PL174082B1 - Koniugat kapsularnego polisacharydu (Vi) i związanego z nim nośnika oraz sposób wytwarzania koniugatu - Google Patents

Abstract

zamiane, usuniecie lub dodanie jednej lub wiekszej ilosci reszt aminokwasowych do sekwencji epitopu komórki T 1 posiadaj a c y c o najmniej 70% wlasciwosci elektrycznych oraz hydroBlowych/hydrofobowych ludzkiego hsp65 odpowiadajacego pozycjom 458-474, Iub posiadajacy sekwencje: 458 474 a ) N E D Q K I G I E I I K R T L K I b) Pep278m, odpowiadajacy pozycjom 458-474 czasteczki ludzkiego hsp65, w której reszta T 4 7 1 jest zastapiona przez A4 7 1 , c) 458 474 N E D Q K IG I E I I K R T L KI, w którym reszta E oznacza E lub D, reszta D4 6 0 oznacza D lub E,reszta K4 6 2 oznacza K lub R lub ornityne (Orn), reszty I4 6 3 oznacza I lub L, V, M, E, norleucyne (NIe) lub norwaline (Nwa), reszta l468 oznacza I lub L, V, M, F, Nie lub Nwa, reszta E4 6 6 ; oznacza E lub D, reszta I4 6 7 oznacza I lub L, V, M, F, Nie lub Nwa, reszta I 4 6 8 oznacza I lub L, V, M, F, NIe lub Nwa, reszta K4 6 9 oznacza K lub R lub Orn, reszta R4 7 0 oznacza R, K lub Orn, reszta L4 7 2 oznacza L lub I, V, M, F, Nie Iub Nwa, reszta K 4 7 3 oznacza K lub R lub Orn, i reszta I4 7 4 oznacza I lub L, V, M, F, Nie lub Nwa, Iub d ) 437 448 V L G G G S A L L R S I , i zwiazany z nim kapsularny polisacharyd Salmonella typhi w stosunku molowym nosnika do Vi wynoszacym od 1:400 do 1:10 8. Sposób wytwarzania koniugatu, obejmujacy lacznie kapsularnego polisacharydu Vi Salmonella typhi (Vi) z syntetycznym nosnikiem peptydowym, znamienny tym, ze wiaze sie Vi wiazaniem konwalencyjnym bezposrednio lub przez rozpórke z syntetycznym nosnikiem peptydowym stanowiacym epitop komórki T wyprowadzony z sekwencji ludzkiego hsp65, lub jego analogu otrzymany przez zamiane, usuniecie lub dodanie jednej lub wiekszej ilosci reszt aminokwasowych do sekwencji epitopu komórki T 1 posiadajacy co najmniej 70% wlasciwosci elektrycznych oraz hydrofilowych/hydrofobowych ludzkiego hsp65 odpowiadajacego pozycjom 458-474, albo posiadajacy sekwencje: 458 474 a) NED Q K I G I E I I K R T L K I b) Pep278m, odpowiadajacy pozycjom 458-474 czasteczki ludzkiego hsp65, w której reszta T 4 7 1 jest zastapiona przez A 4 7 1 c) 458 474 N E D Q K I G L E I I K R T L K I, w którym reszta E oznacza E lub D, reszta D4 6 0 oznacza D lub E, reszta K4 6 2 oznacza K lub R lub ornityne (Orn), reszta I oznacza I lub L, V, M ,F4 6 6 , norleucyne (Nie) lub norwaline (Nwa), reszta I465 oznacza I lub L, V, M, F, Nie lub Nwa, reszta E4 6 6 oznacza E lub D, reszta I4 6 7 oznacza I lub L, V, M, F, Nie lub Nwa, reszta I 4 6 8 oznacza I lub L, V, M, F, Nie lub Nwa, reszta K4 6 9 oznacza K lub R lub Orn, reszta R4 7 0 oznacza R, K lub Om, reszta L4 7 2 oznacza L lub I, V, M, F, Nie lub Nwa..................................... PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest koniugat immunogennego antygenu i syntetycznego nośnika oraz sposób wytwarzania koniugatu. Wynalazek dotyczy zwłaszcza koniugatów o ulepszonej immunogenności opartych na syntetycznych nośnikach peptydowych stanowiących epitopy komórek T i wytwarzania tych koniugatów.

Odpowiedzi przeciwciał klasyfikuje się na dwa główne rodzaje na podstawie ich wymagań w stosunku do komórek T, Pierwotna humoralna odpowiedź immunologiczna na antygeny zależne od komórki T (T-dep) cechuje się aktywacją komórki T i B oraz proliferacją komórek, prowadzącymi z jednej strony do zróżnicowania komórek plazmy i wydzielania immunoglobiny, a z drugiej strony do tworzenia centrów namnażania i pamięci immunologicznej. Po restymulacji przez antygen, te komórki pamięci odgrywają wiodącą rolę we wtórnej odpowiedzi przeciwciała. Głównymi cechami charakterystycznymi wtórnej odpowiedzi na antygeny T-dep są szybka produkcja przeciwciał, znaczniejsza odpowiedź w porównaniu do odpowiedzi pierwotnej oraz zmiana klasy immunoglobuliny z IgM do IgG.

Istnieje jednak niewielka liczba antygenów zdolnych do aktywowania komórek B niezależnie od pomocy komórek T, zwanych antygenami niezależnymi od komórki T (T-ind). Obejmują one między innymi kapsularny polisacharyd z Streptococcus pneumoniae, spolimeryzowane Salmonella flagellin, kwasy poli-D-aminowe oraz lipopolisacharyd E.coli. Antygeny T-ind cechują się dużym ciężarem cząsteczkowym, powtarzającą

174 082 się budową i w większości przypadków ulegają powolnej degradacji. Przez długi okres czasu utrzymują się na powierzchni wyspecjalizowanych makrofagów i mogą się wiązać bardzo łatwo z komórkami B specyficznymi dla antygenu przez ich wielowartościowe przyłączenie do komplementarnych receptorów immunoglobuliny, które sieciują je poprzecznie.

Przy dostatecznie wysokim stężeniu, mogą być zdolne do poliklonalnej aktywacji znacznej części puli komórki B, tzn. bez względu na specyficzność hiperzmiennego obszaru receptora powierzchniowego dla antygenu. Zasadniczo, antygeny- T-ind przyczyniają się do zwiększenia odpowiedzi przeważnie IgM, czasem IgG3 u myszy, i stosunkowo słabo- o ile w ogóle- do aktywacji pamięci. Bakterie otoczkowe, takie jak Haemophilus influenza typu b, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Streptokoki grupy B, oraz E.coli typu K1, wywołują poważne choroby inwazyjne u ludzi, w szczególności u dzieci i u immunokompromisowych osobników. Wykazano, że osoczowe ciała anty-polisacharydowe działają ochronnie przeciw chorobom inwazyjnym spowodowanym przez większość z tych patogenów i opracowano szczepionki składające się z oczyszczonych polisacharydów kapsularnych (CPS) dla wywołania takich przeciwciał u osobników w stanie ryzyka. Polisacharydy są jednak słabymi immunogenami u dzieci i ich zastosowanie jako szczepionek jest wskutek tego poważnie ograniczone. Uważa się, że ich słaba immunogenność wiąże się z tym, że należą do antygenów T-ind.

Odkrycie przez Avery i Goebela (1929), że połączenie polisacharydów z nośnikami proteinowymi zwiększa immunogenność, wykorzystano ostatnio dla wytwarzania szczepionek dla stosowania u ludzi.

Zarówno u ludzi jak i u gryzoni te koniugaty zachowują się jak antygeny T-dep wykazując wywoływanie pamięci immunologicznej. Pomiędzy koniugatowymi szczepionkami polisacharydowymi i proteinowymi układami nośnika-hapten istnieją podobieństwa. Zatem koniugaty CPS mogą wywoływać ochronne poziomy przeciwciał CPS u dzieci, podczas gdy same CPS nie mogą. Możliwe, że wyższa immunogenność koniugatów w porównaniu do czystych polisacharydów wynika z pomocy komórek T specyficznych dla nośnika, jak to wykazano w układzie nośnik-hapten u gryzoni.

W większości przypadków, antygeny T-ind połączono z dużymi proteinami immunogennymi, takimi jak toksoid tężca, toksyna cholery lub toksoid błoniczy. Niemniej, odpowiedź immunologiczna na cząsteczki nośnika o wysokim ciężarze cząsteczkowym chroniące stymulacyjne jak też i supresywne epitopy komórki T nie dadzą się dobrze przewidywać. Wykazano, że odpowiedź przeciwciała na hapten połączony z proteiną nośnika można także inhibitować gdy odbiorcę uprzednio immunizowano niezmodyfikowaną proteiną. Zjawisko to nazwano supresją epitopu wywołaną przez nośnik i okazało się ostatnio, że występuje ono u pewnej liczby koniugatów haptenproteina. Ponieważ opracowanie silniejszych szczepionek koniugatywnych przeciw dużej liczbie organizmów silnie infekcyjnych jest wciąż ważne, podejmuje się wysiłki dotyczące poszukiwania bardziej odpowiednich cząsteczek nośników dostarczających żądanych epitopów komórki T. Uniwersalnie immunogenne epitopy komórki T, określone przez specyficzne peptydy o ostro zarysowanych cechach immunologicznych, mogłyby reprezentować nową generację takich alternatywnych cząsteczek. Proteiny dobrze rozpoznawalne przez system immunologiczny mogłyby być odpowiednim źródłem peptydów służących do tego celu.

Badania przy użyciu szerokiego wachlarza protein, zarówno tych ściśle spokrewnionych ze sobą i tych odległych filogenetycznie, wykazały, że większość komórek T ogniskuje się na pewnej liczbie epitopów immunodominujących, a mniejszość odpowiada innym, subdominantowym determinantom. Ta hierarchia wykorzystania determinanty przez komórki T mogłaby wynikać z kombinacji czynników włączając w to różnicowe powinowactwa dla dostępnych cząsteczek MHC, różnorodność komórek T, wewnętrzne współzawodnictwo miejsc wiążących MHC i niewielkie różnice w przetwarzaniu.

174 082

Istnieje coraz więcej dowodów na to, że proteiny należące do rodziny protein szoku termicznego (hsp) są głównymi antygenami wielu patogenów (Young i in., 1988). Hsp najpierw zostały opisane, a później nazwane wskutek ich produkcji przez komórki wystawione na nagłe podwyższenie temperatury. Hsp obejmują proteiny o różnych ciężarach cząsteczkowych, włączając 20 kDa, 60 kDa, 65-68 kDa, 70 kDa, 90 kDa, 110 kDa i inne. Obecnie jest widoczne, że hsp są wywoływane we wszystkich komórkach przez wiele różnych uchybień środowiskowych, włączając w to urazy utleniające, ubytek środków odżywczych oraz infekcję patogenami wewnątrzkomórkowymi. Odpowiedź hsp umożliwia komórce przeżycie w niekorzystnych warunkach. Chociaż stres komórkowy zwiększa syntezę hsp, wiele hsp jest również istotnie ekspresjonowanych i odgrywa zasadniczą rolę w normalnym funkcjonowaniu komórki. Odpowiedź hsp jest wszędzie obecna w królestwach prokariotycznym i eukariotycznym i hsp należą do jednych z najlepiej zachowanych cząsteczek. Pomimo ewolucyjnego różnicowania przez ponad miliard lat, ludzkie i mikrobakteryjne cząsteczki hsp65, są np. identyczne w około 50% ich reszt aminokwasowych. To zachowanie chemicznej budowy obejmuje szereg odcinków aminokwasowych całkiem Iub niemal identycznych. W konsekwencji, każdy organizm będzie niezbędnie cechował się immunologiczną reaktywnością krzyżową z hsp65 z dowolnej obcej komórki. Zatem, cząsteczka hsp65 dowolnego czynnika infekcyjnego będzie częściowo własna, a częściowo obca w stosunku do jakiegokolwiek gospodarza w systemie immunologicznym. Z tych względów, przewiduje się, że hsp65 i inne hsp będą słabo immunogenne. Natomiast, istnieją dowody na to, że hsp mogą być jednymi z najbardziej dominujących immunogenów.

Hsp65, jako reprezentatywny przedstawiciel protein należących do rodziny hsp, może być uważany za dominujący antygen ponieważ infekcja lub immunizacja wieloma różnymi bakteriami indukuje przeciwciała oraz komórki T specyficzne dla cząsteczki hsp65 (Young i in., 1988). U myszy immunizowanych Mycobacterium tuberculosis, 20% wszystkich komórek T, które odpowiadają na bakterię, jest specyficznych na hsp65. Jest rzeczą interesującą, że komórki T o reaktywności względem hsp65 zidentyfikowano także u normalnych zdrowych osobników bez jakichkolwiek klinicznych objawów choroby (Munk i in., 1988). Przy użyciu peptydów syntetycznych, Lamb i in. (1987) oraz Munk i in. (1988) pokazali odpowiedzi komórki T na uczestniczące epitopy mikrobakteryjnego i ludzkiego hsp65. Udowodniło to formalnie istnienie komórek T dla własnych epitopów hsp65 u osobników normalnych.

Jako konsekwencja tej immunodominancji nie jest zaskakujące, że cząsteczka hsp65 wydaje się być zaangażowana w zdarzenia autoimmunologiczne. Odporność na hsp65 może wywołać cukrzycę autoimmunizacyjną u myszy i może być związana z autoimmunizacyjnym zapaleniem stawów u szczurów i u ludzi (Elias i in., 1990; Pearson, 1964). Zatem, odporność na hsp65 związana jest z chorobą autoimmunizacyjną, lecz również jest związana ze stanem zdrowia. Podczas infekcji, zarówno patogen i gospodarz zwiększają znacznie swoją syntezę hsp dla ochrony przed stresami wywieranymi przez innych. W analogii z odpowiedziami komórki B na autoantygeny, możliwe jest przedstawienie sobie, że własne komórki T reaktywne z hsp, podobnie jak komórki T rozpoznające specyficznie hsp65, mogłyby być korzystnie używane przy likwidowaniu zapalenia przez usuwanie zaatakowanych komórek. Być może jednak choroba autoimmunizacyjna mogłaby wystąpić, gdyby ta odpowiedź nie była prawidłowo regulowana. Cohen i Young (1991) zasugerowali przewagę neutralnej odporności u osobników zdrowych zapewnioną przez system immunologiczny oparty na szeregu wysoce kontrolowanych i regulowanych uodpornionych sieci skierowanych przeciw ograniczonej liczbie kontrolowanych własnych antygenów. Sugeruje się, że cząsteczka hsp65 jest jednym z tych antygenów, na które istnieje naturalna wysoce zorganizowana odpowiedź immunologiczna. (Elias i in., 1990).

Cox i in. (1988) wykazali, że dimer peptydu 65-85 proteiny 65 kDa Mycobacterium tuberculosis nie wpływał na jego zdolność do wywoływania proliferacji komórki T, lecz

174 082 zwiększał produkcję przeciwciała, i zasugerowali, że połączenie heterologicznych peptydów z końcem N mikrobakteryjnej sekwencji 65-85 można zasadniczo zastosować dla zwiększenia mocy szczepionek peptydowych. Lussow i in. (1990) oraz Barrios i in. (1992) wykazali, ze hsp65 oraz hsp70 Mycobacterium bovis mogą działać jako cząsteczki nośnika dla wywoływania przeciwciał przeciwhaptenowych u myszy. Ponadto, zidentyfikowano wiele epitopów komórki T w hsp65 M.bovis i wykazano, że cała proteina jest immunogenna u rozmaitych szczepów myszy z różnymi typami haplo MHC (Brett i in., 1989).

Można założyć, że pewne epitopy komórki T w ramach sekwencji proteiny Hsp65 (odpowiednio, gospodarza i pasożyta) wykazują immunodominancję i mogą wywoływać pamięć immunologiczną, podczas gdy inne nie wyrażają uprzywilejowanego rozpoznania immunologicznego lub są zaangażowane w wywoływaniu autoimmunizacji. Rozróżnienie między tymi różnymi funkcjonalnymi epitopami komórek T może prowadzić do identyfikacji peptydów uniwersalnie immunogennych, które mogą stanowić bezpieczną, określoną alternatywę o dużej mocy dla cząsteczek nośnika antygenów T-ind.

Europejski opis patentowy EP 262 710 oraz opis patentowy St. Zjedn. Ameryki 5 154 923 podają peptydy o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej pozycjom 171-240 i 172-192, odpowiednio, polipeptydu 64 kDa Mycobacterium bovis BCG, które są przydatne jako immunogeny indukujące oporność na autoimmunogenne zapalenie stawów oraz podobne choroby autoimmunogenne.

Zgłoszenie patentowe PCT WO 90/10449 opisuje peptyd oznaczony jako p277 o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej pozycjom 437-460 cząsteczki ludzkiego hsp65 przydatny, jako immunogen wywołujący oporność na diabetes mellitus zależny od insuliny (IDDM). Peptyd kontrolny oznaczony jako p278 odpowiadający pozycjom 458-474 ludzkiego hsp65 nie wywoływał oporności na IDDM.

Lussow i in. (1990) wykazał, że napiętnowanie myszy żywym Mycobacterium tuberculosis var. bovis (BSG) oraz uodpornienie syntetycznym peptydem repetyiywnej malarii (NANP)4o skoniugowanej z oczyszczoną pochodną proteiny (PPD) doprowadziło do wywołania wysokiego miana antypeptydowych przeciwciał IgG. Następnie Lussow i in. (1991) wykazali, że mikobakteryjne proteiny szoku termicznego (hsp) o 65 kDa (typ GroEL) oraz o 70 kDa (typ DnaK) działały jako cząsteczki nośnika u myszy uprzednio napiętnowanych Mycobacterium tuberculosis var. bovis (bacillus Calmette-Guerin BCG) przy wywoływaniu wysokiego i długotrwałego miana IgG przeciw syntetycznemu peptydowi repetytywnej malarii (NANP)40- Antypeptydowe przeciwciała wywoływano gdy peptyd malarii skoniugowany z mikobakteryjnym hsp był stosowany w nieobecności jakiegokolwiek adiuwantu.

Barrios i in. (1992) wykazali, że myszy uodpornione peptydami lub oligosacharydami skoniugowanymi z hsp o 70 kDa wytwarzały wysokie miana przeciwciał IgG w nieobecności jakiegokolwiek uprzednio napiętnowania BCG. Odpowiedź przeciwciała antypeptydowego istniała co najmniej jeden rok. Ten efekt nośnika bez adiuwanta o 70 kDa hsp był zależny od komórki T, ponieważ nie wywołano żadnego antypeptydu ani przeciwciał anti-70 kDa IgG u bezgrasicowych myszy nu/nu. Uprzednie uodpornienie myszy przy pomocy hsp o 65 kDa lub kDa nie miało żadnego negatywnego wpływu na wywoływanie antypeptydowych przeciwciał IgG po uodpornieniu koniugatami hsppeptyd w nieobecności adiuwantów. Ponadto, wstępne uodpornienie hsp o 65 kDa mogłoby zastąpić BCG w dostarczeniu skutecznego napiętnowania dla wywołania przeciwciał anty-(NANP)4o. Ostatecznie zarówno hsp o 65 kDa i 70 kDa działały jako cząsteczki nośnika przy wywoływaniu przeciwciał IgG dla oligosacharydów meningokokowych grupy C w nieobecności adiuwantów sugerując, że zastosowanie hsp jako nośników w koniugowanych fragmentach dla wywoływania przeciwciał antypeptydowych i antyoligosacharydowych mogłoby przedstawiać wartość w projektowaniu nowych szczepionek dla możliwego zastosowania u ludzi.

174 082

Żaden z wyżej wspomnianych odsyłaczy nie opisuje specyficznych epitopów komórki T ludzkiego hsp65 sprzężonego ze słabo immunogennymi cząsteczkami. Przedmiotem wynalazku jest koniugat kapsularnego polisacharydu (Vi) i związanego z nim nośnika, charakteryzujący się tym, że zawiera nośnik obejmujący syntetyczny peptyd stanowiący epitop komórki T wyprowadzony z sekwencji ludzkiego hsp65, lub jego analog otrzymany przez zamianę, usunięcie lub dodanie jednej lub większej ilości reszt aminokwasowych do sekwencji epitopu komórki T i posiadający co najmniej 70% właściwości elektrycznych oraz hydrofilowych/hydrofobowych ludzkiego hsp65 odpowiadającego pozycjom 458-474, lub posiadający sekwencje:

458 744

a) NEDOKIGIEIIKRTLKI

b) Pep278m, odpowiadający pozycjom 458-474 cząsteczki ludzkiego hsp65, w której reszta T⁴⁷¹ jest zastąpiona przez A.

c) 458 474

NEDOKIGIEIIKRTLKI w którym reszta E4⁵⁹ oznacza E lub D, reszta D*¹⁶⁰ oznacza D lub E, reszta Κ4⁶² oznacza K lub R lub ornitynę (Om), reszta I¹⁶³ oznacza I lub L, V, M, F, norleucynę (Nle) lub norwalinę (Nwa), reszta 1*6 ozncz^a I lbb L, V, M, F, Nie lub wwa, reszta E466 oznacza E lub D, reszta I⁴⁶⁷ s>znazαa I hih L, V, M, Nie lub Nwa, ^zta oznacza I lub L, V, M, F, Nle lub Nwa, reszta K^⁹ oznacza K lub R lub Orn, reszta r470 oznacza R, K lub Orn, reszta L4⁷² oznacza L lub I, V, M, F, Nle Iub Nwa, reszta K^ oznacza K lub R lub Orn, i reszta oznacza I Iub L, V, M, F, Nle lub Nwa, lub

d) 437 448

VLGGGSALLRSI;i związany z nim kapsularny polisacharyd Salmonella typhi, w stosunku molowym nośnika do Vi wynoszącym od 1:400 do 1:10. Korzystnie koniugat zawiera syntetyczny peptyd lub analog kowalencyjnie związany ze kapsularnym polisacharydem Vi Salmonella typhi. Również korzystnie koniugat według wynalazku charakteryzuje się tym, że syntetyczny nośnik peptydowy lub jego analog jest związany bezpośrednio kowalencyjnie z kapsularnym polisacharydem Salmonella typhi. Syntetyczny nośnik peptydowy Iub jego analog może być również korzystnie kowalencyjnie związany z kapsularnym polisacharydem Salmonella typhi przez rozpórkę, wybraną z grupy obejmującej: -O-R-CO-, -NH-R-CO-, -NH-R-NH-O-R-NH- i -NH-R-CH2, w której R oznacza nasycony lub nienasycony łańcuch węglowodoru ewentualnie podstawionym i/lub przerwanym przez jeden lub więcej rodników aromatycznych lub przez heteroatomy wybrane spośród N, O i S.

Korzystnie, w koniugacie według wynalazku w tym przypadku, R oznacza alifatyczny łańcuch węglowodorowy zawierający 3-16 atomów węgla.

Jeszcze bardziej korzystnie R oznacza resztę kwasu ε-amizokaprozowego. W takim wykonaniu wynalazku, korzystnie koniugat, posiada wzór:

CO-NH-AC-CO-NH-Pep-COOH

174 082 w którym Ac oznacza acetyl, AC oznacza resztę kwasu ε-aminokapronowego, Pep oznacza resztę nośnika peptydowego Pep278h lub Pep II, a reszta sacharydowa jest powtarzalną jednostką kapsularnego polisacharydu Vi Salmonella typhi.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania koniugatu, obejmujący łącznie kapsularnego polisacharydu Vi Salmonella typhi (Vi) z syntetycznym nośnikiem peptydowym, charakteryzujący się tym, że, wiąże się Vi wiązaniem kowalencyjnym bezpośrednio lub przez rozpórkę z syntetycznym nośnikiem peptydowym stanowiącym epitop komórki T wyprowadzony z sekwencji ludzkiego hsp65, lub jego analogu otrzymany przez zamianę, usunięcie lub dodanie jednej lub większej ilości reszt aminokwasowych do sekwencji epitopu komórki T i posiadający co najmniej 70% właściwości elektrycznych oraz hydrofitowych/hydrofobowych ludzkiego hsp65 odpowiadającego pozycjom 458-474, albo posiadający sekwencje:

458 474

a) NEDOKIGIEIIKRTLKI

b) Pep278m, odpowiadający pozycjom 458-474 cząsteczki ludzkiego hsp65, w której reszta Ί⁴⁷¹ jest zastąpiona przez a4⁷¹,

c) 458 . 474

NEDOKIGIEIIKRTLKI, w którym reszta E459 oznacza E lub D, reszta d46° oznacza D lub E, reszta _K462 oznacza K lub R lub ornitynę (Orn), reszta oznacza I lub L, V, M, F, norleucynę (Nle) lub norwalinę (Nwa), reszta oznacza I lub L, V, M, F, Nle lub Nwa, reszta E466 oznacza E lub D, reszta oznacza I lub L, V, M, F, Nle lub Nwa, reszta oznacza I lub L, V, M, F, Nle lub Nwa, reszta K469 oznacza K lub R lub Orn, reszta R47^o oznacza R, K Iub Orn, reszta L472 oznacza L lub I, V, M, F, Nle Iub Nwa, reszta K oznacza K lub R lub Orn, i reszta I oznacza I lub L, V, M, F, NIe lub Nwa, lub

d) 437 448

VLGGGSALLRS;

w stosunku molowym nośnika do Vi wynoszącym od 1:400 do 1:10

Koniugat według wynalazku znajduje zastosowanie do wytworzenia szczepionek obejmujących koniugat według niniejszego wynalazku lub mieszaninę słabo immunogennego antygenu i odpowiedniego nośnika peptydowego.

Przy pomocy koniugatu według wynalazku można przeprowadzić immunizację gospodarza - ssaka, który obejmuje podawanie wspomnianemu gospodarzowi skutecznej ilości koniugatu według niniejszego wynalazku, lub współpodawanie skutecznych ilości słabo immunogennej cząsteczki antygenu i nośnika - syntetycznego peptydu tworzącego epitop komórki T wyprowadzony z sekwencji ludzkiego hsp65, lub jego analogu, przy czym wspomniany peptyd lub jego analog są zdolne do zasadniczego zwiększenia immunogenności słabo immunogennego antygenu.

Wynalazek został zilustrowany na rysunku, na którym fig. 1A-B przedstawia odpowiedź przeciwciała anty-Vi surowicy wywołaną u myszy przez same Vi, 12 i 24 dni po pierwszym uodpornieniu oraz 12 dni po drugim uodpornieniu, przy rozcieńczeniu surowicy 1:50 (A) oraz 1:500 (B).

Figura 2a-b (A-C) przedstawia odpowiedź przeciwciała anty-Vi wywołaną u myszy przez samo Vi Iub koniugat Vi Vi-Pep II, Vi-Pep278h oraz Vi-Pep348h ((a) 2,5 oraz (b) 0,25 μg Vi wstrzykniętego na 1 mysz), 12 (A) oraz 24 dni (B) po pierwszym uodpornieniu oraz 12 dni po drugim uodpornieniu (C).

174 082

Figura 3a-b (A-B) przedstawia kinetykę wytwarzania przeciwciał anty-Vi wywołanego przez koniugaty Vi-protema/peptyd (A) oraz samo Vi (B) ((a) 2,5 μg oraz (b) 0,25 μg Vi wstrzykniętego na 1 mysz), 12 oraz 24 dni po pierwszym uodpornieniu oraz 12 dni po drugim uodpornieniu.

Figura 4A-B przedstawia specyficzność przeciwciał anty-Vi ujawnionych w myszach uodpornionych samym Vi lub z koniugatami Vi-Pep II oraz Vi-Pep278h. Przeciwciała oznaczono na płytach ELISA powleczonych 2,5 μg (panel A) oraz 1,25 μg Vi na zagłębienie (panel B).

Figura 5A-B przedstawia charakterystykę izotopów przeciwciał anty-Vi ujawnionych u myszy przez samo Vi lub przez koniugat Vi-Pep278h. Panel A - odpowiedź izotypu IgM anty-Vi na Vi oraz Vi-Pep278h; Panel B - odpowiedź izotypu IgG anty-Vi na Vi oraz Vi-Pep278h.

Figura 6A-B przedstawia przebieg czasowy tworzenia przeciwciała anty-Vi u myszy uodpornionych samym Vi lub koniugatami Vi-Pep II oraz Vi-Pep278h, przy rozcieńczeniu 1:100 (panel A) oraz 1:1000 (panel B).

Figura 7A-B(a-c) przedstawia efekt adiuwantu i trybu uodparniania na tworzenie przeciwciała anty-Vi wywołane przez Vi-Pep II wstrzyknięte (A) podskórnie (sc) lub (B) domięśniowo (im) do myszy 12 (panel a) oraz 24 dni (panel b) po pierwszym uodpornieniu oraz 12 dni po drugim uodpornieniu (panel c).

Figura 8A-C przedstawia tworzenie przeciwciała anty-Vi wywołane u myszy przez koniugatę Vi-Pep II lub przez wolny Pep II zmieszany z Vi przed uodpornieniem, 12 (panel A) oraz 24 dni (panel B) po pierwszym uodpornieniu oraz 12 dni (panel C) po drugim uodpornieniu.

Figura 9 przedstawia efekt napiętnowania nośnika na tworzenie przeciwciała antyVi u myszy uodpornionych koniugowanym Vi-Pep II, napiętnowane sc 14 dni przed uodpornieniem wolnym Pep II w IFA (z lewej) lub nie napiętnowane (z prawej).

Figura 10a-b (A-B) przedstawia odpowiedź immunologiczną wywołaną w tej samej pojedynczej myszy przez Vi-Pep277(S) (antygen A), Vi-Pep278h (antygen B, po tym jak wstrzyknięto myszom Vi-Pep277(S), i Vi-Pep278h (antygen D), przy rozcieńczeniu surowicy 1:50 (a) oraz 1:1000 (b), 12 dni po pierwszym (panel A) oraz 12 dni po drugim (panel B) uodpornieniu.

Figura 11A-F przedstawia skrining rozpoznawania samego Vi (panel B) oraz koniugat Vi-Pep II (panel C), Vi-Pep278h (panel D), Vi-Pep II* (panel C) oraz ViPCRP77-83 (panel F) pokrytych do płytek ELISA przez stanowiącą odniesienie surowicę anty-Vi Burro 260 (panel A).

Figura 12A-E przedstawia odpowiedź immunologiczną różnych szczepów myszy na Vi oraz koniugaty V- Panel A: odpowiedź myszy BALB/c na Vi, Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt, Vi-SRes, Vi-348 oraz Vi-277(S); panel B: odpowiedź myszy BALB/k na Vi, Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt Vi-277(S) oraz Vi-SRes; panel C: odpowiedź myszy BALB/b na same antygeny panelu B; panel D: odpowiedź myszy D na Vi Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt oraz Vi-SRes; panel E: odpowiedź myszy NON.NOD na Vi, Vi-278h oraz Vi-278mt.

Figura 13A-C przedstawia rozkład izotypu IgG surowic myszy uodpornionych koniugatem Vi-278h emulgowanym w IFA, z Vi w IFA oraz z IFA/PBS, odpowiednio.

Figura 14 przedstawia odpowiedź immunologiczną myszy na fragmenty Vi oraz koniugat fragmenty Vi - 278h.

Figura 15 przedstawia immunogenność Vi oraz koniugat Vi-278h, Vi-278m, Vi278mt oraz Vi-SerRes u myszy.

Figura 16 przedstawia odpowiedź immunologiczną IgGl uzyskaną u myszy po uodpornieniu polipeptydem FEPK samym lub skoniugowanym z peptydami 278h oraz 348h.

Korzystne koniugaty według niniejszego wynalazku są tworzone przez kowalencyjne połączenie Pep278h lub Pep II z polisacharydem bakteryjnym np., CPS Vi Salmonella typhi,

174 082 zwanych następnie Vi, liniowym homopolimerem poli-I-1-4) Ga-lNAc zmiennie 0-acetylowanym w pozycji C3, jak uwidoczniono na Schemacie 1. Samo Vi, podobnie jak inne CPS, nie uwidacznia odpowiedzi przypominającej u ssaków, zarówno u zwierząt jak i u człowieka, w przypadku powtórnego wstrzyknięcia, lecz jego immunogenność wzrasta gdy występuje jako koniugat według niniejszego wynalazku połączony z odpowiednim peptydem wyprowadzonym z ludzkiego hsp65 lub jego analogu, lub w mieszaninie z takim peptydem lub analogiem. Powtórne wstrzyknięcie koniugatu Vi-peptyd wywołuje wzrost poziomu przeciwciał anty-Vi (efekt przypominania), reprezentowanych głównie przez izotyp IgG.

W przypadku Pep278h, aktywne peptydy wchodzące w skład koniugatu według wynalazku cechują się wysokim ładunkiem tzn. silnie elektrycznymi właściwościami (7 spośród 17 składowych reszt aminokwasowych Pep278h jest ujemnie lub dodatnio naładowanych) oraz dużą hydrofobowością (6 reszt aminokwasowych). Peptyd pep278h charakteryzuje się ponadto polarnym ujemnie naładowanym obszarem N-końcowym, polarnym dodatnio naładowanym obszarem C-końcowym oraz rdzeniem silnie hydrofobowym. Te ogólne cechy powinny być zachowane aby utrzymać skuteczność. Zatem zgodnie z powyższymi zasadami ogólnymi, podstawienie pewnych aminokwasów doprowadzi do otrzymywania aktywnych peptydów. W szczególności, pozycje 6, 8, 10, 11, 15 oraz 17 w łańcuchu peptydowym Pep278h (odpowiadającym pozycjom 463, 465, 468, 472 oraz 474 cząsteczki ludzkiego hsp65) mogą być zajęte bądź przez I lub L lub przez inne aminokwasy hydrofobowe, naturalne, jak V, M lub F Iub nienaturalne aminokwasy, takie jak norleucyna (Nle) lub norwalina (Nva). Pozycje 5, 12, 13 oraz 16 w łańcuchu Pep278h (odpowiadające pozycjom 462, 469, 470 oraz 473 cząsteczki ludzkiego hsp65) mogą być zajęte bądź przez K lub R lub przez nienaturalne dodatnio naładowane aminokwasy, takie jak ornityna (Orn). Zamiana E oraz D może również prowadzić do aktywnych pochodnych.

Określenie analogi w niniejszym opisie odnosi się do peptydów otrzymanych przez zamianę, usunięcie lub dodanie reszt aminokwasowych do sekwencji epitopu komórki T, dopóki mają one zdolność do zasadniczego zwiększenia immunogenności cząsteczek słabo immunogennego antygenu. Np., trwałe pochodne można otrzymać przez zamianę oryginalnych reszt cysternowych resztami serynowymi, jak w przypadku Pep II. Analogi w przypadku Pep278h są peptydami takimi, że jest zachowane co najmniej 70%, korzystnie 90-100%, właściwości elektrycznych oraz hydrofobowych cząsteczki peptydu. Te peptydy można otrzymać według instrukcji w poprzednim paragrafie.

Peptydy według niniejszego wynalazku mogą mieć wszystkie reszty aminokwasowe optycznie czynne w postaci L lub D, lub część reszt aminokwasowych jak w postaci L, a inne w postaci D.

Przez znaczne zwiększenie immunogenności słabo immunogennej cząsteczki antygenu należy rozumieć zarówno wywołanie zwiększenia poziomu przeciwciał przeciw wspomnianemu antygenowi jak też reprezentowanie wspomnianych przeciwciał jako główne izotypu IgG.

Nośnik peptydowy może być połączony z cząsteczką antygenu bezpośrednio lub przez rozpórkę.

Bezpośrednie połączenie między peptydem oraz Vi uwidoczniono na Schemacie 1, gdzie koniugat ^{6 &} CO-NH-Pep-COOH

otrzymuje się według procedury 3 opisanej poniżej.

174 082

Rozporka może mieć wzór -O-R-CO- lub -NH-R-CO-, tworząc zatem ester lub amid, odpowiednio, z grupą karboksylową Vi oraz wiązanie peptydowe z końcową grupą aminową peptydu; -O-R-NH- lub -NH-R-NH-, tworząc zatem ester lub amid, odpowiednio, z grupą karboksylową Vi oraz amid z końcową grupą karboksylową peptydu; lub -NH-R-CH2-, w którym R jest nasyconym lub nienasyconym łańcuchem węglowodorowym ewentualnie podstawionym i/lub przerwanym przez jeden lub więcej rodników aromatycznych lub przez heteroatomy takie jak O, S lub N. Korzystnie, R jest alifatycznym łańcuchem węglowodorowym zawierającym 3-16 atomów węgla, takim jak reszta kwasu M-aminokapronowego.

Koniugat o wzorze:

w którym Ac oznacza acetyl, AC jest resztą kwasu M-aminokapronowego, Pep jest resztą nośnika peptydowego Pep278h lub Pep II oraz reszta sacharydowa stanowi powtarzalną jednostkę polisacharydu kapsularnego Vi Salmonella typhi, można wytworzyć trzema różnymi procedurami 1, 2 oraz 4 wyrażonymi na schemacie 1 i opisanymi następnie szczegółowo.

Koniugaty, w których rozporka jest -NH-R-CH3- otrzymuje się przez redukcję grup -NH-R-CO-.

Szczepionki, które można otrzymać w oparciu o koniugat według wynalazku są podawane drogą podskórną w odpowiednich zarobkach dla ludzi i zwierząt.

Niniejszy wynalazek zostanie obecnie zilustrowany następującymi przykładami, nie stanowiącymi ograniczenia niniejszego wynalazku:

Przykłady

W niniejszych przykładach, użyto następujące materiały i metody.

Materiały i metody

a. Materiały: Wszystkie rozpuszczalniki i odczynniki były czystości analitycznej i otrzymano je od Aldricha, USA, o ile nie zaznaczono inaczej.

b. Synteza peptydu: Peptydy otrzymano przez syntezę w fazie stałej przy użyciu grupy zabezpieczającej t-Boc dla I-N-końcowych grup aminokwasowych. Żywica Merrifielda o 0,5-0,7 meq/g aktywnego chloru na g została nabyta od Chemalog, N.J., USA. Aminokwasy zabezpieczone Boc z odpowiednim zabezpieczeniem bocznego łańcucha nabyto od Baechem, Ca., USA. Połączenie pierwszych aminokwasów z żywicą wykonano przez sole cezowe pochodnych aminokwasowych. Przedłużenie łańcucha peptydowego wykonano manualnie według ogólnych zasad metodologii w fazie stałej (Merrifield, 1963). Rozszczepienie peptydów od żywicy oraz usunięcie ochrony łańcucha bocznego wykonano procedurą HF. Sekwencje peptydów i syntetyzowane analogi znajdują się w tabeli 1.

Analog peptydu 278m odpowiada pozycjom 458-474 mysiego, hsp65, a analog 278mt odpowiada pozycjom 431-447 mikobakteryjnego hsp65.

Zsyntetyzowano również następujące peptydy kontrolne: peptyd 277 (S), analog peptydu p277 odpowiadający pozycjom 437-460 ludzkiego hsp65 (WO 90/10449), w którym reszty Cys (C) w pozycjach 342 i 347 zastąpiono przez reszty Ser (S); peptyd 348h odpowiadający pozycjom 449-460 ludzkiego hsp65; peptyd CR 77-83 odpowiadający

17*4 082 pozycjom 77-83 ludzkiej proteiny C-reaktywnej, oraz peptyd SerRes, wyprowadzony z jeżowca morskiego.

Peptydy II, 277(S), SerRes, 278mt oraz CRP 77-83 zsyntetyzowane jak wyżej. Peptydy 278h, 278m oraz 348h wytworzono w zautomatyzowanym syntetyzatorze (Applied Biosystem model 430A) przy użyciu protokołów firmy dla strategii t-butyloksykarbonylu (t-Boc).

c. HPLC (Wysokosprawna chromatografia cieczowa) z odwróconymi fazami: Końcowe oczyszczenie produktów peptydowych wykonano przy użyciu półpreparatywnej kolumny HPLC RP18 (Merck, Darmstadt, Niemcy) stosując układ chromatografii cieczowej SP8750 wyposażony w detektor o zmiennej długości fali SP8733 w gradientach woda-acetonitryl zawierających kwas trifluorooctowy (TFA) 0,1%. Odcieki monitorowano za pomocą absorbancji przy 220 nm. Acetonitryl stopnia czystości HPLC nabyto od Merck (Darmstadt, Niemcy). Peptydy o czystości HPLC scharakteryzowano za pomocą analizy aminokwasów.

d. Vi: Vi oczyszczony z Citrobacter freundii WR7011 (dostarczony przez J.B. Robbinsa i S.C. Szu, National Institute of Health, Bethesda, Maryland) zawierało <1% (każdego) proteiny, kwasu nukleinowego, oraz lipopolisacharydu. Rozmiar cząsteczki Vi oceniono na 3 ' 103 ,W.

Tabela 1

Sekwencje syntetycznych peptydów

Nr	Pochodzenie peptydu	Nazwa peptydu	Sekwencja
1	Ludzki hsp65 (458-474)	278h	NEDOKIGIEIIKRTLKI
2	analog hsp65	278m	NEDOKIGIEIIKRALKI
3	analog hsp65	278mt	EGDEATGANIVKVALEA
4	ludzki hsp65 (437-448)	PepII	VLGGGSALLRSI
5		277(S)**	VLGGGSALLRSIPALDSLTPANED
6	ludzki hsp65 (449-460	348h	PALDSLTPANED
7	ludzka proteina C-reaktywna (77-83)	CRP77-83	VGGSEIL
8	Jeżowiec morski	SerRes	LRGGGVCGPAGPAGTVCS

* Peptydy nr 5,6,71 8 użyto w celach kontrolnych ** Peptyd 277(S) jest trwałym analogiem peptydu 277 (WO 90/10449) odpowiadającym pozycji 437-460 ludzkiego hsp65, w którym reszty cysternowe (C) w pozygach 442 i 447 zamieniono przez reszty serynowe (S).

e. Koniuganja Vć oraz; syntetyynnyyh zyptydrw: Różne pr^epury doniuganji padsumowano na Schemacie 1.

174 082

Schemat 1: Procedury łączenia

Struktura powtarzającego się segmentu polisacharydu

CO-NH-AC-CO-NH-Pep-COOH

NAc

AC = kwas 2-aminokapronowy sDCC = DCC rozpuszczalne w wodzie HOSU = N-hydroksysukcynimid

174 082

Procedura 1:

Połączenie Vi oraz peptydu poprzez rozpórkę (a):' Podczas syntezy w fazie stałej, Peptyd ll rozszerzono na końcu N przy użyciu zwykłej procedury dodawania reszty aminokwasowej, przez kwas Boc-c-aminokapronowy (AC), działający jako rozporka w koniugacie Vi-peptyd. Równe ilości Vi oraz peptydu ll-AC rozpuszczono w minimalnej objętości wody podwójnie destylowanej (ddw) i pH doprowadzono do około 6. Dwa równoważniki (eqv.) rozpuszczalnego w wodzie karbodiimidu (CDl; chlorowodorek 1(3-dimetyloaminoprapylo)-3-etylokarbodiimidu) dodano dwukrotnie w odstępach kilku godzin, a mieszaninę reakcyjną pozostawiono dla inkubacji przez noc (ON). Nieoczyszczony koniugat dializowano wobec soli buforowanej fosforanem (PBS), natomiast gęstość peptydu w Vi tzn. stopień związania peptydu z Vi oznaczono przez analizę aminokwasową (zob. tabela 2).

Określenie ilości Vi kowalencyjnie związanego z peptydem wykonano za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTlR).

Procedura 2:

Połączenie Vi aktywowanego N-hydroksysukcynimidem oraz peptydu przez rozpórkę. Przed połączeniem z peptydem ll-AC, funkcje karboksylowe Vi aktywowano przez reakcję z N-hydroksysukcynimidem (Sigma). Jeden równoważnik Vi zawieszono w NMP (N-metylopirolidon, Riedel De. Haen, Niemcy), worteksowano i odwirowywano przez 5 min w wirówce Eppendorfa. Grudkę ponownie zawieszono w NMP, po czym dodano po 5 równoważników N-hydroksysukcynimidu oraz rozpuszczalnego w wodzie karbidiimidu (CDl), odpowiednio, i inkubowano przy delikatnym mieszaniu. Po kilku godzinach, mieszaninę reakcyjną odwirowano i ciecz sklarowaną zawierającą ester Nsukcynimidowy Vi zmieszano z 1 równoważnikiem peptydu ll-Ac rozpuszczonego w wodnym roztworze przy pH 7,5. Po kilku godzinach inkubacji, koniugat dializowano wobec ddw, a gęstość peptydu oznaczono za pomocą analizy aminokwasów (zob. tabela 2).

Tabela 2

Koniugaty zastosowane jako immunogeny

Koniugat Vi-peptyd	Procedura łączenia·1	monomer peptyd/Vi2 (stosunek molowy)
Vi-Pep II	1	1/127
Vi-Pep II*	2	1/400
Vi-Pep 278h	3	1/25
Vi-Pep 348h	3	1/22
Vi-Pep CRP77-83	4	1/14
Vi-Pep 277 (S)	4	1/10
Vi-Ova3	3	1/175

Procedura łączenia 1-4 opisana w punkcie Materiały i Metody

Gęstość peptydu oznaczono przez analizę aminokwasów

Ova = Owalbumina

174 082 Tabela 3

Ilość skoniugowanego peptydu wstrzyknięta na 1 mysz a) przy uodpornieniu za pomocą 0,25 fig skoniugowanego Vi na 1 mysz.

Koniugat Vi-peptyd	Wstrzyknięta ilość peptydu/l mysz
Vi-Pep II	0,010 ug
Vi-Pep 278h	0, 170 ug

b) przy uodpornieniu za pomocą 2,50 μg skoniugowanego Vi na 1 mysz.

Koniugat Vi-peptyd	Wstrzyknięta ilość peptydu/1 mysz
Vi-Pep II	0,100 ug
Vi-Pep II*	0,030 ug
Vi-Pep 278h	1,000 ug
Vi-Pep 348h	0,600 ug
Vi-Pep CRP 77-83	0,510 ug
Vi-Pep 277(S) Vi + Pep (zmieszane) Vi-Ova	2,200 ug 2,500 ug 2,200 ug

Procedura 3:

Połączenie Vi oraz proteiny/peptydu bez rozporki. Jeden równoważnik Vi oraz 1 równoważnik proteiny/peptydu rozpuszczono w minimalnej objętości ddw i inkubowano przez 12 godz. w temperaturze pokojowej (RT) przy pH 6 w obecności 2 równoważników rozpuszczalnego w wodzie CDI (dla koniugujących peptydów) oraz 60 równoważników CDI (w przypadku proteiny), odpowiednio. Po dializie mieszaniny reakcyjnej, gęstość proteiny/peptydu oznaczono za pomocą analizy aminokwasów (zob. tabela 2).

Procedura 4:

Połączenie Vi oraz peptydu w następstwie przedłużenia łańcucha peptydowego przez rozpórkę w roztworze (b). Aby aktywować grupę karboksylową kwasu t-Boc-εaminokapronowego (t-Boc-AC) za pomocą N-hydroksysukcynimidu, 1 mmol t-Boc-AC zmieszano z 1.15 mmolami N-hydroksysukcynimidu w minimalnej objętości dioksanu (Merck, Niemcy); dodano 1,15 mmoli N,N-dicykloheksylokarbodiimidu (DCC) rozpuszczonego w dioksanie i po 3 godz. mieszaninę reakcyjną przesączono i przemyto dioksanem. 0,1 mmola żądanego peptydu rozpuszczono w małej ilości ddw i zmieszano z 0,2 mmolami KHCO3 (Merck). Roztwór estru N-hydroksysukcynimidowego t-Boc-AC

174 082 oraz sporządzony roztwór peptydu zmieszano i poddano przez 1 godz. reakcji intensywnie mieszając. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono ddw (10 ml), ochłodzono i zakwaszono 1N KHSO4. Produkt ekstrahowano octanem etylowym. Roztwór organiczny przemyto ddw, osuszono nad Na2SO4 i odparowano do suchości. Po suszeniu produktu przez 2 godz. nad P 2O5, rozpuszczeniu go w 4-5 ml TFA (Merck) i poddaniu reakcji przez 10 min, ciecz odparowano w próżni w 30°C. Związek przemyto dwukrotnie CH2CI2 i płyn odparowano przed suszeniem 2-3 godz. nad P2O5. Następnie produkt peptyd-AC rozpuszczono w ddw, a pH doprowadzono do 8. Dodano 5 mg estru Nhydroksysukcynimidowego Vi (przyrządzonego jak opisano w Procedurze 2).

Po kilku godzinach inkubacji, otrzymany koniugat Vi-AC-peptyd dializowano wobec ddw. Gęstość peptydu w koniugacie oznaczono za pomocą analizy aminokwasów (wyniki przedstawiono w tabeli 2).

f. Koniugacja fragmentów Vi oraz peptydów syntetycznych. Fragmenty Vi (dostarczone przez Dominique Schulz, Pasteur-Merieux, Francja) połączono z syntetycznymi peptydami jak opisano w Procedurze 3 powyżej.

g. Koniugacja wszystkich syntetycznych polipeptydowych poli(Phe, DGlu)-poli(Pro)poli(Lys) (dalej zwanych FEPK) oraz syntetycznych peptydów hsp65. Syntetyczny losowo rozgałęziony polipeptyd FEPK (dostarczony przez grupę Prof. Edna Mozesa i Michaela Sela, Naukowy Instytut Weizmanna, Izrael) połączono z syntetycznymi peptydami hs65 według Procedury 3.

h. Uodpornienie. Myszy BALB/c (samice) (otrzymane od Olac) w wieku 2-3 miesiące, uodporniono podskórnie (sc) i śródmięśniowo (im), odpowiednio, raz, dwa, Iub trzy razy w odstępach 12-dniowych samym Vi, koniugatem Vi Iub Vi zmieszanym z peptydem. Wstrzyknięta ilość antygenu jak również użyty adiuwant zmieniał się od doświadczenia do doświadczenia. Myszy z każdej grupy eksperymentalnej wykrwawiono 12 dni po każdej iniekcji (72 dni po ostatniej iniekcji dla długoterminowego uzupełnienia tworzenia przeciwciał anty-Vi.

i. Serologia.. Poziomy przeciwciała Vi ujawnione u myszy z rodzimym Iub koniugowanym Vi określono za pomocą próby z immunosorbentem połączonym z enzymem (ELISA). Ponieważ ujemnie naładowane polisacharydy nie przyłączają się dobrze do polistyrenu powszechnie stosowanego w próbie ELISA w stałej fazie, do powleczenia Vi na stałej powierzchni z bardzo małym wiązaniem niespecyficznym użyto dodatnio naładowanej metylowanej albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Co do szczegółów, 0,5 mg Vi rozpuszczono w 1 ml PBS i mieszano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. 10 mg metylowanego BSA (Sigma) zawieszono w 1 ml H2O i otrzymany roztwór przesączono na filtrze 0,8 μ m. Aby przyrządzić roztwór do powlekania, 1 ml rozpuszczonego polisacharydu mieszano przez 20 min w temperaturze pokojowej z 50 μΐ metylowanego roztworu BSA, a następnie rozcieńczono 1:20 w PBS. Płytki z mikrowgłębieniami Nunclon delta Si pokryto przez 3 godz. w 37°C 100 μΐ roztworu do powlekania na zagłębienie (2.5 μg Vi/zagłębienie). Płytki przemyto 5 razy PBS zawierającym 0,33% Brij35 (Sigma) i zablokowano roztworem PBS oraz 1% suszonego chudego mleka przez 2 godz. w 37°C. Po przemyciu, 10 μΐ próbek rozcieńczonych nieznanych surowic i rozcieńczonej standardowej surowicy (bufor rozcieńczający zawierający 1% chudego mleka i 0,33% Brij35 w PBS) dodano, a płyty inkubowano przez 1 godz. w 37°C. Surowice odniesienia i badane naniesiono na płyty w dwóch egzemplarzach. Niezwiązane przeciwciała usunięto przez przemywanie i odpowiednie rozcieńczenie koniugatu fosfatazy alkalicznej-koziego anty-mysiego Fab2 IgG (Sigma), w przypadku surowic badanych oraz kozi koniugat enzym Fab2 anty-IgG końskiego (Sigma), w przypadku surowicy standardowej, dodano do płytek (100 μ l na zagłębienie). Po inkubacji przez 2 godz. w 37°C, płytki przemyto i wywołano zabarwienie przez dodanie 100 μΐ roztworu substratu zawierającego 0,6 mg/ml p-nitrofenylofosfatu (Sigma) w dietanoloaminie-H20 (pH 9,8). Reakcję enzymu

174 082 zatrzymano 20 min później przez dodanie 10 μΐ 5N NaOH na zagłębienie. Gęstości optyczne odczytano przy 405 nm. Standardową surowicę anty-Vi Burro 260, zawierającą 550 mg Vi przeciwciała/ml przyrządzono przez wielokrotne dożylne iniekcje umocowanego w formalinie S. typhi Ty2 (otrzymanego od J.B. Robbinsa oraz S.C. Szu, NIH, Maryland). Otrzymane wyniki wyrażono jako gęstość optyczną odczytaną przy 405 nm lub jako Tg Vi przeciwciała/ml.

Przykłady

Przykład I. Przygotowanie koniugatów Vi-peptyd/proteina.

Koniugaty Vi z peptydem II przygotowano przez procedurę łączenia 1 (Vi-Pep II) lub 2 (Vi-Pep II*). Koniugaty Vi z peptydami 278, 278m, 278mt, 348h oraz owalbuminą (Ova) sporządzono według procedury łączenia 3, a koniugaty Vi z CRP 77-83 oraz 277 (S) wg procedury łączenia 4.

Skład pewnych spośród koniugatów Vi określono za pomocą analizy aminokwasowej. Wyniki przedstawione w tabeli 2 wskazują, że stosunek molowy peptyd/proteina monomer w stosunku do Vi był zmienny. Okazało się, że dawki peptydów 0,1-2,0 Tg wstrzyknięte na jedną mysz w postaci koniugatu cukier-peptyd były najbardziej skuteczne.

Tabela 4

Odpowiedź przeciwciała surowicy myszy BALB/c (samic), którym wstrzyknięto Vi lub koniugat Vi-peptyd

	Przeciwciało Vi
Szczepionka	Dawka	12 dni po 1	24 dni po 1	12 dni po 2
	Vi	uodpornieniu	uodpornieniu	uodpornieniu
	mg	mg/ml	mg/ml	mg/ml
Vi	0, 25	0,194	0, 005	0, 053
Vi-Pep 278h	0,25	0, 049	1,455	2,959
		(0,000-0,078)	(0,296-1,906)	(1,533-3,148)
BALB/c PBS	-	0,223	0,205	0,233

Myszom BALB/c (samice) w wieku 2-3 miesięcy wstrzyknięto podskórnie co 2 tygodnie 0,2 ml każdej ze szczepionek w I-FA. W każdej grupie eksperymentalnej było 5 mysz. 12 i 24 dni po pierwszym oraz 12 dni po drugim uodpornieniu myszy wykrwawiono i ich surowice badano na przeciwciała Vi za pomocą testu ELISA jak opisano w punkcie Materiały i metody. Wyniki wyrażono jako średnią geometryczną; w nawiasach podano zmianę stężenia przeciwciała Vi w każdej grupie.

Przykład II. Charakterystyka immunologiczna Vi i koniugatów Vi.

II. 1 Antygenność rodzimego Vi. Aby zbayać odpowiedź przźciwciała wywołaną przez Vi, 2-3 miesięcznym myszom BALB/c (samicom) (trzy-cztery myszy na grupę)

174 082 wstrzykiwano podskórnie (sc) w zmieniających się dawkach sam antygen Vi w adiuwancie Incomplete Freund (IFA) w odstępie 2 tygodni. Myszy wykrwawiono 12 i 24 dni po pierwszym i 12 dniach po drugim uodpornieniu. Surowice wszystkich myszy należących do jednej grupy zbierano. Przeciwciała anty-Vi zmierzono za pomocą ELISA jak opisano za pomocą ELISA jak opisano w punkcie Materiały i metody w niniejszym tekście, a specyficzne poziomy przeciwciał wyrażono jako Absorbancjaąos (A405).

Jak uwidoczniono na fig. 1, jedna iniekcja Vi ujawniła odpowiedź przeciwciała u myszy. Powtórna iniekcja Vi nie wywołała efektu wspomagania, jak spodziewano się dla antygenów T-ind. Podskórne uodpornienie przy użyciu 2,5 μg Vi na 1 mysz w IFA dało najsilniejsze specyficzne wytwarzanie przeciwciała; wyższa dawka nie dała w wyniku zwiększonej odpowiedzi immunologicznej.

Preparat Vi stosowany w tym doświadczeniu zawierał resztkowe ilości proteiny (< 1%). Względnie wysoka odpowiedź immunologiczna Vi mogłaby być wyjaśniona przez ten fakt.

II. 2 Antygenność koniugat Vi.

II. 2.1 Zależność od wstrzykniętej dawki antygenu. Badano efekt różnych dawek na immunogenność postaci: rodzimej i skoniugowanej Vi. Wywołano u myszy odpowiedź przeciwciała anty-Vi przez iniekcję 2,5 fig lub 0,25 fig samego Vi lub koniugatów Vi Vi-Pep II, Vi-Pep278h, Vi-Pep348h obejmujących 2,5 μg lub 0,25 μg Vi. Cztery myszy BALB/c (samice) na grupę uodporniono sc za pomocą 2,5 μg samego Vi lub jako koniugat w IFA w odstępach 2 tygodni (wstrzyknięte ilości peptydu jako koniugat patrz tabela 3). Odpowiedź przeciwciała anty-Vi zmierzono za pomocą ELISA, a wielkość specyficznej odpowiedzi immunologicznej przedstawiono na fig. 2 jako A405. Każdy panel przedstawia średnie geometryczne surowic otrzymanych z 4 pojedynczych myszy, którym wstrzyknięto ten sam antygen. Zebrane surowice 4 myszy immunizowanych samym Vi lub PBS w IFA, odpowiednio, służyły do celów kontrolnych.

Wyniki przedstawione na fig. 2 pokazują, że 12 dni po pierwszej iniekcji 2,5 μg samego Vi lub w postaci koniugatu (odpowiadające temu ilości wstrzykniętego peptydu - patrz tabela 3), wszystkie z koniugatów Vi-peptyd wykazywały odpowiedzi immunologiczne anty-Vi niższe niż te ujawnione przez Vi w jego rodzimej postaci (fig. 2a, panel A). Monitorowanie poziomów przeciwciała Vi przez dodatkowy okres 12 dni bez ponownego uodpornienia wskazało na wyraźny wzrost przeciwciał specyficznych Vi u myszy, którym wstrzyknięto Vi-Pep278h (fig. 2a, panel B). Powtórna iniekcja ujawniła określoną reakcję wspomagającą po uodpornieniu za pomocą Vi-Pep II oraz ViPep278h, odpowiednio, lecz nie w przypadku samego Vi (fig. 2a, panel C).

Obniżenie dawki wstrzykniętego Vi do 0,25 μ g na 1 mysz (odpowiadająca temu ilość wstrzykniętego peptydu, patrz tabela 3a) dało w rezultacie jedynie mniejsze poziomy przeciwciała Vi wywołane przez samo Vi oraz Vi-Pep II (fig. 2b, panele A-C). Natomiast, odpowiedź immunologiczna ujawniona przez koniugat Vi-pep278h pokazała, po drugim uodpornieniu wyraźny efekt wspomagania (fig. 2b, panel C). Jest rzeczą interesującą, że ilość wstrzykniętego peptydu w tym koniugacie wyniosła jedynie 0,17 μg na zwierzę (patrz tabela 3a).

II. 2.2. Zbadano kinetykę wytwarzania przeciwciała anty-Vi wywołanego przez Vi oraz koniugaty Vi u myszy uodpornionych jak opisano powyżej. Poziomy przeciwciał anty-Vi wyższe niż wywołane przez samo Vi są uważane za wartości dodatnie, poziomy przeciwciał anty-Vi niższe niż wywołane przez samo Vi są uważane za wartości ujemne. Surowice zbadano na przeciwciała Vi za pomocą ELISA. Wyniki podano na fig. 3 jako Ao5 i pokazują średnie geometryczne +/-SD otrzymane przez surowice 4 myszy poddanych iniekcji na antygen.

Fig. 3(a-b) przedstawiają rozwój wytwarzania przeciwciała Vi po dwóch następujących po sobie iniekcjach Vi oraz koniugatów Vi w dwóch różnych dawkach antygenu. Figura 3a(A): 2,5 fig Vi wstrzykniętego na mysz z Vi-Pep II, Vi-Pep278h, Vi-Ova, Vi-Pep348 oraz Vi-CRP 77-83; Fig. 3b(A): 0,25 μg Vi wstrzyknięte na mysz z Vi-Pep II

174 082 oraz Vi-Pep278h. Panele B - dla celów porównania, poziomy przeciwciała Vi wywołane przez 2,5 fig samego Vi. Jak uwidoczniono na fig. 3a(A), 12 dni po pierwszym uodpornieniu, wszystkie z koniugatów wywołały wyraźnie niższe poziomy przeciwciał Vi niż ujawnione przez samo Vi, pomimo wstrzyknięcia tej samej ilości Vi. Po fazie odstawania przez około 12 dni, surowice zwierząt uodpornionych koniugatami Vi wykazały wyraźny wzrost specyficznego poziomu przeciwciała Vi. Efekt ten jest szczególnie widoczny dla koniugatu Vi-Pep278h w obydwu zastosowanych dawkach (fig. 3 a-b panele A). Powtórna iniekcja po 24 dniach spowodowała odpowiedź wspomagającą typową dla antygenów T-dep (dla porównania - patrz panele B na fig. 3a-b). Vi-Pep II, Vi-Pep278h oraz Vi-Ova wywołały wyższe poziomy przeciwciał Vi niż ujawnione przez wstrzyknięcie samego Vi. Znaczące jest, że koniugat Vi-Pep278h spowodował silniejszą odpowiedź immunologiczną niż koniugat Vi-proteina Vi-Ova (fig. 3a, panel A).

Uodpornienie dziesięciokrotnie niższą dawką antygenu podkreśliło opisany efekt wytwarzania przeciwciała Vi wywołanego przez Pep278h (fig. 3b, panel A).

Stężenia przeciwciała Vi ujawnione u myszy przez koniugat Vi-Pep278h podano w tabeli 4. Specyficzny poziom przeciwciała wywołany przez Vi-Pep278h wykazał 30krotny wzrost od dnia 13 do dnia 24 po pierwszym uodpornieniu. Powtórna iniekcja dała w rezultacie podwojenie stężenia przeciwciała Vi do około 3 Tg/ml, 55-krotnie więcej niż ujawniono dla samego Vi.

II. 2.3. Specyficzność przeciwciała anty-Vi. Odpowiedź immunologiczna na antygeny T-dep cechuje się tworzeniem centrów namnażania, które są połączone z koncepcją pamięci immunologicznej. Uważa się, że dostarczają one szczególne mikrośrodowisko pozwalające na to, by komórki B podlegały hipermutacji genu V aby wyrazić przeciwciała o receptorach o wyższym powinowactwie i zmienionym rozkładzie izotypów.

Aby zbadać, czy Vi-specyficzne komórki B wywołane przez koniugaty Vi-peptyd podlegają temu procesowi dojrzewania, porównano specyficzność przeciwciał Vi ujawnionych przez Vi w postaciach: rodzimej i skoniugowanej. Cztery-pięć myszy BALB/c (samice) uodporniono antygenami Vi, Vi-Pep II oraz Vi-Pep278h (sc w IFA, przy czym każde z nich zawierało 2,5 Tg Vi bądź samego bądź w postaci koniugatu. Zwierzęta wykrwawiono 12 dni po drugiej iniekcji i przeciwciała Vi oznaczono za pomocą próby ELISA. Symbole na fig. 4 określają poszczególne reprezentatywne myszy z każdej grupy. Płytki ELISA pokryto 2,5 Tg Vi na zagłębienie (panel A) Iub 1,25 Tg Vi na zagłębienie (panel B); fig. 4 (panel A) pokazuje, że miana przeciwciał Vi-specyficznych wywołanych przez samo Vi są niższe niż wywołanych przez Vi-Pep278. Zmniejszenie ilości antygenu pokrytego na płytce ELISA (fig. 4, panel B) uwidacznia nawet wyraźniejszy obraz. Przeciwciała Vi wywołane przez koniugaty Vi-peptyd rozpoznają w znaczących stopniach zmniejszoną ilość Vi, podczas gdy surowiec myszy uodpornionych rodzimym Vi ledwie wykazują jakiekolwiek wiązanie.

Aby dodatkowo potwierdzić charakterystykę T-dep koniugatów Vi-peptyd, oznaczono rozkład izotypów ujawnionych przeciwciał Vi u myszy uodpornionych jak wyżej samym Vi lub Vi-pep278h. Skład IgM oraz IgG przeciwciał anty-Vi u uodpornionych myszy zbadano za pomocą ELISA. Specyficzne przeciwciała IgM, rozpoznające Vi, wykryto przez zastosowanie koniugatu peroksydazy IgM - koziego anty-mysiego Fab2 IgG (fig. 5, panel A), oraz specyficzne przeciwciała IgC wykryto przez zastosowanie koniugatu alkalicznej fosfatazy - koziego anty-mysiego Fab2 IgG (fig. 5, panel B). Wyniki podano dla pojedynczych reprezentatywnych myszy.

Specyficzność izotypowa surowic anty-Vi uzyskana po powtarzanym uodpornieniu uwidoczniono na fig. 5. Przeciwciała do cząsteczki rodzimego Vi zdają się być ograniczone głównie do klasy izotypu UgM, podczas gdy koniugat Vi-Pep278 ujawnił ponadto wyraźną odpowiedź przeciwciała IgG na antygen Vi, wskazującą, że łączenie wybranego epitopu komórki T (w tym przypadku - peptydu 278h) do antygenu T-ind, podobnie jak Vi, daje w wyniku zmianę klasy izotypu Vi-specyficznej populacji komórki B, jak to jest zwykle obserwowane dla antygenów T-dep.

174 082

Aby kontynuować długookresowe wytwarzanie przeciwciała anty-Vi, zwierzęta uodporniano po raz trzeci i specyficzną odpowiedź immunologiczną monitorowano przez okres 72 dni. Grupom 4-5 myszy BALB/c (samic) wstrzyknięto sc samo Vi, Vi-Pep II oraz Vi-Pep278h antygeny w IFA w momentach czasowych zaznaczonych na fig. 6. Odpowiedź immunologiczną monitorowano przez czas 108 dni (72 dni po ostatnim uodpornieniu) przez określanie poziomu przeciwciała Vi w różnych surowicach za pomocą ELISA. Uzyskane wyniki wyrażono jako średnie geometryczne i podano przy rozcieńczeniu surowicy 1:100 (panel A) oraz 1:1000 (panel B). Nie można było zaobserwować żadnego efektu wspomagania po tej dodatkowej iniekcji koniugatów peptyd Vi V-Pep II oraz Vi-Pep278h. Poziomy anty-Vi wywołane przez koniugaty były wyższe niż te ujawnione przez samo Vi i nie obniżyły się po 2 1/2 miesiącach (fig. 6) i nawet po 6 miesiącach (dane nie uwidocznione) po ostatniej iniekcji.

II.2.4. Wpływ adiuwanta oraz trybu uodpornienia na wytwarzanie przeciwciała anty-Vi wywołane przez Vi-Pep II. Aby zbadać wpływ adiuwanta na tworzenie Vispecyficznego przeciwciała przez rodzime i zmodyfikowane Vi, antygeny bądź wstrzykiwano podskórnie w IFA bądź w PBS. Koniugat Vi-Pep II przyrządzono w IFA oraz w PBS. Jednej grupie 4 myszy wstrzyknięto sc (panele A), a drugiej grupie im (panele B) w każdym przypadku preparat antygenu (2,5 ug Vi wstrzykniętego na 1 mysz). Surowice otrzymano 12 (panele a) oraz 24 dni (panele b) po pierwszym uodpornieniu (panele c), przeciwciała anty-Vi zmierzono za pomocą ELISA, co uwidoczniono jako A05 podając średnie +/- SD. Wyniki przedstawione na fig. 7A wskazują, że IFA jest niezbędne do wyrażenia kinetyki odpowiedzi immunologicznej T-dep.

Zmianą trybu uodpornienia przez podanie Vi domięśniowo (im) można zilustrować 2 fakty (jak pokazano na fig. 7B). Po pierwsze, domięśniowe podanie koniugatu Vi prowadzi do wyższej pierwotnej odpowiedzi immunologicznej niż ujawniona przez podanie podskórne tego samego preparatu antygenowego. Po drugie, ta droga iniekcji nie daje w wyniku efektu wspomagania, jak to zaobserwowano w przypadku uodpornienia podskórnego. Ten sam trend zaobserwowano przez wstrzyknięcie Vi-pep II w PBS, podskórnie lub domięśniowo (fig. 7a-B).

W dalszych doświadczeniach z myszami uodpornianymi koniugatem Vi-278h w IFA, PBS lub CFA (adiuwant Complte Freund), uzyskano podobne miana przeciwciał anty-Vi uzyskano z trzema adiuwantami (danych nie uwidoczniono).

H.2.5. Wytwarzanie przeciwciała anty-Vi wywołane przez wolny peptyd II zmieszany z Vi przed uodpornieniem. Dla oceny niezbędności kowalencyjnego wiązania Vi do epitopów peptydowych przed uodpornieniem, Vi oraz Pep II zmieszano fizycznie i wstrzyknięto podskórnie w IFA grupie myszy BALB/c (samice) i porównano z uodpornieniem koniugatem Vi-Pep II. Obydwa preparaty antygenowe wstrzyknięto sc grupie 4 myszy w IFA (mieszanina Pep II i Vi wstrzyknięta w 1 strzykawce). Zwierzęta były krwawione 12 i 24 dni po pierwszym (panele A i B, odpowiednie) oraz 12 dni po drugim uodpornieniu (panel C). Przeciwciała anty-Vi oznaczono przez ELISA i wyniki przedstawiono jako Aws· Każda krzywa przedstawia średnie geometryczne +/-SD.

Jak przedstawiono na fig. 8, mieszanie Vi i peptydu II dało w wyniku dokładnie tę samą odpowiedź immunologiczną jak opisano dla koniugatu Vi-Pep II. Pierwsze uodpornienie prowadziło jedynie do niskich poziomów przeciwciała Vi, podczas gdy powtórna iniekcja spowodowała wyraźny efekt wspomagania.

Π.2.6. Wpływ napiętnowania nośnika na wytwarzanie przeciwciała anty-Vi. Aby zbadać wpływ napiętnowania wolnego peptydu na odpowiedź polisacharydu wywołaną przez koniugaty Vi-peptyd, grupę 4 myszy BALB/c (samice) napiętnowano sc 2 ug peptydu II w IFA na 1 zwierzę. Dwa tygodnie później zwierzętom wstrzyknięto koniugat Vi-Pep II, zawierający 2,5 u g Vi. Surowice pobrano w momentach czasowych wskazanych na fig. 9 i poddano analizie za pomocą ELISA. Poziomy przeciwciał antypolisacharydowych, jak zmierzono we wskazanych momentach czasowych, uwidoczniono na fig. 9. Napiętnowanie dawką 1 u g peptydu II na 1 mysz dało w wyniku silniejszego

174 082 pierwotną reakcję immunologiczną na Vi w porównaniu do poziomów przeciwciała ujawnionych u zwierząt nie napiętnowanych. Niemniej, nie zaobserwowano żadnego efektu napiętnowania dotyczącego wtórnej odpowiedzi immunologicznej.

11.2.7. Odpowiedź immunologiczną anty-Vi można wywołać przez Vi-Pep278H lecz nie przez Vi-Pep277(S) u tej samej pojedynczej myszy. Grupę 4 myszy BALB/c (samice) wstrzyknięto sc Vi-Pep277(S) w IFA w odstępie 2 tygodni (zawartość Vi w goniupacie wstrzykniętym każdej myszy 2,5 μ g). Odpowiedź immunologiczną anty-Vi określono 12 dni po pierwszej i 12 dni po drugiej iniekcji za pomocą ELISA fig. 10, panele A i B, odpowiednio). Dwóm spośród tych zwierrz^t wstrzyknięto powtórnie Vi-Pep278h, dwóm innym - samo Vi (2,5 μg Vi samego Iub jako koniugat). Ponownie, myszy wykrwawiono 12 dni po pierwszym i drugim uodpornieniu i oznaczono poziomy przeciwciała Vi. Dla porównania, odpowiedź immunologiczna wywołana u zwierząt, którym wstrzyknięto jedynie Vi-Pep278h, jest naniesiona na tym samym rysunku. Wyniki podano jako A405 i przedstawiono dla 2 różnych rozcieńczeń surowicy, 1:50 (fig. 10, panele a) oraz 1:1000 (fig. 10, panele a) oraz 1:1000 (fig. 10, panele b). Dane podają średnie geometryczne +/-SD. Antygen A = Vi-Pep277(S), Antygen B = Vi-pep278h (po tym jak myszom wstrzyknięto Vi-Pep277(S), Antygen C = sam Vi (po tym jak myszom wstrzyknięto Vi-Pep277(S), Antygen D = Vi-Pep278h.

Jak uwidoczniono na fig. 10, uodpornienie myszy BALB/c (samice) Vi-Pep277(S) nie dało w wyniku wykrywalnej odpowiedzi przeciwciała Vi (Antygen A). Aby zbadać czy brak odpowiedzi można przypisać indywidualnym myszom czy też cechom charakterystycznym związanym z konkretnym koniugatem, te same myszy, które nie reagowały na Vi-Pep277(S), uodporniono za pomocą Vi-Pep278h (Antygen B) Iub rodzimego Vi (Antygen C), odpowiednio. Powtórna iniekcja Vi-Pep278h mogłaby zdecydowanie zwiększyć poziomy przeciwciała Vi, jak uwidoczniono dla przypadku myszy, którym wstrzyknięto jedynie Vi-Pep278h (Antygen D). Powtórna iniekcja samego Vi również zwiększyła odpowiedź immunologiczną Vi, jednak w mniejszym stopniu niż te wywołane przez koniugat Vi.

11.2.8. Rozpoznanie koniugatów Vi-peptyd przez różne surowice anty-Vi, Vi oraz koniugaty Vi-peptyd Vi-Pep II, Vi-Pep II*, VI-Pep278h oraz Vi-CRP77-83 użyto jako immunogeny pokryte na płytkach ELISA i sprawdzono na rozpoznanie przez surowice uzyskane ze zwierząt uodpornionych odpowiadającym temu koniugatem Iub przez surowice uzyskane ze zwierząt uodpornionych innymi koniugatami Vi. Ilość związanego przeciwciała oznaczono za pomocą ELISA i wyrażono na fig. 11 jako A405. Standardową surowicę anty-Vi Burro 260 (panel A) użyto przy rozcieńczeniu surowicy 1:12000, inne surowice (panele B-F) użyto przy rozcieńczeniu 1:200.

W celu zanalizowania czy łączenie peptydów zmieniło antygenową strukturę ugrupowania Vi w koniugacie, skanowano różne koniugaty Vi, jak również rodzimy Vi na rozpoznawanie przez anti-Vi surowicę odniesienia Burro 260 (fig. 11, panel A). Wiązanie peptydu do Vi widocznie wpłynęło na antygenową aktywność cząsteczki Vi, ponieważ wszystkie koniugaty wykazały w porównaniu do rodzimego Vi, zmniejszone rozpoznanie przez antysmOwicę Burro 260. Nie znaleziono korelacji z ilością peptydu załadowanego na cząsteczkę Vi (patrz tabela 2). Niemniej, wyniki te mogłyby częściowo wyjaśnić stwierdzone różnice co do aktywności antygenowej wyrażonej przez różne koniugaty Vi-peptyd. Vi-Pep II oraz Vi-Pep278h wydają się wiązać większe ilości przeciwciała zawartego w antysurowicy Burro 260 niż mniej ^m^ogen^ koniugaty Vi-Pep II* oraz Vi-Pep CRP 77-83.

Charakterystykę przeciwciał Vi wywołanych przez różne koniugaty pokazano na fig. 11, panele B-F. Antysurowicę wywołane przez Vi-Pep II oraz Vi-Pep278h wykazały najwyższą reaktywność krzyżową z cząsteczką rodzimego Vi, lecz zaskakująco wykazały jedynie niskie rozpoznanie koniugatu, w stosunku do którego zostały użyte. Antysurowicę uzyskane po wstrzyknięciu Vi-Pep II oraz Vi-Pep CR 77-83 nie wykazywały jakiegokolwiek wiązania do cząsteczki rodzimego Vi Iub przedstawionych antygenów komnatowych.

Oprócz specyfiki wybranego peptydu, wyniki te wskazują na wpływ załadowania peptydu i procedury łączenia na immunogenne cechy koniugatu Vi-peptyd.

11.2.9. Odpowiedzi immunologiczne na koniugaty Vi-peptyd u różnych szczepów myszy. Dla zbadania immunogenności koniugatów Vi-peptnd u kongenicznych szczepów myszy różniących się jedynie ich genami MHC, myszy BALB/c (H-2^c), BALB/k (H-2^k) oraz BALB/b (H^) uodporniono samym Vi lub koniugatami Vi-278h, Vi-278m, Vi278mt, Vi-277(S), Vi-SRes (Vi-SerRes). Pięciu myszom na grupę z każdego ze szczepów BALB/c, BALB/k, BALB/b, NOD oraz NON.NOD (fig. 12, panele A do E, odpowiednio) wstrzyknięto sc 2 μg Vi koniugatów wskazanych na rysunku, emulgowanych w IFA. Po 4 tygodniach myszy uzyskały wspomaganie w postaci tej samej dawki antygenu i wykrwawiono je 12 dni później. Surowice indywidualnych myszy sprawdzono na przeciwciała Vi metodą ELISA. Specyficzne poziomy przeciwciała wyrażono na fig. 12 jako procent standardowej surowicy anty-Vi (Burro 260).

Wyniki na fig. 12 wskazują, że reakcja koniugatu Vi-278h jak również Vi-278m nie ogranicza się do pewnej restrykcji MHC. Peptydy wywołały zwiększone miana przeciwciała wobec ugrupowania cukrowego koniugatu zarówno u myszy BALB/c jak i BALB/k. Natomiast myszy BALB/b nie reagowały na jakiekolwiek wstrzykiwane koniugaty. Zatem 2 z 3 genotypów udzielały odpowiedzi.

Myszy NOD oraz NON.NOD cechujące się posiadaniem takich samych genów MHC (H-2^nod) wykazują różny model reaktywności immunologicznej na koniugaty Vipeptyd. Jedynie mikobakteryjny homolog 278mt mógł dać Vi-specyficznn efekt pomocniczy.

11.2.10. Rozkład izotypu IgC surowic anty-Vi. Pięć myszy BALB/c na grupę uodporniono sc za pomocą 2 μ g Vi samego lub koniugatu Vi-278h emulgowanego w IFA. Cztery tygodnie później myszy wspomożono tą samą dawką antygenu i wykrwawiono 12 dni później. Indywidualne dawki surowicy zanalizowano metodą ELISA na przeciwciała IgG anty-polisacharydowe za pomocą biotynnlowanych króliczych przeciw-myszom subklasowo-specyficznnch antysurowic oraz alkalicznej fosfatazy skoniugowanej ze streptavidmą. Poziomy przeciwciał Vi wyrażono jako absorbancja 405™“ (A405).

Badanie rozkładu subklasy mysich przeciwciał skierowanych przeciw bakteryjnemu węglowodanowi dostarczyło zaskajującej obserwacji, że same węglowodany stymulują odpowiedzi IgG w znacznym stopniu ograniczone do rzadkiej subklasy IgG3. Proteiny nośnika takie jak BSA lub toksoid tężca sprzężone z bakteryjnymi polisacharydami kapsuk-irnymi mają tendencję do wywoływania przeciwciała anty-cukrowego zasadniczo izotypu IgG u myszy.

Aby zbadać wpływ peptydu 278h skoniugowanego z Vi, określono rozkład subklasy IgG surowic anty-Vi. Jak przedstawiono na fig. 13, wstrzyknięte samo Vi ujawniło odpowiedź immunologiczną ograniczoną głównie do subklasy IgG3, podczas gdy koniugat Vi-278h peptyd-cukier przesunął rozkład subklasy wyraźnie w kierunku dominacji IgGl.

Skoniugowanie peptydu hsp65 a antygenem T-ind wydaje się zatem być zdolnym do wywołania znacznych jakościowych zmian w odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw ugrupowaniu T-ind kompleksu.

Przykład III.

III.l. Artygerność koniugatów fragment Vi-peptyd. Immunogenność polisacharydów, włączając w to antygen Vi, jest powiązana z ich rozmiarami cząsteczkowymi. Fragmenty Vi (około 45 kDa) przygotowane przez rozszczepianie ultradźwiękowe, które nie zmienia struktury jego jednostek monomerowych i wytwarza stosunkowo homogenny polisacharyd, jest mniej immunogenny niż rodzimy Vi (około 3 x 10³ MW) (Szu i in., 1989). Pięciu myszom BALB/c na 1 grupę wstrzyknięto sc 2 μg fragmentów Vi samego lub jako koniugatu z peptydem 278h emulgowanego w IFA. W 12 dniu po wspomaganiu próbki surowicy zebrano i zbadano metodą ELISA na przeciwciała fragmentów Vi. Specyficzne poziomy przeciwciała są wyrażone jako procent standardowej surowicy anty-Vi.

174 082

Jak uwidoczniono na fig. 14, uodpornienie myszy BALB/c 2 μg samych fragmentów Vi nie dały w wyniku jakiejkolwiek odpowiedzi immunologicznej anty-Vi. Natomiast fragmenty Vi skoniugowane z peptydem 278h wykazały zwiększoną antygenność ujawniając znaczne miana przeciwciał anty-Vi.

Przykład lV.

IV. 1. Antygenność Vi skoniugowanego z homologami peptydu278h. Dla określenia czy peptydy wyprowadzone z hsp65 reprezentujące własne jak również obce epitopy mogą funkcjonować jako nośniki komórki T dla antygenów T-ind u myszy, zsyntetyzowaliśmy peptydy 278m oraz 278mt odpowiadające odpowiednio myszy i mikobakteryjnym wariantom sekwencji ludzkiego 278 (patrz tabela 1) i skoniugowaliśmy je z Vi. Czterem myszom BALB/c wstrzyknięto sc 2 μg Vi samego lub z Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt oraz Vi-SerRes emulgowanego w lFA. 12 dni po wspomaganiu myszy ^^krwawiono i surowice badano na przeciwciała Vi za pomocą ELlSA. Specyficzne poziomy przeciwciała wyrażono jako % standardowej surowicy anty-Vi.

Figura 15 wyraźnie pokazuje, że własny epitop reprezentowany przez homolog 278m myszy może zwiększyć odpowiedź immunologiczną na Vi antygenowe T-ind wstrzyknięte myszom BALB/c. Mikobakteryjny epitop 278 nie wykazał żadnego efektu pomocniczego u myszy BALB/c, lecz był jednym zbadanym peptydem funkcjonującym jako nośnik komórki T u myszy NOD jak również NON.NOD (fig. 12).

Przykład V.

V. l. Zdolność peptydu 278h do funkcjonowania jako nośnik komórki T dla izomerów D syntetycznych losowo rozgałęzionych polipepdydów. Syntetyczne polimery złożone z izomerów D aminokwasów są znane jako należące do grupy antygenów T-ind. Aby ustalić czy peptydy wyprowadzone z hsp65 mogą funkcjonować jako nośnik komórki T dla tej grupy antygenów zbadaliśmy odpowiedź immunologiczną u myszy na koniugaty peptydów hsp65 278h lub 348h i syntetycznego polipeptydu poli(Phe, Glu)-poli(Pro)poli(Lys) (FEPK) u myszy BALB/c. Trzy myszy bAlB/c uodporniono polipeptydem FEPK samym lub skoniugowanym z peptydem 288h lub 348h emulgowanym w lFA. 10 dni po wspomaganiu tym samym preparatem antygenowym próbki surowicy poszczególnych myszy pobrano i zbadano na przeciwciała specyficzne FEPK za pomocą zmodyfikowanej procedury ELlSA. Płytki pokryto 2,5 μg FEPK i inkubowano przez noc w 4°C. Pozostałą procedurę wykonano tak jak opisano w punkcie Materiały i metody. Wyniki wyrażono jako gęstość optyczną 405 (OD405).

Porównanie odpowiedzi immunologicznej lgGl ujawnionej przez sam polipeptyd z tą wywołaną przez polipeptyd skoniugowany z peptydem 278h dowodzi wyższej immunogenności koniugatu. Peptyd kontrolny 348h nie wykazał jakiegokolwiek efektu pomocniczego spójnego z wynikami otrzymanymi przez skoniugowanie tego peptydu z polisacharydem Vi (fig. 16). Peptyd 278h może zatem funkqonować jako nośnik komórki T nie tylko dla antygenów cukrowych niezależnych od komórki T, lecz również dla polipeptydów syntetycznych złożonych z aminokwasów.

Powyższe doświadczenia dostarczają dowodu, że koniugaty Vi-peptyd według niniejszego wynalazku są zdolne do włączenia efektu pomocniczego limfocytu T, co daje w wyniku odpowiedź immunologiczną charakterystyczną dla antygenów zależnych od T. Dowód ten można podsumować jak następuje:

(i) lmmunogenność Vi uległa zwiększeniu gdy występowało ono jako koniugat połączony ze specyficznymi kandydatami peptydowymi. Efekt ten nie może być zależny od wiązania kowalencyjnego, ponieważ proste zmieszanie tych dwóch składników dało w rezultacie podobną odpowiedź immunologiczną.

(ii) lmmunogenność składnika Vi koniugatu może być uzależniona od tożsamości peptydu połączonego z polisacharydem. Peptydy stosowane według niniejszego wynalazku Pep ll i Pep278h zwiększyły immunogenność Vi, podczas gdy kontrolne peptydy 348h, 277(S) oraz CRP 77-83 nie wywołały odpowiedzi anty-Vi surowicy.

174 082 (iii) Powtórna iniekcja koniugatów Vi-peptyd wywołała zwiększenie poziomu przeciwciała anty-Vi (efekt wspomagania) (iv) Przeciwciała anty-Vi wywołane przez koniugaty Vi-peptyd wydają się wykazywać wyższą specyficzność antygenową niż ta ujawniona przez samo Vi i występują głównie jako izotyp IgG.

(v) Napiętnowanie peptydu wywołane przez peptyd II dało w rezultacie zwiększoną odpowiedź przeciwciała anty-Vi surowicy na początkowe uodpornienie odpowiadającym temu konigatem Vi-peptyd.

(vi) Zarówno podawanie antygenu drogą sc oraz zastosowanie IFA wydają się niezbędne dla wywołania odpowiedzi immunologicznej anty-Vi charakterystycznej dla antygenów zależnych od T.

Wszystkie z powyższych wyników przy użyciu ludzkiego Pep278h powtórzono z mysim wariantem sekwencji Pep278m różniącym się od ludzkiego Pep 278h podstawieniem A w miejsce T w pozycji 471. Pomimo tego, że Pep278m jest własnym epitopem u myszy funkcjonował on jako nośnik komórki T przy zwiększaniu immunogenności Vi. Zatem myszy odpowiadają zarówno na mysie jak i ludzkie sekwencje, które są własne łub prawie własne co wskazuje, że ludzkie będą odpowiadać na sekwencję ludzką w ten sam sposób jak myszy odpowiadają na sekwencję mysią.

Wszystko to dowodzi, że składnik Vi koniugatu polisacharyd-peptyd uległ przemianie z immunogenu niezależnego od grasicy, do zależnego od grasicy.

Nie jest oczywiste, że peptydy wyprowadzone z ludzkiego hsp65 można użyć do zwiększenia immunogenności słabo immunogennych cząsteczek antygenu po pierwsze dlatego, że własny ludzki proteinowy hsp65 nie jest uważany za immunogenny u ludzi a po drugje dlatego, że peptydy z sekwencji ludzkiej takie jak Pep278 nie mają wpływu na wywołanie tolerancji/regulacji w dół odpowiedzi immunologicznych (WO 90/10449).

Odsyłacze literaturowe:

-Avery, O.T., Goebel, W.F., J. Exp. Med. 50:533-550 (1929).

-Barrios, C., i in., Eur. J. Immunol. 22:1365-1372 (1992).

-Brett, S.J., i in., Eur. J. Immunol. 19:1303-1310 (1989).

-Cohen, I.R. ,Young D.B., Immunol. Today 12:105-110 (1991).

-Cox i in., Eur. J. Immunol. 18:2015-2019 (1988).

-Elias, D. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1576-1580 (1990).

-Elias, D. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3088-3091 (1991).

-Lamb, J.R. i in., EMBO Journal 6:1245-1249 (1987).

-Lussow, A.R. i in., Immunol. Letters 25:255-263 (1990).

-Lussow, A.R. i in., Eur. J. Immunol. 21:2297-2301 (1991).

-Marrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963).

-Munk, M.E. i in., Eur. J. Immunol. 18:1835-1838 (1988).

-Munk, M.E. i in., J. Immunol. 143:2844-2849 (1989).

-Pearson, C.M., Arthritis Rheum. 7:80-86 (1964).

-Szu, S.C., i in., Infect. Immun. 57:3823-3827 (1989).

-Verbon, A., i in., Clin. Exp. Immun. 86:6-11 (1991).

-Young, D. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4267-4270 (1988).

174 082

174 082 i □ 12 DNI PO 1 UODPORNIENIU 24 DNI PO 1 UODPORNIENIU^

SS 12 DNI PO 2 UODPORNIENIU^ absorbancja absorbancja

i i I

0.25 2.50 25.00 yg Vi WSTRZYKNIĘTEGO

Fig.l

Fig. la

174 082

ABSORBANCJA ABSORBANCJA ABSORBANCJA

405 405 405

Fig. 2b

174 082

ABSORBANCJA ABSORBANCJA ABSORBANCJA

ROZCIEŃCZENIE SUROWICY

Fig.

2d

1; 50 1: 100 1; 500 1: 1000 1: 3000

ROZCIEŃCZENIE SUROWICY

Fig.

2e

Fig

2f

174 082

ABSORBANCJA

405 /-SD

174 082

ONI PO 1 UODPORNIENIU

DNI PO 1 UODPORNIENIU

DNI PO 2 UODPORNIENIU

ABSORBANCJA

Vi-Pep II Vi-Pep 278h

VI-KONIUGATY

Fig.3b

174 082

ANTYGEN || Vi-SAMO

Vi-pep 11 m VI-pep 2785

BALfl/c FBS

ABSORBANCJA ABSORBANCJA

ROZCIEŃCZENIE SUROWICY

Fig. 4a

174 082

ANTYGEN Vi- SAMO Vi~pep 278h

ABSORBANCJA ABSORBANCJA

405 ⁴⁰⁵

U 500 l: 1000 1: 6000

ROZCIEŃCZENIE SUROWICY

Fig. 5a

1:500 1: 1000 1; 6000

ROZCIEŃCZENIE SUROWICY

Fig. 5b

174 082

ANTYGEN -o- Vi SAMO

Vi-Pep II VI-Pep 2785

-a- BALB/c P8S

ABSORBANCJA ABSORBANCJA

405

Fig.6a

Fig.6b

174 082

ADJUWANT

TRYB UODPORNIENIA

Fig. 7c

174 082

ABSORPCJA +/-SD ABSORPCJA _+/__SD ABSORPCJA^ 4/-S0 /Vi-Fec JI KONIUGAT ^Vi⁺Psp II mieszanina

1: 50 1: 400 i; 500 1: iOOO i: 3000

174 082 □ 12 DNI PO 1 UODPORNIENIU □ 24 DNI PO 1 UODPORNIENIU 3 12 DNI PO 2 UODPORNIENIU

ABSORBANCJA ₄₀₅+/-SD ABSORPCJA _4Q5 +/-SD

1.0 0.8 0.5 0.4 0.2 0.0 ^A S C D

ANTYGEN Flg.lUa

ANTYGEN

Fig.lOb

174 082 α

w

I \

4.

lf) ο

V

Ο

Ζ <

C0 α:

Ο w

m <

l.Or

0.5 ί0. s r 0.4 h

I

Γ

0.2 ' 0.0

ANTYGEN

Fig-lOc α

cn

ANTYGEN POWLEKANY NA PŁYTKĘ ELISA

Fig. ilb

174 082

ANTYGEN POWLEKANY NA PŁYTKĘ ELISA

Fig. 11c

ANTYGEN POWLEKANY NA PŁYTKĘ ELISA

Fig. 11d

0.5 <

—>

O

Z <

co θ'

O w

co <

0.4

0.2

0.0 i i i....._M I ' I

Vi Yi-PepII Vi-PepII*Vl-Pep278h Vi-CRP77-53 ANTYGEN POWLEKANY NA PŁYTKĘ ELISA

Fig.11e

0..5 r w

®0.4 ΙΟ <

ω or

O w

co <

0.2

0.0

Vi yi-PepII Vi-Pepl? Vi-Pep2780 Vi-CPP77-83

ANTYGEN POWLEKANY NA PŁYTKĘ ELlSA

174 082 >

Z	400-
<
>	η
υ
£	300-t
o
(t
o
w	200-
<
α
et
O N	100-
$
θ'
	0-

Vi-278h Vi~27Bm Vi-378mt Yi-277 (S) Vi-SRes V: IFA/P3S

ANTYGENY

Fig.12c >

μ 400· z

<

>

y 300· o

(£

200<

et o 100§

Vi-273fi Yi-27Sm Yi-27Sait Yi-SP.ss ANTYGENY

Ył

Fig,

12d

174 082

ΙΓ5 o

Q

O

SOI’ fil) >

z <

>

o

O cc zj </) < o cr

N 100600η 500400300

200-1

Vi-27811 Vi278mt Vi IrA/PSS antygeny

Fig. 12e □ IgGi < IgG2a oIgG2b δIgG3 i

\ Fig.13a oooooooooo inooooooooo »-1........ fT) (β C\j lf}

WM ** ...... OJ

ROZCIEŃCZENIE SUROWICY

:OOOOOOOOC :occoocooc ·- η,¹ - α a ’τ α c .......t rn ic rj

0.2η

o	O	O	o	o	o	o	o	o	o
		o	o	o	o	o	o	o	o
		OJ	T	CS	IC	cj	V	α	to
»*•1					w*	n	tc	ni	un
		’Μ							Oj

ROZCIEŃCZENIE SUROWICY

Fi

ROZCIEŃCZENIE SUROWICY

Fig. 13b - 1 3 c

174 082

IMMUNOGEN:

-o- vi fragmenty-278b Vi fragmenty % WZORCA SUROWICY ANTY-Vi

Fig. 14

174 082

500 η

400 >

£ z

<

>

υ ο

κ

Ζ3 ω

<

υ tt ο

Ν

300 4

100 Vi-27Sfi Vj-27Sm Vi-27Smt Vi-Ssrfles V:

IMMUNOGEN fig.15

174 082

OD 405Λ

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 6,00 zł

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Koniugat kapsularnego polisacharydu (Vi) i związanego z nim nośnika, znamienny tym, że zawiera nośnik obejmujący syntetyczny peptyd stanowiący epitop komórki T wyprowadzony z sekwencji ludzkiego hsp65, lub jego analog otrzymany przez zamianę, usunięcie lub dodanie jednej lub większej ilości reszt aminokwasowych do sekwencji epitopu komórki T i posiadający co najmniej 70% właściwości elektrycznych oraz hydrofilowych/hydrofobowych ludzkiego hsp65 odpowiadającego pozycjom 458-474, lub posiadający sekwencje:

   458 474

   a) NEDQKIGIEIIKRTLKI

   b) Pep278m, odpowiadający pozycjom 458-474 cząsteczki ludzkiego hsp65, w której reszta T⁴” jest zastąpiona przez A⁴ ,

   c) 458 474

   NEDQKIGIEIIKRTLKI, w którym reszta E⁴⁵⁹ oznacza E lub D, reszta D4⁶⁰ oznacza D lub E, reszta K4⁶² oznacza K lub R lub ornitynę (Orn), reszta f¹⁶³ oznacza I lub L, V, M, F, norleucynę (Nie) lub norwalinę (Nwa), reszta f465 oznacza I lub L, V, M, F, Nle lub Nwa, reszta E466 oznacza E lub D, reszta I^⁷ oznacza I lub L, V, M, F, NIe lub Nwa, reszta oznacza I lub L, V, M, F, Nle lub Nwa, reszta oznacza K lub R lub Om, reszta Ri⁷⁹ oznacza R, K Iub Orn, reszta Li*⁷² oznacza L lub I, V, M, F, Nle Iub Nwa, reszta K oznacza K lub R lub Orn, i reszta I oznacza I lub L, V, M, F, Nle lub Nwa, lub

   d) 437 448

   VLGGGSALLRSI;i związany z nim kapsularny polisacharyd Salmonella typhi w stosunku molowym nośnika do Vi wynoszącym od 1:400 do 1:10.
2. 2. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera syntetyczny peptyd lub analog kowalencyjnie związany z kapsularnym polisacharydem Vi Salmonella typhi.
3. 3. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że syntetyczny nośnik peptydowy lub jego analog jest związany bezpośrednio kowalencyjnie z kapsularnym polisacharydem Salmonella typhi.
4. 4. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że syntetyczny nośnik peptydowy lub jego analog jest kowalencyjnie związany z kapsularnym polisacharydem Salmonella typhi przez rozpórkę, wybraną z grupy obejmującej: -O-R-CO-, -NH-R-CO-, -NH-RNH-O-R-NH- i -NH-R-CH2-, w której R oznacza nasycony lub nienasycony łańcuch węglowodoru ewentualnie podstawionym i/lub przerwanym przez jeden lub więcej rodników aromatycznych lub przez heteroatomy wybrane spośród N, O i S.
5. 5. Koniugat według zastrz. 4, znamienny tym, że R oznacza alifatyczny łańcuch węglowodorowy zawierający 3-16 atomów węgla.
6. 6. Koniugat według zastrz. 5, znamienny tym, że R oznacza resztę kwasu ε-aminokapronowego.
7. 7. Koniugat według zastrz. 6, o wzorze

   CO-NH-AC-CO-NH-Pep-COOH

   174 082 w którym Ac oznacza acetyl, Ac oznacza resztę kwasu ε-aminokapronowego, Pep oznacza resztę nośnika peptydowego Pep278h lub Pep II, a reszta sacharydowa jest powtarzalną jednostką kapsularnego polisacharydu Vi Salmonella typhi.
8. 8. Sposób wytwarzania koniugatu, obejmujący łącznie kapsularnego polisacharydu Vi Salmonella typhi (Vi) z syntetycznym nośnikiem peptydowym, znamienny tym, że wiąże się Vi wiązaniem konwalencyjnym bezpośrednio lub przez rozpórkę z syntetycznym nośnikiem peptydowym stanowiącym epitop komórki T wyprowadzony z sekwencji ludzkiego hsp65, Iub jego analogu otrzymany przez zamianę, usunięcie lub dodanie jednej lub większej ilości reszt aminokwasowych do sekwencji epitopu komórki T i posiadający co najmniej 70% właściwości elektrycznych oraz hydrofilowych/hydrofobowych ludzkiego hsp65 odpowiadającego pozycjom 458-474, albo posiadający sekwencje:

   458 474

   a) NED OKIGIEIIKRTLKI

   b) Pep278m, odpowiadający pozycjom 458-474 cząsteczki ludzkiego hsp65, w której reszta T⁴⁷¹ jest zastąpiona przez A,

   c) 458 447

   NEDQKIGIEIIKRTLKI, w którym reszta E4⁵⁹oznacza E lub D, reszta d46° oznacza D lub E, reszta K4⁶² oznacza K lub R lub ornitynę (Orn), reszta I463 oznacza I lub L, V, M, F, norleucynę (Nle) lub norwalinę (Nwa), reszta oznacza I lub L, V, M, F, Nle lub Nwa, reszta

   E466 oznacza E lub D, reszta oznacza I lub L, V, M, F, Nle lub Nwa, reszta oznacza I lub L, V, M, F, Nle lub Nwa, reszta oznacza K lub R lub Orn, reszta R47⁰ oznacza R, K Iub Orn, reszta L47² oznacza L lub I, V, M, F, Nle lub Nwa, reszta oznacza K lub R lub Om, i reszta oznacza I Iub L, V, M, F, Nle lub Nwa, lub

   d) 437 448

   VLGGGSALLRSI;

   w stosunku molowym nośnika do Vi wynoszącym od 1 : 400 do 1 : 10.