PL178003B1 - Sposób wykrywania in vitro obecności lub ilości rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB, sposób oceny predyspozycji do wystąpienia zakrzepu i zestaw do wykrywania in vitro obecności lub ilości rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB - Google Patents

Abstract

1. Sposób wykrywania in vitro obecnosci lub ilosci rozpuszczalnych sieciowanych po- limerów fibiyny DesAABB i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny w próbce plynów ustrojowych pobranej od ssaka, znamienny tym, ze kontaktuje sie próbke plynów ustrojowych ze znakowanym przeciwcialem monoklonalnym MH1 wytwarzanym przez hy- brydome ATCC HB 9739 lub przeciwcialem, które wiaze sie z tym samym epitopem co mono- klonalne przeciwcialo MH1, lub z immunoreaktywnym fragmentem tego przeciwciala, do wytworzenia z nim immunokompleksu i wykrywa sie obecnosc lub oznacza sie ilosc tego immunokompleksu w dwumiejscowych testach sandwiczowych lub jednomiejscowej próbie immunologicznej w badaniach wiazania typu niekompetytywnego lub kompetytywnego i wykrywa sie obecnosc lub oznacza ilosciowo ten rozpuszczalny sieciowany polimer fibryny DesAABB i rozpuszczalny niesieciowany polimer fibryny DesAABB w próbce. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazkujest sposób wykrywania in vitro obecności lub ilości rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB, sposób oceny predyspozycji do wystąpienia zakrzepu i zestaw do wykrywania in vitro obecności lub ilości rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny. Otrzymane z immunizowanego zwierzęcia wolnego od zarazków, monoklonalne i poliklonalne przeciwciała specyficzne wobec fibryny stosowane są do klinicznej diagnostyki in vitro i in vivo oraz terapii.

Kohler i Milstem są zwykle uważani za twórców technik, które pozwoliły na wytworzenie z sukcesem pierwszych wytwarzających monoklonalne przeciwciała hybrydom (G. Kohler i C. Milstein, 1975,Naturę 256,495-497; 1976, Eur. J. Immunol. 6,511-519). Poddając fuzji wytwarzające przeciwciała komórki (limfocyty B śledziony) z komórkami szpiczaka (złośliwe komórki pierwotnych nowotworów szpiku kostnego) wytworzyli oni hybrydową linię komórek, powstającą z pojedynczej hybrydowej komórki fuzyjnej (nazywanej hybrydomąlub klonem). Hybrydoma dziedziczyła pewne cechy linii limfocytów i szpiczaka. Podobnie jak limfocyty, hybrydoma wydzielała jeden rodzaj immunoglobuliny, a ponadto, tak jak szpiczak, hybrydoma wykazywała potencjał nieograniczonego podziału komórkowego. Połączenie tych dwu cech dało wyraźne korzyści w porównaniu z konwencjonalnymi surowicami odpornościowymi.

Surowice odpornościowe pochodzące ze szczepionych zwierząt są różnymi mieszaninami poliklonalnych przeciwciał, które nigdy nie poddają się identycznej reprodukcji. Monoklonalne przeciwciała są silnie specyficznymi immunoglobulinami pojedynczego typu. Pojedynczy typ immunoglobuliny wydzielany przez hybrydomę jest specyficzny wobec jednego i tylko jednego determinantu antygenowego lub epitopu na antygenie, kompleksowej cząsteczce mającej wiele determinantów antygenowych. Np. jeśli antygen jest białkiem, determinant antygenowy może być jednąz wielu sekwencji peptydów (zwykle 6-7 aminokwasów długości; M. Z. Atassi, 1980, Molec. Cell. Biochem. 32, 21-43) wewnątrz całej cząsteczki białka. Wobec tego monoklonalne przeciwciała powstałe w stosunku do pojedynczego antygenu mogą różnić się od siebie w zależności od determinantu wywołującego ich powstawanie; jednak na danej hybrydomie wszystkie powstające przeciwciała są identyczne. Ponadto hybrydomowąbnię komórek rozmnaża się łatwo m vitro lub in vivo, a monoklonalne przeciwciała otrzymuje się w wyjątkowo wysokim stężeniu.

Monoklonalne przeciwciało można wykorzystywać jako sondę do wykrywania jego antygenu. Tak więc monoklonalne przeciwciała stosowano w diagnostyce in vitro, np. testach radiolmmunologicznych i testach immunologicznych związanych z enzymami (ELISA), oraz w diagnostyce in vivo, np. obrazowaniu in vivo, przy pomocy znaczonego radioaktywnie monoklonalnego przeciwciała. Ponadto monoklonalne przeciwciało można wykorzystywać jako nośnik dla leku dostarczanego do antygenu tego przeciwciała.

Jednak przed wykorzystaniem w taki sposób monoklonalnego przeciwciała należy zapewnić, aby przeciwciało to mogło wiązać żądany antygen, to jest antygen docelowy. Procedurę tę prowadzi się przesiewając hybrydomy w celu stwierdzenia, które z nich wytwarzająmonoklonalne przeciwciało, zdolne do wiązania docelowego antygenu. Procedura przesiewania może być bardzo żmudna, ponieważ bardzo wiele, może nawet kilka tysięcy, monoklonalnych przeciwciał należy odsiać przed zidentyfikowaniem hybrydomy wytwarzającej przeciwciało, zdolne do wiązania docelowego antygenu. Tak więc istnieje zapotrzebowanie na sposób wytwarzania monoklonalnych przeciwciał, zwiększający prawdopodobieństwo powstania hybrydomy wytwarzającej przeciwciało wobec docelowego antygenu, a także na specyficzne wykrywanie polimerów fibryny, przy pomocy takiego monoklonalnego przeciwciała.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania in vitro obecności lub ilości rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny w próbce pobranej od ssaka, polegający na tym, że kontaktuje się próbkę płynów ustrojowych ze znakowanym przeciwciałem monoklonalnym MH1 wytwarzanym przez hybrydomę ATCC HB 9739 lub przeciwciałem, które wiąże się z tym samym epitopem co monoklonalne przeciwciało MH1, lub z immunoreaktywnym fragmentem tego przeciwciała, do wytworzenia z mm immunokompleksu i wykrywa się obecność lub oznacza się ilość tego immunokompleksu w dwu178 003 miejscowych testach sandwiczowych lub jednomiejscowej próbie immunologicznej w badaniach wiązania typu niekompetytywnego lub kompetytywnego i wykrywa się obecność lub oznacza ilościowo ten rozpuszczalny sieciowany polimer fibryny DesAABB i rozpuszczalny niesieciowany polimer fibryny DesAABB w próbce.

Korzystnie w sposobie według wynalazku przciwciało specyficznie wiąże się z epitopem rozpoznawanym przez monoklonalne przeciwciało wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9740. Jeszcze bardziej korzystnie jako przeciwciało stosuje się przeciwciało oznaczone MH1 wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9739. Jako próbkę płynów ustrojowych pobraną od ssaka,w sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się próbkę pobraną od człowieka, a bardziej korzystnie jako płyn ustrojowy stosuje się krew.

W kolejnym korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku immunokompleks wykrywa się lub oznacza ilościowo stosując drugie przeciwciało lub immunoreaktywny jego fragment wiążące się specyficznie z immunokompleksem, przy czym drugie przeciwciało lub immunoreaktywny jego fragment są znaczone cząsteczką zgłaszającą. Bardziej korzystnie jako drugie przeciwciało stosuje się przeciwciało wiążące się z epitopem rozpoznawanym przez monoklonalne przeciwciało oznaczone 45 J,wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9740, oraz ewentualnie jako drugie przeciwciało stosuje się przeciwciało oznaczone 45 J,wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9740.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób oceny predyspozycji do wystąpienia zakrzepu, podtrzymywania diagnozy wystąpienia zakrzepu lub monitorowania tworzenia się zakrzepu u ssaka, w oparciu o wykrywanie ilości rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB w próbce płynów ustrojowych pobranej od ssaka, polegający na tym, że kontaktuje się próbkę płynów ustrojowych z przeciwciałem monoklonalnym MH1 wytwarzanym przez hybrydomę ATCC 9739, lub przeciwciałem, które wiąże się do tego samego epitopu co monoklonalne przeciwciało MH1 lub jego immunoreaktywnym fragmentem do wytworzenia z nim immunokompleksu, wykrywa się ilość immunokompleksu w dwumiejscowej próbie sandwiczowej lub jednomiejscowej próbie immunologicznej w badaniach wiązania typu niekompetytywnego lub kompetytywnego, a następnie porównuje się tę ilość rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB z próbką kontrolną płynów ustrojowych od zdrowego ssaka w połączeniu z klinicznym diagnozowaniem i ocenia się predyspozycję do wystąpienia zakrzepu lub wystąpienia zakrzepu, lub monitoruje się tworzenie się zakrzepu u ssaka.

Korzystnie w sposobie tym przeciwciało specyficznie wiąże się z epitopem rozpoznawanym przez monoklonalne przeciwciało oznaczone MH1,wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9739. Bardziej korzystnie jako przeciwciało stosuje się przeciwciało oznaczone MH1,wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9739. W sposobie według wynalazku jako sytuację zakrzepową uznaje się wystąpienie zawału mięśnia sercowego, zakrzepicy głębokiej żyły, zatoru tętnicy płucnej, rozproszoną koagulację naczyniową, udar i wewnątrzsercowy skrzep jako wynik migotania przedsionków.

W sposobie oceny predyspozycji do wystąpienia zakrzepu jako próbkę płynów ustrojowych pobraną od ssaka korzystnie stosuje się próbkę pobraną od człowieka, lub bardziej korzystnie jako płyn ustrojowy stosuje się krew.

Immunokompleks wykrywa się stosując drugie przeciwciało lub immunoreaktywny jego fragment wiążące się specyficznie z immunokompleksem, przy czym drugie przeciwciało lub immunoreaktywny jego fragment są znaczone cząsteczką zgłaszającą.

Korzystnie jako drugie przeciwciało stosuje się przeciwciało wiążące się z epitopem rozpoznawanym przez monoklonalne przeciwciało oznaczone 45J,wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9740, a jeszcze bardziej korzystnie jako drugie przeciwciało stosuje się przeciwciało oznaczone 45J,wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9740.

Przedmiotem wynalazku jest także zestaw do wykrywania in vitro obecności lub ilości rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB i rozpuszczalnych niesiecio6

178 003 wanych polimerów fibryny DesAABB w próbce pobranej od ssaka, charakteryzujący się tym, że zawiera (a) odmierzone ilości wzorców zawierających rozpuszczalne sieciowane polimery fibryny DesAABB i rozpuszczalne niesieciowane polimery fibryny DesAABB; (b) jako środek do tworzenia immunokompleksu z rozpuszczalnymi sieciowanymi polimerami fibryny DesAABB i rozpuszczalnymi niesieciowanymi polimerami fibryny DesAABB pojemnik z unieruchomionym przeciwciałem monoklonalnym MH1, wytwarzanym przez hybrydomę ATCC HB 9739 lub przeciwciałem, które wiąże się do tego samego epitopu co monoklonalne przeciwciało MH1 lub immunoreaktywnym fragmentem tego przeciwciała i znakowane przeciwciało generujące sygnał, oraz (c) środek do wykrywania ilości sygnału generowanego z tej próbki z próbką wzorcową.

W zestawie według wynalazku jako środek do tworzenia immunokompleksu korzystnie stosuje się przeciwciało lub immunoreaktywny jego fragment, który specyficznie wiąże się z epitopem rozpoznawanym przez monoklonalne przeciwciało oznaczone MH1, wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9739, lub również korzystnie jako przeciwciało stosuje się monoklonalne przeciwciało oznaczone MH1, wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9739.

Zestaw według wynalazku, korzystnie jako środek do wykrywania ilości immunokompleksu zawiera drugie przeciwciało lub immunoreaktywny jego fragment znaczone zgłaszającą cząsteczką wytwarzającą wykrywalny sygnał, który mierzy się i koreluje z zawartością immunokompleksu. W zestawie według wynalazku jako to drugie przeciwciało stosuje się przeciwciało wiążące się z epitopem rozpoznawanym przez monoklonalne przeciwciało oznaczone 45 J, wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9740, a bardziej korzystnie stosuje się przeciwciało oznaczone 45J, wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9740.

Zestaw według wynalazku korzystnie zawiera ponadto próbkę kontrolną do określania predyspozycji do zajścia sytuacji zakrzepowej, stwierdzania wystąpienia sytuacji zakrzepowej i obserwacji sytuacji zakrzepowej u ssaka.

Krótki opis rysunków

Figura 1(A). Określanie immunoreaktywności MH1 z monomerem fibrynowym DesAABB metodą chromatografii powinowactwa.

Figura 1 (B). Eksperyment kontrolny w celu potwierdzenia zdolności wiążącej matrycy Sepharose monomeru fibrynowego DesAABB z zastosowaniem specyficznego dla fibrynogenu przeciwciała 45J.

Figura 2. Immunoreaktywność niesieciowanych polimerów fibrynowych DesAABB i sieciowanych polimerów fibrynowych DesAABB w teście in vitro dla rozpuszczalnych polimerów fibrynowych DesAABB z zastosowaniem MH1.

Figura 3. Powstawanie fibryny DesAA przez działanie batroksobiinąna fibrynogen osocza.

Figura 4. Immunoreaktywność rozpuszczalnych polimerów fibrynowych DesAA w układzie do testu in vitro dla rozpuszczalnych polimerów fibrynowych DesAABB z zastosowaniem MH1.

Figura 5. Immunoreaktywność przeciwciała MH1 z aktywowanym fibrynogenem potraktowanym czynnikiem XIII (czynnik XI13a).

Figura 6. Pomiar procesu powstawania rozpuszczalnego polimeru fibrynowego DesAABB in vitro w teście dla rozpuszczalnej fibryny MH1.

Figura 7. Pokaz oczyszczania rozpuszczalnej fibryny od osocza z wykorzystaniem kolumny Sepharose-MHI.

Figura 8. Pomiar poziomu rozpuszczalnych polimerów fibrynowych DesAABB w krwi pacjentów z bólami piersiowymi i potwierdzonym stanem zawału mięśnia sercowego.

Do przygotowania monoklonalnych przeciwciał wykorzystano zwierzęta wolne od zarazków. Wolne od zarazków zwierzęta wyhodowano w końcu XIX wieku i intensywnie wykorzystywano od tego czasu.

Wolne od zarazków zwierzę to gatunek nie wykazujący obecności wszystkich związanych form życia, w tym bakterii, wirusów, grzybów, pierwotniaków i innych saprofitycznych lub pasożytniczych form. Wolne od zarazków jest zwierzę lub szczep otrzymany przez aseptyczne

178 003 cesarskie cięcie lub sterylne wylęganie z jaj i ciągłe zachowywanie technikami bezzarazkowymi w izolowanych warunkach, w którym skład związanej fauny i flory, jeśli występują, wynika w pełni z akceptowanej bieżącej metodologii (należy zauważyć, że wszystkie myszy niosąlatentny wirus leukemogenny, a więc wolne od zarazków poza tym wirusem myszy należy uważać za wolne od zarazków dla potrzeb wynalazku).

Istotą układu wolnego od zarazków jest istnienie barier wobec inwazji niechcianych mikroorganizmów. Poza fizycznymi barierami z tworzywa, metalu, gumy i szkła, zamykającymi zwierzęta, układ wymaga operacyjnych barier filtracji powietrza, sterylizacji pokarmu i wody, manipulacji w rękawiczkach, tworzących integralną część układu barier. Dostarczanie zapasów do układu powinno przebiegać w sterylnych warunkach.

Uważa się, że w wynalazku można wykorzystywać dowolne zwierzę wolne od zarazków. Najczęściej spotykane zwierzęta wolne od zarazków to myszy, świnie, szczury, króliki, świnki morskie, kozy, owce, naczelne i drób, a korzystne to myszy, szczególnie mysz Balb/C.

Istnieje wiele publikacji związanych z wytwarzaniem, opieką i utrzymaniem wolnych od zarazków zwierząt. Są to np. wyd. Wostmann, B.S., Gnotobiotes: Standards and Guidelines for the Breeding, Care and Management of Laboratory Animals, National Research Council, National Academy of Sciences, Washington, D.C. 1970; Coates, M.E., i in., The Germ-free Animal in Research, Academic Press, London, 1968; orazPleasants, J.R., Gnotobiotics, w Handbook of Laboratory Animal Science, tom 1, wyd. Melby, E.C., i in., CRC Press, Boca Raton, Fla., 117 (1974), dołączane niniejszym jako odnośniki literaturowe.

Poniżej podano podsumowanie pochodzące z artykułu wydanego przez Wostmanna, B.S. (1970) Gnotobiotes Standards and Guidelines for the Breeding, Cara and Management of Laboratory Animals, National Research Council, National Academy of Sciences, Washington, D.C. opisującego wytwarzanie, opiekę i utrzymanie wolnych od zarazków szczurów i myszy. Należy zauważyć, że wytwarzanie, opieka i utrzymanie jest podobne dla innych zwierząt.

Pomieszczenie, wyposażenie i procedury hodowlane można zaprojektować i prowadzić w taki sposób, aby osiągnąć maksymalną kontrolę środowiskową! optymalny komfort i dobre warunki dla zwierząt. Klatki, karmniki i pojniki powinny być zaprojektowane i wytworzone tak, aby były jak najwygodniejsze dla zwierząt, woda i pokarm łatwo osiągalne, a oczyszczanie i sterylizacja łatwa i skuteczna.

Pożądany plan pomieszczenia dla szeroko zakrojonych prac, w warunkach wolnych od zarazków, powinien się składać z:

1. powierzchni roboczej do składania i sterylizacji izolatek,

2. powierzchni do przechowywania izolatek ze zwierzętami, oraz

3. powierzchni laboratoryjnej do rutynowej obserwacji środowiska bezzarazkowego.

W skład tej powierzchni może wchodzić część biurowa i przygotowania pokarmu.

Otoczenie pomieszczenia do przechowywania izolatek powinno spełniać standardy ustalone dla hodowli konwencjonalnych laboratoryjnych gryzoni. Struktura powinna być odporna na owady, a ścianki i podłoga na wilgoć. Oświetlenie powinno być jednorodne, z takim samym cyklem dnia i nocy w ciągu roku. Wentylacja powinna móc usunąć dowolne opary związane z chemiczną sterylizacją, a warunki klimatyczne powinny być kontrolowane w poniżej opisany sposób.

Temperatura. Ogólnie akceptowana temperatura pokojowa dla zwierząt 21-27°C (70-80°F) może być obniżona do temperatury izolatki od 22 do 26°C (72 do 78°F).

Wilgotność. Względna wilgotność (RH) powinna mieścić się w warunkach ludzkiego komfortu, 40-60%. Jednak przy stosowaniu powietrza atmosferycznego do wietrzenia izolatki wskazana jest RH 40-50%.

Wentylacja. Wymiana powietrza w pomieszczeniu powinna zapewniać szybkie usunięcia wszelkich oporów związanych z chemiczną sterylizacją. Wskazane jest 2 do 15 wymian powietrza na godzinę. Powinny być dostępne maski na twarz z wentylacją świeżym powietrzem, w celu chronienia personelu przed działaniem niebezpiecznych ilości oparów chemicznych.

178 003

Wyposażenie bezzarazkowe (patrz Sacquiet, E. 1968, Equipment design i management: General technique of maintaining germ-free animals, str. 1-22 w M.E. Coates (wyd.), The germfree animal in research, Academic Press, London; Trexler, P.C. 1968, Equipment design and management: Transport of germ-free animals and current developments m equipment design, str. 23-35 w M.E. Coates (wyd.), The germ-free animal in research, Academic Press, London).

Całkowite wykluczenie mikroorganizmów ze środowiska wymaga bariery absolutnej. Dobre działanie izolatki zależy od zachowania tej bariery przez cały czas. Istnieją dwa ogólne typy dostępnych izolatek, metalowe i plastykowe. Niektóre jednostki metalowe mogą znosić wewnętrzne ciśnienie pary wodnej 20 psi (1406 g/cm²) (patrz Reyniers, J. A. 1959, Design and operation of apparatus for rearing germ-free animals, Ann. N.Y. Acad. Sci. 78:47; Miyakawa, M. 1959, The Miyakawa remote-control germ-free rearing unit. Ann. N.Y. Acad. Sci. 78:37).

Inne zwykle umieszcza się w dużym autoklawie dla wstępnej sterylizacji (patrz Gustafsson, B.E. 1959, Lightweight stainless steel systems for rearing germ-free animals, Ann. N.Y. Acad. Sci. 78:17).

Izolatka z elastycznej folii (patrz Trexler, P C., i L.I. Reynolds. 1957, Flexible film apparatus for the rearing and use of germ-free animals. Appl. Microbiol. 5:406) jest obecnie najczęściej stosowaną jednostką. Zwykle wykonuje się ją z elastycznego laminowanego winylu, musi się ją chemicznie sterylizować i łatwo adaptuje się jądo konkretnych potrzeb. Inny typ, wykonywany z dużej rury nylonowej, zawiązanej na każdym końcu, można sterylizować w autoklawie (patrz Lev, M. 1962, An autoclavable plastic unit for rearing animals under germ-free conditions, J. Appl. Bacteriol. 25:30). Opracowano także izolatki z pleksiglasu i jednorazowe izolatki z elastycznej folii. Wiele z nich ma przejrzystość dostateczną do tego, aby ustawiać je na sobie po dwie lub trzy, co zaoszczędza powierzchnię podłogi.

Przy izolatkach wrażliwych na ciepło stosuje się zwykle specjalny cylinder do sterylizacji pokarmu i innych podawanych substancji. Powinno się go projektować z dużą powierzchnią filtracyjnądla ułatwienia usuwania powietrza z wysokopróżniowego autoklawu (patrz Trexler, P.C. 1963, An isolator system for control ofcontamination. Lab. Anim. Care, 13:572). Alternatywnie, cylmder może być wyposażony w rurkę otwartą do atmosfery, w celu usuwania powietrza i kondensacji w czasie sterylizacji bez stosowania niskiego ciśnienia (patrz Jaworski, N.E., i C.E. Miller, 1963, Refinement of the cylinder technique for supplymg germ-free isolators. Lab. Anim. Care. 13:591).

Sterylizacja. Cały sprzęt, pokarm, wyściółka, woda i powietrze stosowane w izolatce musi być całkowicie sterylne. Sposoby i warunki stosowane tutaj są uzależnione od charakterystyki poszczególnych elementów.

Para wodna pod ciśnieniem jest najlepiej znanym sposobem sterylizacji. Jest ona szczególnie przydatna w przypadku porowatych elementów, odpornych na ogrzewanie. Każdą powierzchnię, która może nieść na sobie mikroorganizmy, należy zetknąć bezpośrednio z parą wodną. Czas wystawiania na działanie pary jest związany ze stosowana temperaturą. Wskazane jest, aby najgorzej dostępna część ładunku (środkowa część elementów) była wystawiona na działanie przez minimalny okres 15 minut temperatury 121°C (250°F). Wyższe temperatury i krótsze czasy wystawiania mogą być przydatne po starannych testach zapewniających sterylność. Standardowe rozmiary i gęstość pokarmu, wyściółki i innych substancji mają podstawowe znaczenie dla zapewnienia stałego i możliwego do przewidzenia czasu penetracji pary wodnej.

Stosowano suche ciepło do sterylizacji powietrza dostarczanego do izolatki (patrz Miyakawa, M. 1959, The Miyakawa remote-control germ-free rearing unit. Ann. N.Y. Acad. Sci. 78:37; Gustafsson, B.E. 1959, Lightweight stainless steel systems for rearing germ-free animals. Ann. N.Y. Acad. Sci. 78:17).

Kwas nadtlenooctowy (CH₃COOOH) jest szeroko stosowany w przypadku wrażliwych na ciepło, nieporowatych substancji, szczególnie jednostek z elastycznej folii. Kwas ten stosuje się w roztworze 2% ze środkiem zwilżającym (detergentem) (patrz Trexler, P. C., i L. I. Reynolds, 1957, Flexible film apparatus for the rearing and use of germ-free animals. Appl. Microbiol. 5:406). W specjalnych sytuacjach można stosować inne związki chemiczne, np. podchloryny, jodo178 003 fory lub czwartorzędowe związki amoniowe w pułapce cieczowej w celu wprowadzania noworodków otrzymanych przez wycięcie macicy, lub HgCl₂ w celu wprowadzania jaj w warunkach sterylnych przed wylęganiem. ,

Do sterylizacji niezwilżalnych wrażliwych na ciepło elementów można stosować tlenek etylenu (ETO). Czas sterylizacji zależy od temperatury, wilgotności, ciśnienia i stężenia ETO. eTo może reagować chemicznie z wyściółkąi składnikami pokarmu, tworząc toksyczne lub niepożądane związki. Ze względu na palność i zagrożenie toksyczne zwykłe stosowanie ETO do sterylizacji powinno być ograniczone do dostępnych w handlu mieszanin gazowych, zawierających nie więcej niż 20% ETO.

Filtry z włókna szklanego stosuje się zwykle do sterylizacji dostarczanego powietrza.

Można stosować przeponową filtrację cieczy w celu uniknięcia działania ciepła, jeśli tylko membrany są filtrami absolutnymi, np. filtrami oddzielającymi cząstki o średnicy mniejszej niż 0,22 pm.

Do sterylizacji pokarmu lub innych specjalnych składników można stosować naświetlanie promieniami gamma lub elektronami. Dawki wahają się od 2,5 do 6 x 10⁶ rad.

Środowisko wewnętrzne

Temperatura. Temperatura wnętrza izolatki jest funkcją temperatury pomieszczenia i powinna wynosić od 22 do 26°C (72 - 78°F).

Wdgotność. W izolatce zachodzi skraplanie wody w przypadku przeładowania, nieodpowiedniej wentylacji lub z obu tych powodów. Powietrze wchodzące do izolatora powinno mieć RH niższą niż 50%, a korzystnie wyższą niż 40%.

Dostawa powietrza. Powietrze w izolatorze powinno się zmieniać 12 do 20 razy na godzinę i mieć nadwyżkę ciśnienia 8-13 cm słupa wody. Powietrze można dostarczać z centralnego źródła lub indywidualnych dmuchaw dla każdej jednostki. Zalecane jest stosowanie turbinowego kompresora w układzie centralnego dostarczania powietrza, ponieważ sprężarka tłokowa ma skłonność do atomizacji oleju w liniach zasilających.

Izolator z dyfuzjąpowietrza (patrz Trexler, P. C. 1968, Equipment design and management: Transport of germ-free animals and current developments in equipment design, str. 23-25 w M.E. Coates (wyd.), The germ-free animal in research, Academic Press, London) nie traci funkcji wentylacyjnej w przypadku zaniku zasilania. Jednak ten typ jest niekorzystny ze względu na mniejszą ilość wymian powietrza na godzinę i brak ochronnego podwyższonego ciśnienia, zapobiegającego zanieczyszczeniu w razie powstania przerw w barierze.

Miary bezpieczeństwa.. Należy przewidzieć zabezpieczenia w celu zachowania ciśnienia powietrza w izolatce w razie utraty napięcia lub awarii mechanicznej, zapewniające nie więcej niż kilka minut przerwy w dostawie powietrza. Zapadnięcie się niepodpartych izolatek foliowych może w końcu doprowadzić do zaduszenia zwierząt, ale bezpośrednie niebezpieczeństwo tkwi w tym, że zwierzęta mogąuszkodzić folię lub rękawice. Można temu tymczasowo zapobiec zatykając przewody powietrzne gumowymi korkami. Działanie dostawy powietrza pojedynczej izolatki wymaga tylko awaryjnego zasilania. Centralny układ napowietrzania powinien zawierać drugą sprężarkę turbinową do rezerwowego zasilania powietrzem.

Wskazana jest graficzna rejestracja temperatury i ciśnienia. Audiowizualny układ alarmowy powinien być zawarty w centralnym układzie powietrznym i uruchamiać się przy spadku ciśnienia wskutek utraty zasilania lub awarii mechanicznej. Dla indywidualnych układów powietrznych izolatek wskazane jest ciągłe graficzne monitorowanie otoczenia pokojowego.

Klatki i wyposażenie wnętrza

Wyposażenie. Podstawowa lista wyposażenia dla izolatek może obejmować klatki z pokrywkami zabezpieczającymi, pojemniki na wodę i podajniki pokarmu, ochronne rękawice tkaninowe na rękawice gumowe, dodatkowe uszczelnienie drzwi lub zamknięcie pierścieniowe pokrywy, długa pinceta z końcami gumowymi, hemostaty, nożyczki, ręcznik, gąbki gazowe, dwukwadratowe naczynie do instrumentów, przykrywane czterokwadratowe naczynie na pokarm, łyżeczki, probówki na kultury, torby papierowe i odporne na wilgoć torby na zużytą podściółkę.

178 003

Klatki powinny być wytwarzane z gładkiego, odpornego na korozję materiału. Powinny być nieprzepuszczalne dla cieczy i łatwe do sterylizacji. Nadające się materiały obejmują tworzywa sztuczne, stal nierdzewną i szkło. Galwanizowane metale korodują i nie są zalecane ze względu na wpływ zanieczyszczeń na wyniki doświadczeń.

Wymiary klatki sązwykle ograniczane przez rozmiary wlotu. Minimalna powierzchnia dla samicy myszy i odpadów wynosi 970 cm². W wielu przypadkach może być potrzebne więcej miejsca na zwierzę.

Tabela I podaje zalecaną przestrzeń podłogi dla myszy i szczurów, zgodnie z klasami wagowymi.

Tabela I

Ilość przestrzeni podłogowej zalecanej w klatce na mysz i szczura

Kategoria Liczba	Masa (g)	Przestrzeń na zwierzę (cm2)	Maksymalna populacja na klatkę
Myszy
1	do 10	40	40
2	10-15	50	30
3	15-25	75	20
4	ponad 25	95	16
Szczury
1	do 50	95	50
2	50-100	110	50
3	100-150	125	40
4	150-200	150	40
5	200-300	185	30
6	ponad 300	260	25

Zalecenia różne. Zaleca się testy freonowe do badania niewielkich przecieków, w celu stwierdzenia integralności bariery.

Każda jednostka powinna być wyposażona we własny dziennik pracy, w celu zachowania chronologicznego zapisu każdej procedury jednostki od złożenia i sterylizacji. Takie zapisy dogodnie jest trzymać w metalowych szpitalnych ramkach z numerem izolatki. Powinny one także zawierać notatki o rutynowych czynnościach, np. wymianie rękawic. Można w tych samych ramkach trzymać zapisy o rozmnażaniu.

Wskutek ograniczonej przestrzeni w izolatorach wskazane są papierowe, składane pojemniki na pokarm i wyściółkę oraz do transportowania zwierząt pomiędzy izolatkami połączonymi sterylnym przejściem.

We wnętrzu izolatki nie powinno się stosować eteru, ponieważ mógłby wybuchnąć w razie statycznego wyładowania. Jako lotny, niepalny środek znieczulający zaleca się fluotan (bromochlorotrifluoroetan).

Pokarm, wyściółka i woda

Zalecenia ogólne:. Powinno się zapewnić pełny skład dostępnych w handlu pokarmów, z wymienionymi wszystkimi składnikami i ich zawartościami, w tym konserwantami, antyutleniaczami i innymi dodatkami. Produkt powinien mieć wyraźnie oznaczoną datę produkcji. Wytwórca powinien gwarantować, że pokarm:

1. mieści siew normalnych l^t^j^i^sz^i^t^lnz^t^łi m^nicach, naturalnie wy stepując ej aktywnot ści hormonalnej;

178 003

2. jest pozbawiony dodatków zawierających narkotyki, hormony, antybiotyki lub inne substancje, mogące powodować wystąpienie nienormalnych stanów fizjologicznych lub wpływać na procedury badawcze;

3. jest pozbawiony salmonelli w losowo badanych próbkach;

4. jest pozbawiony zanieczyszczeń szczurzych i robactwa;

5. jest pozbawiony niewytopionych kawałków mięsa i ryby, mogących zawierać patogeny.

Wzmacnianie pokarmów. Pokarmy zwierząt wolnych od zarazków muszą zawierać więcej niż zwykłą ilość pewnych środków odżywczych, w celu skompensowania utraty witamin w czasie obróbki termicznej (szczególnie pewnych witamin B oraz A i D) i odżywczej wartości białek (zmniejszenie ilości dostępnej lizyny, metioniny, argininy i tryptofanu). Muszą też one dostarczać wymagane środki odżywcze, które u zwykłych zwierząt powstają w drodze mikrobowej syntezy w układzie pokarmowym (patrz Reddy, B.S., B.S. Wostmann, i J.R. Pleasants, 1968, Nutritionally adequate diets for germ-free animals, str. 87-111 w M.E. Coates (wyd.), The germ-free animal in research, Academic Press, London). Przykładem takiego pokarmu jest L-485, tani pokarm zbadany dość dokładnie (patrz Kellogg, T.F. i B.S. Wostmann, 1969, Rat and mouse stock diet L-485. Lab. Anim. Care) i nadający się do wytwarzania na skalę przemysłową (patrz tabela 2).

Uzupełnianie specyficznymi aminokwasami, a nie zwiększanie całkowitej zawartości białka, powinno być rozważone jako środek do zrównoważenia utraty jakości białek. Zwiększanie całkowitej zawartości białka w pokarmie spowoduje większe zużycie i wydzielanie wody, zwiększając wilgotność i ograniczając liczbę zwierząt hodowanych jednocześnie w izolatce o danych rozmiarach.

Tabela II

Skład pokarmu L-485 dla myszy i szczurów

Składnik	Ilość na kg
1	2
POKARM Zmielona żółta kukurydza	590 g
Pokarm z oleju sojowego (surowe białko 50%)	300
Pokarm z lucerny (odwodniona; 7% białka)	35
Olej kukurydziany (raz rafinowany)	30
NaCl	10
CaHPO4-2H2O	10
CaCO3	5
Lizyna (spożywcza)	5
Metionina (spożywcza)	5
B.H.T. (butylowany hydroksytoluen)	0,125
Śladowe pierwiastki	0,25
MIESZANKA WITAMINOWA A	26000IU
d3	1000 IU
E (octan tokoferolu)	225 mg
K3 (menadion)	90
Ryboflawina	30
Kwas pantotenowy	285
Niacyna	65
Chlorek choliny	2000
B]2 (0,1% utarty w mannitolu)	2

178 003 cd. tabeli II

1	2
Tiamina HC1	65
Pirydoksyna HC1	20
Kwas foliowy	10
Kwas paraaminobenzoesowy	50
MIESZANKA MINERAŁÓW ŚLADOWYCH
(handlowa)
Mn jako tlenek manganawy	65 mg
Fe jako węglan żelazawy	20
Cu jako tlenki miedzi	2
Zn jako tlenek cynku	15
I jako jodek wapnia	1,5
Co jako węglan kobaltu	0,6

Sterylizacja parą wodną (patrz Reddy, B.S., B.S. Wostmann i J.R. Pleasants, 1968, Nutritionally adequate diets for germ-free animals, str. 87-111 w M.E. Coates (wyd.), The germ-free animal in research, Academic Press, London).

Rzeczywiste procedury będą zależały od dostępnego sprzętu. Trzy czynniki sąogólnie ważne:

1. Ciśnienie presterylizacyjne, gdzie możliwe, wynoszące co najmniej 67,72 kPa, ułatwi penetrację pary wodnej w pokarmie w autoklawie lub cylindrze odpowietrzanym do atmosfery. Obniżone ciśnienie 94,75 kPa lub większe jest wskazane, jeśli cylinder z pokarmem nie jest odpowietrzany do atmosfery.

2. Stosowanie najkrótszej fazy sterylizacji zapewniającej całkowitą sterylność, z marginesem bezpieczeństwa dyktowanym przez sprzęt i umiejętności. Temperatury mierzone w wewnętrznym rdzeniu pokarmu powinny osiągać co najmniej 121°C (250°F). W tej temperaturze rzeczywista faza sterylizacji będzie trwała minimum 15 minut. Przy wyższych temperaturach sterylizacji czasy będą względnie krótsze.

3. Obniżone ciśnienie posterylizacyjne przyspieszy redukcję temperatury pokarmu. Pozwoli to uniknąć zbędnego cieplnego rozkładu pokarmu. Chociaż pewne straty pokarmu są nieuniknione, można uzyskać dopuszczalne wyniki manipulując:

(a) parametrami technicznymi takimi jak temperatura, czas niskiego ciśnienia presterylizacji i po sterylizacji, oraz rozmiar granulek, (b) zawartością wody w pokarmie. Wzrost zawartości wody prowadzi do szybszego odzyskiwania witamin B po sterylizacji (patrz Zimmerman, D.R., and B.S. Wostmann, 1963, Vitamin stability in diets sterilized for germ-free animals. J. Nutr. 79:318). Dla stałych pokarmów zalecana jest zawartość wody do 25%, lub tak wysoka, jak jest to kompatybilne z jakościąmagazynową pokarmu. Zmianie zawartości wody w pokarmie powinien towarzyszyć nowy test szybkości, z którą pokarm osiąga temperaturę sterylizacji.

Sterylizacja radiacyjna (patrz Reddy, B.S.,B.S. Wostmann, i J.R. Pleasants, 1968, Nutritionally adequate diets for germ-free animals, str. 87-111 w M.E. Coates (wyd.), The germ-free animal in research, Academic Press, London; Ley, F.J., Bleby, M.E. Coates, i J.S. Paterson 1969, Sterilization of laboratory animal diets using gamma radiation, Lab. Anim. 3:221).

Techniki i dozymetria będzie zależała od wyposażenia i rodzaju promieniowania. Chociaż zwykle sterylizacja radiacyjna jest uważana za mniej szkodliwą dla składników odżywczych, obecnie zaleca się sterylizację pokarmu parą wodną.

Test na sterylność. W celu obserwowania stery lności osiąganej dowolnym sposobem sterylizacji, zalecane jest stosowanie pasków zarodników Bacillus stearothermophilus. Paski powinny być wprowadzone do wnętrza pokarmu. Izolatka i jej zwierzęta powinny być okresowo

178 003 obserwowane pod względem mikrobiologicznym. Obserwacja taka jest konieczna, 'w celu stwierdzania przypadkowych zanieczyszczeń powstających w wyniku uszkodzeń bariery izolatki lub nieodpowiedniej sterylizacji izolatki lub jej zawartości. Można tego dokonywać w sposób, jaki opisuje Wostmann, B.S., wyd., Gnotobiotes: Standards and Guidelines for the Breeding Cara and Management of Laboratory Animais, National Research Council, National Academy of Sciences, Washington, D.C., 1970, str. 28-39.

Ocena utraty składników odżywczych w czasie sterylizacji ' Jako przydatny test na utratę ważnych składników odżywczych zaleca się określenie poziomu ekstrahowanej kwasem tiaminy, jako wskaźnika odzysku tiaminy dodanej do pokarmu (patrz Wostmann, B. S. i P.L. Knight, 1960, The effect ofmethyl alcohol on the conversion ofthiamine to thiochrome, Experientia 16:500). Odzyskanie mniej niż 25% wskazuje na poważne uszkodzenie ogólnej jakości odżywczej pokarmu. Przy stosowaniu odpowiedniego wyposażenia i zachowaniu ostrożności, można osiągnąć odzysk 50% lub większy.

. Przechowywanie stałego pokarmu. Ze względu na ogólnie wysoki koszt eksperymentów w warunkach bez zarazków należy dołożyć szczególnych starań, aby nie stosować pokarmu o znacznie zmniejszonej wartości odżywczej. Zaleca się, aby (a) niesterylizowany pokarm był przechowywany zawsze z chłodzeniem i nigdy dłużej niż przez miesiąc, oraz (b) czas przechowywania sterylizowanego pokarmu w izolatce powinien wynosić tydzień lub mniej, a nie może nigdy przekroczyć 10 dni.

Wyściółka. Wyściółkę powinno się zmieniać co najmniej raz tygodniowo. Wskazane jest, aby materiał wyściółki był łatwy do sterylizacji i nie był chętnie zjadany przez zwierzęta. Nie powinien wydzielać toksycznych związków w procedurze sterylizacji. Zalecane są bezpyłowe okruchy z białej sosny (trociny) i wióry. Dopuszczalne są wióry lipowe i topolowe lub pokruszone kolby kukurydzy. Nie poleca się produktów okrzemkowych, cedru, drewna żywicznego i drewna twardego. Nie należy stosować sterylizacji tlenkiem etylenu, jeśli nie wyjaśni się możliwego tworzenia szkodliwych związków.

Woda. Woda do picia musi być sterylizowana. Możnają sterylizować w autoklawie w kwadratowych butelkach, słoikach Masona lub zbiornikach umocowanych do jednostki. W każdym pojemniku należy pozostawić nieco powietrza.

Zasady rozmnażania cesarskiego wolnych od zarazków zwierząt. Powodzenie każdej operacji cesarskiej opiera się w części na pełnym zaawansowaniu ciąży. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku zwierząt o krótkim okresie ciąży, gdy płód może uzyskać 20% swojej masy w ciągu ostatnich 24 godzin przed rozwiązaniem. Odmierzone czasowo parzenie może przynieść sukces, ale w przypadku zwierząt o dużych miotach (szczury i myszy) może być pomocne odczekanie na wylęgnięcie się pierwszego potomstwa przed rozpoczęciem operacji. U świnek morskich najbardziej zadowalającym sposobem jest dobieranie samic do operacji według pomiaru rozstawu kości łonowych (patrz Philips, B.P., PA. Wolfe, i H.A. Gordon, 1959, Studies on rearing the guinea pig germ-free, Ann. N.Y. Acad. Sci. 78:183).

Młode otrzymane w wyniku muszą zostać umieszczone w środowisku wolnym od zarazków, zanim wciągną pierwszy oddech. Można je pobrać z matki bezpośrednio przez wycięcie macicy i przenieść przez nadciętą sterylną membranę bariery do sterylnego izolatora, lub też pobrać przez wycięcie macicy i przenieść przez pułapkę na zarazki do sterylnego izolatora. Zwykłe chirurgiczne przygotowanie samicy przed cesarskim cięciem obejmuje usunięcie owłosienia odwłokowego i oczyszczenie oraz dezynfekcję pola operacyjnego. Korzystnie znieczula się przemieszczając krąg szyjny u myszy i szczurów, chociaż można też stosować lokalne znieczulenie środkowej linii brzusznej lub znieczulenie ogólne, nie powodując poważniejszej depresji płodu i śmiertelności. U świnek morskich zabieg chirurgiczny prowadzi się zwykle po lekowym uspokojeniu i z miejscowym znieczuleniem.

Przenoszenie młodych metodą wycięcia macicy przez membranę bariery wymaga specjalnego wyposażenia izolatki. Zestaw chirurgiczny ze stali nierdzewnej Reyniersa (patrz Reyniers, J.A., 1965. Germ-free lite methodology (gnotobiotics) and experimental nutrition, str. 458-466, w Proc. 3rd Internat. Congr. Biochem., Bruxelles) zawiera wbudowanąmetalowąprzegrodę roz14

178 003 dzielającą górne i dolne pomieszczenie jednostki. Przegroda zawiera okrągłe przejście pokryte warstwą tworzywa mylarowego, w celu zachowania integralności górnego pomieszczenia. Samicę, przygotowaną do zabiegu, umieszcza-się w niższym pomieszczeniu z brzuchem dociśniętym do mylaru. Wszystkie instrumenty chirurgiczne znajdują się w górnym pomieszczeniu, a zabieg przeprowadza się w tej sterylnej przestrzeni. Nacięcie.prowadzi się przez tworzywo i skórę przy pomocy elektrokautera lub skalpela. Korzystnie do nacinania skóry stosuje się samosterylizowabie ostrze elektrokautera. Krawędzie skóry i mylaru spina się ze sobą i odwraca. Na brzuchu umieszcza się sterylną zasłonę, w celu przykrycia przeciętych krawędzi skóry i na odsłonięte powięzi nakłada się ciekły środek dezynfekujący (chlorek benzalkoniowy, 1:1000) przed otworzeniem jamy brzusznej. Należy za wszelka cenę uniknąć przecięcia jelita. Pomocne może być wprowadzenie pary kleszczy pomiędzy ścianę otrzewnej i wnętrzności. Następnie otwiera się macicę i usuwa młode. Błony płodowe usuwa się, pępowinę zaciska kleszczami i ucina. Młode łagodnie osusza się i masuje, w celu stymulowania oddychania. Następnie przenosi się je do jednostki hodowlanej do karmienia przez matkę lub z ręki. Można umocować następny arkusz mylaru i powtarzać operację z 5 lub 6 samicami, bez poważnego ryzyka zakażenia. Poród cesarski można też prowadzić, stosując jako jednostkę chirurgiczną plastykową izolatkę lub pojemnik zrękawicami. Zewnętrzną powierzchnię podłogi izolatki sterylizuje się wstępnie i stykaz brzuchem zwierzęcia, dzięki czemu służy temu samemu celowi, co opisany arkusz mylarowy. Po operacji szczelinę w plastykowej barierze można zamknąć sterylną taśmą i powtórzyć procedurę chirurgiczną na kolejnych ciężarnych samicach.

Poród młodych metodą wycięcia macicy stosuje się częściej w przypadku plastykowych izolatek (patrz Foster, H. 1959. A procedure for obtaining nucleus stock for a pathogen-free animal colony. Lab. Anim. Care 9:135). Macicę odsłania się aseptycznie i przymocowuje klamrą na zewnątrz szyjki. Wyciętą macicę przenosi się do wolnej od zarazków jednostki przez cieczową pułapkę na zarazki. Po umieszczeniu w izolatce, młode usuwa się jak najszybciej z macicy, aby zapobiec wdychaniu płynów płodowych. Zwykle młode osusza się i pozwala na oddychanie przed zaciśnięciem kleszczami i ucięciem pępowiny. Młode oddaje się potem mamce lub karmi z ręki.

Wycięcie macicy można z powodzeniem stosować na myszach, szczurach i świniach. U świnek morskich wycięcie macicy jest sposobem korzystnym, ponieważ występuje wysoka śmiertelność, jeśli miną dwie minuty pomiędzy odłączeniem od krwiobiegu matki, a porodem w izolatce.

Systemy hodowli wsobnych szczepów w koloniach wolnych od zarazków. Zwykły sposób parzenia braci z siostrami, stosowany w zwykłych hodowlach, może być także stosowany w koloniach wolnych od zarazków.

Rasy niewsobne. Prawdziwie losowe parzenie obejmuje także kojarzenie pomiędzy rodzeństwem i kuzynami pierwszego stopnia. Chociaż zwykle unika się takiego kojarzenia w niewsobnych koloniach, powstały system parzenia nie zmniejsza częstotliwości kojarzenia wsobnego w maksymalnym możliwym stopniu (patrz Falconer, D.C. 1967. Genetic aspects of breeding methods. str. 72-96 w The UFAQ handbook on the care and management of laboratory animals, wyd. 3, E and S Livingstone, Ltd., London; National Research Council, Institute for Laboratory Animal Resources. 1969. A guide to genetic standards for laboratory animals. National Academy of Sciences, Washinton, D.C.).

Porównywalne kolonie konwencjonalne i wolne od zarazków.. Jeśli konieczne jest utrzymywanie kolonii konwencjonalnych i wolnych od zarazków do celów porównawczych, ich podobną strukturę genetyczną można zapewnić przez wprowadzanie otrzymanego przez cesarskie cięcie przychówku ze skutecznie rozmnażającej się populacji konwencjonalnej kolonii do kolonii wolnej od zarazków. Jest to sposób z wyboru dla producentów, którzy kładą największy nacisk na wytwarzanie zwykłych (nie wolnych od zarazków) szczurów i myszy, ale ma wadę polegającąna zapobieganiu ustaleniu się układu mikroorganizmów', ułatwiającego monitorowanie mikrobiologiczne. W idealnym przypadku można tego dokonać, stosując przychówek konkretnych kojarzeń rasy konwencjonalnej hodowli i następne pokolenie z każdych z tych kojarzeń

178 003 jako rasy dającej wkład do kolonii wolnej od zarazków. Jeśli procedurę tę powtarza się co drugą lub trzecią generację, składy genetyczne obu kolonii pozostanąbardzo podobne, jeśli oczywiście w obu stosuje się ten sam system kojarzenia.

Alternatywnie potomstwo skutecznie kojarzonej populacji z kolonii wolnej od zarazków można stosować do ustalenia lub rozmnożenia konwencjonalnej kolonii. Konsekwencje genetyczne będą identyczne, jeśli stosuje się takie same procedury.

Notatki (patrz Wolff, G.L. 1967, Practical mating systems and record-keeping in a breeding colony, str. 97-113 w The UFAW handbook on the care and management of laboratory animals, wyd. 3, E. and S. Livingstone, Ltd., London).

Należy utrzymywać właściwe notatki na temat zwierząt i utrzymania izolatki. Notatki dotyczące zwierząt powinny określać skuteczność operacji i biologiczne zachowanie zwierząt. Notatki dotyczące izolatki powinny przechowywać chronologiczny zapis wydarzeń związanych z izolatorem, aby ułatwić lokalizację przerwania bariery w razie zakażenia.

Zwierzę wolne od antygenów. Wskazane jest, aby zwierzę wolne od zarazków było żywione pokarmem zdefiniowanym chemicznie (CD), o niskiej masie molekularnej, rozpuszczalnym w wodzie, poddanym ultrasączeniu. Sądzi się, że taki pokarm pozwala na osiągnięcie całkowitej kontroli poboru składników odżywczych i antygenów przez zwierzę. Pokarm taki zwykle sporządza się w całości ze składników zdolnych do zdefiniowania chemicznego, np. aminokwasów, prostych cukrów, lipidów, witamin i minerałów. Chemicznie zdefiniowana dieta składa się z aminokwasów, prostych cukrów, lipidów, witamin i minerałów, w tym nie zawiera składników o masie cząsteczkowej przekraczaj ącej około 10000 daltonów. Tak więc, wszystkie składniki pokarmu CD mają niską masę cząsteczkową i są naturalnie cyrkulującymi składnikami odżywczymi zwierząt, a więc sądzi się, że składniki takie nie będą stymulowały odpowiedzi immunologicznej. Najnowsza literatura określa zwierzę wolne od zarazków, wykarmione takim pokarmem, jako „zwierzę wolne od antygenów”.

Ponadto, właściwe jest stosowanie wyściółki z bibuły filtracyjnej, w przeciwnym razie zwierzę wolne od zarazków może ją zjadać, co wywoła odpowiedź immunologiczną.

Konkretny pokarm CD dla danego gatunku będzie zawierał takie składniki w ilościach i proporcjach, zapewniających znane pokarmowe zapotrzebowanie gatunku. Skład i wytwarzanie korzystnego pokarmu CD dla myszy wolnej od zarazków jest następujący:

Skład i wytwarzanie chemicznie zdefiniowanego pokarmu L489E14Se
Składnik Ilość (g/100 g składnika)
Do 192 ml wody Milli-Q w temperaturze 70°C dodano:
Leucynę	1,9
Fenyloalaninę	0,74
Izoleucynę	,0)8
Metioninę	,066
Tryptofan	0,37
Walinę	,,23
Asparaginę	0,91
Argininę - HCl	0,81
Treoninę	0,74
Lizynę - HC1	K77
Histydynę · HC1	0,74
Roztwór ochłodzono do 45°C i dodano:
Glicynę	0,59
Prolinę	,,48
Serynę
Alaninę	0,59
Glutaminian sodu	3,40
L-tyrozynę, ester etylowy . HC1	0,62
Glukonia żelazawy	0,05

178 003

Sole 35D1	0,105
Selenian sodu2	0,074
Roztwór ochłodzono do 5°C i dodano :
Glicerynofosforan wapnia	5,22
Glicerynofosforan magnezu	1,43
Do 108 ml wody Milli-Q water
w temperaturze 70°C
dodano bezwodną D-glukozę	71,28
Roztwory ochłodzono do temperatury	5°C i połączono do ultrafiltrowania.

'Skład mieszanki soli 35D podaje tabela 3

2Dodano poza selenianem sodu z soli 35D

3Skład mieszaniny witamin B 111E5 jak w tabeli 4 ⁴Dodano poza witaminą B w mieszaninie witamin B 111E5 (patrz przykład niżej)

Kompozycję tę podawano bez ograniczeń myszom lub szczurom.

Skład lipidowego uzupełnieni Składnik

Oczyszczone triglicerydy soi¹

Palmitynian retinylu

Cholekalcyferol

2ambo-a-tokoferol octan 2ambo-a-tokoferolu

Filochinon

69E6

Ilość dzienna dla dorosłego* (0,385 ml) 0,33 g

6,45 mg (11,7 I.U.)

0,0288 mg (1,15 I.U.)

3,3 mg

6,6 mg mg *Myszy w stanie laktacji otrzymują podwójną dawkę dorosłego.

¹Skład. 12% palmitynianu

1,5% stearynianu

24% oleimanu

55% linolanu

8% linoleinianu

Szczegółowy opis pokarmów CD podają: Pleasants, J.R. i in., J. Nutr., 116, 1949-1964 (1986), Pleasants, J. i in., Germ-free Research: Microflora Control and Its Aeplication to the Biomedical Sciences, wyd. B.S. Wostmann, str. 87, Liss, New York (1985); Wostmann, B.S. i in., J. Nutr., 112, 552 (1982); oraz Pleasants, J.R. i in., J. Nutr., 100,498 (1970), dołączane niniejszym jako odnośniki literaturowe.

Wytwarzanie monoklonalnegoprzeciwciała. Zwierzę wolne od zarazków wykorzystuje się następnie do wytwarzania monoklonalnych przeciwciał. Układ bezzarazkowy można stosować do wytwarzania monoklonalnego przeciwciała wobec jakiegokolwiek antygenu, jaki może wytworzyć zwierzę nie wolne od zarazków¹. Przykładowa lista takich antygenów mieści się w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3935074. Jednak sądzi się, że zwierzę wolne od zarazków daje znacznie lepszą odpowiedź immunologiczną na antygen. Można więc zwiększyć prawdopodobieństwo lokalizacji limfocytu B wytwarzającego przeciwciało, zdolnego do wiązania się ze specyficznym epitopem antygenu. Ponadto sądzi się, że układ wolny od zarazków jest szczególnie przydatny do wytwarzania silnie specyficznego przeciwciała dla antygenów o licznych epitopach.

Zwierzę wolne od zarazków można immunizować standardowymi technikami. Jednak wskazane jest, aby immunizować zwierzę wolne od zarazków co najmniej trzykrotnie z przerwami po co najmniej trzy tygodnie pomiędzy immunizacjami, z następującymi prefuzyjnymi dawkami wzmacniającymi. Sądzi się, że zwiększony poziom immunizacji może być konieczny, ponieważ zaobserwowano, że po dwu typowych immunizacjach występują wciąż głównie wydzielające IgM limfocyty B, a nie wydzielające IgG limfocyty B.

178 003

Komórki somatyczne. Komórki somatyczne zwierzęcia wolnego od zarazków, mające zdolność wytwarzania przeciwciała, a w szczególności limfocyty B, nadaąąsię do fuzji z linią komórek B szpiczaka. Fuzji poddaje się komórki wytwarzające przeciwciała znajdujące się w fazie dzielącego się plazmoblastu. Komórki somatyczne mogą pochodzić z węzłów limfatycznych, śledzion i obwodowej krwi przygotowanych zwierząt wolnych od zarazków, a komórki hmfatyczne z wyboru zależą w znacznym stopniu od ich empirycznej przydatności w danym układzie fuzyjnym. Jednak zwykle stosuje się komórki somatyczne ze śledziony. Po przygotowaniu, czyli hiperimmunizacji, zwierzęta wolne od zarazków można stosować jako źródło limfocytów wytwarzających przeciwciała. Limfocyty mysie dają wyższy procent stabilnych fuzji z opisanymi niżej liniami szpiczaka mysiego. Jednak możliwe jest stosowanie komórek wytwarzających limfocyty z innych zwierząt wolnych od zarazków·'. Dobór odpowiedniego zwierzęcia zależy od wyboru antygenu, ponieważ jest istotne, aby zwierzę wolne od zarazków miało w swym zestawie limfocytów B limfocyty, mogące wytwarzać przeciwciało wobec danego antygenu.

Komórki unieśmiertelniające. Specjalizowane linie komórek szpiczaka wyhodowano z nowotworów limfocytowych do stosowania do wytwarzania hybrydom w procesach fuzji (G. Kohler i C. Milstein, 1976, Eur. J. Immunol. 6:511-519; M. Schulman i in., 1978, Nature 276:269-270). Linie komórkowe opracowano co najmniej z trzech powodów. Pierwszym jest ułatwienie selekcji fuzyjnych komórek szpiczaka. Zwykle dokonuje się tego stosując komórki szpiczaka z brakami enzymatycznymi, aby nie mogły wzrastać w pewnym wybranym środowisku, podtrzymującym wzrost hybrydom. Drugi powód wynika z wrodzonej zdolności komórek nowotworu limfocytów do wytwarzania własnych przeciwciał. Celem stosowania mnnnklnnalnych technik jest otrzymanie nieśmiertelnej fuzyjnej linii hybrydowych komórek wytwarzających pojedyncze specyficzne przeciwciało przy genetycznym kierowaniu przez somatyczny składnik komórki hybrydomy. Aby 'wyeliminować wytwarzanie przez hybrydomy przeciwciał komórek nowotworowych, stosuje się linie komórek szpiczaka, niezdolne do wytwarzania lekkich lub ciężkich łańcuchów immunoglobulinowych lub pozbawione mechanizmów wydzielania przeciwciał. Trzecim powodem wyboru tych linii komórkowych jest ich przydatność i wydajność przy fuzji.

Do wytwarzania hybryd fuzyjnych komórek można stosować kilka linii komórek szpiczaka, w tym NS-1, X63-Ag8,NIS-Ag4/1,MPC11-45.6TG1.7,X63-Ag8.653, Sp2/O-Agfl4, FO, 1 S194/5XXO.Bu.1., wszystkie pochodzące z myszy, oraz 210.RCY3.Ag1.2.3 pochodzący ze szczurów (G.J. Hammerling, U. Hammerling i J.F. Keamly, wyd., 1981, Monoclonal antibodies and hybridomas, w J.L. Turk, wyd. Research Monographs in Immunology, tom. 3, Elsevier/North Holland Biomedical Press, New York).

Fuzja. Sposoby generowania hybryd komórek węzłów chłonnych lub śledziony produkujących przeciwciała obejmują zwykle zmieszanie somatycznych komórek z komórkami unieśmiertelniającymi w proporcji wahającej się od około 20:1 do około 1:1 w obecności środka lub środków (chemicznych, wirusowych lub elektrycznych) ułatwiających fuzję błon komórkowych. Często korzystnejest, aby ten sam gatunek zwierzęcia dostarczał komórek somatycznych i unieśmiertelniających, stosowanych w procedurach fuzyjnych. Metody fuzji opisał Kohler i Milstein (1975, Nature 256:495-497; 1976, Eur. J. Immunol. 6:511-519), Gefteriin. (1977, Somatic Cell Genet. 3:231-236) i Kozbor i in., 1983, Immunology Today, 4,72. Sprzyjające fuzji czynniki stosowane przez tych badaczy to odpowiednio wirus Sendai i glikol polietylenowy.

Można także stosować ostatnio opracowaną technikę transformacji eBv (Cole i in., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., str. 77-96).

Wydzielanie klonów i wykrywanie przeciwciał. Procedury fuzji pozwalająna otrzymanie żywotnych hybryd w bardzo małych ilościach, około 1x10- do 1x10- Ze względu na niską częstość otrzymywania jest istotne, aby dysponować środkiem do oddzielenia fuzyjnych hybryd komórkowych od pozostałych komórek niefUzyjnych, szczególnie niefUzyjnych komórek szpiczaka. Sposób wykrywania pożądanych wytwarzających przeciwciała hybrydom spośród innych powstałych hybryd komórkowych jest także niezbędny.

Zwykle fuzyjne komórki hoduje się w selektywnym środowisku, np. HAT, zawierającym hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę. Środowisko HAT pozwala na rozmnażanie komórek

178 003 hybrydowych i zapobiega wzrostowi nie połączonych przez fuzję komórek szpiczaka, które zwykle dzieliłyby się w nieskończoność. Aminopteryna blokuje syntezę puryny i pirymidyny, mhibitując wytwarzanie tetrahydrofolanu. Dodanie tymidyny pomija blokadę w syntezie pirymidyny, podczas gdy hipoksantynę wprowadza się do środowiska, aby inhibitowane komórki mogły syntetyzować purynę, stosując ścieżkę regeneracji nukleotydów. Komórki szpiczaka są mutantami pozbawionymi fosforybozylowej transferazy hipoksantyny (HPRT), tak więc nie mogą korzystać ze ścieżki regeneracji. W przeżywającej hybrydzie limfocyt B dostarcza informacji genetycznej do wytwarzania tego enzymu. Ponieważ limfocyty B jako takie mają ograniczony czas życia w hodowli (około 2 tygodnie), jedynymi komórkami przeżywającymi w środowisku HAT są hybrydy utworzone z komórek szpiczaka i śledziony.

W celu ułatwienia odsiewania przeciwciała wydzielanego przez hybrydy i zapobiegania przerastaniu pewnych hybryd przez inne, mieszaninę fuzji szpiczaka i limfocytów B rozcieńcza się w środowisku HAT i hoduje w wielu studzienkach, na płytkach do mikromiareczkowania. W ciągu 2 lub 3 tygodni, gdy klony hybryd widoczne są pod mikroskopem, supematant z poszczególnych studzienek zawierających klony hybryd testuje się na wytwarzanie specyficznych przeciwciał.

Test musi być wrażliwy, prosty i szybki. Techniki testowe obejmująradioimmunotesty, immunotesty. enzymatyczne, testy cytotoksyczności i testy płytkowe.

Rozmnażanie komórek i wytwarzanie przeciwciał. Po wybraniu pożądanych fuzyjnych hybryd komórek i klonowaniu ich w indywidualne wytwarzające przeciwciała linie komórek, każdą linię można rozmnażać na dwa standardowe sposoby. Próbkę hybrydomy można wstrzyknąć kompatybilnemu histologicznie zwierzęciu typu wykorzystanego do dostarczenia komórek somatycznych i szpiczaka do właściwej fuzji. Zwierzę po zastrzyku wytwarza komórki nowotworowe wydzielające specyficzne monoklonalne przeciwciało, wytwarzane przez fuzyjną hybrydę komórkową. Płyny ustrojowe zwierzęcia, takie jak osocze lub płyn puchlinowy, można ściągać, otrzymując monoklonalne przeciwciała w dużym stężeniu. Alternatywnie indywidualne linie komórkowe można rozmnażać in vitro w naczyniach do kultur laboratoryjnych. Środowisko hodowli, zawierające wysokie stężenia pojedynczego specyficznego monoklonalnego przeciwciała, można zbierać przez dekantację, filtrację lub odwirowanie.

Zastosowanie monoklonalnego przeciwciała. Otrzymane monoklonalne przeciwciała można wykorzystywać w każdej technice znanej lub możliwej do opracowania w przyszłości, stosującej monoklonalne przeciwciała.

Zasadnicze zastosowanie monoklonalnych przeciwciał to test immunologiczny, który jest miarą interakcji antygenu z przeciwciałem. Takie testy są zwykle homogeniczne lub heterogeniczne. W homogenicznym immunoteście reakcja immunologiczna zwykle obejmuje specyficzne przeciwciało, znaczony analit i badaną próbkę. Sygnał pochodzący ze znacznika ulega bezpośredniej lub pośredniej modyfikacji po związaniu przeciwciała ze znaczonym analitem. Zarówno reakcję immunologiczną, jak i wykrywanie jej zakresu prowadzi się w roztworze homogenicznym. Znaczniki immunologiczne, jakie można wykorzystać, obejmują wolne rodniki, barwniki fluorescencyjne, enzymy, bakteriofagi, koenzymy i tak dalej. Główną korzyścią z homogenicznego immunotestu jest to, że nie trzeba go oddzielać od znaczonego analitu.

W heterogenicznym immunoteście reagentami są zwykle próbka, specyficzne przeciwciało i środek do wytwarzania wykrywalnego sygnału. Próbkę umieszcza się zwykle na podłożu, takimjakpłytka lub szkiełko, i styka się z przeciwciałem w fazie ciekłej. Podłoże oddziela się następnie od fazy ciekłej i/albo podłoże, albo fazę stałą, albo ciecz bada się na obecność wykrywalnego sygnału przy pomocy urządzenia wytwarzającego taki sygnał. Sygnał związany jest z obecnością analitu w próbce. Urządzenie do wytwarzania wykrywalnego sygnału obejmuje stosowanie radioaktywnych znaczników, substancji fluorescencyjnych, enzymów i tak dalej. Przykłady heterogennego immunotestu obejmują radioimmunotest, metody immunofluorescencyjne, immunotesty związane z enzymami i tym podobne.

Dokładniejszą dyskusję powyższych technik zawiera „Enzyme-Immunoassay” Edwarda T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1980. Patrz także, np., opisy patentowe Stanów

178 003

Zjednoczonych Ameryki nr 3690834, 3791932, 3817837, 3850578, 3853987, 3867517, 3901654, 3935074, 3984533, 3996345 i 4098875. ... .

Inne ważne zastosowanie monoklonalnych przeciwciał to wizualizacja in vitro i leczenie. Monoklonalne przeciwciała można znaczyć radioaktywnymi związkami, np. jodem radioaktywnym, i podawać pacjentowi dożylnie. Przeciwciało można też znaczyć sondą magnetyczną. Następnie można wykorzystać NMR do lokalizacji antygenu. Po umiejscowieniu przeciwciał na antygenie można antygen wykrywać metodą emisji tomograficznej i radionukleamego skanowania, ustalając położenie antygenu.

Przykładowo, oczyszczone monoklonalne przeciwciało umieszcza się w zawiesinie w odpowiednim nośniku, np. solance, w obecności lub bez ludzkiej albuminy, w odpowiedniej dawce i podaje się dożylnie, np. przez ciągłą infuzję dożylnąprzez kilka godzin, jak podaje Miller i in. w Hybridomas in Cancer Diagnosis and Therapy (1982), dołączanym niniejszym jako odnośnik literaturowy.

Przeciwciała monoklonalne otrzymane w sposób opisany powyżej można stosować terapeutycznie. Przeciwciała z odpowiednimi biologicznymi właściwościami są przydatne bezpośrednio jako środki lecznicze. Alternatywnie przeciwciała można wiązać z toksyną, tworząc immunotoksynę lub z substancją radioaktywną, tworząc radiofarmaceutyk lub farmaceutyk. Sposoby wytwarzania immunotoksyn i radiofarmaceutyków z przeciwciał są dobrze znane (patrz np. Cancer Treatment Reports (1984) 68:317-328).

Przypuszcza się także, że poliklonalne przeciwciała otrzymane ze zwierząt wolnych od zarazków można także wykorzystywać w testach immunologicznych, otrzymując ulepszony wynik w porównaniu z przypadkiem poliklonalnych przeciwciał, otrzymywanych z konwencjonalnych zwierząt. Poliklonalne przeciwciała pochodzące ze zwierząt wolnych od zarazków można otrzymać stosując zwierzę wolne od zarazków opisane powyżej i techniki immunizacji opisane powyżej, po których następuj e wydzielenie poliklonalnych przeciwciał ze zwierzęcia w konwencj onalny sposób, np. wydzielając osocze zwierzęcia.

Specyficzne wobec fibryny monoklonalne przeciwciało. Mechanizm hemostatycznyj est kompleksowym mechanizmem odpowiedzi fizjologicznej związanym z naprawianiem uszkodzeń naczyń krwionośnych. Hemostazę osiąga się poprzez wspólne interakcje ścianek uszkodzonego naczynia, płytek i systemu koagulacyjnego. Rolą systemu koagulacyjnego jest dostarczanie sieci fibrynowej stabilizującej i kotwiczącej zatyczkę fibrynową, składanąna podśródbłonkowej strukturze uszkodzonego naczynia. Powstawanie nierozpuszczalnej siatki fibrynowej z krążącego fibrynogenu jest wynikiem kompleksowej sekwencji reakcji kulminującej, w gwałtownym wytwarzaniu trombiny w wymaganym miejscu. Koagulacja jest procesem wzmacniania obejmującym łańcuch reakcji enzymatycznych, w których proenzymy (czynniki zakrzepowe) są aktywowane kolejno do postaci aktywnych enzymów. Istnieje kilka fizjologicznych mechanizmów kontrolujących proces polimeryzacji fibryny, związany z tworzeniem skrzepimy. Obejmują one inhibitor trombiny antithrombin III (ATni), białko C, prosta-cyklinę i różne składniki układu fibrynolitycznego, takie jak aktywator plazminogenu tkanki (t-PA) i jego najszybciej działający inhibitor (PAI).

Hipoteza homeostazy proponowana przez Astrupa w 1956 roku w Astrup, T., Blood 11, 781-806 (1956) stwierdza, że istnieje równowaga pomiędzy tworzeniem fibryny (koagulacją) a rozpuszczaniem fibryny (fibrynolizą). W stanie normalnego zdrowia funkcje te są zbilansowane. Jednak w razie awarii procesu hemostatycznego koagulacja i fibrynolizą są patologicznie wyrażane poprzez odpowiednio zakrzepicę i krwotok. Kliniczne manifestacje patologicznej zakrzepicy i choroby zakrzepowej są zdecydowanie rozbieżne i obejmująrozproszonąmiędzynaczyniową koagulację (DIC), głęboką zakrzepicę żył (DVT), zakrzepicę tętniczą i żylną. Zakrzepica z zatorami i komplikacje zakrzepowe innych chorób (np. miażdżycy tętnic) mogą spowodować okluzję ważniejszych arterii, prowadząc do niedokrwienia organów i towarzyszącym zagrażającym życiu stanom, takim jak udar naczyniowy mózgu (zawał), zawał serca i tym podobne.

Proces fibrolityczny obejmuje konwersję nieaktywnego zymogenu, plazminogenu, do proteolitycznego enzymu, plazminy, poprzez działanie środków znanych jako aktywatory plazminogenowe. Mechanizm cząsteczkowy fizjologicznej fibrynolizy nie jest w pełni zrozumiały,

178 003 ale wiadomo, że w czasie tworzenia fibryny plazminogen wiąże się z fibryną, gdzie może ulegać aktywacji aktywatorami plazminogenowymi, np. t-PA. W ten sposób wytwarzanie plazminy przebiega w skrzepie, gdzie jest ono zabezpieczone przed dezaktywacją głównym fizjologicznym ibhibitorem plazminy, alfa₂-antyplazminą.

Po poddaniu działaniu plazminy fibrynogen i fibryna ulegają rozpadowi na produkty degradacji. Fibrynogen rozpada się na fragmenty X i Y, a przy dalszym działaniu plazmmy na D i E. Fibryna rozpada się na fragmenty X, Y, D i E ze stanu niesieciowanej fibryny i sieciowanego dimeru D, kompleks D-D/E, dimer Y, dimer Y-D i oligomer X z sieciowanej fibryny.

Testy na obecność zaburzeń zakrzepowych prowadzono do obecnych czasów, stosując poliklonalne przeciwciała zarówno w radioimmunotestach, jak i testach typu aglutynacji lateksu. Testy te przedstawionojako całkowicie niepewne w publikacji Gaffney’ a (Gaffney, P.J., Ann. N.Y. Acad. Sci., 408,407-423 (1983)). Bardziej specyficzne i wrażliwe immunotesty (jak ELISA) z użyciem monoklonalnych przeciwciał zaczynają się stawać zwykłą praktyką w laboratoriach klinicznych. Czynnikiem ograniczającym w takich testach diagnostycznych jest specyficzność i powinowactwo konkretnego wykorzystywanego monoklonalnego przeciwciała. Wytwarzanie silnie specyficznych przeciwciał do dowolnych potencjalnych wskaźników nieprawidłowej hemostazy jest hamowane zarówno przez niskie zawartości wskaźników, jak i antygenowe pokrewieństwo danego znacznika ze swoim prekursorem, występującym zwykle w znacznie wyższych stężeniach w osoczu.Przykładami jest tworzenie kompleksów pomiędzy enzymami i ich inhibitorami, np. trombina-antytrombina III, plazmina-alfa₂-antyplazmina, t-PA-PAI-1. Liczba nowych miejsc antygenowych generowanych przez tworzenie takich kompleksów jest bardzo mała i czyni skomplikowanym wytwarzanie sond immunologicznych (takich jak monoklonalne przeciwciała).

Podobnie, głównym problemem związanym z wiązaniem monoklonalnego przeciwciała przez fibrynę były strukturalne i konformacyjne podobieństwa fibryny i jej fizjologicznego prekursora, fibrynogenu. Oceniono, że zachowanie kowalencyjnej struktury w czasie przekształcania fibrynogenu w fibrynę przekracza 98% (Plow, E.F. i in., Semin. Thromb. Haemostas, 8, 36 (1982)), a więc tylko niewielka część epitopów na cząsteczce fibryny jest w rzeczywistości neoantygenami (i unikalnymi dla fibryny). Wiele zastosowanych sposobów uzyskania przeciwciał fibryny koncentrowało się na immunizacji zwierząt fragmentami rozpuszczalnej fibryny i syntetycznych peptydów, udających odsłonięte neoantygenowe miejsca fibryny. Patrz Hui, K.Y. i in., Science 22,1129-32 (1983), Scheefers-Borchel, V. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,7091-95 (1985), Elms, M.J. i in., Thromb. Haemostas, 50,591-94 (1983) i Kurdryk, B. i in., Mol. Immul., 21, 89-94 (1984). Jednak sądzi się, że miejsca wiązania takich przeciwciał zachowująsię w czasie procesu degradacji fibryny i dlatego przeciwciała te mogą się też wiązać z produktami degradacji fibryny.

, Wynalazek pozwala na przyjęcie całkowicie innego podejścia i wykorzystuje antygen fibryny w powiązaniu z polepszoną immunologiczną wrażliwością wolnego od antygenów zwierzęcia (AF) do wytwarzania monoklonalnego przeciwciała specyficznego wobec fibryny i wykrycia obecności lub ilości rozpuszczalnych sieciowanych i niesieciowanych polimerów fibryny. Dla celów wynalazku monoklonalne przeciwciało specyficzne wobec fibryny wiąże się z fibryną, a nie fibrynogenem, produktami degradacji fibrynogenu lub produktami degradacji fibryny.

Materiały i sposoby

Zwierzęta. Myszy BALB/cAnN wolne od zarazków otrzymano z kolonii wolnej od zarazków (GF) utrzymywanej w uniwersytecie Wisconsin. Zwierzęta przetransportowano w warunkach GF. Kolonię bezantygenową(AF) rozpoczęto przemieszczając myszy GF w ciąży, karmione pokarmem z naturalnych składników L-485 (patrz Pleasants, J. P. i in., J. Nutr. 116,1949-1964 (1986)) do izolatki AF, w której myszy przestawiono natychmiast na zdefiniowaną chemicznie (CD) dietę AF. Ich potomstwo, nie stykające się nigdy z pokarmem naturalnym (NI), odstawiane od mleka matki i przestawiane na pokarm CD, określono nazwąpierwszego pokolenia AF. Myszy AF kojarzono w pary aż do stanu wyraźnej ciąży samicy; wówczas samca usuwano w celu zapewnienia samicy pełnej dziennej dawki lipidów. Młode odstawiano od matek w wieku 24 dni.

178 003

Pomieszczenia. Reproduktory AF trzymano parami w połowach standardowych klatek dla myszy z poliwęglanu o rozmiarach 28x17,8x12,7 cm. Dno klatek wycięto i zastąpiono fałszywym z sita ze stali nierdzewnej. Podłużną przegrodę z arkusza ze stali nierdzewnej umocowano do końców plastikowej klatki. Wystawała ona dostatecznie ponad i poza klatkę, aby utrzymać na miejscu pokrywę ze stalowego drutu. Ta wgłębiona pokrywa, normalnie pasuj ąca do wnętrza klatki, została odwrócona w celu utworzenia bardziej odpowiedniej przestrzeni ponad fałszywym dnem. Kołnierze ze stali nierdzewnej o odpowiednich rozmiarach przyspawano na wierzchu pokrywy w celu podtrzymywania 60 ml butelek z pokarmem. Cztery kubki ze stali nierdzewnej przyspawano do boków podłużnej przegrody na końcach, w połowie drogi między fałszywym dnem i szczytem. (Rysunek takich klatek podaje Pleasants, J. R., The germfree system for aging and immunity w: CRC Handbok of Immunology in Aging, (wyd. Kay, M. M. B. S. Makinodan, T.), str. 257-297, CRC Press, Boca Raton, FI. (1981)). Butelki na pokarm były z brązowego szkła. Butelki na pokarm i wodę miały plastikowe pokrywki z dziurami wywierconymi na środku. Butelki napełniano i odwracano w kołnierzach. Dzienna dawka lipidów była odmierzana w stalowych kubkach. Pod każdą klatką umieszczono plastikową miskę zbierającą odpady.

Bibuła filtracyjna, która służyła za wyściółkę i niestrawne włókno, była bezpopiołową bibułą filtracyjną Whatman nr 41, w postaci krążków (Sargent Welch). Na wyściółkę papier pocięto w paski. Nie pocięte kwadraty papieru użyto do czyszczenia wnętrza izolatki. Papier sterylizowano w autoklawie przez 25 minut w temperaturze 121 °C lub naświetlano (4,5 Mrad) w plastikowych torebkach. Wszystkie myszy otrzymały dość papieru, aby pokryć jeden koniec klatki. Zastępowano go, gdy stawał się mokry, żółty lub brudny’.

Klatki trzymano we wnętrzu elastycznej izolatki o wymiarach 1,37x0,6x0,6 m typu Trexlera(Trexler, P. C., Lab. Anim. Care, 13,572-581 (1963)), stosując standardową technologię hodowli bez zarazków (patrz Wostmann, B. S., wyd., Gnotobiotes Standards and Guide Lines for the Breeding, Care and Management of Laboratory Animals, National Research Council, National Academy of Sciences, Washington, D. C.). Izolatki przechowywano w pomieszczeniu w temperaturze 21 °C w cyklu oświetleniowym 12 godzin dnia.

Do szczytu izolatki przymocowano rurkę Tygona o średnicy 2,5 cm i długości 7,55 cm, zamkniętą na końcach górnym i dolnym winylowymi zatyczkami. Stanowiła ona wejście sterylizacyjnej filtracji pokarmu, wody i oleju.

Pokarm. Tabela 1 pokazuje zarówno skład pokarmu, jak i kolejność rozpuszczania składników w ultrasączonej wodzie Milli-Q (Millipore, MA). Aminokwasy i glukoza miały czystość do hodowli tkanek Sigma. Witaminy także pochodziły z Sigma, poza czystym palmitynianem retinylu, dostarczonym przez Hoffman-La Roche, Inc. (Nutley, NJ). Inne reagenty miały certyfikat Fischer lub równoważny. Kompletnie rozpuszczalny w wodzie pokarm przesączono na zimno przez ultrafiltr Amicon Diaflo TC3 stosując 3 membrany Pm10 o średnicy 150 mm (Amicon).

Membrany ultrafiltracyjne miały masę cząsteczkową odcięcia 10000. Złożone urządzenie do ultrafiltracji sterylizowano przed użyciem przepuszczając przez niego 0,15% roztwór podchlorynu sodu, a następnie starannie przemyto. Ultrafiltrowany pokarm przechowywano w temperaturze 4°C w sterylnych pojemnikach aż do chwili użycia. Pokarm wprowadzano do izolatki AF przez filtr 0,2 pm Nylon (MSI) w uchwycie ciśnieniowym autoklawowym z rurą doprowadzającą wprowadzoną w zatyczkę nr 6 z Neoprenu. W tym celu wyjmowano górną zatyczkę winylową z rurki Tygona przymocowanej do szczytu izolatki, wnętrze rurki spryskiwano płynem sterylizującym, 2% kwasem nadoctowym zawierającym 0,1% sulfonianu alkilo-arylowego. W miejsce górnej zatyczki wprowadzano zatyczkę filtru. Po 20 minutach niższą zatyczkę wyjmowano (we wnętrzu izolatki) i pokarm lub wodę wsączano do izolatki pod ciśnieniem 20 psi azotu.

Skład lipidowego uzupełnienia podaje tabela 2. Triglicerydy z soi były preparatami otrzymanymi z tych estrów metylowych, które destylowały pod zmniejszonym ciśnieniem w pewnym zakresie temperatur dając estry od palmitynianu do linoleinianu. Estry te transestryfikowano następnie gliceryną tworząc mieszane triglicerydy (Nu-Chek Prep, Elysian, MN). Do mieszaniny triglicerydowej dodano witaminy rozpuszczalne w tłuszczach przed jej wsączeniem

178 003 do izolatki, kiedy to podgrzano ją do temperatury 50°C i przesączono do izolatki w taki sam sposób, jak rozpuszczalną w wodzie część pokarmu.

Pobór lipidów zmierzono na 0,375 ml dziennie. Zwiększenie dodatku lipidowego znacznie zmniejszyło śmiertelność nowo urodzonych myszy. Przeciętna objętość odpadów także wzrosła do wartości dla konwencjonalnie hodowanych zwierząt. Samice w stanie laktacji otrzymywały podwójną normalną dawkę dodatku lipidowego.

Tabela 1

Skład i wytwarzanie chemicznie zdefiniowanego pokarmu L489E14Se

Składnik	Ilość (g/100 g składnika)
1	2
Do 192 ml wody Milli-Q w temperaturze 70°C dodano:
Leucynę	1,9
Fenyloalaninę	0,74
Izoleucynę	1,08
Metioninę	1,06
Tryptofan	0,37
Wahnę	1,23
Asparaginę	0,91
Argininę HC1	0,81
Treoninę	0,74
Lizynę HC1	1,77
Histydynę HC1	0,74
Roztwór ochłodzono do 45°C i dodano.
Glicynę	0,59
Prolinę	1,48
Serynę	1,33
Alaninę	0,59
Glutaminian sodu	3,40
L-tyrozynę, ester etylowyHCl	0,62
Glukoma żelazawy	0,05
Sole 35D1	0,105
Selenian sodu2	0,074
Roztwór ochłodzono do 5°C i dodano·
Glicerynofosforan wapnia	5,22
Glicerynofosforan magnezu	1,43
Chlorek wapnia · 2H2O	0,185
Chlorek sodu - jodek potasu (KI) (mieszanka zawierająca 680 mg KI)	0,086
Witamina B, mieszanka 111E5'3	0,09
Witamina B124	1,20 mg

178 003 cd tabeli 1

1	2
Chlorek choliny	0,31
Octan potasu	1,85
Do 108 ml wody Milli-Q water w temperaturze 70°C dodano bezwodną D-glukozę

Roztwory ochłodzono do temperatury 5°C i połączono do ultrafiltrowania. 'Skład mieszanki soli 35D podaje tabela 3 ²Dodano poza selenianem sodu z soli 35D ³Skład mieszaniny witamin B 1ΠΕ5 jak w tabeli 4 ⁴Dodano poza witaminą B w mieszaninie witamin B 9 91E5

Tabela 2

Skład lipidowego uzupełnienia LADEK 69E6

Składnik	Ilość dzienna dla dorosłego* (0l270 ml)
Oczyszczone triglicerydy soi1	0,33 g
Palmitynian retmylu	6,45 mg (11,7 I. U.)
Cholekalcyferol	0,0288 mg (1,15 I. U.)
2 ambo-a-tokoferol	3,3 mg
Octan 2 ambo-a-tokoferolu	6,6 mg
Filochinon	72,0 mg

*Myszy w stanie laktacji otrzymują podwójną dawkę dorosłego 'Skład: 12% palmitynianu

1,5% stearynianu 24% oleimanu 55% Imolanu

8% linoleinianu

Tabela 3

Skład mieszaniny soli 35D

Sól	Ilość (na 300 ml pokarmu) (mg)
Mn (octan)2 · 4H2O	55,4
ZUSO4 H2O	40,6
Cu (octan)2 · H2O	3,7
Cr (octan)3 · H2O	2,5
NaF	2,1
SnSO4 2H2O	0,37
(NH4)^Mo7O24 · 4H2O	0,37
N1C12 · 3H2o	0,37
Co (octan)2 · 4H2O	0,11
Na3VO4	0,22
Na2SeO3	0,096

178 003

Tabela 4

Skład mieszaniny witamin B 111E5

Składnik	Ilość (na 300 ml pokarmu) (mg)
Tiamina - HCl	1,23
Pirydoksyna HCl	1,54
Biotyna	0,25
Kwas foliowy	0,37
Witamina B12	0,37
Ryboflawina	1,85
Niacyna, amid	9,2
i-inozytol	61,9
Pantoteman wapnia	12,3

Woda była wodąultrafiltrowanąMilli-Q i była wsączana do izolatki w taki sam sposób, jak pokarm.

Obserwacja mikrobiologiczna. System bezantygenowy zbadano na zakażenie mikrobiologiczne zgodnie z zasadami podanymi w publikacji wyd. Wostmann, B. S., Gnotobiotes Standards and Guide Lines for the Breeding, Care and Management of Laboratory Animals, National Research Council, National Academy of Sciences, Washington, D. C. W skrócie, tampony zwilżone pokarmem i wodąz wnętrza izolatki zastosowano do pobrania rozmazów fekalii bezpośrednio od myszy i ze zgromadzonych odpadów pod każdą klatką. Rozmazy pobrano także ze ścianek izolatki, głównie z okolic otworów wejściowych. Za każdym razem pobierano podwójne rozmazy. Jeden zestaw badano bezpośrednio pod mikroskopem na obecność bakterii i grzybów, stosując zabarwienie Gram. Drugi zestaw tamponów zastosowano do wykrywania mikroorganizmów. Dopiero po upływie trzech tygodni uznawano, że kultura dała wynik negatywny.

Testy mikrobiologiczne prowadzono co około dwa tygodnie lub w kilka dni po wprowadzeniu nowych obiektów do izolatki.

Wytwarzanie monoklonalnych przeciwciał z zastosowaniem myszy wolnych od antygenów¹.

Myszy wolne od antygenów opisane powyżej zastosowano jako dawców limfocytów w wytwarzaniu monoklonalnych przeciwciał. Roztwory wszystkich antygenów wytwarzano w sterylnych warunkach w kołpaku z przepływem laminarnym.

Następujący protokół przyjęto przy immunizacji myszy AF. Antygen (25-50 gg) rozpuszczono w sterylnej solance (100 gl) i emulgowano z równą ilością kompletnego adiuwantu Freunda (FCA). Do roztworu przed emulgacją dodano interferon (1000 jednostek). Do immunizacji stosowano sterylne strzykawki i igły. Strzykawki przeniesiono do izolatki AF przez otwór wejściowy, gdzie poddano je sterylizacji roztworek kwasu nadoctowego (2%). Zastrzyki wspomagające podano z taką samą ilością antygenu, ale zastępując FCA niepełnym adiuwantem Freunda. Dokonano trzech wspomagających immunizacji, każda w odstępie trzech tygodni. Końcowy zastrzyk wspomagający (bez adiuwantu) podano na 4-7 dni przed fuzją. Wszystkich immunizacji dokonano dootrzewnowo. Myszy usunięto z izolatki w dniu fuzji i natychmiast zabito przez uduszenia CO2. Śledziony usunięto i splenocyty poddano fuzji z komórkami szpiczaka myszy (NSI) stosując standardową technikę hybrydomową.

Stosowanie zwierząt wolnych od antygenów do wytwarzania specyficznego wobec fibryny monoklonalnego przeciwciała. Układ wolny od antygenów zastosowano do wytwarzania specyficznego wobec fibryny monoklonalnego przeciwciała. Przeciwciałojest silnie specyficzne i nie rozpoznaje fibrynogenu, produktów degradacji fibryny lub produktów degradacji fibrynogenu. Linię hybrydomowych komórek wytworzono przez fuzję splenocytów z wolnych od antygenów myszy BALB/c, immunizowanych ludzką fibryną, i komórkami szpiczaka NSI.

178 003

Procedura immunizacji. Trzytygodniowe samice myszy wolnych od antygenów immunizowano 33 gg preparatu ludzkiej fibryny. Preparat był zamrożoną próbką pokruszonej fibryny, utworzonego jak następuje:

Ludzki fibrynogen przekształcono w fibrynę działaniem trombiny i czynnika XIIIa. Skrzep fibrynowy zamrożono w ciekłym azocie i sproszkowano mechanicznie do bardzo drobnego proszku. Dyspersję zamrożonej sproszkowanej fibryny wytworzono w solance otrzymując przejrzysty roztwór sieciowanej fibryny XL-Fn o końcowym stężeniu 1 mg/ml. Do immunizacji zwierząt zastosowano 33 gl tego antygenu fibrynowego. Objętość roztworu antygenu powiększono do 100 gl dodając sterylną solankę, a następnie emulgowano z FCA w sposób opisany w ostatnim podrozdziale. Podano dwie immunizacje wspomagające, w odstępach trzech tygodni, stosując taką samą zawartość antygenu w niekompletnym adiuwancie Freunda. Końcowy zastrzyk wspomagający podano na 4 dni przed fuzją. Zawartość antygenu była taka sama, a adiuwant zastąpiono solanką.

Detekcja i określanie przeciwciała. Jakościowe i ilościowe określanie cech monoklonalnego przeciwciała wykonano stosując test immunosorpcyjny związany z enzymem (ELISA). Testy ELISA wykonano stosując ludzką fibrynę unieruchomionąna płytce PCW z 96 studzienkami (Costar). Płytki testowe pokryte fibryną przygotowano inkubując 100 μΐ roztworu fibrynogenu (Kabi, czystość L) (50 gg/ml buforu boranu w solance) przez noc w temperaturze 4°C. Niezwiązany fibrynogen usunięto przez wymycie PBS zawierającym 0,05% Tween 80 (PBS-Tween). Fibrynogen powlekający studzienki w tworzywie przekształcono w fibrynę przez inkubację ze 100 gl roztworu trombiny (100 jednostek NIH/ml) zawierającym 2 mM CaCl2 przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Standardowe krzywe kalibracji dla przeciwciała skonstruowano stosując preparat przeciwciała homogeniczny według SDS-PAGE.

Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu, płytki powleczone fibryną inkubowano 1 % roztworem BSA w PBS, pH 7,4. Dodano następnie roztwory zawierające przeciwciało (100 gl) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 90 minut. Po każdym etapie procedury studzienki przemywano dużą ilością PBS-Tween. Związane przeciwciało wykrywano dodatkiem 1000-krotnie rozcieńczonego króliczego przeciwciała anty-mysiego sprzężonego z alkaliczną fosfatazą (Sigma) rozcieńczoną PBS, 1% BSA, pH 8,0.

Wytwarzanie hybrydom - fuzja. Myszy zabito CO2 i usunięto im natychmiast śledziony. Komórki śledziony z immunizowanych myszy poddano fuzji ze środkiem fuzyjnym, glikolem polietylenowym 4000 (3000-3700). Komórki inkubowano w środowisku· selekcyjnym HAT w kolbach T przez tydzień. Po tym czasie komórki umieszczono na płytkach 5 x 96 studzienek, z których 93 wykazały wzrost. Spośród nich 19 miało odczyn pozytywny na antygen fibrynowy. Jeden z tych klonów, F492D8 (później nazwany MH1), wytwarzał przeciwciało, które rozpoznawało antygen fibryny, ale nie reagował krzyżowo z fibrynogenem. Ten właśnie klon, MH 1, poddano trzykrotnemu klonowaniu przez ograniczające rozcieńczanie z trzeciorzędową fazą klonującą, na 1 komórce na studzienkę. Po ustabilizowaniu linii komórkowej odstawiono ją do wolnego od surowicy środowiska. Linia wytwarza przeciwciało w ilości około 7,5 mg/l.

Oczyszczanie monoklonalnego przeciwciała. Przed oczyszczaniem (porcje 4-litrowe) supernatanty kultury tkankowej odwirowano w celu usunięcia resztek komórek i przesączono przez nylonową membranę 0,8 gm w celu usunięcia wszelkich rozdrobnionych resztek. Supematant z hybrydomą zatężono w temperaturze 4°C do objętości 500 ml stosując spiralnie zwinięty układ ultrafiltracyjny z membraną typu YM (Amicon) o masie cząsteczkowej odcięcia 30000. Wymianę bufora na 20 mM kwas 2(N-morfolino)etanosulfonowy (MES) o pH 6 (bufor A) przeprowadzono metodądiafiltracji według instrukcji wytwórcy. Po dalszym zatężeniu do końcowej objętości 100 ml roztwór przeciwciała przesączono przez membranę nylonową 0,451 gm przed dalszym oczyszczaniem. Zatężony roztwór przeciwciała osuszono metodą chromatografii cieczowej na chromatografie HPLC Waters, stosując kolumnę 7,75x10 cm ABx (j. T. Baker, Phillipsburg, NJ). Kolumnę zrównoważono buforem A i próbkę (100 ml) podano z natężeniem 1,0 ml/min. Po obfitym przepłukaniu buforem A przeciwciało eluowano z kolumny gradientem od bufora A do 100% bufora B (octan sodu IM, pH 7) z natężeniem 1,0 ml/min. Frakcje (2 ml) zbierano i zawierające

178 003

MAb (jak określono testem ELISA) łączono i dializowano wobec buforowanej fosforanem solanki (PBS) (20 mM fosforanu sodu, 150 mM chlorku sodu, pH 7,4) i przechowywano w temperaturze -20°C w stężeniu >1 mg/ml. Kolumnę ABx regenerowano przemywając przez 5 minut 100% bufora B, następnie ponownie równoważono 15 objętościami kolumny bufora A.

Określenie specyficzności wobec fibryny. Wstępną ocenę specyficzności wobec fibryny osiągnięto odsiewając supematanty hybrydomowe oddzielnie na pokrytych fibryniąi fibrynogenem płytkach do mikromiareczkowania. Akceptowano tylko linie komórkowe wytwarzające przeciwciało, które nie reagowały krzyżowo z fibrynogenem. Dalsze potwierdzenie specyficzności wobec fibryny otrzymano wykorzystując test współzawodnictwa z fibrynogenem w roztworze, potwierdzając, że przeciwciało nie rozpoznaje fibrynogenu w roztworze.

Test współzawodnictwa wykorzystany do potwierdzenia specyficzności przeciwciała wobec fibryny przeprowadzono w sposób opisany dla testu ELISA powyżej z preinkubacjąprzeciwciała z fibrynogenem w roztworze. W skrócie, supematant hybrydomowy inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut z roztworem fibrynogenu w stężeniach fizjologicznych (4 mg/m!) zawieraj ącym BSA (10 mg/ml) w celu zapobiegania niespecyficznemu wiązaniu przeciwciała z fibrynogenem. Roztwór fibrynogenu z przeciwciałem przeniesiono następnie do studzienek na płytce do mikromiareczkowania, powleczonej fibryną. Do inhibitora fibrynogenu dodano GliProArgPro (GPRP) w celu zapobiegnięcia możliwej polimeiyzacji fibrynogenu przez resztki trombiny w fibrynowych studzienkach. Przeprowadzono następnie konwencjonalny test ELISA na przeciwciała związane z unieruchomionym antygenem. We wszystkich eksperymentach testujących specyficzność wobec fibryny stosowano jako kontrolne drugie przeciwciało 45J. Reaguje ono krzyżowo z fibryną i fibrynogenem.

Określenie reaktywności krzyżowej z fibrynogenem

Unieruchomionafibryna i fibrynogen. Linia komórek MH1 wytwarza mysie monoklonalne przeciwciało reagujące krzyżowo po unieruchomieniu na powierzchni płytki testowej PCW do mikromiareczkowania (tabela 5). W tym samym teście przeciwciało nie rozpoznaje fibrynogenu unieruchomionego na płytce. Dane w tabeli 5 wskazują że występuje ogromny wzrost immunoreaktywności po przekształceniu fibrynogenu w fibrynę przez trombinę, co wskazuje jasno na powstanie lub odsłonięcie neoepitopu na cząsteczce fibryny. Kontrolne przeciwciało 45J wyraźnie rozpoznaje epitop zachowany przy przekształceniu fibrynogenu w fibrynę.

Test współzawodnictwa fibrynogenu z fibryną.. Specyficzność fibryny wobec przeciwciała MH1 wykazano dalej w teście współzawodnictwa, w którym supematant hybrydomowy poddano wstępnej inkubacj i z roztworem fibrynogenu (końcowe stężenie 4 mg/ml) przed testem ELISA na pokrytych fibryną studzienkach. Ze względu na wysokie stężenie fibrynogenu w teście współzawodnictwa (x 500 w porównaniu ze stężeniem przeciwciała), do mieszaniny dodano BSA (końcowe stężenie 10 mg/ml). Dodano peptyd (GPRP) w celu zapobiegnięcia możliwej polimeiyzacji fibiyny przez resztki trombiny w powlekanych fibryną studzienkach. Wyniki testu wskazują, że przeciwciało MH1 nie rozpoznaje fibrynogenu w roztworze (tabela 6).

Zakładając, że 400 ng fibryny wiąże się z każdą studzienką na płytce testowej do mikromiareczkowania, poziom fibrynogenu w tym właśnie teście współzawodnictwa stanowi 1000-krotny nadmiar ponad poziom związanego antygenu fibryny. Ponadto stanowi on 400-krotny nadmiar wobec poziomu przeciwciała w supematancie tkankowym.

Tabela 5

Reaktywność krzyżowa przeciwciała MH1 z antygenem fibrynogenu i fibryny

MAb	A4o5nM/30 min.
	fibryna	fibrynogen
MH1	0,90	0,025
45J	1,65	1,50

178 003

Tabela 6

Reaktywność krzyżowa przeciwciała MH1 z fibryną w obecności fibrynogenu

MAb	A4MnM/30 min.
	+fibrynogen	-fibrynogen
MH1	1,24	1,27
45J	0,438	1,74

Określanie reaktywności krzyżowej z piroduktami degradacji fibrynogenu i fibryny. Produkty degradacji fibrynogenu (FDP) wytworzono inkubując fibrynogen z plazminąw temperaturze 37°C przez okres od 10 minut do 3 godzin. Po określonym czasie fibrynogenolizę zatrzymano dodając Trasylol (100 jednostek inhibitora kallikreiny na ml) i 20 mM kwasu e-amino-kapronowego (EACA).

Sieciowane produkty degradacji fibrynogenu (XLFDP) wytworzono dodając trombinę (4 jednostki NIH na ml) do roztworu fibrynogenu (5 mg/ml) w solance buforowanej Tris (TBS, pH 7,4, 50 mM Tris HC1, 150 mMNaCl) zawierającej 10 mM CaCl2, plazminogen (0,25 mg/ml) i urokinazę (50 IU/ml). Mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C i kończono trawienie plazminowe po różnych odstępach czasowych w sposób opisany powyżej dla FDP.

W celu określenia reaktywności krzyżowej przeciwciała z produktami degradacji fibryny i produktami degradacji fibrynogenu odpowiednimi produktami degradacji powleczono płytki do mikromiareczkowania i przeprowadzono konwencjonalne testy ELISA. Jak wskazują wyniki w tabeli 7, przeciwciało MH1 nie reaguje krzyżowo z jakimikolwiek utworzonymi przez plazminę produktami degradacji fibrynogenu. Jak wskazuje tabela 8, przeciwciało nie reaguje z produktami degradacji XL-fibryny. Obserwacji tej dokonano także, gdy przeciwciało testowano na reaktywność krzyżową metodą analizy Western.

Można wyciągnąć wniosek, że przeciwciało rozpoznaje epitop nietkniętej cząsteczki fibryny, nieobecny lub zasłonięty na powierzchni cząsteczki prekursora, fibrynogenu. Epitop ten ulega oczywiście zniszczeniu przez trawienie plazminą sieciowanej fibryny, jak sugerują dane z tabeli 8.

Odpowiednio, przeciwciało MH1 jest specyficznym wobec fibryny monoklonalnym przeciwciałem, które można zdefiniować jak poniżej.

Dla celów niniejszego wynalazku specyficzne wobec fibryny monoklonalne przeciwciało jest monoklonalnym przeciwciałem, które:

1. w teście współzawodnictwa mierzącym reaktywność krzyżową z fibryną i fibrynogenem, jak opisano powyżej, monoklonalne przeciwciało wykazuje mniej niż około 75%, korzystnie mniej niż około 10%, reaktywności krzyżowej z fibrynogenem, gdy fibrynogen stosuje się w ilości 1000-krotnego nadmiaru w porównaniu z fibryną,

2. w teście mierzącym reaktywność krzyżową z sieciowaną fibryną i produktami degradacji fibryny, jak opisano powyżej, reaktywność monoklonalnego przeciwciała z fibryną trawioną plazminą przez około trzy godziny jest mniejsza niż około 50%, korzystnie mniejsza niż około 40%, reaktywności monoklonalnego przeciwciała z fibryną w chwili 0, oraz

3. w teście mierzącym reaktywność krzyżową z fibrynogenem i produktami degradacji fibrynogenu, jak opisano powyżej, reaktywność monoklonalnego przeciwciała z fibrynogenem trawionym plazminą przez około cztery godziny nie większa reaktywność monoklonalnego przeciwciała z fibrynogenem w chwili 0.

Przeciwciało MH1 testowano także określając jego powinowactwo z fibryną. Powinowactwo określano metodą analizy Scatcharda (Frankel i in., Molecular Immunology, 16,101-106 (1979)) stosując znaczone ¹²⁵I przeciwciało MH1. Wartość otrzymana dla stałej dysocjacji K_D wynosiła 6,7 x 10’¹⁰ M. Takie powinowactwo jest około 5000 razy większe niż powinowactwo t-PA z fibryną.

Określono także metodą analizy immunologicznej Western, że przeciwciało MH1 nie reaguje krzyżowo z łańcuchami Aa, B β i gamma fibrynogenu. Stwierdzono także tą samą metodą

178 003 analizy, że przeciwciało MH1 nie reaguje krzyżowo z traktowanymi trombiną łańcuchami Aa, B β i gamma fibrynogenu. (obróbka fibrynogenu trombinaprowadzi do uwolnienia fibrynopeptydu A i fibrynopeptydu B odpowiednio z łańcuchów Aa i B β, tworząc w ten sposób łańcuchy a i (3 fibryny).

Tabela 7

Reaktywność krzyżowa przeciwciała MH1 z produktam i degradacji fibrynogenu

Czas trawienia plazminą (min.)	A405nM/30 mm.
	MH1	45J
0	0,15	1,037
10	0,10	nie mierz.
20	0,11	1,02
40	0,11	0,410
60	0,10	0,330
240	0,09	0,300

Tabela 8

Reaktywność krzyżowa przeciwciała MH1 z produktami degradacji fibryny

Czas trawienia plazminą (min.)	A405nni/3O min.
	MH1	45J
0	0,890	1,40
3	0,354	1,00
5	0,310	0,77

Ponadto, jak wskazuj ąwyniki w tabeli 7, kontrolne przeciwciało 45J wiąże się z fibrynogenem i nie reaguje krzyżowo z produktami degradacji fibrynogenu. A więc takie monoklonalne przeciwciało jest specyficznym wobec fibrynogenu monoklonalnym przeciwciałem. Specyficzne wobec fibrynogenu monoklonalne przeciwciało można stosować w dowolnym teście immunologicznym oceniającym poziom fibrynogenu w osoczu in vitro. Przeciwciało 45J charakteryzuje się też tym, że określono, że epitop 45J znajduje się na łańcuchu a fibrynogenu w regionie od reszty aminokwasowej około 206 do około 424, a najprawdopodobniej w regionie od około 207 do około 231 reszty aminokwasowej. Specyficzne wobec fibrynogenu monoklonalne przeciwciało jest przeciwciałem, które w teście mierzącym reaktywność krzyżową z fibrynogenem i z produktami degradacji fibrynogenu, jak opisano powyżej, reaktywność monoklonalnego przeciwciała z fibrynogenem trawionym plazminą przez około 40 minut jest mniejsza niż około 50% reaktywności monoklonalnego przeciwciała z fibrynogenem w chwili 0.

Hybrydomę 45J wytworzono konwencjonalnymi technikami wykorzystując konwencjonalną mysz Balb/c, immunizowanąflbryną. Jednakjako antygen można też stosować fibrynogen.

Określanie reaktywności krzyżowej z niesieciowanąfibrynąi niesieciowanymi skrzepami fibrynowymi

Określono w teście EL1SA, że przeciwciało MH1 reaguje krzyżowo nie tylko z sieciowaną fibryną(XLFn), ale także niesteciowanąfibryną(NONXLFn). Test ELISA przeprowadzono jak następuje:

1. 96-studzisnkowe p^Tei testowe do mikromiareczkatwania pawaekano 100μ1 roztw oni fibrynogenu (50 pg/ml boranu (pH 8,5) wbuforze solankowym) w temperaturze 4°C przeznoc.

178 003

2. Sieciowaną fibrynę uformowano na studzienkach pokrytych fibrynogenem przez inkubację przez 1 godzinę w temperaturze 37°C z roztworem trombiny (10 jednostek NIH na ml) w solance buforowanej Tris (TBS, pH 7,4, 50 mM Tris HC1, 150 mM NaCl) zawierającej 2 mM CaCl₂ i 10 mM cysteiny.

3. Niesieciowaną fibrynę utworzono na studzienkach pokrytych fibrynogenem przez inkubację przez 1 godzinę w temperaturze 37°C z roztworem trombiny (10 jednostek NIH na ml) w buforze fosforanowym (pH 6,1) zawierającym EDTA, do końcowego stężenia 0,0125 M.

4. Ilość związanego przeciwciała określono przez inkubację z anty-mysim koniugatem alkalicznej fosfatazy. Ilość związanego koniugatu określono przez dodanie alkalicznej fosfatazy, a powstałą kolorymetryczną reakcję obserwowano przy długości 405 nm na automatycznym czytniku płytek.

Wyniki testu pokazano w tabeli 9; można wywnioskować, że reaktywność krzyżowa przeciwciała z sieciowaną fibryną jest większa, niż z niesieciowaną. Najprostszym wyjaśnieniem jest to, że kowalencyjne sieciowanie obecne w sieciowanej polimerycznej strukturze służy do zablokowania lub zamrożenia konformacji rozpoznawanej przez przeciwciało. W niesieciowanej odmianie konformacja, chociaż powstaje, nie jest stabilizowana kowalencyjnym wiązaniem w polimerze.

Wykazano także, że przeciwciało reaguje krzyżowo ze skrzepami sieciowanymi i niesieciowanymi, tworzonymi in vitro. Sieciowaną fibrynę wytworzono inkubując roztwór fibrynogenu (w Tris (50 mM, pH 7,4) w solance, zawierającej CaCl₂ (2 mM) i cysteinę (10 mM) z trombiną(10 jednostek NIH na ml) przez 3 godziny w temperaturze 37°C. Niesieciowaną fibrynę wytworzono inkubując roztwór fibrynogenu (3 mg/ml) w buforze fosforanowym (pH 6,1) zawierającym EDTA do końcowego stężenia 0,0125 M z roztworem trombiny (10 jednostek NIH na ml) przez 3 godziny w temperaturze 37°C. Po utworzeniu się skrzepów przemyto je i inkubowano w temperaturze 37176C z 400 μΐ 1% roztworu BSA zawierającego znaczone ¹²⁵I przeciwciało MH1. Niewielkie próbki roztworu pobierano w różnych momentach i oceniano pobór przeciwciała licząc osocze w liczniku promieniowania gamma.

Tabela 10 pokazuje pobór przeciwciała w skrzepach sieciowanych i niesieciowanych.

Tabela 9

Reaktywność krzyżowa przeciwciała MH1 z sieciowaną i niesieciowaną fibryną

Stężenie przeciwciała (ng/ml)	Sieciowana fibryna	Niesieciowana fibryna
	(absorbancja, 405 nm)
100,000	0,764	0,409
50,000	0,460	0,319
25,000	0,305	0,154
12,500	0,174	0,074
6,250	0,069	0,000

Tabela 10

Reaktywność krzyżowa przeciwciała MH1 z sieciowanym i niesieciowanym skrzepem fibrynowym

Skrzep fibrynowy	% pobór znaczonego przeciwciała po 8 godzinach
Sieciowany	79%
Niesieciowany	76%

178 003

Depozyt hybrydomy. MH1 i 45 J złożono w American Type Culture Collection (ATCC) 9 czerwca 1988 i dano odpowiednio im numery dostępu HB 9739 i HB 9740. ATCC mieści się przy 12301 Parklawn Drive w Rockville, MD 20852. Przeciwciało MH1 jest przeciwciałem IgG1 z lekkim łańcuchem kappa; zaobserwowano, że przeciwciało MH1 reaguje krzyżowo nie tylko z ludzką fibryną, ale i fibryną królika.

Niniejszy wynalazek nie jest ograniczany w swym zakresie do złożonych hybrydom, raczej mają one ilustrować hybrydomy wytwarzające specyficzne wobec fibryny monoklonalne przeciwciało i specyficzne wobec fibrynogenu monoklonalne przeciwciało, zdefiniowane powyżej. Dowolna linia komórkowa funkcjonalnie równoważna mieści się w zakresie niniejszego wynalazku. Termin “funkcjonalnie równoważna” oznacza, że przeciwciało jest zdolne współzawodniczyć z przeciwciałem MH1 lub przeciwciałem 45J, do którego wiąże się przeciwciało MH1 lub w wiązaniu do epitopu fibrynogenu, z którym wiąże się przeciwciało 45J. Ponadto taki termin obejmuje także specyficzne wobec fibryny monoklonalne przeciwciała i specyficzne wobec fibcynngenu monoklonalne przeciwciała zdefiniowane powyżej, które wiążą się z epitopem różnym od epitopu, z którym wiąże się odpowiednio przeciwciało MH1 i przeciwciało 45J.

Diagnostyka in vivo i zastosowania terapeutyczne specyficznych wobec fibryny monoklonalnych przeciwciał

Skrzepy/lokalizacja choroby naczyniowej. Specyficzne wobec fibryny monoklonalne przeciwciała są zdolne do znajdowania skrzepów fibrynowych lub agregacji fibryny in vivo. Mogą więc być stosowane u ludzi do lokalizowania możliwych uszkodzeń tkanki lub naczyń oraz do obserwowania chorób naczyniowych. Specyficzne wobec fibryny monoklonalne przeciwciało jest szczególnie korzystne w tym zastosowaniu, ponieważ takie monoklonalne przeciwciało me będzie się wiązało z fibrynogenem. produktami degradacji fibryny i produktami degradacji fibrynogenu, zmniejszając w ten sposób tło, co pozwala na bardziej precyzyjną lokalizację skrzepu fibrynowego lub agregacji fibryny.

Do celów tego zgłoszenia korzystnie jest stosować oczyszczone monoklonalne przeciwciała. Korzystnie oczyszczanie można prowadzić metodami HPLC. Oczyszczanie monoklonałnych przeciwciał w celu podawania ludziom można także prowadzić metodą strącania siarczanem amonu lub sodu, a następnie dializy wobec solanki i sterylizacji filtracyjnej. Alternatywnie można w celu oczyszczenia monoklonalnych przeciwciał stosować techniki chromatografii z immunopowinowactwem.

Oczyszczone monoklonalne przeciwciała można znaczyć związkami radioaktywnymi, np. ¹²³I, ’2⁵I, ¹³'I, mTc, ¹¹'In i podawać pacjentowi dożylnie. Przeciwciało można także znaczyć sondą magnetyczną. Można wykorzystywać NMR do lokalizacji skrzepu. Po umieszczeniu się przeciwciał na skrzepie lub agregacie fibryny można wykrywać je metodą emisji tomograficznej i skanowania radlnnukleamego, ustalając lokalizację np. skrzepu lub otorbionego fibryną nowotworu.

Przykładowo oczyszczone monoklonalne przeciwciało umieszcza się w zawiesinie w odpowiednim nośniku, np. solance, w obecności lub bez ludzkiej albuminy, w odpowiedniej dawce i podaje się pacjentowi. Monoklonalne przeciwciała korzystnie podaje się dożylnie, np. przez ciągłą infuzję dożylną przez kilka godzin.

Leczenie chorób naczyniowych koniugatami monoklonalnych przeciwciał. Monoklonalne przeciwciała można zastosować w połączeniu z szerokim zakresem środków farmaceutycznych, takich jak reagenty cytotoksyczne i trombolityczne, np. t-PA, streptokinaza urokinazy i inne proteazy zdolne do rozpuszczania fibryny. Takie zastosowanie jest szczególnie korzystne, ponieważ monoklonalne przeciwciała specyficzne wobec fibryny pozwalają na bardzo wydajne stosowanie takich reagentów·', gdyż nie będą one tracone na wiązanie z fibrynogenem, produktami degradacji fibryny i produktami degradacji fibrynogenu. Z różnych przeglądów literaturowych na ten temat patrz Bale i m., 1980, Cancer Research, 40:2965-297; Ghose i Blair, 1978, J. Natl. Cancer Inst., 61(3):657-676; Grergoriadis, 1977, Nature, 265:407-411; Gregoriadis, 1980,Pharmac. Ther. 10:103-108 oraz Trouet i in., 1980, Recent Results Cancer Res. 75:229-235.

178 003

Sposoby stosowane do wiązania tych środków do cząsteczki monoklonalnego przeciwciała mogą obejmować albo niekowalencyjne, albo kowalencyjne wiązania. Ponieważ niekowalencyjne wiązania łatwiej ulegają zerwaniu, zanim kompleks przeciwciała osiągnie docelowe miejsce, korzystniejsze są wiązania kowalencyjne. Np. wiązanie karbodiimidowe może powstać pomiędzy grupą karboksylową środka farmaceutycznego i grupami aminowymi cząsteczki przeciwciała. Można stosować dwufunkcyjne środki, takie jak dialdehydy lub imidoestry, do związania grupy aminowej leku z grupami aminowymi cząsteczki przeciwciała. Do wiązania leku z cząsteczką przeciwciała można stosować reakcję z zasadą Schiffa. Sposób ten obejmuje utlenianie nadtlenkiem leku lub środka cytotoksycznego zawierającego glikol lub grupę hydroksylową z wytworzeniem aldehydu, który poddaje się reakcji z cząsteczkąprzeciwciała. Wiązanie zachodzi poprzez tworzenie zasady Schiffa z grupami aminowymi cząsteczki przeciwciała. Ponadto leki z reaktywnymi grupami sulfhydrylowymi sprzęgano z cząsteczkami przeciwciał.

Wykrywanie i pomiar in vitro rozpuszczalnej fibryny

Tło. Jak opisano powyżej, mechanizm hemostatyczny obejmuje kompleksową sekwencję reakcji, dzięki którym fibrynogen przekształca się ostatecznie dzięki trombinie w fibrynę. Wynikiem takich reakcji jest wytworzenie trombusa (skrzepu krwi). Sekwencje reakcji można łatwo opisać trój etapowym procesem:

Etap 1 - Proteoliza: Fibrynogen —>Monomery fibryny + Fibrynopeptydy A i B

Etap 2 - Polimeryzacja: Monomery fibryny —> Rozpuszczalne polimery fibryny

Etap 3 - Zakrzepnięcie: Rozpuszczalne polimery fibryny -a Skrzep fibrynowy

Fibrynogen składa się z trzech par nieidentycznych łańcuchów polipeptydowych: Aoc, Ββ i γ. Patrz L. Stryer, Biochemistry, wyd. 3, str. 249, W. H. Freeman and Company New York (1988). We wstępnym etapie przy przekształcaniu fibrynogenu w fibrynę, pokazanym powyżej jako etap 1, fibrynogen j est przecinany przez trombinę w celu uwolnienia fibrynopeptydu A z końców aminowych dwu łańcuchów Aoc. Powstały monomer jest monomerem fibryny Des AA. Jak pokazuje etap 1, jednocześnie, ale wolniej, trombina odcina także fibrynopeptyd B z końców amonowych dwu łańcuchów Ββ. W wyniku uwolnienia fibrynopeptydów odsłaniane sąnowe końce aminowe na łańcuchach fibryny α i β. Jak pokazano powyżej, cząsteczkami tworzonymi w etapie 1 są: fibrynopeptyd A, fibrynopeptyd B i monomer fibryn DesAA i DesAABB, opisane powyżej jako “monomery fibryny”. Patrz W. Nieuwehuizen, Blood Coagulation and Fibrinolysis, 4:93-95 (1993). Jak pokazano powyżej w etapie 2, monomery fibryny tworzą niekowalencyjne (niesieciowąne) i kowalencyjne (sieciowane) polimery tworząc rozpuszczalne polimery fibryny. Jak pokazano powyżej w etapie 3, rozpuszczalne polimery fibryny tworzą następnie skrzep fibrynowy.

Rozpuszczalną fibrynę definiuje się jako dowolne cząsteczki pochodzące z fibrynogenu lub fibryny, które mogą prowadzić do tworzenia polimeru fibryny lub dowolne cząsteczki pochodzące z fibrynogenu lub fibryny, które mająmasę cząsteczkową rodzimego fibrynogenu, i zachowuje się w krwi w roztworze. Niesieciowąne i sieciowane polimery fibryny DesAABB, powstające w etapie 2 powyżej, są dwoma z wielu rozpuszczalnych fibryn i dwoma z wielu rozpuszczalnych polimerów fibryny. Ponadto termin “rozpuszczalna fibryną” obejmuje wiele innych cząsteczek, np. polimery fibryny DesAA, kompleksy powstałe z oddziaływań pomiędzy monomerami fibryny (DesAA lub DesAABB) i produktami degradacji fibrynogenu X, Y, D i E (patrz podrozdział 5.1 powyżej, opis takich produktów degradacji), a także, np., monomery Des A i DesAABB w kompleksie z fibrynogenem, patrz Nieuwehuizen, str. 93-94.

Rozpuszczalne polimery fibryny są bezpośrednimi prekursorami nierozpuszczalnej fibryny, to jest skrzepu, a więc można przypuszczać, że poziom rozpuszczalnych polimerów w osoczu podnosi się u pacjentów bez obecności trombozy (tworzenia wewnątrznaczyniowych skrzepów). Wykrywanie i pomiar ilości tych polimerów w krwi, w szczególności rozpuszczalnych polimerów fibryny DesAABB, będzie więc przydatnym wskaźnikiem zaczynającego się tworzenia skrzepu. Patrz Bang i Chang, str. 119-121, i Nieuwehuizen, str. 94, Marder i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5206140.

Pewne rodzaje rozpuszczalnej fibryny wykrywano już uprzednio lub mierzono i wykrywano różnymi sposobami, obejmującymi np. pomiar zawartości fibrynopeptydu A, pomiar z zasto32

178 003 sowaniem przeciwciał wobec epitopów Aa i γ udostępnionych w czasie konwersji fibrynogenu do fibryny, Nieuwehuizen, 94-96 i pomiar D-dimerów, Marder i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5206140. Inne sposoby stosowane do wykrywania i pomiaru zawartości rozpuszczalnej fibryny obejmują pomiar aglutynacji erytrocytów powleczonych fibryną w obecności rozpuszczalnej fibryny, chromatografia wykluczająca na żelu, wzrost szybkości aktywacji plazminogenu aktywatorem plazminogenu t-PA, patrz Nieuwehuizen, str. 94, żelowanie etanolem lub siarczanem protaminy, N-terminalna analiza frakcji fibrynogenu oczyszczonej z osocza, inkorporacja znaczonego ¹⁴C estru etylowego glicyny i chromatografia na żelu agarowym, patrz Bang i Chang, str. 191-110. Żaden z tych testów nie wykrywa ani nie mierzy ilości zarówno sieciowanych, jak i niesieciowanych rozpuszczalnych polimerów fibryny.

Test in vitro na rozpuszczalne sieciowane polimery fibryny i rozpuszczalne niesieciowane polimery fibryny według wynalazku. Wynalazek jest oparty na odkryciu, że możliwe jest przeprowadzenie testu in vitro w celu wykrycia i zmierzenia ilości rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB, które to polimery są złożone z monomerów fibryny DesAABB, w teście, który nie wykrywa (a) fibrynogenu, (b) produktów degradacji fibrynogenu, (c) monomerów fibryny DesAA, (d) polimerów fibryny DesAA, (e) monomerów fibryny DesAABB, (f sieciowanego fibrynogenu (fibrynogen traktowany czynnikiem XIHa), (g) kompleksów monomer fibryny DesAA-fbrynogen oraz (h) produktów degradacji fibryny (“cząsteczki (a)-(h)”). Produktami degradacji fibrynogenu i produktami degradacji fibryny są związki powstające przez trawienie plazmmą fibrynogenu lub fibryny.

Sądzi się, że opisany powyżej sposób według wynalazku jest szczególnie przydatny w diagnostyce klinicznej stanów charakteryzujących się zakrzepicą.

Sposób ten można prowadzić stosując dowolnąpróbkę płynów ustrojowych, ale korzystnie wykonuje się go na próbce krwi ssaka. Odpowiednie ssaki obejmująkróliki, małpy i ludzi, korzystnie ludzi.

Po wykryciu, ilości rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB w próbce można zmierzyć albo przez porównanie z próbką kontrolną, albo przez zastosowanie wzorców zawierających znane ilości rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB, a nie zawierających żadnych z cząsteczek (a)-(h).

Środek do wykrywania jest przeciwciałem wobec rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB, nie reagującym krzyżowo z (a) fibrynogenem, (b) produktami degradacji fibrynogenu, (c) monomerami fibryny DesAA, (d) polimerami fibryny DesAA, (e) monomerami fibryny DesAABB, (f sieciowanym fibrynogenem, (g) kompleksem monomer fibryny DesAA-fibrynogen oraz (h) produktami degradacji fibryny. Takie przeciwciało można stosować do wykrywania i mierzenia ilości rozpuszczalnego sieciowanego polimeru fibryny DesAABB i rozpuszczalnego niesieciowanego polimeru fibryny DesAABB w próbce. Przeciwciała takie obejjnuiąpoliklonalne i monoklonalne przeciwciała, korzystnie monoklonalne. Przeciwciało może pochodzić z dowolnego gatunku. Korzystnie jednak pochodzi od człowieka, myszy lub królika. Ponadto takie przeciwciała obejmują między innymi chimeryczne przeciwciała, jednołańcuchowe przeciwciała i fragmenty Fab.

Przykładem takiego przeciwciała jest monoklonalne przeciwciało MH1, opisane powyżej. Sądzi się, że MH1, poza opisanapowyżej charakterystyką wiązania, nie wiąże się z kompleksem fibrynogen-produkty degradacji fibryny. Taka charakterystyka MH1 może polepszać jego skuteczność jako środka do wykrywania i mierzenia ilości rozpuszczalnych sieciowanych i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB.

Należy zauważyć, że jako środek do wykrywania można stosować dwa lub więcej przeciwciał. Tak więc można stosować łącznie przeciwciała o różnych specyficznościach w celu wykrywania i mierzenia ilości rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB w próbce, przy czym np. żadne z

178 003 przeciwciał pojedynczo nie jest w stanie kompleksować zarówno rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB, jak i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB, podczas gdy dwa lub więcej przeciwciał może tworzyć takie kompleksy. Oczywiście, żadne przeciwciało nie może reagować krzyżowo z cząsteczkami (a)-(h).

Należy zauważyć, że gdy stosuje się przeciwciała, może być konieczne wykorzystanie specyficznego dla gatunku przeciwciała.

W celu wytwarzania przeciwciał można immunizμnać różne zwierzęta wstrzykując im rozpuszczalne sieciowane polimery fibryny DesAABB i rozpuszczalne niesieciμwane polimery fibryny DesAABB j ako antygen, przy czym mogą to być między innymi króliki, myszy, szczury i tym podobne. Takie polimery można selektywnie wydzielać stosując np. przeciwciało MH1, sprzężone z kolumną z powinowactwem Sepharoseiprzeciwciało MH1. Polimery takie można wytwarzać wytwarzając najpierw odpowiednią fibrynę in vitro dodając nlewielkąilaść trombiny do cytrynianowego osocza. Po przerwaniu reakcji trombiny dodatkiem silnego inhibitora trombiny, takiego jak hirudyna, próbki osocza można podać na kolumnę Se^a^e-MEł. Kolumnę można przygotować sprzęgając przeciwciało MH1 z aktywowanym bromocyjanem Sepharose 4B (Pharmacia) w sposób znany fachowcom. Patrz wkładka do produktów Sepharose, informacje na temat sposobów wytwarzania kolumny przecinclaeaiSepharose 4B na wstępnie aktywowanym Sepharose 4B. Rozpuszczalną fibrynę umieszcza się wstępnie na kolumnie Sepharose-MH'1 w obecności buforowanej fosforanem solanki (PBS). Po związaniu z kolumną Sepharose-MH1 w obecności PBS rozpuszczalną fibrynę związaną z kolumną Sepharose-MH1 można eluować stosując roztwór tiocyjanianu sodu. Po dializie wobec PBS otrzymany rozpuszczalny polimer fibryny można przechowywać w temperaturze -70°C.

W połączeniu z wydzielonymi polimerami można stosować różne adiuwanty w celu podwyższenia odpowiedzi immunologicznej, zależne od gatunku gospodarza, obejmujące między innymi adiuwant Freunda (pełny i niepełny), żele mineralne takie jak wodorotlenek glmu, środki powierzchniowo czynne takie jak lizolecytyna, pluroniczne poliole, poRaniony, pe^cly, emulsje olejowe, hemocyjanina pijawki, dinitrofenol i potencjalnie przydatne ludzkie adlunanty, takie jak BCG (zarazek Calmette-Guerin) i coryenbacterium parvum.

Monoklμnalne przeciwciała specyficzne wobec rozpuszczalnych sieciowanych, jak i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB, które nie reagują Przyżono z cząsteczkami (a) - (g), można wytwarzać stosując dowolną technikę pozwalającą na nytwarzenie cząsteczek przeciwciała przez ciągłe linie komórek w kulturze. Obejmują one między innymi technikę hybrydomowąμplsanąprzez Kohlera i Milsteina, (Nature, 1975,256:495-497), nowszą technikę hybrydomo wąz ludzką komórką B (Kosbor i in., 1983, Immunology Today, 4:72) i technikę hybrydomo wąEBV (Cole i in., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., str. 77-96). W dodatkowej odmianie wynalazku manμplonalne przeciwciała można wytwarzać w zwierzętach wolnych od zarazków stosując najnowszą technologię. Przykładem wytwarzania takiego przeciwciałajest wytwarzanie MH 1, opisanego w powyższym zgłoszeniu.

Według wynalazku można stosować ludzkie przeciwciała, otrzymywane z ludzkich hybrydom (Cote i in., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., 80:2026-2030) lub przez transformację ludzkich komórek B wirusem EBV in vitro (Cole i in., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., str. 77-96). W istocie, według wynalazku, można stosować techniki wypracowane do wytwarzania “chimerycznych przeciwciał” (Morrison i in., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neuberger i in., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda i in., 1985, Nature, 314:452-454) przez rozszczepienie genów z cząsteczki mysiego przeciwciała o odpowiedniej specyfice antygenowej wraz z genami z cząsteczki ludzkiego przeciwciała o odpowiedniej aktywności biologicznej; takie przeciwciała mieszczą się w zakresie wynalazku.

Według wynalazku opisane techniki wytwarzania pojedynczołańcuchonych przeciwciał (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4946778) można adaptować do wytwarzania specyficznych pojedynczołańcuchonych przeciwciał.

Dodatkowa odmiana wynalazku wykorzystuje techniki opisane przy konstruowaniu bibliotek ekspresji Fab (Huse i in., 1989, Science, 246:1275-1281) w celu umożliwienia szybkiej i łatwej iden34

178 003 tyfikacji monoklonalnych fragmentów Fab o pożądanej specyficzności wobec rozpuszczalnych sieciowanych, jak i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB.

Fragmenty przeciwciała, które zawierają specyficzne miejsca wiązania rozpuszczalnych sieciowanych, jak i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB, można wytwarzać znanymi technikami. Np. takie fragmenty obejmują między innymi; fragmenty F(ab')2, które można wytwarzać metodą trawienia pepsynowego cząsteczek przeciwciała i fragmenty Fab, które można wytwarzać redukując mostki disiarczkowe fragmentów F(ab')2Przeciwciała otrzymane w powyżej opisany sposób można stosować w dowolnych układach immunotestowych znanych fachowcom, obejmujących między innymi radioimmunotesty, immunosorpcyjne testy związane z enzymami, testy sandwiczowe, reakcje precypitynowe, immunodyfuzyjne testy na żelu, testy aglutynacyjne, immunotesty fluorescencyjne, immunotesty z białkiem A 1 testy immunoelektroforetyczne, aby wymienić tylko kilka. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4629783 i cytowane w nim opisy patentowe także omawiają odpowiednie testy.

Przeciwciała te stosuje się w sposobie według wynalazku, jako podstawowe reagenty w pewnej liczbie różnych immunotestów w celu określenia obecności rozpuszczalnych sieciowa-, nych, jak i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB w próbce krwi lub innego płynu ciała. Mówiąc ogólnie przeciwciała można wykorzystywać w każdym typie lmmunotestu, ilościowego lub jakościowego. Obejmuje on dwumiejscowe testy typu sandwiczowego i immunotesty na pojedynczych miejscach typu niewspółzawodniczącego, a także tradycyjne współzawodniczące testy wiązania.

Szczególnie korzystny, ze względu na łatwość wykrywania i ilościowąnaturę, jest test typu sandwiczowego lub z podwójnym przeciwciałem, mający wiele wariantów, z których każdy jest w zamierzeniu obejmowany przez wynalazek.

Na przykład w typowym teście sandwiczowym z wyprzedzeniem, nieznakowane przeciwciało unieruchamia się na stałym podłożu, np. studzienkach płytki do mikromiareczkowania, i testowaną próbkę styka się ze związaną cząsteczką. Po odpowiednim okresie inkubacji, wystarczającym na utworzenie podwójnego kompleksu przeciwciało-antygen, dodaje się drugie przeciwciało, znaczone zgłaszającą cząsteczką zdolną do indukcji wykrywalnego sygnału, i inkubuje przez czas dostateczny do związania z antygenem w innym miejscu i utworzenia potrójnego kompleksu przeciwciało-antygen-znakowane przeciwciało. Nieprzereagow<anąsubstancję wymyto i stwierdzono obecność antygenu obserwując sygnał, który można ocenić ilościowo porównując z próbkami kontrolnymi (wzorcami) zawierającymi znane ilości antygenu. Odmiany takiego testu sandwiczowego z wyprzedzeniem obejmiy^ą test równoczesny, w którym próbkę i przeciwciało dodaje się jednocześnie do związanego przeciwciała, lub testu sandwiczowego odwrotnego, w którym znaczone przeciwciało i badaną próbkę najpierw łączy się, inkubuje i dodaje do nieznaczonego, związanego z powierzchnią przeciwciała. Techniki te są dobrze znane fachowcom i oczywista będzie możliwość dokonywania niewielkich zmian. W niniejszym opisie “test sandwiczowy” ma obejmować wszystkie odmiany podstawowej techniki dwumiejscowej.

Jako dokładniejszy przykład, w typowym teście sandwiczowym z wyprzedzeniem, pierwsze przeciwciało jest kowalencyjnie lub pasywnie związane ze stałym nośnikiem. Stałąpowierzchniąjest zwykle szkło lub polimer, najczęściej stosowanym polimeremjest przy tym celuloza, poliakryloamid, nylon, polistyren, polichlorek winylu) lub polipropylen. Stałe nośniki mogą mieć postać rurek, kulek, pastylek lub mikropłytek, lub też dowolne inne powierzchnie nadające się do prowadzenia immunotestu. Procesy wiązania są znane fachowcom. Po związaniu kompleks stałej fazy z przeciwciałem przemywa się w przygotowaniu do próbki testowej. Porcję płynów ustrojowych poddawanych testowi dodaje się do kompleksu stałej fazy i inkubuje przez czas dostateczny do związania rozpuszczalnego sieciowanego polimeru fibryny DesAABB i rozpuszczalnego niesieciowanego polimeru fibryny DesAABB z przeciwciałem specyficznym dla danego białka. Następnie dodaje się drugie przeciwciało do kompleksu fazy stałej i inkubuje przez dodatkowy okres dostateczny do związania drugiego przeciwciała z kompleksem w fazie stałej pierwsze przeciwciało-antygen. Drugie przeciwciało wiąże się ze zgłaszającą cząsteczką, której widoczny sygnał jest stosowany do wskazywania wiązania drugiego przeciwciała z anty178 003 genem w próbce. Przez “zgłaszającą cząsteczkę” w niniejszym opisie rozumie się cząsteczkę, która ze swej natury chemicznej daje analitycznie wykrywalny sygnał pozwalający na wykrywanie związanego z antygenem przeciwciała. Wykrywanie musi być co najmniej ilościowe, aby można było określić ilość antygenu w próbce, obliczonąw sposób absolutny lub względem wzorca (lub serii wzorców) zawierających znany normalny poziom antygenów.

Najczęściej stosowane zgłaszające cząsteczki w tym typie testu są enzymami lub fluoroforami. W przypadku immunotestu enzymatycznego enzym sprzęga się z drugim przeciwciałem, często przy pomocy aldehydu glutarowego lub nadjodanu. Jak jednak można łatwo stwierdzić, istnieje wiele różnych technik sprzęgania, znanych fachowcom. Zwykle stosowane enzymy obejmująmiędzy innymi peroksydazę chrzanu, oksydazę glukozy, β-galkttozydaz ę f fosfatazę alkaliczną. Substraty stosowane z konkretnymi enzymami dobiera się ze względu na wytwarzanie, w czasie hydrolizy enzymu, wykrywalnej zmiany zabarwienia. Np. fosforan p-nitrofenylujest odpowiedni do stosowania z koniugatami alkalicznej fosfatazy; dlakoniugatów peroksydazy zwykle stosuje się 1,2-fenylenodiaminę lub toluidynę. Możliwe jest także wykorzystywanie fluorogenów, które dają produkt fluorescencyjny, w odróżnieniu od chromogennych substratów opisanych wyżej. We wszystkich przypadkach przeciwciało oznaczone enzymem dodaj e się do kompleksu pierwszego przeciwciała i pozwala mu się związać z kompleksem, następnie wypłukuje się nadmiar reagentu. Następnie dodaje się roztwór zawierający odpowiedni substrat do potrójnego kompleksu przeciwciało-antygen-znaczone przeciwciało. Substrat reaguje z enzymem związanym z drugim przeciwciałem, dając jakościowy wizualny sygnał, który można potraktować następnie ilościowo, zwykle spektrofotometrycznie, otrzymując oszacowanie ilości antygenu obecnej w próbce osocza.

Alternatywnie, związki fluorescencyjne, takie jak fluoresceina i rodamina, można chemicznie sprzęgać z przeciwciałami bez zmieniania ich zdolności wiążącej. Po aktywacji przez oświetlenie światłem o konkretnej długości fali znaczone' fluorochromowo przeciwciało absorbuje energię świetlną, indukującą pobudzenie cząsteczki i emisję światła o określonej długości fali. Emisja pojawia się jako charakterystyczne zabarwienie widoczne pod mikroskopem optycznym. Jak w immunoteście enzymatycznym (ELISA) znaczone fluorescentem przeciwciało wiąże się z kompleksem z pierwszym antygenem. Po wymyciu nieowiązαnegf reagenta pozostały potrójny kompleks wystawia ' się na działanie światła o określonej długości fali, a obserwowana fluorescencja 'świadczy o obecności antygenu. Immunofluorescencja i techniki EIA są szczególnie korzystne dla celów niniejszego wynalazku. Jednak można także stosować inne zgłaszające cząsteczki, takie jak radioizotopy, cząsteczki chemfluminescencyjne lub bioluminescencyjne.

Alternatywnie testowaną próbkę krwi ssaka lub innych płynów ustrojowych zawierającą rozpuszczalny niesieciowany polimer fibryny DesAABB i rozpuszczalny sieciowany polimer fibryny DesAABB można stosować w immunoteście na pojedynczym miej scu, w którym łączy się ze stałym podłożem kowalencyjnie lub niekowalencyjnie. Naznaczone przeciwciało styka się z próbką związaną ze stałym podłożem. Po odpowiednim okresie inkubacji przez czas dostateczny do powstania podwójnego kompleksu przeciwciało-antygen dodaje się drugie przeciwciało znakowane zgłaszającą cząsteczką zdolną do wytwarzania wykrywalnego sygnału, i inkubację kontynuuje się przez czas dostateczny do powstania potrójnego kompleksu przeciwciało-antygen-znaczfne przeciwciało. W immunoteście na pojedynczym miejscu drugie przeciwciało może być przeciwciałem ogólnym (to jest ksenogennego przeciwciała wobec immunoglobuliny, szczególnie anty-(IgM lub IgG) związanego z cząsteczką zgłaszającą) zdolnym do wiązania przeciwciała specyficznego rozpuszczalnego sieciowanego polimeru fibryny i rozpuszczalnego niesieciowanego polimeru fibryny.

Wykrywanie i pomiar zawartości rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB, jak i rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB in vitro jest szczególnie korzystne, gdy takie wykrywanie i pomiar zawartości wykonuje się stosując osocza pacjentów w celu uzyskania wskaźnika grożącego lub istniejącego skrzepu w wyniku grożącej lub istniejącej zakrzepicy. Patrz Nieuwehuizen, str. 94, Bang i Chang, str. 109-122 oraz Marder i

178 003 in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5206140. Takie przypadki obejmująnp. głęboką żylną zakrzepicę (DVT), stan powstający w wyniku tworzenia skrzepów w głębokich żyłach nogi, zator tętnicy płucnej (PE), powstający, gdy skrzep przemieszcza się z głębokich żył i blokuje płucne naczynia, rozproszona koagulacja wewnątrznaczyniowa, powstająca w wyniku układowej aktywacji kaskady krzepnięcia krwi (np. w wyniku infekcji bakteryjnej), zawał mięśnia sercowego (MI), powstający w wyniku skrzepu w arteriach wieńcowych dostarczających krwi do mięśnia sercowego, udar i skrzepy wewnątrzsercowe powstające w wyniku migotania przedsionków. Typ przypadku skrzepowego może być diagnozowany przez zastosowanie testu na wykrywanie i pomiar zawartości rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB i rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB w połączeniu z obserwacją innych objawów pacjenta. Wykorzystywane objawy to objawy, jakie zwykle stosowałoby się w klinicznej diagnostyce zagrażającego przypadku trombotycznego. Np. wykrywanie i pomiar zawartości rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB jest szczególnie korzystne jako środek do odróżnienia pacjentów z bólami piersi wskutek zagrożenia M1 od pacjentów z bólami piersi z innych powodów.

Przykłady

Białka. Białko surowicy bydlęcej i trombinę zakupiono z ICN (Costa Mesa, CA). Hirudynę, peroksydazę chrzanu i dichlorowodorek o-fenylenodiaminy w tabletkach jako podłoże zakupiono w Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Ludzki fibrynogen (czystość L) zakupiono z Helena Laboratories (Beaumont, TX). Fibrynogen oczyszczono jeszcze metodą strącania z siarczanem amonu opisany przez Holma i in., Thromb. Res. 37:165-176 (1985). Antyfibrynowe monoklonalne przeciwciało, MH1, stosowane w układach testowych wytworzono w opisany powyżej w podrozdziale 5. Antyfibrynogenowe monoklonalne przeciwciało, 45 J, stosowane w układach testowych wytworzono w opisany powyżej w podrozdziale 5.

Monomer fibryny DesAABB wytworzono przez rozpuszczenie niesieciowanego polimeru fibrynowego w roztworze 50 mM bufora (pH 5,3) zawierającym bromek sodu.

Sieciowane rozpuszczalne polimery fibrynowe DesAABB wytworzono przez inkubację fibrynogenu lub cytrynianowego osocza o niskiej zawartości trombiny (0,025 jednostek na ml) przez 7-8 minut. Mieszanina reakcyjna zawierała też czynnik XIIIa. Reakcję przerwano dodając hirudynę do mieszaniny reakcyjnej przy końcowym stężeniu 10 ATU/ml.

Niesieciowane rozpuszczalne polimery fibrynowe DesAABB wytworzono przez inkubację cytrynianowego osocza lub fibrynogenu z roztworem trombiny zawierającym EDTA (stężenie końcowe 12 mM) przez 7-8 minut w temperaturze 37°C. Reakcję przerwano dodając nadmiar hirudyny do mieszaniny reakcyjnej przy końcowym stężeniu 10 ATU/ml.

Koniugat MH1 i 45J z peroksydazą chrzanu (adaptowany według Wilsona i Nakane, Immunofluorescence and Related Staining Techniques, wyd, Knapp i in., str. 215-224, Elsevier/North Holland Biomedical Press, Amsterdam (1978)).

Peroksydazę chrzanu (HRP) (RZ>3) (10 mg) rozpuszczono w 1 ml wody destylowanej. Dodano świeżo wytworzony roztwór 0,1 M nadjodanu sodu (0,4 ml) i mieszano łagodnie przez 20 minut. Roztwór przeniesiono do bufora z octanem sodu (1 % mM, pH 4,4) w temperaturze 4°C stosując zatężacz Centrico 10 |X

Odczyn pH roztworu podniesiono do 9,5 dodając 40 pl 0,2 M bufora z węglanu-wodorowęglanu sodu (pH 9,5). Następnie natychmiast dodano przeciwciało MH 1 (20 mg) w 2,0 ml 0,01 M bufora z węglanu-wodorowęglanu sodu (pH 9,5). Roztwór mieszano łagodnie w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, po czym dodano 0,2 ml świeżo wytworzonego roztworu borowodorku sodu (4 mg/ml). Mieszaninę pozostawiono na 2 godziny w temperaturze 4°C.

Na koniec koniugat HRP dializowano wobec 5x41 PBS w temperaturze 2-8°C.

Koniugat przechowywano w brązowym pojemniku w temperaturze 2-8°C.

Próbki krwi.. Próbki krwi otrzymano za zgodą zarówno zdrowych ochotników, jak i od pacjentów z izby przyjęć z klinicznymi objawami M1, np. silnymi bólami piersi. Próbki krwi zebrano w cytrynianie w cytrynianie sodu w próżniowych pojemnikach (Becton Dickinson). Osocze

178 003 oddzielano przez odwirowanie przy prędkości 2400 obrotów na minutę przez 15 minut. Osocze stosowano natychmiast lub zamrażano w temperaturze -70°C.

Procedura ELISA do pomiaru zawartości rozpuszczalnej fibryny. Rozpuszczalną fibrynę wykrywano w świeżych lub mrożonych próbkach osocza stosując immunotest sandwicznwy z enzymem. Wiążącym przeciwciałem w wynalazku było antyfibrynowe przeciwciało MH1. Wykrywające (lub znacznikowe) przeciwciało było koniugatem HRP antyfibrynowego przeciwciała 45J wykorzystywanym jako znacznikowe.

96-studzienkowe płytki testowe z polichlorku winylu) (PCW) do mikromlarenzkowania (Costar Cambridge, MA) powlekano mnnoklnnalnym przeciwciałem MH 1 przez inkubacj ę 100 pl roztworu Mab (50 pg/ml) w buforze powlekającym (boran sodu, pH 8,5) przez 12-15 godzin w temperaturze 4°C. Niezwiązane przeciwciało usunięto z płytek przemywając studzienki trzykrotnie roztworem PBS-Tween. Powlekane MH1 studzienki pokryto następnie BSA inkubując 200 pl roztworu BSA (1%) w PBS (PBS-BSA) przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Niezwiązany BSA usunięto odwracając płytki i postukując łagodnie na ręczniku papierowym. Próbki z cytrynianu (50 pl) zawierające rozpuszczalną fibrynę inkubowano w studzienkach blokowanych MH 1-BSA przez 30 minut w temperaturze 37°C. Niezwiązaną substancję usunięto odwracając płytki i postukując łagodnie. Studzienki przemyto trzykrotnie PBS-Tween. Związaną rozpuszczalną fibrynę wykrywano inkubując najpierw 100 pl roztworu PBS-BSA koniugatu MH1-HRP (lub koniugatu HRP z antyfibryno(geno)wym przeciwciałem, 45 J) w studzienkach przez 30 minut w temperaturze 37°C. Niezwiązany koniugat usunięto odwracając płytkę i przemywając studzienki 3 razy PBS-Tween. Związany koniugat wykrywano dodając 100 pl roztworu dichlorowodorku o-fenylenodiaminy w ciągu 100 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór substratu wytworzono rozpuszczając tabletkę dichlorowodorku o-fenylenodiaminy w cytrynianie sodu zawierającym H₂o₂.

Kolorymetcycznąceakcję zatrzymano po 10 minutach dodatkiem 25 pl roztworu H2SO4 (1M). Absorbancję roztworu w każdej studzience określono pizy długości dali 490 nm w czytniku płytek do mikromiareczkowania Thermomax (Molecular Devices, Menlo Park, CA).

Wytwarzanie kolumn do chromatografii z powinowactwem. Kolumny Sepharose-MHl wytworzono w poniższy sposób.

g świeżo osuszonego, aktywowanego bromocyjanem Sepharose 4B (Pharmacia) odważono i umieszczono w zawiesinie w 1 mM HC1. Spęczniały żel przemywano przez 15 minut w 1 mM HC1 na spiekany szklanym filtrze.

Przeciwciało MH1 (20 mg) rozpuszczono w buforze sprzęgania (0,1 M NaHCO₃, pH 8,3 zawierającym 0,5 M NaCl) i łagodnie mieszano ze spęczniałym żelem w zakorkowanym naczyniu przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.

Po zmieszaniu żel przemyto buforem sprzęgającym w celu usunięcia nadmiaru przeciwciała. Niezablokowane miejsca aktywne zablokowano traktując 0,1 M Tns-HCl, pH 8,0 (lub 1M etanoloaminą, pH 9,0) przez 2 godzony w temperaturze pokojowej. Żel związany z przeciwciałem przemyto następnie trzykrotnie 0,1 M buforem octanowym (pH 4,0 zawierającym 0,5 M NaCl), następnie buforem Tris (0,1 M, pH 8,0 zawierającym 0,5 M NaCl). Sprzężone przeciwciało przechowano w temperaturze 4°C w roztworze azydku sodu (0,05%).

Kolumny Sepharose-monomer fibryny DesAABB wytworzono w następujący sposób: monomery fibryny DesAABB sprzężono z aktywowanym bromocyjanem Sepharose 4b w obecności 1 M NaBr w 0,1 M buforze boranowym (pH 8,2) stosując procedurę opisaną powyżej dla wytwarzania Sepharose-MHl.

Właściwości jednostki rozpuszczalnej fibryny rozpoznawanej w teście in vitro dla rozpuszczalnych polimerówfibryny stosując MH1 do wykrywania rozpuszczalnejfibryny. Wykazano powyżej, że przeciwciało MH1 nie rozpoznaje fibrynogenu, prekursora polimeru fibryny z osocza. Wykazano także, że przeciwciało rozpoznaje zarówno sieciowane, jak i niesieciowane polimery fibrynowe. Ponadto, plazminowa degradacja fibryny (jakikolwiek proces prowadzący do zniszczenia polimerycznej struktury fibryny) powoduje utratę immunologicznego rozpoznawania fibryny przez takie przeciwciało. Wobec tego, przeciwciało MH1 nie rozpoznaje żadnego ze znanych produktów degradacji plazminowej sieciowanej fibryny.

178 003

Dowody, że przeciwciało MH1 rozpoznaje tylko polimeryczną strukturę fibryny DesAABB i nie rozpoznaje monomerycznej fibryny DesAABB, otrzymano metodą chromatografii z powinowactwem. 0,1 mg przeciwciała MH1 przepuszczono przez kolumnę 5 ml Sepharose-monomer fibryny DesAABB. Kolumnę przemyto buforem równoważącym (0,1 M solanki buforowanej Tris (TBS), pH 8,5). Nie zanotowano znaczącego wiązania przeciwciała do kolumny. Jak pokazano na fig. 1A, przeciwciało eluowało w czasie eluowania kolumny. Gdy kolumnę przepłukiwano 6 M chlorowodorkiem guanidyny, odzyskano małą ilość związanego białka. Białko wykryto obserwując wszystkie frakcje przy długości fali 280 nm. Przeciwciało oznaczono testując immunoreaktywność białka metodą testu ELISA w fazie stałej stosując studzienki płytki pokrytej fibryną. Patrz, opis testu ELISA. Białko związane z kolumnąjest wynikiem obecności niewielkich ilości rozpuszczalnego polimeru fibryny DesAABB zanieczyszczającego sprzężony z kolumną monomer fibryny DesAABB. Zanieczyszczenie tojest obecne w substratach stosowanych do wytwarzania kolumny monomeru fibryny DesAABB. W celu wykazania, że kolumna Sepharose-monomer fibryny DesAABB jest zdolna do wiązania przeciwciała, specyficzne wobec fibrynogenu monoklonalne przeciwciało (Mab) przepuszczono przez kolumnę w eksperymencie kontrolnym.

Jak pokazuje fig. 1B, kolumna związała kontrolne Mab, antyfibrynogenowe przeciwciało 45J, i potrzebne było działanie chlorowodorku guanidyny (6 M) w celu wyeluowania przeciwciała 45J.

Dowody, że przeciwciało MH1 opisane powyżej rozpoznaje zarówno niesieciowane, jak i sieciowane rozpuszczalne polimery fibryny DesAABB, otrzymano w eksperymencie, w którym wytworzono rozpuszczalne polimery fibryny DesAABB przez dodanie trombiny do cytrynianowych próbek osocza w obecności i nieobecności EDTA (EDTA zapobiega sieciowaniu polimerów fibryny DesAABB przez Czynnik XIIIa). Sieciowane i niesieciowane rozpuszczalne polimery fibryny DesAABB otrzymano jak opisano poprzednio, a ich odpowiednie immunoreaktywności zmierzono stosując ELISA również jak opisano poprzednio. Jak pokazuje fig. 2, nie ma znaczącej różnicy w immunoreaktywności sieciowanego (B) i niesieciowanego (C) polimeru fibryny w układzie testowym.

Dowody, że przeciwciało MH1 nie rozpoznaje rozpuszczalnego polimeru fibryny DesAA, otrzymano w eksperymencie, w którym polimer fibryny DesAA wytwarza się traktując fibrynogen lub osocze otrzymanym z jadu żmii enzymem batroksobiną z Bothrops atrox, selektywnie odcinającą fibrynopeptyd A (FPA) z cząsteczki fibrynogenu. Batroksobina nie odcina fibrynopeptydu B (FPB), w odróżnieniu od trombiny, która odcina FPA i FPB. Usunięcia FPA powoduje polimeryzację jednostek monomeru fibryny DesAA z utworzeniem skrzepu fibryny. Figura 3 pokazuje tworzenie skrzepu mierzone absorbancją mieszaniny reakcyjnej przy 340 nm, gdy roztwór batroksobiny inkubuje sięprzez 15 minut w temperaturze pokojowej z próbką fibrynogenu. Absorbancja rośnie stopniowo z czasem w miarę przedłużania się długości i stężenia polimerów rozpuszczalnej fibryny DesAA, aż do utworzenia skrzepu. W doświadczeniu testującym rozpoznawanie przez MH1 fibryny DesAA, polimer rozpuszczalnej fibryny DesAA wytworzono in vitro przez inkubacj ę próbki fibrynogenu z batroksobiną (końcowe stężenie 0,5 j ednostek na ml) w temperaturze 37°C. Porcję usuniętą z próbki traktowanej batroksobiną po 7 minutach testowano w teście ELISA. Próbka ta, próbka C, nie wykazała żadnej reaktywności, co pokazuje fig. 4. Można wydedukować z eksperymentu, że układ testowy nie rozpoznaje kompleksu fibrynogen-fibryna DesAA, będący innym źródłem rozpuszczalnej fibryny. Wyraźnie mieszanina reakcyjna wytwarzana w tym eksperymencie będzie zawierała taką “rozpuszczalną fibrynę”, ponieważ batroksobina wytwarza monomery fibryny DesAA wolne od oddziaływań z innymi monomerami DesAA lub nietrawionymi cząsteczkami fibrynogenu. Ponieważ w układzie testowym nie zachodziła żadna reakcj a po dodaniu batroksobiny, można wyciągnąć wniosek, że test nie wykrywa takich jednostek fibrynogen-fibryna DesAA. Próbka B, będąca pozytywną kontrolną próbką, była złożona z polimerów fibryny utworzonych przez działanie na próbkę osocza trombiną lub hirudyną. Nietraktowany fibrynogen, próbka A, dodano jako negatywną próbkę kontrolną.

178 003

Rozpuszczalny kompleks fibryny może także powstać wskutek sieciowania przez Czynnik XIIIa rodzimego fibrynogenu z utworzeniem dimerów fibrynogenu (Kanaide i in., J. Lab. Clin. Med. 86:574-579 (1975)). W układzie testowym nie wykrywa się fibrynogenu traktowanego Czynnikiem XTTia (FXIIIa). W tym eksperymencie płytki do mikromiareczkowania powlekane fibrynogenem potraktowano aktywowanym trombiną Czynnikiem XIIIa przez 1,5 godziny w temperaturze 37°C. Po przerwaniu działania trombiny przeciwciało MH1 inkubowano w studzienkach pokrytych FXIIIa i związany MH1 wykrywano stosując anty-mysi koniugat alkalicznej fosfatazy. Związane anty-mysie przeciwciało wykrywano dodając alkaliczną fosfatazę. Poziom MH1 związanego ze studzienkami zmierzono odczytując optyczną gęstość przy długości 490 nm. Figura 5, próbka oznaczona Fg+FXIIIa pokazuje, że ze studzienkami nie wiąże się żadne MH1, co wskazuje, że przeciwciało nie rozpoznaje sieciowanych struktur fibrynogenu. Jako pozytywną kontrolę potraktowano trombiną powlekane fibrynogenem studzienki z utworzeniem polimerów fibryny DesAABB i przetestowano na immunoreaktywność z przeciwciałem Mh1, fig. 5, próbka oznaczona Fg + trombiną.

Pomiarpowstawania rozpuszczalnego polimeru fibryny DesAABB in vitro. Rozpuszczalne polimery fibryny DesAABB wytworzono in vitro przez dodanie niewielkich ilości trombiny (0,025 jednostek NIH na ml) do cytrynianowej próbki osocza. Próbkę inkubowano w temperaturze 37°C. Porcje usuwano z próbki w odstępach co 1 minutę i wstrzymywano aktywność trombiny dodatkiem silnego inhibitora trombiny, hirudyny (końcowe stężenie 2 ATU/ml). Ilość rozpuszczalnego polimeru fibryny DesAABB w każdej porcji zmierzono procedurą ELISA opisaną w podrozdziale 6.3.4.

Jak pokazuje fig. 6, ilość rozpuszczalnego polimeru fibryny, wskazywana przez absorbancję przy 490 nm, rośnie gwałtownie po początkowym okresie stagnacji 4-5 minut po dodaniu trombiny do osocza. Poziom rozpuszczalnych polimerów fibryny osiąga maksimum po około 7,5 minuty po dodaniu trombiny do osocza. Ostry spadek poziomu rozpuszczalnej fibryny obserwowany po 9-10 minutach zbiega się z żelowaniem i powstawaniem nierozpuszczalnych polimerów fibryny (tworzenie skrzepu).

Oczyszczanie rozpuszczalnych polimerów fibryny z osocza metodą chromatografii powinowactwa Sepharose-MHl. Próbkę osocza inkubowano z trombiną (0,025 j ednostek na ml) przez 7 minut w temperaturze 37°C. Działanie trombiny zatrzymano dodatkiem nadmiaru hirudyny. Mieszaninę reakcyjną przepuszczono przez kolumnę Sepharose-MH1. Substrat, przepuszczono (niezwiązaną) substancję, związane białko (oczyszczone białko) eluowane NaSCN (3) i dializowane wobec PBS, testowano na immunoreaktywność z MH1 w teście ELISA. Immunoreaktywność osocza traktowanego trombiną po zatrzymaniu reakcji hirudyną (substrat), związanego białka po usunięciu z kolumny i dializie (eluat) i niezwiązanej substancji (niezwiązane) pokazano na fig. 7. Substrat i związane białko po dializie wykazywało immunoreaktywność z mH1, a niezwiązana substancja nie wykazywała jej.

Detekcja in vitro i pomiar zawartości rozpuszczalnych sieciowanych i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny w celu diagnozowania Ml. Zbadano 36 różnych próbek osocza zbadano na zawartości rozpuszczalnych sieciowanych i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB stosując test ELISA z MH1 jako przechwytującym przeciwciałem. Po zebraniu próbki osocza umieszczono w antykoagulancie i zamrożono. Rozmrożone próbki przetestowano na zawartości rozpuszczalnych sieciowanych i niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB. Dziesięć z 36 próbek pobrano od zdrowych ludzi dla kontroli. Zdrowi ludzie rekrutowali się z personelu laboratoryjnego o doskonałym zdrowiu, nie cierpiącego na bóle w piersiach nawet po wysiłku. Wszystkie pozostałe próbki pochodziły od pacjentów z izby przyjęć lokalnego szpitala publicznego. Wszyscy pacjenci z izby przyjęć wykazywali kliniczne objawy (bóle piersiowe) sugerujące zawał serca (MI); z tych u 15 istotnie potwierdzono wystąpienie M1, a 11 nie cierpiało na M1. W tej ostatniej grupie wystąpiły różne kliniczne stany, takie jak angina pectoris, lęki, puchlina płucna. Próbki krwi pobrano od pacjentów natychmiast po przyjęciu na izbę przyjęć. W większości przypadków zanotowano informację o długotrwałości objawów. W stadium tym wszyscy pacjenci odczuwali bóle w piersiach przez 1 -3 godziny przed przyjęciem. Jak pokazuje fig. 8, we wszystkich przypadkach pacjenci z potwierdzonym MI wykazywali znacząco wy40

178 003 ższe poziomy rozpuszczalnych polimerów fibryny DesAABB, niż zdrowe osoby kontrolne (3-30-krotne różnice). U pacjentów z bólami piersiowymi, ale bez MI, poziomy rozpuszczalnych polimerów fibryny DesAABB nie były znacząco różne od wartości u osób zdrowych (poziomy rozpuszczalnych sieciowanych i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB pokazano jako “Poziomjednostek ELISA rozpuszczalnej fibryny (x 1000)”).

Czułość tego układu testowego wynosiła więc 100% (dla n=36), a specyficzność także 100% (dla n=36), to jest nie było fałszywych wyników pozytywnych ani negatywnych. Można więc wnioskować, że ten układ testowy wykazuje duży poziom diagnostycznej dokładności na zawał mięśnia sercowego.

Zestaw in vitro do wykrywania rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerówfibryny. Niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do stosowania monoklonalnych przeciwciał w sposobach według wynalazku. Jednak przy stosowaniu takiego przeciwciała w postaci zestawu, zestaw składa się z wzorców, pierwszego przeciwciała (to jest przeciwciała przechwytującego, np. MH1), które może być unieruchomione na powierzchni, i drugiego przeciwciała znaczonego generatorem sygnałów opisanym powyżej. Zestawy takie zawierąjąwzorce w postaci znanych ilości rozpuszczalnego sieciowanego polimeru fibryny DesAABB i rozpuszczalnego niesieciowanego polimeru fibryny DesAABB. Takie wzorce można wytwarzać przez wydzielanie rozpuszczalnych sieciowanych i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny przy pomocy kolumny z powinowactwem MH1-Sepharose. Zestawy mogą też zawierać specyficzne bufory, środki rozdzielające i związki kontrolne. Zestawy mogą zawierać urządzenia do pobierania lub chemikalia do obróbki testowanej próbki.

178 003

ABSORBANCJA (280nm)

FIG.1A

178 003

178 003

CQ
W	« cn ω Q >1 S	>1 Pi W g H tJ O Pm
N	>1	W
U	Pi	S
O	Pd
ω	H	S
o	Cm	O H
w	>»	O	o
S	Pi	W	P3
d	W g	H cn	£
	H	W	tn
S	C!	H	<15
o	O	s	Ci
S	Λ	II
II	II m	o

o

cs τ— o

ABSORBANCJA (490 nm)

178 003

OZ

O cn

FIG.3

178 003

A= FIBRYNOGEN

B⁼POLIMERY FIBRYNY DesAABB

C=FIBRYNA DesAA

FIG.4

FIG.5

178 003

ABSORBANCJA (490nM)

Czas (minuty)

178 003

SUBSTRAT

ELUAT NIEZWIĄZANE (PO DIALIZIE)

178 003

οο

ο «η

Ο μ

Η

I w ta Z ο »3 PS c ta CO en ta PS h en w μ η m W ft

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (24)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wykrywania in vitro obecności lub ilości rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny w próbce płynów ustrojowych pobranej od ssaka, znamienny tym, że kontaktuje się próbkę płynów ustrojowych ze znakowanym przeciwciałem monoklonalnym MH1 wytwarzanym przez hybrydomę ATCC HB 9739 lub przeciwciałem, które wiąże się z tym samym epitopem co monoklonalne przeciwciało MH1, lub z immunoreaktywnym fragmentem tego przeciwciała, do wytworzenia z nim immunokompleksu i wykrywa się obecność lub oznacza się ilość tego immunokompleksu w dwumiejscowych testach sandwiczowych lub jednomiejscowej próbie immunologicznej w badaniach wiązania typu niekompetytywnego lub kompetytywnego i wykrywa się obecność lub oznacza ilościowo ten rozpuszczalny sieciowany polimer fibryny DesAABB i rozpuszczalny niesieciowany polimer fibryny DesAABB w próbce.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przciwciało specyficznie wiąże się z epitopem rozpoznawanym przez monoklonalne przeciwciało, wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9740.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako przeciwciało stosuje się przeciwciało oznaczone MH1, wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9739.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako próbkę płynów ustrojowych pobraną pod ssaka stosuje się próbkę pobraną od człowieka.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako płyn ustrojowy stosuje się krew.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że immunokompleks wykrywa się lub oznacza ilościowo stosując drugie przeciwciało lub immunoreaktywny jego fragment wiążące się specyficznie z immunokompleksem, przy czym drugie przeciwciało lub immunoreaktywny jego fragment są znaczone cząsteczką zgłaszającą.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako drugie przeciwciało stosuje się przeciwciało wiążące się z epitopem rozpoznawanym przez monoklonalne przeciwciało oznaczone 45J, wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9740.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako drugie przeciwciało stosuje się przeciwciało oznaczone 45J, wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9740.
9. 9. Sposób oceny predyspozycji do wystąpienia zakrzepu, podtrzymywania diagnozy wystąpienia zakrzepu lub monitorowania tworzenia się zakrzepu u ssaka, polegający na wykrywaniu ilości rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB w próbce płynów ustrojowych pobranej od ssaka, znamienny tym, że kontaktuje się próbkę płynów ustrojowych z przeciwciałem monoklonalnym MH1 wytwarzanym przez hybrydomę ATCC 9739, lub przeciwciałem które wiąże się do tego samego epitopu co monoklonalne przeciwciało MH1 lub jego immunoreaktywnym fragmentem do wytworzenia z nim immunokompleksu, wykrywa się ilość immunokompleksu w dwumiejscowej próbie sandwiczowej lub jednomiejscowej próbie immunologicznej w badaniach wiązania typu niekompetytywnego lub kompetytywnego, a następnie porównuje się tę ilość rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB z próbką kontrolną płynów ustrojowych od zdrowego ssaka w połączeniu z klinicznym diagnozowaniem i ocenia się predyspozycję do wystąpienia zakrzepu lub wystąpienie zakrzepu, lub monitoruje się tworzenie się zakrzepu u ssaka.

   178 003
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że przeciwciało specyficznie wiąże się z epitopem rozpoznawanym przez monoklonalne przeciwciało oznaczone MH1, wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9739.
11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako przeciwciało stosuje się przeciwciało oznaczone MH1, wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9739.
12. 12. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako sytuacja zakrzepowa występuje zawał mięśnia sercowego, zakrzepica głębokiej żyły, zator tętnicy płucnej, rozproszona koagulacja naczyniowa, udar i wewnątrzsercowy skrzep jako wynik migotania przedsionków;
13. 13. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako próbkę płynów ustrojowych pobraną od ssaka stosuje się próbkę pobraną od człowieka.
14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że jako płyn ustrojowy stosuje się krew.
15. 15. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że immunokompleks wykrywa się stosując drugie przeciwciało lub immunoreaktywny jego fragment wiążące się specyficznie z immunokompleksem, przy czym drugie przeciwciało lub immunoreaktywnyjego fragment są znaczone cząsteczką zgłaszającą.
16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako drugie przeciwciało stosuje się przeciwciało wiążące się z epitopem rozpoznawanym przez monoklonalne przeciwciało oznaczone 45J, wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9740.
17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że jako drugie przeciwciało stosuje się przeciwciało oznaczone 45J, wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9740.
18. 18. Zestaw do wykrywania in vitro obecności lub ilości rozpuszczalnych sieciowanych polimerów fibryny DesAABB i rozpuszczalnych niesieciowanych polimerów fibryny DesAABB w próbce pobranej od ssaka, znamienny tym, że zawiera (a) odmierzone ilości wzorców zawierających rozpuszczalne sieciowane polimery fibryny DesAABB i rozpuszczalne niesieciowane polimery fibryny DesAABB; (b) jako środek do tworzenia immunokompleksu z rozpuszczalnymi sieciowanymi polimerami fibryny DesAABB i rozpuszczalnymi niesieciowanymi polimerami fibryny DesAABB pojemnik z unieruchomionym przeciwciałem monoklonalnym MH1 wytwarzanym przez hybrydomę ATCC HB 9739 lub przeciwciałem, które wiąże się do tego samego epitopu co monoklonalne przeciwciało MH1 lub immunoreaktywnym fragmentem tego przeciwciała i znakowane przeciwciało generujące sygnał, oraz (c) środek do wykrywania ilości immunokompleksu przez porównanie ilości sygnału generowanego z tej próbki z próbką wzorcową.
19. 19. Zestaw według zastrz. 18, znamienny tym, że jako środek do tworzenia immunokompleksu stosuje się przeciwciało lub immunoreaktywnyjego fragment, który specyficznie wiąże się z epitopem rozpoznawanym przez monoklonalne przeciwciało oznaczone MH1, wytwarzane przez hybrydomę ATCC Hb 9739.
20. 20. Zestaw według zastrz. 19, znamienny tym, że jako przeciwciało stosuje się monoklonalne przeciwciało oznaczone MH1, wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9739.
21. 21. Zestaw według zastrz. 19, znamienny tym, że jako środek do wykrywania ilości immunokompleksu stosuje się drugie przeciwciało lub immunoreaktywny jego fragment znaczone zgłaszającą cząsteczką wytwarzającą wykrywalny sygnał, który mierzy się i koreluje z zawartością immunokompleksu.
22. 22. Zestaw według zastrz. 21, znamienny tym, że jako drugie przeciwciało stosuje się przeciwciało wiążące się z epitopem rozpoznawanym przez monoklonalne przeciwciało oznaczone 45J, wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9740.
23. 23. Zestaw według zastrz. 22, znamienny tym, że jako drugie przeciwciało stosuje się przeciwciało oznaczone 45J, wytwarzane przez hybrydomę ATCC HB 9740.
24. 24. Zestaw według zastrz. 19, znamienny tym, że zawiera ponadto próbkę kontrolną do określania predyspozycji do zajścia sytuacji zakrzepowej, stwierdzania wystąpienia sytuacji zakrzepowej i obserwacji sytuacji zakrzepowej u ssaka.

    178 003