PL175422B1 - Sposób wytwarzania wariantu ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz - Google Patents

Sposób wytwarzania wariantu ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz

Info

Publication number
PL175422B1
PL175422B1 PL93304468A PL30446893A PL175422B1 PL 175422 B1 PL175422 B1 PL 175422B1 PL 93304468 A PL93304468 A PL 93304468A PL 30446893 A PL30446893 A PL 30446893A PL 175422 B1 PL175422 B1 PL 175422B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
amino acid
variant
cys
dna encoding
phe
Prior art date
Application number
PL93304468A
Other languages
English (en)
Inventor
Fanny Norris
Kjeld Norris
Soren E. Bjorn
Lars Ch. Petersen
Ole H. Olsen
Original Assignee
Novo Nordisk As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk As filed Critical Novo Nordisk As
Publication of PL175422B1 publication Critical patent/PL175422B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Production Of Liquid Hydrocarbon Mixture For Refining Petroleum (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Amplifiers (AREA)

Abstract

1. Sposób wytwarzania wariantu ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz o sekwencji aminokwasowej: X1 Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp X2 Gly X3 Cys X4 X5 X 7 X 8 X9 Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe X1 0 Tyr Gly Gly Cys X1 1 X 1 2 X13 Met Asn Asn Phe X14 Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Be Cys Glu Asp X 15(SEQ ID Nr 1), gdzie X 1 oznacza H lub 1-5 reszt naturalnie wystepujacych aminokwasów z wyjatkiem Cys, X2 do X1 4 kazde z osobna oznacza reszte naturalnie wystepujacego aminokwasu z wyjatkiem Cis, a X1 5 oznacza OH lub 1-5 reszt naturalnie wystepujacych aminokwasów z wyjatkiem Cys, przy czym co najmniej jedna z reszt aminokwasowych X1 do X1 5 jest rózna od odpowiadajacej jej reszty aminokwasowej w sekwencji natywnej i przy czym X4 ma znaczenie inne niz Leu, znamienny tym, ze hoduje sie komórki zawierajace DNA obejmu- jacej sekwencje DNA kodujaca wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz w warunkach sprzyjajacych ekspresji bialka i odzyskuje sie otrzymane bialko z hodowli. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiot wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest wariant ludzkiej domeny, hamującej proteazy, typu Kunitz, DNA kodujący ten wariant, sposób wytwarzania tego wariantu i preparat farmaceutyczny zawierający ten wariant.
Stan techniki
Krwinki białe cechujące się różnokształtnością jąder komórkowych (zwane leukocytami obojętnochłonnymi, czyli neutrofilami, lub PMN) i fagocyty jednojądrzaste (monocyty) odgrywają ważną rolę przy uszkodzeniach tkanek, zakażeniach, ostrych i przewlekłych stanach zapalnych oraz gojeniu się ran. Komórki przemieszczają się z krwi obwodowej do miejsca zapalenia i, w następstwie odpowiedniego pobudzenia, uwalniają związki utleniające (O20, O'2, H2O2 i HOCl), jak również ziarnistości zawierające różne enzymy proteolityczne. Ziarnistości wydzielnicze zawierają między innymi fosfatazę zasadową, metaloproteinazy, jak np. żelatynę i kolagenazę, oraz proteazy serynowe, takie jak elastaza neutrofilowa, katepsyna G i proteinaza 3.
Utajone metaloproteinazy uwalniane są wraz z tkankowym inhibitorem metaloproteinazy (TIMP). Mechanizm aktywacji nie został w pełni wyjaśniony, ale prawdopodobne jest, że w procesie tym odgrywa rolę utlenienie grup tiolowych i/lub rozkład białka. Tak więc aktywność swobodnej metaloproteinazy zależy od unieczynnienia TIMP.
Proteazy serynowe: elastaza neutrofilowa, katepsyna G i proteinaza-3 znajdują się wewnątrz azurochłonnych ziarnistości leukocytów w postaci aktywnych enzymów, tworzących kompleks z glikozaminoglikanami. Kompleksy te są nieaktywne, ale po wydzieleniu rozłączają się, uwalniając aktywne enzymy. W osoczu znajdują się duże ilości inhibitorów: inhibitora Ct1-proteinazy (ttj-PI) i inhibitora on-chymotrypsyny (cn-ChI), służących do zobojętnienia aktywności proteaz. Jednakże PMN zdolne są do miejscowego unieczynniania inhibitorów. I tak αι-PI, stanowiący najważniejszy inhibitor elastazy neutrofilowej, wrażliwy jest na utlenienie w centrum reaktywnym (Met 358) przez tlenowe metabolity wyzwolonych PMN. Ogranicza to powinowactwo α,-PI do elastazy neutrofilowej o około 2000 razy.
175 422
Po miejscowym zobojętnieniu αι-PI elastaza zdolna jest do rozkładu niektórych inhibitorów innych enzymów proteolitycznych. Elastaza rozkłada a1-ChI i w ten sposób wzmaga aktywność katepsyny G. Elastaza rozkłada również TIMP, czego wynikiem jest rozkład tkanki przez metaloproteinazy. Następnie elastaza rozkłada antytrombinę III i kofaktor II heparyny, oraz inhibitor układu krzepnięcia zależnego od czynników tkankowych (TFPI), który prawdopodobnie przyczynia się do powstawania skrzepu. Z drugiej jednak strony zdolności elastazy neutrofilowej do rozkładu czynników krzepnięcia przypisuje się wpływ przeciwny, tak więc sumaryczny efekt działania elastazy nie jest jasny. Wpływ elastazy neutrofilowej na fibrynolizę jest bardziej jednoznaczny. Elastaza rozkłada inhibitor aktywatora plazminogenu i inhibitor a2-plazminy, w związku z czym aktywność fibrynolityczna rośnie. Oba te inhibitory są zresztą utleniane i unieczynniane przez metabolity O2.
PMN zawierają duże ilości proteaz serynowych; dziennie uwalnia się 200 mg każdej z proteaz leukocytowych, które mają zwalczać czynniki inwazyjne w ustroju. W wyniku ostrego zapalenia dochodzi do wielokrotnego wzrostu ilości uwalnianego enzymu. W normalnych warunkach rozkład białka utrzymywany jest na dopuszczalnie niskim poziomie przez duże ilości inhibitorów αι-PI, αι-ChI i a2-makroglobuliny. Istnieją jednak pewne dane wskazujące, że niektóre choroby przewlekłe spowodowane są patologicznym rozkładem białka, którego przyczyną jest nadmierne pobudzenie PMN, spowodowane np. przez odpowiedź autoimmunologiczną, przewlekłe zakażenie, dym tytoniowy lub inne czynniki drażniące itp.
Wiadomo, że aprotynina (bydlęcy inhibitor trypsyny trzustkowej) jest inhibitorem różnych proteaz serynowych, w tym również trypsyny, chymotrypsyny, plazminy i kalikreiny i jest stosowana w leczeniu ostrego zapalenia trzustki, różnych stanów zespołu wstrząsu, krwawienia hiperfibrynolitycznego oraz zawału mięśnia sercowego (por. np. J. E. Trapnell i in, Brit. J. Surg. 61, 1974, str. 177; J. McMichan i in, Circulatory Shock 9, 1982, str. 107; L. M. Auer i in, Acta Neurochir. 49,1979, str. 207; B. Sher, Am. J. Obstet. Gynecol. 129,1977, str. 164; i B. Schneider, Artzneim.-Forsch. 26, 1976, str. 1606). Podawanie aprotyniny w wysokich dawkach znacząco zmniejsza utratę krwi przy operacjach kardiochirurgicznych, włącznie z operacjami w krążeniu pozaustrojowym (por. np. B. P. Bidstrup i in., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97,1989, str. 364-372; W. van Oeveren i in, Ann. Thorac. Surg. 44, 1987, str. 640-645). Uprzednio wykazano (por. H. R. Wenzel i H. Tschesche, Angew. Chem. Internat. Ed. 20, 1981, str. 295), że niektóre analogi aprotyniny, na przykład aprotynina (1-58, Val15) wykazują stosunkowo wysoką wybiórczość dla elastazy granulocytamej oraz działanie hamujące kolagenazę; aprotynina (1-58, Ala15) wykazuje słaby wpływ na elastazę, podczas gdy aprotynina (3-58, Arg15, Ala17, Ser42) wykazuje wybitny wpływ hamujący kalikreinę osoczową (por. WO 89/10374).
Wykazano jednakże, że przy podawaniu in vivo aprotynina wykazuje działanie nefrotoksyczne u szczurów, królików i psów po powtarzanych wstrzyknięciach stosunkowo wysokich dawek aprotyniny (Bayer, Trasylol. Inhibitor of Proteinase; E. Glaser i in. w Verhandlugen der Deutschen Gesellschaft fur Innere Medizin, 78. Kongress, Bergmann, Munchen, 1972, str. 1612-1614). Nefroloksyczność (to znaczy pojawianie się zmian chorobowych), obserwowaną w przypadku aprotyniny, przypisać można akumulacji aprotyniny w komórkach kanalików bliższych nerek, będącej wynikiem wysoce dodatniego ładunku netto aprotyniny, który powoduje, że wiąże się ona z ujemnie naładowaną powierzchnią kanalików. Nefrotoksyczność ogranicza kliniczne zastosowanie aprotyniny, zwłaszcza tam, gdzie niezbędne byłoby podawanie wysokich dawek inhibitora, jak na przykład w operacjach w krążeniu pozaustrojowym. Aprotynina jest poza tym białkiem bydlęcym, może zatem zawierać jedną lub więcej determinant antygenowych, zdolnych wywołać niepożądaną odpowiedź immunologiczną przy stosowaniu aprotyniny u ludzi.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatem identyfikacja ludzkich inhibitorów proteaz tego samego typu, co aprotynina (tzn. inhibitorów typu Kunitz), o profilu hamowania podobnym lub zmodyfikowanym w celu osiągnięcia pożądanego profilu hamowania.
Istota wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest wariant ludzkiej domeny II typu Kunitz, hamującej proteazy, inhibitora układu krzepnięcia zależnego od czynników tkankowych (TFPI), przy czym wariant ten zawiera następującą sekwencję aminokwasów: X1 Asp Phe Cys Phe Leu Glu
175 422
Glu Asp X2 Gly X3 Cys X4 X5 X6 X7 X8 X9 Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Χιδ Tyr Gly Gly Cys X11 X12 X13 Met Asn Asn Phe X14 Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp X35 (SEQ ID Nr 1), gdzie X1 oznacza H lub 1-5 reszt naturalnie występujących aminokwasów z, wyjątkiem Cys, X2 do X14 każde z osobna oznacza resztę naturalnie występującego aminokwasu z wyjątkiem Cys, a X15 oznacza OH lub 1-5 reszt naturalnie występujących aminokwasów z wyjątkiem Cys, z zastrzeżeniem, że co najmniej jedna z reszt aminokwasowych X1 do X15 jest różna od odpowiadającej jej reszty aminokwasowej w sekwencji natywnej.
W niniejszym kontekście określenie reszta naturalnie występującego aminokwasu oznaczać ma dowolny z 20 powszechnie wystających aminokwasów, to znaczy Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg i His.
TFPI, znany również jako inhibitor zewnątrzpochodnego układu krzepnięcia (EPI) lub inhibitor krzepnięcia związany z lipoproteinami (LACI), wyizolowany został prze Broze i in. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1987, str. 1886-1890 oraz EP 300 988); sklonowano również gen kodujący to białko, por. EP 318 451. Analiza drugorzędowej struktury tego białka wykazała, że białko to zawiera trzy domeny hamujące typu Kunitz, od aminokwasu 22 do aminokwasu 79 (I), od aminokwasu 93 do aminokwasu 150.(11) i od aminokwasu 185 do aminokwasu 242 (Hł). Wykazano, że domena I typu Kunitz TFPI wiąże TF/FVHa, natomiast domena Π typu Kunitz wiąże FXa (Girard i in., Naturę 338, 1989, str. 518-520). Podstawiając jeden lub więcej aminokwasów w jednym lub więcej z położeń wskazanych powyżej, można zmienić profil hamowania domeny Π typu Kunitz TFPI tak, aby wybiórczo hamowała ona ełastazę neutrofiłową, katepsynę G i/lub proteinazę 3. Następnie możliwe byłoby wytworzenie wariantów, które swoiście hamowałyby enzymy związane z krzpnięciem lub fibrynolizą (np. plazminę lub kalikreinę osoczową) lub kaskadę dopełniacza. Zaletą domeny II typu Kunitz TFPI jest to, że ma ona ujemny ładunek netto w przeciwieństwie do aprotyniny, która, jak to wspomniano powyżej, ma wysoce dodatni ładunek netto. Można zatem wytworzyć warianty wynalazku o niższym ładunku dodatnim netto od aprotyniny, zmniejszając w ten sposób ryzyko uszkodzenia nerek przy podawaniu dużych dawek tych wariantów. Inną zaletą jest fakt, że w przeciwieństwie do aprotyniny wariant taki jest ludzkim białkiem (fragmentem), tak więc znacząco ogranicza się występowanie niepożądanych odczynów immunologicznych przy stosowaniu go u łudzi.
Szczegółowy opis wynalazku
Przykładami korzystnych wariantów domeny II typu Kunitz TĘPI są warianty, w których
XI stanowi Lys, Pro; lub w których X2 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Ala, Arg, Thr, Asp, Pro, Glu, Lys, Gin, Ser, Ile i Val, w szczególności, w których X2 stanowi Thr lub Pro; lub w których X3 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Pro, Thr, Leu, Arg, Val i De, w szczególności w których X3 stanowi Pro lub Ile; lub w których X4 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr, Gin, Asn i Ala, w szczególności w których X4 stanowi Lys, Val, Leu, Ile, Thr, Met, Gin lub Arg; lub w których X5 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Ala, Gly, Thr, Arg, Phe Gin i Asp, w szczególności, w których X5 stanowi Ala, Thr, Asp lub Gly; lub w których X6 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Arg, Ala, Lys, Leu, Gly, His, Ser, Asp, Gin, Glu, Val, Thr, Tyr, Phe, Asn, Ile i Met, w szczególności w których X6 stanowi Arg, Phe, Ala, Leu lub Tyr; lub w których X7 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Ile, Met, Gin, Glu, Thr, Leu, Val i Phe, w szczególności w których X7 stanowi He; lub w których X8 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Ile, Thr, Leu, Asn, Lys, Ser, Gin, Glu, Arg, Pro i Phe, w szczególności w których X8 stanowi Ile lub Thr; lub w których X9 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Arg, Ser, Ala, Gin, Lys i Leu, w szczególności w których X9 stanowi Arg; lub w których X10 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Gin, Pro, Phe, Ile, Lys, Trp, Ala, Thr, Leu, Ser, Tyr, His, Asp, Met, Arg i Val, w szczególności w których X10 stanowi Val lub Lys; lub w których
XII stanowi resztę aminokwasowa dobraną spośród Gly, Met, Gin, Glu, Leu, Arg, Lys, Pro i Asn, w szczególności w których Xn stanowi Arg lub Leu; lub w których X12 stanowi Ala lub Gly; lub w których X13 stanowi Lys, Asn i Asp, w szczególności w których X13 stanowi Lys lub Asn; lub w której X14 stanowi resztę aminokwasową dobraną spośród Val, Tyr, Asp, Glu, Thr, Gly, Leu, Ser, He, Gin, His, Asn, Pro, Phe, Met, Ala, Arg, Trp i Lys, w szczególności w których X34
175 422 stanowi Lys lub Glu; lub w których X15 stanowi Gły. W korzystnym wykonaniu X1 stanowi Lys, Pro, a X15 stanowi Gly, natomiast X2 do X14 stanowią reszty aminokwasowe okręslone powyżej.
Warianty domeny Π typu Kunitz TFPI według wynalazku, korzystnie, nie powinny zawierać reszty Met w regionie wiążącym proteazę (to znaczy reszt aminokwasowych oznaczonych przez X3 do X14). Analogicznie jak w przypadku opisanego powyżej ai-PI, reszta Met w dowolny, z tych położeń spowodowałaby, że inhibitor stałby się wrażliwy na unieczynienie prze utlenienie przez tlenowe metabolity produkowane przez PMN, a nieobecność reszty Met w tych położeniach powinna, przeciwnie, uczynić inhibitor bardziej stabilnym w obecności takich tlenowych metabolitów.
Pożądana może być zmiana sposobu glikolizacji wariantu domeny II typu Kunitz przy wytwarzaniu go przez komórkę gospodarza. Wariant według wynalazku może zatem, w jednym z wykonań, mieć następującą sekwencję aminokwasów: X1 Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp X2 Gly X3 Cys X4 X5 X6 X7 X8 X9 Tyr Phe Tyr Asn X16 Gin X17 Lys Gin Cys Glu Arg Phe Xfo Tyr Gly Gly Cys X11 X12 X13 Met Asn Asn Phe X14 Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp X75 (SEQ ID Nr 2), 6 gdzie X7 do X15 stanowią reszty aminokwasowe określone w zastrz. 1, X16 stanowi reszta aminokwasowa dobrana spośród Gin, Gly, Ala, Ser, Val i Phe, w szczególności Gin lub Ala, a X17 stanowi reszta aminokwasowa dobrana spośród Thr i Ala.
Aktualnie korzystnymi wariantami wynalazku są takie warianty, w których jedna lub więcej reszt aminokwasowych, znajdujących się w miejscu wiążącym proteazę domeny Kuntz, tzn. jedna lub więcej reszt aminokwasowych X3 do X14 (odpowiadających położeniom 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 34, 39,40, 41 i 46 aprotyniny) jest podstawionych w miejsce aminokwasów znajdujących się w tym samym położeniu (położeniach) aprotyniny aktywnej. Przykłady takich wariantów stanowią
Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly He Cys Lys Ala Arg He Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (SEQ ID nr 3);
Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly He Cys Lys Ala Arg He Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (SEQ ID nr 4);
Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly He Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (SEQ ID nr 5); lub
Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Pro Cys Lys Ala Arg He Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (SEQ ID nr 6).
Inną cechą charakterystyczną wynalazku jest DNA kodujące ludzki wariant domeny hamującej typu Kunitz według wynalazku. DNA według wynalazku można wytworzyć syntetycznie za pomocą znanych standardowych metod, na przykład metody fosfamidynowej, opisanej przez S. L. Beaucage i Μ. H. Caruthers, Tetrahedron Latters 22, 1981, str. 1859-1869, lub metody opisanej przez Matthes i in., EMBO Journal 3, 1984, str. 801-805. Według metody fosfamidynowej syntetyzuje się oligonukleotydy, np. w automatycznym urządzeniu do syntezy DNA, a następnie oczyszcza się je, paruje, wiąże przy pomocy ligazy i klonuje w odpowiednich wektorach.
Można zamiast tego stosować gen lub fragment cDNA, kodujące domenę Π typu Kunitz TFPI (uzyskując gen lub fragment cDNA przez sondowanie, odpowiednio, biblioteki genomu lub biblioteki cDNA w poszukiwaniu fragmentu DNA, kodującego TFPI, stosując syntetyczne sondy oligonukleotydowe i izolując stamtąd sekwencję DNA kodującą domenę II). Następnie modyfikuje się sekwencję DNA w jednym lub więcej miejsc odpowiadających miejscu (miejscom), w których pożądane jest dokonanie podstawienia aminokwasu; modyfikacji dokonuje się np. poprzez mutagenezę ukierunkowaną na konkretne miejsce z zastosowaniem syntetycznych oligonukleotydów, kodujących pożądaną sekwencję aminokwasów w celu osiągnięcia homologicznej rekombinacji, jak w metodach znanych ze stanu techniki.
175 422
Kolejną cechą charakterystyczną wynalazku jest rekombinacyjny wektor ekspresyjny, zawierający fragment DNA według wynalazku. Rekombinacyjny wektor ekspresyjny może stanowić dowolny wektor, dogodny dla zastosowania do rekombinacji DNA; wybór wektora zależeć będzie często od komórki - gospodarza, do której wektor ma być wprowadzony. Wektor może zatem stanowić wektor autonomicznie replikujący się, to znaczy wektor istniejący jako jednostka pozachromosomalńa, którego replikacja nie zależy od replikacji chromosomalnej; wektorem tym może na przykład być plazmid. Zastosowanym wektorem może być zamiast tego taki wektor, który, wprowadzony do komórki gospodarza, włączany jest do jej genomu i replikowany jest razem z chromosomem (chromosomami), do których został włączony.
Sekwencja DNA, kodująca wariant domeny Π TFPI według wynalazku, powinna być wewnątrz wektora złączona z odpowiednią sekwencją promotorową, jednakże w sposób umożliwiający działanie. Promotor stanowić może dowolna sekwencja DNA, wykazująca aktywność tran skry pcyjną w wybranej komórce gospodarza; promotor pochodzić może z genów kodujących białka homologiczne lub heterologiczne dla komórki gospodarza. Przykładami promotorów odpowiednich do sterowania transkrypcją DNA kodującego wariant domeny Π typu Kunitz TFPI według wynalazku w komórkach ssaków są: promotor SV 40 (Subramani i in., Mol. Celi Biol. 1, 1981, str. 854-864), promotor MT-1 (gen metalotioneiny) (Palmiter i in., Science 222, 1983, str. 809-814) oraz główny opóźniony promotor adenowirusa 2. Do promotorów odpowiednich do zastosowania w komórkach drożdży należą promotory pochodzące z drożdżowych genów glikolizy (Hitzeman i in., J. Biol. Chem. 255, 1980, str. 12073-12090; Alber i Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, str. 419-434) lub genów dehydrogenazy alkoholowej (Young i in., w Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (pod red. Hollaender i in.), Plenum Press, New York, 1982), oraz promotory TPI1 (US 4, 599, 311) lub ADH2-4c (Russell i in., Naturę 304, 1983, str. 652-654). Promotorami odpowiednimi do użycia w komórkach grzybów nitkowatych są np. promotor ADH3 (McKnight i in., The EMBO J. 4, 1985, str. 2093-2099), lub promotor tpiA.
Sekwencja DNA, kodująca wariant domeny II typu Kunitz TFPI według wynalazku może również być przyłączona, w sposób umożliwiający działanie, do odpowiedniej sekwencji terminacyjnej, takiej jak sekwencja terminacyjna ludzkiego hormonu wzrostu (Palmiter i in., op. cit.), lub, u grzybów, promotory TPI1 (Alber i Kawasaki, op. cit.) lub ADH3 (McKnight i in., op. cit). Wektor może także zawierać takie elementy, jak sygnały poliadenylacji (np. z SV 40 lub z regionu Elb adenowirusa 5), sekwencje wzmagające transkrypcję (np. sekwencja wzmagająca SV 40) i sekwencje wzmagające translację (np. sekwencje kodujące RNA adenowirusa VA).
Rekombinacyjny wektor ekspresyjny według wynalazku może także zawierać sekwencję DNA umożliwiającą wektorowi replikację w danej komórce gospodarza. Przykładem takiej sekwencji (gdy komórką gospodarza jest komórka ssaka) jest zapoczątkowanie replikacji przez SV, lub (gdy komórką gospodarza jest komórka drożdży) geny replikacji plazmidu 2 μ drożdży REP 1-3 i zapoczątkowanie replikacji. Wektor może również zawierać możliwy do wyróżnienia znacznik (np. gen, którego produkt uzupełnia brak w komórce gospodarza, jak np. gen kodujący reduktazę dwuhydrofolanu (DHFR), lub gen nadający oporność na lek, na przykład neomycynę, hygromycynę lub metotreksat, lub gen TPI Schizosaccharomyces pombe (opisany przez P. R. Russell, Gene 40, 1985, str. 125-130).
Sposoby związania przy użyciu ligazy sekwencji DNA, odpowiednio, inicjującej i terminacyjnej, wariantu domeny II typu Kunitz TFPI według wynalazku, i wprowadzania ich do odpowiednich wektorów zawierających informację niezbędną dla replikacji, są dobrze znane specjalistom (por. np. Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Komórkę gospodarza, do której wprowadzany jest wektor ekspresyjny według wynalazku, może stanowić dowolna komórka zdolna do produkcji wariantu domeny II typu Kunitz TFPI według wynalazku, a korzystnie, komórka eukariotyczna, jak na przykład komórka ssaka, drożdży lub grzyba.
Drożdże, używane jako komórki - gospodarze według wynalazku, mogą stanowić dowolne drożdże, które, w hodowli, produkują duże ilości wariantu domeny II typu Kunitz TFPI według
175 422 wynalazku. Przykładami odpowiednich drożdży są szczepy gatunków drożdży Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe łub Saccharomyces uvarum. Transformacja komórek drożdży może dokonać się na przykład przez wytworzenie protoplastu, a następnie transformację w sposób sam przez się znany.
Przykładami odpowiednich linii komórkowych komórek ssaków są linie komórkowe: COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10) lub CHO (ATCC CCL 61). Metody transfekcji komórek ssaków i ekspresji sekwencji DNA wprowadzonych do komórek opisane zostały na przykład przez: Kaufman i Sharp, J. Mol. Biol. 159, 1982, str. 601621, Southern i Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, str. 327-341; Loyter i in.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79,1982, str. 422-426; Wigier i in., Cell 14,1978, str. 725; Corsaro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 1981, str. 603; Graham i van der Eb, Virology 52, 1973, str. 456 oraz Neuman i in., EMBO J. 1, 1982, str. 841-845.
Zamiast wyżej wymienionych, jako komórek gospodarza według wynalazku używać można komórek grzybów. Przykładami odpowiednich komórek grzybów są komórki grzybów nitkowatych, na przykład Aspergillus spp. lub Neurospora spp., w szczególności szczepów Aspergillus oryzae lub Aspergillus niger. Zastosowanie Aspergillus spp. do ekspresji białek opisano na przykład w EP 238 023.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest następnie sposób wytwarzania wariantu domeny II typu Kunitz TFPI według wynalazku, składający się z wyhodowania komórki według powyższego opisu w warunkach sprzyjających ekspresji wariantu i odzyskania powstałego wariantu z hodowli.
Do hodowli komórek stosować można dowolną konwencjonalną pożywkę, odpowiednią do hodowli komórek ssaków lub grzybów (w tym również drożdży), w zależności od wyboru komórki - gospodarza. Wariant wydzielany będzie przez komórki - gospodarzy do pożywki i może być z niej odzyskany przy zastosowaniu konwencjonalnych metod, obejmujących wydzielenie komórek z pożywki przez odwirowanie lub filtrację, strącenie białkopodobnych składników nadsączu lub filtrację za pomocą soli, np. siarczanu amonowego oczyszczenie za pomocą różnych metod chromatograficznych, na przykład chromatografii jonowymiennej lub chromatografii powinowactwa, lub tp.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również preparat farmaceutyczny, zawierający wariant domeny II typu Kunitz TFPI według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę. Preparat według wynalazku może wytworzony z zastosowaniem dowolnej ze znanych metod wytwarzania preparatów farmaceutycznych, jak to na przykład opisano w Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985. Typowo będzie to preparat przeznaczony do podawania ogólnego w postaci wstrzyknięć lub wlewów dożylnych i jako taki zawierać może jałową wodę albo roztwór soli fizjologicznej lub glukozy.
Zamierzeniem jest uzyskanie wariantu domeny II typu Kunitz TFPI według wynalazku, wykazującego zalety przy użyciu dla celów leczniczych proponowanych dla natywnej aprotyniny lub analogów aprotyniny o innych profilach hamowania, szczególnie dla tych celów, które wymagają zastosowania dużych dawek aprotyniny. Wskazania do leczniczego zastosowania wariantu według wynalazku wynikają z jego zdolności hamowania ludzkich proteaz serynowych, np. trypsyny, plazminy, kalikreiny, elastazy, katepsyny G i proteinazy-3, i obejmują (ale nie są do nich organiczne) ostre zapalenie trzustki, stany zapalne, małopłytkowość, zachowanie funkcji płytek krwi, ochronę narządów, gojenie się ran, wstrząs (w tym również płuco wstrząsowe) oraz stany wywołujące krwawienie hiperfibrynolityczne, rozedmę płuc, reumatoidalne zapalenie stawów, zespół ostrego wyczerpania oddechowego dorosłych (ARDS), przewlekłe zapalne choroby jelit i łuszczycę, innymi słowy choroby, co do których sądzi się, że mogą być spowodowane patologicznym rozkładem białka, powodowanym przez elastazę, katepsynę G lub proteinazę-3, uwalniane z wyzwolonych PMN.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również zastosowanie domeny II inhibitora typu Kunitz TFPI lub jej wariantu, jak to opisano powyżej, do wytworzenia leku, służącego zapobieganiu lub leczeniu chorób lub stanów związanych z patologicznym rozkładem białka przez proteazy uwolnione z nadmiernie pobudzonych PMN. Jak to wskazano powyżej, korzystnie
175 422 może być jednoczesne z domeną hamującą II typu Kunitz TFPI lub jej wariantem stosowanie heparyny.
Niezależnie od farmaceutycznego zastosowania opisanego powyżej, domena II typu Kunitz TFPI lub jej wariant, jak to wyszczególniono powyżej, mogą być stosowane do wyizolowania pożytecznych substancji naturalnych, np. proteaz lub receptorów, z materiału ludzkiego; substancje te bezpośrednio lub pośrednio wiążą się z domeną II typu Kunitz TFPI przy zastosowaniu na przykład testów przesiewowych lub chromatografii powinowactwa.
PRZYKŁADY
Metody ogólne.
Postępowano zgodnie z opisanymi standardowymi technikami DNA (Sambrook, J., Fritsch, E. F. i Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Wytworzono syntetyczne oligonukleotydy przy pomocy automatycznego urządzenia do syntezy DNA (380B, AppIled Biosystems), stosując metodę fosfamidynową na regulowanym podłożu ze szkła porowatego (Beaucage, F. L. i Caruthers, M. H., Tetrahedron Letters 22, (1981), 1859-1869). Określono sekwencję DNA z zastosowaniem techniki terminacji dwudezoksy łańcucha (Sanger, F., Micklen, S. i Coulson, A. R., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 74 (1977), 5463-5467). Przeprowadzono polimerazowe reakcje łańcuchowe (PCR) przy pomocy urządzenia do cykli cieplnych DNA (Perkin Elmer Cetus).
Po hydrolizie w 6M HCl w temperaturze 110°C w uszczelnionych próżniowo rurkach przez 24 godziod,przeprowadzono onal izę aminokwasów. Analizę przeprowadzono za p om ocą auto matycznego analizatora amiaρkwasón Beckman 121MB, zmodyfikowanego do procesu mikroOrożenia.
Analizę sekwencji aminokwasów od końca N przeprowadzono z zastosowaniem automatycznej degradacji Edman przy pomocy urządzenia do badania sekwencji w fazie gazowej, AppIieO Biosystems 470A. W celu wykrycia i ilościowego ozanczeaia uwolnionych aminokwasów PTH w każdym cyklu urządzenia do badania sekwencji przeprowadzono analizę z zastosowaniem bezpośredniej chromatografii cieczowej nysokosprawęej z odwróconymi fazami.
Oznaczono ciężar cząsteczkową za pomocą spektrometru masowego z desorpcją plazmy (PDMS) BIO-ION 20, wyposażonego w około 15 cm rurę wylotową, zastosowanego w trybie dodatnim. Przeannlizowaęo próbki o objętości 5 μ! każda w zestawie napięcia przyspieszającego do 15 kV i zebrano jony dla 5 milionów rozszczepień. Dokładność oznaczenia ciężaru cząsteczkowego jonów wynosi około 0,1% dla dobrze zdefiniowanych maksimów, w przeciwnym razie jest ona nieco mniejsza.
Przykład 1. Wytwarzanie drugiej domeny typu Kunitz inhibitora układu krzepnięcia zależnego od czynników tkankowych, TFPI-2, ze szczepu drożdży KFN-1593.
Z pochodzącej z wątroby ludzkiej linii komórkowej HepG2 (ATCC HB 8065) wyizolowano cDNA kodujący pełnej długości TFPI i wprowadzono jako fragment 0,8 kb BamHI-XbaI do ekspresyjnego wektora ssaka, pKFN-1168, jak to zostało opisane (Pedersen, A. H., Nzzrdfarιg. O., Norris, F., Wilberg F. C., Christensen, P. M., Moelle, K. B., Mei0ahl-Pe0ersea, J., Beck, T. C., Norris, K., Hedner, U. i Kisiel, W., 1990, J. Biol. Chem. 265, 16786-16793). Sekwencję DNA wprowadzonego fragmentu podaęo w SEQ ID Nr 7. TFPI-2 kodowany jest przez nukleotydy 365-538, jak to wskazano.
TFPI-2: w reakcji PCR znstosonano jako matryce 1,0 |ig fragment 0,9 kb BamHI-KbaI z pKFN 1168, zawierający 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących (primerów) NOR-2526 (GCTGAGAGATTGGAGAAGAGAAAGCCAGATTTCTGCTT) i NOR-2528 (CTGGAATCTAGATTAACCATCTTCACAAATGTT). 17 3'-końcowych zasad NOR-2526 jest tożsamych z zasadami 365 do 381 genu TFPI-2 w SEQ ID Nr 7, a 21 5,-końcowzch zasad jest tożsamych z zasadami 215 do 235 syntetycznego genu stanowiącego lider (zob. fig. 2) z pKFN-1000, opisanego powyżej. Sekwencja inicjująca NOR-2528 jest komplementarna do zasad 521 do 540 w SEQ ID Nr 7 i ma 5'-nydłużeęle zawierające kodon zatrzymujący translację, po którym następuje miejsce XbaI.
Przeprowadzono reakcję PCR w objętości 100 μ!, używając zestawu handlowego (GeneAmp, Perkin Elmer Cetus) i stosując następujący cykl: 94° przez 20 sekund, 50° przez 20 sekund i 72° przee 30 seeund. Po 19 cyklaah pozzpoowadzono cykl końcowy, w którym eeta 72°
175 422 utrzymywano przez 10 minut. Produkt PCR, fragment 210 bp, wyizolowano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym.
Lider sygnału: jako matrycy w reakcji PCR użyto 0,1 gg fragmentu 0,7 kb PvuII z pKFN-1000, opisanego poniżej, zawierającego 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-1478 (GTAAAACGACGGCCAGT) i NOR-2523 (TCTCTTCTCCAATCTCTCAGC). NOR-1478 jest komplementarna do sekwencji położonej bezpośrednio przed miejscem EcoRI w SEQ ID Nr 9. Sekwencja inicjująca NOR-2523 jest komplementarna do 17 3'-końcowych zasad syntetycznego genu, stanowiącego lider sygnału, pKFN-1000, zob. SEQ ID Nr 9. Przeprowadzono reakcję PCR według powyższego opisu, w wyniku czego otrzymano fragment 257 bp.
Plazmid pKFN-1000 jest pochodną plazmidu pTZ19R (Mead, D. A., Szczesna-Skorupa, E. i Kemper, B., Prot. Engin. 1 (1986), 67-74), zawierającm DNA kodujący syntetyczny peptyd drożdżowy, stanowiący lider sygnału. Plazmid pKFN-1000 opisano w WO 90/10075. Sekwencję DNA 235 bp, położona za miejscem EcoRI pKFN-1000, i kodowaną sekwencję aminokwasów syntetycznego drożdżowego lidera sygnału podano w SEQ ID Nr 9.
Lider sygnału TFPI-2: zmieszano po około 0,1 (Ig każdego z dwóch fragmentów PCR opisanych powyżej. Przeprowadzono reakcję PCR z użyciem 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-1478 i NOR-2528, stosując następujący cykl: 94° przez 1 minutę, 50° przez 2 minuty i 77^° przze 3 minuty. Po 16 cyklach prz.zerowadzon° cykl końcowy, w którym eeap 72° utrzymywano przez 10 minut.
Powstały fragment 442 bp oczyszczono przez elektroforezę na 1% żelu agarozowym i poddano strawieniu przez EcoRI i XbaI. Powstały fragment 412 bp związano za pomocą ligazy z fragmentem 9,5 kb NcoI-XbaI z pMT636 oraz z fragmentem 1,4 kb Ncol-EcoRI z pMT 636. Plazmid pMT-636 opisany jest w Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym Nr PCT/DK88/00138.
pMT636jest wahadłowym wektorem pochodzącym z E. coli - S. yerevisiae, zawierającym gen TPI (POT) ze Schizosaccharomyces pombe (Russell, P. R., Gene 40 (1985) 125-130), promotor i sekwencję terminacyjną (terminator) izomerazy triozofosforanu S. cerevisiae, TPIp i TPIy (Alber, T. i Kawasaki, G„ J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434).
Mieszaninę wytworzoną z użyciem ligazy zastosowano do transformacji kompetentnego szczepu E. coli (r', m+), selekcjonując pod kątem oporności na ampicylinę. Sekwencjonowanie DNA wykazało, że plazmidy z powstałych kolonii zawierały prawidłową sekwencję DNA dla TFPI-2, prawidłowo wbudowaną w syntetyczny drożdżowy gen stanowiący lider sygnału.
Wybrano jeden plazmid pKFN-1605 do dalszego zastosowania. Budowę plazmidu pKFN1605 przedstawiono na fig. 1.
Kaseta ekspresji plazmidu pKFN-1605 zawiera następującą sekwencję:
TPIp - lider sygnału KFN-1000 -TFPI2 - TPIy
Sekwencję DNA fragmentu 412 pb EcoRI-XbaI z pKFN-1605 przedstawiono w SEQ ID Nr 11.
Transformacja drożdży: szczep S. yerevisiae MT663 (E2-7B XE11-36 a/α, Atpi/Atpi, pep 4-3/pep 4-3) hodowano na pożywce YPGaL (1% wyciągu drożdżowego Bacto, 2% peptonu Bacto, 2% galaktozy, 1% mleczanu) do gęstości optycznej wynoszącej 0,6 w 600 nm.
100 ml hodowli zebrano poprzez odwirowanie, przepłukano 10 ml wody, ponownie odwirowano i ponownie zawieszono w 10 ml roztworu zawierającego 1,2 M sorbitu, 25 mM' Na2EDTA o odczynie i 6,7 mg/mi dti^oreetui. Zawiesinę inkubowano w 30°C przez 15 minut, następnie odwirowano i ponownie zawieszono w 10 ml roztworu zawierającego 1,2 M sorbitu, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M cytrynianu sodowego o odczynie pH=5,8 i 2 mg preparatu Novozym® 234. Zawiesinę inkubowano w 30°C przez 30 minut, komórki zebrano przez odwi- rowanie, przepłukano 10 ml 1,2 M sorbitu i 10 ml CAS (1,2 M sorbitu, 10 mM CaCh, 10 mM Tris HCl (Tris=Tris(hydroOsymetylo)aminometan, pH=7,5) i ponownie zawieszono w 2 ml CAS. Dla transformacji zmieszano 0,1 ml komórek ponownie zawieszonych w CAS z około 1 gg plazmidu pKNF-1605 i pozostawiono w temperaturze pokojowej na 15 minut. Dodano 1 ml (20% glikol polietylenowy 4000, 20 mM CaCh, 10 mM CaCh, 10 mM Tris HCl, pH=7,5) i mieszaninę pozostawiono na dalsze 30 minut w temperaturze pokojowej. Mieszaninę odwirowano, a granulkę ponownie zawieszono w 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitu, 33% obj. YPD,
175 422
6,7 mM CaCh, 14 gg/ml leucyny) i inkubzwaao w 30°C przez 2 godziny. Zawiesinę odwirowano, a granulkę ponownie zawieszono w 0,5 ml 1,2 M sorbitu. Następnie dodano 6 ml specjalnego agaru (pożywka SC według Sherman i in., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Labo^ory (1982)) zawierająca 1,2 M sorbitu i 2,5% agar) w 52°C i zawiesinę wylano na wierzch płytek zawierających tę samą pożywkę z sorbitem, zestaloną agarem.
Po 3 dniach w 30°C kolonie transformacyjne pobrano, ponownie wyizolowano i zastosowano do zapoczątkowania hodowli płynnych. Wybrano jedną taką kolonię transformacyjną KFN-1593 do dalszej charakterystyki.
Fermentacja: hodowano szczep drożdży KFN-1593 na pożywce YPD (1% wyciągu z drożdży, 2% peptonu (z Laboratoriów Difco) i 3% glukozy). 1 litr hodowli szczepu wytrząsano w 30°C do uzyskania gęstości optycznej wynoszącej 24 w 650 nm. Po odwirowaniu wyizolowano nadsącz.
Oczyszczenie: nadsącz drożdży (1000 ml) o odczynie doprowadzonym do pH=3,0 za pomocą kwasu fosforowego, nałożono na kolumnę Szybkiego Przepływu S-Sefarozy (Pharmacia, 2,6 x 3,6 cm) zrównoważoną25 mM dwuwzdorofosforynu sodowego o odczynie pH=3,5. Po przepłukaniu buforem równoważącym, TFPI-2, przetestowany ze względu na aktywność hamowania trypsyny, eluowano buforem zawierającym 1 M chlorku sodowego (40 ml). Na kolumnie Sephadex G-25 (Pharmacia, 2,6 x 34 cm), zrównoważonej i eluowanej wodorowęglanem amonowym o odczynie pH=7,5, uzyskano oasolenie. Dalszego oczyszczenia dokonano stosując kolumnę Mono S ^armacia, 0,5 x 5 cm) poprzez elucję gradientową w czasie 23 minut przy prędkości przepływu 1 ml/min z chlorku sodowego od 0 do 0,43 M w 25 mM dwuwodorofosforanie sodowym, 10% obj. nitrylu octowym przy odczynie o pH=3,5. N-glikonylowany TFPI-2 i nieglikozylowaay TFPI-2 eluowane były, w odpowiednio, 0,20 M i 0,26 M chlorku sodowym. Ostatecznego oczyszczenia aieglikozdlowanego TFPI-2 dokonano, przez chromatografię cieczową wysokosprawną z odwróconymi fynami, na kolumnie C18 (Novo Nordisk A/S, 0,4 x 25 cm) poprzez elucję gradientową przez 30 minut z prędkością przepływu 1 ml/min w nitrylu octowym od 0 do 50% i 0,1 % kwasie trójfluorooctowym.
TFPI-2 eluowano w 40% nitrylu octowym. Oczyszczony produkt liofilizowano i ponownie rozpuszczono w wodzie do stężenia około 200 nM. Jednakowej objętości próbki tego roztworu analizowano ze względu na skład amiaokwasowy (tabela 1), sekwencję aminokwasów, ciężar cząsteczkowy (PDMS; stwierdzony: MW 6840,8, z obliczeń: 6840,6) i aktywność hamującą proteazy.
Przykład 2. Wytwarzanie TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T191] ze szczepu drożdży KFN-1811.
W dwóch reakcjach PCR zastosowano jako matrycę 0,1 gg fragment 1,3 kb SphI-BymHI, kodującego TFPI-2 z plazmidu pKFN-1605. Do pierwszej reakcji PCR użyto 100 pmole każdej z sekwencji iaicjującdcn (primerów) NOR-2022 (GGAGTTTAGTGAACTTGC) i M-460 (GTTATTAAAAATACCTGATAATACGAGCTTTACATATTCCAGGATC). Do drugiej reakcji PCR użyto 100 pmole każdej z sekwencji laicjującycn NOR-1495 (TAAgTgGCTCAGAATGA) i M-459 (GATCCTGGAATATGTAAAGCTCGTATTATCAGGTATTTTTATAAC).
NOR-2022 stanowi sekwencję inicjującą w pozycji 94 bp za miejscem SphI. M-460 jest komplementarny do pozycji 263 do 307 sekwencji DNA TFPI-2, SEQ ID Nr 11, z wyjątkiem sześciu aiekomplemeatαmych zasad. NOR-1495 stanowi sekwencję inicjującą w pozycji 561 bp przed miejscem BamHI. M-459 jest komplementarny do M-460.
Przeprowadzono reakcję PCR w objętości 100 gl, używając zestawu handlowego (GeneAmp, Perkin Elmer Cetus) i stosując następujący cykl: 95° przez 1 minutę, 50° przez 1 minutę i 72° przez 2 minuty. Po 24 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72° utrzymywano przez 10 minut. Produkt PCR, fragment 444 bp z pierwszej PCR i fragment 285 bp z drugiej, wyizolowano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym. Zmieszano po około 0,1 gg każdego z dwóch opisanych powyżej fragmentów PCR. Przeprowadzono reakcję PCR, stosując 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-2022 i NOR-1495 i następujący cykl: 95° przez 1 minutę, 50° przez 2 minuty i 72° przez 3 minuty. Po 22 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72° utrzymywano przez 10 miart.
Powstały fragment 687 bp oczyszczono przez elektroforezę na 1% żelu agarozowym i poddano strawieniu przez EcoRI i XbaI. Powstały fragment 412 bp związano za pomocą ligazy z fragmentem 9,5 kb NcoI-XbaI z pMT636 oraz z fragmentem 1,4 kb Ncol-EcoRI z pMT636. Plazmid pMT-636 opisany jest w przykładzie 1.
Mieszaninę wytworzoną z użyciem ligazy zastosowano do transformacji kompetentnego szczepu E. coli (r, m+), selekcjonując pod kątem oporności na ampicylinę. Sekwencjonowanie DNA wykazało, że plazmidy z powstałych kolonii zawierały prawidłową sekwencję DNA dla TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T19I], wbudowaną w syntetyczny drożdżowy gen stanowiący lider sygnału.
Wybrano jeden plazmid pKFN-1798 do dalszego zastosowania. Sekwencję DNA fragmentu 412 bp EcoRI-XbaI z pKFN-1798 przedstawiono w SEQ ID Nr 13.
W szczepie drożdży MT663 stransformowano plazmid pKFN-1798, jak to opisano w przykładzie 1, w wyniku czego otrzymano szczep drożdży KFN-1811.
Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1811 w pożywce YPD, analizę pod kątem TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T19I] w nadsączu i oczyszczenie wykonano według opisu z przykładu 1.
Przykład 3. Hamowanie proteinaz serynowych przez TFPI (domena II) KFN 1593.
Oczyszczono KFN 1593 z pożywki hodowlanej drożdży, jak to opisano w przykładzie 1. Stężenie KFN 1593 określono używając 1% E280nm=8,3 i Mw=6500. Trypsyna świńska pochodziła z firmy Novo Nordisk (Bagsvaerd, Dania), chymotrypsyna bydlęca (poddana obróbce TLCK) i świńska kalikreina trzustkowa pochodziły z firmy Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, USA), a ludzka plazmina i ludzka kalikreina osoczowa pochodziły z firmy Kabi (Sztokholm, Szwecja).
Ludzką neutrofilową elastazę i katepsynę G oczyszczono z wyciągów z PMN według metody opisanej przez Baugh i Travis (Biochemistry 15 (1976), 836-843). Substraty nitroanillidu peptydylowego S2251, S2586, S2266, S2302 pochodziły z firmy Kabi (Sztokholm, Szwecja). M4765 i S7388 pochodziły z firmy Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, USA), a FX-a - z firmy NycoMed (Oslo, Norwegia).
Proteinazy serynowe inkubowano z różnymi stężeniami KFN-1593 przez 30 minut. Następnie dodano substraty i zmierzono w 405 nm resztkową aktywność proteinazową. Wyniki przedstawiono na Fig. 2 i Fig. 3.
Niemodyfikowana domena II typu Kunitz TFPI (KFN 1593) jest inhibitorem trypsyny (K1 = 5 x 10‘9m) i czynnika X (Ki=150 nM). KFN 1593 wykazuje umiarkowane hamowanie plazminy i elastazy neutrofilowej, podczas gdy w zasadzie nie stwierdza się hamowania katepsyny G i kalikrein.
T a b e l a 1
Aminokwas TFPI-2 Aminokwas TFPI-2
Teoret. Wykryto Teoret. Wykryto
Ala 0 0,31 Leu 3 3,04
Cys 6 5,14 Met 1 0,82
Asx 9 8,94 Pro 2 2,08
Glx 9 9,25 Arg 3 2,86
Phe 5 4,89 Ser 0 0,17
Gly 6 6,01 Thr 3 2,92
His 0 0,13 Val 0 0,16
Ile 3 2,82 Trp 0 -
Lys 4 4,12 Tyr 4 3,75
W sumie 58 57,41
Przykład 4. Wytwarzanie TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T19I, L39R] ze szczepu drożdży KFN-1867.
175 422
W dwóch reakcjach PCR zastosowano jako matrycę 0,1 gg fragment 1,3 kb SphI-BamHI, kodującego TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T19I] z plazmidu pKNF-1798. Do pierwszej reakcji PCR użyto 100 pmole każej z sekwencji inicjujących (primerów) NOR-2022 (GGAGTTTAGTGAACTTGC) i M-462 (CCAGTGTCTCAAAATTGTTCATATTGCCCCTGCATCCACC). Do drugiej reakcji PCR użyto 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-1495 (TAAGTGGCTCAGAATGA) i M-461 (GGTGGATGCAGGGGCAATATGAACAATTTTGAGACACTGG). NOR-2022 stanowi sekwencję inicjującą w pozycji 94 bp za miejscem SphI. M-462 jest komplementarny do pozycji 341 do 380 sekwencji DNA TFPI-2, SEQ ID Nr 11, z wyjątkiem dwóch niekomplementarnych zasad. NOR-1495 stanowi sekwencję inicjującą w pozycji 561 bp przed miejscem BamHI. M-461 jest komplementarny do M-462.
Przeprowadzono reakcję PCR w objętości 100 gl, używając zestawu handlowego (GeneAmp, Perkin Elmer Cetus) i stosując następujący cykl: 95° przez 1 minutę; 50° przez 1 minutę i 72° przez 2 minuty. Po 24 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72° utrzymywano przez 10 minut. Produkt PCR, fragment 518 bp z pierwszej PCR i fragment 209 bp z drugiej, wyizolowano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym. Zmieszano po około 0,1 gg każdego z dwóch opisanych powyżej fragmentów PCR. Przeprowadzono reakcję PCR, stosując 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-2022 i NOR-1495i następujący cykl: 95° przez 1 minutę, 50° przez 2 minuty i 72° przez 3 minuty. Po 22 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72° utrzymywano przez 10 minut.
Powstały fragment 687 bp oczyszczono przez elektroforezę na 1% żelu agarozowym i poddano strawieniu przez EcoRI i XbaI Powstały fragment 412 bp związano za pomocą ligazy z fragmentem 9,5 kb NcoI-XbaI z pMT636 oraz z fragmentem 1,4 kb Ncol-EcoRI z pMT636. Plazmid pMT-636 opisany jest w przykładzie 1.
Mieszaninę wytworzoną z użyciem ligazy zastosowano do transformacji kompetentnego szczepu E. coli (r, m+), selekcjonując pod kątem oporności na ampicylinę. Sekwencjonowanie DNA wykazało, że plazmidy z powstałych kolonii zawierały prawidłową sekwencję DNA dla TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T191, L39R], wbudowaną w syntetyczny drożdżowy gen stanowiący lider sygnału.
Wybrano jeden plazmid pKFN-1861 do dalszego zastosowania. Sekwencję DNA fragmentu 412 bp EcoRI-XbaI z pKFN-1861 przedstawiono w SEQ ID Nr 15.
W szczepie drożdży MT663 stransformowano plazmid pKFN-1861, jak to opisano w przykładzie 1, w wyniku czego otrzymano szczep drożdży KFN-1867.
Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1867 w pożywce YPD, analizę pod kątem TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T19I, L39R] w nadsączu i oczyszczenie wykonano według opisu z przykładu 1.
Przykładni. Wytwarzanie TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, Tl 91, L39R, E46K] ze szczepu drożdży KFN-1868.
W dwóch reakcjach PCR zastosowano jako matrycę 0,1 gg fragment 1,3 kb SphI-BamHI, kodującego TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T19I] z plazmidu pKNF-1798. Do pierwszej reakcji PCR użyto 100 pmole każej z sekwencji inicjujących (primerów) NOR-2022 (GGAGTTTAGTGAACTTGC) i M-464 (CCAGTGTCTTAAAATTGTTCATATTGCCCCTGCATCCACC). Do drugiej reakcji PCR użyto 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-1495 (TAAGTGGCTCAGAATGA) i M-463 (GGTGGATGCAGGGGCAATATGAACAATTTTAAGACACTGG). NOR-2022 stanowi sekwencję inicjującą w pozycji 94 bp za miejscem SphI. M-464 jest komplementarny do pozycji 341 do 380 sekwencji DNA TFPI-2, SEQ ID Nr 11, z wyjątkiem trzech niekomplementarnych zasad. NOR-1495 stanowi sekwencję inicjującą w pozycji 561 bp przed miejscem BamHI. M-463 jest komplementarny do M-464.
Przeprowadzono reakcję PCR w objętości 100 gl, używając zestawu handlowego (GeneAmp, Perkin Elmer Cetus) i stosując następujący cykl: 95° przez 1 minutę, 50° przez 1 minutę i 72° przez 2 minuty. Po 24 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72° utrzymywano przez 10 minut. Produkt PCR, fragment 518 bp z pierwszej PCR i fragment 209 bp z drugiej, wyizolowano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym. Zmieszano po około 0,1 gg każdego z dwóch opisanych powyżej fragmentów PCR. Przeprowadzono reakcję PCR, stosując 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-2022 i NOR-1495 i następujący cykl: 95° przez
175 422 minutę, 50° przez 2 minuty i 72° przez 3 minuty. Po 22 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72° utrzymywano przez 10 minut.
Powstały fragment 687 bp oczyszczono przez elektroforezę na 1% żelu agarozowym i poddano strawieniu przez EcoRI i XbaI. Powstały fragment 412 bp związano za pomocą ligazy z fragmentem 9,5 kb NcoI-XbaI z pMT636 oraz z fragmentem 1,4 kb Ncol-EcoRI z pMT636. Plazmid pMT-636 opisany jest w przykładzie 1.
Mieszaninę wytworzoną z użyciem ligazy zastosowano do transformacji kompetentnego szczepu E. coli (r', m+), selekcjonując pod kątem oporności na ampicylinę. Sekwencjonowanie DNA wykazało, że plazmidy z powstałych kolonii zawierały prawidłową sekwencję DNA dla TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T191, L39R, E46K], wbudowaną w syntetyczny drożdżowy gen stanowiący lider sygnału.
Wybrano jeden plazmid pKFN-1862 do dalszego zastosowania. Sekwencję DNA fragmentu 412 bp EcoRI-XbaI z pKFN-1862 przedstawiono w SEQ ID Nr 17.
W szczepie drożdży MT663 stransformowano plazmid pKFN-1798, jak to opisano w przykładzie 1, w wyniku czego otrzymano szczep drożdży KFN-1868.
Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1868 w pożywce YPD, analizę pod kątem TFPI-2-[R15K, G16A, Y17R, T19I, L39R, E46K] w nadsączu i oczyszczenie wykonano według opisu z przykładu 1.
Przykład 6. Mutacja wielokrotna TFPI-2 w pozycjach 15 i 16.
W dwóch reakcjach PCR zastosowano jako matrycę 0,1 pg fragment 1,3 kb SphI-BamHI, kodującego TFPI-2 z plazmidu pKFN-1605. Do pierwszej reakcji PCR użyto 100 pmole każej z sekwencji inicjujących (primerów) NOR-2022 (GGAGTTTAGTGAACTTGC) i M-749 (AATACCTGGTAATATAA(C/G)C(C/G)A(A/C)ACATATTCCAGGATC). Do drugiej reakcji PCR użyto 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-1495 (TAAGTGGCTCAGAATGA) i M-750 (GATCCTGGAATATGT(T/G)T(C/G)G(C/G)TTATATTACCAGGTATT) NOR-2022 stanowi sekwencję inicjującą w pozycji 94 bp za miejscem SphI. M-749 jest komplementarny do pozycji 263 do 299 sekwencji DNA TFPI-2, SEQ ID Nr 11, z wyjątkiem czterech niekomplementamych zasad. NOR-1495 stanowi sekwencję inicjującą w pozycji 561 bp przed miejscem BamHI. M-750 jest komplementarny do M-749.
Przeprowadzono reakcję PCR w objętości 100 pl, używając zestawu handlowego (GeneAmp, Perkin Elmer Cetus) i stosując następujący cykl: 95° przez 1 minutę, 50° przez 1 minutę i 72° przez 2 minuty. Po 24 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72° utrzymywano przez 10 minut. Produkt PCR, fragment 439 bp z pierwszej PCR i fragment 285 bp z drugiej, wyizolowano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym. Zmieszano po około 0,1 pg każdego z dwóch opisanych powyżej fragmentów PCR. Przeprowadzono reakcję PCR, stosując 100 pmole każdej z sekwencji inicjujących NOR-2022 i NOR-1495 i następujący cykl: 95° przez 1 minutę, 50° przez 2 minuty i 72° przez 3 minuty. Po 22 cyklach przeprowadzono cykl końcowy, w którym etap 72° utrzymywano przez 10 minut.
Powstały fragment 687 bp oczyszczono przez elektroforezę na 1% żelu agarozowym i poddano strawieniu przez EcoRI i XbaI. Powstały fragment 412 bp związano za pomocą ligazy z fragmentem 2,8 kb NcoI-XbaI z plazmidu pTZ19R (Mead, D. A., Szczesna-Skopura, E. i Kemper, B., Prot. Engin. 1 (1986) 67-74).
Mieszaninę wytworzoną z użyciem ligazy zastosowano do transformacji kompetentnego szczepu E. coli (r', m+), selekcjonując pod kątem oporności na ampicylinę. Sekwencjonując DNA zidentyfikowano następujące sześć plazmidów kodujących wskazane analogi TFPI wbudowane w syntetyczny drożdżowy gen stanowiący lider sygnału.
175 422
Plazmid Analog
pKFN-1885 TFPI-2-[R15F]
pKFN-1883 TFPI-2-[R15F, G16A]
pKFN-1905 TFPI-2-[R15L]
pKFN-1882 TFPI-2-[R15L, G16A]
pKFN-1887 TFPI-2-[R15V]
pKFN-1886 TFPI-2-[R15V, G16A]
Fragmentów 412 bp RcoRI-XbaI z tych plazmidów użyto do wytworzenia plazmidów ekspresyjnych, jak to opisano w przykładzie I.
Transformacja szczepu drożdży MT-663, opisana w przykładzie 1, dała w wyniku następujące szczepy drożdży:
Szczep drożdży Analog
KFN-1896 KFN-1894 KFN-1928 KFN-1893 KFN-1898 KFN-1897 TFPI-2-[R15F] TFPI-2-[R15F, G16A] TFPI-2-[R15L] TFPI-2-[R15L, G16A] TFPI-2-[R15V] TFPI-2-[R15V, G16A]
Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1811 w pożywce YPD, analizę pod kątem analogów TFPI-2 w nadsączu i oczyszczenie wykonano według opisu z przykładu 1.
Przykład 8. Hamowanie proteinaz serynowych przez TFPI (domena II) KFN 1811, 1867 i 1868.
Z pożywki hodowli drożdży oczyszczono trzy warianty TFPI (domena II). Ich stężenia określono według absorbancji w 214 nm przy zastosowaniu BTPI jako standardu. Końcowe stężenie określono przez miareczkowanie trypsyną. Trypsynę ludzką i ludzkie białka rekombinacyjne, czynnik VIIa, aktywowane białko C (ACP) i tPA uzyskano z firmy Novo Nordisk A/S (Bagvaerd, Dania), podobnie jak ludzką trombinę. Bydlęcą chymotrypsynę i kalikreinę gruczołową uzyskano z firmy Siga Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Niepełny ludzki tkankowy czynnik rekombinacyjny otrzymano z firmy Corvas (San Diego, Kalifornia, USA). Ludzką neutrofilową katepsynę G oczyszczono z wyciągów PMN według metody opisanej przez Baugh i Travis (Biochemistry 15 (1976), 836-843). Ludzka plazmina pochodziła z firmy Kabi (Sztokholm, Szwecja), uPA pochodziła z firmy Serono (Mediolan, Włochy), ludzki czynnik Xa był darem od dr. W Kisiel (Albuquereque, stan Nowy Meksyk, USA), a ludzka kalikreina osoczowa była darem od dr. I. Schousboe (Kopenhaga, Dania).
Substraty nitroanilidu peptydylowego S2251, S2302, S2266, S2586, S2288, S2444, S2366 i S2238 pochodziły z firmy Kabi (Sztokholm, Szwecja). S7388 i M4765 pochodziły z firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), a czynnik Xa-1 pochodził z firmy Nycomed (Oslo, Norwegia).
Proteinazy serynowe inkubowano z różnymi stężeniami wariantu domeny Kunitz przez 30 minut. Następnie dodano substrat (0,6 mM) i zmierzono resztkową aktywność proteinazową w 405 nm. Wyniki przedstawiono w tabeli 1. Te trzy warianty stanowią silne swoiste inhibitory plazminy, nie powodując jednocześnie znaczącego hamowania innych testowanych proteinaz osoczowych.
Tabela 1
Enzym Stężenie enzymu Substrat Składowa K1 (nM)
KFN 1811 KFN1867 KFN 1868
1 2 3 4 5 6
Trypsyną 10 nM S2251 <<1 <<1 <<1
175 422 cd. tabeli 1
1 2 3 4 5 6
Plazmina 4nM S2251 3 3 3
Elastaza neutrof. 10 nM M4765 n.i. n.i. n.i.
Neutr. katepsyna G 50 nM S7388 n i n.i. n.i.
Kalikreina osocz. 3nM S2302 >100 >100 >100
Kalikreina grucz. 1 U/ml S2266 >100 >100 >100
Chymotrypsyna 2,5 nM S2586 10 20 20
tPA 10 nM S2288 n i. n.i. n.i.
Czynnik VIIa/TF 10 nM/15 nM FXa-1 n.i. n.i. n.i.
Czynnik Xa 3nM FXa-1 n.i. n.i. n.i.
uPA 5nM S2444 n.i. n.i. n.i.
APC 5nM S2366 n.i. n.i. n.i.
Trombina 3 NIHu/ml S2238 n.i. n.i. n.i.
Przykład 9. Hamowanie proteinaz serynowych przez TFPI (domena II) KFN 1893, 1897, 1898 i 1928.
Z pożywki hodowli drożdży oczyszczono cztery warianty TFPI (domena II). Ich stężenia określono według absorbancji w 214 nm przy zastosowaniu BTPI jako standardu. Trypsynę świńską uzyskano z firmy Novo Nordisk A/S (Bagvaerd, Dania), chymotrypsynę bydlęcą (poddaną obróbce TLCK) uzyskano z firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Niepełny ludzki tkankowy czynnik rekombinacyjny uzyskano z firmy Corvas (San Diego, Kalifornia, USA). Ludzką plazminę uzyskano z firmy Kabi (Sztokholm, Szwecja). Ludzką neutrofilową katepsynę G i elastazę oczyszczono z wyciągów PMN według metody opisanej przez Baugh i Travis (Biochemistry 15 (1976), 836-843). Substraty nitroanilidu peptydylowego S2251, S2586 pochodziły z firmy Kabi (Sztokholm, Szwecja). S7388 i M4765 pochodziły z firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Proteinazy serynowe inkubowano z różnymi stężeniami wariantu domeny Kunitz przez 30 minut. Następnie dodano substrat (0,6 mM) i zmierzono resztkową aktywność proteinazową w 405 nm. Wyniki przedstawiono w tabeli 2. Stwierdzono, że te cztery warianty domeny II Kunitz TFPI (KFN 1893, 1897, 1898, 1928) stanowią silne inhibitory elastazy neutrofilowej.
Tabela 2
Enzym Stężenie enzymu Substrat Składowa K1 (nM)
KFN 1893 KFN 1897 KFN 1898 KFN 1928
Trypsyna 10 nM S2251 n.i. n.i. n.i. n i
Chymotrypsyna 2,5 nM S2568 <5 w.i. w.i. <5
Elastaza neutrof. 4nM M4765 0,23 0,46 0,35 2,2
Neutr. katapsyna G 50 nM S7388 n.i. n.i. n.i. n.i.
Plazmina 4nM S2251 n.i. n.i n.i. n.i
n.i. - brak hamowania w stęż. <1 pM; w.i. słabe hamowanie w 100 nM
1^^422
WYDRUK SEKWENCJI.
(1) INFORMACJA OGÓLNA:
(i) ZGŁASZAJĄCY:
(A) NAZWA: Novo Nordisk A/S (B) ULICA: Novo Alle (C) MIASTO: BagsvaerO (E) KRAJ: Dania (F) KOD POCZTOWY: DK-2880 (G) TELEFON: +45 4444 8888 (H) TELEFAKS: +45 4449 3256 (I) TELEKS: 37304 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Wnriaat inhibitora pzoteno ludzkich typu Kunitz.
(iii) LICZBA SEKWENCJI: 18 (iv) POSTAĆ CZYTELNA DLA KOMPUTERA:
(a) TYP NOŚNIKA: dysk elastyczny (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, wersja #1.25 (EPO) (2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 57 nmiaokwasón (B) TYP: aminokwasowo (C) TOPOLOGIA: liaenzęa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (iv) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(a) ORGANIZM:: syntetyczna (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 1:
Xaa Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Xan Gly Xaa Cys Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Tyr Asn Asn IBln Trn (_sn Gln Cys Glu Arg Phe
20 25 30
Xaa Tyr Gly Gly Cys Xaa Xaa Xan Men Asn ssn Phe Xaa Thr Leu Glu
35 40 45
Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Xaa
50 55
(2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 57 amiaoknasón (B) TYP: aminokwasoną (C) TOPOLOGIA:
(ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(a) ORGANIZM: syntetyczna (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 2:
Xaa As p P iFFh Cys Phe snu Ple G1l hnp Xau Gly una Cyp Xaa ana Xay
1 5 10 11
Xaa Xaa X aa nyr phT rnr Phe XaT rin Xan Lys ann Cys Glu ang F'Xs
20 25 30
Xaa TyT r g G ly Cys Xna Caa Xaa Xnt Aaa Asn ane Xea Thr Siu Gln
35 40 45
Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Xaa
50 55
175 422 (2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 58 aminokwasów (B) TYP: aminokwasową (C) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(A) ORGANIZM: syntetyczna (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 3:
Lys Fro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro 10 Gly Ile Cys Lys 15 Ala
1 5
Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin hrr Lys Gin Cyr Glu Arg
20 25 30
Phe Lys Tyr Gly Gly £ys Leu Gly Asn Met Asr Asn Phe {51u Thr Leu
35 40 455
Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly
50 55
(2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 4: (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 58 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(A) ORGANIZM: syntetyczna (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 4:
Lys 1 Pro Aas Phe Cys phe Lur Glu SR Apr Pro Gly Ile Cys Lys 15 Ala
5 1 0
Arg Ile TTr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gln Cys Glu Aa·
20 25 30
Phe Lys Tt/ Gly Gly Ccy Arg Gly Asr Met Asn Asn Phe Lys Thr Llu
35 400 4-5
Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly
50 55
(2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 58 aminokwasów (B) TYP: aminokwasową (C) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(A) ORGANIZM: syntetyczna (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 5:
LYs 1 Pro Alp Phe Cys PPih Leu Glu (Hu Asp Pro Gly lir Cys Lys 15 Ala
5 10
Arg Ile TTr Arg T'/r PPh Tyr Asn Asi Gln Thr Lys Gir Cys Glu a ir
20 25 30
Phe Lys Tym Gly Gir Ccs Arg Gly sm Met Asn Asn Pim Lys Thr Llu
35 40 45
Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly
50 55
177 542 (2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ED NR 6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 58 aminokwasów (B) TYP: aminokwasową (C) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(A) ORGANIZM: syntetyczna (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 6:
Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Pro Cys Lys Ala
1 5 10 15
Arg Ile Ile Arg 20 Tyr Phe Tyr Asn Asn 25 Gln Thr Lys Gln Cys 30 Glu Arg
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu
35 40 45
Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly
50 55
(2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ EDNR 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 495 par zasad (B) TYP: kwasu nukleinowego (C) SKRĘT: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iv) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 365 538 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 7:
GGATCCGAAT TCCACCATGA AGAAAGTACA TGCACTTTGG GCTTCTGTAT GCCTGCTGCT 60
TAATCTTGCC CCTGCCCCTC TTAATGCTGA TTCTGAGGAA GATGAAGAAC ACACAATTAT 120
CACAGATACG GAGTTGCCAC CACTGAAACT TATGCATTCA TTTTGTGCAT TCAA6GCGGA 180
TGATGGCCCA TGTAAAGCAA TCATGAAAAG ATTTTTCTTC AATATTTTCA CTCGACAGTG 240
CGAAGAAATT ATATATGGGG GATGTGAAGG AAATCAGAAT CGATTTGAAA GTCTGGAAGA 300
GTSCAAAAAA ATGTG rACAA GAGATAATGC AAACAGGAAT ATAAAGACAA CATTGCAACA 360
AGAA AAG CCA GAT TTC TGC TTT TTG GAA GAA GAT CCT GGA ATA TGT CGA 409
Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg
1 5 10 15
GGT TAT ATT ACC AGG TAT TTT TAT AAC AAT CAG ACA AAA CAG TGT GAA 457
Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu
20 25 30
CGT TTC AAG TAT GGT GGA TGC CTG GGC AAT ATG AAC AAT TTT GAG ACA 505
Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr
35 40 45
175 422
CTG GAA GAA TGC AAG AAC ATT TGT GAA GAT GGT CCGAATGGTT TCCAGGTGGA 553 Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly
55
TAATTATGGA ACCCAGCTCA ATGCTGTGAA TAACTCCCTG ACTCCGCAAT CAACCAA6GT 613
TCCCAGCCTT TTTGAATTTC ACGGTCCCTC ATGGTGTCTC ACTCCAGCAG ACAGAGGATT 678
GTGTCGTGCC AAT6AGAACA GATTCTACTA CAATTCAGTC ATTGGGAAAT GCCGCCCATT 733
TAAG fACAGT GGATGT6GGG GAAATGAAAA CAATTTTACT TCCAAACAAG AATGTCTGAG 79S
GGCATGTAAA AAAGGTTTCA TCCAAAGAAT ATCAAAAGGA GGCCTAATTA AAACCAAAAG 853
AAAAAGAAAG AAGCAGAGAG TGAAAATAGC ATATGAA6AG ATCTTTGTTA AAAATATTGT 918
AATTTGTTAT AGCAATGTAA CTCTAGA 945
(2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 58 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 8:
Lys 1 Pro Asp Phe Cys 5 Phe Leu Glu Glu Asp 10 Pro Gly Ile Cys Arg 15 Gly
Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg
20 25 30
Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu
35 40 45
G’ .i Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly
50 55
(2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 235 par zasad (B) TYP: kwasu nukleinowego (C) SKRĘT: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(A) ORGANIZM: syntetyczna (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 77..235 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 9:
GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT 60
ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT SC UT TTG GTT TTG TCC TTG ATC Met Lys Ala Val Phe Leu Vel Leu Ser Leu Ile 1 5 10
109
175 422
GGA Gly TTC Phe TGC Cys TGG Trp 15 GCC Ala CAA Gln CCA Pro GTC Val ACT Thr 20 GGC Gly GAT Asp GAA Glu TCA Ser TCT Ser 25 GTT Val GAG Glu
ATT Ile CCG Pro GAA Glu 30 GAG Glu TCT Ser CTG Leu ATC Ile ATC Ile 35 GCT Ala GAA Glu AAC Asn ACC Thr ACT Thr 40 TTG Leu GCT Ala AAC Asn
GTC Vał GCC Ala ATG Met GCT Ala SAG Glu AGA Arg TTG Leu GAG Glu AAG Lys AGA Arg
50 (2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 10 (I) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 53 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 10:
Met 1 Lys Ala Val Phe 5 Leu Val Leu Ser Leu 10 Ile Gly Phe Cys Trp 15 Ala
Gln Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Vał Glu Ile Pro Glu Glu Ser
20 25 30
Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu
35 ao 45
Arg Leu Glu Lys Arg
(2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 11 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 418 par zasad (B) TYP: kwasu nukleinowego (C) SKRĘT: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(A) ORGANIZM: syntetyczna/ludzka (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 77..409 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: peptyd_sig (B) POZYCJA: 77..235 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: peptyd_mat (B) POZYCJA: 236..409 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 11:
6AATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA ABATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT 60
ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG 3CT GTT UC TTS ΘΤΤ TTC TCC TTG ATC Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile -55 -50 -45
109
175 422
GGA Gly TTC Phe TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT Thr GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 157
Cys -40 Trp Ala Gln Pro Val -35 Gly Asp Glu Ser -30 Ser Val Glu
ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 205
Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn
-25 -20 -15
GTC GCC ATG GCT GAG AGA TTG GAS AAG AGA AAG CCA GAT TTC TGC TTT 253
Val Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Lys Pro Asp Phe Cys Phe
-10 -5 1 5
TTG GAA GAA GAT CCT GGA ATA TGT CGA GGT TAT ATT ACC AGG TAT TTT 301
Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe
10 15 20
TAT AAC AAT CAG ACA AAA CAG TGT GAA CGT TTC AAG TAT GGT GGA TGC 349
Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys
25 30 3-5
CTG GGC AAT ATG AAC AAT TTT GAG ACA CTG GAA GAA TGC AAG AAC ATT 397
Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile
40 45 50
TGT GAA GAT GGT TAATCTAGA 413
Cys Glu Asp Gly
55
(2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 111 aminokwasów (B) TYP: aminokwasową (C) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 12:
Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu SSr Lee Ile Gly Phe Cys TTr SU
-53 -50 -45 --O
Gln Pro Oal Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro 61u SGu Ssr
-35 -30 --5
Leu Ile Ili? AU Glu Am Thh STir Leu AU Asn Val Ala Met Ala GU
-20 -15 --0
Arg Leu Glu Lys Arg Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro
-5 1 5 11
Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Trs Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn GU Thr
15 20 25
Lys Gln Cys Glu Agg Phe Lys Tys Gly Gly Cys Leu Gis Asn Met Asn
30 35 40
Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly
50 55
175 422 (2) INFORMACJA ODNOŚNE SEQ ID NR 13 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 418 par zasad (B) TYP: kwasu nukleinowego (c) SKRĘT: pojedyncza (d) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(A) ORGANIZM: syntetyczna (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 77..409 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: peptyd_sig (B) POZYCJA: 77..235 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: peptyd_mat (B) POZYCJA: 236..409 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ IN NR 13:
SAAfTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA ASATTACAAA CTATCAATTT 60
ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GT TTG TCC TTG ATC 109
Met Lys Ala V.a 1 Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile
-53 -50 -45
GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA gtc ACT GGC GGT GAA TTA tct GTT GAG 117
Gly Phe Cys Trp Ala Gln PrO Val Thr Gil- Acp Glu Ser Ser Va1 Glu
-40 -35 -30
ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC ł3b i GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 20^
Ile Pro Glu G lu St^|T Leu Ile lis? Ala. Glu Acn Thr Thr Leu Ala Acn
-25 -20 -15
STC GCC ATG GCT GAG ASA TTG GAS AAG AGA AAG CCA GAT TTC TGC TTT 253
val Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Lys Pro Asp Phe Cys Phe
-10 -5 1 5
TTG GAA GAA GAC CCT GGA ATA TL AAA GCT CGT ATT ATC AGG TAT ttt 301
Leu Glu Glu Asp Pro SI/ łe Cys Eys Ais a Ar Iie Iie Arg Tyr Phe
10 15 20
TAT AAC AAT CAG ACA AAA CAG TGT GAA CGT TTC CCG TAT G^T GGA TGC 349
Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Siu Arg Phe Lys Tlyr -7r Sły Gly Cys
25 30 35
CTG GGC AAT ATG AAC AAT TTT GAG At^A CTG GAA GAA TGC AAG AAC ATT 397
Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Iie
40 45 50
TGT GAA GAT GGT TAATCTAGA 413
Cys Glu Asp Gly
175 422 (2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 14:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 111 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 14:
Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser -45 Leu Ile Gly Phe cys -40 Trp Ala
-53 -50'
Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser
-35 -30 -25
Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu
-20 -15 -10
Arg Leu Glu Lys Arg Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro
-5 1 5 10
Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr
15 20 25
Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys T/r Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn
30 35 40
Asn pHp G1 u τ-ν- Leu 31 u Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly
45 50 55
(2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 418 par zasad (B) TYP: kwasu nukleinowego (C) SKRĘT: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(A) ORGANIZM: syntetyczna (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 77..409 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: peptyd_sig (B) POZYCJA: 77..235 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: peptyd_mat (B) POZYCJA: 236..409 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 15:
GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT
ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC Met Lys Ala Phe Leu Vał Leu Ser Leu Ile -53 -50 -45
109
175 422
GGA TTC Gly Phe TGC Cys -40 fGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG Glu 157
Trp Ala Gln Pro lal -35 Thr Gly Asp Glu Ser -30 Ser lal
ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 205
Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn
-25 -20 -15
GTC GCC ATG GCT GAG AGA TTG GAG AAG AGA AAG CCA GAT TTC TGC TTT 253
lal Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Lys Pro Asp Phe Cys Phe
-10 -5 1 5
TTG GAA GAA GAT CCT GGA ATA TGT AAA GCT CGT ATT ATC AGG TAT TTT 301
Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe
10 15 20
TAT AAC AAT CAG ACA AAA CAG TGT GAA CGT TTC AAG TAT GGT GGA TGC 349
Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys
25 30 35
AGG GGC AAT ATG AAC AAT TTT GAG ACA CTG GAA GAA TGC AAG AAC ATT 397
Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile
45 50
TGT GAA GAT GGT TAATCTAGA 418
Cys Glu Asp Gly (2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 111 aminokwasów (B) TYP: amięokwnsoną (C) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 16:
Met Lys Ala -53 V li -50 His Leu lal Leu ner --5 i .eu Ile Gly Phe Cey --4 irp Ala
Gls Pro Val T Tr Gly Asp Glu Ser Ser lal Glu IUi Pro Glu Glu Ser
-35 -30 --5
Leu Ile Ile Ala Glu Asn TTh Thr LeU Ala Asn Ili Ala Met Ala Glu
-20 -15 -KO
Arg Leu Glu Lys Arg Lys Pro Asp Phe CCy Phe Len Glu Glu Aas Pro
-5 1 5 10
Gly He Cys Lys Ala Arg Hu Ile Arg Tyy Phe Tyn Asn Asn Glu Thr
15 2<0 25
Lys Gln C'/s 6 lu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Agy Gly Asn Met Asn
30 35 40
Asn Phe Glu Thr i Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly
45 50 55
175 422 (2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 17:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(a) DŁUGOŚĆ: 418 par zasad (B) TYP: kwasu nukleinowego (c) SKRĘT: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(A) ORGANIZM: syntetyczna (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 77..409 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: peptyd-sig (B) POZYCJA: 77..235 (ix) CECHA:
(a) NAZWA/KLUCZ: peptyd-mat (B) POZYCJA: 236..409 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 17:
GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT 60
ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC 109
Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile
-5 i3 - c >0 -45
GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 157
Gly Phe Cys Trp Ala Gln Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu
-40 -35 -30
ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 205
Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn
-25 -20 -15
GIC GCC ATG GCT GAG AGA TTG GAG AAG AGA AAG CCA GAT TTC TGC TTT 253
Val Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Lys Pro Asp Phe Cys Phe
-10 -5 1 5
TTG GAA GAA GAT CCT GGA ATA TGT AAA GCT CGT ATT ATC AGG TAT TTT 301
Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe
10 15 20
TAT AAC AAT CAG ACA AAA CAG TGT GAA CGT TTC AAG TAT GGT GGA TGC 349
Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys
25 30 35
AGG GGC AAT ATG AAC AAT ITT AAG ACA CTG GAA GAA TGC AAG AAC ATT 397
Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile
40 45 50
TGT GAA GAT GGT TAATCTAI gA 418
Cys Glu Asp Gly 55 (2) INFORMACJA ODNOŚNIE SEQ ID NR 18:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 111 aminokwasów (B) TYP: aminzkwasowa (C) TOPOLOGIA: linearna (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko
175 422 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ DDNR 18:
Met Lys Ala V al Phe Leu aal Leu Sgm· Leu Ile siy Phe Cys Tt· Ala
-53 -50 -45 -00
Gln Pro Val T Th Asp Glu '□er Sgt aal Glu Ile Pro Glu GGu Ser
-35 -30 --^i5
Leu Ilu Ile Ala Glu Ais TTh Thr Luu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu
-20 -15 --0
Arg Leu Glu Lys Arg Lys Pro Aas Phe Cys Phu Leu GGu GGu Asp Fro
-5 1 5 10
Gly Ilu cys Lys Ala Arg IIe IIe Arg Tys Phi Tyr Asn Asn G R Thr
15 20 25
Lys Gln Cys G Ig Arg Phe Lys T,^r Gly Gly Cys Gly Asn MMt Asn
30 35 40
Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Ccs Glu Asp Gly
50 55
175 422
175 422
TRYPSYNA CHYMOTRYPSYNA
[KFN 1593] (nM) [KFN 1593] (nM)
PLAZMINA CZYNNIK Xa
Fig.
175 422
Kalikreina gruczołowa Kalikreina osoczowa
[KFN 1593] (nM) [KFN 1593] (nM)
Katepsyna G Elastaza neutrofilową
Fig. 3
175 422
EcoRI
— NOR-2523
NOR-2528
PCR
PCR _EcoRI ©-r
PCR
EcoRI v
Xbol rh -*
Xbol
EcoRI +
Fig- 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Claims (34)

1. Sposób wytwarzania wariantu ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz o sekwencji aminokwasowej: X1 Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp X2 Gly X3 Cys X4 X5 X6 X7 X8 X9 Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Xw Tyr Gly Gly Cys Xn Xn X13 Met Asn Asn Phe XM Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp X“ (SEQ ID Nr 1), gdzie X1 oznacza H lub 1-5 reszt naturalnie występujących aminokwasów z wyjątkiem Cys, X2 do Xu każde z osobna oznacza resztę naturalnie występującego aminokwasu z wyjątkiem Cis, a Xw oznacza OH lub 1-5 reszt naturalnie występujących aminokwasów z wyjątkiem Cys, przy czym co najmniej jedna z reszt aminokwasowych X1 do X^ jest różna od odpowiadającej jej reszty aminokwasowej w sekwencji natywnej i przy czym X4 ma znaczenie inne niż Leu, znamienny tym, że hoduje się komórki zawierające DnA obejmującej sekwencję DNA kodującą wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz w warunkach sprzyjających ekspresji białka i odzyskuje się otrzymane białko z hodowli.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X1 oznacza Lys-Pro.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X2 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Ala, Arg, Thr, Asp, Pro, Glu, Lys, Gln, Ser, Ile i Val.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X2 oznacza Thr lub Pro.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X3 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Pro, Thr, Leu, Arg, Val i Ile.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X3 oznacza Pro lub Ile.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X4 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr, Gln, Asn i Ala.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X4 oznacza Lys, Val, Ile, Thr, Met, Gln lub Arg.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X5 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Ala, Gly, Thr, Arg, Phe, Gln i Asp.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X5 oznacza Ala, Thr, Asp lub Gly.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X6 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Arg, Ala, Lys, Leu, Gly, His, Ser, Asp, Gln, Glu, Val, Thr, Tyr, Phe, Asn, Ile i Met.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stosuje DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X6 oznacza Arg, Phe, Ala, Leu lub Tyr.
175 422
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X7 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Ile, Met, Gln, Glu, Thr, Leu, Val i Phe.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X oznacza Ile.
15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X8 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Ile, Thr, Leu, Asn, Lys, Ser, Gln, Glu, Arg, Pro i Phe.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X8 oznacza Ile lub Thr.
17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X9 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Arg, Ser, Ala, Gln, Lys i Leu.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X oznacza Arg.
19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której Xw oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Gln, Pro, Phe, Ile, Lys, Trp, Ala, Thr, Leu, Ser, Tyr, His, Asp, Met, Arg i Val.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X10 oznacza Val lub Lys.
21. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Gly, Met, Gln, Glu, Leu, Arg, Lys, Pro i Asn.
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X oznacza Arg lub Leu.
23. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której Xn oznacza Ala lub Gly.
24. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X^ oznacza resztę aminokwasową dobrana spośród Lys, Asn i Asp.
'
25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X.'3 oznacza Lys lub Asn.
26. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X 14 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Val, Tyr, Asp, Glu, Thr, Gly, Leu, Ser, Ile, Gln, His, Asn, Pro, Phe, Met, Ala, Arg, Trp i Lys.
27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której XM oznacza Lys lub Glu.
28. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X15 oznacza Gly.
29. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej, w której X1 oznacza Lys-Pro, a X^ oznacza Gly.
30. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej: X1 Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp X2 Gly X3 Cys X4 X5 X6 X X8 X9 Tyr Phe Tyr Asn Xfó Gln Xn Lys Gln Cys Glu Arg Phe X™ Tyr Gly Gly Cys Xn X“ XB Met Asn
175 422
Asn Phe X14 Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp X15 (SEQ ID Nr 2), w którym X1 do X15 oznacza reszty aminokwasowe określone w zastrz. 1, X 16 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Gln, Gly, Ala, Ser, Val i Phe, w szczególności Gln lub Ala, a X17 oznacza resztę aminokwasową dobraną spośród Thr i Ala.
31. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej: Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (SeQ ID nr 3).
32. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej: Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (SEQ IDnr 4).
33. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej: Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (SEQ ID nr 5).
34. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako DNA kodujące wariant ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz stosuje się DNA kodujące wariant o sekwencji aminokwasowej: Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (SEQ ID nr 6).
PL93304468A 1992-01-07 1993-01-07 Sposób wytwarzania wariantu ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz PL175422B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK9200001 1992-01-07
PCT/DK1993/000004 WO1993014121A1 (en) 1992-01-07 1993-01-07 A human kunitz-type protease inhibitor variant

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL175422B1 true PL175422B1 (pl) 1998-12-31

Family

ID=8153770

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL93304468A PL175422B1 (pl) 1992-01-07 1993-01-07 Sposób wytwarzania wariantu ludzkiej domeny II inhibitora proteazy typu Kunitz

Country Status (18)

Country Link
US (1) US5576294A (pl)
EP (1) EP0621871B1 (pl)
JP (1) JP3350549B2 (pl)
KR (1) KR100278036B1 (pl)
AT (1) ATE154938T1 (pl)
AU (1) AU676145B2 (pl)
CA (1) CA2127249A1 (pl)
CZ (1) CZ284911B6 (pl)
DE (1) DE69311893T2 (pl)
ES (1) ES2104121T3 (pl)
FI (1) FI943233A0 (pl)
HU (1) HU218104B (pl)
IL (1) IL104325A (pl)
NO (1) NO942550L (pl)
NZ (1) NZ246569A (pl)
PL (1) PL175422B1 (pl)
WO (1) WO1993014121A1 (pl)
ZA (1) ZA9395B (pl)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060134087A1 (en) * 1988-09-02 2006-06-22 Dyax Corp. ITI-D1 Kunitz domain mutants as hNE inhibitors
US5455338A (en) * 1993-11-05 1995-10-03 Zymogenetics, Inc. DNA encoding novel human kunitz-type inhibitors and methods relating thereto
EP0737207B1 (en) 1994-01-11 2004-09-22 Dyax Corporation Inhibitors of human plasmin derived from the kunitz domains
US6057287A (en) 1994-01-11 2000-05-02 Dyax Corp. Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof
CA2180950C (en) * 1994-01-11 2005-03-29 William Markland Kallikrein-inhibiting "kunitz domain" proteins and analogues thereof
US5795954A (en) * 1994-03-04 1998-08-18 Genentech, Inc. Factor VIIa inhibitors from Kunitz domain proteins
US5589359A (en) 1994-08-05 1996-12-31 Chiron Corporation Chimeric proteins
AU707762B2 (en) * 1994-08-05 1999-07-22 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Production of tissue factor pathway inhibitor
US5780265A (en) * 1995-06-05 1998-07-14 Genentech, Inc. Kunitz type plasma kallikrein inhibitors
US5786328A (en) * 1995-06-05 1998-07-28 Genentech, Inc. Use of kunitz type plasma kallikrein inhibitors
US20030199450A1 (en) * 2001-04-27 2003-10-23 Chiron Corporation Regulation of cytokine synthesis and release
US6242414B1 (en) 1995-06-07 2001-06-05 Chiron Corporation Regulation of cytokine synthesis and release
US6346510B1 (en) 1995-10-23 2002-02-12 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions
WO1997033996A2 (en) * 1996-03-11 1997-09-18 Bayer Corporation Human bikunin
US20070140979A1 (en) * 1998-12-22 2007-06-21 Bayer Aktiengesellschaft Method for accelerating the rate of mucociliary clearance
ATE254473T1 (de) * 1998-12-22 2003-12-15 Bayer Ag Verwendung eines serinproteaseinhibitors vom kunitz-typ zur beschleunigung der schleimauflöserate
GB9916913D0 (en) * 1999-07-19 1999-09-22 Natural Enviromental Research Inhibitor proteins
US20040054082A1 (en) * 2001-12-03 2004-03-18 Bank David H Toughened polymer blends with improved surface properties
PT2298278E (pt) 2002-06-07 2016-02-25 Dyax Corp Prevenção e redução da perda de sangue e resposta inflamatória
US7153829B2 (en) 2002-06-07 2006-12-26 Dyax Corp. Kallikrein-inhibitor therapies
WO2004019968A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-11 Dyax Corp. Methods for preserving organs and tissues
PT1587907E (pt) * 2003-01-07 2011-04-08 Dyax Corp Biblioteca de domínios de kunitz
US6989369B2 (en) 2003-02-07 2006-01-24 Dyax Corp. Kunitz domain peptides
CA3050564A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-10 Dyax Corp. Poly-pegylated protease inhibitors
US7235530B2 (en) 2004-09-27 2007-06-26 Dyax Corporation Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof
US7276480B1 (en) 2005-12-30 2007-10-02 Dyax Corp. Prevention and reduction of blood loss
US20070213275A1 (en) * 2006-03-10 2007-09-13 Dyax Corp. Formulations for ecallantide
EP2379096B1 (en) 2008-12-19 2019-10-30 Baxalta GmbH Tfpi inhibitors and methods of use
JP2013516389A (ja) 2009-01-06 2013-05-13 ダイアックス コーポレーション カリクレイン阻害剤による粘膜炎治療
CN101798346B (zh) * 2009-02-06 2013-05-29 复旦大学 一种酵母表达的长效重组人组织因子途径抑制物
ES2905545T3 (es) 2010-01-06 2022-04-11 Takeda Pharmaceuticals Co Proteínas de unión a calicreína plasmática
ES2983470T3 (es) 2010-03-19 2024-10-23 Takeda Pharmaceuticals Co Inhibidores del TFPI y métodos de uso
KR102011156B1 (ko) 2011-01-06 2019-08-16 다이액스 코포레이션 혈장 칼리크레인 결합 단백질
KR101391988B1 (ko) 2011-11-04 2014-05-08 동아대학교 산학협력단 항섬유소용해 기능을 가진 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 염기서열
BR112014022435B1 (pt) 2012-03-21 2023-02-14 Takeda Pharmaceutical Company Limited Inibidores de tfpi e métodos de uso
IL247942B (en) 2014-03-27 2022-09-01 Dyax Corp Compositions and methods for drops in macular edema as a result of diabetes
US11286307B2 (en) 2015-12-11 2022-03-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Plasma kallikrein inhibitors and uses thereof for treating hereditary angioedema attack
AU2021209045A1 (en) 2020-01-13 2022-07-28 Takeda Pharmaceutical Company Limited Plasma kallikrein inhibitors and uses thereof for treating pediatric hereditary angioedema attack

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5106833A (en) * 1987-07-23 1992-04-21 Washington University Coagulation inhibitors
DK408089D0 (da) * 1989-08-18 1989-08-18 Novo Nordisk As Proteiner

Also Published As

Publication number Publication date
DE69311893D1 (de) 1997-08-07
EP0621871A1 (en) 1994-11-02
CZ164994A3 (en) 1994-12-15
JP3350549B2 (ja) 2002-11-25
CZ284911B6 (cs) 1999-04-14
KR940703854A (ko) 1994-12-12
ES2104121T3 (es) 1997-10-01
HU9401991D0 (en) 1994-09-28
HU218104B (hu) 2000-06-28
DE69311893T2 (de) 1998-02-05
IL104325A0 (en) 1993-05-13
ZA9395B (en) 1993-08-20
NO942550D0 (no) 1994-07-06
FI943233A7 (fi) 1994-07-06
HUT70295A (en) 1995-09-28
NO942550L (no) 1994-09-07
NZ246569A (en) 1996-05-28
CA2127249A1 (en) 1993-07-22
EP0621871B1 (en) 1997-07-02
ATE154938T1 (de) 1997-07-15
US5576294A (en) 1996-11-19
FI943233L (fi) 1994-07-06
IL104325A (en) 2000-10-31
AU3345993A (en) 1993-08-03
AU676145B2 (en) 1997-03-06
KR100278036B1 (ko) 2001-01-15
FI943233A0 (fi) 1994-07-06
WO1993014121A1 (en) 1993-07-22
JPH07506335A (ja) 1995-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU676145B2 (en) A human kunitz-type protease inhibitor variant
AU675926B2 (en) A human kunitz-type protease inhibitor variant
AU671611B2 (en) Human kunitz-type protease inhibitor variants
US5618696A (en) Human kunitz-type protease inhibitor and variants thereof
AU675925B2 (en) A human kunitz-type protease inhibitor variant
US5843895A (en) Pharmaceutical administration of ecotin homologs