukleotydu (komplementarnego do specyficznej sekwencji docelowego kwasu nukleinowego i, korzystnie, także zawierającego miejsce rozszczepienia andonukłeazy restrykcyjnej).

Dostępnych jest szereg syntetycznych oligonukleotydów, komplementarnych do pewnej liczby sekwencji docelowego kwasu nukleinowego, których można użyć jako sond do badania obecności niektórych bakterii, wirusów, pasożytów itp. (patrz dodatek A). Jako konkretny przykład można podać, że wynalazek można zastosować, na przykład, do wykrywania następujących indywiduów, w przypadku których podane poniżej sekwencje oligonukleotydów będą unieruchamiane na nośniku :

Wirus Epsilon Bar GAC AAC TCG GCC GTG ATG GA

Toxoplazma gondii GGA ACT GCA TCC GTT GAT GAG

Trypanosoma brucei brucei CGA ATG AAT ATT AAA CAA TGC GCA G

Oligonukleotyd można związać z nośnikiem albo w orientacji 3' - 5', albo w orientacji 5' - 3'. Związanie w orientacji 3' - 5' można osiągnąć na drodze reakcji grupy epoksy nośnika z Pierwszorzędową grupą hydroksylową soli sodowej nukleotydu /na przykład nukleotyd tymidynowy/dimetoksytritylodeoksyrybonukleozyd/dT/ /patrz fig. 4a//, w wyniku czego tworzy się wiązanie trwałe zarówno w warunkach kwasowych jak i zasadowych, inaczej niż w przypadku aktualnie stosowanych grup wiążących.

Związanie w orientacji 5' - 3' uzyskać można w sposób następujący (patrz także fig. 4b). 5'-jodo-5' - deoksytymidynę poddaje się reakcji z trifenylometylomerkaptylem sodowym w środowisku DMF z utworzeniem związku S-tritylowego. Związek ten w dalszym ciągu reaguje z diizopropyloaminotetrazolidem i 2-cyjjinoetoksy-bis-/N,N-dnzopropyloamino/fosfoamidytem w środowisku DCM, w wyniku czego tworzy się pochodna β-cyjanowa. Grupę C-tritylową usuwa się na drodze reakcji redukcji z wykorzystaniem metod znanych w tej dziedzinie techniki [Connolly, Nucleic Acid Research, 13, 12, 1985; Chu, Nucleic Acid Research, 16, 9 (1988); Guar, Nucleic Acid Research, 17, 11 (1989)] przed związaniem z nośnikiem podstawionym grupą epoksy, stosując wodorek sodowy. Inne sposoby wytwarza10 nia oligonukleotydów przeznaczonych dowiązania się w orientacji 5' - 3' są znane [Anisorge, Nucleic Acid Research, 15, 11 (1987); Sproat, Nucleic Acid Research, 15, 12 (1987); Zuckerman, Nucleic Acid Research, 13, 5305 (1987); Verheyden, JOREGA CHEM, 35. 2319 (1979)], aczkolwiek wykaz ten nie jest wyczerpujący i jakiejkolwiek innej metody, oczywistej dla fachowców w tej dziedzinie techniki, można użyć w celu wytworzenia oligonukleotydów, albo w orientacji 3' -5' albo w orientacji 5' -3'wiążących się ze stałym układem nośnikowym według niniejszego wynalazku.

W przypadku, gdy oligonukleotyd zawiera grupy zabezpieczające, co wiąże się z reakcją syntezy, takie jak grupy butylowe i izopropylowe dla zasad (G, A, C) 3' - 5'-oligonukleotydów oraz grupy /J-cyjanoetylowe dla 5' - 3'-oligonukleotydów, muszą one zostać po zakończeniu syntezy usunięte. Układ oligo-stały nośnik można ogrzewać do temperatury 55°C w ciągu 2 godzin w 38% NH4OH w celu wyeliminowania grup zabezpieczających, w wyniku czego otrzymuje się odblokowany oligonukleotyd.

Przykładem manipulacji odpowiedniej dla układu tego rodzaju jest amplifikacja sekwencji docelowego kwasu nukleinowego.

Figury 5a - c przedstawiają diagramy odnoszące się do etapów występujących w metodach amplifikacji w zależności od pozycji miejsca startera, orientacji oligonukleotydu (to znaczy 3' - 5' lub 5' - 3'), a stąd sekwencji docelowego kwasu nukleinowego, oraz od obecności jednej lub dwu sekwencji oligonukleotydu (to jest oligonukleotydów z odwrotną orientacją). Te wprowadzone etapy amplifikacji są znane, na przykład dodanie startera, wydłużenie startera, dodanie drugiego startera dla zreplikowania kopii celu itd.

W wariancie objaśnionym na fig. 5a, koniec 5' oligonukleotydu można związać z nośnikiem i manipulację może stanowić wtedy amplifikacja docelowego kwasu nukleinowego, który jest zhybrydyzowany z oligonukleotydem. W takim przypadku, oligonukleotyd może służyć jako starter, względnie z oligonukleotydem można zligować osobny starter 11, jeszcze przed etapem hybrydyzacji. W obu tych przypadkach syntetyzowany jest produkt wydłużenia startera 12 (przy użyciu docelowego kwasu nukleinowego jako matrycy) od startera do końca docelowego kwasu nukleinowego. W ten sposób otrzymuje się sekwencję kwasu nukleinowego związaną z nośnikiem i komplementarną do docelowego kwasu nukleinowego. Dla wygody, komplementarną sekwencję określa się w niniejszym opisie jako kopię celu.

Następnie nośnik można przemyć i nici zhybrydyzowanego kwasu nukleinowego (to znaczy cel i kopię celu) można w dalszym ciągu poddać denaturacji, z zastosowaniem technik dobrze znanych w tej dziedzinie wiedzy (takich jak, na przykład, ogrzewanie w określonej temperaturze), w wyniku czego pozostaje tylko kopia celu związana ze stałym nośnikiem (poprzez oligonukleotyd). Dla wygody, w dalszej części niniejszego opisu stały nośnik ze związanym z nim oligonukleotydem określa się jako oligo-stały nośnik.

Układ nośnikowy można przemyć i kopii celu, która na nim pozostaje, użyć można do syntezy dalszych ilości wyjściowego kwasu nukleinowego. Synteza taka obejmować będzie hybrydyzację startera 13 z kopią celu, przemycie nośnika w celu usunięcia niezhybrydyzowanego startera, przeprowadzenie wydłużenia startera (przy czym kopia celu służy za matrycę), a następnie denaturację i nagromadzenie zsyntetyzowanej sekwencji kwasu nukleinowego 14. Proces ten można powtarzać tyle razy ile trzeba, dzięki czemu, w rezultacie, wyjściowy kwas nukleinowy zamphfikować można w żądanym zakresie. Należy zdawać sobie sprawę z tego, że we wszystkich etapach amplifikacji używa się tego samego kompletu cząsteczek kopii celu.

Sposób postępowania objaśniony na fig. 5a nadaje się w sposób szczególny do wykrywania obecności nieznacznych ilości docelowego kwasu nukleinowego w próbkach medycznych. Starter 13 można oznakować z wykorzystaniem znanych metod i operację detekcji wykonuje się tak, aby wykryć odpowiednio znakowaną sekwencję kwasu nukleinowego 14. W przypadku, gdy wykryty zostanie znacznik, stanowi to potwierdzenie, że w pierwotnej próbce obecny był docelowy kwas nukleinowy 3.

171 810

Modyfikację sposobu postępowania opisanego odnośnie do fig. 5a stanowi proces, w którym dwuniciowy kwas nukleinowy zawierać może miejsce restrykcyjne (na przykład dostarczone przez starter ligowany do oligonukleotydu), i w którym można użyć odpowiedniego enzymu restrykcyjnego do odszczkpikkin dwuniciowej cząsteczki od nośnika.

W alternatywnym wariancie sposobu realizacji wynalazku (patrz fig. 5b), w którym koniec S^ligonukleotydu jest związany z nośnikiem, manipulacja może obejmować sekwenzhyboydyzowakkgo docelowego kwasu nukleinowego z zastosowaniem standardowej metodologii (na przykład metoda sekwencjonowania DNA Sangera). Tak więc, starter l5 można zhybrydyzować z docelowym kwasem nukleinowym (któryjest zhybrydyzowany z oligonukleotydem na nośniku). Starterem musi być w tym przypadku taki starter, który będzie hybrydyzować z celem w takiej temperaturze, w której ten ostatni nie wytapia oligonukleotydu. Następnie przeprowadza się reakcję syntezy nici przy użyciu mieszaniny 4 deoksynukleotydów (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) łącznie z pojedynczym didkoksykuklkotydem. Synteza biegnie w kierunku 5' - 3' od startera do oligonukleotydu. Reakcję przeprowadza się cztery razy, za każdym razem stosując odmienny dSdkoksykuklkotyd. Jak jest to dobrze znane, obecność dideoksynukleotydu powoduje to, że otrzymuje się sekwencje kwasu nukleinowego o różnej długości, jak to przedstawiono liniami przerywanymi. Produkty tych czterech reakcji rozwijają się równolegle na stosownym żelu i na podstawie pozycji pasm na czterech torach określa się sekwencję. Ten szczególny wariant sposobu realizacji wynalazku nadaje się zwłaszcza do wykrywania mutacji punktowych w kwasie nukleinowym (dostarczonym, na przykład, jako próbka medyczna), na zasadzie porównania otrzymanej sekwencji z sekwencją próbki kontrolnej, o której wiadomo, że ma sekwencję normalną.

Wariant sposobu realizacji wynalazku, w którym koniec 3' oligonukleotydu jest związany z nośnikiem można także zastosować do amplifikowania sekwencji docelowego kwasu nukleinowego. Tak jak w powyżej opisanym przypadku skkwkkcjokownkin, starter można zhybrydyzować z docelowym kwasem nukleinowym. Starterem musi być w tym przypadku taki starter, który będzie hybrydyzować z kwasem w temperaturze niższej od temperatury, w której cel wytapia oligonukleotyd. Wydłużenia startera dokonuje się następnie w znanych warunkach, przy czym wydłużenie to rozwija się w kierunku, i aż do, oligonukleotydu. Tak otrzymany produkt stanowiący kopię można następnie wytopić z docelowego kwasu nukleinowego w takich warunkach, aby pozostawić ten ostatni w stanie zhybrydyzowanym z nośnikiem do wykorzystania w dalszych reakcjach amplifikacji.

We wszystkich powyżej opisanych reakcjach amplifik^ji, z oligo-stałym nośnikiem pozostaje związana ta sama matryca i używa się jej w dalszych reakcjach amplifikacji. W znaczący sposób odróżnia to korzystnie niniejszy wynalazek od opisów metod ujawnionych w EP-A-0 200 362, ponieważ, w tym ostatnim przypadku, jako matryc używa się obu nici docelowego kwasu nukleinowego i po skopiowaniu, wszystkie docelowe nici i skopiowane nici stosuje się jako matryce w drugim etapie amplifikacji i w etapach dalszych. W ten sposób może zdarzyć się błąd w kopiowaniu w jakimkolwiek stadium i błąd ten zostanie replikowany w reakcję łańcuchową.

Niniejszy wynalazek pozwala uniknąć tego problemu albo przez przyjęcie jednego stadium replikacji i utrzymanie tej kopii wszystkich przyszłych amplifikacji, albo przez utrzymanie pierwotnej sekwencji docelowej dla wszystkich amplifikacji. Niniejszy wynalazek zapewnia także wyższą wydajność niż sposób opisany w EP-A-0 200 362, ponieważ w sposobie według wynalazku kikzhyboydyzownkk startery oraz sekwencje celu lub kopii zostają usunięte z układu przez wymycie, podczas gdy we wspomnianym opisie niezhybiydyzowany cel, starter i produkt replikacji występują w układzie, powodując, że metoda jest ^wydajna.

Zgodnie z jeszcze dalszym wariantem sposobu realizacji wynalazku (patrz fig. 5c), wprowadzić można dwa startery komplementarne do różnych fragmentów celu lub kopii celu, albo w orientacji 5' - 3' albo w orientacji 3' - 5'. Można je wprowadzić albo w orientacji 5' - 3' albo w orientacji 3' - 5' i można je wykorzystać do skontrolowania sekwencji pod względem obecności mutacji punktowych w sposób znany w tej dziedzinie

171 810 techniki (reakcja łączenia z udziałem ligazy DNA). W badaniu tym zazwyczaj używa się starterów znakowanych, a test ten stosowany jest do szybkiej diagnozy albo, na przykład, do stwierdzenia mutacji genu supresorowego guza P53, ponieważ 75% chorych na raka okrężnicy wykazuje w tym genie punkt delecji.

Na podstawie powyższego opisu należy zdać sobie sprawę z tego, że sposób według wynalazku różni się od sposobów znanych tym, że układ nośnikowy w fazie stałej oraz aparat według niniejszego wynalazku umożliwiają uzyskiwanie większej efektywności i wydajności amplifikowanego kwasu nukleinowego. Wynika to z możliwości prowadzenia procesu etapami. Kolumnę po każdej hybrydyzacji można przemyć w celu wyeliminowania niezhybrydyzowanego DNA itd. i wycszyszczenia układu, co w wysokim stopniu przyczynia się do polepszenia wydajności. Składniki roztworu reakcyjnego w kolumnie, a mianowicie nowo zamplifikowaną sekwencję docelową, można skierować bezpośrednio do detektora, takiego jak komórka optyczna, połączonego z kolumną, a dzięki temu szybko potwierdzać obecność lub nieobecność sekwencji docelowej. Nadaje się to szczególnie do zastosowania przy diagnozowaniu próbek pobranych od pacjentów, w celu zbadania obecności jakiegoś powodującego chorobę organizmu w próbce. Jak dotychczas, szybki i niezawodny sposób dokonywania tego nie był dostępny.

Dalszy sposób realizacji wynalazku (który nie obejmuje amplifikacji) objaśniony jest na fig. 5d i nadaje się on do testowania próbek pod względem obecności (lub w innym sensie) względnie dużych ilości docelowego kwasu nukleinowego. W wariancie sposobu realizacji wynalazku przedstawionym na fig. 5d, do układu nośnikowego wprowadza się znakowany starter 16, przy czym starterem jest taki starter, który będzie hybrydyzować z docelowym kwasem nukleinowym w temperaturze niższej od temperatury, w której cel wytapia oligonukleotyd. W przypadku obecności docelowego kwasu nukleinowego 3, starter będzie z nim hybrydyzował, po czym nośnik przemywa się w temperaturze niższej od temperatury, w której starter 16 wytapia docelowy kwas nukleinowy, w celu usunięcia nieprzyłączonego startera 16. W następnym etapie, stały nośnik ogrzewa się do temperatury, w której starter 16 zostaje wytopiony (albo z docelowym kwasem, albo bez niego), po czym nośnik przemywa się i wyeluowany produkt przepuszcza do detektora. Jeżeli zostanie wykryty znacznik, stanowi to dowód obecności docelowego kwasu nukleinowego w próbce pierwotnej.

Jeżeli chodzi o fig. 6, to objaśnia ona konstrukcję aparatu, w którym można dokonywać hybrydyzacji docelowego kwasu nukleinowego z oligonukleotydem związanym z nośnikiem, a także przeprowadzać reakcje amplifikacji.

Aparat pokazany na fig. 6 obejmuje kolumnę 20 (równoważną kolumnie 6 na fig. 2) wstępnie załadowaną cząstkami nośnika 21 ze związanym z nimi oligonukleotydem 22. Typowo, kolumna 20 ma objętość około 200μΐ i posiada wlot 23 oraz wylot 24, wyposażone w porowate elementy zatrzymujące 25, przeznaczone do utrzymywania cząstek 21 wewnątrz kolumny. Aparat wyposażony jest w układ zaworów 26 - 34, jak pokazano, a także w źródło gazu pod ciśnieniem, który można kierować zgodnie ze strzałkami G. Gaz stosuje się do wprawiania odczynników i produktów w aparacie w ruch. Niektóre zawory rozmieszczone są po to, by zapewnić odpowietrzanie, jak to przedstawiono przy pomocy strzałek V.

Zawór 26 umożliwia selektywną komunikację wnętrza kolumny 20 z urządzeniem zasilającym w odczynniki 35, obejmującym oddzielne naczynia 35a - 35d zawierające roztwory (na przykład próbek, starterów, buforów itd.), które wprowadza się do kolumny 20 poprzez otwarte zawory 26 i 27 pod ciśnieniem gazu. W trakcie takiego zasilania kolumny można posłużyć się zaworem 29 do zlikwidowania nadciśnienia gazu przez odpowietrzenie.

Po wylotowej stronie zaworu 28 znajduje się miejsce przekazywania 36, które może w sposób selektywny komunikować się (poprzez zawór 30) z miejscem gromadzenia produktu 37, połączonym z detektorem 38. Może nim być, na przykład, detektor optyczny lub detektor znacznika promieniotwórczego. Można tu także zastosować detektory innych typów.

Miejsce przekazywania 36 może także w sposób selektywny komunikować się (poprzez zawór 31) z miejscem przetrzymywania roztworu 39 lub ze zbiornikiem odpadów 40.

171 810

Miejsce przetrzymywania roztworu 39 zasilane jest jednym z przewodów rurowych aparatu, przy czym jego objętość jest co najmniej równa objętości kolumny 20.

Kolumna ma umieszczony dookoła niej grzejnik 41, jak pokazano.

Zaworami, w które wyposażony jest aparat przedstawiony na figurze, mogą być, na przykład, zawory typu zero dead Teflon seated (na przykład takie, jakie można otrzymać z firmy General Valve (U.S.A)). Przewodami rurowymi w aparacie mogą być rurki teflonowe o średnicy 1,5 mm.

Jeśli chodzi o użycie aparatu, próbkę razem ze stosownymi buforami wprowadza się do kolumny 20 z zastosowaniem gazu pod ciśnieniem, jak poprzednio zaznaczono. Hybrydyzację docelowego kwasu nukleinowego przeprowadza się w odpowiedniej temperaturze. Następnie kolumnę przemywa się roztworem dopływającym z urządzenia zasilającego 35. Przemywki mogą przepływać do zbiornika odpadów 40 (poprzez odpowiednio ustawione zawory 28 i 31). W trakcie tego postępowania może być otwarty zawór 34, w celu likwidowania nadciśnienia gazu przez odpowietrzanie.

Następnie przeprowadza się manipulację na docelowym kwasie nukleinowym utrzymywanym na nośniku. W tym celu, odpowiednie roztwory odczynników dostarcza się z urządzenia zasilającego 35 poprzez odpowiednio ustawione zawory (dotyczy to zarówno zasilania cieczami jak i odpowietrzania).

Po dokonaniu manipulacji, roztwór reakcyjny można przepuścić z kolumny 20 do miejsca przetrzymywania roztworu 39.

Produkt manipulacji wytapia się z nośnika 21 i przepuszcza do miejsca gromadzenia produktu 37, lub do bezpośredniej detekcji albo do odbieralnika i przechowuje.

W przypadku, gdy ma być przeprowadzana dalsza manipulacja na docelowym kwasie nukleinowym (lub jego kopii) na nośniku, wtedy roztwór znajdujący się w miejscu przetrzymywania 39 zawraca się do kolumny 20 pod ciśnieniem gazu poprzez zawór 32. Następnie można powtórzyć opisany powyżej proces.

Produkt manipulacji można nagromadzać w miejscu 37 tak często, jak często jest to potrzebne. W trakcie gromadzenia produktu zawór 33 powinien być ustawiony tak, aby możliwe było odpowietrzanie. Aby zapobiec natychmiastowemu przechodzeniu produktu do detektora, po krótkim czasie można zamknąć zawór 33 tak, że zgromadzony produkt nie może przemieścić się na tyle daleko wzdłuż miejsca 37, aby osiągnąć detektor 38. Zapewnienie doprowadzania gazu do detektora 38 jest środkiem umożliwiającym oczyszczanie detektora w miarę potrzeby.

Należy zdawać sobie sprawę z tego, że opisany powyżej aparat można zautomatyzować, przy ustawianiu zaworów z zastosowaniem sterowania elektronicznego.

Aparat może obejmować pojedynczą kolumnę, jak to pokazano na fig. 6, albo może obejmować większą ilość kolumn do badania większej ilości sond oligonukleotydowych na jednej próbce lub do badania jednej sondy oligonukleotydowej na większej ilości próbek (na przykład sonda HIV I).

Poza tym, kolumna 20 nie musi stanowić stałej części aparatu. Możliwe jest w tym przypadku, na przykład, posiadanie w dyspozycji większej ilości kolumn 20 wstępnie załadowanych stałym nośnikiem ze związanym z nim oligonukleotydem. Kolumny takie można wstawiać do aparatu inaczej niż to pokazano na fig. 6. Dzięki temu unika się konieczności opróżniania kolumny ze stałego nośnika, co byłoby niezbędne w przypadku kolumny zamocowanej na stałe.

Wynalazek zostanie opisany w następujących, nie ograniczających jego zakresu, przykładach. Oligonukleotydy stosowane w przykładach, zarówno wiązane w kolumnie jak i odszczepiane w kolumnie (próbki starterów), syntetyzowano wykorzystując typowy program sprzęgania przy użyciu syntetyzera DnA Biosearch Model 8500. W syntezie stosowano fosfoamidyty zabezpieczone grupami β-cyjanoetylowymi. Próbki starterów odszczepianych w kolumnie były całkowicie odblokowane (to znaczy wszystkie grupy DMTr były usunięte) i były odszczepiane automatycznie działaniem NH4OH od kolumn CPG. Oligonukleotydy wiązane w kolumnie nie były odszczepiane działaniem NH4OH i końcowa

171 810 grupa DMTr nie była usuwana, jeżeli inaczej nie ustalono. Po zakończeniu syntezy oligonukleotydy tak wiązane w kolumnie jak i odszczepiane w kolumnie przenoszono do probówek z nakrętkami, zawierających po 1 ml 38% NH4OH. Probówki, w zaciskach, umieszczono na 1 godzinę w piecu o temperaturze 55° C w celu usunięcia grup zabezpieczających. Następnie probówki i zaciski przeniesiono na 10 minut do zamrażarki o temperaturze -20°C. Supernatant z NH4OH usunięto z oligonukleotydów związanych w kolumnie i odrzucono. Próbki zliofilizowano w suszarce wirówkowej Savant i przechowywano w eksykatorze. Każdy oligonukleotyd odszczepiany w kolumnie rozdzielono do trzech probówek i zliofilizowano. Następnie pobrano jedną z tych trzech probówek i zawarty w niej surowy oligonukleotyd poddano oczyszczaniu.

Przykład I. Otrzymywanie nośnika w postaci żelu krzemionkowego.

g kalcynowanego nośnika Spherisorb GC wysuszono przy użyciu P2O5 w okragłodennej kolbie z 40 ml bezwodnego toluenu. Zawartość kolby mieszano przy użyciu mieszadła magnetycznego, następnie otrzymaną gęstą zawiesinę ogrzano na łaźni olejowej do temperatury 90 - 95°C, po czym dodano do niej 1,5 ml bezwodnego 3-glicydoksypropżlotrimetok^sysilanu. Reakcję prowadzono, przy mieszaniu, w ciągu 3 godzin w temperaturze 90 - 95°C. Zwracano uwagę na to, aby temperatura nie przekroczyła 95°C. Po upływie 3 godzin mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej, po czym przesączono i przemyto 40 ml bezwodnego toluenu, 40 ml metanolu i 20 ml eteru. Sfunkcjonalizowanż zel krzemionkowy suszono przy użyciu P 2O 5 i SiO 2 przez noc.

Przykład II. Synteza nośnika podstawionego nukleotydem cytozynowym.

(a) Otrzymywanie soli sodowej pochodnej nukleotydu C. 1 g dimetoksytritżlodeoksżrżbonukleozżdocytozynż (DMTr dC) suszono przez kilka dni przy użyciu P2O5 i SiO2. Wysuszoną DMTr dC rozpuszczono w 20 ml bezwodnego N,N-dimetyloformamidu (DMF) w atmosferze azotu. Po osiągnięciu całkowitego rozpuszczenia dodano 0,6 g wodorku sodowego i reakcję prowadzono w środowisku bezwodnego AMF, w ciągu 20 minut, przy mieszaniu. Następnie z mieszaniny reakcyjnej wydzielono NaH za pomocą odsączenia.

(b) Reakcja spreparowanego żelu krzemionkowego z pochodną nukleozydu. Do przesączonej soli sodowej nukleozydu dodano bezpośrednio wysuszony nośnik w postaci żelu krzemionkowego i mieszaninę, w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną, mieszano w ciągu 2 godzin. Mieszaninę zawierającą nukleozyd sprzężony z nośnikiem ochłodzono przez noc do temperatury pokojowej. Nośnik w postaci podstawionej krzemionki poddano sączeniu przez srlanrzowanż filtr ze spiekanego szkła i przemywaniu 20 ml bezwodnego DMH, 20 ml bezwodnego toluenu, 20 ml metanolu i 20 ml eteru. W końcu, stały nośnik wysuszono i przechowywano) w eksykatorze.

Tlen w pozycji 5' części cukrowej pochodnej nukleozydu zabezpieczony jest grupą DMTr. Jest ona nietrwała w warunkach kwasowych i można ją usunąć działaniem bezwodnych kwasów, takich jak kwas dichlorooctowy (DCA), w wyniku czego powstaje kation DMTr o barwie jaskrawopomarańczowej. Na część wysuszonego podstawionego nośnika podziałano 1 ml 2% DCA w dichlorometanie i zaobserwowano zabarwienie jaskrawopomarańczowe. Wskazuje to na pomyślne sprzężenie nośnika w postaci krzemionki z pochodną nukleozydu cytozynowego.

Przykład III.

Układ testu stanowił sposób postępowania pomyślany tak, aby wyizolować klon z mieszaniny bakteryjnego i wirusowego DNA. Sekwencja docelowa (klonowany gen) zlokalizowana była w obrębie bakteriofaga M13 mp i zawierała następujące dwie sekwencje:

GCG GGT CCC AAAA GGG TCA GTG CTG (1)

AGT GTG TCC TTT GTC GAT ACTG (2)

M13 mp jest to typowy wirus stosowany w biologii molekularnej i używa się go rutynowo jako przenośnika przy sekwencjonowaniu.

Na nośniku wytworzonym w przykładzie II zsyntetyzowano oligonukleotyd o następującej sekwencji, to jest homologiczny z sekwencją (1):

CGC CCA GGG TTT CCC AGT CAC GAC (3)

171 810

Reszta cytozyny na końcu po lewej stronie powyższej sekwencji jest to ta reszta, która została włączona w nośnik wytworzony w przykładzie II.

Następnie 15 mg stałego nośnika ze związaną z nim sekwencją oligonukleotydów umieszczono w kolumnie przepfywowej i do kolumny wprowadzono, po denaturacji termicznej, mieszaninę DNA otrzymanego z 10⁸ komórek E. coli i 1 μg DNA M13. Kolumnę utrzymywano w temperaturze (Tm - 2)°C, przy czym Tm jest to temperatura topnienia sekwencji (3), obliczona na podstawie wzoru:

Tm = 2 (A + T) + 3 (G + C) w którym A, T, G i C oznaczają, odpowiednio, liczbę reszt adeniny, tyminy, guaniny i cytozyny w sekwencji (3).

Ponieważ kolumnę utrzymuje się w temperaturze nieco niższej od temperatury topnienia (Tm), wirusowy DNA jest zdolny do przyłączenia się do związanego oligonukleotydu.

Kolumnę utrzymywano w temperaturze (Tm - 2)°C i przemyto 2 1/2 ml buforu sprzęgającego (10 mM MgCb i 10 mM Tris HCl pH 7,5). Przemywki z kolumny zbierano w 200 fil frakcjach do probówek (łącznie 1 litr).

Następnie każdą z odebranych frakcji poddano w sposób typowy reakcji sekwencjonowania (metoda Sangera-Coulsona) polegającej na dodaniu do każdej probówki 1 ng powyższej sekwencji (3) razem z polimerazą DNA (fragment Klenowa) oraz deoksyrybonukleotydami i dideoksyrybonukleotydami w standardowej mieszaninie reakcyjnej. Do mieszaniny reakcyjnej dodano także znakowaną ³²P deoksytymidynę.

Reakcję sekwencjonowania przeprowadzono także na materiale unieruchomionym na kolumnie. Materiał związany z kolumną wytopiono z kolumny i zebrano. Sekwencjonowanie przeprowadzono przy użyciu takiej samej mieszaniny reakcyjnej jak w przypadku sekwencjonowania w fazie roztworu.

Produkty reakcji sekwencjonowania, zarówno związane z nośnikiem jak i znajdujące się w fazie roztworu, rozwijano na typowym 8 % żelu poliakryloamidowym stosując typowy sposób postępowania. Figura 7 przedstawia uzyskane wyniki w postaci autoradiogramu, na którym:

Ścieżka Objaśnienie

Selwvencja wytworzona na materiale wdązanjmn ze stałym nośnikiem po przemyciu 2,5 ml mieszaniny sprzęgającej

Pienvsze 200 μ 1 wytworzonej tekwencji

Drugie 200 μ 1 wytworzonej sekweneji itd.

itd.

itd

Ścieżka 1 pokazuje, że docelowy kwas nukleinowy (wirusowy DNA) rzeczywiście był związany z nośnikiem (czego dowiedziono faktem, że sekwencja starterowa (3) była zdolna do łączenia się z docelowym kwasem nukleinowym i umożliwiała zachodzenie reakcji sekwencjonowania). Ścieżki 1-10 pokazują także, że w przypadku DNA E. coli nie występuje zjawisko przebijania się czy rozmazywania. Wynika z tego, że DNA wirusowy został w sposób selektywny zatrzymany na nośniku. Poza tym, docelowy DNA związany z nośnikiem utrzymywany jest na nośniku w sposób trwały. Nośnik sam z siebie nie stwarza zawady przestrzennej w przypadku fragmentu Klenowa, gdyż reakcje sekwencjonowania wykonywane są na DNA związanym z nośnikiem.

171 810

Ścieżki 2-12 pokazują stopniowo zmniejszające się ilości docelowego DNA (to znaczy DNA wirusowego) w przemywkach odbieranych z kolumny. Wynika z tego, że do kolumny został wprowadzony nadmiar wirusowego DNA, który nie został przyłączony do sekwencji oligonukleotydów (3). Toteż, istnieje możliwość zestrojenia wydajności wiązania przez kolumnę ze stężeniem docelowego kwasu nukleinowego.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób przeprowadzania manipulacji na sekwencji kwasu nukleinowego obejmujący:

a) otrzymanie w naczyniu przepfywowym, stałego układu nośnikowego ze związanym z nim jednoniciowym oligonukleotydem komplementarnym do specyficznej sekwencji docelowego kwasu nukleinowego, dłuższej niż wspomniany oligonukleotyd

b) dodanie do stałego układu nośnikowego źródła jednoniciowego docelowego kwasu nukleinowego

c) hybrydyzację docelowego kwasu nukleinowego z oligonukleotydem

d) przemyciu po hybrydyzacji dla usunięcia niezhybrydyzowanego docelowego kwasu nukleinowego

e) przeprowadzenie manipulacji na sekwencji kwasu nukleinowego docelowego, unieruchomionego na nośniku, znamienny tym, że manipulacja obejmuje wytwarzanie kopii oraz denaturację lub hybrydyzację jej z docelowym kwasem nukleinowym.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że manipulację stanowi replikowanie co najmniej części sekwencji docelowego kwasu nukleinowego unieruchomionego na nośniku.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że z nośnikiem wiąże się koniec 5'-oligonukleotydu.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że replikację prowadzi się z wytworzeniem kopii celu związanej z nośnikiem.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że obejmuje etapy denaturacji docelowego kwasu nukleinowego z celu i przemywanie dla usunięcia docelowego kwasu nukleinowego.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że dodatkowo prowadzi się co najmniej jedną reakcję replikacji na kopii celu związanej z nośnikiem.
7. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że z nośnikiem wiąże się koniec 3'-oligonukleotydu.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że replikacja obejmuje sekwencjonowanie docelowego kwasu nukleinowego.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że manipulacja obejmuje hybrydyzację znakowanej sondy, z docelowym kwasem nukleinowym hybrydyzowanym z nośnikiem.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etapy przemywania układu stałego nośnika dla usunięcia niezhybrydyzowanej sondy, obróbkę nośnika w warunkach, w których sonda będzie usuwana z nośnika i testowana na obecność znacznika.
11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że obejmuje przemywanie nośnika dla usunięcia niehybrydyzowanej sondy, prowadzenie co najmniej jednej reakcji replikacji docelowego kwasu nukleinowego z użyciem znakowanej sondy jako startera i testowanie na obecność znakowanego amplifikowanego produktu.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się układ nośnika w postaci cząstek stałych.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że cząstki nośnika są nieporowate.
14. Sposób według zastrz. 12 lub 13, znamienny tym, że stosuje się nośnik zawierający cząstki o wielkości 100-200 μ m.
15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako nośnik stosuje się krzemionkę.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się nośnik o usieciowanej matrycy siłoksanowej z którą związany jest oligonukleotyd.