PL177329B1 - Zrekombinowana sekwencja DNA, wektor obejmujący zrekombinowaną sekwencję DNA, białka otrzymane przez ekspresję zrekombinowanej sekwencji DNA oraz komórka mikroorganizmu lub komórka roślinna lub protoplast stransformowane zrekombinowaną sekwencją DNA - Google Patents
Zrekombinowana sekwencja DNA, wektor obejmujący zrekombinowaną sekwencję DNA, białka otrzymane przez ekspresję zrekombinowanej sekwencji DNA oraz komórka mikroorganizmu lub komórka roślinna lub protoplast stransformowane zrekombinowaną sekwencją DNAInfo
- Publication number
- PL177329B1 PL177329B1 PL94302320A PL30232094A PL177329B1 PL 177329 B1 PL177329 B1 PL 177329B1 PL 94302320 A PL94302320 A PL 94302320A PL 30232094 A PL30232094 A PL 30232094A PL 177329 B1 PL177329 B1 PL 177329B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sequence
- region
- gene
- equivalent
- seq
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 148
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 title description 44
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 title description 5
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 title description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 12
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 51
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 51
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 28
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 14
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 91
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 58
- 230000004044 response Effects 0.000 description 46
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 40
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 39
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 38
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 36
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 35
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 24
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 21
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 21
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 20
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 20
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 19
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 13
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 13
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 13
- 241000589771 Ralstonia solanacearum Species 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 5
- 101150101900 uidA gene Proteins 0.000 description 5
- 101100437498 Escherichia coli (strain K12) uidA gene Proteins 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 4
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 241000588694 Erwinia amylovora Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 3
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 2
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 2
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 2
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid;cyclohexanamine Chemical compound [NH3+]C1CCCCC1.O1C(C([O-])=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 235000011303 Brassica alboglabra Nutrition 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 235000011302 Brassica oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O Chemical compound CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N Chalcone Natural products C=1C=CC=CC=1C(=O)C=CC1=CC=CC=C1 DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N D-ribulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N D-threo-2-Pentulose Natural products OCC(O)C(O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 108700003861 Dominant Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 101150057070 HPR gene Proteins 0.000 description 1
- 101150106864 HR gene Proteins 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 244000070406 Malus silvestris Species 0.000 description 1
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 1
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108700005084 Multigene Family Proteins 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- IHPVFYLOGNNZLA-UHFFFAOYSA-N Phytoalexin Natural products COC1=CC=CC=C1C1OC(C=C2C(OCO2)=C2OC)=C2C(=O)C1 IHPVFYLOGNNZLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 1
- 240000003889 Piper guineense Species 0.000 description 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 240000005809 Prunus persica Species 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101150032520 STR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 description 1
- 101000611441 Solanum lycopersicum Pathogenesis-related leaf protein 6 Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006064 Urena lobata Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 235000021015 bananas Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 235000005513 chalcones Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 description 1
- 238000001446 dark-field microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004665 defense response Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003699 evans blue Drugs 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 101150039191 hrpN gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000013435 necrotic lesion Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000011824 nuclear material Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930015704 phenylpropanoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002995 phenylpropanoid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000280 phytoalexin Substances 0.000 description 1
- 150000001857 phytoalexin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000005080 plant death Effects 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 210000004918 root sheath Anatomy 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009495 transient activation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 235000020138 yakult Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8237—Externally regulated expression systems
- C12N15/8239—Externally regulated expression systems pathogen inducible
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Zrekombinowana sekwencja DNA zawierajaca region obejmujacy sekwencje nukleotydowa przedstawiona w Sek. Id. Nr 1 lub jego funkcjonalny odpowiednik, lub zrekombinowana sekwencja obejmujaca czesc wymienionego regionu lub wymienio- nego odpowiednika, lub sekwencja DNA hybrydyzujaca z sekwencja przedstawiona na Sek. Id. Nr 1. PL PL PL
Description
Wynalazek dotyczy zrekombinowanej sekwencji DNA, DNA wektora obejmującego tę sekwencję, białek otrzymanych przez ekspresję tych sekwencji DNA oraz komórki mikroorganizmu lub komórki roślinnej, lub protoplastu stransformowanych tymi zrekombinowanymi sekwencjami. Zrekombinowana sekwencja DNA należy do rodziny genów hsr (hypersensitivity related genes; geny związane z nadwrażliwością) oraz do poszczególnych składników tej rodziny, włączając w to promotor, regiony regulatorowe i regiony kodujące oraz ich modyfikacje.
Reakcja nadwrażliwości (HR) roślin wyższych to indukowana, lokalna odpowiedź rośliny, związana z chorobową opornością na patogen. Odpowiedź ta charakteryzuje się szybką i zlokalizowaną nekrozą tkanek zaatakowanych patogenem niekompatybilnym (awirulentnym lub spoza zakresu gospodarza danej rośliny), zapobiegającą dalszemu rozprzestrzenianiu się patogenu. Badanych jest kilkanaście genów, których produkty uczestniczą prawdopodobnie w nadwrażliwej odpowiedzi rośliny; obejmują one enzymy związane ze szlakiem fenylopropanoidowym uczestniczącym w syntezie przeciwdrobnoustrojowych fitoaleksyn), enzymów o aktywności hydrolitycznej, związków toksycznych oraz białek ściany komórkowej. W zainfekowanych roślinach geny te ulegają indukcji naokoło obszaru nekrozy, niezwłocznie po jej wystąpieniu, tzn. w późnej fazie reakcji HR. Ponadto większość z nich jest również eksprymowana, z wysoką wydajnością, podczas oddziaływań z patogenami kompatybilnymi, prowadzącymi do wystąpienia choroby, a w przypadku niektórych z nich - również podczas normalnego rozwoju rośliny. Brak specyficzności tych „obronnych” genów, jak również fakt ich aktywacji w późnych fazach odpowiedzi HR, sugeruje, iż same z siebie mogą nie uczestniczyć w powstawaniu kompleksowej odpowiedzi HR, a raczej towarzyszyć tej reakcji. Mechanizm molekularny prowadzący do wzajemnego rozpoznania między patogenem a rośliną do powstania reakcji HR jest, jak dotąd, nieznany. Według hipotezy „gen-za-gen” pierwszy etap rozpoznania między rośliną a patogenem, prowadzący do powstania oporności, obejmuje przypuszczalne oddziaływania między produktami roślinnych genów oporności a odpowiadającymi im awirulentnymi genami patogenu. Badania genetyczne ujawniły, że przebieg wielu oddziaływań między rośliną a patogenem określony jest przez działanie po jednym dominującym genie u obu partnerów. Z odpowiedzią HR związanych jest kilkanaście szybkich zmian fizjologicznych, takich jak ucieczka elektrolitów, zmiany tempa procesów oddechowych oraz niedawno odkryte zjawisko oksydatywnego wzajemnego łączenia się białek ściany komórkowej. Jednakże w żadnym z tych przypadków nie znaleziono genów, których aktywacja występuje specyficznie lub chociaż jest zwiększona w czasie powstawania odporności i towarzyszy rozwojowi reakcji HR.
Wiadomo, że bakteria infekująca wiązki przewodzące roślin, Pseudomonas solanacearum, powoduje zamieranie roślin różnych gatunków, włączając w to Solanaceae. Wykazano, że w bakterii tej zespół genów powodujących reakcję Hr (hrp) oraz patogenność, kontroluje zarówno zdolność do wywoływania reakcji HR u roślin spoza zakresu gospodarza, jak również powoduje chorobę u roślin wrażliwych. W szczególności, mutanty genowe hrp P. solanacearum tracą zdolność do wywoływania reakcji HR u roślin tytoniu. Ustalono ostatnio, że gen hrpN, należący do zespołu genów hrp patogennej bakterii Erwinia amylovora, koduje białkowy czynnik wywołujący reakcję HR, zwany harpiną. Wyniki te potwierdzają ważną rolę genów hrp w wywoływaniu reakcji HR. Po nasyceniu liści roślin tytoniu niekompatybilnym izolatem indukującym odpowiedź HR, scharakteryzowano sześć różnych rodzin genowych, aktywowanych we wczesnych fazach oddziaływania, jeszcze przed pojawieniem się objawów nekrozy liści. Geny te nie są indukowane po nasyceniu liści izolatem hrp różniącym się poziomem gromadzenia własnych transkryptów podczas oddziaływań kompatybilnych, w przeciwieństwie do niekompatybilnych: gen str (sensitivity-related, związane z wrażliwością) ulegają ekspresji w podobnym stopniu w obu typach oddziaływań, podczas gdy geny hsr aktywowane są w sposób preferencyjny podczas reakcji HR.
Wynalazek dotyczy rodziny genów hsr, reprezentowanej przez gen oznaczany dalej jako hsr203J, którego sekwencja podana jest w Sek. Id. Nr 1. Przypuszczalny produkt białkowy (Sek. Id. Nr 2) tego genu wykazuje niewielkie lub żadne zasadnicze podobieństwa sekwencyjne do znanych białek. Testy wykorzystujące, np. region promotorowy strukturalnego genu hsr203J przyłączonego do genu reporterowego, zarówno w teście przejściowej ekspresji, jak w roślinach transgenicznych, wykazały że ekspresja genu hsr203J jest ściśle związana z rozwojem nadwrażliwości: promotor jest w specyficzny sposób aktywowany w czasie reakcji HR, kilkanaście godzin przed wystąpieniem nekrozy, a ekspresja jest ograniczona do komórek zaszczepionym izolatem niekompatybilnych bakterii.
Zgodnie z wynalazkiem, dostarcza się zrekombinowanych sekwencji DNA, włączając w to region obejmujący sekwencję nukleotydową przedstawioną w Sek. Id. Nr 1 lub jej funkcjonalny odpowiednik, lub zrekombinowaną sekwencję obejmującą część wymienionego regionu lub jej odpowiednik.
Termin „funkcjonalny odpowiednik” używany w odniesieniu do białka kodowanego przez region w sekwencji DNA, oznacza region ten, w którym jeden lub więcej kodonów zostało zastąpionych kodonami równoważnymi, tzn. kodującymi ten sam aminokwas lub odpowiadający terminator.
Termin „funkcjonalny odpowiednik” używany w odniesieniu do transkrypcyjnych odcinków regulatorowych danej sekwencji, oznacza wymieniony odcinek, w którym jeden lub więcej nukleotydów zostało zastąpionych innymi nukleotydami i/lub odcinek, w którym jeden lub więcej nukleotydów zostało dodanych lub usuniętych z zastrzeżeniem, że wytworzony odpowiednik zachowuje zdolność do regulowania transkrypcji i wykazuje zasadnicze podobieństwo sekwencyjne do odcinka lub jego części, położonego w kierunku 5' od wyżej wymienionego regionu kodującego białko.
Termin „zasadnicze podobieństwo sekwencyjne” odnosi się do sekwencji DNA hybrydyzującej z sekwencją odniesienia, w konwencjonalnych warunkach hybrydyzacji. Wskazane by hybrydyzacja następowała w warunkach, w których wartość Tm wahała się między 35 a 45°C. Bardziej wskazane by termin „znaczące podobieństwo sekwencyjne” odnosił się do sekwencji hybrydyzującej z sekwencją referencyjną w warunkach „ścisłych” (tak, jak je zdefiniowano poniżej).
177 329
Termin „sekwencja regulatorowa” odnosi się do odcinka nukleotydowego w obrębie sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr 1, który położony jest w kierunku 5' od regionu kodującego genu. Region regulatorowy obejmuje więc promotor genu hsr203J i funkcjonalne składniki promotora, wpływające na transkrypcję. Takie funkcjonalne składniki obejmują „promotor delecyjny” oraz „wyciszacze” i „wzmacniacze” transkrypcji.
„Promotor delecyjny” w kontekście wynalazku jest dowolnym promotorem pochodzącym z genu hsr203J, który posiada delecję, w stosunku do sekwencji naturalnego promotora, i który nadal zachowuje aktywność promotora. Aktywność taka może być zwiększona lub zasadniczo taka sama, w porównaniu z promotorem pierwotnym. Specjaliści znają sposób badania aktywności takich promotorów delecyjnych. Promotory delecyjne według wynalazku są promotorami indukowalnymi, m.in. patogenami roślinnymi, i znajdują zastosowanie w konstruktach obejmujących geny strukturalne, wykorzystywane do ulepszenia oporności roślin.
Termin „funkcjonalny odpowiednik” używany jest w odniesieniu do białka, którego sekwencja kodowana przez, co najmniej część sekwencji DNA przedstawionej w Sek. Id. Nr 1, wtedy termin ten oznacza białko posiadające podobną funkcję i podobną lub ulepszoną aktywność oraz podobną sekwencję aminokwasową. Wynalazek obejmuje czyste białka o sekwencji aminokwasowej, co najmniej w 60% podobnej do sekwencji lub części (patrz niżej) sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr 2. Wskazane jest by stopień podobieństwa wynosił co najmniej 60%, bardziej wskazane jest by wynosił co najmniej 70%, a zwłaszcza wskazane jest by stopień podobieństwa wynosił co najmniej 80%.
W kontekście wynalazku dwie sekwencje aminokwasowe o wzajemnym podobieństwie sekwencyjnym, co najmniej 60% definiuje się jako posiadające, co najmniej 70% identycznych lub podobnych reszt aminokwasowych w tych samych pozycjach, gdy obie sekwencje są zestawione w najbardziej odpowiadający sobie sposób, zakładając możliwość do 4 delecji i do 10 addycji. Dla celów wynalazku przyjmuje się, że:
- alanina, seryna i treonina są podobne,
- kwas glutaminowy i kwas asparaginowy są podobne,
- asparagina i glutamina są podobne,
- arginina i lizyna są podobne,
- izoleucyna, leucyna, metionina i walina są podobne,
- fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan są podobne.
Termin „część” używamy w odniesieniu do sekwencji białka, oznacza peptyd obejmujący sekwencję przedstawioną w Sek. Id. Nr 2, i posiadającą co najmniej 5 aminokwasów. Bardziej wskazane jest, by część ta obejmowała 20 aminokwasów, a zwłaszcza wskazane jest, by peptyd miał co najmniej 40 aminokwasów.
Termin „część” używany w odniesieniu do sekwencji nukleotydowej oznacza sekwencję nukleotydową obejmującą sekwencję przedstawioną w Sek. Id. Nr 1, i mającą co najmniej 15 nukleotydów. Bardziej wskazane jest by część ta miała 25 nukleotydów, a zwłaszcza wskazane by miała 40 nukleotydów.
Wynalazek obejmuje również zrekombinowaną sekwencję DNA, włączając w to region zawierający się między nukleotydami 1413 a 2417, sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr 1, lub jej funkcjonalny odpowiednik lub zrekombinowaną sekwencję obejmującą część wymienionego regionu lub jego odpowiednika. Nukleotydy 1413-2417 odpowiadają regionowi kodującemu białko, genu hsr203J, którego użyteczność polega na tym, że produkt tego genu pełni funkcjonalną rolę w regulowaniu lub nadawaniu roślinom oporności na patogen. Tak więc, sekwencja kodująca białko, lub jej część, genu hsr203J może być przyłączona do indukowalnego promotora, takiego jak promotor regulujący aktywność WIN, WUN lub białek PR, tak by ekspresja strukturalnego genu hsr203J była indukowana w czasie infekcji kompatybilnym patogenem. Następująca później aktywacja odpowiedzi HR, powodowana przez białko hsr203J, w zainfekowanych komórkach roślinnych, hamuje dalsze rozprzestrzenianie się patogenu.
Wynalazek obejmuje również zrekombinowaną sekwencję DNA, zawierającą region obejmujący nukleotydy 1-1341 sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr 1, lub jej funkcjonalny odpowiednik, lub zrekombinowaną sekwencję obejmującą część wymienionego regionu, lub
177 329 jej odpowiednika. Nukleotydy od 1 do 1341 odpowiadają nie kodującemu białko regionowi sekwencji położonej w kierunku 5' od wyżej wymienionego regionu kodującego białko. Region wymienionej sekwencji DNA zawierający nukleotydy 1-1341 obejmuje transkrypcyjny region regulacyjny genu hsr203J, włączając w to promotor (miejsce wiązania polimerazy RNA) oraz „wyciszacze” i „wzmacniacze” transkrypcji.
Wyciszacze i wzmacniacze są elementami użytecznymi, jako że umożliwiają modulowanie poziomu ekspresji, znajdujących się pod ich kontrolą, genów strukturalnych.
Wynalazek obejmuje również zrekombinowaną sekwencję DNA, zawierającą region obejmujący nukleotydy 1-651 sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr 1, lub jej funkcjonalny odpowiednik lub zrekombinowaną sekwencję obejmującą część wymienionego regionu lub jej odpowiednika. Region obejmujący nukleotydy 1-651 zawiera wyciszacz transkrypcji.
Wynalazek obejmuje również zrekombinowaną sekwencję DNA, zawierającą region obejmujący nukleotydy 651-1341 sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr 1, lub jej funkcjonalny odpowiednik, lub zrekombinowaną sekwencję obejmującą część wymienionego regionu, lub jej odpowiednika. Region obejmujący nukleotydy 651-1341 zawiera wzmacniacz transkrypcji oraz promotor (tzn. miejsce wiązania polimerazy RNA) genu hsr203J.
Wynalazek dostarcza ponadto sposobu użycia sekwencji promotorowej genu hsr203J, jako sekwencji wiążącej dla identyfikowania i dalszego oczyszczania białek wiążących się z promotorem genu hsr203J (hsr-PBP) oraz białek związanych z hsr-PBP. Białka hsr-PBP zostały częściowo scharakteryzowane i prawdopodobnie są eksprymowane konstytutywnie i mogą wiązać się z sekwencją promotorową genu hsr203J w czasie reakcji HR komórek roślinnych, tak jak ma to miejsce podczas inokulacji hodowli komórek Nicotiana tabacum L. specyficznym szczepem Pseudomonas solanacearum.
Wynalazek obejmuje również zrekombinowaną sekwencję DNA, zawierającą region obejmujący nukleotydy 1195-1341 sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr 1, lub jej funkcjonalny odpowiednik, lub zrekombinowaną sekwencję obejmującą część wymienionego regionu, lub jej odpowiednika. Region obejmujący nukleotydy 1195-1341 zawiera element odpowiedzi bakeryjnej, zdolny do wiązania specyficznych białek produkowanych przez komórki patogenów w czasie infekcji tkanek roślinnych, i jest uwikłany w rozwój reakcji HR (patrz wyżej).
Wynalazek obejmuje również zrekombinowaną sekwencję DNA, zawierającą region obejmujący nukleotydy 1195-1268 sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr 1, lub jej funkcjonalny odpowiednik, lub zrekombinowaną sekwencję obejmującą część wymienionego regionu, lub jej odpowiednika. Region ten w bardziej szczegółowy sposób określa element odpowiedzi bakteryjnej.
Wynalazek obejmuje również zrekombinowaną sekwencję DNA, przedstawioną powyżej, w której wymieniony region, jego część lub jej odpowiednik, położony jest po stronie 5', i jest przyłączony do sekwencji kodującej białko heterologicznego genu, lub sekwencji obejmującej nukleotydy 1413-2417 sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr 1, lub jej funkcjonalnego odpowiednika. Szczególnie wskazane jest by sekwencja wzmacniająca transkrypcję położona była pomiędzy regionem, lub jego odpowiednikiem, a regionem kodującym białko, położonym w stronę 3'.
Gen heterologiczny może być dowolnym, stosowanym genem strukturalnym, włączając w to geny markerowe ułatwiające selekcję lub przeszukiwanie bibliotek genowych lub genem, którego produkt nadaje tolerancję lub odporność na co najmniej jeden czynnik z wymienionej listy: owady, herbicydy, grzyby, bakterie, wirusy; gen markerowy użyteczny w przewidywaniu rozprzestrzeniania się choroby i geny uniemożliwiające owadom odżywianie się zawierającymi je roślinami.
Promotor i/lub regiony regulatorowe genu hsr203J mogą być przyłączone do genu strukturalnego kodującego nie dyfundujące, cytotoksyczne produkty białkowe, takie jak rybonukleazy, proteazy, lipazy lub glukanazy. Indukcja ekspresji takich genów umożliwia szybką i ograniczoną przestrzennie odpowiedź na infekcję patogenami i może być użyteczna w dostarczaniu oporności lub ulepszaniu tolerancji roślin wobec patogenu.
177 329
Ponadto sekwencje regulatorowe genu hsr203J mogą być pomocne w tworzeniu roślin „detektorowych”, pozwalających na wczesne wykrywanie pojawiającego się w środowisku patogenu. Wymienione sekwencje promotorowe i/lub regulatorowe genu hsr203J mogą być przyłączone do sekwencji nukleotydowej powodującej, po aktywacji promotora w czasie infekcji, optyczną zmianę fenotypu rośliny będącej gospodarzem patogenu. Sekwencje takie obejmują antysensownie zorientowany gen kodujący małą podjednostkę rybulozo B-fosfo karboksylazy (SS-RUBISCO), powodującą ograniczenie przestrzennie odbarwione normalnie zielonej tkanki. Sekwencje takie mogą również obejmować gen kodujący kluczowe enzymy szlaku biosyntezy barwników, takich jak syntetaza chalkonowa.
Wynalazek obejmuje również zrekombinowane DNA według wynalazku, które są zmodyfikowane w kodonach, które preferowane są przez organizm, do którego taki zrekombinowany DNA zostaje wprowadzony, w celu ekspresji takiego zmodyfikowanego DNA, dając zasadniczo podobne białko, do białka otrzymywanego w wyniku ekspresji niezmodyfikowanego DNA, w organizmie dla którego kodujące białko składniki wymienionego zrekombinowanego DNA są endogenne.
Wynalazek obejmuje ponadto sekwencję DNA, która jest komplementarna do jednej z sekwencji, która w warunkach ścisłych hybrydyzuje z dowolną zrekombinowaną sekwencją przedstawioną powyżej.
„Ścisłe warunki hybrydyzacji” to takie, w których hybrydyzacja zachodzi w temperaturze pomiędzy 50 a 60°C w 2 x SSC zawierającym 0.1% SDS, po której następuje przemywanie membrany w tej samej temperaturze i w buforze o zmniejszonym stężeniu SSC, nie wpływającym na efektywność przeprowadzonej hybrydyzacji. Stosuje się bufory o zmniejszającym stężeniu SSC, jak następuje (a) 1 x SSC, 0.1% SDS; lub (B) 0.5 x SSC, 0.1% SDS; lub ( c ) 0.1 x SSC, 0.1% SDS.
Wynalazek obejmuje ponadto DNA wektora obejmujący zrekombinowaną sekwencję DNA według wynalazku lub sekwencję DNA, która jest komplementarna do jednej z sekwencji z którą hybrydyzuje w warunkach ścisłych.
Korzystne jest aby wektor według wynalazku, wykorzystywany był do transformacji gospodarza eukariotycznego, a zwłaszcza gospodarza pochodzenia roślinnego. Uznaje się, że stosowany mikroorganizm może być transformowany takim wektorem, i mikroorganizm taki stanowi dalsze zastosowanie wynalazku.
Termin „roślina” używany jest w szerokim znaczeniu, i odnosi się do zróżnicowanych roślin, jak również do niezróżnicowanego materiału roślinnego, takiego jak: protoplasty, komórki roślinne, nasiona, fragmenty roślin itd., które w odpowiednich warunkach mogą rozwinąć się w dojrzałe rośliny, rośliny potomne i ich części, takie jak sadzonki i owoce takich roślin.
Wybór wektora zależy oczywiście od wybranego wcześniej organizmu gospodarza. W przypadku roślin dwuliściennych wektor może być wprowadzony do protoplastów, poprzez kontakt wektora z protoplastami w odpowiednim podłożu i w odpowiednich warunkach, ukompetentniających protoplasty do pobierania DNA; wektorem może być również plazmid pochodzący z plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens, którym infekuje się komórki roślinne lub protoplasty. Rośliny jednoliścienne transformowane są zwykle metodą mikroiniekcji, elektroporacji lub wstrzeliwania DNA (tzw. metoda balistyczna). We wszystkich przypadkach odpowiednie wektory do transformacji i przepisy wykonania znane są specjalistom. Stransformowane komórki lub protoplasty hodowane są w odpowiednich pożywkach i regenerowane, metodami znanymi specjalistom, do organizmów roślinnych. Wprowadzony materiał jądrowy jest stabilnie włączany do genomu regenerowanych stransformowanych roślin, eksprymujących tym samym pożądane geny.
Przykłady zmodyfikowanych genetycznie roślin obejmują: owoce, włączając w to pomidory, pieprz, mango, brzoskwinie, jabłka, gruszki, truskawki, banany i melony; rośliny uprawne, takie jak kanola, słonecznik, tytoń, buraki cukrowe; zboża, takie jak pszenica, jęczmień i ryż, kukurydza i bawełna, warzywa takie, jak ziemniaki, marchewka, sałata, Brassica oleracea, takie jak kapusta i cebula. Roślinami preferowanymi są szczególnie rośliny buraka cukrowego i kukurydza.
177 329
Wynalazek obejmuje więc wektor z wprowadzoną, zrekombinowaną sekwencją DNA zawierającą region obejmujący sekwencję nukleotydową przedstawioną w Sek. Id. Nr 1 lub jego funkcjonalny odpowiednik, lub zrekombinowaną sekwencję obejmującą część wymienionego regionu lub wymienionego odpowiednika, lub sekwencję DNA hybrydyzującą z nimi.
Wynalazek obejmuje ponadto białko otrzymywane poprzez ekspresję zrekombinowanego DNA według wynalazku, a w szczególności, eksprymowane białko o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Sek. Id. Nr 2, lub jego części, lub funkcjonalnego odpowiednika wymienionej sekwencji lub jej części.
Wynalazek dotyczy również komórki mikroorganizmu lub komórki roślinnej lub protoplastu stransformowanych zrekombinowaną sekwencję nukleotydową zawierającą region obejmujący sekwencję przedstawioną w Sek. Id. Nr 1 lub jego funkcjonalny odpowiednik, lub zrekombinowaną sekwencją obejmującą część wymienionego regionu lub wymienionego odpowiednika, lub sekwencją DNA hybrydyzuiącąz nimi.
Wynalazek może być lepiej zrozumiany poprzez odniesienie do następujących opisów i związanych z nimi rysunków i zestawienia sekwencji.
Figura 1 przedstawia chimerowy konstrukt wykorzystywany do testowania przejściowej ekspresji genu w protoplastach roślin tytoniu i transformowania roślin tytoniu poprzez Agrobacterium tumefaciens. Fig. (A) przedstawia mapę restrykcyjną chimerowego genu βglukuronidazy w plazmidzie pHG21 (lub pHG21A). Gen ten składa się z ulegającego translacji połączenia pomiędzy 1.4 kb sekwencją flankującą ze strony 5' genu hsr203J i genu kodującego region genu uidA, połączone z sekwencją poliadenylacyjną genu syntetazy nopalinowej (nos T). Fig. (B) przedstawia sekwencję (Sek. Id. Nr 2) miejsca połączenia z plazmidu pHG21. Sekwencja genu hsr203J podana jest pogrubionymi literami, a sekwencja genu uidA normalnymi. Sekwencja podana jest w orientacji 5'—3', a strzałka na figurze wskazuje złącze między sekwencjami.
Figura 2 przedstawia efekt infekcji różnymi izolatami (hrp, K 60 i GMI 1000) szczepu Pseudomonas solanacearum, na aktywność promotora genu hsr203J w stransformowanych protoplastach roślin tytoniu. Jako kontrolę, do protoplastów dodawano wodę. Plazmidy pBI20ł i pBI1221 stanowiły odpowiednio negatywną i pozytywną kontrolę; pGH21 niósł gen fuzyjny hsr203J-uidA. Test aktywności GUS przeprowadzano w 24 godziny po inkubacji. Przedstawione dane są średnią z trzech eksperymentów.
Figura 3 przedstawia charakterystykę przejściowej aktywacji promotora hsr203J genu GUS w transgenicznych liściach tytoniu, różnymi izolatami (hrp, K 60 i GMI 1000) szczepu Pseudomonas solanacearum. Aktywność GUS mierzono w ekstraktach czterech liści z dwu transformantów pHG21-14A.
Figura 4 przedstawia ilościową analizę aktywności GUS w lokalnie infekowanych bakteriami transgenicznych roślinach tytoniu. Fig. (A) przedstawia indukcję aktywności βglukuronidazy w zaszczepionym trzecim liściu oraz w niezaszczepionych liściach górnym i dolnym. Fig. (B) obrazuje indukcję β-glukuronidazy w i naokoło ubytków w zaszczepionym trzecim liściu. Przebadano następujące próbki liści: tkankę nekrotyczną z ubytków w miejscu uszkodzenia; 0-3 mm fragment zdrowej tkanki do 3 mm od miejsca uszkodzenia; 3-6 mm fragment tkanki zdrowej, z od 3 do 6 mm naokoło miejsca uszkodzenia. Zaszczepiania dokonywano na transformantach pHG21-14A. Niewielkie perforacje liści pokrywano zawiesiną bakterii (3 μΐ zawiesiny zawierające 108 c.f.u/ml) lub wodą, jak przedstawiono na figurze. Próbki tkanki pobierano w 18 godzin po zaszczepieniu.
Figura 5 przedstawia wpływ mutantów hrp na aktywację promotora hsr203J w transgenicznych wobec pHG21(14A) roślinach tytoniu. Fig. (A) przedstawia lokalizację mutacji hrp w różnych jednostkach transkrypcyjnych zespołu genów hrp. Figura (B) przedstawia wyniki pomiarów aktywności GUS, w liściach w 18 godzin po zaszczepieniu izolatami hrp K60 lub GMI 1000 lub wodą, lub mutantami wskazanymi na fig. (A). Zaszczepianie przeprowadzono tak, jak opisano na fig. 4.
Figura 6 jest schematycznym przedstawieniem konstruowania plazmidów pHGD, z kilkunastoma delecjami w pHG21.
177 329
Figura 7 przedstawia ekspresję genu GUS, otrzymanego poprzez delecję w obrębie 5' promotora pochodzącego z plazmidu pHG21 (zgodnie ze schematem przedstawionym na fig. 5), w transgenicznych roślinach tytoniu. Rośliny stransformowano 5 pl DNA; wartość 100 przypisano aktywności GUS, otrzymanej z ekspresji konstruktu pHG21 w transformantach. Figura pokazuje wzrost aktywności po 18 godzinach) genu GUS w rezultacie zaszczepienia stransformowanych roślin szczepami Delta 3, K60 i GMI 1000. Rośliny kontrolne zaszczepiano wodą.
Sekwencje:
Sek. Id. Nr 1 przedstawia sekwencję nukleotydową genu hsr203J wyizolowanego z roślin tytoniu, obejmującą region kodujący białko, promotor i elementy regulujące wydajność transkrypcji tego genu. Region kodujący białko genu obejmuje nukleotydy 1413-2417 tej sekwencji. Przypuszczalny sygnał dla poliadenylacji obecny jest w kierunku 3' od regionu kodującego białko, a sekwencja odpowiedzialna za reakcję Hr położona jest w obrębie 1.4 kb w kierunku 5' od niekodującego regionu genu. Sekwencję tę w zasadzie stanowią:
a) 72 bp sekwencji liderowej mRNA; nukleotydy 1341-1412 włącznie
b) sekwencje konsensusowe CAAT i TATA; odpowiednio nukleotydy 1282-1286 i 1313-1316
c) kodon startu translacji; pozycja 1413-1415
d) sekwencja promotora delecyjnego, w pozycji 1-1341 włącznie (zasadniczo odpowiedzialna za aktywność promotora)
e) sekwencja w pozycji 1195-1268, mająca działanie wzmagające aktywność promotora
f) sekwencja znajdująca się w pozycji 1-651, mająca działanie wyciszające aktywność promotora.
Sek. Id. Nr 2 przedstawia produkt translacji strukturalnego genu hsr203J, kodowanego przez nukleotydy 1413-2417 Sek. Id. Nr 1.
Sek. Id. Nr 3 przedstawia region łącznikowy chimerowego genu obejmującego 5' flankujący region strukturalnego genu hsr203J i region kodujący reporterowego genu uidA. Kodon startu translacji strukturalnego genu hsr203J znajduje się w pozycji 10-12, a nukleotydy 13-64 kodująN-końcową sekwencję produktu genu hsr203J.
Szczepy bakteryjne i materiał roślinny
Źródło wykorzystywanych szczepów Pseudomonas solanacearum podane jest tabeli 1.
Tabela 1
Szczep dziki Pseudomonas solanacearum i szczepy zmutowane wykorzystywane w badaniach, oraz ich zdolność do wywoływania objawów u roślin tytoniu
| Szczep | Źródło lub odnośnik literaturowy | Wyizolowany z | Odpowiedź roślin tytoniu |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| Typ dziki GMI 1000 | Boucher et al. (1) | pomidora | HR |
| K60 | Lozano etal. (17) | pomidora | Choroba |
| Mutanty pochodzące od GMI 1000 (delecja zespołu genów hrp) | |||
| Ahrp | Boucher et al., niepublikowane | Bez objawów |
177 329 ciąg dalszy tabeli 1
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| Mutanty zespołu genów hpr pochodzące od GMI 1000 (mutageneza Tn5-B20) | |||
| GMI 1462, 1475, 1494, 1492, 1487 GMI 1423, 1425 | Arlat et al. (18) Arlat et al. (18) | Bez objawów Częściowa i/lub opóźniona HR | |
| Mutant pochodzący od GMI 1000 (mutagenaza Tn5-B20 poza zespołem genów hrp) | |||
| GMI 1485 | Arlat et al. (18) | HR |
Izolaty GMI 1000 oraz K60 to szczepy dzikie P. solanacearum, pierwszy z nich wywołuje powstanie reakcji HR na liściach tytoniu w czasie 24 godzin po zaszczepieniu, drugi wywołuje typowe objawy więdnięcia. Szczep pochodny szczepu GMI 1000, Ahrp, nie posiadający zespołu genów hrp, nie powoduje widocznych objawów w zaszczepionych liściach. Osiem zmutowanych szczepów powstałych ze szczepu GMI 1000 w wyniku mutagenezy transpozonowej (Tn5-B20) wykorzystano w sposób, jak podano poniżej. Każdy ze szczepów: GMI 1462, 1475, 1494, 1485, 1423 i 1425 zmutowany jest w jednej z sześciu przypuszczalnych jednostek transkrypcyjnych zespołu genów hrp. Wszystkie one utraciły zdolność do wywoływania reakcji Hr u roślin tytoniu, za wyjątkiem szczepów GMI 1423 i 1425, zmutowanych w prawym końcu zespołu genów hrp, i indukują jedynie częściową i/lub opóźnioną odpowiedź HR w roślinach tytoniu; oraz szczep GMI 1485 zmutowany poza obszarem zespołu genów hr, wywołujący normalną reakcję HR w roślinach tytoniu i konstytutywnie eksprymujący strukturalny gen β-galaktozydazy. Wszystkie one rosną w temperaturze 28°C, w pożywkach B lub BGT (1). Wykorzystywane tu kultury Nicotiana tabacum L. Bottom Special i Samsun, wykazują podobną odpowiedź na zaszczepienie bakteriami. Sadzonki hodowano metodą in vitro na podłożu MS (Murashige i Skoog'a) (2) w czasie od 2 do 5 tygodni (25°C, okres naświetlenia 16 godzin, 15 W/m2), a następnie przenoszono do gleby, w komorach wzrostowych (25°C, okres naświetlenia 16 godzin, 30 W/m2).
Izolacja genu hsr203J i analiza sekwencji nukleotydowej
Bibliotekę genową Nicotiana tabacum L. odmiany NK 326 w bakteriofagu Z-EMBL-3 (Clontech) przeszukiwano klonem cDNA pNt203 (3). Wstawkę plazmidu pNt302 znakowano metodą wydłużania „random primers” (4). Replikowe filtry nitrocelulozowe biblioteki hybrydyzowano z tak przygotowaną sondą według sugestii producenta (Amersham). Wyizolowano cztery różne klony genomowe zawierające hsr203J. Otrzymano klony delecyjne, stosując egzonukleazę III, z obu stron wstawki genomowego DNA, wklonowanego do plazmidu pKS (Stratagene) według HenikofPa (5). Otrzymane subklony sekwencjonowano z obu nici, metodą terminacyjną (6) wykorzystując zestaw Sequenase (US Biochemical, Corp.). Przeprowadzono analizę i kompilację otrzymanych sekwencji nukleotydowych, wykorzystując oprogramowanie Genetic Computer Group z Uniwersytetu w Wisconsin (7). Podobieństw sekwencyjnych poszukiwano stosując bazy danych Genebank (wersja 71.0) i Swissprot (wersja 21.0) i algorytm FASTA (8). Sekwencje białkowe analizowano szukając potencjalnych N-końcowych miejsc terminacyjnych i domen transmembranowych, korzystając z programu PC/Gene Programme (wersja 5.0) (Wydział Biochemii Medycznej Uniwersytetu Genewskiego, Szwajcaria). Miejsce startu transkrypcji określono metodą wydłużania primera, wykorzystując poliA mRNA, otrzymany z liści roślin tytoniu dziewięć godzin po zaszczepieniu niekompatybilnym izolatem bakterii oraz oligonukleotyd lokujący się w pozycji 1413-1425 Sek. Id. Nr 1 (w miejscu kodonu ATG).
m 329
Konstrukty genu reporterowego
2.2 kb fragment Bglll zawierający 1.3 kb 5' niekodującego regionu genu hsr203J z roślin tytoniu i 890 bp sekwencji nukleotydowej w kierunku 3' od miejsca startu transkrypcji, wklonowano do miejsca BamHI fagmidu pKS, otrzymując pKJ2.2. Plazmid ten strawiono enzymem BstBI, przecinającym sekwencję genu hsr203J na 55 bp w kierunku 3' od miejsca startu translacji. Lepkie końce uzupełniono do końców tępych stosując fragment Klenowa polimeraz I DNA, przed trawieniem Sa1I. Otrzymany fragment Sa1l-BstBI wklonowano następnie do miejsca Sa1l-SmaI binarnego wektora ekspresyjnego pBI101.2 zawierającego gen β-glukuronidazy (GUS) (9) w celu otrzymania genu fuzyjnego hsr203J-uidA, nazwanego pHG21A. 3.5 kb fragment HindIII-EcoRI plazmidu pHG21A, zawierający promotor genu hsr203J i sekwencję kodującą genu uidA, zligowano ze strawionym HinIII-EcoRI wektorem pUC19, otrzymując plazmid pHG21, dla potrzeb testu przejściowej ekspresji genu (fig. 1). Konstruktu pHG21 i pHG21A zawierają 1341 fragment 5' niekodującej sekwencji, 72 bp sekwencję liderową, pierwszych 55 nukleotydów sekwencji kodującej genu hsr203J przyłączonego „w fazie” do sekwencji kodującej genu GUS oraz sygnał poliadenylacji pochodzący z genu syntazy nopalinowej. Istnienie ulegającego translacji połączenia potwierdzono metodą sekwencjonowania dwuniciowej matrycy, stosując primer specyficzny do fragmentu sekwencji genu GUS (10). Dwa dodatkowe plazmidy, pBI1201 i pBI1221, zawierające powyżej terminatora nos, w plazmidzie pUC19 (Clonetch) odpowiednio: gen uidA pozbawiony promotora i gen uidA z promotorem 35S pochodzącym z CaMV (wirusa mozaikowatości kalafiora).
Izolacja protoplastów i test przejściowej ekspresji
Do izolowania protoplastów wykorzystywano liście pochodzące z 4-5 tygodniowych roślin tytoniu odmiany Samsun NN. Wycinki liści inkubowano w pożywce TO (11) zawierającej 1 g/l celulazy R10 Onozuka, 200 mg/l macerozymu Onozuka (Yakult Honsha, Nishinomiya, Japonia) i 500 mg/l pektoliazy Y23 (Seshin Pharmaceutical Ind.) przez 15 godzin w 22°C, w ciemności. Protoplasty oddzielano od materiału komórkowego filtrując poprzez nylon o średnicy porów 85 pm, a następnie materiał wirowano przy 50 g przez 5 minut przez 1 ml poduszeczkę 19% sacharozy (w/v). Flotowane protoplasty zawieszano w pożywce To, zliczano i doprowadzano do gęstości 1.5 x 106 protoplastów/ml. Transformację przeprowadzano inkubując najpierw protoplasty (próbki po 320 pl) w 45°C przez 5 minut, a po krótkim schłodzeniu do temperatury pokojowej, dodawano plazmidowego DNA (50 pg na reakcję, w 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) i 160 pl roztworu PEG (40% PEG, 0.4 M mannitol, 30 mM MgCl2, 0.1% MES pH 5.8). Protoplasty łagodnie mieszano przez 10 minut w temp. pokojowej. Następnie zbierano przez wirowanie i zawieszano w 500 pl pożywki TO. Dodawano następnie przygotowaną, jak podano poprzednio (12), zawiesinę bakterii (10 bakterii/protoplast). Po inkubacji w 28°C przez 24 godziny, protoplasty lizowano przez dodanie 50 pl 10 x stężonego buforu GUS, wirowano, a supernatant testowano na obecność aktywności GUS (10).
Transgeniczne rośliny tytoniu pHG2A, pBI121 i pBI101 przekazywano ze szczepu DH5a Escherichia coli do szczepu LBA 4404 Agrobacterium tumefaciens (13) i metodą dysków liściowych tworzono transgeniczne rośliny tytoniu (N. tabacum, Bottom Special) (14). Stransformowane rośliny selekcjonowano na podłożu MS, zawierającym 0.8% agar (Difco), kanamycynę (w stężeniu 100 pg/ml) i karbenicylinę (500 pg/ml). Rośliny transgeniczne samozapładniano i następnie zbierano nasiona. Genotyp roślin określano analizując rośliny potomne (metodą T2), prowadząc wzrost na podłożu MS zawierającym kanamycynę (500 pg/ml).
177 329
Zaszczepianie roślin transgenicznych izolatami bakteryjnymi
Wszystkie doświadczenia polegające na zaszczepianiu roślin przeprowadzano na roślinach T2 kanamycynoopomych, testując w jednakowych warunkach co najmniej dwie rośliny o tym samym genotypie. Dla badań przesiewowych transformantów i dla eksperymentów kinetycznych z ośmiotygodniowych roślin tytoniu zbierano liście i nasycano pod próżnią zawiesiną bakterii <107 c.f.u./ml> lub wodą, jak przedstawiono w <12>. Doświadczenia z nasycaniem metodą strzykawkową przeprowadzano na ośmiotygodniowych roślinach, podając strzykawką bez igły zawiesinę bakterii <108 c.f.u./ml> do małego regionu nieuszkodzonego liścia. W niektórych doświadczeniach zaszczepianie przeprowadzano na pięciotygodniowych roślinach, rosnących w kubkach Magenta <Sigma> lub na podłożu MS. Każda połówka liścia była nakłuwana 6 razy igłą 10 pl strzykawki Hamiltona i na miejsce to nakładano natychmiast zawiesinę bakterii <3 μΐ, 108 c.f.u./ml w 0.4% agarze Difco).
W celu miejscowego zaszczepiania korzeni używano czterotygodniowe rośliny, rosnące na podkładce <Sigma> w kontakcie z podłożem MS, zawierającym 0.2% agar Difco. Rośliny zaszczepiano 3 pl kroplą zawiesiny bakteryjnej, poprzez nakłucie igłąjeden centymetr powyżej szczytu korzenia lub w regionie rozgałęziania korzenia. Przy uogólnionym zaszczepianiu korzeniowym roślinki delikatnie, bez uszkodzeń, wyciągano z podkładki, i system korzeniowy zanurzano w 7 ml zawiesiny w 7 ml zawiesiny bakterii <108 c.f.u./ml).
Zaszczepione rośliny hodowano w 28°C i analizowano albo bezpośrednio, albo przechowywano w -80°C po okresie inkubacji.
Test aktywności GUS
Tkanki roślinne rozcierano w moździeżu, pod płynnym azotem, homogenizowano w 1 x buforze GUS, wirowano przez 5 minut przy 10.000, a supernatant badano na obecność aktywności GUS, tak jak podano powyżej <15). Stężenie białek oznaczano metodą Bradforda. Aktywność GUS wyrażano w postaci pikomoli 4-metyloumbeliferonu na minutę na mg białka. Przeprowadzano również alternatywny test histochemiczny, na świeżych tkankach, wykorzystując jako substrat X-gluc <5-bromo-4-chloro-3-indolylo-e-D-glukuronid, Clontex) lub Magneta-gluc <Biosynth AG) <10). W niektórych doświadczeniach stosowano utrwalanie tkanek 0.3% formaldehydem w buforze 50 mM NaPO4 o pH 7,0, prześwietlanym następnie przez gotowanie w etanolu i przechowywanych następnie w 70% etanolu.
Test aktywności β-galaktozydazy
Po przeprowadzeniu histochemicznego testu aktywności GUS niektóre próbki równoważono buforem Z' <16) <100 mM bufor NaPO4 pH 7.4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4), utrwalano w 1.25% aldehydzie glutarowym przez jedną godzinę, w celu inaktywowania endogennych roślinnych β-galaktozydaz, przemywano i barwiono w 28°C 0.8 mg/ml barwnika Magenta-Gal <Biosynth AG) lub X-gal w buforze Z', zawierającym 5 mM K3Fe<CN)6 i 5 mM K4Fe<CN)6, następnie prześwietlano przez gotowanie w etanolu i obserwowano metodą mikroskopi w polu jasnym lub ciemnym.
Charakterystyka genu hsr203J
Gen hsr203J wyizolowano przeszukując bibliotekę genomową roślin tytoniu klonem cDNA pNt203. Należy on do małej, wielogenowej rodziny, składającej się co najmniej z 4 genów <3) i co najmniej 2 geny tej rodziny odpowiadające dwóm równym klonom cDNA <pNt203 i pNt239) są eksprymowane w czasie reakcji HR.
Analiza sekwencji regionu wielkości 2.7 kb w DNA genu hsr203J <Sek. Id. Nr 1) ujawniła obecność pojedynczej otwartej ramki odczytu, nie zawierającej intronów, z potencjalną możliwością kodowania produktu białkowego o długości 255 aminokwasów. Sekwencja nukleotydowa tego 2.7 kb regionu jest identyczna jak klonu cDNA pNt239, za wyjątkiem dwu substytucji nukleotydowych <dane nie zamieszczone). Różnice te biorą się prawdopodobnie z tego,
177 729 że klon genomowy wyizolowano z odmiany NK326, a klon cDNA (pNt239) z odmiany Bottom Special. Przewidywane białko strukturalne kodowane przez gen hsr203J. (Sek. Id. Nr 2) posiada masę cząsteczkową 37.5 kD i teoretycznie wyznaczony punkt izoelektryczne - 5.17.
Miejsce startu tarnsktypcji, zlokalizowano metodą wydłużania primera w odległości 72 bp w kierunku 5' od przypuszczalnego kodonu inicjacji translacji. Promotor i 5' niepodlegąjący translacji region wykazują brak znaczących podobieństw sekwencyjnych do cis-aktywnych elementów opisywanych w przypadku innych genów kontrolujących reakcje obronne.
Przejściowa ekspresja fuzyjnego genu hsr203J - uidA w protoplastach roślin tytoniu
Plazmid pHG21 składa się z ulegającego translacji połączenia pomiędzy 1.4 kb odcinkiem flankującym z 5' strony gen hsr203J i regionu kodującego genu reporterowego uidA, przyłączonych do nieulegającego translacji regionu 3' genu syntetazy nopalinowej (fig. 2). Plazmidy pNI201 i pBI221 wykorzystywano odpowiednio, jako negatywną i pozytywną kontrolę w teście przejściowej ekspresji genu.
Wstępne doświadczenia wykazały, że żywotność protoplastów, mierzona stopniem usuwania barwnika niebieskiego Evans'a, nie jest w sposób znaczący zmieniona w obecności bakterii, przy gęstości 10 - 100 bakterii/protoplast. Przy tej gęstości komórek bakteryjnych, ekspresja genu GUS przyłączonego do promotora genu hsr203J, w odpowiedzi na zaszczepienie izolatem GMI 1000, jest sześciokrotnie większa niż odpowiedź kontrolna (woda lub inokulacja Ahrp) (fig. 3). Dla porównania, zaszczepienie niekompatybilnym izolatem - K60 powodowało dwukrotny wzrost aktywności enzymatycznej. Otrzymane poziomy aktywności GUS musiały być porównywane z poziomami aktywności otrzymanymi w protoplastach stransformowanych fuzyjnym genem CaMV 35S-uidA (pBI221), wykazującym wysoki i prawie konstytutywny poziom ekspresji po zastosowaniu różnych sposobów inokulacji (fig. 3).
Wyniki testu przejściowej ekspresji genu wykazują więc jasno, że promotor hsr203J posiada wszystkie elementy niezbędne do jego preferencyjnej aktywacji izolatami bakterii zdolnymi do wywoływania odpowiedzi HR, oraz że zastosowany system ekspresji w sposób doskonały naśladuje zależności między rośliną a patogenem.
Ekspresja genu fuzyjnego hsr203J-uidA w transgenicznych roślinach tytoniu
W celu określenia czaso-przestrzennego wzorca ekspresji promotora hsr203J w roślinach, stransformowano rośliny tytoniu metodą transformacji dysków liściowych, stosując gen fuzyjny hsr203J-uidA. We wszystkich eksperymentach wykorzystywano rośliny pokolenia T2, oporne na kanamycynę. Z 23 roślin kanamycynoopomych 20 eksprymowało gen fuzyjny i wszystkie one wykazywały ten sam wzorzec ekspresji: aktywność GUS była najwyższa po nasyceniu roślin szczepem GMI 1000, powodującym 2 do 90- krotny wzrost aktywności powyżej aktywności kontrolnej (woda lub Ahrp), oraz od 2 do 25- krotną indukcję powyżej aktywności wywoływanej przez K60 (wszystkie pomiary w 18 godzin po zaszczepieniu) (dane nie przedstawione). Otrzymane poziomy aktywności były porównywalne z otrzymanymi w teście przejściowej ekspresji genu, po inokulacji szczepami GMI 1000 lub K60.
W oparciu o przedstawione doświadczenia wybrano transformanta (pHG21-14A), który wykazywał 90-krotną stymulację aktywności GUS po zaszczepieniu niekompatybilnym patogenem w porównaniu do kontroli, i zawierał jeden wbudowany gen fuzyjny na genom haploidalny. Obecność nieuszkodzonego genu fuzyjnego sprawdzano metodą hybrydyzacji Southern'a z genomowym DNA (dane nie przedstawione).
Do śledzenia aktywności promotora genu hsr203J w różnych organach podczas rozwoju rośliny oraz w czasie odpowiedzi na zaszczepianie różnymi szczepami bakterii, określano stopień aktywności rozpuszczonej GUS oraz histochemicznie lokalizację aktywności GUS w 4, 7 lub 15 dniowych siewkach roślin pHG21-14A tytoniu. Zarówno w liściach, kwiatach lub w całych roślinach nie wykrywano aktywności GUS (dane nie przedstawione). Dane te wskazuj że promotor genu hsr203J ulega silnej aktywacji w liściach zaszczepianych izolatem bakterii wywołującym odpowiedź HR (GMI 1000) 18 godzin po zaszczepieniu, tak jak to wykazano dla wszystkich otrzymanych transformantów. Badania kinetyczne przeprowadzone
177 329 na transformantach pGH21-14A (fig. 3) wykazują, że w liściach nasyconych GMI 1000 aktywność GUS wzrasta do poziomu 12-krotnie przewyższającego poziom kontroli, w 6 godzin po zaszczepieniu, osiąga maksimum - 200-krotną stymulację, po 9 godzinach i spada do średniego poziomu (80-krotna indukcja) po dłuższej inkubacji. Znacznie niższe poziomy aktywacji osiągane są po zastosowaniu nasycania izolatem K60, a niewykrywalne poziomy aktywności GUS obserwuje się po nasycaniu liści wodą lub izolatem Ahrp, po dowolnych czasach inkubacji.
Rośliny stransformowane nie zawierającym promotora konstruktem pHU01 wykazywały zaniedbywalne poziomy aktywności GUS. Ponadto, rośliny stransformowane plazmidem pBI121, zawierającym gen fuzyjny CaMV 35S-uidA, wykazywały podobne poziomy aktywności enzymatycznej, niezależnie od stosowanego inokulum (dane nie przedstawione). Tak więc gen fuzyjny hsr203J-uidA wykazywał osobny i specyficzny wzór aktywacji po zaszczepieniu roślin transgenicznych komórkami bakteryjnymi; wzór ten ściśle odpowiadał wzorowi gromadzenia transkryptów genu hsr203J in vivo, występującym po nasyceniu roślin tytoniu odpowiednimi izolatami bakteryjnymi (3). Dane te wskazują również, że promotor hsr203J jest aktywowany wcześnie i w sposób specyficzny w czasie oddziaływań pomiędzy rośliną, a niekompatybilnym patogenem, i że indukcja tej odpowiedzi jest zależna od genu hrp, ponieważ izolaty bakteryjne pozbawione tego genu nie były zdolne do aktywowania promotora hsr203J.
Lokalizacja miejsca aktywacji genu fuzyjnego hsr203J-uidA w odpowiedzi na zaszczepienie bakteriami
Przeprowadzono różne testy inokulacyjne na roślinach pHG21-14A w celu dokładnego zlokalizowania miejsca aktywacji promotora hsr203J w odpowiedzi na zaszczepianie komórkami bakteryjnym; po pierwsze w liściach tytoniu, w celu zbadania indukcji promotora w czasie typowej reakcji Hr oraz po drugie w korzeniach, które są organem zwykle infekowanym przez bakterie.
Inokulacja liści
W celu sprawdzenia czy ekspresja genu hsr203J-GUS ma charakter lokalny czy systemiczny, zaszczepiano liście 5 tygodniowej rośliny transgenicznej, kroplami zawierającymi zawiesinę bakteryjną. Po inkubacji przez 18 i 70 godzin określano aktywność GUS w połowie zaszczepionych liści, jak również w liściach powyżej i poniżej miejsca zaszczepienia. Wykazano, że w zaszczepionych liściach nastąpił 15 krotny wzrost aktywności GUS, podczas gdy w liściach położonych powyżej i poniżej wykrywano jedynie bardzo niski poziom tej aktywności (fig, 4A). Pozostałą część zaszczepionych liści wykorzystano do histochemicznego testu aktywności GUS. Po 18 i 70 godzinach po zaszczepieniu izolatem indukującyn odpowiedź HR, na około miejsca uszkodzenia uwidoczniono wąski region barwiący się na niebiesko, składający się z kilku warstw komórek. Był on zlokalizowany bardzo blisko żółciejących, prawdopodobnie martwych komórek. Intensywność koloru wzrastała do 70 godzin po zaszczepieniu. Po zaszczepieniu izolatem K60 jedynie kilka komórek wykazywało słaboniebieskie zabarwienie; woda lub izolat Ahrp nie indukował wykrywalnej ekspresji GUS. Barwiąc rośliny transgeniczne, niosące chimerowy gen uidA, znajdujący się pod kontrolą promotora CaMv 35S, powodowało powstawanie niebieskiego zabarwienia całych liści, bez preferencji do obszarów wokół uszkodzenia, co wskazywało na specyficzną indukcję promotora hsr203J w tym regionie. Nieco dokładniejszą lokalizację tej aktywności podczas infekcji osiągano badając aktywność GUS w małych kwadratach naokoło ubytków, w 18 godzin po zaszczepieniu (fig. 4B). Wysoki poziom aktywności enzymatycznej (48-krotność poziomu kontrolnego) wykrywano tylko w obrębie ubytków nekrotycznych, po zaszczepieniu izolatem GMI 1000. W tkance liścia, do 3 mm od ubytku, nie wykazywano obecności aktywności GUS.
W celu określenia czasu aktywacji promotora hsr203J w rejonie zaszczepionym, przeprowadzono histochemiczną lokalizację aktywności GUS, w liściach z 8 tygodniowych
177 329 roślin transgenicznych, nasyconych lokalnie poprzez strzykawkę, zawiesiną bakteryjną lub izolatem K60. W 6 godzin po zaszczepieniu izolatem GMI 1000, w czasie gdy objawy nekrotyczne są jeszcze niedostrzegalne, wykazano niebieskie zabarwienie, którego intensywność wzrastała do 9 godzin po zaszczepieniu. W późniejszym okresie zaczynały pojawić się znamiona nekrozy (zażółcenie), ograniczone cienką strefą niebieskiego zabarwienia, w zaszczepionej części liścia.
Przedstawione powyżej różne doświadczenia wykazują jasno, że ekspresja hsr203JGUS ograniczona jest do obszaru odpowiadającego dokładnie do warstw komórek zainfekowanych izolatem GMI 1000 wywołującym odpowiedź HR.
Inokulacja korzenia
Korzenie roślin transgenicznych hodowanych na podkładkach (Sigma) uszkadzano i inokulowano kroplą zawiesiny bakteryjnej. W 48 godzin po zaszczepieniu, badano metodą histochemiczną lokalizację aktywności GUS w tkankach. Zabarwienie, występujące jedynie w korzeniach zainfekowanych izolatem GMI 1000, rozciąga się na odległość do 2 mm od miejsca początkowej inokulacji. Badania cytologiczne wskazują, że aktywacja promotora hsr203J wydaje się być niezależna od typu komórki (dane nie przedstawione). Przeprowadzono również uogólnioną inokulację korzenia, poprzez proste zanurzenia całego systemu korzeniowego w zawiesinie bakterii. W tym przypadku aktywność GUS znajdowano w ograniczonych regionach korzenia, tj. w punktach powstawania korzeni drugorzędowych. Ekspresja w tych miejscach była prawdopodobnie skorelowana z istnieniem preferencyjnych miejsc wnikania bakterii do rośliny, obserwowanych wzdłuż osłonek korzeni drugorzędowych. W tych specyficznych miejscach, podwójne barwienie - aktywności GUS oraz bakterii niosących gen fuzyjny β-galaktozydazy, wykazało pozytywną korelację pomiędzy aktywacją promotora hsr203J i obecnością bakterii. Obserwowano również powierzchniowe i międzykomórkowe zasiedlenie końców korzeni przez bakterie, powodujące silną. aktywację promotora hsr203J w tej części korzenia.
Tak więc, gen fuzyjny hsr203J-GUS wykazuje osobny i specyficzny wzór aktywacji po zaszczepieniu roślin transgenicznych komórkami bakteryjnymi; wzór ten ściśle odpowiadał wzorowi przedostawania się bakterii do rośliny.
Zależność aktywacji hsr203J-uidA od genów hrp
Do zaszczepienia roślin transgenicznych (pHG21-14A) metodą kroplową, wykorzystano różne szczepy P. solanacearum, zmutowane w jednej z sześciu jednostek transkrypcyjnych, zespołu genów hrp (fig. 5A). Mutanty te utraciły zdolność indukowania odpowiedzi HR w roślinach tytoniu, jakkolwiek dwa z nich (GMI 1425 i GMI 1423) powodowały częściową lub odroczoną odpowiedź HR. 18 godzin po inokulacji roślin 6 z 7 przebadanych mutantów nie wykryto aktywności GUS; jedynie GMI1423 powodował wzrost aktywności enzymatycznej, porównywalny do wzrostu powodowanego przez szczep dziki (GMI 1000) (fig. 5B). Dane te wskazują, że do aktywacji hsr203J potrzebny jest cały funkcjonalny zespół genów hsr. Do tej pory nie zidentyfikowano genu roślinnego specyficznie zaangażowanego w rozpoznawanie niekompatybilnego patogenu, przekazywanie sygnału w komórce, i w końcu za zaprogramowaną śmierć Komórki (reakcja HR), który zapewniałby wydajny mechanizm ograniczający rozprzestrzenianie się i ewentualną eliminację patogenu.
Gen hsr203J (Sek. Id. Nr 1) jest pierwszym wyizolowanym genem związanym z nadwrażliwością, którego promotor wykazuje szybką, wydajną, zlokalizowaną oraz specyficzną aktywację w odpowiedzi na obecność izolatów bakteryjnych wywołujących odpowiedź HR.
Tworzenie delecji w 5' regionie promotora pHG21
Przeprowadzono jednokierunkowe delecje promotora chimerowego genu, poczynając od 5' końca wg. Henrkoffa (5). W tym celu, plazmid pHG21 (fig. 1) linearyzowano enzymami SphI i Sa1I, a następnie trawiono egzonukłeazą III. Wybierano konstrukty posiadające
177 329 następujące kolejno po sobie delecje, odległe od siebie o około 200 bp. Koniec 5' promotorów delecyjnych określano metodą sekwencjonowania i porównywano z sekwencją nukleotydową genu hsr203J (patrz: fig. 6).
Efekt delecji w promotorze na ekspresję chimerowego genu w roślinach transgenicznych μg plazmidowego DNA różnych klonów delecyjnych (fig. 6) wprowadzano do roślin tytoniu poprzez transformację. W 18 godzin po inokulacji mierzono aktywność GUS.
Figura 7 przedstawia ekspresję genu GUS w konstrukcie otrzymanym metodą tworzenia 5' klonów delecyjnych promotora pHG21 (według schematu na fig. 5). Rośliny stransformowano 5 μg DNA; aktywność GUS otrzymaną po stransformowaniu plazmidem pHG21 oznaczono jako 100.
Rysunek pokazuje wzrost aktywności (po 18 godzinach) genu GUS, w konsekwencji nasycenia stransformowanych roślin szczepem bakteryjnym Delta 3, K60 o GMI 1000. Kontrolę stanowiły rośliny inokulowane wodą. Doświadczenie to wykazało obecność 2 głównych regionów, mających regulacyjny wpływ, w promotorach delecyjnych genu hsr203J.
W pozycji 1-651 Sek. Id. Nr 1 położony jest jeden lub więcej elementów odpowiedzialnych za zmniejszanie ekspresji genu chimerowego, elementy położone w drugim obszarze (pozycje 62552-1268) wykazują efekt zwiększający aktywację promotora genu hsr203J.
Badania czaso-przestrzennego wzoru aktywacji promotora w korzeniach i liściach transgenicznych roślin zaszczepianych Pseudomonas solanacearum wskazują, że:
- promotor ulega specyficznej aktywacji w czasie odpowiedzi HR, na kilkanaście godzin przed pojawieniem się ubytków nekrotycznych,
- aktywacja promotora jest ograniczona do kilku warstw komórkowych będących w kontakcie z bakteriami,
- promotor nie ulega aktywacji w wyniku działania wielu czynników stresowych i jest bardzo słabo aktywowany podczas oddziaływań kompatybilnych,
- aktywacja promotora silnie zależy od genów hrp (genów odpowiedzi nadwrażliwej i patogenności) Pseudomonas solanacearum. Geny te kontrolują zdolność bakterii do wywoływania odpowiedzi HR w roślinach opornych lub w roślinach spoza zakresu gospodarza, i które to powodują objawy chorobowe roślin podatnych.
Za główną rolą bakteryjnych genów hrp w aktywacji promotora genu hsr203J świadczy fakt, że promotor hsr203 ulega ekspresji w odpowiedzi na obecność specyficznego wywoływacza reakcji HR, harpiny, produktu jednego z genów hrp Erwinia amylowora. W odpowiedzi na ten polipeptyd, promotor ulega aktywacji do poziomu obserwowanego w przypadku inokulacji odpowiednim szczepem niezjadliwym (lecz szybciej). Inne potencjalne induktory, tj. biotyczne i abiotyczne wywoływacze, induktory oporności, nie wpływały na poziom ekspresji. Uogólnioną, lecz specyficzną ekspresję hsr203J w czasie oddziaływania niekomatybilnych ze szczepami bakteryjnymi wykazano dla Pseudomonas syringae pv pisi/Pseudomonas syringae pv tabaci oraz Erwinia amylovora.
Przeprowadzono ponadto funkcjonalną analizę elementów cis aktywnych, odpowiedzialnych za aktywację transkrypcji genu hsr203J w odpowiedzi na niekompatybilne szczepy bakteryjne, tworząc serię 5' delecji i analizując otrzymane konstrukty w teście przejściowej ekspresji i w roślinach transgenicznych. Doświadczenia te ujawniły obecność dystalnego elementu wyciszającego oraz dwu pozytywnych elementów regulacyjnych, ilościowego (pozycje 655-770 w Sek. Id. Nr 1) oraz specyficznego względem bakterii (pozycje 11951268 w Sek. Id. Nr 1).
Wyniki wskazują, że promotor genu hsr203J wykazuje nowe i oryginalne cechy aktywacji w porównaniu do badanych dotychczas roślinnych genów obronnych: czasoprzestrzenny program aktywacji w powiązaniu z jego specyficzną indukcją w czasie reakcji HR podkreślająiego znaczenie jako molekularnego narzędzia w badaniu powstawania i regulacji reakcji HR. Ponadto zdefiniowano 74 nukleotydowy element odpowiedzialny za indukowalność promotora przez niezjadliwy patogen.
177 329
Jakkolwiek wynalazek opisywany jest w szczegółowy sposób w odniesieniu do aktywacji promotora hsr203J w odpowiedzi na poddane działaniu niekompatybilnego patogena rośliny tytoniu, przyjmuje się, że promotor może być w podobny sposób aktywowany poddawaniem innych roślin transgenicznych działaniu innych patogenów, włączając w to niektóre wirusy i niektóre grzyby, wskazując że specyficzna ekspresja promotora hsr203J jest zjawiskiem ogólnym, zależnym od niekompatybilnych oddziaływań pomiędzy gospodarzem a patogenem, prowadzących do reakcji HR.
Ponadto sekwencje nukleotydowe obejmujące pozycje 1195-1268 przedstawione w Sek. Id. Nr 1, zawierają elementy odpowiedzi bakteryjnej, wiążące się, a białkami jądrowymi pochodzącymi z różnych źródeł (zdrowe rośliny, rośliny zaszczepione różnymi szczepami Pseudomonas solanacearum: kompatybilnymi, niekompatybilnymi, mutantami hrp-, po różnych czasach inkubacji). Wiązanie takie może być oszacowane metodą analizy spowolnienia migracji w żelu wykorzystując, np. region długości 74 bp i kilkanaście pod-fragmentów, umożliwiając identyfikację dyskretnych sekwencji w obrębie regiony BRE, które są użyteczne przy dostarczaniu konstruktów obejmujących geny oporności na choroby.
Claims (17)
1. Zrekombinowana sekwencja DNA zawierająca region obejmujący sekwencję nukleotydową przedstawioną w Sek. Id. Nr 1 lub jego funkcjonalny odpowiednik, lub zrekombinowana sekwencja obejmująca część wymienionego regionu lub wymienionego odpowiednika, lub sekwencja DNA hybrydyzująca z sekwencją przedstawioną na Sek. Id. Nr 1.
2. Zrekombinowana sekwencja DNA, według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera region obejmujący nukleotydy od 1413 do 2417 sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr 1 lub jego funkcjonalny odpowiednik, lub zrekombinowana sekwencja obejmująca część wymienionego regionu lub wymienionego odpowiednika.
3. Zrekombinowana sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera region obejmujący nukleotydy od 1 do 1341 sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr 1 lub jego funkcjonalny odpowiednik, lub zrekombinowana sekwencja obejmująca część wymienionego regionu lub wymienionego odpowiednika.
4. Zrekombinowana sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera region obejmujący nukleotydy od 1 do 651 sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr 1 lub jego funkcjonalny odpowiednik, lub zrekombinowana sekwencja obejmująca część wymienionego regionu lub wymienionego odpowiednika.
5. Zrekombinowana sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera region obejmujący nukleotydy od 652 do 1341 sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr 1 lub jego funkcjonalny odpowiednik, lub zrekombinowana sekwencja obejmująca część wymienionego regionu lub wymienionego odpowiednika.
6. Zrekombinowana sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera region obejmujący nukleotydy od 1195 do 1341 sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr 1 lub jego funkcjonalny odpowiednik lub zrekombinowana sekwencja obejmująca część wymienionego regionu lub wymienionego odpowiednika.
7. Zrekombinowana sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera region obejmujący nukleotydy od 1195 do 1268 sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr 1 lub jego funkcjonalny odpowiednik lub zrekombinowana sekwencja obejmująca część wymienionego regionu lub wymienionego odpowiednika.
8. Zrekombinowana sekwencja DNA według zastrz. 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, znamienna tym, że wymieniony region lub jego część lub odpowiednik umiejscowiony jest po 5' stronie i jest przyłączony operacyjnie do sekwencji kodującej białko genu heterologicznego lub do sekwencji obejmującej nukleotydy od 1413 do 2417 sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr 1 lub jej funkcjonalnego odpowiednika.
9. Zrekombinowana sekwencja DNA według zastrz. 8, znamienna tym, że sekwencje wzmacniające translację są obecne pomiędzy regionem lub jego częścią lub jego odpowiednikiem i regionem kodującym białko w sekwencji DNA, położonym po stronie 3' wymienionej sekwencji.
10. Zrekombinowana sekwencja DNA według zastrz. 8, znamienna tym, że gen heterologiczny jest genem markerowym, umożliwiającym selekcję lub przeglądanie biblioteki genowej, lub genem, którego produkt zdolny jest do nadawania oporności lub tolerancji na co najmniej jeden z takich czynników jak owady, herbicydy, grzyby, bakterie i wirusy.
177 329
11. Zrekombinowana sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że jeden lub więcej nukleotydów zostało w niej dodanych lub usuniętych, lub podstawionych bez zasadniczego wpływu na jej funkcję, lub zdolność do kodowania aminokwasów.
12. Zrekombinowana sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że jest zmodyfikowana w kodonach, które preferowane są przez organizm, do którego taka zrekombinowana sekwencja DNA zostaje wprowadzona.
13. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi ją sekwencja, która hybrydyzuje do sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr 1 w warunkach ścisłych.
14. Wektor obejmujący zrekombinowaną sekwencję DNA zawierającą region obejmujący sekwencję nukleotydową przedstawioną w Sek. Id. Nr 1 lub jego funkcjonalny odpowiednik, lub zrekombinowaną sekwencję obejmującą część wymienionego regionu lub wymienionego odpowiednika, lub sekwencję DNA hybrydyzującąz nimi.
15. Białka otrzymane przez ekspresję sekwencji DNA zawierającej region obejmujący sekwencję nukleotydową przedstawioną w Sek. Id. Nr 1 lub jego funkcjonalny odpowiednik, lub zrekombinowanej sekwencji obejmującej część wymienionego regionu lub wymienionego odpowiednika, lub sekwencji DNA hybrydyzującej z nimi.
16. Białka według zastrz. 15, znamienne tym, że mają sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sek. Id. Nr 2 lub funkcjonalne odpowiedniki wymienionej sekwencji.
17. Komórka mikroorganizmu lub komórka roślinna lub protoplast stransformowane zrekombinowaną sekwencją DNA zawierającą region obejmujący sekwencję nukleotydową przedstawioną w Sek. Id. Nr 1 lub jego funkcjonalny odpowiednik, lub zrekombinowaną sekwencją obejmującą część wymienionego regionu lub wymienionego odpowiednika, lub sekwencją DNA hybrydyzuiącąz nimi.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP93102887 | 1993-02-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL302320A1 PL302320A1 (en) | 1994-09-05 |
| PL177329B1 true PL177329B1 (pl) | 1999-10-29 |
Family
ID=8212635
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL94302320A PL177329B1 (pl) | 1993-02-24 | 1994-02-22 | Zrekombinowana sekwencja DNA, wektor obejmujący zrekombinowaną sekwencję DNA, białka otrzymane przez ekspresję zrekombinowanej sekwencji DNA oraz komórka mikroorganizmu lub komórka roślinna lub protoplast stransformowane zrekombinowaną sekwencją DNA |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5550228A (pl) |
| EP (1) | EP0612848A3 (pl) |
| JP (1) | JPH06319558A (pl) |
| KR (1) | KR940019860A (pl) |
| AU (1) | AU682674B2 (pl) |
| CA (1) | CA2116202A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ40494A3 (pl) |
| HU (1) | HUT69614A (pl) |
| IL (1) | IL108728A0 (pl) |
| PL (1) | PL177329B1 (pl) |
| SK (1) | SK20694A3 (pl) |
| ZA (1) | ZA941281B (pl) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU638438B2 (en) | 1989-02-24 | 1993-07-01 | Monsanto Technology Llc | Synthetic plant genes and method for preparation |
| DE69334354D1 (de) | 1992-07-01 | 2011-05-26 | Cornell Res Foundation Inc | Elicitor von Überempfindlichkeitsreaktionen in Pflanzen |
| US5708139A (en) * | 1993-05-17 | 1998-01-13 | Cornell Research Foundation, Inc. | Pseudomonas syringae pv syringae hrpZ gene |
| US5981843A (en) * | 1995-05-18 | 1999-11-09 | Board Of Trustee Of The University Of Kentucky | Elicitin-mediated plant resistance |
| NZ309611A (en) * | 1995-06-07 | 1999-08-30 | Cornell Res Foundation Inc | A method of imparting pathogen resistance to plants by applying a hypersensitive response elicitor polypeptide or protein to the plants cells |
| US5850015A (en) * | 1995-06-07 | 1998-12-15 | Cornell Research Foundation, Inc. | Hypersensitive response elicitor from Erwinia chrysanthemi |
| AR008231A1 (es) * | 1996-06-13 | 1999-12-29 | Univ Michigan State | Una secuencia de acido nucleico aislada, un vector que la comprende, una celula de planta transgenica, una semilla de dicha planta y un metodo paradisminuir la transcripcion de una secuencia de adn en una planta transgenica |
| US6235974B1 (en) * | 1996-12-05 | 2001-05-22 | Cornell Research Foundation, Inc. | Hypersensitive response induced resistance in plants by seed treatment with a hypersensitive response elicitor |
| US6998515B1 (en) | 1997-01-27 | 2006-02-14 | Cornell Research Foundation, Inc. | Use of a nucleic acid encoding a hypersensitive response elicitor polypeptide to enhance growth in plants |
| US6277814B1 (en) | 1997-01-27 | 2001-08-21 | Cornell Research Foundation, Inc. | Enhancement of growth in plants |
| US5977060A (en) * | 1997-02-28 | 1999-11-02 | Cornell Research Foundation, Inc. | Insect control with a hypersensitive response elicitor |
| EP0996729A2 (en) | 1997-05-30 | 2000-05-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | Hypersensitive response elicitor fragments and uses thereof |
| US6262018B1 (en) | 1997-08-06 | 2001-07-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Hypersensitive response elicitor from Erwinia amylovora and its use |
| US6228644B1 (en) | 1997-08-06 | 2001-05-08 | Cornell Research Foundation, Inc. | Hypersensitive response elicitor from Erwinia amylovora, its use, and encoding gene |
| US6172184B1 (en) * | 1997-08-06 | 2001-01-09 | Cornell Research Foundation, Inc. | Hypersensitive response elicitor from Pseudomonas syringae and its use |
| US6333302B1 (en) | 1997-09-03 | 2001-12-25 | Cornell Research Foundation, Inc. | Use of hypersensitive response elicitor protein or polypeptide from Clavibacter michiganensis for disease resistance, growth enhancement and insect control |
| WO2000002996A2 (en) | 1998-07-10 | 2000-01-20 | Cornell Research Foundation, Inc. | Recombinant constructs and systems for secretion of proteins via type iii secretion systems |
| US6087558A (en) * | 1998-07-22 | 2000-07-11 | Prodigene, Inc. | Commercial production of proteases in plants |
| EP0987331A1 (en) * | 1998-09-01 | 2000-03-22 | Hoechst Schering AgrEvo GmbH | Plant pathogenicity control by use of a pathogen inducible expression of deac gene |
| US6858707B1 (en) | 1998-10-05 | 2005-02-22 | Eden Bioscience Corporation | Hypersensitive response elicitor fragments which are active but do not elicit a hypersensitive response |
| US6960705B2 (en) | 1998-10-05 | 2005-11-01 | Eden Bioscience Corporation | Nucleic acid encoding a hypersensitive response elicitor from Xanthomonas campestris |
| US6624139B1 (en) * | 1998-11-05 | 2003-09-23 | Eden Bioscience Corporation | Hypersensitive response elicitor-induced stress resistance |
| US6018038A (en) * | 1999-01-04 | 2000-01-25 | Korea Kumho Petrochemical Co., Ltd. | Incompatible plant and pathogen interaction related gene |
| US6734401B2 (en) | 2000-06-28 | 2004-05-11 | 3M Innovative Properties Company | Enhanced sample processing devices, systems and methods |
| KR20090105934A (ko) * | 2006-12-22 | 2009-10-07 | 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니 | 향상된 샘플 처리 장치, 시스템 및 방법 |
| AU2007336774A1 (en) * | 2006-12-22 | 2008-07-03 | 3M Innovative Properties Company | Thermal transfer methods and structures for microfluidic systems |
| US9168523B2 (en) | 2011-05-18 | 2015-10-27 | 3M Innovative Properties Company | Systems and methods for detecting the presence of a selected volume of material in a sample processing device |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8800725A (nl) * | 1988-03-23 | 1989-10-16 | Mogen International N V En Rij | Recombinant dna; getransformeerde microorganismen, plantecellen en planten; werkwijze voor het produceren van een polypeptide of eiwit m.b.v. planten of plantecellen; werkwijze voor het produceren van planten met virusresistentie. |
| US5312912A (en) * | 1989-06-13 | 1994-05-17 | Hadwiger Lee A | Procedures and regulatory DNA sequences for genetically engineering disease resistance and other inducible traits in plants |
| JP2500321B2 (ja) * | 1990-04-06 | 1996-05-29 | 農林水産省農業生物資源研究所長 | 新規なｄｎａ鎖 |
-
1994
- 1994-02-21 EP EP94810104A patent/EP0612848A3/xx not_active Withdrawn
- 1994-02-22 CZ CZ94404A patent/CZ40494A3/cs unknown
- 1994-02-22 CA CA002116202A patent/CA2116202A1/en not_active Abandoned
- 1994-02-22 SK SK206-94A patent/SK20694A3/sk unknown
- 1994-02-22 IL IL10872894A patent/IL108728A0/xx unknown
- 1994-02-22 AU AU56311/94A patent/AU682674B2/en not_active Ceased
- 1994-02-22 PL PL94302320A patent/PL177329B1/pl unknown
- 1994-02-22 KR KR1019940003100A patent/KR940019860A/ko not_active Abandoned
- 1994-02-23 JP JP6025205A patent/JPH06319558A/ja active Pending
- 1994-02-23 US US08/202,054 patent/US5550228A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-02-23 HU HU9400527A patent/HUT69614A/hu unknown
- 1994-02-24 ZA ZA941281A patent/ZA941281B/xx unknown
-
1995
- 1995-05-18 US US08/446,923 patent/US5552527A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL108728A0 (en) | 1994-05-30 |
| CA2116202A1 (en) | 1994-08-25 |
| HUT69614A (en) | 1995-09-28 |
| US5550228A (en) | 1996-08-27 |
| EP0612848A2 (en) | 1994-08-31 |
| HU9400527D0 (en) | 1994-05-30 |
| AU5631194A (en) | 1994-09-01 |
| KR940019860A (ko) | 1994-09-15 |
| EP0612848A3 (fr) | 1995-05-24 |
| AU682674B2 (en) | 1997-10-16 |
| PL302320A1 (en) | 1994-09-05 |
| CZ40494A3 (en) | 1995-07-12 |
| ZA941281B (en) | 1995-08-24 |
| JPH06319558A (ja) | 1994-11-22 |
| US5552527A (en) | 1996-09-03 |
| SK20694A3 (en) | 1995-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL177329B1 (pl) | Zrekombinowana sekwencja DNA, wektor obejmujący zrekombinowaną sekwencję DNA, białka otrzymane przez ekspresję zrekombinowanej sekwencji DNA oraz komórka mikroorganizmu lub komórka roślinna lub protoplast stransformowane zrekombinowaną sekwencją DNA | |
| Samac et al. | Developmental and pathogen-induced activation of the Arabidopsis acidic chitinase promoter | |
| Walter et al. | Bean ribonuclease‐like pathogenesis‐related protein genes (Ypr10) display complex patterns of developmental, dark‐induced and exogenous‐stimulus‐dependent expression | |
| RU2130491C1 (ru) | Фрагмент днк (варианты), слитый фрагмент днк для экспрессии в растениях и способ получения трансгенного растения и его потомков | |
| AU720780B2 (en) | Pathogen-induced plant promoters | |
| US6175060B1 (en) | Phosphate-deficiency inducible promoter | |
| JPH11505423A (ja) | 転写調節配列および方法 | |
| JPH09503652A (ja) | Ｈｍｇ２プロモーター発現系ならびに植物および植物細胞培養物における遺伝子産物の収穫後生産 | |
| US7772462B2 (en) | Recessive plant viral resistance results from mutations in translation initiation factor eIF4E | |
| Lasserre et al. | Differential activation of two ACC oxidase gene promoters from melon during plant development and in response to pathogen attack | |
| CN100535118C (zh) | 百草枯抗性基因及维管束和毛状体特异性启动子 | |
| JPH03112488A (ja) | 調節ｄｎａ配列 | |
| US6841720B1 (en) | Inducible promoters | |
| AU5379699A (en) | Gene switch | |
| US6441273B1 (en) | Constitutive and inducible promoters from coffee plants | |
| US6225527B1 (en) | Plant pathogen resistance genes and uses thereof | |
| JP5173847B2 (ja) | 耐病性植物 | |
| US6903247B2 (en) | Constitutive α-Tubulin promoter from coffee plants and uses thereof | |
| EP1414953B1 (en) | Identification and cloning of the receptor gene for symbiotic nitrogen fixation | |
| EP1092034A2 (en) | Inducible promoters | |
| JP4366496B2 (ja) | 病原体感染初期に誘導されるイネペルオキシダーゼ遺伝子 | |
| US20040172685A1 (en) | Method of using MAPK4 and orthologues thereof to control plant disease resistance and plant growth | |
| Zhao | Structure and regulation of 4-coumarate: CoA ligase genes in rice (Oryza sativa) | |
| CZ20004746A3 (cs) | Indukovatelné promotory |