PL175128B1 - Środek kontrastowy do ultrasonografii - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy środek kontrastowy do stosowania w diagnostyce ultrasonograficznej.

Obrazowanie ultrasonograficzne jest oparte na penetracji ultradźwięków, np. w zakresie częstotliwości 1-10 MHz, w głąb organizmu człowieka lub zwierzęcia, przy użyciu przetwornika. Ultradźwięki oddziaływują z powierzchniami tkanki ciała i płynami. Kontrast w obrazie ultrasonograficznym pochodzi z różnic w odbiciu/absorpcji fal dźwiękowych na takich powierzchniach; wyniki można wzmocnić stosując techniki dopplerowskie, w tym barwny efekt Dopplera do określenia przepływu krwi.

Od dawna wiadomo, że może być korzystne zwiększenie różnicy właściwości akustycznych różnych tkanek/płynów przy pomocy środków kontrastowych. Od czasu zastosowania w 1968 roku zieleni indocyjaninowej jako pierwszego ultradźwiękowego środka kontrastującego zbadano wiele innych potencjalnych środków. Obejmują one emulsje, stałe cząstki, rozpuszczalne w wodzie związki, swobodne bąbelki gazu i inne typy układów zawierających uwięziony gaz. Ogólnie uważa się, że środki kontrastowe małej gęstości, nadające się do łatwego prasowania, są szczególnie skuteczne w kategoriach rozpraszania wstecznego. Zawierające i wytwarzające gaz układy wykazują więc znacznie większą skuteczność w porównaniu z innymi typami środków kontrastujących.

Dostępne są obecnie trzy środki kontrastowe w handlu lub w końcowych badaniach klinicznych. Jest to Echovist®, oparty na zawierających gaz mikrokryształach galaktozy, Levovist , złożony z zawierających gaz mikrokryształów galaktozy powleczonych kwasem tłuszczowym oraz Albunex®, złożony z bąbelków gazu w kapsułkach z częściowo denaturowanej albuminy ludzkiego osocza. Kliniczne zastosowanie tych środków jest jednak ograniczone krótkim okresem półtrwania (to jest względnym brakiem trwałości in vivo) i ograniczoną

1715128 trwałością przy przechowywaniu. A więc istnieje potrzeba opracowania nowych środków kontrastowych, szczególnie do celów badania perfuzji sercowej i niesercowej, łączących w sobie dobrą trwałość przy przechowywaniu ze stabilnością in vivo, korzystnie przez co najmniej kilka przejść cyrkulacyjnych w przypadku zastrzyków dosercowych.

Kolejna wadą mikrorozdrobnionych ultrasonograficznych środków kontrastowych takich jak Echovist® i Levovist® jest to, że muszą być przygotowywane przed podaniem, np. przez dodanie odpowiedniego ciekłego nośnika i mieszanie przez wytrząsanie. Nieuniknione jest pewne opóźnienie, a więc konieczne jest opracowanie ulepszonych ultrasonograficznych środków kontrastowych, które będzie można przechowywać przez dłuższy czas (np. co najmniej 12 miesięcy, korzystnie 2-3 lata) w postaci gotowej do użycia.

Niniejszy wynalazek jest oparty na odkryciu, że cel ten można osiągnąć stosując środki kontrastowe oparte na emulsji typu olej w wodzie, zawierającej rozpuszczalne w oleju gazy/ciecze w postaci rozpuszczonej w zdyspergowanej fazie olejowej.

Przedmiotem wynalazku jest środek kontrastowy do ultrasonografii, charakteryzujący się tym, że stanowi biokompatybilną emulsję typu olej w wodzie, w której fazę olejową stanowi roztwór gazu obojętnego, chlorowcowanego węglowodoru lub halogenku siarki w rozpuszczalniku lipofilowym, wybranym z grupy składającej się z oleju sojowego, alifatycznego lub cykloalifatycznego perfluorowęglowodoru i monobromopodstawionego analogu takiego perfluorowęglowodoru.

Charakterystyczną cechą środków kontrastowych według wynalazku jest to, że są one zasadniczo wolne od pęcherzyków i mikropęcherzyków gazu w czasie przechowywania przed podaniem. Jednak po podaniu, np. dożylnym lub dotętniczym, może nastąpić gwałtowne wytwarzanie mikropęcherzyków. Może też być ono indukowane natychmiast po podaniu, np. w sposób opisany szczegółowo dalej. Pod tym względem środki według wynalazku różnią się od istniejących środków kontrastowych, które zwykle zawierają wolny gaz w postaci zmagazynowanej, np. inkluzji w przestrzeniach struktur krystalicznych i/lub związany na powierzchniach w przypadku mikrorozdrobnionych substancji takich jak Echovist® i Levovist® lub kapsułkowany jak w substancjach takich jak Albunex®.

Gazy i płyny nadające się do stosowania w środkach kontrastowych według wynalazku są słabo rozpuszczalne w wodzie, co zapewnia ich dobrą rozpuszczalność w fazie oleju lipofilowego emulsji i polepsza stabilność mikropęcherzyków wytwarzanych w wodnym środowisku krwi po dożylnym lub dotętniczym wstrzyknięciu środka kontrastującego. Należy jednak rozumieć, że rozpuszczalność gazu/płynu w fazie olejowej powinna korzystnie nie być na tyle wysoka, aby inhibitować wytwarzanie mikropęcherzyków po podaniu, chociaż tworzenie mikropęcherzyków można w razie potrzeby polepszyć w takiej sytuacji przez np. wstępne ogrzanie emulsji przed podaniem, np. jak opisano dalej w szczegółach. Odpowiednie gazy obojętne obejmują gazy szlachetne, takie jak hel, neon, argon, krypton lub ksenon, korzystnie ksenon. Odpowiednie chlorowcowane węglowodory obejmują chlorowcoalkany takie jak bromek metylu, C1-C4hydrofluoroalkany takie jak heksafluoropropan, oraz korzystnie perfluoroalkany takie jak perfluorometan lub perfluorobutan. Korzystnym halogenkiem siarki jest heksafluorek siarki.

Fazę olejową stanowi gaz/płyn rozpuszczony w co najmniej jednym lipofilowym składniku rozpuszczalnika, wraz z niezbędnymi biokompatybilnymi środkami emulgującymi, w tym środkami powierzchniowo czynnymi i innymi stabilizatorami. Należy rozumieć, że takie środki emulgujące mogą być korzystnie rozpuszczone lub zdyspergowane w fazie olejowej lub wodnej w zależności od wymagań konkretnej emulsji.

Klasą użytecznych lipofilowych składników rozpuszczalnika według wynalazku są perfluorowane związki organiczne, takie jak proponowane jako składniki sztucznej krwi - patrz np. zgłoszenia patentowe EP-A-0231091 i WO-A-8910118. Należy zauważyć, że przy stosowaniu w sztucznej krwi związki fluorowe są uważane za związki przenoszące tlen dzięki kompleksowaniu z cząsteczkami tlenu, w odróżnieniu od niniejszego wynalazku, w którym stanowią dobre środowisko dla rozpuszczalnego w lipidach gazu/płynu.

Silnie fluorowane związki organiczne nadające się do stosowania według wynalazku obejmują alifatyczne i cykloalifatyczne perfluorowęglowodory, np. zawierające do 20 atomów węgla, takie jak perr'luoro-2,2,4,4-tetiaimet.ylopentun, perfluorooktan, perfluorodekan,

175 128 perfluorotrimetylocykloheksan, perfluoroizopropylocykloheksan, perfluorodekalina, perfluoroindan, perfluorotrimetylobicyklo[3.3.1]nonan, perfluorobicyklo[5.3.0]dekan, perfluorometyloadamantan i perfluorodimetyloadamantan, oraz monobromopodstawione analogi powyższych związków, takie jak bromek perfluorooktylu i mieszaniny powyższych związków. Korzystne związki tego typu obejmują bromek perfluorooktylu i perfluorodekalinę, przy tym tę ostatnią można stosować w połączeniu z perfluorotripropyloaminą, np. jak w produkcie Fluosol DA®.

Środki powierzchniowo czynne można stosować jako środki emulgujące w celu stabilizacji emulsji lub jako składniki lipofilowe rozpuszczalnika, w których rozpuszcza się gaz/płyn Odpowiednie biokompatybilne środki powierzchniowo czynne, jakie mogą być przydatne w wynalazku, obejmują więc anionowe środki powierzchniowo czynne, np. sole metali alkalicznych kwasów tłuszczowych takie jak dodekanian sodu, alkilosiarczany metali alkalicznych takie jak laurylosiarczan sodu i sulfonowane estry metali alkalicznych takie jak dioktylosulfobursztynian sodu (dokusat) i korzystniej środki niejonowe lub obojnacze. Przykłady tych ostatnich kategorii obejmują alkohole tłuszczowe takie jak n-dekanol, kopolimery polioksyetyleno-polioksypropylenowe (np. poloksamery takie jak Pluronic® F68), estry sorbitanu z kwasami tłuszczowymi, typu Span, oraz ich polioksyetylowane analogi, typu Tween, fosfolipidy (np. fosfatydylocholina, to jest lecytyna) lub dioleilofosfatydylodietanoloamina) oraz estry glikolu polietylenowego z kwasami tłuszczowymi (np. produkty Cremaphoi®').

Jako środki powierzchniowo czynne można stosować także polimeryzujące amfifile, takie jak opisane w zgłoszeniu patentowym WO-A-9217212, polimeryzację takich amfili, np. przez napromieniowanie nadfioletem, można w razie potrzeby przeprowadzić po emulgacji.

Odpowiednie środki powierzchniowo czynne można stosować w postaci wielokomorowych pęcherzyków, np. opisanych przez Kim i in. w Biochim. Biophys, Acta 728 (1983) str. 339 oraz w europejskim zgłoszeniu patentowym EP-A-0 280 503. Można je uważać za złożone z lipidowych membran dwuwarstwowych otaczających wiele niekoncentrycznych rdzeni, to jest mających strukturę podobną do plastra pszczelego. Dogodnie można zastosować wiele amfipatycznych lipidów, przy czym co najmniej jeden z nich może korzystnie mieć wypadkowy ładunek ujemny, mogą być także obecne lipidy obojętne. Reprezentatywne składniki obejmują fosfatydyloseryny, fosfatydylogliceryny takie jak dimirystynian fosfatydylogliceryny, kwasy fosfatydowe takie jak kwas dimirystoilofosfatydowy, fosfatydylocholiny takie jak dioleinian fosfatydylocholiny lub dipalmitynian fosfatydylocholiny, fosfatydyloetanoloaminy, dioleinian lecytyny, cholesterol, trioleina, trioktanoina i inne oleje/triglicerydy i ich pochodne.

Inne lipofilowe substancje, które można stosować w emulsjach, np. jako składniki stabilizujące, obejmują antyutleniacze, takie jak tokoferole lub kwas tiooktylowy, perfluorowane środki powierzchniowo czynne rozpuszczające i stabilizujące rozpuszczalny w lipidach gaz lub płyn, ciekłe kryształy, związki do wytwarzania warstw Langmuira-Blodgeta oraz lipofilowe biodegradowalne polimery, np. kopolimery blokowe (jak opisane w zgłoszeniach patentowych WO-A-9204392 lub WO-A9317718. Można także stosować rozpuszczalne w oleju cząsteczki nośnikowe dla gazu/płynu; dobrymi nośnikami mogą być porfiryny.

Do stosowania nadają się także dodatki takie, jak środki pomocnicze środków powierzchniowo czynnych, np. środki zwiększające lepkość, takie jak sacharoza.

Jedna ze szczególnie przydatnych klas emulsji obejmuje oparte na tłuszczach emulsje takie jak handlowo dostępne podawane dożylnie emulsje Liposyn® (Abbot Laboratories), Intralipid® (Kabi Vitrum) i Soyacal® (Alpha Therapeutic). Takie emulsje są zwykle oparte na oleju sojowym, fosfolipidzie żółtka jaja, glicerynie i wodzie do zastrzyków, i zwykle cząstki tych emulsji mają średnice mniejsze niż 0,5 pm, podobnie do naturalnie występujących chylomikronów. Korzyści z ich stosowania mogą obejmować przedłużenia czasu magazynowania, dłuższy okres półtrwania jako kontrast żylny i przedłużone wydzielanie gazu.

W razie potrzeby faza olejowa środków kontrastowych według wynalazku może dodatkowo zawierać w zawiesinie stałe mikrocząsteczki jednego lub kilku tolerowanych biologicznie minerałów, np. o cząstkach mniejszych niż 1 pm, korzystnie mniejszych niż 0,2 pm. Takie mikrocząstki złożone np. z krzemionki lub tlenku żelaza mogą funkcjonować jako zarodki, ułatwiając wydzielanie się gazu na granicy ciecz/ciało stałe po podaniu środka kontrastowego.

175 128

Dokładny skład środków kontrastowych według wynalazku może się zmieniać w szerokim zakresie w zależności od takich czynników, jak zastosowane składniki, zamierzany sposób stosowania i spodziewane rozmiary mikropęcherzyków po podaniu.

Tak więc np. rozmiary mikropęcherzyków powstających po podaniu środka będą zwykle rosły ze stężeniem gazu/płynu, z uwzględnieniem natury substancji tworzących fazę olejową. Gdy środek kontrastowy zawiera rozpuszczony gaz, może on występować w dowolnym żądanym stężeniu aż do stanu nasycenia, a nawet przesycenia, np. przy przechowywaniu środka pod ciśnieniem.

W przypadku ciśnieniowych środków kontrastowych tworzenie mikropęcherzyków może się rozpocząć przed podaniem środka, np. natychmiast po otwarciu fiolki lub innego pojemnika i trwać in vivo po podaniu. Nieciśnieniowe środki kontrastowe będą wytwarzały mikropęcherzyki in vivo wskutek np. ogrzania środka do temperatury ciała, dyfuzji składników krwi do substancji stabilizującej i/lub stopniowego rozpadu emulsji. Alternatywnie wytwarzanie mikropęcherzyków może być indukowane przed podaniem, np. przez wstępne ogrzanie emulsji np. mikrofalami.

Jak wspomniano wyżej, rozpuszczalne w oleju gazy/płyny są słabo rozpuszczalne w wodzie. Dzięki temu gaz/płyn asocjuje z lipofilowymi składnikami emulsji, polepszając dodatkowo trwałość mikropęcherzyków, może też to prowadzić do powstania elastycznej sieci mikropęcherzykowo/lipofilowej np. w postaci powleczonych mikropęcherzyków. Wiadomo fachowcom, że takie elastyczne struktury są szczególnie korzystne ze względu na polepszony kontrast ultradźwiękowy w porównaniu ze sztywniejszymi kapsułkowanymi układami mikropęcherzyków.

Środki kontrastowe według wynalazku można wytwarzać w dowolny dogodny sposób. Tak więc np. fazę olejową stanowiącą roztwór rozpuszczalnego w oleju gazu/płynu w co najmniej jednym rozpuszczalniku lipofilowym można poddać emulgacji w fazie wodnej aż do wytworzenia emulsji typu olej w wodzie, stosując np. konwencjonalne techniki takie jak homogenizacja lub działanie ultradźwiękami, albo też pożądany gaz/płyn można włączyć do fazy olejowej w postaci wstępnie wytworzonej emulsji typu olej w wodzie.

Przy stosowaniu rozpuszczalnego w oleju gazu może on być np. rozpuszczony w wybranym rozpuszczalniku lipofilowym, np. pod zwiększonym ciśnieniem, a olej można następnie poddać emulgacji, korzystnie pod ciśnieniem nadmiaru gazu, i w razie potrzeby lub konieczności w obecności jednego lub wielu biokompatybilnych emulgatorów. Analogiczne techniki można zastosować, gdy korzysta się z rozpuszczalnego w oleju płynu. Alternatywnie gaz można dołączyć do wstępnie uformowanej emulsji, np. przepuszczając go przez emulsję i/lub trzymając emulsję pod podwyższonym ciśnieniem gazu.

Ultrasonograficzne środki kontrastowe według wynalazku można np. podawać jelitowo lub pozajelitowo, chociaż w niektórych zastosowaniach korzystne może być podawanie bezpośrednio do jam ciała, takich jak jajowody. Ogólnie jednak będzie się wykorzystywać podawanie donaczyniowe, najczęściej dożylne, aby polepszyć obrazowanie naczyń, w tym perfuzji sercowych i pozasercowych.

Należy rozumieć, że środki kontrastowe do podawania dożylnego powinny generować mikropęcherzyki dostatecznie małe, aby przechodziły przez łożysko włośniczkowe układu płucnego. Środki powinny więc być takie, aby wytwarzały mikropęcherzyki o średnicach mniejszych niż 10 pm, korzystnie 0,2-8 pm np. 0,3-7 pm.

Poniższe przykłady nie ograniczające wynalazku mają na celu jego zilustrowanie.

Przykład 1.

Span 20 (0,10 g) zdyspergowano w perfluorodekalinie (4 ml) nasyconej następnie heksafluorkiem siarki w temperaturze 4°C. Tween 60 (0,45 g) rozpuszczono w wodzie (36 ml), ochłodzono do 4°C i dwa roztwory emulgowano w temperaturze 4°C stosując homogenizator Ystral przy szybkości 20000 obrotów na minutę przez 30 s. Tłumienie ultradźwięków zmierzono wstrzykując 2 ml emulsji do 6 ml wody destylowanej w temperaturze 4°C i ogrzewając powoli do temperatury 37°C. Zaobserwowano tłumienie ultradźwięków 2 dB/cm lub wyższe przez około 120 sekund.

175 128

Przykład 2.

n-Dekanol (0,5 ml) i dodekanian sodu (0,50 g) zdyspergowano w wodzie (36 ml). Perfluorodekalinę (4 ml) ochłodzono do temperatury 4°C i nasycono heksafluorkiem siarki. Dwa roztwory emulgowano w temperaturze 4°C stosując homogenizator Ystral przy szybkości 20000 obrotów na minutę przez 30 s. Tłumienie ultradźwięków zmierzono mieszając 2 ml emulsji z 6 ml wody destylowanej w temperaturze 37°C. Zaobserwowano silne tłumienie ultradźwięków (>2 dB/cm) przez około 30 sekund.

Przykład 3.

Emulsję z przykładu 2 (2 ml) zmieszano z wodą destylowaną (6 ml) w temperaturze 4°C i rozcieńczoną emulsję ogrzano powoli do temperatury 37°C. Zmierzono tłumienie ultradźwięków i zaobserwowano maksymalne tłumienie 2,7 dB/cm przez około 30 sekund.

Przykład 4.

n-Dekanol (0,5 ml) i dodekanian sodu (0,50 g) zdyspergowano w wodzie (36 ml). Perfluorodekalinę (4 ml) ochłodzono do temperatury 4°C i nasycono ksenonem. Dwa roztwory emulgowano w temperaturze 4°C stosując homogenizator Ystral przy szybkości 20000 obrotów na minutę przez 30 s. Tłumienie ultradźwięków zmierzono mieszając 2 ml emulsji z 6 ml wody destylowanej w temperaturze 37°C. Tłumienie ultradźwięków wzrosło od 1 do około 3 dB/cm przez 5 minut.

Przykład 5.

n-Dekanol (0,5 ml) i dodekanian sodu (0,50 g) zdyspergowano w wodzie (36 ml). Bromek perfluorooktylu (4 ml) ochłodzono do temperatury 4°C i nasycono ksenonem. Dwa roztwory emulgowano w temperaturze 4°C stosując homogenizator Ystral przy szybkości 20000 obrotów na minutę przez 30 s. Tłumienie ultradźwięków zmierzono mieszając 2 ml emulsji z 6 ml wody destylowanej w temperaturze 37°C.

Przykład 6.

** (ίΰ (fi)

Intralipid (Kabi Vitrum, Stockholm, Szwecja), Fluosol (Alpha Therapeutic Ltd, Wielka Brytania) lub bromek perfluorooktylu (10 ml) ochłodzono do temperatury 4°C w autoklawie. Emulsje mieszano w warunkach nadciśnienia ksenonu (20 atm) przez 16 godzin. Mieszanie zakończono i obniżono powoli ciśnienie. Tłumienie ultradźwięków zmierzono mieszając 2 ml emulsji z 6 ml wody destylowanej w temperaturze 37°C.

Przykład 7.

Perfluoro-n-butan (1,6 g) pod ciśnieniem 2,5 atmosfery dodano do perfluorodekaliny (0,4 g) ochłodzonej do -5°C, poniżej temperatury wrzenia perfluoro-n-butanu (około -2°C). Powstały olej emulgowano z 40 ml wodnego roztworu zawierającego Pluronic F68 (1% wagowych) i sacharozę (30% wagowych) działając ultradźwiękami przez 20 minut w ochłodzonym zamkniętym zbiorniku z tworzywa. Średnica kropli otrzymanej emulsji (olej w wodzie) zaobserwowana pod mikroskopem wynosiła około 1 pm. Nie stwierdzono znaczącej zmiany po tygodniu przechowywania. Porcję (5 ml) emulsji w zbiorniku 15 ml ogrzano do temperatury 80°C w kuchence mikrofalowej 800 W (czas ogrzewania zwykle 8-10 s), ochłodzono i przesączono (Millipore, 10 pm). Mikroskopia potwierdziła powstanie mikropęcherzyków perfluoro-n-butanu o stabilizowanych powłokach perfluorodekaliny. Tłumienie akustyczne in vitro takiej dyspersji mikropęcherzyków rozcieńczonej do całkowitej zawartości oleju 0,2% wagowych przekraczało 10 dB/cm w zakresie częstotliwości 1-6 MHz i było stabilne przez ponad 10 minut. Podobną próbkę przygotowano bez wstępnego ogrzewania emulsji i testowano w temperaturze 37°C otrzymując tłumienie akustyczne, które wzrastało od 2 dB/cm do 6 dB/cm w czasie 7 minut spontanicznego powstawania mikropęcherzyków.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 2,00 zł

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Środek kontrastowy do ultrasonografii, znamienny tym, że stanowi biokompatybilną emulsję typu olej w wodzie, w której fazę olejową stanowi roztwór gazu obojętnego, chlorowcowanego węglowodoru lub halogenku siarki w rozpuszczalniku lipofilowym wybranym z grupy składającej się z oleju sojowego, alifatycznego lub cykloalifatycznego perfluorowęglowodoru i monobromopodstawionego analogu takiego perfluorowęglowodoru.
2. 2. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako gaz obojętny zawiera ksenon.
3. 3. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako chlorowcowany węglowodór zawiera perfluoroalkan.
4. 4. Środek według zastrz. 3, znamienny tym, że jako perfluoroalkan zawiera perfluorobutan.
5. 5. Środek według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że jako halogenek siarki zawiera heksafluorek siarki.
6. 6. Środek według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik lipofilowy zawiera bromek perfluorooktylu lub perfluorodekalinę.
7. 7. Środek według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że emulsja dodatkowo zawiera biokompatybilny środek emulgujący wybrany spośród alkoholi tłuszczowych, soli metali alkalicznych kwasów tłuszczowych, kopolimerów polioksyetylenowo-polioksypropylenowych, estrów sorbitanu z kwasami tłuszczowymi, polioksyetylowanych estrów sorbitanu z kwasami ^tłuszczowymi i fosfolipidów.
8. 8. Środek według zastrz. 7, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik lipofilowy zawiera olej sojowy, jako biokompatybilny środek emulgujący fosfolipidy żółtka jaja kurzego, zaś fazę wodną emulsji stanowi mieszanina gliceryny i wody do iniekcji.