PL174636B1

PL174636B1 - Sposób otrzymywania inhibitorów cysteinowych peptydaz

Info

Publication number: PL174636B1
Application number: PL94303949A
Authority: PL
Inventors: Maciej Siewiński; Izabela Berdowska; Jerzy Jarmułowicz
Original assignee: Akad Medyczna
Priority date: 1994-06-21
Filing date: 1994-06-21
Publication date: 1998-08-31
Also published as: PL303949A1

Abstract

1· Sposób otrzymywania inhibitorów cysteinowych peptydaz, metodą chromatografii powinowactwa, z zastosowaniem jako biosorbentów papainy lub ficyny immobilizowanych na znanym nośniku, w którym supernatant nanosi się na kolumnę chroma- tograficzną co najmniej dwukrotnie i eluuje buforem o pH około 6, z dodatkiem 0,2 M chlorku sodowego, znamienny tym, że białkajaj dodaje się powoli, w małych dozach, do bufom fosforanowego zawierającego kwas etylenodiaminotetra - octowy i cysteinę, utrzymując pH = 6, zaś uzyskany z kolumny biosorbent zawiesza się w wodzie i doprowadza bądź do pH = 1 - 4 bądź do pH = 9 - 12, najpierw ogrzewa do temperatury powyżej 60°C, potem schładza, zobojętnia, osad oddziela, supernatant zagęszcza, oczyszcza z chlorkiem sodu i ampułkuje.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania inhibitorów cysteinowych peptydaz, przeznaczonych do leczenia chorób śluzówki, zwłaszcza chorób przyzębia oraz chorób skórnych.

Jak wynika z wielu publikacji naukowych ostatnich lat inhibitory cysteinowych peptydaz zdolne są do hamowania aktywności cysteinowych endopeptydaz takich jak katepsyny B i L, które pojawiają się w stanach patologicznych organizmu człowieka. Wykazano, że naruszenie równowagi enzym - inhibitor może być przyczyną pojawienia się, między innymi, takich chorób jak nowotwory, zapalenie stawów, paradontoza, niektórych chorób skórnych oraz niektórych infekcji bakteryjnych. Ostatnio wykazano, że cysteinowe peptydazy odgrywają pewną rolę związaną z procesami towarzyszącymi in vivo HlV -1.

Jak wynika z badań prowadzonych głównie w Japonii inhibitory cysteinowych peptydaz obecne w ślinie stanowią prawdopodobnie zabezpieczenie tkanekjamy ustnej przed możliwością pojawienia się niektórych stanów patologicznych. Badania wielu zespołów naukowych potwierdza fakt podobieństwa inhibitorów cysteinowych peptydaz obecnych w ślinie ludzkiej, do obecnych w białku jaj.

Znane metody izolowania inhibitorów cysteinowych peptydaz są mało wydajne i wieloetapowe.

Z polskiego zgłoszenia patentowego nr P-289769 znany jest sposób otrzymywania inhibitorów tiolowych czyli cysteinowych peptydaz z moczu osób chorych na nowotwory złośliwe. Sposób oparty jest na metodzie chromatografii powinowactwa, z zastosowaniem jako biosorbentów papainy lub ficyny immobilizowanych na znanym nośniku. Wstępnie oczyszczony mocz nanosi się na kolumnę chromatograficzną co najmniej dwukrotnie, eluuje buforem o pH około 6, z dodatkiem 0,2 M chlorku sodu. Biosorbent wypakowuje się i zawiesza w wodzie, doprowadza do pH od 1 do 4 i ogrzewa do temperatury 60 - 100°C, następnie schładza do temperatury pokojowej, zobojętnia do pH = 7, osad odwirowuje, a supernatant zagęszcza i przechowuje w temperaturze - 20°C. Odmiana sposobu polega na doprowadzeniu eluentu do pH od 1 - 4, ogrzewaniu i schładzaniu i doprowadzeniu do pH = 7, a następnie naniesieniu co najmniej dwukrotnym na kolumnę chromatograficzną i immobilizowaną papainą lub ficyną. Eluent odstawia się, a biosorbent wypakowuje się i zawiesza w wodzie i postępuje jak w odmianie pierwszej sposobu.

Otrzymywane w ten sposób aktywne inhibitory cysteinowych peptydaz, wyodrębnione z moczu chorego na chorobę inwazyjną, w tym nowotworową, podawane w okolice ciała zmienione chrobowo lub dożylnie, hamują zachodzące zmiany inwazyjne. Inhibitory wolne i reakty174 636 wowane sposobem według wynalazku z kompleksów zawartych w moczu chorego, mają także zastosowanie przy diagnozowaniu rozwoju choroby inwazyjnej i przy ocenie skuteczności obrony organizmu.

Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania inhibitorów cysteinowych peptydaz, metodą chromatografii powinowactwa, z zastosowaniem jako biosorbentów papainy lub ficyny immobilizowanych na znanym nośniku, w którym supernatant nanosi się na kolumnę chromatograficzną co najmniej dwukrotnie i eluuje buforem o pH około 6, z dodatkiem 0,2 M chlorku sodowego.

Istota wynalazku polega na tym, że supernatant uzyskuje się z białka jaj, które dodaje się powoli, w małych dozach do buforu fosforanowego zawierającego kwas etylenodiaminotetra octowy i cysteinę, utrzymując pH = 6, zaś uzyskany z kolumny biosorbent zawiesza się w wodzie i doprowadza bądź do pH = 1-4 bądź do pH = 9 -12, następnie ogrzewa do temperatury powyżej 60°C, potem schładza, zobojętnia, osad oddziela, supernatant zagęszcza, oczyszcza z chlorku sodu i ampułkuje. Korzystne jest oczyszczanie supematantu od sodu na kolumnie chromatograficznej z Sephadexem G - 75 i następnie przepuszczenie przez filtry bakteryjne.

Otrzymane tym sposobem aktywne inhibitory cysteinowych peptydaz dodaje się do odpowiednich nośników np. do żeli i podaje do kieszonek zębowych u osób z zaawansowanymi chorobami przyzębia. Mogą być także stosowane w chorobach skórnych. Podawane w formie żeli inhibitory cysteinowych peptydaz, izolowane z białek jaj hamują aktywność cysteinowych peptydaz, które inicjują zmiany enzymatyczne, towarzyszące degradacji tkanki kieszonki zębowej oraz w niektórych chorobach skórnych wywołanych infekcjami bakteryjnymi.

Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykładzie realizacji.

Przykła d. 500 g białka jaj dodaje się powoli z prędkością około 20 kropli na minutę do 1000 ml 0,01 M buforu fosforanowego zawierającego 2 mM kwasu etylenodiaminotetra octowego i 1 mM 1-cysteiny, utrzymując pH = 6. Uzyskany roztwór, mający 500 - 600jednostek antypapainowych, nanosi się trzykrotnie na kolumnę chromatograficzną o wymiarach 1,5 x 10 cm, wypełnioną papiną lub ficyną, immobilizowaną na nośniku Sepharose 4B. Kolumnę równoważy się buforem: 0,01 M fosforan; 0,2 M chlorek sodu; 0,002 M kwas etylenodiaminotetra - octowy; 0,02 M 1-cysteina; 0,01% merkaptoetanol. Gdy w supernatancie nie stwierdza się obecności wolnych inhibitorów, nośnik kolumny chromatograficznej wypakowuje się i przemywa 5,0 litrami buforu użytego do jej równoważenia z dodatkiem 0,2 M chlorku sodu, a na koniec 400 ml wody destylowanej. Biosorbent z kolumny zawiesza się w wodzie i zawiesinę doprowadza się do pH = 1- 4, za pomocą 1M kwasu solnego lub do pH = 9 -12, za pomocą 1M wodorotlenku sodu. Całość miesza się, ogrzewa do temperatury około 80°C przez 20 minut, po czym chłodzi do temperatury pokojowej, zobojętnia do pH = 7 i zagęszcza do żądanej objętości na wyparce próżniowej, w temperaturze około 40°C.

Dodatkowe oczyszczanie preparatu prowadzi się na kolumnie chromatograficznej z Sephadexem G - 75 o wymiarach 1,5 x 80 cm. Uzyskany supernatant, pozbawiony chlorku sodu, zagęszcza się do wymaganej objętości w wyparce próżniowej, w temperaturze około 90°C, a następnie przepuszcza przez filtry bakteryjne, sprawdza czystość mikrobiologiczną i przechowuje w sterylnych ampułkach.

174 636

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania inhibitorów cysteinowych peptydaz, metodą chromatografii powinowactwa, z zastosowaniem jako biosorbentów papainy lub ficyny immobilizowanych na znanym nośniku, w którym supernatant nanosi się na kolumnę chromatograficzną co najmniej dwukrotnie i eluuje buforem o pH około 6, z dodatkiem 0,2 M chlorku sodowego, znamienny tym, że białka jaj dodaje się powoli, w małych dozach, do buforu fosforanowego zawierającego kwas etylenodiaminotetra - octowy i cysteinę, utrzymując pH = 6, zaś uzyskany z kolumny biosorbent zawiesza się w wodzie i doprowadza bądź do pH =1-4 bądź do pH = 9 -12, najpierw ogrzewa do temperatury powyżej 60°C, potem schładza, zobojętnia, osad oddziela, supernatant zagęszcza, oczyszcza z chlorkiem sodu i ampułkuje.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że supernatant oczyszcza się na kolumnie chromatograficznej z Sephadexem 6-75 i następnie przepuszcza przez filtry bakteryjne.