CZ696A3 - Method and set for detecting in vitro the presence or quantity of polymers of dissolved cross-linked fibrin - Google Patents

Method and set for detecting in vitro the presence or quantity of polymers of dissolved cross-linked fibrin Download PDF

Info

Publication number
CZ696A3
CZ696A3 CZ966A CZ696A CZ696A3 CZ 696 A3 CZ696 A3 CZ 696A3 CZ 966 A CZ966 A CZ 966A CZ 696 A CZ696 A CZ 696A CZ 696 A3 CZ696 A3 CZ 696A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
fibrin
antibody
fibrinogen
soluble
polymers
Prior art date
Application number
CZ966A
Other languages
English (en)
Inventor
Paul E Gargan
Victoria A Ploplis
Julian R Pleasants
Original Assignee
American Biogenetic Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by American Biogenetic Sciences filed Critical American Biogenetic Sciences
Publication of CZ696A3 publication Critical patent/CZ696A3/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6815—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/75—Fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/36—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
    • G01N2333/75—Fibrin; Fibrinogen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/972—Plasminogen activators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/972—Plasminogen activators
    • G01N2333/9723—Urokinase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/809—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fv, fc, heavy chain or light chain
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/972—Modified antibody, e.g. hybrid, bifunctional
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
    • Y10S436/808—Automated or kit

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Název vynálezu:
Metoda a souprava pro in vitro detekci přítomnosti nebo množství polymerů rozpustného síťovaného fíbrinu DesAABB a polymerů rozpustného nesíťováného fíbrinu DesAABB v | savčích vzorcích, zahrnující kontakt daného vzorku s t| protilátkou nebo jejím imunoreaktivním fragmentem, které se specificky vážou na DesAABB polymery rozpustného síťovaného fíbrinu a DesAABB polymery rozpustného nesíťovaného fíbrinu za vzniku imunokomplexu, přičemž se tato protilátka nebo její imunoreaktivní fragment neváže specificky na: (a) fíbrinogen, (b) produkty degradace fibrinogenu, (c) monomery DesAA fíbrinu, (d) polymery DesAA fíbrinu, (e) monomery DesAABB fíbrinu, (f) kovalentní fíbrinogen, (g) komplex monomer DesAA fíbrin-fibrinogen a (h) produkty degradace fíbrinu, a která dále zjišťuje přítomnost nebo množství takového imunokomplexu s použitím sekundární
_.....................onačené’ ' zp r avódajs ko u-'' “ m ole ku 1 o u—in dukujíc ídetekovatelný signál za účelem vyhodnocení predispozic pro trombotickou příhodu, diagnostiku trombotické příhody a jejího monitorování u skupin- pacientů s podezřením na infarkt myokardu, trombózu hlubokých žil, pulmonální embolii,
-; diseminovanou intravaskulární koagulaci, mrtvici a
I intrakardiální trombus vzniklý v důsledku sinové fibrilace.
-2Oblast techniky
Předmět tohoto vynálezu se vztahuje k metodě výroby monoklonálních protilátek. Tato metoda používá imunizovaná bezmikrobní živočichy. Tento vynález rovněž popisuje metodu využití těchto monoklonálních i polyklonálních protilátek získaných z imunizovaných bezmikrobních zvířat pro klinickou diagnostiku a terapii při použití in vitro a in vivo. - Tentc vynález rovněž popisuje monoklonální protilátky specifické
--------proti fibrinu_________________________ _____________________________ _______________________
Dosavadní stav techniky
H- *
Kohler a Milstein byli první, kteří vypracovali takové techniky, které vedly k vytvořeníw hybridomů produkujících první monoklonální protilátky (G. Kohler a C. Milstein, 1975, Nátuře 256. 495-497; 1976. Eur. J. Immunol. 6, 511-519). Fúzí buněk produkujících protilátky (slezinné B-lymfocyty) s myelomovými buňkami, (maligní buňky primárních, nádorů kostní dřeně) vytvořili hybridomové buněčné linie odvozené·od jediné hybridní fúzované buňky (nazývané hybridom nebo klon). Takovýto hybridom zdědil určité vlastnosti jak lymfocytové buněčné linie, tak i myelomové. Podobně jako lymfocyty i hybrydom produkoval jednoduchý typ imunoglobulinu a navíc, stejně jako myelomové buňky měl takovýto hybridom rovněž potenciál neomezeného dělení. Kombinace těchto dvou vlastností poskytovala výrazné vylepšení v porovnání s konvenčními antiséry.
-3•I·'
Antiséra získaná z imunizovaných zvířat jsou různorodou směsí polyklonálních protilátek, kterou nelze nikdy ^opětovně vytvořit tak, aby byla zcela identická s předchozí šarží. Monoklonální protilátky jsou vysoce specifické imunoglobuliny jednoduchého typu. Jednoduchý typ imunoglobulinů produkovaných hybridomem je specifický pro jednu jedinou antigenní determinantu nebo epitop na daném antigenu, tj. na složité molekule mající Četné antigenní determinanty. Na příklad je-li antigenem protein, může být antigenní determinantou v celé molekule proteinu jen jedna z jeho mnoha • I ♦ peptidových sekvencí (obecně v délce 6-7mi aminokyselin;
M.Z. Atassi, 1980, Molec. Cell. Biochem. 32'. 21-43).? Tudíž se mohou monoklonální protilátky vytvořené proti jedinému antigenu výrazně lišit jedna od druhé v závislosti na determinantě, která indukovala jejich tvorbu;.avšak u jakéhokoli hybridomu jsou protilátky, které produkuje, naprosto identické. Navíc se hybridomová buněčná linie snadno množí in vitro nebo v ~Γή~νίvo a poskytuje'vyt:ěžetčmonokl'on'álnŤchrpro'tiíáte'k”o~vysoké'~r koncentraci.
Monoklonální protilátka může být použita jako sonda pro detekci jejího antigenu. Proto jsou monoklonální protilátky používány rovněž pro in vitro diagnostiku, na příklad v imunologických - testech využívajících, izotopy nebo venzymových imunosorpčních testech (ELISA), a v in vivo diagnostice, např. in vivo zobrazování s použitím radioaktivně značených monoklonálních protilátek. Monoklonální protilátky
-4mohou být rovněž použity jako prostředek pro transport léku. k antigenu dané protilátky.
Nicméně, dříve než může být monoklonální protilátka použita pro takovéto účely, musí být tato monoklonální protilátka schopná vazby na. svůj antigen, tj. na cílový antigen. Proto se provádí vyšetřením vytvořených hybridomů za účelem zjištění, které hybridomy, pokud takové jsou, produkují monoklonální protilátku, která je schopná vázat se na cílový ___antigem Takováto vyšetřovací metoda může být velice pracná “ -při obvykle velkémpočtumonoklonálnícíí protilátek,' neboť' někdy je třeba vyšetřit iněkolik tisíc monokíonáíních protilátek než se najde hybridom, který produkuje protilátku schopnou se vázat na určitý antigen. Je tedy velice zapotřebí takové metody výroby ·L monokíonáíních , protilátek, která zvyšuje pravděpodobnost, že hybridom bude produkovat protilátku pro určitý cílový antigen.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je poskytnout metodu pro výrobu monoklonálníchprotilátek proti antigenu. Tato metoda zahrnuje: - , (a) imunizaci bezmikrobních zvířat daným antigenem, která, umožní buňkám produkujícím protilátky vytvářet protilátky ..proti použitému antigenu, (b) odebrání alespoň části těchto buněk produkujících protilátky z uvedených zvířat,
-5(c) ‘ vytvoření hybridomu pomocí fúze daných buněk produkujících protilátky s nesmrtelnými buňkami, přičemž vzniklý hybridom musí mít schopnost tvorby protilátky na daný antigen, (d) množení tohoto hybridomu a (e) sklizeň monoklonálních protilátek vyprodukovaných daným hybridomem.
Tento vynález rovněž popisuje metodu využití mónoklonální nebo polyklonální protilátky získané z bezmikrobních zvířat. Dále tento vynález popisuje monoklonální protilátku specifickou proti .fibrinu a metody využití těchto monoklonálních protilátek.
1 A y
Přehled obrázků na výkresech > .
Obr. 1(A)
Určení imunoreaktivity MH1 s monomerem fibrinu
DesAABB pomoci afinitní chromatografie.
: - ,1 , __ ------------Obr. 1(B)
Kontrolní pokus pro potvrzení vazebné kapacity Sepharosového matrixu DesAABB monomeru fibrinu s použitím protilátky 45J specifické proti fibrinu.
Obr. 2
Imunoreaktivita nesíťovaných DesAABB polymerů fibrinu a síťovaných DesAABB polymerů fibrinu v in vitro testu pro rozpustné DesAABB polymery fibrinu s použitím MH1.
-6Obr.3
Tvorba fíbrinu DesAA reakcí plazmového fibrinogenu s' batroxobinem.
Obr. 4
Imunoreaktivita rozpustných DesAABB polymerů fíbrinu 1 v testovacím systému in vitro pro rozpustné DesAABB , *
polymery fíbrinu s použitím MH1.
.Obr. 5,„„ .................„ . . . . ...... /
Imunoreaktivita protilátky MH1 s fíbrinogenem aktivovaným faktorem XIII,(faktor XlIIa).
Obr. 6
Měření tvorby rozpustného polymeru fíbrinu DesAABB in vitro s použitím testu na rozpustný fíbrinu pomocí MH1 protilátky:
Obr. 7
Purifikace rozpustného fíbrinu z plazmy pomocí kolony s Sepharosou - MH1. Obr. 8
Měření rozpustných polymerů fíbrinu DesAABB v krvi pacientů s bolestmi na prsou a potvrzeným infarktem myokardu.
-74. PŘÍKLADY provedeni vynalezu
4.1, Bezmikrobní zvířata
Předmět tohoto vynálezu se vztahuje na použití bezmikrobních zvířat pro výrobu monoklonálních protilátek. Bezmikrobní zvířata byla poprvné vyvinuta v druhé polovině | , 19.stol. a od té doby jsou v hojné míře využívána dodnes.
Bezmikrobní živočich je gnotobiot, který v sobě nemá žádné zjistitelné spolužijící formy života, včetně bakterií, virů, plísní, prvoků a dalších saprofytických či parazitických forem. Gnotobiot je zvíře nebo kmen získané aseptickým císařským řezem nebo sterilním líhnutím vajec, a které je chováno pomocí sterilních technik a neustále udržováno ve sterilní izolaci a u kterého je jeho případná fauna nebo flora přesně určena pomocí současných a přijatelných metodik. (Je třeba uvést, že všechny myši přenáší latentní leukemický virus a tudíž myš, která by byla bez mikrobů a měla tento virus, je stále považována za bezmikrobní pro účely tohoto vynálezu).
____________ „ _Základe.m_b_ezm ikrobního systému je vytvoření bariér proti vstupu nechtěných mikrobiálních vetřelců. Kromě fyzikálních překážek z plastiku, kovu, gumy a' skla, které dané zvíře uzavírají, vyžaduje tento systém i filtraci vzduchu, sterilizaci vody a potravy a manipulaci v rukavicích, což je nedílnou součástí takovéhoto bariérového systému. Rovněž přísun potřeb l do izolátoru by měl probíhat ve sterilních podmínkách.
. Věříme, že pro účely tohoto vynálezu mohou být použita jakákoli bezmikrobní zvířata. Nejběžnějšími bezmikrobními zvířaty jsou myši, prasata, potkani, králíci, morčata, kozy, ovce,
-8primáti a drůbež, přičemž nejpoužívanějšími jsou myši především typu Balb/c.
4.2 Produkce, ošetřování a chov bezmikrobních zvířat.
Bylo vydáno mnoho publikací na téma produkce, ošetřování a chování bezmikrobních zvířat. Na příklad Wostmann, B.S., vyd. Gnotobiotes: .Standards and Guidelines for the Breeding, Care and Management of Laboratory Animals, National-RěseářčhT Cdiincil; “National· Academy _of -SciencesyWashington, D.C. 1970; Coates, M.E., sé sp., The Gěrmfree Animal in Research, Academie Press London, 1968, a Pleasants, J.R., Gnotobiotics, v Handbook of Laboratory Animal Science, vol. 1, Melby, E.C. se sp., vyd. CRC Press, Boca.Raton, Fla., 117, (1974). Na tyto objevy je dále odkazováno v textu.
Následuje souhrn odvozený z Článku Wostmanna, B.S. vyd. Gnotobiotes Standards and Guidelines for the Breeding, Care and Management of Laboratory Animals (1970), National Research Council, Natonal Academy of Sciences, Washington, D.C., ve kterém je popsána produkce, ošetřování a chování bezmikrobních potkanů a myší. Je třeba podotknout, že takováto produkce, ošetřování a chování jsou podobné pro všechna další zvířata.
,1
LABORATORNÍ PROSTŘEDÍ Prostory, vybavení a chovné postupy by měly být navrženy a provozovány tak, aby poskytovaly maximální
-9kontrolu prostředí a optimální pohodlí a zabezpečení pro daná zvířata. Klece, krmítka a pitítka by měla být navržena a sestrojena tak, aby poskytovala zvířatům maximální pohodlí, aby byla potrava i pití snadno dostupné a zároveň aby mohly být čištění a sterilizace prováděny praktickým a účinným způsobem.
Vhodné rozvržení pracovního prostoru pro rozsáhlou práci s bezmikrobními zvířaty by mělo sestávat z:
1. pracovní oblasti pro. sestavování a sterilizaci izolátorů,
2. pracovní oblast pro provoz izolátorů se zvířaty
3. laboratorní část pro rutinní sledování gnotobiotického prostředí.
Takovýto plán může zahrnovat rovněž kancelář a oblast pro přípravu krmení. *'
Laboratorní prostředí pro provoz gnotobiotických izolátorů by mělo vyhovovat normám stanoveným pro ustájení konvenčních laboratorních hlodavců. Stavba by měla být zabezpečena proti hmyzu a stěny i podlahy by měly být čhraňěňy~přěd~vlHkěnř OšvětlenFby mělF~byT~jednotné se stejným cyklem světlo-tma v průběhu roku. Ventilace by měla rychle odstraňovat jakékoli výpary způsobené sterilizací a klima bý mělo být kontrolováno následujícím způsobem.
TEPLOTA. Teploty místností 21°-27°C (70°-80°F) obecně používané pro prostory se zvířaty bude možná potřeba snížit, aby se udržela teplota izolátorů mezi 22°C a 26°C (72° a 78°F)..
VLHKOST. Relativní vlhkost (RH) by se měla udržovat na pro člověka přijatelné hladině 40-60%. Avšak tam, kde se
-10vzduch používá pro větrání izolátorů, se doporučuje relativní vlkhost 40-50%.
VENTILACE. Pohyb vzduchu by měl být dostatečný, aby rychle odstranil jakékoli výpary vniklé během chemické sterilizace. Doporučuje se výměna vzduchu desetkrát až patnáctkrát za hodinu. Pro pracovníky vystavované V nebezpečným hladinám chemických výparů by měly být k
- S' dispozici obličejové masky.
BEZMIKROBNÍ ZAŘÍZENÍ (viz Sacquiet, E. 1968, _ EquipmenL designand management: _ Gerieraí' tečhnique of ' ' maintaining germ-free animals, str. 1-22 v M.E. Coates [vyd.].
The germfree animal in. research. Academie Press, London).
Kompletní vyloučení mikrobů z prostředí vyžaduje absolutní barieru. Úspěšný provoz izolátorů je závislý na zajišťování této bariery po celý čas. V současné době se používají dva typy izolátorů - kovové a z plastů. Některé kovové části jsou konstruované tak, aby vydržely vnitrní tlak páry 20 psi (l,406g/cm3). (viz Reyniers, J.A. 1959. Design and operation of apparatus for rearing germ-free animals. Ann.
N.Y. Acad. Sci. 75:47; Miyakawa, M. 1959. The Miyakawa remote-contról germfree rearing unit. Ann. N.Y. Acad. Sci.
75:37). Ostatní jsou sterilizovány ve velkém autoklávu určeném pro počáteční sterilizaci (viz Gustafsson, . B.E. 1959.
Lightweight stainless Steel systems fůr rearing germfree í animals. Ann. N.Y. Acad. Sci. 75:17). I
Izolátor z pružné folie (viz Trexler, P.C., a L.I. Reynolds.
1957. Flexible film apparatus for the rearing and use of
-11germfree animals. Appl. Microbiol· 5:406) je v současné době nejvíce používanou jednotkou. Je většinou vyroben z pružného laminovaného vinylu, musí být chemicky sterilizován a je snadno přizpůsobitelný specifickým požadavkům. Další typ, který je vyroben z velkého nylonového válce uzavřeného na obou koncích, může být sterilizován v autoklávu. (viz Lev, M.
1962. An autoclave plastic unit for rearing animals under germfree conditions. J. Appl. Bacteriol 25:30). Byly rovněž sestrojeny izolátory z plexiskla s odnímatelnými Částmi z pružné folie. Často jsou dostatečně lehké, aby se mohly dva nebo tři umístit na jeden stojan, což je výhodné pro ušetření podlahové plochy.
Pro izolátory citlivé na vyšší teploty se většinou používají í speciální válce pro sterilizaci potravy, a pomůcek. Pro ; vysokovakuové autoklávy je zapotřebí zabezpečit rozsáhlou filtrační část, aby mohlo probíhat odčerpání vzduchu (viz Trexler, P.C. 1963. An isolator systém for control of ·.
----------eontam-inat-iOnT—Lab--A-n i m - Care --7-5?5 -7-2-)-^-Ne bo-můž-e-b-vt-tento válec napojen na odpadovou rouru vyvedenou do atmosféry za účelem odvedení vzduchu a kondenzačních par během sterilizace bez vakua, (viz Jaworski, N.E., a C.. Miller. 1963. Refinement of the cylinder technique for supplying germfree isolators. Lab. Animal. Care. 75:591).
STERILIZACE
Veškeré vybavení, potrava, podestýlka, voda a vzduch používané v takovém izolátoru musí být absolutně sterilní.
-12Používané metody a podmínky jsou dány vlastnostmi jednotlivých součástí.
Nejlepší známou metodou sterilizace je sterilizace párou pod tlakem. Tento typ sterilizace je obzvláště vhodný pro porézní předměty, které jsou stabilní ve vysokých teplotách. Veškeré plochy, které by se mohly stát úkrytem mikrobů, musí být vystaveny přímému působení páry. Doba působení závisí na použité teplotě. Doporučuje se, aby se na nejhůře přístupné Části sterilizovaného materiálu (střed balíku) nechala pára působit“ po-maximální - dobu,- tj-.--15 minut -při -teplotě -121-°C-.... ’(250°F)? Po vyzkoušení zajištění“ sterility mohoubýt použity vyšší teploty a kratší časy. Standardní velikost balení a hustota potravy, podestýlky a dalších materiálů je velice důležitým faktorem při zabezpečování konstantního a předvídatelného Času potřebného pro dostatečný průnik páry sterilizovaným materiálem.
Pro sterilizaci vzduchovacích součástí izolátorů se používá suchý horký vzduch (viz Miyakawa, M. 1959. Thy Miyakawa remote-control germfree rearing unit. Ann. N.Y, Acad. Sci.
. 75:37; Gustafsson, B.E. 1959. Líghtweíght stainless Steel systems for rearing germfree animals. Ann. N.Y. Acad. Sci. 75:17).
Na neporézní materiály citlivé na vysoké teploty, především na části z pružné folie, se používá kyselina peroctová (CH3COOOH). Tato kyselina se používá v dvouprocentním roztoku se smáčecí složkou (detergentem). (viz Trexler, P.C., a L.I. Reynolds. 1957. Flexible film apparatus for the rearing and
-13use of germfree animals. Appl. Microbiol. 5:406). Ve zvláštních případech lze používat i další chemikálie jako chlornany, sloučeniny uvolňující jód nebo kvarterní amoniové sloučeniny pro tekuté lázně při zavádění mláďat získaných hysterektomií, či HgCÍ3 pro ošetření vajec ve sterilních podmínkách před líhnutím.
Součásti, -které jsou citlivé na vysoké teploty a nesmácitelné, se používá ethylenoxid (ETO). Doba sterilizace závisí na teplotě, vlhkosti, tlaku a koncentraci ETO. ETO může chemicky reagovat s podestýlkou nebo potravinovými složkami za vzniku nežádoucích sloučenin. Vzhledem k hořlavostí a nebezpečí vzniku toxických produktů by mělo být rutinní používání ETO pro sterilizaci omezeno na použití komerčně ú dodávaných plynových směsí, které neobsahují více než 20% > ETO. - :
Fiberglass filtry se běžně používají, pro sterilizaci vzduchových součástí izolátorů. Měly by fungovat jako ,ab.s.olu.tn.Lfíltrv. . ____ . . '
Membránovou filtraci tekutin lze použít, chceme-li se \ vyhnout vysokým teplotám, ovšem za předpokladu, že jsou tyto membrány dokonalými filtry, např. filtrem, který nepropouští částice větší než 0,22 mikrometrů v průměru.
Ozařování gama. paprsky nebo svazkem elektronů lze použít pro sterilizaci potravy nebo jiných speciálních položek. Použité dávky se pohybují v rozmezí od 2,5 do 6 x 106 rad.
-14VNITŘNÍ PROSTŘEDÍ
TEPLOTA. Vnitrní teplota izolátoru je funkcí laboratorního prostředí a měla by se udržovat na hodnotách mezi 22qC a 26qC (72qF-78°F).
VLHKOST. Izolátor je vystaven kondenzaci vlkosti v případech přeplnění, nevhodného větrání, či obojího. Vzduch V přicházející do izolátoru by měl mít relativní vlhkost pod 50% a nejlépe nad 40% relativní vlhkosti.
‘ PŘÍVOD VZDUCHU. Izolátor by měl mít výměnu vzduchu dvanáctkrát až dvacetkrát' ža“h'odinu a'pozitivní-tlak ~ vody 3-5 in (8-13 cm). Vzduch může být přiváděn z centrálního zdroje vzduchovacího systému nebo z výtlačných ventilátorů pro jednotlivé jednotky. Doporučuje se vzduchový kompresor turbínového typu, protože systémy s olejovými písty mají tendenci rozprašovat olej do trubek vzduchovacího systému.
U vzduchového difuzního izolátoru (viz Trexler, P.C.
1968. Equipment design and management: Transport of germ-free animal and current develppments in equipment design, str. 23-35, v M.E. Coates [vyd.]. The germfree animals in research. Academie Press, London) nedochází ke ztrátě ventilace v případě výpadku elektrického proudu. Tento typ izolátoru má však nevýhodu nižšího počtu výměn vzduchu za hodinu a nedostatek ochranného kladného tlaku, který zabraňuje kontaminaci v případě malých porušení nebo výpadků bariery. 7 '
BEZPEČNOSTNÍ HLÁSIČE. V případě' výpadku. ? elektrického proudu nebo v případě mechanické poruchy by mělo vhodné zařízení zabezpečit, aby takovýto výpadek netrval
-15déle než pouze několik minut. Selhání nezabezpečených foliových izolátorů může v takových případech vést k udušení zvířat, ale častějším nebezpečím je možnost, že by se zvířata mohla dostat do blízkosti folie a poškodit ji. Tomu lze zabránit dočasným uzavřením vzduchového přívodu gumovými zátkami. Provoz jednotlivých vzduchovacích zařízení izolátoru vyžaduje pouze zdroj pro případ výpadku. Centrální vzduchovací systém by měl mít druhý turbinový kompresor jako rezervní zásobovač vzduchem.
Doporučuje se grafický záznam teploty a tlaku. Do vzduchovacího systému by měl být rovněž začleněn audiovizuální bezpečnostní systém, který by se spouštěl při poklesu tlaku v důsledku výpadku elektrického proudu nebo v s. případě mechanické závady. Podobné alarmové systémy by , měly hlásit nežádoucí výkyvy teploty přívodu vzduchu. Doporučuje se grafický záznam laboratorního prostředí pro vzduchovací systémy jednotlivých izolátorů.
~KLECE A VNITŘNÍ VYBAVENÍ. ,
VYBAVENÍ. Základní seznam vybavení izolátoru může zahrnovat klece s bezpečnostními uzávěry, láhve na vodu a násypky na krmení, ochranné plátěné rukavice pod gumové rukavice, speciální těsnění nebo uzávěr dveří, dlouhé kleště s gumou chráněnými konci, hemostaty, nůžky, ručník, gázové polštářky, čtvrtlitrové nádoby na instrumenty, čtvrtlitrové nádoby na krmení, lžíce, kultivační zkumavky, papírové sáčky a vlhkuvzorné sáčky na znečištěnou podestýlku.
-16Klece by měly být vyrobeny z hladkého nerezového materiálu. Měly by být odolné proti tekutinám a snadno sterilizovatelné. Mezi vhodné materiály patří umělé hmoty, nerezavějící ocel a sklo. Galvanizované kovy korodují a tudíž se nedoporučují, protože i nepatrná kontaminace kovy může ovlivnit experimentální výsledky.
Rozměry klece jsou většinou omezeny rozměry vstupu do izolátoru. Minimální plocha pro myší samici a litr je 50 in2 (970cm2). V mnoha případech může být zapotřebí pro ’ jédnó’tlivá'žvířátá více místa. -............
Tabulka 1 uvádí seznam doporučované podlažní plochy ná jednu myš a potkana podle váhy skupin.
TABULKA .1
Velikost podlažní plochy doporučené na jednu myš a potkana v zajetí.
Číslo Hmotnost (g) Prostor na Maximální
kategorie zvíře (in2/cm2) počet v kle
Myši .
i do 10 6/40 40
2 10-15 8/50 30
3 15-25 12/75 20
4 nad 25 15/95 » 16
$
-Y1Potkani
1 do 50 15/95 50
2 50-100 17/110 50
3 100-150 19/125 40
4 150-200 23/150 40
5 200-300 29/185 30
6 nad 300 40/260 25
RŮZNÁ DOPORUČENÍ
K zajištění integrity bariérového systému se doporučují freonové testy pro zjištění malých trhlin.
Každá jednotka by měla být vybavena samostatným provozním deníkem, do kterého se chronologicky zaznamenávají veškeré procedury týkající se dané jednotky od chvíle, kdy byla sestavena a sterilizována. Tyto záznamy lze snadno připevnit do nemocničních kovových držáků označených podTě^čÍšePjEdh^nVýEh“izblatořů/ Tyto záznamy by^rovněž mely obsahovat poznámky ohledně běžné údržby, např. o výměně rukavic. Chovatelské záznamy mohou být umístěny ve stejném držáku. ’
Vzhledem k nedostatku místa uvnitř izolátoru doporučujeme používat pro krmení a podestýlku a pro transport zvířat mezi jednotlivými izolátory spojenými sterilním průchodem papír a skládací zásobníky.
-18Uvnitř izolátoru by se nikdy neměl používat ether, protože by mohl v případě jiskry statické elektřiny explodovat. Jako těkavé nehořlavé anestetikum se doporučuje fluothan (bromochlorotrifluorethan).
KRMIVO, PODESTÝLKA A VODA.
OBECNÁ DOPORUČENÍ
Měl by být k dispozici kompletní předpis komerčně vyráběného krmivá, ve kterém jsou sepsány veškeré ingredience a jejich koncentrace, óchrannT Tlaťky, 'ántioxidánty~a další přísady. Mělo by být jasně vyznačeno datum výroby. Výrobce by měl zaručit, že krmivo je:
1. v rozmezí normálně přijatelných limitů přirozeně se vyskytující hormonální aktivity,
2. bez přísad obsahujících léčiva, hormony, antibiotika nebo jiné látky, které by způsobovaly abnormální fyziologické stavy nebo by narušovaly experimentální postupy,
3. bez salmonely na základě statistiky vybraných vzorků,
4. bez kontaminace hlodavci nebo hmyzem,
5. bez veškerých nevyjádřených masových zbytků nebo rybího masa, které by mohly obsahovat patogeny.
OBOHACOVÁNÍ KRMIVÁ <
Krmivo bezmikrobních zvířat musí obsahovat více určitých živin, aby se kompenzovala ztráta vitamínů v průběhu teplotní sterilizace (zvláště určité B vitamíny a vitamíny A a D)
-19a nutriční hodnota proteinů (redukce dostupného lysinu, methioninu, argininu a tryptofanu). Musí rovněž poskytovat požadované živiny, které by pro běžná zvířata byly dostupné přes mikrobiální syntézu v gastrointestinálním traktu (viz Reddy, B.S., B.S. Wostmann, a J.R. Pleasants, 1968 Nutritionally adequate diets for germ-free animals, str. 87-11V v M.E. Coates [vyd.], The germ-free animal in research. Academie Press, London). Příkladem takové výživy je L-485, levná dieta, která byla podrobena rozsáhlým testům (viz Kellogg, T.F., a B.S. Wostmann. 1969; ’ Rat and mouše stock diet L-485. Lab. Anim. Care.) a může být komerčně vyráběna (viz Tabulka 2). / ' Kompenzace snížení kvality proteinů by měla být řešena spíše přídavkem specifických aminokyselin než zvýšením celkových proteinů. Zvyšování obsahu proteinů v krmivu by vedlo ke zvýšené spotřebě a vylučování vody, což by způsobovalo vyšší vlhkost a tudíž i omezenější počet zvířat, která by mohla být v izolátoru dané velikosti ustájena.____
-20TABULKA 2
Složení diety L-485 pro potkany a myši
IngredienceMnožství v 1 kg
DIETA mletá žlutá kukuřice . 590 sojové boby (syrový protein 50%) 300 alfalfa moučka (dehydratovaná, 7% protein) 35
-kukuřičný olej. (jedno.uxafínoyaný)______ 30
NaCl·- ' - - '; , lO~ ' *· ·___T»CaHPO4.2H2O 10
CaCOj . 5
Lysin (pro krmné účely) 5
Methionin (pro krmné účely) 5
B.H.T. (butylovaný hydroxytoluen) 0,125 směs stopových minerálů 0,25
SMÉS VITAMÍNŮ
A
D;
E (acetát tokoferolu) K3 (menádion) Riboflavin
Kyselina panthotenová Niacin
Chlorid cholinu
000 IU
000 IU .225 mg . 90
285
000
-21B12 (0,1 % rozmělněný v mannitolu) 2
Thiamin HCI 65
Pyridoxin HCI 20
Kyselina listová 10
Kyselina para-aminobenzoová 50
- SMĚS STOPOVÝCH MINERÁLŮ (komerčních) ,
Mn jako oxid manganatý 65 mg
Fe jako uhličitan železnatý 20
Cu jako měďnaté oxidy 2
Zn jako oxid zinečnatý' 15
I jako jodid vápenatý 1,5
Co jako uhličitan kobaltnatý 0,6
STERILIZACE PÁROU (viz Reddy, B.S., B.S. Wostmann, a J.R. Pleasants. 1968 Nutritionally adequate diets for germ-free animals, str. 87-111 v M.E. Coates [vyd.]. The _____germ-free animal in research., Academie Press, London)^
Použité postupy budou záviset na dostupném zařízení. Obecně: jsou důležité tři faktory:
1. Předsterilizační vakuum, je-li to možné, o nejméně 50 cm.Hg, které tak pomáhá průniku páry krmivém v autoklávu nebo ve válci vyvedeném do atmosféry. Vakuum 70 cm.Hg nebo více se doporučuje tam, kde není pomocný válec vyveden do atmosféry.
2. Využití nejkratší sterilizační fáze, která zaručí absolutní sterilitu, s dalšími bezpečnostními omezeními danými
-22zařízením a zkušenostmi. Teploty měřené uprostřed krmivá by měly dosáhnout nejméně 121’C (250°F). Při této teplotě by měla fáze skutečné sterilizace trvat nejméně 15 minut. S vyššími teplotami sterilizace se bude doba sterilizace zkracovat.
3. Posterilizační vakuum urychlí snižování teploty krmivá. Tím se zamezí zbytečnému tepelnému poškození živin. Nicméně konstrukce a výkon přístroje musí být takového druhu, aby nedocházelo k únikům během této fáze provozu.
Při párové sterilizaci krmivá je cílem vyhnout se neúplné sterilizaci azbytečným poškozením živin způsobeným' nadměrně prodlouženým zahříváním. I když jsouněkteré nutriční'ztráty nevyhnutelné, poměrně přijatelných výsledků může být . dosaženo při správném využití;
(a) technických postupů jako je teplota, doba předsterilizačního a posterilizačního vakua a velikost pelet.
(b) obsahu vody v krmivu. Zvýšení obsahu vody vede k lepší obnově vitamínů B po sterilizaci (viz Zimmerman, D.R., a B.S. Wostmann. 1963. Vitamin stability in diets sterilized for germfree animals. J. Nutr. 7ý;318). U pevného krmivá se doporučuje obsah vody do 25% nebo až do výše, která se ukázala jako vyhovující pro skladovací podmínky .a kvalitu krmivá. Po změnách obsahu vody v krmivu by měly následovat testy na rychlost, za jakou dosáhne krmivo sterilizační teploty.
STERILIZACE RADIACÍ (viz Reddy, B.S;, B.S. Wostman, a J.R. Pleasanís. 1968. Nutritionaíly adequate diets for germ-free animals, str. 87-111 v M.E. Coates [vyd.]. The
-23germfree animals in research. Academie Press, London; Ley, F.J.. J, Bleby, M.E. Coates, a J.S.Paterson. 1969. Sterilization of laboratory animal diets using gamma radiation. Lab. Anim. 3:221).
Techniky a dozimetrie budou záviset na zařízení a typu záření. I když se obecně předpokládá, že sterilizace radiací vede k menšímu poškození živin, přesto se v současné době doporučuje sterilizovat krmivo parou. .
TESTY NA STERILITU.
Pro sledování sterility dosažené kteroukoli specifickou sterilizační technikou se doporučuje použití testovacích proužků obsahujících spory Bacillus stearothermophilus. Tyto proužky by měly být umístěny uvnitř krmivá. Rovněž izolátor a jeho zvířata by měla být pravidelně podrobována mikrobiologickým testům. Takovéto monitorování je nezbytné pro zjištění náhodných kontaminací způsobených prolomením bariery izolátoru nebo nedostatečnou sterilizací izolátoru a jeho obsahu. Tato vyšetření se mohou provádět podle popisu ve Wostmann,
B.S., vyd., Gnotobiotes: Standards and Guidelines for the Breeding Care and Management of Laboratory -Animals, National Research Council, National Academy of Sciences, Washington, D.C., 1970, str. 28-39.
ř '· , ODHAD NUTRIČNÍCH ZTRÁT BĚHEM STERILIZACE '
Jako užitečná kontrola ztrát životně důležitých živin se doporučuje určení thiaminu extrahovatelného kyselinou jako
-24ukazatele obnovy thiaminu přidaného do .krmivá (viz Wostmánn, B.S. a P.L. Knight. 1960. The effect of methyl alcohol ori the cónversion of thiamine to thiochrome. Experimentia 16:50). Obnova méně než 25% ukazuje na výrazné snížení nutriční kvality krmivá. Při správném zacházení á vhodném zařízení by se mělo dosáhnout obnovy 50% a více.
USKLADNĚNÍ PEVNÉHO KRMIVÁ
Protože experimenty s bezmikrobními zvířaty jsou obecně -------------velice-nákladné,-nemělo -b-y_s.e..nikdy .používat krmivo, u kterého *se'výrazněsnížila jeho nutriční hodnota.-Doporučuje se, aby. se^ (a) nesterilizované krmivo přechovávalo vždy v chladnících a nikdy ne déle než jeden měsíc, a aby (b) byla doba skladování krmivá uvnitř izolátoru jeden týden nebo méně, nikdy však aby nepřekročila deset dnů.
·%
PODESTÝLKA
Podestýlka by se měla vyměňovat nejméně jednou týdně. Jako podestýlka se doporučuje materiál, který lze snadno sterilizovat a který není zvířaty ochotně konzumován. Sterilizací takového materiálu by neměly vznikat toxické sloučeniny. Doporučují se hobliny a piliny borovice vejmutovky. Rovněž jsou přijatelné lipové a topolové piliny nebo drcené kukuřičné klasy. Rozsivkové výrobky, cedrové pryskyřičné dřevo a tvrdé dřevo se nedoporučují. Sterilizace ethylen-oxidem by še neměla používat, dokud nejsou vyřešeny otázky ohledně možností vzniku škodlivých sloučenin.
-25VODA
Pitná voda musí být sterilizována. Může být autoklávována ve čtvrtlitrových láhvích, Masonových láhvích nebo nádržkách připevněných k izolační jednotce. V každé nádobě musí být ponecháno trochu vzduchu.
PRINCIPY ZÍSKÁVÁNÍ GNOTOBIOTŮ CÍSAŘSKÝM
ŘEZEM t
Úspěch každého císařského řezu částečně závisí ria dodržení plné doby březosti. Toto platí částečně pro zvířata s krátkým obdobím březosti, kdy může plod nabýt 20% své hmotnosti v průběhu posledních 24 hodin před porodem. Dobré výsledky dává načasování páření, ale u zvířat, která mívají i početné vrhy (potkani a myši), bývá užitečné počkat na ’ narození prvního mláděte a teprve pak začít s císařským řezem. U morčat je nejúspěšnější metodou výběr samic vhodných pro operaci a měření rozestupu jejich stydkých kostí (viz Philips, B.P., P.A. Wolfe, a H.A. Gordon. 1959. Studies on rearing the guinea pig germfře”f ~Ánri ,N7ΫΓÁcad? Sci. 7ffTT83).
Mláďata získaná císařským řezem musí být umístěna do bezmikrobního prostředí ještě před tím, než se poprvé nadechnou. Mohou být převzaty přímo z matky hysterótomií přes sterilní ohraničenou bariérovou membránu do sterilního izolátoru nebo hysterektomií pres germicidn-í lázeň do sterilního izolátoru. Obvyklá předoperační příprava samice předcházející císařskému řezu zahrnuje odstranění abdominálního osrstění a desinfekci operačního místa. Anestezie se u potkanů a myší
-26provádí nejčastěji dislokací krčních obratlů, i když lze použít i lokální anestetikum do abdominální linie nebo celková anestezie bez vzniku nebezpečí vážnějšího ohrožení plodu a úmrtí. U morčat se chirurgický zákrok provádí po podání uklidňujících prostředků a při lokální anestezii.
Porod mláďat hysterotomií pres bariérovou membránu vyžaduje speciální vybavení izolátoru. Reynierova chirurgická jednotka z nerezavějící oceli (viz Reyniers, J.A. 1965. Germfree life methodology (gnotobiotics) and experímental riutritióm ' p. 458-466 v Proc.3rd internát; -'Gongr. - Biochem.,-------------Bruxelles) má vestavěný horizontální ’k6vovou”*přěpáž; která odděluje horní a dolní část jednotky.. Přepážka obsahuje i kruhový otvor pokrytý mylarovou plastikovou folií, která udržuje integritu horního kompartmentu. Samice připravená k operaci se umístí do dolní části tak, že její abdominální část je natlačena na folii. Veškeré chirurgické nástroje jsou v horním kompartmentu a operace se provádí ve sterilním prostředí. Incize se provede skrz plastik a kůži skalpelem nebo elektrokauterem. Pro řez kůží je lepší samosterilizující elektrokauter. Okraje kůže a mylaru jsou sesvorkovány a odhrnuty. Abdomen je pak překryt sterilní rouškou, aby se zakryly okraje řezu, a na odkryté svalstvo se aplikuje teplý dezinfekční prostředek (henzalkonium chlorid v ředění 1:1 000) před vlastním otevřením břišní dutiny. Operatér musí dát velký pozor především na to, aby neprořízl střeva. Může být užitečné vložit svorky nebo hemostaty mezi peritoneální stěnu a vnitřnosti. Po té je otevřena děloha a mláďata vyjmuta.
-27Plodové obaly se odstraní, pupeční šňůra zaškrtí á přestřihne. Mláďata jsou jemně osušena a masírována, aby se stimulovalo dýchání. Pak jsou mláďata přenesena do chovné jednotky, kde jsou krmena náhradní matkou nebo ručně. Operační otvor může být opět překryt novým plátkem mylaru a postup se může opakovat. Tímto způsobem může být odoperováno 5 až 6 samic bez vážnějšího nebezpečí kontaminace. Císařský řez může být rovněž proveden s použitím plastikového izolátoru nebo rukavicového sáčku jako chirurgické jednotky. Vnější povrch podlahy izolátoru je předsterilizován a abdomen zvířete je na něj přitlačen, takže slouží ke stejnému účelu jako arch mylaru v předchozím případě. Po operaci může být naříznutá plastická bariera uzavřena sterilní lepící páskou a operace opakována na dalších březích samicích.
Při používání plastických izolátorů je běžnější získávání mláďat hysterektomií (viz Foster, H. 1959. A proceduře for obtaining nucleus stock for a pathogen-free animal colony. Lab.
Anim Care 5:1.3.5.)______Děloha—j.e asepticky—.vytažena—azasvorkována přesně před děložním hrdlem. Vyříznutá děloha je přenesena do bezzárodkové jednotky přes tekutou germicidní lázeň. Jakmile je již v izolátoru, jsou mláďata vyjmuta co nejrychleji, aby se zabránilo vdechnutí plodových tekutin. Za normálních okolností jsou osušena a dýchají ještě před zaškrcením a odstřižením pupeční šňůry. Pak jsou mláďata předána náhradní matce nebo krmena ručně.
Hysterektomií lze úspěšně provádět u myší, potkanů a prasnic. U morčat se však dává přednost hysterotomii, protože
-28dochází k častému úhynu mláďat, pokud uplynou dvě a více minut mezi oddělením mláďat od krevního řečiště matky a porodem v izolátoru.
CHOVNÉ SYSTÉMY PRO GNOTOBIOTICKÉ KOLONIE INBREDNÍ KMENY
Obvyklé páření bratr x sestra, které se používá pro konvenční chovné kolonie, může být použito rovněž pro kolonie gnotobíotické.
NEINBRÉDNIPLEMENA
Pravé nahodilé množení zahrnuje i páření sourozenců a prvních bratranců a sestřenic. Ačkoli se takovémuto páření snažíme za normálních okolností vyhnout u neimbredních chovných kolonií, nesnižuje výsledný systém páření míru inbrídingu na maximum. Může být použit jakýkoli systém minimálního inbrídingu. (viz Falconer, D.C. 1967. Genetic aspects of breeding methods. str. 72-96 v The UFAQ handbook on the care and management of laboratory animals, 3. vyd., E. a
S. Livíngstone, Ltd., London; National Research Council, Institute for Laboratory Animal Resources. 1969. A guide to genetic standards for laboratory animals. National Academy of Sciences, Washington, D.C.).
SROVNATELNÉ KONVENČNÍ A GNOTOBIOTICKÉ
KOLONIE.
Je vhodné udržovat jak konvenční, tak gnotobíotické kolonie, a to za účelem srovnání. Jejich podobná genetická konstituce
-29může být udržována zaváděním vrhů získaných císařským řezem v efektivní chovné populaci konvenční kolonie do kolonie gnotobiotické. To je zjevně vhodná metoda pro ty výrobce, kteří dávají přednost produkci negnotobiotických potkanů a myší, ale mají tu nevýhodu, že musí zabránit vytvoření mikrobiálního rodokmene, který by zjednodušoval mikrobiologické monitorování. V ideálním případě by se mohly jako chovná zásoba pro konvenční kolonii používat vrhy ze specifických páření a každý další vrh z každého takového páření by sloužil jako chovná zásoba pro gnotobiotickou kolonii. Jestliže se tento postup dodržuje každou druhou nebo třetí generaci, neměla by se genetická konstituce obou kolonií příliš lišit, pochopitelně za předpokladu, že se v obou koloniích používá stejný systém páření.
Vrhy z efektivní chovné zásoby gnotobiotické kolonie mohou být popřípadě použity k založení nebo doplnění konvenční kolonie. Genetické důsledky budou totožné za předpokladu, že budou dodržovány stejné postupy.
VEDENÍ ZÁZNAMŮ (viz Wolff, G.L. 1967. Practical mating systems and record-keeping in a breeding colony, str. 97-113 v UFAW handbook on the care and management of laboratory animals, 3.vyd. E. a S. Livingstone, Ltd., London).
O chovu zvířat a provozu izolátoru by měly být vedeny řádné záznamy. Záznamy o zvířatech by mely uvádět efektivitur .provozu a biologický výkon zvířat. Záznamy o izolátoru by
- t· měly obsahovat chronologické pořadí událostí týkajících se
-30izolátoru, čímž se usnadní vyhledávání příčin porušení bariery v případě kontaminace.
4.3. Bezantigenní zvířata
V hlavním provedení tohoto vynálezu se vyžaduje, aby byla bezmikrobní zvířata živena chemicky definovanou (CD), . nízkomolekulámí, ve vodě rozpustnou a ultrafíltrovanou z '* potravou. Předpokládá se, že takovéto krmení umožňuje získat absolutní kontrolu příjmu živin a antigenu zvířaty. Takové krmivo je většinou-vyrobeno-tak,- -že -veškeré-jeho ingredience lze chemičky*“ určit,např.“ámihokýselinyfjednoduché' cukry,r lipidy, vitamíny a minerály. Pro účely tohoto vynálezu obsahuje takovéto chemicky definované krmivo aminokyseliny, jednoduché cukry, lipidy, vitamíny a minerály a neobsahuje žádné další složky o molekulové hmotnosti vyšší než 10 000 daltonů. Takže veškeré složky CD krmivá mají nízkou molekulovou hmotnost a jsou živinami přirozeně obíhajícími ve zvířatech a tudíž se má za to, že takovéto složky nebudou stimulovat imunitní odpověď. Literatura z poslední doby uvádí bezmikrobní zvířata krmená CD krmivém jako bezantigenní zvířata.
Rovněž se doporučuje používat filtrační papír jako podestýlku, protože by bezmikrobní zvířata mohla jíst podestýlku, což vede k vyvolání imunitní odpovědi.
Úrčité CD krmivo pro daný druh využívá tyto složky v takových poměrech a množstvích, aby vyhovovaly nutričním
-31požadavkům známým pro daný druh. Složení a příprava vhodného CD krmení pro bezmikrobní myši je následující:
Složení a příprava chemicky definovaného krmení L489E14Se
Složka Množství (gramy/100 g složky)
K 192 ml Milli-Q vody o teplotě 70°C se přidá následující:
Leucin 1,9
Fenylalanin 0,74
Izoleucin 1,08
Methionin 1,06
Tryptofan 0,37
Valin 1,23
Asparagin 0,91
Arginin HCI 0,81
Threonin 0,74
Lvzin HCI 1/77 ......
Histidin HCI 0,74
Roztok se ochladí na 45°C a přidá se následující:
Glycin 0,59
Prolin 1,48
Serin 1,33
Alanin 0,59
Glutamát sodný 3,40
L-tyrozin ethylester HCI 0,62
Glukonát žeieznatý 0,05
Soli 35D1 0,105
Selenit sodný2 0,074
Roztok se dále ochladí na 5°C a přidá se následující:
Glycerofosfát vápenatý 5,22
Glycerofosfát hořečnatý 1,43
Chlorid vápenatý 2H2O 0,185
(KI) směs (obsahující 680 mg KI) 0,086
Vitamín B směs 111Έ53 -------------; 0,09' ·
Vitamín B124 1,20 mg
Cholinchlorid 0,31
Octan sodný 1,85
Ke 108 ml Milli-Q vody o teplotě 70°C byla přidána bezvodá D-Dextrosa 71,28
Roztok byl ochlazen na 5°C a oba byly smíchány a ultrafiltrovány.
Složení solí směsi 35D je uvedeno v tabulce 3 2Pridáno jako přídavek k selenanu sodnému v solích 35D 3Slození směsi 111E5 vitamínů B je uvedeno v tabulce 4 “Přidáno jako přídavek k vitamínu B-12 ve směsi 11-1E5 vitamínů B
Touto směsí jsou myši nebo potkani krmeni adlibitum.
-33Složení lipidového přídavku LADEK 69E6
Složka Denní dávka pro dospělého jedince* (0,385ml)
0,33g
6,45 (11.7 I.U.)
0,0288mg(1.15 I.U.)
3,3mg
6,6mg
72mg
Purifíkované sojové triglyceridy Retinylpalmitát Cholekalciferol 2ambo-alfa-tokoferol 2ambo-alfa-tokoferol acetát Fyllochinon *Kojící samice obdrží dvojnásobek normální dospělé dávky. Skládající se z: 12% palmitátu
1,5% stearátu 24% oleátu K *
55% linoelátu 8% linoleátu
Podrobný popis krmivá CD viz Pleasant, J.R., se sp., J, Nutr., 116: 1949-1964 (1986), Pleasant, J., se sp., Germfree Research: Microflora Control and Its Application to the Biomedical Sciences, B.S. Wostmann, vyd., str. 87, Liss, New York (1985); Wostmann, B.S., se sp., J. Nutr.· 112: 552 (1982); a Pleasant, J.R., se sp., J. Nutr. 100: 498 (1970), jejich poznatky jsou zde uvedeny v odkazech.
-344.4. Produkce monoklonální protilátky Takovýto bezmikrobní živočich je potom použit pro výrobu monoklonální protilátky. Bezmikrobní systém může být použit k výrobě monoklonální protilátky proti jakémukoli antigenu, který by takový živočich v bezmikrobním stavu mohl produkovat. Seznam příkladů antigenů se objevuje v U.S. patentu č. 3,935,074. Nicméně lze předpokládat, že u takového bezmikrobního zvířete vyvolává antigen mnohem silnější , imunitní odpověď. Proto lze zvýšit pravděpodobnost vypátrání “B-lymfocytu, který' produkuje- protilátku~ schopnOU“vazby -na~ - specifický epitop daného antigenu. Tojé Hlavní výhodou Tohoto ~ ~ vynálezu. Navíc se věří, že takovýto bezmikrobní systém je zvláště užitečný při tvorbě vysoce specifických protilátek proti těm antigenům, které mají četné epitopy.
Bezmikrobní živočich může být imunizován standardními technikami. Nicméně je lepší, aby bylo bezmikrobní zvíře imunizováno třikrát s nejméně třítýdenními přestávkami mezi jendotlivými injekcemi, po kterých následuje přeočkování posilovači dávkou. Věří se, že tato zvýšená hladina imunizace je zřejmě nezbytná, protože bylo pozorováno, že po dvou imunizacích, které jsou běžné, lze nalézt stále většinou •B-lymfocyty sekretující IgM spíše než požadovaně B-lymfocyty se sekrecí IgG.
4.5 Somatické buňkv
Somatické buňky bezmíkrobních zvířat, které mají potenciál pro produkci protilátek a které, zvláště pak B lymfocyty, jsou
-35vhodnými buňkami pro fúzi s myelomovou linií B buněk.. Nejlépe fúzují ty buňky produkující protilátky, které jsou ve stadiu dělení. Somatické buňky mohou být získány z lymfatických uzlin, sleziny a periferní krve vybraných bezmikrobních zvířat. Výběr lymfatických buněk závisí ve velké míře na jejich empirické užitečnosti v určitém fúzním systému. Většinou jsou však používány somatické buňky Získané ze sleziny. Jakmile je bezmikrobní zvíře imunizováno nebo hyperimunizováno, může být zdrojem lymfocytů produkujících protilátky. Myší lymfocyty poskytují vyšší procento stabilních fúzí s myšími myelomovými buňkami. Je však možno použít protilátky produkující buňky z jiných živočichů. Výběr typu bezmikrobního zvířete záleží na volbě antigenu, pročež je důležité, aby dané bezmikrobní zvíře mělo ve svém repertoáru B lymfocyty, které by byly schopny produkovat protilátky proti danému antigenu.
___4.6. Nesmrtelné buňkv______________________
Z lymfatických národů byla vypěstována speciální linie buněk, které se používají při přípravě hybridomů pomocí fúze buněk (G. Kohler a C. Milstein, 1976, Eur. J. Immunol. 6:511-519);
M. Schulman se sp., 1978, Nátuře 276:269-270). Tato buněčná linie byla vypěstována nejméně ze tří důvodů. Prvním důvodem je provádění selekce fúzovaných myeolomových buněk. Ta se z obvykle provádí pomocí myelomů deficientních na enzym, takže nejsou schopny přežívat na určitých selektivních mediích, která podporují růst hybridomů. Druhý důvod vyplývá z dědičné
-36viastnosti buněk lymfatických nádorů produkovat své vlastní protilátky. Účelem použití monoklonálních technik je získání nesmrtelné fúzované hybridní buněčné linie, která produkuje požadovanou samostatnou specifickou protilátku geneticky řízenou tou složkou hybridomu, která pochází ze somatické buňky. Aby se vyloučila produkce protilátek nádorových buněk hybridomy, používají se myelomové buněčné linie bez schopnosti produkce lehkých nebo těžkých imunoglobulinových řetězců nebo buňky, které jsou deficientní na sekreční mechanismy .'“Třetím- důvodem-výběru-těchto- buněčných linií-je--------jejich vhodnost a účihňdšfprffúžích. ..'.........
Pro přípravu fúzovaných buněčných hybridů může být použito několik linií myelomových buněk včetně NS-1, X63-Ag8, NIS-Ag4/l, MPC11-45.6TG1.7, X63-Ag8.653,
Sp2/0-Agfl4, FO a S194/5XX0.Bu.l. Všechny tyto buněčné linie byly získány z myší a buňky 210 -,RCY3.Agl,2.3 byly získány z potkanů (G.J. Hammerling, U. Hammerlilng a J.F. Kearnly, 6.vyd., 1981, Monoclonal antibodies and hybridomas v J.L. Turk, vyd. Research Monographs in Immunology, vol. 3., Elsevier/Norht Holland Biomedical Press, New York).
- 4.7. FÚZE
Metoda přípravy hybridomu ze slezinných buněk produkujících protilátky nebo buněk lymfatických žláz a nesmrtelných buněk obvykle zahrnuje smíchání somatických buněk s nesmrtelnými buňkami v poměru, který se může měnit od 20:1 až k okolo 1:1 v přítomnosti činidla nebo činidel (chemických, virových nebo
-37elektrických), která podporují fúzi buněčných membrán. Je lepší, aby jako zdroj somatických a nesmrtelných buněk použitých pro fúzi byl stejný živočišný druh. Metody fúze byly popsány Kohlerem a Milsteinem (1975, Nátuře 256: 495-497;
1976, Eur. J, Immunol. 6: 511-519), dále Gefterem se sp. (1977, Somatic Cell Genet. 3: 231-236) a Kozborem se sp., (1983, Immunology Today 4: 72). Jako Činidla podporující fúzi používali tito vědci Sendai virus a pólyethylenglykol (PEG).
Lze rovněž použít nedávno vyvinutou EBV-transformaČní techniku (Cole se sp., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R; Liss, lne., str. 77-96).
4.8. IZOLACE KLONŮ A DETEKCE PROTILÁTKY Fúze většinou poskytují životaschopné hybridy ve velice nízkém počtu kolem 1 x 1O'S až 1 x 10'3. Vzhledem k této nízké četnosti získaných přežívajících hybridů je užitečné mít metodu, * jak fúzované hybridomy vyselektovat ze zbývajících ________ _nefúzovanýchmyelomo vých buněk. Je r_oyn.ě.ž_n.e.z.bytn.é_m ít.l,__— způsob, jak mezi ostatními fúzovanými buněčnými hybridy určit v \ . hybridomy, které produkují požadovanou protilátku.
Fúzované buňky jsou obvykle pěstovány na selekčním mediu, jakým je na příklad HAT medium, které obsahuje hypoxantin, aminopterin a thymidin. HAT medium umožňuje proliferaci hybridních buněk a zabraňuje růstu nefúzovaných z myelomových buněk, které by se jinak dále neomezeně dělily. Aminopterin blokuje syntézu purinu a pyrimidinu de novo inhibicí produkce tetrahydrofolátu. Přídavek thymidinu
-38způsobuje překlenutí zablokované syntézy pyrimidinu a hypoxantin je do media přidáván, aby mohly inhibované buňky syntetizovat purin při použití alternativní dráhy syntézy nukleotidů. Používané myelomové buňky jsou mutanti postrádající hypoxantin-fosforibosyl transferázu (HPRT) a tudíž nemohou využívat tuto alternativní dráhu. V přežívajících hybridech poskytuje B lymfocyt genetickou informaci potřebnou pro produkci tohoto enzymu. Protože samotné B lymfocyty mají omezenou životnost v kultuře (přibližně dva týdny), jsou jedinými .buňkami, které' šé mohou v HAT mediu’ mňóžitjj hybridní buňky vytvořené z myelomových a slezinných buněk.
Směs fúzovaných myelomových buněk a B lymfocytů je naředěna v HAT mediu a pěstována na vícejamkových mikrotitračních destičkách, aby bylo možno testovat protilátky produkované hybridními buňkami a aby se zabránilo přerůstání některých hybridních buněk přes druhé. Za dva až tři týdny jsou hybridní klony pozorovatelné v mikroskopu a může být z jednotlivých jamek odebrán tekutý supernatant, aby se otestovaly specifické protilátky vyprodukované jednotlivými hybridomy.
. Test; musí být citlivý, jednoduchý a rychlý. Testovací techniky zahrnují imunologické testy využívající izotopy, enzymy, testy cytotoxicity, a plakové testy.
4.9. Dělení buněk a produkce protilátky Jakmile jsou požadované hybridní buňky vybrány a vyklonovány do jednotlivých buněčných linií produkujících
-39protilátky, může se každá buněčná linie množit jedním ze dvou standardních způsobů. Vzorek hybridomu může být injikován do histokompatibilního zvířete stejného druhu, jaký býl použit pro získání somatických a myeolomových buněk pro počáteční fůzi. U naočkovaných zvířat se vyvinou nádory produkující dané specifické monoklonální protilátky produkované fúzovaným buněčným hybridem. Od takového zvířete mohou být odebírány tělesné tekutiny jako sérum a ascitová tekutina, ze kterých lze získat dané protilátky ve vysokých koncentracích. Alternativním způsobem je množení těchto jednotlivých buněčných linií in vitro v laboratorních kultivačních miskách. Z kultivačního media obsahujícího vysoké koncentrace samotné specifické monoklonální protilátky se může tato protilátka sklízet buď dekantací, filtrací nebo centrifugací.
4.10. Využití monoklonálních protilátek Tyto monoklonální protilátky_jyrpbené ..ppstupem^.který^J.e.'.. předmětem tohoto vynálezu, mohou být využity jakoukoli dosud známou nebo v budoucnosti vyvinutou technikou, která využívá
J monoklonální protilátky.
Hlavní využití monoklonálních protilátek je v imunotestech, které měří reakci antigenu s protilátkou. Takové testy jsou obvykle heterogenní nebo homogenní. V 7 homogenním testu zahrnuje imunologická reakce obvykle specifickou protilátku, značený antigen a zkoumaný vzorek. Signál vzniklý na značeném antigenu je přímo či nepřímo
-40upraven podle vazby protilátky na značený antigen. Jak imunologická reakce, tak i její detekce v uvedeném rozsahu, jsou prováděny v homogenním roztoku. Imunologické značení používané pro takovéto testy zahrnuje volné radikály, fluoreskující barvy, enzymy, bakteriofágy, koenzymy, a podobně. Hlavní výhodou imunoanalýzy je, že není třeba separovat specifické protilátky od značených antigenů. ·.
V heterogenních imunotestech jsou reagujícími látkami obvykle testovaný vzorek, specifická protilátka a protředek pro tvorbu určovátélněhcT signálu. Vzorek se “obvykle’ umíštinď nějaký povrch jako třeba laboratorní misku nebo sklíčko a buď tato pevná podpůrná fáze, nebo tekutá fáze jsou poté testovány na přítomnost signálu pomocí prostředků, které takový signál měří. Tento signál vzniká v závislosti na přítomnosti značené látky ve vzorku. Mezi prostředky produkující detekovatelný signál patří využitelné radioaktivního značení, fluoreskující činidla, enzymy, a podobně. Příkladem heterogenních imunoanalýz jsou radioimunoanalýzy, imunofluorescenční metody, imunosorpční testy využívající enzymy, a další.
Podrobnější informace o imunoanalytických technikách lze vyhledat v Enzyme-Immunoassay, Edward T. Maggio, CRC Press, lne., Boča Raton, Fla., 1980. Dále rovněž v U.S. Pat. Nos. 3, 690, 834; 3, 891, 932; 3, 817, 837; 3, 850, 578; 3, 853, 987; 3, 867, 517; 3, 901, 654; 3, 935, 074; 3, 984, 533; 3, 996,345; a 4, 098, 876, přičemž tento seznam nevyčerpává všechny možnosti.
-41Dalším hlavním využitím monoklonálních protilátek je in vivo zobrazování a terapie. Monoklonální protilátky mohou být značeny radioaktivní složkou, na příklad radioaktivním jodem, a pacientovi aplikovány nitrožilně. Takové protilátky mohou být rovněž značeny magnetickou sondou. Pak může být pro detekci antigenu použito zařízení NMR. Po navázání protilátek na antigen může být antigen detekován emisními’ tomografíckými nebo radionukleárními vyšetřovacími technikami, které vyhledají umístění antigenu, , Pro znázornění je purifikovaná monoklonální protilátky navázána na vhodný nosič, např. fyzilogický roztok obsahující lidský albumin nebo bez něj ve vhodných dávkách a pacientovi se aplikuje nitrožilně na příklad nepřetržitou nitrožilní infúzí poněkolik hodin, jak bylo popsáno Millerem se ,sp. v Hybridomas in Cancer Diagnosis and Therapy (1982), které zde uvádíme v . odkazech,
Monoklonální protilátky, které jsou předmětem tohoto r vynálezu, .mohcmbýt „používány^ pro„ié_čebnéjíče3y._Pr.otilátky_ s.^_ vhodnými biologickými vlastnostmi jsou použitelné přímo jako terapeutická agens. Tyto protilátky mohou být rovriěž navázány na toxin za vzniku imunotoxinu nebo na radioaktivní materiál nebo lék, a tak vytvořit radiofarmaka nebo farmaka. Metody přípravy imunotoxinů a radiofarmak s využitím protilátek jsou dostatečně známy (viz na příklad, Cancer Treatment Reports 7 (1984)63:317-328).
Má se rovněž za to, že polyklonální protilátky získané z bezmikrobních zvířat mohou být rovněž využity v imunotestech
-42a poskytovat lepší výsledky v porovnání s polyklonálními protilátkami získanými od konvenčních laboratorních živočichů. Polyklonální protilátky získané z bezmikrobních zvířat mohou být vytvořeny, jak zde již bylo popsáno, s použitím bezmikrobních laboratorních živočichů a imunizačních technik, po kterých následuje separace polyklonálních protilátek z ^daných živočichů konvenčními technikami, tj. získáním séra z těchto zvířat.
FIBRIŇ-SPECIFICKÁ-MONOKLÓNALNrPŘOpLATKA~
5,1. Předpoklady
Hemostatický mechanizmus je složitý fyziologický proces, který se spouští jako odpověď na poškození krevního řečiště. Rovnováhy je dosaženo pomocí spřažených reakcí mezi stěnou poškozené cévy, krevních destiček a koagulačního systému. Úlohou koagulačního systému je vytvořit rozsáhlou fíbrinovou síť, která má stabilizovat a ukotvit zátku složenou z krevních destiček. Tato zátka se vytváří na subendoteliální struktuře poškozené cévy, Tvorba nerozpustného fibrinového matrixu z kolujícího fibrinogenu je výsledkem složitého komplexu reakcí, který vrcholí výraznou produkcí trombinu'v poškozeném místě. Koagulace je další proces a zahrnuje řetězové enzymatické reakce, ve kterých jsou proenzymy (koagulační faktory) postupně aktivovány až na aktivní enzymy. Existuje mnoho fyziologických mechanizmů, které ovládají proces polymerizace fibrinu zapojený do tvorby trornbu. Sem patří inhibitor trombinu antitrombin III (ATIII), C protein, prostacyklin a
-43různé složky fíbrinolytického systému, jako jsou aktivátory tkáňového plasminogenu (t-PA) a jeho rychle působící inhibitor (PAI).
Hypotéza homeostázy navržená Astrupem v roce 1956 (Astrup, T., Blood 11: 781-806, 1956) uvádí, že mezi tvorbou fíbrinu (koagulací) a jeho rozpouštěním (fíbrinolyzou) existuje rovnováha. U normálního zdravého jedince jsou tyto funkce v rovnováze. Jakmile je však tento rovnovážný stav porušen, koagulace a fíbrinolýza se projeví patologicky jako trombóza nebo hemoragie. Klinické projevy patologické trombózy nebo trombotického onemocnění jsou velmi různorodé a zahrnují diseminovanou intravaskulární koagulaci (DIC), trombózu hlubokých žil (DVT), arteriální a venózní trombózu. r Tromboembolie a trombotické komplikace jiných vaskulárních onemocnění (např. atheriosklerózy) mohou vést k okluzi hlavních arterií, která vede k ischemii orgánu a k životu nebezpečným stavům, jako je cerebrovaskulární příhoda * „(mrtvice), infarkt- myokardu,· apod. “·’ ‘
Fibrinolytický proces zahrnuje konverzi inaktivního zymogenu, plasminogenu, na proteolytický enzym plasmin pomocí účinku látek známých jako aktivátory plasminogenu. Molekulární mechanizmus fyziologické fibrinolýzy ještě není zcela objasněn, ale ví se, že během tvorby fíbrinu se na fibrin váže plasminogen, který pak může být aktivován aktivátory plasminogenu, tj. t-PA. Tímto způsobem postupuje tvorba plasminu v trombu, kde je od inaktivace chráněn hlavním fyziologickým inhibitorem plasminu, a,-antiplaminem.
-44Při setkání s plasminem jsou fíbrinogen a fibrin štěpeny, na své degradační produkty. Fíbrinogen se dělí na své fragmenty X a Y a po dalším působení plasminu dále na fragmenty D a E.
Fibrin se rozděluje na fragmenty X, Y, D a E u nesíťovaného fibrinu, a fibrin propojený v síti se láme na fragmenty D-dimer, komplex D-D/E, dimer Y, Y-D-dimer a X oligomer.
Až do nedávné doby byly testy na známky trombotických onemocnění prováděny s použitím radioimunotestů a testů; s latexovou aglutinací. Ukázalo se, že tyto testy jsou zcela n'ěsppléhTivě”(Gáffney, P.J., Ann. N.Y. Ácaď. Sci.. 407-423 . . ·. _.
(1983)). Citlivější a specifičtější imunoanalýzy (jako ELISA testy) využívající monoklonální protilátky s.e stávají běžnou metodou v klinických laboratořích. Limitujícím faktorem těchto diagnostických testů je specifita a afinita určité použité monoklonální protilátky. Tvorba vysoce specifických protilátek proti jakémukoli potenciálnímu ukazateli na porušení hemostázy je znesnadněna jak nízkými hladinami takovýchto ukazatelů, tak antigenní příbuzností toho určitého znaku s jeho prekurzorem, který je za normálních okolností v plazmě přítomen v mnohem vyšších hladinách. Příkladem je tvorba komplexů enzymů a jejich inhibitorů, , např. trombin-antitrombin III, plazmin-alfa2-antiplazmin, T-PA-PAI-1. Počet nových antigenních míst vytvořených vznikem takového komplexu je extrémně nízký a je tedy příčinou extrémně obtížné výroby imunologických sond (jako jsou monoklonální protilátky). *·
Podobně je i hlavním problémem spojeným se získáním monoklonální protilátky proti fibrinu strukturní a konformační
-45podobnost mezi fibrinem a jeho fyziologickým prekurzorem fibrinogenem. Bylo odhadováno, že konzervace kovalentní struktury po přeměně fibrinogenu ve fibrin je větší než 98% (Plow, E.F., se sp,. Semin. Thromb. Heamostas 3:36 (1982)), a tudíž pouze malý počet epitopů na molekule fibrinu jsou ve skutečnosti neoantigeny (a unikátní pro fibrin). Mnoho postupů, které byly vyvinuty pro získání protilátek proti fibrinu, se zaměřilo na imunizaci zvířat rozpustnými fragmenty fibrinu a syntetickými peptidy, které napodobovaly obnažená neoantigenní místa na fibrinu. Viz Hui, K.Y., se sp.. Science 22: 1129-32 (1983), Scheerers-Borchel, V., se sp.. Proč. Natí. Acad. Sci. USA 32: 7091-95 (1985), Elms, M.J., se sp., Thromb. Haemostas 50: 591-94 (1983) a Kundryk, B,, se sp., Mol. Immunol, 21: 89-94 (1984). Nicméně se věří, že vazebné místo takových protilátek je v průběhu- degradačního procesu fibrinu konzervováno, a tudíž se tyto protilátky mohou vázat i na produkty vzniklé degradací fibrinu.
_________Předmět-tohoto-vy-nálezu-umožňujΓ použí'f žcela odfišný přístup a využít intaktní fibrinový antigen ve spojení se zvýšenou imunologickou citlivostí bezmikrobních živočichů (AF) pro přípravu monoklonálních protilátek proti fibrinu. Pro účely tohoto vynálezu se fibrin-specifícké protilátky vážou na fibrin a ne na fibrinogen nebo produkty vzniklé degradací fibrinu či fibrinogenu.
-465.2. MATERIÁL A METODY 5.2.1 .Zvířata
Bezmikrobní myši BALB/cAnN byly získány z bezmikrobní kolonie (GF) chované na univerzitě ve Wisconsinu. Zvířata byla do našich laboratoří transportována v bezmikrobních podmínkách. Bezantigenní kolonie (AF) byla založena přenesením březích GF samic krmených přírodní dietou L-485 (viz Pleasants, J.P., se sp., J, Nutr. 116: 1949-1964 (1986)) do AF izolátoru, kde byly tyto myši okamžitě převedeny na chemický 'definované' lomení'.(CD) .AF. Jejich mláďata,, která nikdy nepřišla do přímého styku s přírodním krmivém (NI), byla odstavena od mateřského mléka na CD krmení a byla označena jako první AF generace. Tyto AF myši byly pářeny po párech' dokud samice pozitivně nezabřezla; pak byli samci odstraněni, aby se samicím zajistila plná dávka lipidových přídavků. Mláďata byla odstavena ve věku 24 dnů.
5.2.2. Ustájení
AF chovní jedinci byly ustájeni v párech v jedné polovině standardních polykarbonátových myších klecí o rozměrech 28x17,8x12,7* cm. Dno bylo odříznuto a nahraženo falešným dnem z ocelového nerezavějícího síta. Podélné rozdělení bylo provedeno plátem nerezavějící ocelí, který byl na koncích plastikové klece zahnut tak, aby přečníval nad i pod klec a upevňoval víko z nerezavějícího drátu. Toto zapuštěné víko, které se normálně vejde dovnitř klece, bylo převráceno tak, aby poskytovalo více místa nad falešným dnem. Sloupky vhodné
-47velikosti a z nerezavějící oceli byly přivařeny k hornímu víku, aby držely 60ml láhve na krmení. Ke stranám podélné přepážky v polovině její výšky mezi dnem a víkem byly na jejích koncích přivařeny nádobky z nerezavějící oceli. (Obrázek těchto klecí je uveden v Pleasants, J.R., The germfree systém for agíng and immunity V: CRC Handbook of Immunology in Aging, (Kay, M.M. B.S. Makinodan, T., vyd.), str. 257-297, CRC Press, Boča Raton, Fl. (1981)). Krmné láhve byly z hnědého skla. Láhve na krmení i vodu měly plastiková víčka s vyvrtanými otvory ve středu. Láhve byly naplněny o obráceny dnem vzhůru ve svých držácích. Lipidový přídavek byl denně odměřován do nerezových nádobek. Pod každou klecí byl umístěn plastikový tác na zachycování odpadu.
Jako stelivo a stravitelná vláknina byl použit bezpopelnatý filtrační papír Whatman č.41, prodávaný jako ústřižky (Sargent
Welch). Pro podestýlku byl papír nastříhán na proužky.
Nerozstříhané čtverce papíru byly použity pro čištění vnitřního prostorujzolátoru._Papír_.byLautoklávován--po'dObu· 25τηϊηΰί při
121°C nebo byl v plastikových sáčcích ozařován (4,5 Mrad).
*
Všechny myši dostaly dostatek papíru, který by pokryl jeden konec klece. Papír byl vyměněn, jakmile byl vlhký, žlutý nebo špinavý.
Klece byly udržovány uvnitř pružného izolátoru 4ypu Trexler o rozměrech 1,37x0,6x0,6m (Trexler, P.C., Lab. Anim. Care 13: 572-581 (.1963)), pří použití standardní gnotobiotické technologie (viz Wostmann, B.S., vyd., Gnotobiotes Standards and Guide Lines for the Breeding, Care and Management of
-48Λ
Laboratory Animals, Natonal Research Council, National Academy of Sciences, Washington, D.C.). Izolátory byly provozovány v laboratoři při teplotě 21°C a 12ti hodinovém světelném režimu.
Válec Tygon o průměru 2,5 cm a délce 7,55 cm byl připevněn ke stropu izolátoru a na obou koncích uzavřen vinylovými zátkami. Tento válec byl vstupem pro sterilní filtraci krmení, vody a oleje.
______5.2.3.Krmení ________‘___________________________________________ .. ___________ ,, Tabulka 1 ukazuje složení Ucrmiva-a-postup při- rozpouštění - jednotlivých složek v ultrafiltrované vodě Milli-Q (Millipore, MA). Aminokyseliny a dextrosa byly od firmy Sigma v kvalitě pro tkáňové kultury. Vitamíny byly rovněž od Sigmy kromě čistého retinylpalmitátu, které nám laskavě dodaly Hoffman-La Roche, lne. (Nutley, NJ). Ostatní látky byly od firmy Fisher nebo jejich ekvivalenty. Kompletní ve vodě rozpuštěné krmení bylo filtrováno za chladu přes ultrafiltr Amícon Diaflo TC3 při použití membrán Pm 10 s průměrem 150 mm (Amicon),
Ultrafíltrační membrány měly propustnost do 10 000 daltonů. Seřízený ultrafíltrační přístroj byl před použitím sterilizován 0,15% roztokem chlornanu sodného a důkladným promytím. Ultrafiltrované krmení bylo skladováno ve sterilních nádobách při teplotě 4°C až do jeho použití. Krmení bylo do AF izolátorů zavedeno s použitím 0,2pm nylonových filtrů (MSI) v autoklávovaném držáku tlakového filtru, který měl svou výpusť vloženou do neoprenového (No 6) uzávěru. Pro tyto účely byl *
-49horní uzávěr Tygonového sloupce neprodyšně upevněného ve stropu izolátoru odstraněn a vnitřní povrch válce byl vystříkán sterilizačním roztokem 2% kyseliny peroctové obsahující 0,1% alkyl-aryl sulfonát. Uzávěr držáku filtru byl vložen místo * horního uzávěru. Po dvaceti minutách byl odstraněn dolní uzávěr (uvnitř izolátoru) a krmení nebo voda byly filtrovány do izolátoru při 20 psi dusíku.
Složení lipidového přídavku je uvedeno v tabulce 2. Sojevé triglyceridy byly ve formě přípravku vyrobeného vakuovou destilací methylesterů v teplotním rozmezí odpovídajícím esterům kyseliny palmítové až linoleové. Tyto estery pak byly transesterifíkovány glycerolem za vzniku, smíšených triglyceridů. (Nu-Chek Prep, Elysian, MN). Ke směsi triglyceridů byly před její filtrací do izolátoru přidány vitamíny rozpustné v tucích a v té době byla směs zahřáta na 50°C a filtrována do izolátoru stejným způsobem používaným pro ve vodě rozpustnou část krmení.
Příděl lip idů_byL..odměřen—na--Qr37-5- mí /den. - - Zvýšení lipidového přídavku značně snížilo úmrtnost novorozených myší. Průměrná četnost vrhu se rovněž zvýšila na úroveň konvenčně pěstovaných zvířat. Kojící samice dostávaly dvojnásobnou dávku lipidového přídavku.
-50Tabulka 1
Složení a příprava chemicky definovaného krmení L489ElSe
Složka ' Množství (gramy/100 g složky)
---............ ________________________-_____________
K 192 ml Milli-Q vody o teplotě 70°C se přidá následující: Leučin 1,9
Fenylalanin 0,74
Izoleucin 1,08 .
_ Methionin......... .1,06 .1
- ' Tryptofan ... . —·._ 0,37 . _ . Valin 1,23
Asparagin 0,91
Arginin HC1 0,81
Threonin 0,74
Lyzin HC1 1,77
Histidin HC1 0,74
Roztok se ochladí ná 45°C a přidá se následující:
Glycin 0,59
Prolin 1,48
Šeřin ’ 1,33 ‘
Alanin 0,59
Glutamát sodný 3,40
L-tyrozin ethylester HC1 0,62
Glukonát železnatý 0,05
Soli 35D1 0,105
Selenit sodný2 0,074
Roztok se dále ochladí na 5°C a přidá se následující:
Glycerolfosfát vápenatý 5 ??
Glycerolfosfát horečnatý 1,43
Chlorid vápenatý 2H2O 0,185
(KI) směs (obsahující 680 mg KI) 0,086
Vitamín B směs 111E53 0,09
Vitamín B124 1,20 mg
Cholinchlorid 0,31
Octan sodný 1,85
Ke 108 ml Milli-Q vody o teplotě 70°C byla přidána bezvodá D-Dextrosa 71,28
Oba roztoky byly ochlazeny na 5oC, smíchány a ultrafiltrovány,
Γ
Složení lipidového přídavku LADEK 69E6
Složka Denní dávka pro ?
dospělého jedince* (O,385ml)
Purifikované sojové triglyceridy
Retinylpalmitát
Cholekalciferol
2ambo-alfa-tokoferol
2ambo-alfa-tokoferol acetát
Fyllochinon
0,33g
6,45 (11.7 I.U.)
0,0288mg(l.i5I.U.)
3,3mg
6,6mg
72mg
-52*Kojící samice obdrží dvojnásobek normální dospělé dávky. 'Skládající se z; 12% palmitátu
1,5% stearátu 24% oleátu 55% linoelátu 8% linoleátu
TABULKA 3 Složení směsi solí 35D
Sůl '' Množství (na 300 ml krmení)
Mn (octan)2 4H,0 55,4
ZuSO4 H,0 40,6
Cu (octan)2 H2O 3,7
Cr (octan)3 H,0 2,5
NaF 2,1
SnSO4 2H2O 0,37
(NH4)á Mo7O,4 4H,0 0,37
NiCl, 3H2O 0,37
Co (octan), 4H20 ,h . 0,11
Na3VO4 0,22
Na2SéO3 0,096
-53TABULKA 4
Složení směsi vitamínů Β 111E5
Složka
Množství (mg) / 300 ml krmení
Thiamin HCl 1,23
Pyridoxin HCl 1,54
Biotin 0,25
Kyselina listová 0,37
Vitamín B12 0,37
Riboflavin 1,85
Niacinamid 9,2 i-inositol 61,9
Pantothenát vápenatý 12,3 t
Použitá voda Milli-Q byla ultrafiltrovaná a do izolátoru byla filtrována stejným způsobem jako krmení.
^-^Mikrobiologické monitorování _________________________
Bezantigenní systém byl testován na kontaminaci mikroby podle návodu uvedeného v Wostmann, B.S. vyd. (1970) Gnotobiotics Standards and guidelines for the breeding care and management of laboratory animals, National Research Council, National Academy of Sciences, Washington, D.C. Stručně, tampony namočené do krmení a vody uvnitř izolátoru byly použity na provedení roztěrů fekálií získaných čerstvě od myší a z nahromaděných výkalů pod každou klecí. Stery byly rovněž odebrány ze stěn izolátoru, především v okolí vstupního otvoru
-54izolátoru. Byly rovněž odebrány duplikované stěry. Jedna sada stěrů byla zkoumána přímo pod mikroskopem na přítomnost bakterií a plísní při použití gram barvení. Druhá sada roztěrů byla použita pro detekci mikroorganizmů. Každá kultura byla prohlášena za negativní až po uplynutí třítýdenní kultivace.
Testování na přítomnost mikroorganizmů bylo prováděno přibližně každé dva týdny nebo několik dnů po novém vstupu do izolátoru. *
.......5:3/ Produkce monoklonáiních-protilátek-s-použitím -----------------bezantigenníčh mvší* ~·* — - Bezantigenní myši podle zde uváděného popisu byly při výrobě monoklonálních protilátek použity jako dárci lymfocytů.
Roztoky veškerých antigenů byly připraveny ve sterilních podmínkách v laminárním boxu.
Následující protokol byl upraven pro imunizaci AF myší.
Daný antigen (25-30pg) byl rozpuštěn ve sterilním fyziologickém roztoku/100 μΐ) a emulgován stejným množstvím Freundova kompletního adjuvans (FCA). K roztoku antigenu byl přidán interferon (1000 jednotek) před vlastní přípravou emulze. Pro veškerá očkování byly použity sterilní stříkačky a jehly. Stříkačky byly přeneseny do AF izolátoru přes vstupní otvor, a tam sterilizovány přestříkáním 2% roztokem kyseliny peroctové. PřeoČkovávací injekce byly aplikovány se stejným A ’ množstvím antigenu, FCA však bylo nahrazeno Freundovým nekompletním adjuvans. Celkově byly provedeny tři podpůrné imunizace každá v intervalu tří týdnů. Poslední ze tři imunizací
-55(bez adjuvans) byla provedena 4-7 dní před fúzí. Všechny injekce byly aplikovány nitrobrišně. Myši byly odebrány z izolátoru v den fúze a byly okamžitě usmrceny udušením CO,. Byly jim odebrány sleziny a slezinné buňky byly fúzovány s myšími myolomovými buňkami (NS1) pri použití standardních hybridomových technik.
5.4. Využití svstému bezantigenních laboratorních zvířat pro výrobu fibrin-specifické monoklonální protilátky.
Tento bezantigenní systém byl použit při výrobě fíbrin-specifické monoklonální protilátky. Tato protilátka je . vysoce specifická a nerozeznává fibrinogen, ani produkty z degradace fibrinu či fibrinogenu. Linie hybridomových buněk 4 byly vytvořeny fúzí slezinných buněk získaných z bezantigenních myší BALB/c imunizovaných lidským fibrinem a myelomových myších buněk NS1. ;
5.4.1.Rozvrh imunizace
Tři týdny staré samice bezantigenních myší byly imunizovány 33 mikrogramy přípravku lidského fibrinu. - Přípravek byl zmraženou frakcí vzorku fibrinu, který byl připraven následujícícm způsobem:
Lidský fibrinogen byl převeden na fibrin působením trombinu a faktoru XlIIa. Fibrinová sraženina pak byla zmražena v tekutém dusíku a mechanicky rozdrcena na velmi jemný prášek. Disperze tohoto mrazem frakturovaného fibrinu
-56byla provedena ve fyziologickém roztoku, čímž vznikl čistý roztok síťovaného fíbrinu XL-Fn o konečné koncentraci lmg/ml. Pro imunizaci zmíněných zvířat byly použity 33 μΐ tohoto fíbrinového antigenu. Toto množství roztoku antigenu bylo upraveno na 100-μ1 sterilním fyziologickým roztokem a roztok byl pak emulgován FCA výše uvedeným postupem. V intervalu tří týdnů byly aplikovány dvě podpůrné imunizace při použití stejných hladin antigenu ve Freundově nekompletním adjuvans. Poslední očkování bylo provedeno 4 dny před fúzi.
___________Byla -použita-stejná hladina-antigenu a-adjuvans bylo-nahraženó----. _ fyziologickým roztokem; - - - - — —
5.4.2.Detekce a určení protilátky Kvalitativní a kvantitativní určení monoklonální protilátky bylo provedeno použitím enzymatického imunosorpčního testu ELISA. ELISA testy byly provedeny s použitím lidského fíbrinu imobilizo váného v 96ti jamkových mikrotitračních destičkách z PVC (značka Costar). Testovací ,mikrotitrační destičky potažené fibrinem byly připraveny inkubací 100 μΐ roztoku fíbrinu (Kabi, stupeň L) v pufru s boritanem (50 pg boritanu/ml fyziologického roztoku) přes noc při teplotě 4°C. Nenavázaný fíbrinogen byl odstraněn opláchnutím PBS; obsahujícím 0,05% Tween 80 (PBS-Tween). Fíbrinogen, kterým byla potažena dna komůrek, byl přeměněn na fíbrin * inkubací s 1Ό0 μΐ roztoku trombinu (10 ΝΙΉ jednote.k/ml) obsahujícím 2 mM CaCl, po dobu jedné hodiny při 37°C. Byla sestrojena standardní kalibrační křivka pro danou protilátku při
-57použití přípravku protilátky, který byl zhomogenizován pomocí SDS-PAGE.
Aby se zabránilo nespecifickým vazbám, byly fíbrinem potažené mikrotitrační destičky inkubovány s 1% roztokem BSA v PBS o pH7,4. Poté byly přidány roztoky obsahující protilátky (100 μΐ) a misky byly inkubovány při 37°C po dobu 90 minut. Po každém kroku tohoto postupu byly jamky důkladně obláchnuty PBS-Tween. Navázané protilátky byly detekovány přidáním tisícinásobku králičí anti-myší protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou (Sigma) rozpuštěnou v PBS, 1% BSA pH8,0.
5.4.3.Příprava hybridomů-fúze. '
Myši byly utraceny udušením CO2 a okamžitě jim byly. odebrány sleziny. Slezinné buňky z těchto imunizovaných myší buly fúzovány s polyethylen glykolem 4000 (3000-7000). Tyto buňky byly inkubovány v HAT selekčním mediu v T lahvích po dobu jednoho týdne.__Pp^tétp_době-byly-buňky-rozmístěnydo;;, jamek destiček 5 X 96. V 93 jamkách byl zaznamenán růst buněk, z těchto 93 jamek bylo 19 pozitivních na antigen fibrinu. Jeden z těchto klonů, F492D8 (později přejmenován na MH1), produkoval protilátku, která rozpoznávala fibrinový antigen, ale v křížové reakci nereagovala s fibrinogenem. Tento určitý, klon MH1 byl třikrát opětovně klonován mezním ředěním až do dosažení jedné buňky na jamku při třetí klonovací fázi. Jakmile byla buněčná linie stabilizována, byla převedena na ' bezsérové
-58medium. Tato buněčná linie produkuje protilátku v množství přibližně 7,5 mg/litr.
5.4.4.Purifíkace monoklonální protilátky Před purifíkací (41itrové dávky) byly supernatanty. tkáňových kultur cetrifugovány, aby se odstranily zbytky buněk, a filtrovány přes 0,8 gm nylonové membrány, které zadržely veškeré zbytkové částice. Supernatant z hybridomů byl koncentrován při 4°C na objem 500 ml při použití, spirálového- —
------ultrafiltračního sy šťémíi využívaj i cího„,membrány “typu “YM ~ ' (Amicon) s propustností částic do molekulární hmotnosti 30000.
Výměna pufru za 20mM (N-morfolin) kyselina ethansulfonová (MES), pH6,0 (pufr A) byla provedena podle návodu dodavatele. Po dalším zahušťování na konečný objem 100 ml byl roztok s protilátkou filtrován přes 0,451 gm nylonovou membránu před další purifíkací. Koncentrovaný roztok protilátky byl purifikován tekutou chromatografíí na chromatografu Waters HPLC při použití kolony 7,75mm x lOcm AB x sloupec (J.T. Baker, Phíllipsburg, NJ). Kolona byla ekvilibrována pufrem A, protilátka byla z kolony eluována gradientem od pufru. A do 100% pufru Β. (1M octan sodný pH7,4) při průtoku 1 ml/min. Byly odebírány frakce (2 ml) a ty, které obsahovaly monoklonální protilátku (určenou ELISA v testem) byly sbírány a dialýzovány proti fyziologickému roztoku tlumenému fosfátem (PBS)' (20 mM fosfát sodný, 150mM chlorid sodný, pH7,4) a skladovány v -20°C v koncentraci >lmg/ml. ABx kolona byla regenerována promýváním 100% B
-59pufrem po dobu 5 minut, po kterém následovala nová ekvilibrace 15ti násobkem objemu sloupce pufrem A.
5.5. Určení specifíty na fibrin.
I
Prvního určení specifíty na fibrin bylo dosaženo vyšetřením supernatantů z hybridomů zvlášť na fibrinen potažených mikrotitračních destičkách a zvlášť na destičkách potažených fibrinogenem. Jako přijatelné byly vybrány ty buněčné linie produkující protilátky, které v křížové reakci nereagovaly s fibrinogenem.
Dalším určením specifíty na fibrin byl kompetiční test s fibrinogenem v roztoku, ve kterém se potvrdilo, že protilátka nerozpoznává fibrinogen v roztoku.
Použitý kompetiční test k potvrzení specifíty protilátky na fibrin byl proveden podle návodu pro ELISA test, přičemž tato protilátka byla předem inkubována s fibrinogenem v roztoku. Stručně řečeno, supernatant z hybridomů byl inkubován při 37°C_po dobu 30 minut s roztokem fibrinogenu ve fyziologické koncentraci ,(4mg/ml) za přítomnosti BSA (IQmg/ml), který má zabránit nespecifické vazby protilátky na fibrinogen. Roztok t· fibrinogen/protilátka byl poté přenesen do jamek mikrotitračních destiček, které byly předem potaženy fibrinem. K inhibitoru fibrinogenu byl přidán GlyProArgPro (GPRP), aby se zabránilo možné polymerizaci fibrinogenu prostřednictvím zbytkového trombinu ve fibrinových komůrkách. Pak byl již test prováděn jako konvenční ELISA test pro protilátku vázanou na imobilizovaný antigen. Jako kontrola byla u všech testů na
-60specifitu protilátky MH1 na fibrinu použita druhá protilátka 45 J. Protilátka 45J reaguje v křížové reakci · s fibrinem i fibrinogenem.
5.5.1. URČENÍ KŘÍŽOVÉ REAKTIVITY NA FIBRINOGEN.
5.5.1.1. Imobilizovanv fíbrin a fibrinogen.
Buněčná linie MH1 produkuje myší protilátky, které reagují v křížové reakcí s fibrinem, je-li tento imobilizován na povrqhu PVČ mikrotitračních testovacích ^deštiček' (tabulka ‘5); V* tom ’ samém testu tato protilátka nerozpoznává fibrinogen imobilizovaný na daných destičkách. Jak ukazují údaje v tabulce 5, dochází k výraznému zvýšení imunoreaktivity, jakmile je fibrinogen trombinem přeměněn na fíbrin, čímž se zjevně vytvoří nový epitop na molekule fibrinu. ’ Kontrolní protilátka 45J však jasně rozpoznává neoepitop, který je konzervován, když se fibrinogen přemění na fíbrin.
*
5.5.1.2. KompetiČní test s fibrinem a fibrinogenem.
Specifita protilátky MH1 proti fibrinu byla dáte prokázána kompetičním testem, ve kterém byl supernatant z hybridomu před vlastním testem inkubován s roztokem fibrinogenu (o konečné koncentraci 4mg/ml). Protože v tomto kompetičním testu byly použity vysoké koncentrace fibrinogenu (500x vyšší > koncentrace fibrinogenu než protilátky), byl ke směsi přidán BSA (konečná koncentrace 10 mg/ml). Peptid GPRP byl přidán, aby se zabránilo polymerizaci fibrinu zbytkovým , -61trombinem v jamkách pokrytých fibrinem. Výsledky tohoto testu ukazují, že protilátka MH1 nerozpoznává fibrinogen v roztoku (tabulka 6).
Za předpokladu, že se na každou komůrku mikrotitrační destičky naváže 400 ng fibrinu, pak hladina fíbrinogenu použitá v tomto kompetičním testu představuje tisícinásobný nadbytek vzhledem k vázanému fibrinovému antigenu. Navíc to představuje 400ti násobný nadbytek antigenu v tkáňovém supernatantu.
Tabulka 5
Schopnost křížové reakce protilátky MH1 s fibrinogenem a antigenem fibrinu.
MAb A405nm/30 min
45J
Fibrin Fibrinogen
ΜΗ-1—-------------0,-90 - -------- - - -—0,02 5 · 1,65
1,50
-62*
TABULKA 6
Schopnost křížové reakce protilátky MH1 s fíbrinem v přítomnosti fíbrinogenu
MAb A4O5aia/30 min
+fibrinogen -fibrínogen
MH1 1,24 1,27
45J 0,438 1,74
2. Urč e n i schopriosti křížóvě'réakcě Yprodukty ''
degradace fibrinu (fíbrinogenu).
Produkty A degradace fíbrinogenu (FDPs) byly připraveny
inkubací fíbrinogenu s plasminem při teplotě 37°C po dobu v rozmezí od 10 minut do 3 hodin. Fibrinogenolýza byla po požadované době zastavena přidáním trasylolu (100 jednotek inhibitoru kalikreinu/ml) a 20mM kyseliny ε-aminokapronové (EACA).
Produkty degradace fibrinu (XLFDPs) byly připraveny přidáním trombinu (4 NIH jednotky/ml) k roztoku fíbrinogenu (5 -mg/ml) ve fyziologickém roztoku tlumeném Trisem (TBS, pH7,4, 50 mM Tris HC1, 150 mM NaCl) obsahujícím 10 mM CaCl2, plasminogen (0,25 mg/ml) a urokinázu (50 IU/ml). Směs byla inkubována při 37°C a Štěpení plasminem bylo ukončeno po různých časových intervalech pomocí FDPs výše uvedeným způsobem.
-63Pro určení křížové reakce s produkty degradace fíbrinu a s produkty degradace fíbrinogenu byly příslušnými degradačnímí produkty potaženy jamky mikrotitračních .destiček a byly provedeny enzymové imunosorpční testy běžným t postupem. Výsledky uvedené v Tabulce 7 ukazují, že protilátka MH1 nereaguje křížovou reakcí s žádným produktem vzniklým degradací fíbrinu plasminem. Tabulka 8 ukazuje, že tato protilátka nereaguje s produkty degradace XL-fíbrinu. Tohoto závěru bylo dosaženo použitím technik analýzy Western blottingu.
Můžeme tudíž vyslovit závěr, že tato protilátka rozpoznává takový epitop intaktní molekuly fíbrinu, který není přítomen nebo obnažen na povrchu molekuly prekurzoru fíbrinu, : tj. fíbrinogenu. Tento epitop je zjevně zničen degradací fíbrinu > plasminem, což potvrzují údaje uvedené v tabulce 8.
Na základě těchto poznatků je MH1 fíbrín-specifícká monoklonální protilátka takovou protilátkou, která může být ____defíno-vána-takto:- --------— -----------Pro účely tohoto vynálezu je fibrin-specifícká monoklonální protilátka taková monoklonální protilátka, která:
1. má v kompetičním testu na měření křížové reakce s fibrinem a fíbrinogenem podle výše uvedeného postupu méně než 75%ní, v lepším případě méně než 10%ní, schopnost křížové reakce s fíbrinogenem, ve které je fíbrinogen použit v množství 1 000 násobně vyšším v porovnání s fibrinem,
-642. má v testu měření křížové reakce se síťovaným fíbrinem a s produkty degradace fibrinu podle výše uvedeného postupu schopnost křížové reakce s fíbrinem, který byl Štěpen plasminem po dobu přibližně 3 hodin, méně než 50%ní a v lepším případě méně než 40%ní v reakci této protilátky s fíbrinem v čase nula, a
3. nemá v testu na měření křížové reakce s fíbrinogenem a produkty degradace fibrinogenu (podle výše uvedeného __________ postupu) takováto monoklonální protilátka v reakci s
.....,. - fíbrinogenem, kterým byl štěpen píasminem po^ dobu’ přibližně 4 hodin, o nic vyšší reaktivitu než jakou má tato monoklonální protilátka v reakcí s fíbrinogenem v čase nula.
MH1 monoklonální protilátka byla dále charakterizována určením její afinity k fibrinu. Tato afinita byla určena Scatchardovým výnosem (Frankel se sp., Molecular Immunology 16. 101-106 (1979)) při použití MH1 protilátky značené 125I. Hodnoty získané pro disociační konstantu KD byly
6,7 χ 1O*10. Takováto afinita je přibližně 5000 násobek afinity t-PA k fibrinu.
Pomocí analýzy Western imunobiottingu bylo roviiěž určeno, že tato MH1 protilátka nereaguje v křížové reakci s Aa, Ββ nebo γ řetězci fibrinogenu. Stejnou metodou bylo zjištěno, že tato-protilátka MH1 nereaguje v křížové reakci s Aa nebo Y Ββ řetězci fibrinogenu po reakci s trombinem. · (Reakce fibrinogenu s trombinem vede k uvolnění fibrinopeptidu A a
-65fíbrinopeptidu B z řetězce Aa a Ββ, čímž vznikají a a β řetězce fíbrinu.
TABULKA 7
Křížová reakce protilátky MH1 s produkty degradace fibrinogenu
Doba štěpení plasminem v min. A4OS„/30 min
MH1 45J
0 0,15 1,037
10 0,10 nm
20 0,11 - 1,02
40 0,11 0,410
60 0,10 0,330
240 0,09 0,300
TABULKA 8
Křížová reakce MH1 protilátky s produkty degradace fíbrinu
Doba štěpení plasminem v hod. A4O5am/30 min
MH1 45J
0 0,890 1,40
3 0,354 1,0
5 0,310 0,77
-66Výsledky Tabulky 7 navíc ukazují, že kontrolní protilátka 45J se váže na fibrinogen, ale v křížové reakci nereaguje s produkty degradace fibrinogenu. Na základě toho je taková monoklonální protilátka specifická proti fibrinogenu a představuje jeden z dalších aspektů tohoto vynálezu. Tato fibrinogen-specifícká monoklonální protilátka může být využita pro jakékoli imunoanalýzy k určení hladin fibrinogenu in vitro. Daná protilátka 45J byla dále určena v tom smyslu, že epitop 45J je na a řetězci fibrinogenu přibližně v oblasti mezi áíhinokýselinamf 206“a-424-^ a-s -největší pravděpodobností ...v. _ oblasti mezi aminokyselinami ‘ 207 a“23 T. Proúčely tohoto vynálezu je fibrinogen-specifícká monoklonální protilátka jakákoli monoklonální protilátka, která v testu na schopnost křížové reakce s produkty degradace fibrinu a degradace fibrinogenu podle výše uvedeného postupu vykazuje reaktivitu s fibrinogenem, který byl štěpen plasminem po dobu přibližně 40 minut, nižší než 50% reaktivity této protilátky s fibrinogenem v čase nula.
Hvbridom 45J byl připraven konvenčním způsobem využívajícím běžně používané myši Balb/c, které byly v tomto případě imunizovány fibrinem.. . Jako antigen však může být použit i fibrinogen. , '
5.5.3. Určení křížové reakce s nesíťovaným fibrinem a nesíťo vánými fibrinovými sraženinami.
Pomocí enzymových imunosorpčních testů ELISA se dokázalo, že protilátka MH1 reaguje v křížové reakci nejen se síťovaným
-67♦· — fibrinem (XLFn), ale rovněž s nesíťovaným fibrinem (NONXLFn). ELISA test byl proveden následujícím způsobem.
1. 96ti jamkové mikrotitrační destičky byly potaženy 100 μΐ roztoku firbinogenu (50 pg/ml ve fyziologickém roztoku tlumeném boritanem, pH8,5) a ponechány při teplotě 4°C přes noc.
. 2. Síťovaný fibrin se vytvořil v komůrkách potažených fibrinogenem inkubací s roztokem trombinu po dobu jedné hodiny při teplotě 37°C • (10NIH jednotek/ml) ve fyziologickém roztoku tlumeném Trisem (TBS, PH7,4, 50mM Tris HCI, 150mM NaCl) obsahujícím 2mM CaCl2 a lOmM cystein.
3. Nesíťovaný fibrin se vytvořil v komůrkách potažených fibrinogenem ikubací s roztokem trombinu po dobu jedné hodiny při teplotě 37°C (10NIH jednotek/ml) ve fosfátovém pufru (ρΗό,Ι) obsahujícím EDTA v konečné koncentraci 0,0125M.
4. Navázaná protilátka byla určena inkubací s konjugátem antimyší alkalické fosfatázy. Navázaný konjugát byl určen přidáním substrátu alkalické fosfatázy a výsledná kolorimetrická reakce byla odečítána v automatické čtečce mikrotitračních destiček při 405 nm.
Výsledky tohoto testu jsou uvedeny v Tabulce 9 a je z nich zřejmé, že křížová reaktivita této protilátky se síťovaným fibrinem je větší než s nesíťovaným fibrinem. Nejjednodušším
-68vysvětlením je, že kovalentní síťování přítomné v síťované polymerní struktuře slouží k uzamčení nebo zamrznutí té konformace, kterou daná protilátka rozpoznává. V nesíťovaných druzích není konformace, i když je vytvořena, stabilizována kovalentními vazbami daného polymeru.
Rovněž bylo dokázáno, že tato protilátka reaguje v křížové reakci jak se síťovanými tak s nesíťovanými sraženinami vytvořenými in vitro. Síťovaný fibrin byl připraveninkubací roztoku fibrinogenu (ve fyziologickém roztoku tlumeném' Trisem 50mM,' pH7;4obsahujícím C-aC12- (-2mM) a - cystein (lOmM)) s trombinem po dobu’tří hodin' při' teplotě 37°C. Nesíťovaný fibrin se vytvořil inkubací roztoku fibrinogenu (3 mg/ml) ve fosfátovém pufru (ρΗό,Ι) obsahujícím EDTA v konečné koncentraci 0,0125M s roztokem trombinu (10 NIH jednotek/ml) po dobu tří hodin při teplotě 37°C. Po vytvoření sraženin byly tyto shluky omyty a inkubovány s 400μ1 1% roztoku BSA obsahujícím MH1 protilátku značenou l2JI při teplotě 37°C. Malé alikvotní části roztoku byly odebírány v různých časech a množství protilátky bylo určeno odečtem plazmy v přístroji měřícím γ záření.
Tabulka 10 ukazuje množství navázané protilátky jak na síťované tak na nesíťované sraženiny.
-69TABULKA 9
Křížová reakce protilátky MH1 se síťovaným a nesíťováným fíbrinem
Koncentrace Síťovaný Nesíťovaný
Drotilátkv fibrin fibrin
(ng/ml) (absorbance při 405 nm)
100 000 0,764 0,409
50 000 0,460 0,319
25 000 0,305 0,154
12 500 0,174 0,074
6 250 0,069 0,000
TABULKA 10
Křížová reakce protilátky MH1 se síťovanými a nesíťovanými
fibrinovými sraženinami
Fibrinová % vazby značené protilátky po 8 hodinách
sraženina síťovaný 79% nesíťovaný 76%
5.6. Uložení hybridomů
Protilátky MH1 a 45J byly uloženy v ATCC (American Type Culture Collection) dne 9. června 1988 a byla jim přidělena
-70registrační, čísla HB 9739 a HB 9740. American Type Culture Collection je na adrese 12301 Parklawn Drive, Rockville, MĎ, 20852. Protilátka MH1 je IgGl protilátkou s lehkým řetězcem kappa a bylo zjištěno, že tato MH1 protilátka reaguje v křížové reakci nejen s lidským, ale i s králičím fibrinem.
Předmět tohoto vynálezu se neomezuje pouze na tyto uložené hybridomy. Uvedené hybridomy byly použity jako ilustrační příklady hybridomu, které produkují fibrin-specifícké monoklonální protilátky zde uváděným způsobem. Termínem fiinkční ekvivalent^'s“émíni7žě protílátká je schopnákompetice s protilátkou MH1 nebo 45J ve vazbě na epitop fibrinu, na který se váže protilátka MH1, nebo na epitop fibrinogenu, na který se váže protilátka 45J. Takovýto termín navíc zahrnuje fibrin-specifícké monoklonální protilátky, podle výše popsaného postupu, které se váží na epitop odlišný od epitopu, na který se váže protilátka MH1 nebo 45J.
5.7. Diagnostika in vivo a terapeutické využití fibrin-specifických monoklonálních protilátek.
Fibrin-specifícké monoklonální protilátky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mají schopnost zaměřit chomáče fibrinu nebo jeho shluky in vivo. Tyto monoklonální protilátky mohou být tudíž použity pro lokalizaci možných tkáňových nebo vaskulárních poškození u člověka nebo pro sledování vaskulámích onemocnění. Pro tyto účely je obzválšť vhodná fibrin-specifická monoklonální protilátka, protože takováto monoklonální protilátka se nebude vázat ani na flbrinogen, ani . -71na produkty degradace fibrinogenu nebo fibrinu, čímž snižuje pozadí takového vyšetření, které pak umožňuje daleko přesnější lokalizaci fibrinových sraženin nebo shluků fibrinu.
Pro takové použití je lépe používat purifikované monoklonální protilátky. Purifikace monoklonálních protilátek pro použití u lidí může být rovněž provedena síranem amonným nebo síranem sodným a dialýzou proti fyziologickému roztoku, po které následuje sterilizace filtrací. K purifikaci monoklonálních protilátek mohou být rovněž použity chromatografícké techniky.
Takto purifikované monoklonální protilátky mohou být označeny radioaktivními sloučeninami, jako na příklad U3I, 12iI, I31I, mTc, luIn, a pacientovi pak aplikovány nitrožiíně. Tyto protilátky mohou být rovněž značeny magnetickou sondou. Pak je k vyhledání sraženiny použita technika NMR. Po usídlení těchto protilátek na sraženině nebo shluku’ fibrinu mohou být tyto lokalizovány pomocí emisní tomografie nebo radíonukleárními vyšetřovacími metodami a tak ukázat na polohu například trombu nebo zapouzdřeného nádoru.
Pro lepší viditelnost je taková purifikovaná protilátka rozpuštěna ve vhodném nosiči, např. fyziologickém roztoku s lidským albuminem nebo bez něj, a pacientovi je podána ve vhodné dávce. Monoklonální protilátky se obvykle aplikují nitrožiíně, např. kontinuální nitrožilní infuzí po dobu několika hodin.
-125.7.2. Léčba vaskulárních onemocnění koniugáty monoklonálních protilátek.
Monoklonální protilátky popsané v tomto vynálezu mohou být použity ve spojení s širokou škálou farmaceutických látek jakou jsou cytotoxické reagencie a trombolytické reagencie, např. t-PA, urokináza streptokináza, a s dalšími proteázami, které mají schopnost lyžovat fibrin. Využití monoklonálních protilátek tímto způsobem je obzvlášť výhodné, protože fibrin-specífícké monoklonální protilátky tohoto vynálezu,
----umožňují -velice -účinné -využití-- takových - reagencií,—protože— neďójde ké ztrátám žádného'z 'těchtočinidel·'vazbou~na^— fíbrinogen nebo produkty degradace fibrinogenu či produkce degradace fíbrinu.
Další informace k tomuto tématu lze nalézt v Bale se sp., 1980. Cancer Research. 40: 2965-291; Ghose a Blair, 1978, J. Nati. Cancer Inst., 6/(3): 657-676; Gregoriadis, 1977, Nátuře, 265:407-411; Gregoriadis, 1980 Pharmac, Ther.. 10:103-108; a Trouet se sp., 1980, Recent Results Cancer Res.. 75:229-235.
Metody použité k navázaní těchto agens na molekuly monoklonální protilátky mohou zahrnovat buď kovalentní nebo . nekovalentní vazby. Protože je pravděpodobnější, že nekovalentní vazby budou snáze přerušeny ještě před tím, než takový komplex protilátek dosáhne svého cílového místa, dává se přednost kovalentním vazbám. Může být například vytvořena karbodiimidová vazba mezi karboxylovými skupinami farmaceutického Činidla a aminoskupinami molekuly protilátky. Bifunkční Činidla jako jsou dialdehydy nebo imidoestery mohou
-73být použity k navázání aminoskupiny takového činidla na aminoskupiny molekuly protilátky. K vazbě léků na molekuly protilátek může být využito reakce Shiffových bází. ' Tato metoda sestává z oxidace léku nebo cytotoxického činidla, který obsahuje glykol nebo hydroxyskupinu, jodistanem, Čímž vzniká aldehyd, který pak reaguje s molekulou protilátky. Připojení probíhá přes vytvoření Shiffovy báze s aminoskupinou molekuly protilátky. Rovněž byly s molekulami protilátek spárovány léky s reaktivními sulfhydrylovými skupinami.
... 6. DETEKCE IN VITRO A MĚŘENÍ ROZBUSTNÉHO FIBRINU.
6.1. Základní informace
Jak jsem uvedli již v oddíle 5.1., zahrnuje hemostatický mechanizmus složitý komplex reakcí, ve kterých je nakonec fibrinogen působením trombínu převeden na fibrin. Výsledkem těchto teakcí je vznik trombu (krevní sraženiny). Sekvence reakcí může být jednoduše představována následujícím třístupňovým procesem;
trombin krok 1 - Proteolýza: fibrinogen monomery fibrinu + fibrinopeptidy A a B krok 2 - Polymerizace: monomery fibrinu rozpustné polymery fibrinu
-Ί4krok 3 - Srážení: rozpustné polymery fibrinu fibrinová sraženina
Fibrinogen se skládá ze tří párů různých polypeptidových řetězců: Aa, Ββ a γ. Viz L. Stryer, Biochemistry, 3.vyd. str. 249, W.H. Freeman a Company New York (1988). V prvním kroce, kde je fibrinogen přeměňován na fibrin (viz výše jako krok 1), je fibrinogen štěpen trombinem, přičemž se ze dvou Aa řetězců fibrinu odštěpuje fíbrinopeptid A z aminokonců teto molekuly /' Výšredňý~moňbmer‘jě Tibrinovy7 mononféf DesAX. Jak je rovněž uvedeno v kroku 1, trombin rovněž odštěpuje z aminokonců obou Ββ řetězců fibrinu fíbrinopeptid B. Výsledkem uvolnění fibrinopeptidu dochází na a a β řetězcích fibrinu k expozici nových aminokonců. V prvním kroku tedy dochází ke vzniku fibrinopeptidu A, fibrinopeptidu B a fibrinových monomerů DesAA a DesBB, které jsou výše uvedeny pouze jako fibrinové monomery. Viz W, Nieuwenhuizen, Blood Coagulation and Fibrinolysis, 4:93-96 (1993). Podle kroku 2 pak fibrinové monomery vytváří nekovalentní (nesíťované) a kovalentní (síťované) polymery, čímž vznikají rozpustné polymery fibrinu. Jak vidíme v kroku 3, rozpustné polymery fibrinu pak vytváří fibrinovou sraženinu.
Rozpustný fibrin je definován jako jakýkoli druh molekuly pocházející z fíbrinogenu nebo fibrinu, který může vést k tvorbě polymeru fibrinu nebo jakýkoli druh molekuly odvozený od fíbrinogenu nebo fibrinu, který má molekulovou hmotnost vyšší než je molekulová hmotnost nativního fíbrinogenu a udržuje s v
-75krvi v roztoku. Nesíťované a síťované DesAABB polymery fíbrinu, vytvořené podle kroku 2 výše, představují dva z několika druhů rozpustného fíbrinu a jsou rovněž dvěma druhy rozpustných polymerů fíbrinu. Termín rozpustný fibrin navíc zahrnuje další různé druhy; např. polymery fíbrinu DesAA, tj. komplexy vytvořené interakcemi mezi monomery fíbrinu (buď monomery fíbrinu DesAA nebo DesAABB) a X, Y, D a E produkty degradace fibrinogenu (viz oddíl 5.1. výše, kde jsou popsány produkty těchto degradací) a rovněž na příklad DesAA a DesAABB monomery v komplexu s fíbrinogenem, viz Nieuwenhuizen, str. 93-94.
Polymery rozpustného fíbrinu jsou bezprostřední prekurzorý nerozpustného fíbrinu, to znamená, že sraženina a následně hladiny rozpustných fibrinových polymerů v plazmě se u jednotlivce zřejmě zvyšují při ohrožení trombózou nebo při její existenci (tvorba intravaskulárních krevních sraženin). Zjišťování a měření množství těchto polymerů v krvi, zvláště pak polymerů DesAABB rozpustného fíbrinu, by tak poskytovalo užitečný ukazatel počínající tvorby krevních sraženin. Viz Bang a Chang, str. 119-121, a Nieuwenhuizen, str. 94, Marder se sp., patent Spojených států amerických č. 5,206,140. Určité druhy rozpustného fíbrinu byly dříve zjišťovány a méřenv pomocí různých metod včetně měření fibrinopeptidu A při použití protilátek proti epitopům Aa a γ exponovaným při přeměně fibrinogenu na fibrin, Nieuwenhuizen, 94-96, a měření D-dimerů, 'Marder se sp., patent Spojených států amerických
-16č.5,206,140. Další metody používané ke zjišťováni a měření rozpustného fíbrinu zahrnují například měření aglutinacě erytrocytů potažených fibrinem v přítomnosti rozpustného fíbrinu, gelovou chromatografii, míru zvýšení aktivace plasminogenu t-PA aktivátorem plasminogenu, viz Nieuwenhuizen. str. 94, ethanolové nebo protaminové síranové gelování, analýzu N-konců frakcí fíbrinogenu purifíkoyaných z plazmy, inkorporaci gíycin-ethylesteru značeného 14C a agarózovou gelovou chromatografii, viz Bang a Chang, str.
11-118. Žádný z těchto těstu specificky· neurčuje “a neměří 'jak- _ rozpustné kovalentní tak nekovalentní polymery fíbrinu.
6.2. In vitro analvza rozpustných síťovaných polymerů , fíbrinu a rozpustných nesíťovanvch polymerů w fíbrinu.
Tento vynález je založen na objevu, že je možné provádět takovou in vitro analýzu vedoucí ke zjištění a měření množství rozpustných síťovaných polymerů DesAABB fíbrinu a rozpustných nesíťovaných DesAABB polymerů fíbrinu, kde jsou tyto polymery složeny z monomerů fíbrinu DesAABB, a která neobsahuje žádnou detekci (a) fíbrinogenu, (b) produktů degradace fíbrinogenu, (c) monomerů fíbrinu DesAA, (d) DesAA fíbrinových polymerů, (e) DesAABB fibrinových monomerů, (f) síťovaného fíbrinogenu (fíbrinogen po reakci s faktorem XI11 a), (g) komplexů fíbrinogen-DesAA monomer fíbrinu a (h) produktů degradace fíbrinu (druhy (a) - (h)). Produkty degradace fíbrinogenu a produkty degradace fíbrinu
-77jsou ty produkty, které vznikají štěpením fibrinogenu nebo fibrinu plasminem tak, jak bylo popsáno v oddíle 5.5.2. výše.
Věříme, že výše popsaná analýza je zvláště užitečná pro klinickou diagnostiku stavů charakterizovaných trombózou.
Tato analýza může být prováděna při použití jakéhokoli vhodného vzorku tělesné tekutiny, ale je obvykle prováděna s použitím savčí krve jako vzorku. Vhodnými savci jsou pro tyto účely například králíci, opice a lidé, kteří jsou pro diagnostiku lidských nemocí nej vhodnější.
V takovémto testu mohou být použity jakékoli dosud známé či v budoucnosti vyvinuté prostředky pro zjišťování polymerů DesAABB síťovaného rozpustného fibrinu a polymerů DesAABB nesíťovaného rozpustného fibrinu, a které nedetekují druhy (a) - (h).
Jakmile je zjištěna jejich přítomnost, mohou být DesAABB polymery rozpustného síťovaného fibrinu a DesAABB polymery rozpustného nesíťovaného fibrinu ve & vzorku měřeny buď srovnáním s kontrolním vzorkem, nebo použitím standardů majících známé množství DesAABB polymerů rozpustného síťovaného fibrinu a DesAABB polymerů rozpustného nesíťovaného fibrinu ve vzorku, přičemž tyto standardy neobsahují žádný z druhů (a) - (h).
Podotýkáme, že prostředek pro zjištění přítomnosti určité látky je jakýkoli prostředek, jehož pomocí může být určena přítomnost požadovaného materiálu v testovaném vzorku. Vhodnějším takovýmto prostředkem je protilátka proti DesAABB polymerům síťovaného rozpustného fibrinu a
-78DesAABB polymerům nesíťovaného rozpustného fibrinu, přičemž tato protilátka nereaguje v křížové reakci s (a) fibrinogenem, (b) produkty degradace fibrinogenu, (c) DesAA monomery fibrinu, (d) DesAA polymery fibrinu, (e) DesAABB monomery fibrinu, (f) síťovaným fibrinem, (g) komplexy fibrinogen-DesAA monomer fibrinu a (h) produkty degradace fibrinu. Zmíněná protilátka může být použita ke . zjištění přítomnosti a měření množství DesAABB polymerů rozpustného síťovaného fibrinu a ke zjištění přítomnosti a měření množství DesAABB polymerů'TozpusTnéhó^néšíťovaiiěho - fibrinu'v-testovaném vzorku. Mezi takové protilátky patří polyklónálňí nebo monoklonální protilátky, častěji však monoklonální. Taková protilátka může-být odvozena od jakéhokoli živočišného druhu. Je však lépe, je-li původu lidského, myšího nebo králičího. Tyto protilátky navíc zahrnují i chimérické protilátky, jednoduché řetězce protilátek a Fab fragmenty, tento výčet však není konečný.'
Příkladem takové protilátky je monoklonální protilátka MH1 popsaná v oddíle 5.5.1. - 5.5.3. a v oddíle 5.6 výše. Věříme, že MH1 protilátka nemá kromě výše uvedených vazebných charakteristik schopnost vázat se na komplexy produktů degradace fíbrin-fíbrinogen. Tato vazebná vlastnost této MH1 protilátky může zvyšovat její účinnost jako prostředku pro zjišťování a měření rozpustných síťovaných a nesíťovaných DesAABB fibrinových polymerů.
Jako prostředek k detekci mohou být použity dvě nebo více protilátek. Tak mohou být použity kombinace protilátek s
-79odlišnou specifítou pro zjišťování a měření rozpustných síťovaných DesAABB fibrinových polymerů a rozpustných nesíťovaných DesAABB fibrinových polymerů ve vzorku, kde například ani jedna z protilátek není schopna sama o sobě tvořit komplex ani s DesAABB polymery síťovaného rozpustného fibrinu, ani s DesAABB polymery nesíťovaného rozpustného fibrinu, a kde takové komplexy mohou vytvořit dvě nebo více těchto protilátek. Samozřejmě nesmí žádná z těchto protilátek reagovat v křížové reakci s druhy (a) - (h).
Rovněž podotýkáme, že pri použití protilátek může být nezbytné použít protilátky specifické pro daný živočišný druh.
• <
Pro výrobu protilátek mohou být použita různá zvířata * fV imunizací injekcí s DesAABB polymery rozpustného síťovaného λ
-*Á>
fibrinu a DesAABB polymery rozpustného nesíťovaného fibrinu jako antigenu, přičemž mezi tato zvířata patří králíci, myši, potkani, a další. Takové polymery mohou být selektivně izolovány při použití např. MH1 protilátky spolu s afinitní chromatografii na koloně se Sepharózou a navázanou , protilátkou MH1. Tyto polymery mohou být připraveny následujícím způsobem; rozpustný fibrin může být nejdříve připraven in vitro přidáním nízkých hladin trombínu do plazmy s citrátem. Po potlačení aktivity trombínu některým z inhibitorů trombínu jako např, hirudinem se mohou vzorky plazmy nanést na kolonu Sepharósa-MHl protilátka. Takováto MH1 kolona může’být připravena známou metodou navázání protilátky MH1 na Sepharosu 4B (Pharmacia) aktivovanou bromidem kyanovodíku (viz příloha výrobků Pharmacia pro metody
-80přípravy kolony protilátka-Sepharosa 4B využívající předem aktivovanou Sepharosu 4B). Rozpustný fibrin je nejdříve aplikován na kolonu Sepharosa-MHl za přítomnosti fyziologického roztoku tlumeného fosfátem (PBS). Po navázání na sloupec Sephařosy-MHl může být fibrin eluován roztokem thiokyanátu sodného. Po dialýze proti PBS může být izolovaný polymer fíbrinu skladován při -70°C.
Za účelem zvýšení imunitní odpovědi-mohou být spolu s izolovanými polymery použita různá adjuvans v závislost na
-----živočišném- -druhu. —Mezi -4ato_adj.uy.ans. JjatLL pumo jiné
Freundovokompletnr i nekompletní adjuvans, anorganické gely™,..
jako hydroxid hliníku, povrch aktivující látky jako íysolecitin, pluronové polyoly, polyaniony, peptidy, olejové emulze, . hemocyanin, dinitrofenol, a potenciálně, vhodná lidská adjuvans jako BCG (bacil Calmette-Guerin) a Corynebacterium parvum.
Monoklonální protilátky specifické ha DesAABB polymery rozpustného síťovaného a rozpustného nesíťovaného fíbrinu, přičemž tyto protilátky nereagují v křížové reakci s druhy (a) - (g), mohou být připraveny jakýmikoli technikami používanými pro přípravu molekul protilátek pomocí kontinuálního pěstování buněčné linie v kultuře. Mezi tyto techniky mimo jiné patří hybridomové techniky původně popsané Kohíerem a Milsteinem, (Nátuře, 1975, 256:495-497), v poslední době rovněž techniky pro hybridomy lidských B buněk (Kosbor se sp., 1983. Immunolog-v Todav. 4:72). a technikyy EBV-hybridomů (Cole se sp., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss., Inc., str. 77-96).
-81V dalším provedení tohoto vynálezu mohou být monoklonální protilátky vyráběny pomocí gnotobiotických laboratorních zvířat při použití současné technologie, viz oddíl 5.2.-5.4. Příkladem výroby takové protilátky je protilátka MH1 popsaná v oddíle 5.3-5.6.
Podle tohoto vynálezu mohou - být lidské protilátky vyráběny a získávány s použitím lidských hybridomů (Cote se sp., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. 36:2026-2030) nebo transformací lidských B buněk virem EBV in vitro (Cole se sp., 1985, v Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77-96). Ve skutečnosti mohou být podle tohoto vynálezu použity techniky vyvinuté pro výrobu chimérických protilátek (Morrison se sp., 1984. Proč. Nati. Acad. Sci. 81. 6851-6855; Neuberger se sp., 1984, Nátuře 372:604-608; $ Takeda se sp. 1985, Nátuře 374:452-454) sestřihem genů pro 5 specifitu molekuly myší protilátky proti příslušnému antigenu spolu s geny molekuly lidské protilátky o příslušné biologické v’ aktivitě. Takové protilátky spadají do rozsahu tohoto vynálezu.
$
Podle tohoto vynálezu mohou být zde popsané metody ‘ přípravy protilátek s jednoduchým řetězcem (patent Spojených států amerických, č. 4,946,778) upraveny pro přípravu protilátek se specifickým řetězcem.
V dalším provedení tohoto vynálezu jsou použity techniky popsané pro konstrukci expresívních knihoven Fab (Huse se sp., Science, 246:1275-1281), které umožňují snadnou identifikaci monoklonálních Fab fragmentů s požadovanou specifítou na
-82rozpustné síťované a rozpustné nesíťované polymery DesAABB fibrinu.
Fragmenty protilátky, které obsahují specifická vazebná místa pro rozpustné síťované a rozpustné nesíťované DesAABB fibrinové polymery, mohou být připravovány známými metodami. Mezi takové fragmenty, patří na příklad fragmenty F(abl)2, které mohou být připravovány štěpením molekuly protilátky pepsinem, a fragmenty Fab, které mohou být připravovány redukcí disulfidových můstků fragmentů Ffab1),.
- Přóťirátký7které“jsou“přeďmětemtohoto_vynálezurmohou--------být používány v systému imunoanalýz, které jsou pracovníkům v oboru dostatečně známy. Mezi tyto imunologické testy mimo jiné patří radioimunoanalýza; enzymový imunosorpční? test, sendvičový test, analýza imunodifuze na.gelu, aglutinační.test, fluorescenční imunoanalýza, imunoanalýza proteinem A, imunoelektroforéza, a jiné. Patent Spojených států amerických č. 4,629,783 a. zde citové patenty rovněž uvádějí .použitelné, způsoby testování.
Daná protilátka může být použita jako základní reagencie v řadě různých imunoanalýz k určování přítomnosti rozpustných síťovaných a rozpustných nesíťovaných DesAABB fibrinoyých . . polymerů ve vzorku krve nebo jiné tělesné tekutiny. Obecně řečeno může být tato protilátka využita v jakémkoli typu imunoanalýzy ať již kvantitativní, nebo kvalitativní. Tyto imunoanalýzy zahrnují jak oboustranný sendvičový tesť, ták jednostrannou imunoanalýzu nekompetičního typu a tradiční kompetiční test.
-83Nejčastěji používaným testem je pro snadnou detekci a jeho kvantitativní povahu sandvičový test nebo test s dvojí protilátkou mající mnoho variant, které jsou všechny použitelné pro tento vynález.
Na příklad v typickém sandvičovém testu je protilátka imobilizována na pevném substrátu, např. na mikrotitrační destičce, a testovaný vzorek je aplikován na navázanou protilátku. Po určité době potřebné pro inkubaci, to jest po době dostatečné pro vytvoření binárního komplexu antigen-protilátka, je přidána druhá protilátka značená skupinou schopnou indukovat detekovatelný signál a inkubace pokračuje po další dostatečný čas potřebný pro vytvoření vazby na antigen ; v různých místech a pro tvorbu ternárního komplexu .rvš protilátka-antigen-značená protilátka. Veškerý nezreagovaný ...·?·;·;$ materiál je odmyt a přítomnost antigenu je určena pozorováním ·’ —l signálu, který může být vyhodnocen srovnáním s kontrolním vzorkem (standardem) obsahujícím známé množství antigenu. τ * $
Různé obměny sendvičového testu zahrnují simultánní analýzu, ve které jsou jak vzorek tak protilátka současně přidány k y navázané protilátce, nebo obrácený sendvičový test, ve kterém jsou značená protilátka a testovaný vzorek nejdříve smíchány, inkubovány, a pak přidány k neznačené protilátce navázané na povrchu. Tyto techniky jsou pracovníkům v oboru dostatečně známy a možnosti drobných obměn těchto metod jsou zřejmé:
Sendivičový test” zde zahrnuje všechny obměny základních dvoustranných technik.
-84Jako specifičtější příklad uvádíme typický sendvičový test, ve kterém je primární protilátka buď kovalentně nebo pasivně, navázána na pevný podklad. Pevným podkladem je obvykle sklo nebo nějaký polymer, přičemž nejpoužívanějšími polymery jsou celulóza, polyakrylamid, nylon, polystyren, polyvinylchlorid nebo polypropylen. Pevný podklad může být ve formě zkumavky, lázně, desek nebo mikrodestiček, nebo v jakékoli další formě, vhodné k provádění imunoanalýzy. Pracovníkům v oboru jsou vazebné procesy dostatečně známy.
PO' navázání protilátky je-pevnáfáze-komplexu- protilátky-omyta----------a připravena pro testovaný vzorék. Alikvot testované tělesné ~ * * tekutiny je pak přidán k pevné fázi komplexu a inkubován po dostatečnou dobu, aby došlo k navázání veškerých přítomných, rozpustných nesíťo.vaných. DesAABB polymerů: fibrinu a rozpustných síťovaných DesAABB polymerů fibrinu na protilátku specifickou na tyto proteiny. Pak je k pevné fázi komplexu přidána druhá protilátka a je inkubována po další dobu nezbytnou pro navázání druhé protilátky na pevnou fázi komplexu primární protilátka-antigen. Druhá protilátka je navázána na zpravodajskou molekulu poskytující viditelný signál, který je použit jako .ukazatel vazby druhé protilátky na kterýkoli antigen testovaného vzorku. Zpravodajskou molekulou je pro tuto specifikaci míněna molekula, která svou chemickou povahou poskytuje analyticky zjistitelný signál, který umožňuje detekci protilátky navázané na antigen.
Detekce musí být alespoň poměrně kvantifikovatelná, aby bylo možno určit množství antigenu ve vzorku, které může být
-85vypočteno v absolutních hodnotách nebo jako porovnání se standardem (nebo několika standardy) obsahujícím známou normální hladinu antigenu.
Nejběžněji používanou zpravodajskou molekulou v tomto typu testů jsou buď enzymy nebo fluorofory. V případě imunoanalýzy je enzym konjugován s druhou protilátkou často pomocí glutaraldehydu nebo jodistanu. Je ovšem jasné, že existuje celá řada různých konjugačních technik a pracovníci v oboru je jistě dobře znají. Běžně používaným enzymem je mimo jiné křenová peroxidáza, glukosaoxidáza, β-galaktosidáza a alkalická fosfatáza. Substráty používané s těmito specifickými enzymy se obvykle volí podle jejich schopnosti měnit barvu pri hvdrolýze příslušným enzymem. Tak na příklad >. f | p-nitrofenylfosfát je vhodný pro použití s konjugáty alkalické Ť. r. fosfatázy, pro konjugáty peroxidázy se obvykle používají ? 1,2-fenylendiamin nebo toluidin. Je rovněž možné použít fluorogenní substráty, které dávají vznik fluoreskujícím Λ produktům. V každém případě je enzymem značená protilátka z $ přidána ke komplexu první protilátky a ponechána, aby se ~ ·**ϊ navázala na tento komplex, a pak je přebývající značená protilátka odmyta. Poté je k ternárnímu komplexu protilátka-antigen-značená protilátka přidán roztok obsahující vhodný substrát. Tento substrát reaguje s enzymem navázaným na druhou2 protilátku, čímž dává kvalitativní viditelný signál, který může být dále kvantifikován, obvykle spektrofotometricky, a tím poskytnout vyhodnocení množství antigenu přítomného v séru vzorku.
-86Nebo mohou být použity fluoreskující sloučeniny jako fluorescein nebo rhodamin, které jsou chemicky navázány na protilátky, aniž by nějak změnily vazebnou kapacitu těchto protilátek. Po aktivaci osvícením nebo určitou vlnovou délkou absorbuje protilátka značená fluoreskující látkou světelnou energii, čímž v molekule dochází k excitovanému stavu, který má za následek emisi světla o určité charakteristické vlnové délce. Emise se objeví jako charakteristická barva pozorovatelná ve světelném mikroskopu. Stejně jako v _____enzymové^_ imuno_analýze __(EIA) je_____Protilátka značená/ * fluoreskující látkou ponechána, aby se navázala-na .komplex prvního protilátky a antigenu. Po odmytí nenavázané složky je zbývající ternámí komplex vystaven světlu,o příslušné vlnové délce a pozorování fluorescence, vypovídá o přítomnosti antigenu. Techniky imunofluorescence i EIA jsou obě dobře odzkoušené a známé, a pro účely této metody obzvlášť vhodné. Nicméně mohou .být použity i další zpravodajské molekuly jako jsou radioizotopy, chemiluminiscentní nebo bioluminiscentní molekuly. Pracovníci v Oboru budou již sami vědět, jakou variantu této metody pro své potřeby zvolit.
Další možností u testovaného vzorku, ať už jím je savčí krev nebo jiná tělesná tekutina obsahující rozpustné DesAABB polymery nesíťovaného fibrinu a rozpustné DesAABB polymery síťovaného fibrinu, je použití jednostranné imunoanalýzy, ve které je tento vzorek kovalentně nebo nekovalentně připoután k. pevnému substrátu. Neznačená protilátka je uvedena do kontaktu s vzorkem vázaným na pevný substrát. Po vhodné
-87«ί době inkubace, která poskytuje dostatek času pro tvorbu binárních komplexů protilátka-antigen, je přidána druhá protilátka značená zpravodajskou molekulou schopnou indukovat zjistitelný signál a inkubace pokračuje dále po dobu potřebnou pro vytvoření ternárního komplexu antigen-protilátka-značená protilátka. Pro jednostrannou imunoanalýzu může být druhou protilátkou obecná protilátka (tj. zenogeneická protilátka proti imunoglobulinu, zvláště anti-IgM a anti-IgG navázaná na zpravodajskou molekulu), která je schopná vázat protilátku specifickou na rozpustný polymer kovalentního fibrinu a na rozpustný polymer nekovalentního fibrinu. v,
Zjišťování a měření rozpustných DesAABB polymerů síťovaného fibrinu a rozpustných DesAABB polymerů .s nesíťovaného fibrinu je obzvláště užitečné v případech, kdy je tento test prováděn na plazmě pacientů, aby se zjistila začínající nebo již existující trombotická příhoda, která je důsledkem d začínající nebo již existující trombózy. Viz. napr. W. Nieuwenhuizen, str. 94, Bang a Chang, str. 109-122, a Marder se sp., patent Spojených států amerických č.5,206,140. Takové příhody zahrnují například trombózu hlubokých žil (DVT), stav, který vzniká, jestliže se trombus (krevní sraženina) uvolní z hlubokých žil a embolizuje pulmonámí vaskulaturu; diseminovanou intravaskulární koagulaci, která vzniká jako výsledek systémové aktivace kaskády srážení krve (napr. při bakteriální infekci); infarkt myokardu (MI), který vzniká pri ucpání koronární arterie, která zásobuje srdeční sval krví,
-88trombem; mrtvice; a intrakardiálního trombu vzniklého v důsledku sinové fibrilace. Typ trombotické příhody může být diagnostikován s použitím testu pro zjišťování a měření rozpustných DesAABB polymerů síťovaného fibrinu a rozpustných DesAABB polymerů nesíťováného fibrinu v kombinaci s pozorování dalších symptomů pacienta. Jedná se o ty symptomy, které by byly běžně využity pro klinickou diagnózu počínající nebo již existující trombotické příhody. Uvedené zjišťování a měření rozpustných DesAABB polymerů fibrinu je zvl’ášťě~užiťěčňe~jakó^prošťřéděk' pro difěrenciační diagnostiku pro odlišení pacientů s bolestmi na prsou v důsledku počínajícího infarktu myokardu od pacientů s bolestmi na prsou z jiných důvodů.
6.3. PŘÍKLADY MATERIÁLŮ A METOD
6.3.1.Proteiny
Hovězí serumalbumin a trombin byly zakoupeny od ICN (Costa Mesa, CA). Hirudin, křenová peroxidáza a tablety substrátu o-fenylendiamindichloridu byly nakoupeny od Sigma Chemical Co. (St. Luis, MO). Lidský fibrinogen (stupeň L) byl nakoupen od Helena Laboratories (Beaumont, TX). Fibrinogen byl dáte purifikován precipitací síranem amonným podle Holma se sp Thromb. Res. 37; 165-176 (1985). Monoklonální protilátka proti fibrinu, MH1, používaná v systému testů byla provedena výše popsaným způsobem, viz oddíl 5. Monoklonální protilátka proti fibrinogenu, 45J, byla rovněž připravena postupem podle oddílu 5.
-89DesAABB monomer fibrinu byl připraven rozpuštěním polymeru nesíťovaného fibrinu v pufrovacím roztoku 50 mM octanu sodného (pH5,3) obsahujícím bromid sodný.
Polymery DesAABB síťovaného rozpustného fibrinu byly vyrobeny inkubací fíbrinogenu nebo plazmy s citrátem s nízkými hladinami trombinu (0,025 jednotek/ml) po dobu 7-8 minut. Reakční směs rovněž obsahovala faktor XlIIa. Reakce byla zastavena přidáním hirudinu k reakční směsi (do konečné koncentrace 10 ATU/ml).
Polymery DesAABB nesíťovaného rozpustného fibrinu byly připraveny inkubací plazmy s přídavkem citrátu nebo fíbrinogenu s roztokem trombinu obsahujícím EDTA (konečná koncentrace' 12 mM) po dobu 7-8 minut při teplotě 37°C. Reakce byla zastavena přídavkem nadbytku hirudinu k reakční směsi (konečná koncentrace 10 ATU/ml).
6.3.2. Konjugátv MH1 a 45J křenové peroxidázy (upraveno podle Wilsona a Nakane, Imunofluorescence and Related Statning Techniques, Knapp se sp. (vyd.), str. 215.224, Elsevier/North Holland Biomedical Press, Amsterdam (1978))
Křenová peroxidáza (HRP) (RZ > 3) (10 mg) byla rozpuštěna v 1 ml destilované vody. Byl přidán Čerstvě připravený 0,lM roztok jodistanu sodného (0,4 ml) a ža mírného míchání ponecháno po dobu 20 minut. Poté byl roztok přenesen do pufru octanu sodného (1% mM, pH4,4) při teplotě 4°C a s použitím mikrokoncentrátoru Centricon 10.
-90Bylo zvýšeno pH roztoku na 9,5 přidáním 40 ml 0,2'M uhličitanového pufru s hydrogenuhličitaňem sodným (pH9,5).
Pak byla okamžitě přidána protilátka MH1 (20 mg) v objemu 2,0 ml 0,01M uhličitanového pufru (pH9,5). Tento roztok byl mírně promícháván při laboratorní teplotě po dobu 2 hodin, po kterých byl přidány 0,2 mi čerstvě připraveného roztoku boritanů sodného ( 4 mg/ml). Směs byla ponechána v klidu 2 hodiny při teplotě 4°C. «
Nakonec byl konjugát protilátka HRP dialyzován proti 5x4litrům PBS při teplotě 2-8°C. -------------------------------------------------------Konjugát byl uskladněn v hnědém kontejneru- při“ teplotě“— 2-8°C.
6.3.4, Vzorky krve
Vzorky krve byly získány jak od zdravých dobrovolníků, tak od pacientů na pohotovosti s klinickými příznaky MI jako např. ostrými bolestmi na prsou, na základě jejich souhlasu. Krevní vzorky byly shromažďovány do vacutainerů, tj. jednorázových odběrek, (Becton Dickinson) s použitím citrátu sodného. Plazma byla oddělena centrífugací při 2400 rpm po dobu 15 minut. Pak byla plazma okamžitě použita nebo uskladněna při -70°C.
6.3.4. ELISA test pro měření rozpustného fibrinu Rozpustný fibrin byl zjišťován v čerstvých nebo zmrzlých vzorcích plazmy s použitím enzymového imunosorpčního testu sendvičového typu. Imobiíizovanou protilátkou byla protilátka
-91MH1 proti fibrinu, která je předmětem tohoto vynálezu.
Zjišťovací (nebo označovací) protilátkou byl HRP konjugát té samé protilátky. Jako označovací protilátka může být rovněž použit HRP konjugát antifíbrinové protilátky 45J.
Polyvinylchloridové (PVC) 96ti jamkové mikrotitrační destičky (Costar Cambridge, MA) byly potaženy monoklonální protilátkou MH1 inkubací 100 μΐ roztoku Mab (v 50 mg/ml) v inkubačním pufru (borát sodný, pH8,5) po dobu 12-16 hodin při teplotě 4°C. Nenavázaná protilátka byla z mikrotitračních destiček odstraněna trojím omytím jamek roztokem PBS-Tween.
Jamky potažené MH1 byly. dále potaženy BSA inkubací 200 μΐ roztoku BSA (l%j v PBS (PBS-BSA) po dobu 1 hodiny při teplotě 37°C. Nenavázaný BSA odstraněn překlopením destiček dnem vzhůru a jejich ponechání na papírovém ručníku, aby , * , ý
I t odkapaly. Vzorky s citrátem (50 μΐ) obsahující rozpustný fibrin ~ :* byly inkubovány v jamkách s blokovanými MH1-BSA po dobu 30 minut při teplotě 37°C. Nenavázaný materiál byl odstraněn j . ' ’í.
překlopením destiček a jejich jemným odkapáním. Jamky pak < - Ί byly třikrát omyty PBS-Tween. Navázaný rozpustný fibrin byl « v jamkách zjišťován nejdříve inkubací se 100 μΐ roztoku PBS-BSA konjugátu MH1-HRP (nebo HRP konjugátu protilátky proti fibrinu [fíbrinogenu] 45J) po dobu 30 minut při 37°C.
Nenavázaný konjugát byl odstraněn překlopením mikrotitrační destičky a trojím omytím jamek PBS-Tween. Navázaný konjugát byl zjišťován přidáním 100 μΐ roztoku 0-fenylendiamin dichloridu, který byl v jamkách ponechán po dobu 10 minut při laboratorní teplotě. Roztok substrátu byl připraven rozpuštěním
-92tabulky O-fenylendiamin dichloridu v roztoku citrátu sodného obsahujícím H2O2.
Kolorimetrická reakce byla zastavena po 10 minutách přidáním 25 μΐ roztoku H2SO4 (ÍM). Absorbance roztoku v každé jamce byla určována při 490 nm ve čtecím zařízení pro mikrotitrační destičky Thermomax (Molecular Devices, Menlo Park, CA).
6.3.5. Příprava kolon pro afinitní chromatografii.
Kolony . Sepharosy MH1 _byíy ^připraveny _ násTědujícim^ způsobem:
Zmrzlá vysušená Sepharosa 4B (Pharmacia) aktivovaná bromkyanem byla odvážena v množství 1 g a rozmíchána v ImM HCl. Nabobtnalý gel byl 15 minut promýván 1 mM HCl na sintrováném skleněném filtru.
Protilátka MH1 (20 mg) byla rozpuštěna ve spojovacím pufru (0,1 M NaHCO3, pH8,3 obsahujícím 0,5M NaCl) a jemně vmíchána do nabobtnalého gelu v uzavřené nádobě a ponechána při laboratorní teplotě 2 hodiny nebo při 4°C přes noc.
Po promýchání byl gel promyt spojovacím pufrem, aby se odstranila nadbytečná protilátka. Nezablokovaná aktivní místa byla zablokována reakcí s OJM.Tris HCl, pH8,0 (nebo ethanolaminem, pH9,0) trvající 2 hodiny při laboratorní teplotě. Gel s navázanou protilátkou pak byl třikrát promyt O,1M octanovým pufrem (pH4,0 obsahujícím 0,5M NaCl), po kterém následoval Trisový pufr (O,1M, pH8,0 obsahující NaCl Q,5M).
-93Spárovaná protilátka byla uskladněna při 4°C v 0,05% roztoku s azidem sodným.
Kolony Sepharosy s DesAABB monomerem fibrinu byly připraveny takto:
DesAABB monomery fibrinu byly navázány na Sepharosu 4B aktivovanou bromkyanem za přítomnosti 1M NaBr v O,1M borátovém pufru (pH8,2) pri použití stejného postupu jako při přípravě Sepharosy 4B s MH1 protilátkou.
6.3.6 Charakterizace jednotky rozpustného fibrinu rozpoznáváné in vitro testem pro polymery rozpustného fibrinu používajícího pro detekci rozpustného fibrinu protilátku MH1.
Jak již bylo dříve uvedeno v oddíle 5.5, protilátka MH1 nerozpoznává fibrinogen, plazmový prekurzor polymeru fibrinu: V oddíle 5.5 jsme rovněž ukázali, že tato protilátka rozpoznává polymery jak síťovaného tak nesíťovaného fibrinu. Navíc jsme v tom samém oddíle 5.5 poukázali na to, že degradace fibrinu plasminem (nebo kterýkoli proces, který vede k destrukci struktury fibrinových polymerů) způsobuje ztrátu imunitního rozpoznávání fibrinu takovouto protilátkou. Následně tato MH1 protilátka nerozeznává žádný ze známých produktů degradace kovalentního fibrinu plasminem.
Důkazy, že tato MH1 protilátka rozpoznává pouze polymerní: strukturu fibrinu DesAABB a nerozpoznává monomerní jednotky DesAABB fibrinu, poskytla afinitní chromatografie. Stručně řečeno, 0,5 mg MH1 protilátky bylo
-94I pasážováno přes 5 ml kolonu Sepharosy-desAABB fíbrinového monomeru. Kolona byla promyta ekvilibračním pufrem (O,1M Trisem pufrovaný fyziologický roztok [TBS], pH8,5). Nebylo pozorováno žádné výrazné vázání protilátky na kolonu. Jak ukazuje obrázek IA, byla tato protilátka z kolony vyeluována.
Elucí 6M guanidinhydrochloridem bylo z kolony získáno malé , množství navázaného proteinu. Protein byl zjištěn vyšetřením všech frakcí při 280 nm. Protilátka pak byla určena testováním >
imunoreaktivity daného proteinu pomocí ELISA testu na pevné
---------------fázi s -použitím mikrOt-itračníeh destiček-potažených- fibrinem.---------------Použitý ELISA test je popsán v oddíle 5:4:2 výše: ‘Protein navázaný na kolonu je výsledkem přítomnosti malého množství kontaminujícího rozpustného, polymeru DesAABB fibrinu spárovaného s monomerem DesAABB fibrinu v koloně. Tato kontaminující složka je přítomna v počátečním materiálu použitém pro přípravu kolony monomeru fibrinu DesAABB.
Pro demonstraci, že Sepharosová kolona desAABB monomeru fibrinu má schopnost vázat protilátku, byla kolonou v. kontrolním experimentu pasážována monoklonální protilátka (Mab) specifická proti fibrinu. Jak je vidět na obrázku 1B, kolona vázala kontrolní Mab, tj. protilátku proti fibrinogenu l ... t
45J, a tato protilátka byla opět získána z kolony elucí guanidinhydrochloridem (6M).
Důkazy, že výše popsaná MH1 protilátka rozpoznává polymery jak síťovaného, tak nesíťovaného rozpustnéhoDesAABB fibrinu, byly získány v experimentu, ve kterém byly *
DesAABB polymery rozpustného fibrinu vytvořeny přídavkem
-95trombinu do plazmy s citrátem za přítomnosti EDTA a bez EDTA (EDTA zabraňuje faktoru XlIIa vytvořit kovalentní vazby s polymery DesAABB fibrinu). DesAABB polymery síťovaného a nesíťovaného rozpustného fibrinu byly připraveny podle postupu popsaného v oddíle 6.3,1 a jejich příslušná imunoreaktivita byla měřena pomocí ELISA testu podle popisu uvedeného v oddíle 6.3.4. Jak ukazuje obrázek 2, neexistuje v tomto testovacím systému žádný výrazný rozdíl mezi imunoreaktivitou polymerů síťovaného (B) a nesíťovaného (A) fibrinu.
Důkaz, že MH1 protilátka nerozeznává DesAA polymer rozpustného fibrinu, byl získán v experimentu, ve kterém byl . polymer DesAA fibrinu připraven reakcí fibrinogenu nebojý plazmy s enzymem batroxobinem odvozeným od hadího jedu z Bathrops atrox, který selektivně odštěpuje z molekuly > fibrinogenu fíbrinopeptid A (FPA). Batroxobin neštěpí fibrinopeptid B (FPB) na rozdíl od trombinu, který štěpí jak FPA, tak FPB. Odstranění FPA vede k polymerizaci monomerových jednotek desAA fibrinu a k vytvoření fibrinové -vsraženiny DesAA. Obrázek 3 ukazuje tvorbu sraženiny, jak byla měřena absorbancí reakční směsi při 340 nm při inkubaci vzorku fibrinogenu s roztokem batroxobinu po dobu 15 minut při laboratorní teplotě. Absorbance se s časem zvyšovala tak, jak se zvyšovala délka a koncentrace polymerů DesAA rozpustného fibrinu, dokud se nevytvořila konečná sraženina. V experimentu na otestování schopnosti MH1 protilátky rozpoznávat desAA fibrin byl polymer desAA fibrinu vytvořen
-96in vitro inkubací vzorku fibrinogenu s batroxobinem (konečná koncentrace 0,5 jednotek/ml) při 37°C. Ze vzorku byla po reakci s batroxobinem odebírána alikvotní část každých 7 minut a testována ELISA testem podle oddílu 6.3.4. U tohoto vzorku, tj. vzorku C podle obrázku 4, nebyla zjištěna žádná reaktivita.
Z tohoto experimentu můžeme rovněž vydedukovat, že tento testovací systém nerozpoznává komplex fíbrinogen-desAA fíbrin, který je dalším zdrojem rozpustného fíbrinu. Je zřejmé, ?
že reakční směs vytvořená v tomto experimentu obsahovala takové“ jednotky 'rozpustného -fíbrinu·,—protože—batrOxobm---------------------vytváří monomery desAA'fíbrinu,'které jsou volné'pro interakce” ’ ' ’ ~ — s dalšími desAA monomery nebo s neštěpenými molekulami fibrinogenu. Protože v tomto testu nebyla po přidání batroxobinu pozorována žádná reaktivita, můžeme vyslovit závěr, že tento test nedetekuje tyto fibrinogen-desAA fíbrinové jednotky. Vzorek B, který byl pozitivní kontrolou, se skládal z polymerů DesAABB fíbrinu vytvořených reakcí vzorku plazmy s trombinem a hirudinem. Jako negativní kontrola byl přidán nezreagovaný fíbrinogen, tj. vzorek A,
Rozpustný fíbrinový komplex může rovněž vzniknout působením faktoru XlIIa, který spojuje molekuly nativního fibrinogenu za vzniku dimerů fibrinogenu (Kanaide se sp., 8J.
Lab. Clin. Med. 36: 574-579 (1975)). Tento test nedetekuje fíbrinogen po reakci s faktorem XlIIa (FXIIIa). V tomto 13 experimentu byl do jamek mikrotitrační destičky nejdříve přidán trombin aktivovaný faktorem XlIIa a inkubace probíhala po * dobu 30 minut pri 37°C. Po zastavení aktivity zbytkového
-97trombinu byla protilátka MHl inkubována v jamkách po reakci s FXIIIa a navázaná protilátka MHl byla zjišťována použitím konjugátu myší alkalické fosfatázy. Navázaná antimyší protilátka byla zjišťována přídavkem substrátu alkalické fosfatázy. Hladina MHl protilátky navázané v jamkách * mikrotitrační destičky byla měřena odečítáním optické density při 490 nm. Obrázek 5 ukazuje, že u značeného vzorku Fg + ~ FXIIIa nebyla zjištěna žádná protilátka MHl navázaná na jamky mikrotitrační destičky, což ukazuje, že tato protilátka nerozpoznává kovalentní struktury fibrinogenu. Jako pozitivní kontrola byly jamky potažené fíbrinogenem uvedeny v kontakt s trombinem, čímž se vytvořily polymery fíbrinu desAABB. Tyto pak byly na vzorku značeného Fg + trombin testovány na % imunoreaktivitu s protilátkou MHl, viz obrázek 5. V
6.3.7 Měření tvorby rozpustného DesAABB polymeru fíbrinu in vitro,
Rozpustné polymery fíbrinu DesAABB byly in vitro vytvořeny přidáním nízkých hladin trombinu (0.025 NIH jednotek/ml) ke vzorku plazmy s citrátem. Vzorek byl inkubován při teplotě 37°C. V jednominutových intervalech byly ze vzorku odebírány alikvoty a aktivita trombinu byla zastavena přídavkem silného . inhibitoru trombinu hirudinu (do konečné koncentrace 9 2-ATU/ml). Množství polymeru rozpustného fíbrinu DesAABB bylo měřeno v každém alikvotním vzorku ELISA testem popsaným v oddíle 6.3.4.
-98Obrázek 6 ukazuje, jak množství rozpustného polymeru fibrinu určené absorbancí při 490 nm prudce vzrůstá po první lag fázi trvající 4-5 minut po přidání trombinu do plazmy. Hladina polymerů rozpustného, fibrinu dosahuje svého vrcholu po přibližně 7,5 minutách po přidání trombina do plazmy. Strmost křivky hladiny rozpustného fibrinu pozorované po 9-10 minutách se shoduje s gelovatěním a tvorbou nerozpustných fibrinových polymerů (tvorba sraženiny).
Σ6·^·8 Purifikace polymerů rozpustného fibrinu z plazmy afinitní chromatografíí využívající Sepharosu-MHl.
Vzorek plazmy byl inkubován s trombinem (0,025 jednotek/ml) po dobu 7 minut při teplotě 37°C, Aktivita trombinu byla zastavena přidáním nadbytku hirudinu. Reakční směs byla pasážována přes kolonu Sepharosa-MHl. Počáteční materiál, výtok z kolony (nenavázaný materiál), navázaný protein (purifikovaný protein), který byl eluován s použitím NaSCN (3) a dialyzován proti PBS, byly testovány na imunoreaktivitu s MH1 protilátkou pomocí ELISA testu podle sekce 6.3.4. Imunoreaktivita plazmy po přidání trombinu a po zastavení reakce hirudinem (počáteční materiál), navázaného proteinu po odebrání z kolony a dialýze (eluce), a nevázaného materiálů (nevázaný) je uvedena na obrázku 7. Počáteční materiál a vázaný protein po dialýze byly imunoreaktivní s MH1, zatímco nevázaný materiál nebyl.
-996.3.9 In vitro zjišťování a měření polvmerů rozpoustného kovalentního a rozpustného nekovalentního fibrinu pro diagnostiku MI
Třicetšest různých vzorků plazmy bylo testováno na hladiny polymerů rozpustného nesíťovaného a rozpustného síťovaného DesAABB fibrinu pomocí ELISA testů popsaných výše v oddíle 6.3.4 s MH1 jako imobilizovanou protilátkou. Po sebrání byl do vzorků plazmy přidán antikoagulant a vzorky byly zamraženy. Rozmražené vzorky byly testovány na polymery rozpustného síťovaného a nesíťovaného DesAABB fibrinu. Deset z těchto i
vzorků bylo odebráno od zdravých lidských jedinců pro kontrolu. Zdravé kontroly byly získány od dobrovolníků z řad zdravotnického personálu, kteří se těšili plnému zdraví a kteří nikdy po námaze necítili bolesti na prsou. Všechny ostatní vzorky byly odebrány pacientům na oddělení intenzívní péče v místní nemocnici. Všichni tito pacienti z oddělení intenzivní péče měli klinické příznaky (bolest pod prsní kostí) ukazující na infarkt myokardu (MI); u 15 pacientů byl potvrzen infarkt myokardu; u ostatních 11 pacientů bylo prokázáno, že infarktem myokardu netrpí. U druhé skupiny pacientů byíy vysloveny různé diagnózy včetně angíny pectoris, úzkosti, pulmonální edemy. Vzorky krve byly od pacientů odebírány okamžitě po jejich přijetí na oddělení intenzivní péče. U většiny pacientů byly vedeny záznamy o průběhu symptomů. V této studii všichni pacienti zaznamenali bolest pod hrudní kostí 1-3 hodiny před přijetím na oddělení intenzívní péče. Obrázek 8 ukazuje, že všichni pacienti s potvrzeným infarktem myokardu měli
-100výrazně vyšší hladiny polymerů rozpustného ĎesAABB fibrinu než zdravé kontroly (rozdíly byly 3-30tinásobné). U pacientů, kteří měli bolesti na prsou, ale nebyl u nich potvrzen infarkt myokardu, nebyly rozdíly mezi hladinami polymerů rozpustného fibrinu DesAABB. (Hladiny polymerů síťovaného rozpustného a rozpustného nesíťovaného DesAABB fibrinu jsou uvedeny jako Hladina rozpustných fibrinových Elisa jednotek (x 1000]).
Citlivost tohoto testu byla tudíž 100% (pro n=36) a specifíta tohoto testu byla rovněž 100%, tj. test neposkytoval žádné faléšné^kladnenebo 'žápóřhé-hodriofy _MŮžěmé“’fudíž' vyslovit závěr, že tento systém testu má vysokou hladinu přesnosti diagnózy případů infarktu myokardu.
6.4 SOUPRAVY PRO IN VITRO DETEKCI POLYMERŮ ROZPUSTNÉHO SÍŤOVANÉHO FIBRINU A POLYMERŮ ROZPUSTNÉHO NESÍŤOVANÉHO FIBRINU.
Je potřeba si u vědomit, že tento vynález se neomezuje pouze.na využití monoklonálních protilátek v testech. Avšak tam, kde jsou tyto protilátky použity v testovacích soupravách zde uváděných, obsahují tyto soupravy sadu standard, první protilátku (tj. imobilizovanou protilátku, na příklad MH1), která může být imobilizována na nějakém povrchu, a druhou protilátku značenou tvůrcem signálu, jak bylo popsáno výše. Tyto soupravy obsahují standardy se známým množstvím polymeru rozpustného síťovaného DesAABB fibrinu a rozpustného nesíťovaného DesAABB fibrinu. Takové standardy
-101mohou být připraveny izolací rozpustných síťovaných a nesíťovaných DesAABB fíbrinových polymerů pomocí MH1 Sepharosové afinitní kolony podle výše popsaného postupu. Tyto soupravy mohou rovněž obsahovat soubor pomůcek nebo chemikálií potřebných pro reakce s testovanými vzorky.
Veškeré citované publikace a patenty jsou uvedeny v přehledu literatury.

Claims (21)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Metoda pro in vitro detekci přítomnosti nebo množství polymerů rozpustného síťovaného fibrinu DesAABB a polymerů rozpustného nesíťovaného fibrinu DesAABB v savčích vzorcích, vyznačující se tím, že zahrnuje kontakt daného vzorku s protilátkou nebo jejím imunoreaktivním fragmentem, která se specificky váže na polymery rozpustného síťovaného fibrinu DesAABB a polymery
    ..rozpustného.....nesíťovaného... „fibrinu- -DesAABB --za—-vzniku imunokomplexu, přičemž se tato ' protilátka nebo Její' imunoreaktivní fragment neváže specificky na: (a) fibrinogen, (b) produkty degradace fibrinogenu, (c) monomery DesAA fibrinu, (d) polymery DesAA fibrinu, (e) monomery DesAABB fibrinu, (f) kovalentní fibrinogen, (g) komplex monomer DesAA fibrin-fibrinogen a (h) produkty degradace fibrinu, a která dále zjišťuje přítomnost nebo množství takového imunokomplexu.
  2. 2. Metoda podle nároku Ivyznačující se tím, ž e v ní používaná protilátka se specificky váže na epitop rozpoznávaný monoklonální protilátkou označenou MH1 produkovanou hybridomem ATCC HB 9739,
  3. 3. Metoda podle nároku 2vyznačující se tím, že v ní používaná protilátka je' monoklonální'protilátka označená MH1 a produkovaná hybridomem ATGC HB 9739.
    jt;
    -1034. Metoda podle nároku lvyznačující se tím, že savčím vzorkem je lidsky vzorek.
  4. 5. . Metoda podle nároku 4vyznačující setím, že lidský vzorek je tělesná tekutina.
    .
  5. 6. Metoda podle nároku 5 v y z n ačující se tím, že tělesnou tekutinou je krev.
  6. 7. Metoda podle nároku lvyznačující se tím, že je v ní imunokomplex detekován nebo kvantifikován pomocí sekundární protilátky nebo jejím imunoreaktivním fragmentem, která se specificky váže na tento imunokomplex, a ve které je K zmíněná sekundární protilátka (nebo její imunoreaktivní fragment) značena zpravodajskou molekulou, která vydává detekovatelný signál, který je měřen a koreluje s přítomností nebo množstvím daného imunokomplexu.
  7. 8. Metoda podle nároku 7vyznačující se tím, ž e v ní používanou sekundární protilátkou je protilátka, která se váže’ na epitop rozpoznávaný monoklonální protilátkou označenou 45J a produkovanou hybridomem ATCC HB 9740.
  8. 9. Metoda podle nároku 8 v y z n a č u j i c í se tím, že v ní používanou sekundární protilátkou je monoklonální protilátka označená 45J a produkovaná hybridomem ATCC HB 9740.
    -10410. Metoda vyznačující se tím, že vyhodnocuje predispozice pro trombotickou příhodu, napomáhá diagnostice výskytu trombotické příhody u savců, zahrnuje detekci množství polymerů rozpustného síťovaného fibrinu DesAABB a polymerů rozpustného nesíťovaného fibrinu DesAABB ve vzorku ze zmíněného savce, zahrnuje, reakci zmíněného vzorku s protilátkou nebo jejím im únore aktivním fragmentem za vzniku imunokomplexu, přičemž se tato protilátka nebo jej í imúriórěáktivřn fragměnCšpéčifický’ neváže na: (a) fíbrinogen, (b) produkty degradace fibrinogenu, (c) monomery DesAA fibrinu, (d) polymery DesAA fibrinu, (e) monomery DesAABB fibrinu, (f) kovalentní fíbrinogen, (g) komplex monomer DesAA fibrin-fíbrinogen, a (h) produkty degradace fibrinu za vzniku jejich imunokomplexu, a která detekuje množství zmíněného imunokomplexu a porovnává dané množství s kontrolním, vzorkem za účelem vyhodnocení predispozic pro trombotickou příhodu nebo za účelem monitorování trombotické příhody u daného savce.
    *
    ..11. Metoda podle nároku 10 v y z n a č u j i c i se tím,, ž e v ní používaná’ protilátka se specificky váže na epitop rozpoznávaný monoklonální protilátkou označenou MH1 a produkovanou hybridomem ATCC HB 9739.
  9. 12. Metoda podle nároku llvyznačující se tím,
    -105ž e v ní používaná protilátka je označena MH1 a produkována hybridomem ATCC HB 9739.
  10. 13. Metoda podle nároku 10 vyznačující se tím, ž e je její pomocí trombotická příhoda vybrána ze skupiny obsahující infarkt myokardu, trombózu hlubokých žil, pulmonální embolii, diseminovanou intravaskulární koagulaci, mrtvici a intrakardiální trombus vzniklý v důsledku síňové fíbrilace.
  11. 14. Metoda podle nároku 10 v y z n a č u j i c i se tím, ž e v ní používaným savčím vzorkem je vzorek lidský.
  12. 15. Metoda podle nároku 14 v y z n a č u j í c í se tím, ž e v ní používaným lidským vzorkem je tělesná tekutina.
    * T
  13. 16. Metoda podle nároku 15 v y z n a č u j í c r s e tím, ž e v ní používanou tělesnou tekutinou je krev.
  14. 17. Metoda podle nároku 10 v y z n a č u j i c í se tím, ž e je v ní množství imunokomplexu detekováno pomocí sekundární protilátky nebo jejího imunoreaktivního fragmentu, která se specificky váže na tento imunokomplex, a ve které je tato sekundární protilátka nebo její ’imunoreaktivní fragment značena zpravodajskou molekulou, která produkuje detekovatelný signál, který je měřen a koreluje s množstvím daného imunokomplexu. ,
    -10618. Metoda podle nároku 17vyznačující se tím, že v ní používanou sekundární protilátkou je protilátka, která se váže na epitop rozpoznávaný monoklonální protilátkou označenou 45J a produkovanou hybridomem ATCC HB 9740.
  15. 19. Metoda podle nároku 18vyznačující se tím, ž e v ní používanou sekundární protilátkou je monoklonální protilátka označená 45J a produkovaná hybridomem ATCC HB 9740--------------------------------------------------- ---------------------- -------
  16. 20. Souprava pro in'*vitro detekci'přítomnosti ;nebo množství polymerů rozpustného síťovaného fibrinu DesAABB a polymerů rozpustného nesíťovaného fibrinu DesAABB ve vzorku ze savce,, v y značující s e t í m, ž e zahrnuje:
    (a) měřená množství standardů obsahujících zmíněné polymery rozpustného síťovaného DesAABB fibrinu a polymery zmíněného rozpustného nesíťovaného DesAABB fibrinu;
    (b) prostředky pro vytvoření imunokomplexu s uvedenými polymery rozpustného síťovaného DesAABB fibrinu a polymery uvedeného rozpustného nesíťovaného DesAABB fibrinu, přičemž tyto prostředky zahrnují protilátku nebo její imunoreaktivní fragment, která se neváže specificky na: (i) fibrinogen, (ii) produkty degradace fibrinogenu, (iii) monomery DesAA. fibrinu, (iv) polymery DesAA fibrinu, (v) monomery DesAABB fibrinu, (vi) kovalentní fibrin, (vii) komplex monomer DesAA fibrinu-fibrinogen a (viii) produkty degradace fibrinu; a
    -107(c) prostředky pro detekci množství uvedeného imunokomplexu.
  17. 21. Souprava podle nároku 20 vyznačující se t i m, ž e v ní používaným prostředkem pro tvorbu imunokomplexu’ se zmíněnými polymery rozpustného síťovaného DesAABB fibrinu a zmíněného rozpustného nesíťovaného DesAABB fibrinu je protilátka nebo její imunoreaktivní fragment, která se specificky váže na epitop rozpoznávaný monoklonální protilátkou označenou MH1 a produkovanou hybridomem ATCC HB 9739.
  18. 22. Souprava podle nároku 21 vyznačující se ? t i m, z e v ní používaná protilátka je monoklonální protilátka / označená MH1 a produkovaná hybridomem ATCC HB 9739.
  19. 23. Souprava podle nároku 20 vyznačující se tím, že v ní používaným prostředkem pro detekci množství uvedeného imunokomplexu je sekundární protilátka nebo její * imunoreaktivní fragment značená zpravodajskou molekulou, která produkuje detekovatelný signál, který je měřen a který koreluje s množstvím uvedeného imunokomplexu.
  20. 24. Souprava podle nároku 23 vyznačující se t í m, ž e v ní používaná sekundární protilátka se specificky váže na epitop rozpoznávaný monoklonální protilátkou označenou 45J a produkovanou hybridomem ATCC HB 9740.
    -10825. Souprava podle nároku 24 vyznačující se t í m, ž e v ní používanou sekundární protilátkou je monoklonální protilátka označená 45J a produkovaná hybridomem ATCC HB 9740.
  21. 26. Souprava podle nároku 20 vyznačující še tím, že dále obsahuje kontrolní vzorek užitečný.při určování predispozice pro trombotickou příhodu, výskyt trombotické
    -----------příhody nebo přrsledovánrtrombotické-příhody u-savců;-------------------
CZ966A 1993-07-02 1994-06-22 Method and set for detecting in vitro the presence or quantity of polymers of dissolved cross-linked fibrin CZ696A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/086,423 US5453359A (en) 1988-06-13 1993-07-02 Immunoassay and kit for in vitro detection of soluble DesAABB fibrin polymers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ696A3 true CZ696A3 (en) 1996-07-17

Family

ID=22198474

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ966A CZ696A3 (en) 1993-07-02 1994-06-22 Method and set for detecting in vitro the presence or quantity of polymers of dissolved cross-linked fibrin

Country Status (18)

Country Link
US (7) US5453359A (cs)
EP (1) EP0706656A4 (cs)
JP (1) JPH08512136A (cs)
KR (1) KR100291368B1 (cs)
CN (1) CN1129984A (cs)
AU (1) AU688345B2 (cs)
BR (1) BR9406944A (cs)
CA (1) CA2166386A1 (cs)
CZ (1) CZ696A3 (cs)
FI (1) FI960006L (cs)
HU (1) HUT73804A (cs)
NO (1) NO955314L (cs)
NZ (1) NZ268785A (cs)
PL (1) PL178003B1 (cs)
RU (1) RU2173347C2 (cs)
SG (1) SG50674A1 (cs)
SK (1) SK596A3 (cs)
WO (1) WO1995001568A1 (cs)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5453359A (en) * 1988-06-13 1995-09-26 American Biogenetic Sciences, Inc. Immunoassay and kit for in vitro detection of soluble DesAABB fibrin polymers
DK0678524T3 (da) * 1993-11-02 2008-05-26 Mitsubishi Kagaku Iatron Inc Antistoffer mod oplöselig human fibrin, hybridom, der producerer dem, samt immunassayfremgangsmåde
EP0759762A4 (en) * 1994-05-02 1999-09-01 Squibb & Sons Inc RECOMBINANT FIBRIN CHAINS, FIBRIN AND FIBRIN APPROVED
US6991907B1 (en) * 1995-04-18 2006-01-31 Biosite, Inc. Methods for the assay of troponin I and T and complexes of troponin I and T and selection of antibodies for use in immunoassays
US6627404B1 (en) * 1995-04-18 2003-09-30 Biosite, Inc. Methods for improving the recovery of troponin I and T in membranes, filters and vessels
WO1996040986A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 American Biogenetic Sciences, Inc. Calibrator for use in a soluble fibrin assay
US5817768A (en) * 1995-06-07 1998-10-06 The New York Blood Center, Inc. Monospecific antibodies against a subunit of fibrinogen
JP3742675B2 (ja) * 1995-06-28 2006-02-08 東菱薬品工業株式会社 虚血−再灌流障害の予防および治療薬
AU6398596A (en) * 1995-06-30 1997-02-05 American Biogenetic Sciences, Inc. Method of producing fibrin-specific antibodies using soluble fibrin polymers as an immunogen
US6962981B1 (en) 1996-03-25 2005-11-08 Medarex, Inc. Monoclonal antibodies specific for the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen
US7381407B1 (en) * 1996-03-25 2008-06-03 Medarex, Inc. Monoclonal antibodies specific for the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen
US5840256A (en) * 1996-04-09 1998-11-24 David Sarnoff Research Center Inc. Plate for reaction system
EP0892672A4 (en) * 1996-04-09 2001-02-28 Sarnoff Corp PLATE FOR REACTION SYSTEM
US5938595A (en) * 1996-05-24 1999-08-17 The Regents Of The University Of California Fiber optic D dimer biosensor
KR100222292B1 (ko) * 1997-06-18 1999-10-01 허일섭 피브린 단량체를 이용한 혈액 응고 제 13인자의활성 측정방법
US6727102B1 (en) 1997-06-20 2004-04-27 Leuven Research & Development Vzw Assays, antibodies, and standards for detection of oxidized and MDA-modified low density lipoproteins
EP0922761B1 (en) * 1997-06-24 2009-02-18 Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. Monoclonal antibody specific to anti-human fibrin monomer, process for producing the same, hybridomas, and immunoassay method
PT1086138E (pt) 1998-06-12 2010-01-04 Genentech Inc Anticorpos monoclonais, anticorpos de reacção cruzada e método para produzir os mesmos
US6309888B1 (en) * 1998-09-04 2001-10-30 Leuven Research & Development Vzw Detection and determination of the stages of coronary artery disease
NZ518740A (en) 1999-11-08 2004-04-30 Univ Florida Marker detection method and apparatus to monitor drug compliance
FR2813395B1 (fr) * 2000-08-28 2003-01-24 Stago Diagnostica Methode de dosage in vitro de la fibrine soluble par generation de produits de degradation specifiques
US20020043389A1 (en) * 2000-09-29 2002-04-18 Selvarajan Murugan Virtual gate design for thin packages
US6981947B2 (en) * 2002-01-22 2006-01-03 University Of Florida Research Foundation, Inc. Method and apparatus for monitoring respiratory gases during anesthesia
US7104963B2 (en) * 2002-01-22 2006-09-12 University Of Florida Research Foundation, Inc. Method and apparatus for monitoring intravenous (IV) drug concentration using exhaled breath
US20050054942A1 (en) * 2002-01-22 2005-03-10 Melker Richard J. System and method for therapeutic drug monitoring
US20040203083A1 (en) * 2001-04-13 2004-10-14 Biosite, Inc. Use of thrombus precursor protein and monocyte chemoattractant protein as diagnostic and prognostic indicators in vascular diseases
US20040121350A1 (en) * 2002-12-24 2004-06-24 Biosite Incorporated System and method for identifying a panel of indicators
US7632647B2 (en) * 2001-04-13 2009-12-15 Biosite Incorporated Use of B-type natriuretic peptide as a prognostic indicator in acute coronary syndromes
US20030199000A1 (en) * 2001-08-20 2003-10-23 Valkirs Gunars E. Diagnostic markers of stroke and cerebral injury and methods of use thereof
US7713705B2 (en) * 2002-12-24 2010-05-11 Biosite, Inc. Markers for differential diagnosis and methods of use thereof
US20040253637A1 (en) * 2001-04-13 2004-12-16 Biosite Incorporated Markers for differential diagnosis and methods of use thereof
US20040176914A1 (en) * 2001-04-13 2004-09-09 Biosite Incorporated Methods and compositions for measuring biologically active natriuretic peptides and for improving their therapeutic potential
US7524635B2 (en) * 2003-04-17 2009-04-28 Biosite Incorporated Methods and compositions for measuring natriuretic peptides and uses thereof
EP1322957B1 (en) 2001-05-04 2009-08-12 Biosite Incorporated Diagnostic markers of acute coronary syndromes and methods of use thereof
US7052854B2 (en) 2001-05-23 2006-05-30 University Of Florida Research Foundation, Inc. Application of nanotechnology and sensor technologies for ex-vivo diagnostics
US7052468B2 (en) 2001-05-24 2006-05-30 University Of Florida Research Foundation, Inc. Method and apparatus for detecting environmental smoke exposure
US20040219509A1 (en) * 2001-08-20 2004-11-04 Biosite, Inc. Diagnostic markers of stroke and cerebral injury and methods of use thereof
US20040209307A1 (en) * 2001-08-20 2004-10-21 Biosite Incorporated Diagnostic markers of stroke and cerebral injury and methods of use thereof
US7608406B2 (en) * 2001-08-20 2009-10-27 Biosite, Inc. Diagnostic markers of stroke and cerebral injury and methods of use thereof
US20070167853A1 (en) 2002-01-22 2007-07-19 Melker Richard J System and method for monitoring health using exhaled breath
EP1485118A2 (en) * 2002-02-26 2004-12-15 Sangstat Medical Corporation Methods and compositions for treating gastrointestinal toxicity induced by cytoablative therapy
RU2296995C2 (ru) * 2003-06-20 2007-04-10 Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) Способ многопрофильного иммунохимического выявления антигенов в жидких образцах
JP2007518062A (ja) * 2003-09-29 2007-07-05 バイオサイト インコーポレイテッド 敗血症を診断する方法および診断するための組成物
RU2253474C1 (ru) * 2003-10-23 2005-06-10 Айсина Роза Бакировна Способ получения растворимого фибрин-мономера
US20050181451A1 (en) * 2004-02-12 2005-08-18 Bates Harold M. Detection of asymptomatic coronary artery disease using atherogenic proteins and acute phase reactants
US20080050832A1 (en) * 2004-12-23 2008-02-28 Buechler Kenneth F Methods and compositions for diagnosis and/or prognosis in systemic inflammatory response syndromes
JP4088328B2 (ja) * 2004-12-28 2008-05-21 第一化学薬品株式会社 抗ヒト可溶性フィブリンモノクローナル抗体及び当該抗体を用いる免疫学的測定方法
CA2598454C (en) * 2005-02-18 2013-04-09 Medarex, Inc. Monoclonal antibodies against prostate specific membrane antigen (psma) lacking in fucosyl residues
EP2005168A4 (en) * 2006-03-09 2009-05-20 Biosite Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIAGNOSING DISEASES OF AORTA
US20080118924A1 (en) * 2006-05-26 2008-05-22 Buechler Kenneth F Use of natriuretic peptides as diagnostic and prognostic indicators in vascular diseases
EP1870712A1 (en) * 2006-06-20 2007-12-26 Universität Bern Method for assaying a thrombotic event
US7914460B2 (en) 2006-08-15 2011-03-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Condensate glucose analyzer
US7740801B2 (en) * 2006-10-31 2010-06-22 Lifescan Scotland Limited System for determination of an analyte in a bodily fluid sample that includes an electroluminescent component
US7842472B2 (en) * 2006-11-14 2010-11-30 Alere International Methods and compositions for monitoring and risk prediction in cardiorenal syndrome
EP2095106B1 (en) * 2006-11-14 2013-03-20 Alere San Diego, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal artery stenosis
US20090004755A1 (en) * 2007-03-23 2009-01-01 Biosite, Incorporated Methods and compositions for diagnosis and/or prognosis in systemic inflammatory response syndromes
US8221995B2 (en) * 2007-03-23 2012-07-17 Seok-Won Lee Methods and compositions for diagnosis and/or prognosis in systemic inflammatory response syndromes
AU2012250924B2 (en) 2011-05-02 2017-05-25 Immunomedics, Inc. Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration
CA2847839A1 (en) * 2011-09-07 2013-03-14 Genway Biotech, Inc. Diagnostic assay to predict cardiovascular risk
US9754505B2 (en) 2012-03-29 2017-09-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for training staff in quality control
WO2013144215A1 (de) * 2012-03-29 2013-10-03 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur schulung von personal in der qualitätskontrolle
AU2013302696B9 (en) 2012-08-14 2018-08-09 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
CN107753954A (zh) 2012-12-13 2018-03-06 免疫医疗公司 功效改进且毒性降低的抗体与sn‑38的免疫缀合物的剂量
CN103954758A (zh) * 2014-05-15 2014-07-30 海南世济医学技术有限公司 一种用于纤维蛋白和纤维蛋白原及其降解产物的检测方法和试剂盒
CA3012985A1 (en) 2015-01-27 2016-08-04 Kardiatonos, Inc. Biomarkers of vascular disease
WO2020092531A1 (en) * 2018-10-30 2020-05-07 The Research Institute At Nationwide Children's Hospital Factor xiii immunoassay
EP3965885B1 (en) * 2019-05-09 2025-03-26 Truvian Sciences, Inc. Methods and compositions for reversing platelet clumping
WO2021062298A1 (en) 2019-09-27 2021-04-01 Arterez, Inc. Biomarker panel targeted to diseases due to multifactorial ontology of glycocalyx disruption
IL298245A (en) 2020-05-18 2023-01-01 Truvian Sciences Inc An optical assembly for continuous scanning and a method for using it
US12636859B2 (en) 2020-09-22 2026-05-26 Truvian Sciences, Inc. Methods for bonding plastics and components made by the same
USD1116151S1 (en) 2023-05-03 2026-03-03 Truvian Sciences, Inc. Monolayer
CN119798429B (zh) * 2025-01-22 2025-12-05 北京赛科希德科技股份有限公司 纤溶酶降解产物fdp抗体及其应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1362776A (en) * 1970-07-17 1974-08-07 Wellcome Found Immunological reagent
DE2532151C3 (de) * 1975-07-18 1979-06-13 Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt Antisenim zur quantitativen Bestimmung der Abbauprodukte des Fibrins und Fibrinogen« und Verfahren zu seiner Herstellung
US4036945A (en) * 1976-05-03 1977-07-19 The Massachusetts General Hospital Composition and method for determining the size and location of myocardial infarcts
US4421735A (en) * 1980-04-17 1983-12-20 The Massachusetts General Hospital Radiolabeled diagnostic compositions and method for making the same
US4355023A (en) * 1980-09-30 1982-10-19 The Massachusetts General Hospital Antibody fragment compositions and process
US4438209A (en) * 1981-07-17 1984-03-20 Mallinckrodt, Inc. Radioimmunoassay for fibrinopeptide A
US4550086A (en) * 1983-02-16 1985-10-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibodies that recognize human T cells
AU572125B2 (en) * 1983-03-17 1988-05-05 Mabco Limited Monoclonal antibodies with specificity for crosslinked fibrin and their diagnotic uses
US4722903A (en) * 1983-11-14 1988-02-02 New York Blood Center, Inc. Monoclonal antibodies specific to in vivo fragments derived from human fibrinogen, human fiberin I or human fibrin II
US4927916A (en) * 1984-04-23 1990-05-22 The General Hospital Corporation Method of producing fibrin-specific monoclonal antibodies lacking fibrinogen-cross-reactivity using fibrin-specific peptides
AU595173B2 (en) * 1985-01-08 1990-03-29 General Hospital Corporation, The Method and use for site-specific activation of substances
US5256413A (en) * 1985-01-08 1993-10-26 The General Hospital Corporation Method and use for site-specific activation of substances
NL8501682A (nl) * 1985-06-11 1987-01-02 Tno Nieuw, uit bloed geisoleerd eiwit, werkwijze ter bereiding van dit eiwit, antilichamen tegen het nieuwe eiwit en farmaceutische preparaten, die het eiwit of de antilichamen bevatten.
US4916070A (en) * 1986-04-14 1990-04-10 The General Hospital Corporation Fibrin-specific antibodies and method of screening for the antibodies
US5223410A (en) * 1988-06-13 1993-06-29 American Biogenetic Sciences, Inc. Method for production of antibodies utilizing an antigen-free animal
US5091512A (en) * 1988-06-13 1992-02-25 American Biogenetic Sciences, Inc. Fibrinogen-specific monoclonal antibody
US5453359A (en) * 1988-06-13 1995-09-26 American Biogenetic Sciences, Inc. Immunoassay and kit for in vitro detection of soluble DesAABB fibrin polymers
US5120834A (en) * 1988-06-13 1992-06-09 American Biogenetic Sciences, Inc. Fibrin-specific monoclonal antibody
IE67430B1 (en) * 1988-06-24 1996-04-03 Res Corp Technologies Inc Assay for soluble crosslinked fibrin polymers
SU1725123A1 (ru) * 1989-07-03 1992-04-07 Киевский Медицинский Институт Им.Акад.А.А.Богомольца Способ дифференциальной диагностики стабильной стенокардии и острого инфаркта миокарда
US5487892A (en) * 1994-02-24 1996-01-30 American Biogenetic Sciences, Inc. Method for treating thrombotic disease using a fibrin specific monoclonal antibody

Also Published As

Publication number Publication date
SG50674A1 (en) 1998-07-20
CA2166386A1 (en) 1995-01-12
EP0706656A4 (en) 1998-05-20
KR960703468A (ko) 1996-08-17
FI960006A0 (fi) 1996-01-02
NO955314D0 (no) 1995-12-27
WO1995001568A1 (en) 1995-01-12
AU688345B2 (en) 1998-03-12
AU7212294A (en) 1995-01-24
US5721122A (en) 1998-02-24
HU9503875D0 (en) 1996-02-28
RU2173347C2 (ru) 2001-09-10
CN1129984A (zh) 1996-08-28
HUT73804A (en) 1996-09-30
US5871737A (en) 1999-02-16
US6294173B1 (en) 2001-09-25
JPH08512136A (ja) 1996-12-17
US6187593B1 (en) 2001-02-13
KR100291368B1 (ko) 2002-02-01
US5723126A (en) 1998-03-03
PL312384A1 (en) 1996-04-15
US5843690A (en) 1998-12-01
US5453359A (en) 1995-09-26
NZ268785A (en) 1997-12-19
PL178003B1 (pl) 2000-02-29
NO955314L (no) 1996-02-20
BR9406944A (pt) 1996-08-06
FI960006A7 (fi) 1996-03-01
FI960006L (fi) 1996-03-01
EP0706656A1 (en) 1996-04-17
SK596A3 (en) 1996-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5843690A (en) Immunoassay and kit for in vitro detection of soluble DesAABB fibrin polymers
EP0413763B1 (en) Method for the production of monoclonal antibodies utilizing a germfree animal
JP3180082B2 (ja) 無菌動物を用いたモノクローナル抗体及びその利用
JPS62502964A (ja) 細胞表面抗原に対する抗体を有する活性化血小板の検出
PT1325033E (pt) Inibição da activação do complemento c5 para o tratamento e a prevenção da rejeição diferida de um xenoenxertos ou de uma rejeição vascular aguda
US5091512A (en) Fibrinogen-specific monoclonal antibody
US5223410A (en) Method for production of antibodies utilizing an antigen-free animal
Sheffield et al. Production and characterization of a monoclonal antibody against bovine haptoglobin and its use in an ELISA
CA1340013C (en) Method for the production of monoclonal antibodies utilizing a germfree animal
WO1996040986A1 (en) Calibrator for use in a soluble fibrin assay
KR0185295B1 (ko) 피브리노겐-특이적인 항체
Nevard Activation of coagulation in the childhood haemolytic uraemic syndrome
WO1997002291A1 (en) Method of producing fibrin-specific antibodies using soluble fibrin polymers as an immunogen

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic