PL178040B1 - Sposób wytwarzania ksylitolu i zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy - Google Patents

Abstract

1. Sposób w ytw arzania ksylitolu przez zrekom binowanego gospodarza p olegajacy na genetycznym m odyfikowaniu natywnego organizmu, prow a- dzeniu hodowli tego organizmu, oraz izolowaniu ksylitolu, znam ienny tym, ze (a) drobnoustrojow ego gospodarza produkujacego arabitol transform u- je sie DNA kodujacym dehydrogenaze D-arabitolu (EC 1 1 1 1 1) ew entual- nie DNA kodujacym dehydrogenaze ksylitolu (EC 1.1 19), (b) hoduje sie zrekom binow anego gospodarza z etapu (a) wykorzystujac jako zródlo w egla D -heksozy takie jak. glukoza, fruktoza, galaktoza, manno- za, lub ich mieszaniny, lub polimer lub oligomer zawierajacy ta k a D-heksoze, lub D -arabitol, etanol lub glicerol, uzyskujac jako produkt ksylitol, oraz (c) wydziela sie ksylitol wytworzony w etapie (b) 9 Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy zdolny do produkcji ksylitolu wykorzystujacy jako zródlo w egla D-heksozy takie jak glukoza, fruktoza, galaktoza, m annoza, lub ich mieszaniny, lub polimer lub oligomer zawierajacy takaD -heksoze, lub D-arabitol, etanol lub glicerol, transform o- wany DNA kodujacym dehydrogenaze D-arabitolu (EC 1 1 1.11 ) i ewentual- nie DNA kodujacym dehydrogenaze ksylitolu (EC 1119). 16. Sposób wytw arzania ksylitolu przez gospodarza drobnoustrojowego polegajacy na genetycznym modyfikowaniu natywnego organizmu, prow a- dzeniu hodowli tego organizmu, oraz izolowaniu ksylitolu, znam ienny tym , ze (a) hoduje sie drobnoustrojow ego gospodarza transform owanego genem kodujacym dehydrogenaze ksyhtolow a (EC 1 1 .1 9); dehydrogenaze D-glu- kozo-6-fosforanow a (EC 1 1.1 44), 3-epimeraze D-rybulozo-5-fosforanowa (EC 5 1.3 1) i/lub D -rybulokinaze (2 7 i 47), wykorzystujac jako zródlo w e- gla D-heksozy takie jak glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza. lub ich m ie- szaniny, lub polim er lub oligomer zawierajacy taka D-heksoze lub D-arabitol etanol lub glicerol, uzyskujac jako produkt ksylitol, oraz (b) wydziela sie ksylitol wytworzony w etapie (a). 20 Zrekom binow any gospodarz drobnoustrojowy zdolny do produkcji ksylitolu wykorzystujacy jako zródlo wegla D-heksozy takie jak glukoza, fruktoza, galaktoza, m annoza, lub ich m ieszaniny, albo polim er lub oligomer zawierajacy takaD -heksoze, albo etanol lub glicerol, transform owany genem kodujacym dehydrogenaze ksyhtolow a (EC 1 1. 1.9)„dehydrogenaze D-glu kozo-6-fosforanow a (EC 1 1 1 49), dehydrogenaze 6-fosfo-D-glukonianowa EC 1.1 1 44), D-rybulozo-5-fosforano-3-epim eraze (EC 5 13 1), i/lub D-ry - bulokinaze (EC 2 7 I 47) FIG. 1 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ksylitolu przez zrekombinowanego gospodarza na drodze genetycznego modyfikowania natywnego organizmu, prowadzenia hodowli tego organizmu, oraz izolowania ksylitolu, polegający na tym, że:

(a) drobnoustrojowego gospodarza produkującego arabitol transformuje się DNA kodującym dehydrogenazę D-arabitolu (EC 1.1.1.11) i ewentualnie DNA kodującym dehydrogenazę ksylitolu (EC 1.1.1. 9);

(b) hoduje się zrekombinowanego gospodarza z etapu (a) wykorzystując jako źródło węgla D-heksozy takie jak: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza lub ich mieszaniny, lub polimer lub oligomer zawierający takąD-heksozę, lub D-arabitol, etanol lub glicerol, uzyskując jako produkt ksylitol; oraz (c) wydziela się ksylitol wytworzony w etapie (b).

Korzystnie arabitol stanowi związek pośredni w wymienionej drodze przemian.

Również korzystnie, natywnego gospodarza stanowią drożdże wytwarzające arabitol lub grzyb wytwarzający arabitol.

W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazku w gospodarzu inaktywuje się aktywność D-ksylulokinazy (EC 2.7.1.17), i ewentualnie inaktywuje się aktywność transketolazy (EC 2.2.1.1) gospodarza.

Jeszcze bardziej korzystnie inaktywuje się aktywność trαnpketslazy (EC 2.2.1.1) i D-ksylulokinazy (EC 2.7.1.17) gospodarza.

Stosowane w sposobie według wynalazku drożdże wybrane sąz grupy obejmującej Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha, Torulopsis canaiaα, Pichia farinosa i Tozuloppsrα hansenii, a grzyby wybrane sąz grupy obejmującej Dendryohiella salina i Schizophyllum commune. Bardziej korzystnie jako drożdże stosuje się Zygosaccharomyces rouxii.

Przedmiotem wynalazku jest także zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy charakteryzujący się tym, żejest zdolny do produkcji ksylitolu wykorzystując jako źródło węgla D-heksozy takie jak: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza, lub ich mieszaniny, lub polimer lub oligomer zawierający takąD-heksozę, lub D-arabitol, etanol lub glicerol, transformowany DNA, kodujący dehydrogenazę D-arabitolu (EC 1.1.1.11) i ewentualnie DNA, . kodujący dehydrogena178 040 zę ksylitolu (EC 1.1.1.9). Korzystnie, w tak zrekombinowanym gospodarzu według wynalazku aktywność D-ksylulokinazy (EC 2.7.1.17), oraz ewentualnie aktywność transketolazy (EC 2.2.1.1) została zinaktywowana.

Najbardziej korzystnie gospodarz drobnoustrojowy według wynalazku charakteryzuje się tym, że aktywności D-ksylulokinazy (EC 2.7.1.17) i transketolazy (EC 2.2.1.1) zostały zinaktywowane.

Korzystnie zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy charakteryzuje się tym, że jako natywnego gospodarza drobnoustrojowego wykorzystuje się drożdże wytwarzające arabitol lub grzyb wytwarzający arabitol, a jeszcze bardziej korzystnie jest, gdy drożdże wybrane są z grupy obejmującej Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha, Torulopsis candida, Pichia farinosa i Torulospora hansenii, a grzyby wybrane są z grupy obejmującej Dendryphiella salina i Schizophyllum commune. Najbardziej korzystnie, drożdże stanowi Zygosaccharomyces rouxii.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania ksylitolu przez gospodarza drobnoustrojowego na drodze genetycznego modyfikowania natywnego organizmu, prowadzenia hodowli tego organizmu, oraz izolowania ksylitolu, charakteryzujący się tym, że (a) hoduje się drobnoustrojowego gospodarza transformowanego genem kodującym dehydrogenazę ksylitolową (EC 1.1.1.9); dyhydrogenezę D-glukozo-6-fosforanową (eC 1.1.1.44), 3-epimerazę D-rybulozo-5-fosforanową (EC 5.1.3.1) i/lub D-rybulokinazę (2.7.1.47), wykorzystując jako źródło węgla D-heksozy takie jak: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza, lub ich mieszaniny, lub polimer lub oligomer zawierający taką D-heksozę, lub D-arabitol, etanol lub glicerol, uzyskując jako produkt ksylitol; oraz (b) wydziela się ksylitol wytworzony w etapie (a). Korzystnie jako gospodarza drobnoustrojowego stosuje się gospodarza z inaktywowaną aktywnością transketolazy (EC 2.2.1.1), i ewentualnie z inaktywowaną aktywnością ksylulokinazy (EC 2.7.1.17). Jeszcze bardziej korzystnie jako gospodarza drobnoustrojowego stosuje się gospodarza transformowanego genem kodującym niespecyficzną fosfatazę katalizującą defosforylację D-ksylulozofosforanu do D-ksylulozy.

Następnym przedmiotem wynalazku jest także zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy zdolny do produkcji ksylitolu wykorzystując jako źródło węgla D-heksozy takie jak: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza, lub ich mieszaniny, albo polimer lub oligomer zawierający taką D-heksozę, albo etanol lub glicerol, transformowany genem kodującym dehydrogenazę ksylitolową (EC 1.1.1.9), dehydrogenazę D-glukozo-6-fosforanową (EC 1.1.1.49), dehydrogenazę 6-fosfo-D-glukonianową (EC 1.1.1.44), D-rybulozo-5-fosforano-3-epimerazę (EC 5.1.3.1), i/lub D-rybulokinazę (EC 2.7.1.47). W korzystnej odmianie wynalazku w zrekombinowanym gospodarzu drobnoustrojowym aktywność transketolazy (EC 2.2.1.1) została zinaktywowana, lub ewentualnie aktywności D-ksylulokinazy (EC 2.7.1.17) została zinaktywowana.

Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy korzystnie charakteryzuje się tym, że gospodarz ten jest transformowany genem kodującym niespecyficzną fosfatazę katalizującą defosforylację D-ksylulozofosforanu do D-ksylulozy.

W związku z tym wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania ksylitolu, zgodnie z którym przygotowuje się nowy i nieznany szczep drobnoustrojowy, zmodyfikowany metodami inżynierii genetycznej wytwarzający taki ksylitol albo de novo lub w zwiększonych ilościach w porównaniu z rodzimym drobnoustrojem nie zmodyfikowanymi metodami inżynierii genetycznej. Nowa droga przemian metabolicznych zostaje wbudowana metodami inżynierii genetycznej do drobnoustroju, w wyniku czego następuje wytwarzanie de novo lub w zwiększonych ilościach ksylitolu przez taki drobnoustrój. Nowa droga modyfikuje drogę biosyntezy i/lub metabolizmu D-arabitolu poprzez wydłużenie występującej wcześniej drogi biosyntezy D-arabitolu o dodatkowe etapy wykorzystania D-arabitolu, poprzez wprowadzenie i nadekspresję genów kodujących dehydrogenazę D-arabitolową wytwarzającą D-ksylulozę (EC 1.1.1.11) i dehydrogenazę ksylitolową (EC 1.1.1.9) do drobnoustroju wytwarzającego D-arabitol. Dzięki temu drobnoustrój wytwarza ksylitol w wyniku fermentacji źródeł węgla, które niemodyfikowany drobnoustrój wykorzystuje do biosyntezy D-arabitolu.

178 040

W korzystnej realizacji sposobu wedbig wynalazku aby zablokować drogę metaboliczną jest zużywana D-ksyloza w reakcji D-ksylokinazy i transketolazy inaktywuje się aktywność D-ksylulokinazy (EC 2.7.1.17) gospodarza, lub też inaktywuje się aktywność transketolazy (EC 2.2.1.1.) gospodarza.

Wynalazek dostarcza zatem sposób wytwarzania ksylitolu z wykorzystaniem nowych drobnoustrojów wspomnianych powyżej, przy czym zgodnie z tym sposobem wykorzystuje się powyższą zmodyfikowaną drogę biosyntezy D-arabitolu, która to droga została dodatkowo zmodyfikowana poprzez zdezaktywowanie w wyniku wywołanej chemicznie mutagenezy lub rozpadu genowego genu kodującego transketolazę (EC 2.2.1.1) lub genu kodującego D-ksylulokinazę (EC 2.7.1.17) w takich drobnoustrojach.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się drożdże wybrane z grupy obejmującej Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha, Torulopsis candida, Pichia farinosa i .Torulaspora hansenii, a grzyby wybrane z grupy obejmującej Dendryphiella salina i Schizophyllum commune. Szczególnie korzystnie jako drożdże stosuje się Zygosaccharomyces rouxii.

Dostarczane przez wynalazek komórki gospodarza są zdolne do wytwarzania ksylitolu, gdy hodowane sąna źródłach węgla innych niż D-ksyluloza lub D-ksyloza, oraz innych niż polimery lub oligomery albo ich mieszaniny. Źródła węgla wykorzystywane przez komórki gospodarze według wynalazku są tanie i łatwo dostępne. Drobnoustroje według wynalazku są również zdolne do wydzielania zsyntetyzowanego ksylitolu do hodowli. Cel ten osiąga się poprzez modyfikację metabolizmu pożądanego drobnoustroju, najczęściej występującego w przyrodzie drobnoustroju drożdżowego, w wyniku wprowadzenia i wywołania ekspresji pożądanych genów heterologicznych. Cel ten osiąga się również poprzez dalszą modyfikację metabolizmu takich pożądanych drobnoustrojów, tak aby wywołać nadekspresję i/lub zdezaktywować aktywność lub ekspresję pewnych genów homologicznych dla takich drobnoustrojów w stanie rodzimym.

W korzystnym zmodyfikowanym zrekombinowanym gospodarzu drobnoustrojowym według wynalazkujest zinaktywowana aktywność D-ksylulokinazy (EC 2..7.1.17), bądź też jest zinaktywowana aktywność transketolazy (EC 2.2.1.1.), lub też są zinaktywowane aktywności D-ksylulokinazy (EC 2.7.1.17) oraz transketolazy (EC 2.2.1.1).

Na fig. 1 przedstawiono mapę restrykcyjną insertu w plazmidzie pARL2. Jest to insert z locus chromosomowego Klebsiella terrigena Phpl, zawierający gen dehydrogenazy D-arabitolu K. terrigena. Otwarta ramka oznacza chromosomowy DNA K. terrigena. Strzałkami zaznaczono miejsce i kierunek genu dehydrogenazy D-arabitolowej (EC 1.1.1.11) w tym DNA.

Na fig. 2 przedstawiono konstrukcję pYARD z pADH i pAAH5. Na diagramach plazmidów linią pojedynczą(-) zaznaczono sekwencje bakteryjne; linią pofalowaną zaznaczono 2μΜ. DNA z S.cerevisiae; otwartą strzałką (=> ) zaznaczono promotor ADCI (gen ADCI kodujący dehydrogenazę alkoholową S. cerevisiae lub ADCI poprzednio oznaczany był jako AD HI); pustym rombem (0 ) zaznaczono terminator transkrypcyjny ADCI; blok prostokątny oznacza gen LEU2; a strzałką zakreskowaną zaznaczono gen dehydrogenazy D-arabitolowej.

Na fig. 3 przedstawiono konstrukcję plazmidu pJDB(AX)-16. XYL2 oznacza gen dehydrogenazy ksylitolowej z Pichia stipitis. dalD oznacza gen dehydrogenazy D-arabitolowej. ADCI oznacza obszar regulacji transkrypcyjnej (promotor) genu ADCI, poprzedzający sekwencję kodującą dalD i połączony z nią funkcjonalnie. Symbole nie majątego samego znaczenia co na fig. 4. Na diagramach plazmidu liniąpojedynczą(-) zaznaczono sekwencje bakteryjne i 2 pm. DNA, gdy to zaznaczono; zamkniętą strzałką oznaczono promotor ADC1; zaciemnionym rombem ( 0 ) zaznaczono terminator transkrypcyjny ADCI; blok prostokątny oznacza gen markera LEU2; strzałką zakreskowaną zaznaczono gen XYL2; a prostokąt zablokowany oznacza gen dalD.

Na fig. 4 przedstawiono konstrukcję wektora wrzecionowego pSRT(AX)-9 z E.coli-Z. Rouxii. Symbole mają to samo znaczenie co na fig. 3.

Na fig. 5 przedstawiono mapę restrykcyjną klonowanego fragmentu rDNA T. candida.

Na fig. 6 przedstawiono konstrukcję plazmidu pTC(AX)

Na fig. 7 przedstawiono mapę restrykcyjną klonowanego fragmentu rDNA T. candida.

Na fig. 7a przedstawiono konstrukcję plazmidu pCPU(AX).

178 040

Na fig. 8 przedstawiono klonowanie ZWF1 i genu gnd.

Na fig. 8a przedstawiono konstrukcję plazmidu PAAH(gnd).

Na fig. 9 przedstawiono konstrukcję plazmidu pSRT(ZG).

Na fig. 10 przedstawiono hodowlę szczepu Z. rouxii ATCC 13356 [pSRT(AX)-09] w fermentatorze.

Na fig. U przedstawiono hodowlę mutanta pochodzącego ze szczepu Z.rouxii ATCC 13356 [pSRT(AX)-09] w fermentatorze.

I. Definicje

W poniższym opisie powszechnie używa się szereg terminów wykorzystywanych w technologii zrekombinowanego DNA. Aby zapewnić klarowne i jednoznaczne zrozumienie opisu i zastrzeżeń, w tym również zakres tych terminów, poniżej podano odpowiednie definicje.

Źródło węgla inne niż ksyloza lub ksyluloza. W użytym znaczeniu określenie „źródło węgla inne niż ksyloza lub ksyluloza” oznacza substrat węglowy do wytwarzania ksylitolu inny niż D-ksyloza i D-ksyluloza, ich polimery lub oligomery albo ich mieszaniny (takie jak ksylan i hemiceluloza). Źródło węgla korzystnie podtrzymuje wzrost genetycznie zmodyfikowanych metodami inżynierii genetycznej drobnoustrojowych komórek gospodarzy według wynalazku, oraz fermentację w gospodarzach drożdżowych. Wiele tanich i łatwo dostępnych związków można zastosować jako źródło węgla do wytwarzania ksylitolu w drobnoustrojowych komórkach gospodarzach według wynalazku, w tym D-glukozę i różne syropy zawierające D-glukozę oraz mieszaniny D-glukozy z innymi cukrami. Określenie to obejmuje również inne cukry przyswajane przez gospodarzy według wynalazku translacji z uwagi na obecność translacyjnych kodonów stopu w sekwencji antysensownego RNA.

Określenie „komplementarny DNA” lub gen „cDNA” obejmuje zrekombinowane geny syntetyzowane np. w wyniku odwrotnej transkrypcji mRNA, w związku z czym nie zawierają one zakłócających sekwencji (intronów). Klony genowe z genomowego DNA będą zazwyczaj zawierać introny.

Nośnik klonowania. Plazmidowy lub fagowy DNA albo inna sekwencja DNA zdolna do przenoszenia informacji genetycznej, w szczególności DNA, w komórce gospodarzu. Nośnik klonowania często charakteryzuje się tym, że zawiera jedno lub niewielką liczbę miejsc rozpoznawania przez endonukleazę, w których takie sekwencje DNA mogą być rozcinane w ustalony sposób bez utraty zasadniczej funkcji biologicznej nośnika i do których można włączać wymagane DNA w tym celu, aby wywołać jego klonowanie w komórce gospodarzu. Nośnik klonowania może ponadto zawierać marker przydatny do wykorzystania przy identyfikacji komórek transformowanych nośnikiem klonowania, oraz źródła replikacji, które umożliwiająutrzymanie i replikację nośnika w jednym lub więcej gospodarzach prokariotycznych lub eukariotycznych. Markery dotyczą np. oporności na tetracyklinę lub oporności na ampicylinę. Określenie „wektor” używa się czasami zamiast „nośnika klonowania”. „Plazmid” jest nośnikiem klonowania, zazwyczaj kołowego DNA, który utrzymywany jest i ulega autonomicznie replikacji w co najmniej jednej komórce gospodarzu.

Nośnik ekspresji.. Nośnik lub wektor zbliżony do nośnika klonowania, ale który podtrzymuje ekspresję genu, w którym został on sklonowany, po przetransformowaniu do gospodarza. Klonowany gen zazwyczaj umieszcza się pod kontrolą (to znaczy w połączeniu funkcjonalnym) pewnych sekwencji kontrolnych takich jak sekwencje promotorowe, które mogą być dostarczane przez nośnik lub przez zrekombinowaną konstrukcję klonowanego genu. Sekwencje kontrolujące ekspresję będą zmieniać się w zależności od tego czy wektor przeznaczony do tego, by wytwarzać w wyniku ekspresji gen połączony funkcjonalnie w gospodarzu prokariotycznym czy w eukariotycznym, a ponadto mogą zawierać elementy transkrypcyjne takie jak elementy wzmacniacza ( w górę od sekwencji aktywacji) oraz sekwencje zakończania i/lub miejsca inicjowania i zakończania translacji.

Gospodarz. Gospodarzem jest komórka, prokariotyczna lub eukariotyczna, która wykorzystywana jest jako odbiorca lub nośnik zrekombinowanego materiału.

178 040

Gospodarz według wynalazku. „Gospodarz według wynalazku” jest gospodarzem drobnoustrojowym, który z natury nie wytwarza w znacznych ilościach ksylitolu w czasie fermentacji, ze znanych źródeł węgla innych niż D-ksyloza i D-ksyluloza, ich polimery lub oligomery lub mieszaniny, ale został zmodyfikowany metodami inżynierii genetycznej, aby mógł go wytwarzać, zgodnie ze sposobami według wynalazku. „Znaczna ilość” oznacza ilość umożliwiającą wydzielanie ksylitolu w postaci czystej lub ilość, którą można łatwo zmierzyć technikami analitycznymi zazwyczaj wykorzystywanymi w analizie węglowodanów w drobnoustrojowym bulionie fermentacyjnym.

Dehydrogenaza arabitolowa. Znane są dwa typy dehydrogenaz D-arabitolowych: wytwarzająca D-ksylulozę (EC 1.1.11) oraz wytwarzająca D-rybozę. Dehydrogenazy wytwarzające D-rybozę znaleziono w dzikich drożdżach i grzybach. Dehydrogenazy arabitolowe wytwarzające D-ksylulozę zostały znalezione jedynie w bakteriach. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie wzmianki i odsyłacze w opisie dotyczące dehydrogenazy arabitolowej odnoszą się do dehydrogenazy arabitolowej wytwarzającej D-ksylulozę.

Gałąź utleniająca drogipentoza-fosforan. Określenie „gałąź utleniająca drogi pentoza-fosforan” obejmuje tą część bocznika pentoza-fosforan, która katalizuje reakcje utleniania, takie jak reakcje katalizowane przez dehydrogenazę 6-fosforanu D-glukozy (EC 1.1.1.49) i/lub dehydrogenazę 6-fosfo-D-glukonianu (EC 1.1.1.44), w których wykorzystywane są substraty heksozowe i powstają fosforany pentoz. „Nie utleniająca” część drogi pentoza-fosforan (która również katalizuje bezpośrednie powstawanie rybozy z D-glukozy) charakteryzuje się nieutleniającymi izomeryzacjami takimi jak reakcje katalizowane przez izomerazę 5-fosforanu rybozy, D-rybulozo-5-fosforano-3-epimerazę i transaldolazę. Patrz Biological Chemistry, R.H. Mahler i i E. H. Cordes, Harper & Row, wydawcy, New York, 1966, str. 448-454.

Pochodnefunkcyjne. „funkcyjnąpochodną” białka lub kwasu nukleinowego jest cząsteczka stanowiąca chemiczną lub biochemiczną pochodną otrzymaną z tego białka lub kwasu nukleinowego, która zachowuje biologiczną aktywność (funkcyjną lub strukturalną), którą charakteryzuje się rodzime białko lub kwas nukleinowy. Określenie „funkcyjna pochodna” obejmuje również „fragmenty”, „warianty”, „analogi” lub „pochodne chemiczne” cząsteczki, które zachowują pożądaną aktywność cząsteczki rodzimej.

W opisie cząsteczkę określa się jako „chemicznąpochodną” innej cząsteczki, gdy zawiera ona dodatkowe grupy chemiczne nie stanowiące normalnie części cząsteczki. Grupy takie mogą zwiększać rozpuszczalność, absorpcję, okres biologicznego półtrwania cząsteczki itp. Grupy mogą zmniejszać toksyczność cząsteczki, eliminować lub osłabiać niepożądane działanie uboczne cząsteczki itp. Grupy zdolne do wywierania takich efektów opisane są w Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980). Procedury sprzęgania takich grup z cząsteczką są dobrze znane.

Fragment. „Fragment” cząsteczki takiej jak białko lub kwas nukleinowy oznacza część rodzimej genetycznej sekwencji aminokwasów lub nukleotydów, a zwłaszcza funkcyjne pochodne według wynalazku.

Wariant lub analog;. „Wariant” lub „analog” białka lub kwasu nukleinowego oznacza cząsteczkę zasadniczo podobną strukturalnie lub pod względem aktywności biologicznej do cząsteczki rodzimej, takąjak cząsteczka kodowana przez allel funkcyjny.

II. Konstrukcja dróg przemian metabolicznych dla biosyntezy ksylitolu

Według wynalazku przeprowadza się taką manipulację dróg przemian metabolicznych drobnoustrojowego gospodarza, aby osłabić lub wyeliminować wykorzystanie węgla w innych celach niż wytwarzanie ksylitolu. Wszyscy tacy gospodarze wytwarzająksylitol w jednym etapie fermentacji. W jednym wykonaniu gospodarze według wynalazku mogą wykazywać aktywność dehydrogenazy ksylitolowej (EC 1.1.1.9) w stopniu wystarczającym do wytwarzania ksylitolu. Jednakże, jak to opisano poniżej, w tych gospodarzach, w których pożądana jest nadprodukcja dehydrogenazy ksylitolowej, zrekombinowane geny kodujące dehydrogenazę ksylitolowąmogą być transformowane do komórek gospodarzy’.

W praktycznej realizacji wynalazku gospodarze według wynalazku charakteryzują się zdolnością do syntetyzowania ksylitolu ze strukturalnie niezbyt podobnych źródeł węgla takich

178 040 jak D-glukoza, a nie po prostu z D-ksylozy i/lub D-ksylulozy. Gospodarze według wynalazku są również zdolni do wydalania zsyntetyzowanego ksylitolu do ośrodka.

W szczególności w przykładowych i korzystnych wykonaniach gospodarze według wynalazku charakteryzują się występowaniem jednej z dwóch dróg przemian. Po pierwsze występowaniem drogi przemiany, w której arabitol stanowi związek pośredni przy wytwarzaniu ksylitolu, a po drugie występowaniem drogi przemiany, w której do wytwarzania ksylitolu wykorzystuje się 5-fosforan ksylulozy w wyniku reakcji odfosforylowania i redukcji. W związku z tym gospodarze według wynalazku charakteryzuj a się co najmniej jedną z następujących modyfikacji genetycznych:

(1) wykonane zostało klonowanie genu kodującego białko wykazujące aktywność dehydrogenazy D-arabitolowej wytwarzającej D-ksylulozę (EC 1.1.1.11), dzięki czemu uzyskuje się konwersję D-arabitolu do D-ksylulozy (cecha drogi przemiany I); i/lub (2) natywny gen gospodarza kodujący aktywność transketolazową został zdezaktywowany (cecha drogi przemiany II).

Dodatkowo wykonać można szereg innych modyfikacji gospodarza, tak aby zwiększyć jego zdolność do wytwarzania ksylitolu. Tak np. gospodarzy opisanych w (1) i (2) można dodatkowo zmodyfikować tak, że:

(3) przeprowadzone zostało klonowanie w gospodarzu genu kodującego białko wykazujące aktywność dehydrogenazy ksylitolowej (EC 1.1.1.9);

(3) natywny gen gospodarza kodujący D-ksylulokinazę (EC 2.7.1.17) został zdezaktywowany;

(4) przeprowadzone zostało klonowanie w gospodarzu genu kodującego białko wykazujące aktywność dehydrogenazy 6-fosforanu D-glukozy (EC 1.1.1.49);

(4) przeprowadzone zostało klonowanie w gospodarzu genu kodującego białko wykazujące aktywność dehydrogenazy 6-fosfo-D-glukonianowej (EC 1.1.1.44); oraz (5) przeprowadzone zostało klonowanie w gospodarzu genu kodującego białko wykazujące aktywność D-rybulozo -5-fosforano-3-epimerazy (EC 5.1.3.1).

W korzystnym wykonaniu gospodarze według wynalazku wykazują więcej niż jednąz wyżej podanych modyfikacji genetycznych. Tak np. w korzystnym wykonaniu według wynalazku węgiel przechodzi z D-arabitolu „bezpośrednio do” (to znaczy w jednym etapie) D-ksylulozy i z D-ksylulozy „bezpośrednio do” ksylitolu. W związku z tym w takim wykonaniu gospodarz według wynalazku został tak zmodyfikowany, że zostało w nim wykonane klonowanie genu kodującego białko wykazujące aktywność dehydrogenazy D-arabitolowej wytwarzającej D-ksylulozę oraz gen kodujący dehydrogenazę ksylitolową (EC 1.1.1.9). Należy podkreślić, że jakkolwiek w wielu rozwiązaniach D-arabitol jest wewnętrznie syntetyzowany z innych źródeł węgla przez gospodarzy według wynalazku, to może on być również dodany z zewnątrz bezpośrednio do pożywki.

W innym korzystnym wykonaniu droga biosyntezy ksylitolu nie obejmuje arabitolu jako związku pośredniego. Następuje raczej przechodzenie węgla z 5-fosforanu D-ksylulozy do D-ksylulozy i dalej do ksylitolu. Gdy D-glukozę stosuje się jako źródło węgla, węgiel może przechodzić przez część utleniającą drogi przemiany pentoza-fosforan, z D-glukozy poprzez 6-fosforan D-glukozy i 6-fosfo-D-glukonian do 5-fosforanu D-rybulozy. Fosforan D-rybulozy może następnie ulegać epimeryzacji do 5-fosforany D-ksylulozy, odfosforylowaniu do D-ksylulozy i redukcji do ksylitolu. W związku z tym gospodarz według wynalazku stosowany w takim wykonaniu powinien stanowić gospodarz, w którym:

(a1) przeprowadzone zostało klonowanie w gospodarzu genu kodującego białko wykazujące aktywność dehydrogenazy 6-fosforanu D-glukozy (EC 1.1.1.49) lub gen natywny gospodarza ulega nadekspresji; i/lub (a2) przeprowadzone zostało klonowanie w gospodarzu genu kodującego białko wykazujące aktywność dehydrogenazy 6-fosfo-D-glukonianowej (EC 1.1.1.44) lub gen natywny gospodarza ulega nadekspresji; i/lub

178 040 (a3) przeprowadzone zostało klonowanie w gospodarzu genu kodującego białko wykazujące aktywność D-rybulozo-5-fosforano-3-epimerazy lub gen natywny gospodarza ulega nadekspresji; i/lub (a4) przeprowadzone zostało klonowanie w gospodarzu genu kodującego białko wykazujące aktywność dehydrogenazy ksylitolowej (EC 1.1.1.9) lub gen natywny gospodarza ulega nadekspresji; i/lub (b) natywny gen transketolazy został zdezaktywowany; i/lub (c) natywny gen gospodarza kodujący aktywność ksylulokinazy (EC 2.7.1.17) został zdezaktywowany.

Etap odfosforylowania (konwersja fosforanu D-ksylulozy do D-ksylulozy) jest jednym etapem katalizowanym przez enzym, który nie został scharakteryzowany w postaci czystej. Jednakże wykazano, że aktywność enzymatyczna odpowiedzialna za podobny etap (konwersja 5-fosforany D-rybulozy do D-rybulozy) w natywnej drodze wytwarzania D-arabitolu przez drożdże osmofilowe jest niespecyficzna i zdolna jest również do katalizowania safosfórylswαnia 5-fosforany D-ksylulozy (J.M.Ingram i W. A. Wood, J. Bacteriol. 89:1186-1194 (1965)). Mutacja transketolazy i nadekspresja dwóch dehydrogenaz utleniającej drogi przemiany pentoza-fosforan służy dwóm celom. Po pierwsze mogą one zwiększyć wydajność drogi przemiany I zwiększając ilość 5-fosforanu rybulozy w komórce i w konsekwencji wytwarzanie arabitolu i ksylitolu. Po drugie w wyniku tej samej kombinacji modyfikacji może wystąpić nadmierne nagromadzenie się 5-fssforany ksylulozy, niezbędne do zajścia drogi przemiany II.

Z tego względu sposoby z wykorzystaniem występującej w przyrodzie drogi przemiany prowadzącej do powstawania D-arabitolu z różnych źródeł węgla i przedłużenie tej drogi o dwie reakcje w celu przekształcenia D-arabitolu w ksylitol nie stanowiiąjedynej możliwej drogi przemiany objętej zakresem wynalazku. Skonstruować można inne drogi przemiany prowadzące do ksylitolu jako końcowego produktu metabolicznego, nie obejmujące D-arabitolu jako związku pośredniego. I tak drogę przemiany do ksylitolu z 5-fosfsrαnu D-rybulozy można zrealizować na drodze więcej niż jednego łańcucha reakcji. 5-fosfsrαn D-rybulozy może zostać wydajnie przekształcony w 5-fssfsran D-ksylulozy przez D-rybulszo-5-fssfsrano-3-epimerazę, a jeśli dalszej konwersji 5-fosfsrany D-ksylulozy zapobiegnie się w wyniku mutacji w genie transketolazy, to nagromadzony 5-fosforan D-ksylulozy może zostać odfosforylowany przez tą samą niespecyficzną fosfatazę co ó-fosforan D-rybulozy (J.M. Ingram i inni, J. Bacteriol. 89:1186-1194(1965)) oraz zredukowany do ksylitolu przez dehydrogenazę ksylitolową. Realizacja takiej drogi przemiany może dodatkowo wymagać dezaktywacji genu D-ksylulokinazy, aby zminimalizować straty energii spowodowane jałową pętlą 5-fosforan D-ksylulozy -> D-ksyluloza 5-fosfsrαn D-ksylulozy. Dodatkowa zmiana genetyczna - wprowadzenie i (nad)ekspresja genu D-rybulokinazy (EC 2.7.1.47) może zminimalizować równoczesne wytwarzanie D-arabitolu przez takie szczepy wiążąc D-rybulozę wytworzoną przez niespecyficzną fosfatazę. D-rybuloza może zostać z powrotem przekształcona w fosforan D-rybulozy, a następnie w 5-fosforan D-ksylulozy.

III. Konstrukcja gospodarzy według wynalazku

Metoda wytwarzania metodami inżynierii genetycznej gospodarzy według wynalazku jest ułatwiona w wyniku wydzielania i częściowego sekwencjonswania czystego białka kodującego interesujący enzym lub klonowania sekwencji genetycznych zdolnych do kodowania takiego białka z wykorzystaniem technologii łańcuchowych reakcji polimerazowych; oraz w wyniku ekspresji takich sekwencji genetycznych. W użytym znaczeniu określenie „sekwencje genetyczne” odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego (korzystnie DNA). Sekwencje genetyczne zdolne do kodowania białka pochodzą z różnych źródeł. Do źródeł tych należy genomowy DNA, cDNA, syntetyczny DNA i ich kombinacje. Korzystnym źródłem genomowego DNA jest genomowa biblioteka drożdży. Korzystnym źródłem cDNA jest biblioteka cDNA wytworzona z mRNA drożdży hodowanych w warunkach znanych z tego, że indukują ekspresję pożądanego mRNA lub białka.

178 040 cDNA według wynalazku nie obejmuje występujących w naturze intronów, jeśli cDNA został wytworzony z wykorzystaniem dojrzałego mRNA jako matrycy. Genomowy DNA według wynalazku może, lecz nie musi obejmować występujące w naturze introny. Ponadto uzyskać można taki genomowy DNA zasocjowany z obszarem 5' promotora sekwencji genomowych i/lub z obszarem 3'terminacji transkrypcyjnej. Ponadto uzyskać można taki genomowy DNA w asocjacji z sekwencjami genetycznymi, które kodująnietranslatowany obszar 5' mRNA i/lub z sekwencjami genetycznymi, które kodują nietranslatowany obszar 3'. W takim stopniu, aby komórka gospodarz mogła rozpoznawać transkrypcyjne i/lub translacyjne sygnały regulatorowe związane z ekspresją mRNA i białka, nietranslatowane obszary 5' i/lub 3' obszary natywnego genu i/lub nietranslatowane obszary 5' i/lub 3' mRNA można zachować i wykorzystać w regulacji transkrypcyjnej i translacyjnej. Genomowy DNA można wydzielić z komórki dowolnego gospodarza, zwłaszcza z gospodarza drożdżowego, a następnie oczyścić go, dobrze znanymi sposobami (patrz np. Guide to Molecular Cloning Techiques, S.L. Berger i inni, red., Academic Press (1987)). Korzystnie stosowany preparat mRNA będzie wzbogacony w mRNA kodujący pożądane białko, w sposób naturalny, w wyniku wydzielenia z komórek wytwarzających duże ilości białka, albo in vitro, technikami powszechnie stosowanymi do wzbogacania preparatów mRNA w specyficzne sekwencje, takimi jak wirowanie z gradientem sacharozy, albo też obydwoma technikami.

W przypadku klonowania w wektorze takie odpowiednie preparaty DNA (genomowego DNA lub cDNA) przypadkowo rozciera się lub rozszczepia enzymatycznie i liguje się z odpowiednimi wektorami uzyskując bibliotekę zrekombinowanego genu (genomową lub cDNA).

Sekwencję DNA kodującąpożądane białko lub jej funkcyjne pochodne wstawić można do wektora DNA znanymi technikami obejmującymi tworzenie końcówek z tępymi końcami i ze skośnymi końcami do ligowania, trawienie enzymem restrykcyjnym w celu uzyskania odpowiednich końcówek, odpowiednie wypełnianie lepkich końców, obróbkę fosfatazą alkaliczną w celu uniknięcia niepożądanych połączeń oraz ligowanie z odpowiednimi ligazami. Techniki takich manipulacji opisane sąprzez T. Maniatisa (T. Maniatis i inni, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, II wyd., 1988) i są dobrze znane.

Biblioteki zawierające sekwencje kodujące pożądany gen można poddać selekcjonowaniu i sekwencję pożądanego genu zidentyfikować dowolnym sposobem specyficznie wybierającym sekwencję kodującątaki gen lub białko, takimjak np. a) hybrydyzacja z odpowiedniąsondą(sondami) kwasu nukleinowego, które zawierają sekwencję specyficzną względem DNA tego białka, B) analiza translacyjna wybrana na podstawie hybrydyzacji, w której przeprowadza się translację in vitro natywnego mRNA hybrydyzującego z danym klonem, po czym dokładniej charakteryzuje się produkty translacji, albo c) w przypadku gdy klonowane sekwencje genetyczne są same zdolne do ekspresji mRNA, przeprowadza się immunoprecypirację produktu translacji białka wytworzonego przez gospodarza zawierającego klon.

Sondy oligonukleotydowe specyficzne względem określonego białka, które można wykorzystać do identyfikacji klonów tego białka można zaprojektować na podstawie znajomości sekwencji kwasów nukleinowych w DNA kodującym takie białko lub białko pokrewne. Alternatywnie wyhodować można przeciwciała przeciw oczyszczonym formom białka i zastosować je do identyfikacji obecności unikatowych determinantów białkowych w transformantach, które wytwarzają w wyniku ekspresji pożądane klonowane białko. Sekwencję reszt aminokwasów w peptydzie określa się stosując ich powszechnie wykorzystywane trzyliterowe oznaczenia lub ich oznaczeniajednoliterowe. Zestawienie takich trzyliterowych i jednoliterowych oznaczeń można znaleźć w podręcznikach takich jak Biochemistry, A. Lehninger, Worth Publishers, New York NY, (1970). Gdy sekwencję aminokwasów przedstawia się poziomo, to o ile nie zaznaczono tego inaczej, koniec aminowy znajduje się na lewym końcu, a koniec karboksylowy znajduje się na prawym końcu. Podobnie, o ile nie zaznaczono inaczej, w sekwencji kwasów nukleinowych koniec 5' znajduje się z lewej strony.

Z uwagi na to, że kod genetyczny jest wieloznaczny, więcej niż jeden kodon można wykorzystać do kodowania określonego aminokwasu (J.D. Watson, w: Molecular Biology od the Gene, 3 wyd., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Ca(1977), str. 356-357). Fragmenty peptydu

178 040 analizuje się w celu zidentyfikowania sekwencji aminokwasów, które mogą być kodowane przez oligonukleotydy o najniższym stopniu wieloznaczności.

Korzystnie towarzyszy temu identyfikacja sekwencji, które zawierają aminokwasy kodowane tylko przez jeden kodon.

Jakkolwiek przypadkowo sekwencja aminokwasów może być kodowana tylko przez pojedynczą sekwencję oligonukleotydową, to często sekwencja aminokwasów może być kodowana przez dowolną z zestawu podobnych oligonukleotydów. Ważne jest jednak to, że jakkolwiek wszystkie elementy takiego zestawu zawierająsekwencję oligonukleotydową, które sązdolne do kodowania tego samego fragmentu peptydu i w związku z tym potencjalnie zawierają taką samą sekwencję oligonukleotydowąjak gen, który koduje fragment peptydu, to jednak tylko jeden element w zestawie zawiera sekwencję nukleotydów identycznąz sekwencją genu kodującą egzon. Ponieważ element ten znajduje się w tym zestawie i jest zdolny do hybrydyzacji z DNA nawet w obecności innych elementów zestawu, można zastosować niefrakcjonowany zestaw oligonukleotydów w taki sam sposób, jak stosuje się jeden oligonukleotyd, do klonowania genu kodującego peptyd.

Wykorzystując kod genetyczny zidentyfikować możnajeden lub więcej oligonukleotydów na podstawie sekwencji aminokwasów, przy czym każdy z nich może być zdolny do kodowania pożądanego białka. Prawdopodobieństwo, że określony oligonukleotyd będzie rzeczywiście zawierał odpowiednią sekwencję kodującąbiałko, można oszacować biorąc pod uwagę zależności nienormalnego parowania zasad oraz częstotliwość, z jaką określony kodon jest rzeczywiście wykorzystywany (do kodowania określonego aminokwasu) w komórkach eukariotycznych. Wykorzystując „zasady wykorzystywania kodonów” identyfikuje się pojedynczą sekwencję oligonukleotydową lub zestaw sekwencji oligonukleotydowych, który zawiera teoretycznie „najbardziej prawdopodobną” sekwencję niezdolną do kodowania sekwencji białkowych.

Odpowiedni oligonukleotyd lub zestaw oligonukleotydów zdolny do kodowania fragmentu pewnego genu (albo komplementarny z takim oligonukleotydem lub zestawem oligonukleotydów) można zsyntetyzować powszechnie znanymi sposobami (patrz np. Synthesis and Application of DNAandRNA, S.A. Narang,red., 1987, Academic Press, San Diego, CA) i zastosować jako sondę do identyfikacji i wydzielania klonu takiego genu, z wykorzystaniem znanych technik. Sposoby hybrydyzacji kwasu nukleinowego i identyfikacji klonu opisane sąprzez T. Maniatisa i innych w Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982) oraz przez B.D. Hamesa i innych w Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)). Te elementy opisanej powyżej biblioteki genów, których zdolność do takiej hybrydyzacji została potwierdzona, analizuje się następnie w celu ustalenia długości i charakteru zawartych w nich sekwencji kodujących.

Aby ułatwić wykrywanie pożądanej sekwencji kodującej DNA opisaną powyżej sondę DNA znakuje się możliwą do wykrycia grupą. Taką wykrywalną grupę może stanowić dowolny materiał o wykrywalnych właściwościach fizycznych lub chemicznych. Materiały takie są dobrze znane w technikach hybrydyzacji kwasów nukleinowych, tak że zasadniczo większość znaczników stosowanych w takich metodach zastosować można w sposobie według wynalazku. Szczególnie przydatne są znaczniki radioaktywne takie jak ³²P, ³H, ^l4C, ³⁵S, ^,25I itp. Zastosować można dowolny znacznik radioaktywny dający wymagany sygnał i wykazujący odpowiedni okres półtrwania. Jeśli oligonukleotyd jest jednoniciowy, to można go znaczyć radioaktywnie wykorzystując reakcję kinazy. Jako sondy hybrydyzacji kwasów nukleinowych przydatne mogą być również polinukleotydy znaczone nieradioaktywnym markerem takim jak biotyna, enzym lub grupa fluorescencyjna. W związku z tym ustalenie częściowej sekwencji białka umożliwia identyfikację teoretycznie „najbardziej prawdopodobnej” sekwencji DNA lub zestawu takich sekwencji, zdolnych do kodowania takiego peptydu. Konstruując oligonukleotyd komplementarny z taką teoretyczną sekwencją (lub konstruując zestaw oligonukleotydów komplementarnych z takim zestawem „ najbardziej prawdopodobnych” oligonukleotydów) uzyskuje się cząsteczkę DNA (lub zestaw cząsteczek DNA), zdolnych do działania jako sonda (sondy) do identyfikacji i wydzielania klonów zawierających gen.

178 040

W alternatywnym sposobie klonowania genu wytwarza się bibliotekę stosując wektor ekspresji w wyniku klonowania DNA lub, jeszcze korzystniej, cDNA uzyskanego z komórki zdolnej do ekspresji białka, w wektorze ekspresji. Bibliotekę selekcjonuje się następnie w celu wyodrębnienia elementów wytwarzających w wyniku ekspresji pożądane białko, np. selekcjonując bibliotekę za pomocą przeciwciał białka.

Powyższymi sposobami można w związku z tym zidentyfikować sekwencje genetyczne zdolne do kodowania białka albo biologicznie czynnych lub antygenowych fragmentów tego białka. W celu dokładniejszego scharakteryzowania takich sekwencji genetycznych oraz w celu wytworzenia zrekombinowanego białka pożądane jest wykonanie ekspresji białek, które kodują te sekwencje. Ekspresja taka identyfikuje te klony, które wytwarzają w wyniku ekspresji białka wykazujące charakterystykę białka pożądanego. Do takich charakterystyk może należeć między innymi zdolność do specyficznego wiązania przeciwciała, zdolność do inicjowania wytwarzania przeciwciała, które jest zdolne do wiązania się z natywnym, niezrekombinowanym białkiem, zdolność do nadawania aktywności enzymatycznej komórce, będącej właściwością białka, oraz zdolność do nadawania nieenzymatycznego (ale specyficznego) działania komórce biorczej.

Sekwencję DNA można skrócić znanymi sposobami w celu wydzielenia pożądanego genu z obszaru chromosomowego, który zawiera więcej informacji, niż to jest konieczne przy zastosowaniu tego genu w gospodarzach według wynalazku. Tak np. wykorzystać można trawienie restrykcyjne w celu rozszczepienia sekwencji o pełnej długości w wymaganym miejscu. Alternatywnie lub dodatkowo zastosować można nukleazy, które odszczepiają od końca 3' cząsteczki dNa, w celu strawienia pewnej sekwencji i uzyskania skróconej formy, przy czym sekwencję o wymaganej długości identyfikuje się i oczyszcza metodami elektroforezy żelowej i sekwencjonowania DNA. Do takich nukleaz należy np. egzonukleaza III i Bal 31. Inne nukleazy są dobrze znane.

W praktycznej realizacji wynalazku jako model zastosowano drożdże osmofilowe Z. rouxii. Z. rouxii można zastosować przy wytwarzaniu środków spożywczych, gdyż są one tradycyjnie stosowane w Japonii do wytwarzania sosu sojowego. Drożdże zostały np. opisane w publikacji The Yeast, A Taxonomic Study, Kreger-van Rijn (red.), Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1984, w której drożdże te opisano na stronach 462-465. Inne drożdże wytwarzające D-arabitol, takie jak Candida polymorpha, Torulopsis candida, Candida tropicalis, Pichia farinosa, Torulospora hansenii itp., a także grzyby wytwarzające D-arabitol, takie jak Dendryphiella salina lub Schizophyllum commune, można także zastosować jako organizmy - gospodarze w sposobie według wynalazku.

Wiadomo, że enzymy utleniające D-arabitol do D-ksylulozy (C 1.1.1.11) występują w bakteriach, a nie występują w drożdżach i grzybach. W związku z tym Klebsiella terrigena stanowi korzystne źródło genu dehydrogenazy D-arabitolowej (wytwarzającej D-ksylulozę), gdyż jest to niepatogeniczna bakteria glebowa, wykazująca wysoką pobudzaną aktywność dehydrogenazy D-arabitolowej. Szczep Klebsiella terrigena Phpl zastosowany . w przykładach uzyskano do K. Haahteli, Uniwersytet w Helsinkach. Wydzielanie szczepu opisali Haahtela i inni, App. Env. Microbiol. 45: 563-570 (1983). Klonowanie genu dehydrogenazy D-arabitolowej można dogodnie przeprowadzić konstruując bibliotekę genomową chromosomowego DNA K. terrigena w odpowiednim wektorze, np. w dobrze znanym i dostępnym w skali technicznej plazmidzie pUC19. Bibliotekę tę transformuje się do jednego z wielu szczepów E. coli, zdolnych do wykorzystywania D-ksylulozy, ale nie D-arabitolu jako jedynego źródła węgla. Przykład odpowiedniego szczepu stanowi szczep E. coli SCSI dostępny ze Stratagene. Transformanty posiewa się następnie na pożywce zawierającej D-arabitol jako jedyne źródło węgla i wydziela się klony zdolne do rozwoju na takiej pożywce. Obszar kodujący dehydrogenazy D-arabitolowej K. terrigena można dogodnie wydzielić w postaci fragmentu 1,38 kb Bcll-Clal i wykonać fuzję z sekwencjami odpowiedniego promotora i transkrypcyjnego terminatora. Promotor i terminator transkrypcyjny Saccharomyces cerevisiae ADCI stanowią przykłady transkrypcyjnych elementów regulatorowych przydatnych w realizacji wynalazku, gdy drożdże Z. rouxii stosuje się jako organizm gospodarza. Sekwencje ADCI dostępne są z GenBank.

178 040

Jakkolwiek większość D-ksylulozy i grzybów zawiera gen dehydrogenazy ksylitolowej (EC 1.1.1.9), nadekspresja tego genu będzie zazwyczaj konieczna przy realizacji wynalazku. Klonowanie genu xYL2 Pichia stipitis kodującego dehydrogenazę ksylitolową (EC 1.1.1.9) można dogodnie przeprowadzić zgodnie z technologią łańcuchowych reakcji polimerazowych, wykorzystując opublikowaną informację dotyczącą sekwencji nukleotydowej genu XYL2 (Kotter i inni, Cum Genet. 18: 493-500 (1990)). Gen można wprowadzić do innego gatunku drożdży bez jakiejkolwiek modyfikacji wykonując ekspresję pod kontroląjego własnego promotora, albo też promotor można wymienić na inny silny promotor drożdżowy.

Wykonać można konstrukcje genetycznie stabilnych transformantów z układami wektorowymi lub z układami transformującymi, integrując w ten sposób pożądany DNA w chromosomie gospodarza. Taka integracja może wystąpić de novo w komórce, albo może przebiegać z udziałem transformacji wektorem, który funkcyjnie sam wbudowuje się do chromosomu gospodarza, takim jak fag, wektory retrowirusowe, transpozony lub inne elementy DNA, które ułatwiają integrację sekwencji DNA w chromosomach.

Geny kodujące dehydrogenazę D-arabitolową i dehydrogenazę ksylitolową (EC 1.1.19). pod kontrolą odpowiednich promotorów można połączyć w jednej konstrukcji plazmidowej i wprowadzić do komórek gospodarza - organizmów wytwarzających D-arabinozę w wyniku transformacji. Charakter wektora plazmidowego będzie zależeć od organizmów gospodarzy. I tak w korzystnym wykonaniu wynalazku w przypadku Z. rouxii stosuje się wektory zawierające DNA utajonego plazmidu pSRl (K. Ushio i inni, J. Ferment. Technol. 66: 481-488 (1988)). W przypadku innych gatunków drożdży lub grzybów, dla których nie są znane plazmidy ulęgające autonomicznie replikacji, wykorzystać można integrację genów dehydrogenazy ksylitolowej (EC 1.1.1.9) i dehydrogenazy D-arabitolowej w chromosomie gospodarza. Skierowanie integracji do rybosomowego locus DNA (DNA kodującego rybosomowe RNA) gospodarza stanowi korzystny sposób przeprowadzenia integracji o dużej liczbie kopii, a wysoki poziom ekspresji dwóch genów dehydrogenazowych tak skierowanych można uzyskać zapewniając w wystarczającej ilości sekwencje zrekombinowanego DNA na zrekombinowanym konstrukcie, tak aby sterować integrację w to właśnie locus. Genetyczne markery wykorzystywane do transformacji drobnoustrojów wytwarzających D-arabitol stanowią korzystnie markery dominatowe z wprowadzoną opornością na różne antybiotyki takie jak gentamycyna lub fleomycyna, na metale ciężkie takie jak miedź itp. Wybieralny gen markera można albo bezpośrednio połączyć z sekwencjąDNA genu ulegającego ekspresji lub wprowadzić do tej samej komórki na drodze współtransformacji.

Poza wprowadzeniem genów dehydrogenazy D-arabitolowej i dehydrogenazy ksylitolowej (EC 1.1.1.9) wykonać można inne modyfikacje genetyczne konstruując nowe szczepy wytwarzające ksylitol. I tak wykonać można nadekspresję genów kodujących enzymy utleniającej drogi przemiany pentoza-fosforan, aby zwiększyć szybkość syntezy 5-fosforanu D-rybulozy, prekursora D-arabitolu. Ponadto zdezaktywować można gen kodujący transketolazę - enzym katalizujący katabolizm 5-fosforanów pentuloz lub 5-fosforanów pentoz, wykorzystując konwencjonalne techniki mutagenezy lub rozbijania genu, co prowadzi do zwiększenia nagromadzenia się fosforanów cukrów o 5 atomach węgla. Dezaktywacja genu D-ksylulokinazy może spowodować wzrost wydajności ksylitolu w wyniku wyeliminowania strat D-ksylulozy na skutek fosforylowania. Kombinację mutacji dezaktywującej transketolazę i nadekspresji 5-epimerazy D-rybulozowej zastosować można w celu stworzenia odmiennego rodzaju drogi wytwarzania ksylitolu, w której D-arabitol nie jest wykorzystywany jako związek pośredni.

Do przeprowadzenia ekspresji pożądanego białka i/lub jego aktywnych pochodnych konieczne są sygnały transkrypcyjne i translacyjne rozpoznawane przez odpowiedniego gospodarza. Klonowane sekwencje kodujące uzyskane sposobami opisanymi powyżej, korzystnie w formie dwuniciowej, można połączyć funkcjonalnie z sekwencjami kontrolującymi transkrypcyjną ekspresję w wektorze ekspresji, a następnie wprowadzić do komórki gospodarza, prokariotycznego lub eukariotycznego, uzyskując zrekombinowane białko lub jego funkcyjną pochodną. W zależności od tego, którą nić połączy się funkcjonalnie z sekwencjami kontrolującymi ekspresję transkrypcyjną, można także osiągnąć ekspresję antysensownego RNA lub jego funkcyjnej pochodnej.

178 040

W wyniku ekspresji białka w różnych gospodarzach powstać mogą różne portranslacyjne modyfikacje, które mogązmienić właściwości białka. Korzystnie wynalazek obejmuje ekspresję białka lub jego funkcyjnej pochodnej w komórkach eukariotycznych, a zwłaszcza w drożdżach.

Cząsteczkę kwasu nukleinowego takiego jak DNA, określa się za „zdolnądo ekspresji” polipeptydu, gdy zawiera ona sekwencje kontrolujące ekspresję, które obejmujątranskrypcyjnąinformację regulatorową, przy czym sekwencje te są „funkcjonalnie połączone” z sekwencją nukleotydową, która koduje polipeptyd.

Połączenie funkcjonalne stanowi połączenie, w którym sekwencja połączona jest z jedną lub więcej sekwencjami regulatorowymi w taki sposób, aby ekspresja sekwencji przebiegała pod wpływem lub kontrolą sekwencji regulatorowej. Dwie sekwencje DNA (takie jak sekwencja kodująca i sekwencja obszaru promotora połączona z końcem 5' sekwencji kodującej) określa się jako połączone funkcjonalnie, jeśli w wyniku indukcji działania promotora następuje transkrypcja mRNA kodującego pożądane białko oraz jeśli charakter połączenia między dwoma sekwencjami DNA (1) nie wpływa na ramkę odczytu sekwencji kodującej, 92) nie zakłóca zdolności regulatorowych sekwencji ekspresyjnych do kierowania ekspresją białka, antysensownego mRNA lub (3) nie zakłócają zdolności matrycy DNA do transkrypcji. W związku z tym obszar promotora powinien być funkcjonalnie połączony z sekwencjąDNA jeśli promotor ma być zdolny do skutecznej transkrypcji tej sekwencji DNA.

Dokładny charakter obszarów regulatorowych niezbędnych do osiągnięcia ekspresji genu może zmieniać się w zależności od gatunków lub typów komórek, z tym że zazwyczaj zawierają one jako niezbędne, 5' nie-transkrybujące i 5' nie-translatujące (nie-kodujące) sekwencje odgrywające rolę odpowiednio w transkrypcji i translacji, takie jak ramka TATA, sekwencja przykrywająca, sekwencja CAAT itp. W szczególności takie kantrolne sekwencje 5' nie transkrybujące będą zawierać obszar obejmujący promotor transkrypcyjnego regulowania funkcjonalnie połączonego genu. Takie transkrypcyjne sekwencje kontrolne mogą również zależnie od potrzeb obejmować sekwencje wzmacniacza lub sekwencje aktywatora w górę.

Ekspresja białka w gospodarzach eukariotycznych takich jak drożdże wymaga stosowania obszarów regulatorowych działających w takich gospodarzach, a korzystnie drożdżowych układów regulatorowych. Zastosować można wiele różnych transkrypcyjnych i translacyjnych sekwencji regulatorowych, zależnie od charakteru gospodarza. Korzystnie takie sygnały regulatorowe sązasocjowane w stanie natywnym z określonym genem zapewniającym wysoki poziom ekspresji w komórce gospodarzu.

W przypadku eukariotów gdy transkrypcja nie jest połączona z translacją, takie obszary kontrolne może, lecz nie musi, zapewniać kodon inicjatorowy metioniny (AUG), w zależności od tego czy klonowana sekwencja zawiera metioninę. Obszary takie będą zazwyczaj zawierać obszar promotora wystarczający do skierowania zaincjowania syntezy RNA w komórce gospodarzu. Korzystne sąpromotory z genów drożdży kodujących produkt mRNA zdolny do translacji, a w szczególności zastosować można silne promotory, pod warunkiem, że działają one jako promotory również w komórce gospodarzu. Do korzystnych silnych promotorów należy promotor genu GALI, promotory genu glikolitycznego takiego jak gen fosfoglicerokinazy (pGk) lub promotor konstytutywnej dehydrogenazy alkoholowej (ADC1) (G.Ammerer, Meth. Enzymol. 101C: 192-201 (1983); Aho, FEBS Lett. 291: 45-49 (1991)). '

Jak to jest powszechnie znane, translacja eukariotycznego mRNA inicjowana jest przy kodonie kodującym pierwszą metioninę. Z tego względu korzystnie jest zapewnić, aby połączenie między promotorem eukariotycznym i sekwencjąDNA kodującą pożądane białko lub jej funkcyjnąpochodnąnie zawierało jakichkolwiek zakłócających kodonów, które sązdolne do kodowania metioniny. Obecność takich kodonów wynika albo z powstawania białka fuzyjnego (gdy kodon AUG znajduje się w tej samej ramce odczytu co sekwencja DNA kodująca białko) albo z mutacji przesuwającej ramkę (gdy kodon AUG nie znajduje się w tej samej ramce odczytu co sekwencja kodująca białko).

Dobrać można takie sygnały regulatorowe inicjowania transkrypcyjnego, które umożliwiają tłumienie lub aktywację, tak że można będzie modulować ekspresję funkcjonalnie połączonych

178 040 genów. Interesujące są sygnały regulatorowe wrażliwe na temperaturę, tak że zmieniając temperaturę można będzie tłumić lub inicjować ekspresję, albo sąpodatne na regulację chemiczną, np. tworząc metabolit. Sygnały translacyjne nie są konieczne, gdy pożądana jest ekspresja antysensownych sekwencji RNA.

W razie potrzeby opisanymi powyżej technikami klonowania uzyskać można nie-transkrynowane i/lub nie-translatowane obszary 3' względem sekwencji kodującej pożądane białko. Obszar 3'-nie-transkrybowany może zostać zachowany z uwagi na jego elementy regulatorowej sekwencji zakończania transkrypcyjnego; obszar 3'-nie-tranlatowany może zostać zachowany z uwagi na jego elementy regulatorowej sekwencji zakończania translacyjnego, albo z uwagi na te elementy, które kierują poliadenylowaniem w komórkach eukariotycznych. Gdy natywne sygnały sekwencji kontrolnych ekspresji nie działają w sposób zadowalający w komórce gospodarza, to sekwencje działające w komórce gospodarza można zamienić.

Wektory według wynalazku mogą ponadto zawierać inne funkcjonalnie połączone elementy regulatorowe takie jak elementy DNA, które nadają oporność na antybiotyki, albo źródła replikacji do utrzymywania wektora w jednej lub więcej komórkach gospodarza.

W innym korzystnym wykonaniu, zwłaszcza w przypadku Z. rouxii, wprowadzoną sekwencję wbudowuje się do wektora plazmidowego zdolnego do autonomicznej replikacji w gospodarzu - biorcy. W tym celu wykorzystać można dowolny z wielu wektorów.

Do istotnych czynników uwzględnianych przy doborze konkretnego wektora plazmidowego lub wirusowego należą: łatwość z jaką komórki biorcze, które zawierają wektor, można rozpoznawać i odróżniać od tych komórek biorczych, które nie zawierąjąwektora; liczba wymaganych kopii wektora w konkretnym gospodarzu; oraz to, czy pożądana jest możliwość „wymiany” wektora między komórkami gospodarzami różnych gatunków.

Korzystne plazmidy drożdżowe zależą od gospodarza. W przypadku Z. rouxii korzystnie stosuje wektory oparte na natywnych utajonych plazmidach pSRl (E. Toh i inni, J. Bacteriol. 151: 1380-1390 (1982)), pSB1, pSB2, pSB3 lub pSB4 (E. Toh i inni, J. Gen. Microbiol. 130: 2527-2534 (1984). Plazmid pSRT303D (A. Jeampipatkul i inni, Mol. Gen. Genet. 206: 88-84 (1987)) stanowi przykład użytecznego wektora plazmidowego dla drożdży Zygosaccharomyces.

Po wytworzeniu wektora lub sekwencji DNA zawierającej konstrukcję (konstrukcje) w celu wykonania ekspresji, konstrukcję (konstrukcje) DNA wprowadza się do odpowiedniej komórki gospodarza dowolnym z wielu różnych sposobów takich jak transformacja. Po wprowadzeniu wektora komórki biorcze hoduje się w selektywnej pożywce zapewniającej selekcję z uwagi na wzrost komórek zawierających wektor. W wyniku ekspresji jednej lub więcej klonowanych sekwencji genów powstaje pożądane białko, albo też fragment tego białka. Ekspresja taka może zachodzić w sposób ciągły w transformowanych komórkach, albo też w sposób kontrolowany, np. w wyniku zainicjowania ekspresji.

W celu skonstruowania gospodarzy według wynalazku, którzy zostali zmienieni w taki sposób, że nie może już w nich zachodzić ekspresja pewnego produktu genowego, przeprowadzić można miejscowo ukierunkowaną mutagenezę z wykorzystaniem znanych technik, takich jak rozbicie genu (R.S. Rothstein, Meth. Enzymol. 101C: 202-211 (1983)).

IV Wytwarzanie ksylitolu

Gdy zrekombinowane drożdże wytwarzające arabitol, korzystnie drożdże osmofilowe, zastosuje się jako gospodarzy według wynalazku, mogą one rozwijać się na pożywce o wysokim ciśnieniu osmotycznym, np. na pożywce zawierającej 10-60% D-glukozy, a korzystnie 25% D-glukozy. („Normalna” pożywka zazwyczaj zawiera zaledwie 2-3% glukozy. Pożywka o wysokim ciśnieniu osmotycznym wywołuje wytwarzanie D-arabitolu w dzikich szczepach drożdży osmofilowych takich jak Z. rouxii. Pożywkę hodowlaną dla zrekombinowanych i kontrolnych (dzikich) szczepów analizuje się znanymi sposobami, w różnych odstępach czasu hodowli, w celu oznaczenia zawartości ksylitolu. W warunkach hodowli nie zoptymalizowanych pod względem maksymalnej wydajności D-arabitolu szczep Z. rouxii ATCC13356 [pSRT (AX)-9] wytwarza i wydziela do pożywki zarówno ksylitol jak i D-arabitol. Tylko D-arabitol wykrywany jest

178 040 w hodowli szczepu kontrolnego. Wydajność ksylitolu w pierwszych próbach [patrz tabela 4 w przykładzie 4] po 48 godzinach hodowli wynosiła około 7,7 g/litr.

Ksylitol można wyodrębniać z pożywki dla gospodarza według wynalazku i oczyszczać dowolnym ze znanych sposobów. Tak np. w patencie USA nr 5 081 026, który wprowadza się jako źródło literaturowe, opisano chromatograficzne wydzielanie ksylitolu z hodowli drożdżowych. W związku z tym po etapie fermentacji ksylitol można wyodrębniać z hodowli i oczyszczać z wykorzystaniem etapów chromatografii opisanych w patencie USA nr 5 081 026, przeprowadzając następnie krystalizację.

Przykłady

Przykład 1. Klonowanie bakteryjnego genu dehydrogenazy D-arabitolowej

Klebsiella terrigena Phpl (otrzymane od K. Haahteli, Uniwersytet w Helsinkach, patrz Haahtelai inni, Appl. Env. Microbiol. 45: 563-570 (1983)) hodowano w 1 litrze pożywki LB(1%tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 1°% NaCl) przez noc w 30°C. Komórki bakteryjne (około 5 g) odwirowano, przemyto raz TE (10 mM tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) i ponownie zawieszono w TE zawierającym 1 % dodecylosiarczanu sodowego i 200 pg/ml proteinazy K. Zawiesinę inkubowano w 37°C przez 30 minut, po czym wyekstrahowano raj równą objętością fenolu i dwa razy chloroformem. Dodano 3 M octan sodowy (1/10 objętości) i etanol (3 objętości), po czym wytrącone kwasy nukleinowe odwirowano i ponownie rozpuszczono w 5 ml Te. RNA usunięto w wyniku wirowania roztworu w 25 ml 1M NaCl przez noc z szybkością30 000 obrotów/minutę w wirówce Beckman Ti50.2. Uzyskany w ten sposób chromosomowy DNA K. terrigena zawierał fragmenty o przeciętnej wielkości 50 000 par zasad (bp). DNA strawiono następnie endonukleaząrestrykcyjną Sau3A w buforze dostawcy (Boehringera) przy stosunku enzym:DNA 5U/mg, aż do zmniejszenia średniej wielkości fragmentu DNA do około 5 -10 kb (ocenianej na podstawie elektroforezy na żelu agarozowym). Produkt trawienia frakcjonowano metodą elektroforezy na bloku 0,6% żelu agarozowego o wymiarach 20 x 10 x 0,6 cm w buforze TBE (0,09 M tris-kwas borowy, 1 mM EDTA, pH 8,3) przy 5V/cm przez noc, po czym wycięto otwór w bloku agarozowym w miejscu odpowiadającym fragmentowi o wielkości około 5 kB, w otwór wstawiono kawałek membrany do dializy i elektroforezę kontynuowano tak długo, aż zasadniczo wszystkie fragmenty DNA o wielkości ponad 5 kB zostaną zaadsorbowane na membranie. Plazmidowy DNA z pUC19 (otrzymany z Pharmacia) strawiono endonukleazą restrykcyjną BamHI i bakteryjną fosfatazą alkaliczną stosując bufor i warunki reakcji podane przez producenta. Liniowąpostać pUC19 oczyszczono metodą preparatywnej elektroforezy na żelu wykorzystując metodę elektroelucji membranowej opisaną powyżej, a następnie zligowano z frakcją 5-15 kB chromosomowego DNA Klebsiella terrigena. Mieszaninę z ligowania zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli SCSI (otrzymanych ze Stratagene) do uzyskania oporności na ampicylinę. W doświadczeniu tym uzyskano około 10 000 zrekombinowanych klonów. Uśrednione komórki z płytek do transformowania posiano na płytkach z minimalną pożywką zawierającą D-arabitol (1%) jako jedyne źródło węgla. Po 2 dniach inkubowania w 37°C uzyskano szereg kolonii. Plazmidowy DNA wydzielono z dwóch (najszybciej rozwijających się) klonów zastosowano do powtórnego transformowania szczepu HB101 E. coli, niezdolnego do katabolizowania D-arabitolu, ale zdolnego do wykorzystywania D-ksylulozy. Stwierdzono, że wszystkie transformanty wykazują dodatnią próbę wykorzystania D-arabitolu na płytkach McConke/a agarowo-D-arabitolowych (otrzymanych z Difco), podczas gdy klony kontrolne (ten sam szczep transformowany pUC19) dały wynik negatywny. Analiza restrykcyjna wykazała, że dwa wydzielone klony zawierają identyczne plazmidy. Jeden z dwóch wydzielonych plazmidów (nazwany pARL2) wykorzystano do dalszej analizy. Mapę restrykcyjną klonowanego fragmentu DNA z K. terrigena o 9,5 kb (około) w pARL2 zawierającym gen dehydrogenazy D-arabitolowej przedstawiono na fig. 1.

Przykład 2. Ekspresja genu bakteryjnej dehydrogenazy D-arabitolowej w drożdżach

Z wyjściowego klonu DNA K. terrigena o 9,5 kb, zawierającego gen dehydrogenazy D-arabitolowej fragment Sacl-HindIII o około 1,8 kb subklonowano z wykorzystaniem zwykłych technik rekombinacji DNA stwierdzając, że zawiera on gen dehydrogenazy D-arabitolowej.

178 040

Plazmid zawierający ten fragment DNA w wektorze pUC19 (pADH, gdzie ADH oznacza dehydrogenazę D-arabitolową) wydzielono ze szczepu E. coli JM110, strawiono endonukleazami restrykcyjnymi BclI i Clal, po czym fragment DNA o 1,38 kb wydzielono metodą preparatywnej elektroforezy na żelu agarozowym. Ten fragment DNA potraktowano fragmentem DNA-polimerazy I Klenowa w obecności wszystkich czterech trifosforanów dezoksynukleotydów i zligowano z drożdżowym wektorem ekspresji pAAH5 (Ammerer, Meth. Enzymol. 101:192-203 (1983)) rozciętym za pomocąHindIII i zadanym fragmentem Klenowa (fig. 2). Uzyskany plazmid ekspresji, pYARD, jest wektorem wrzecionowym E. coli-Saccharomyces cerevisiae, zawierającym replikację i gen oporności na ampicylinę pochodzenia bakteryjnego (E. coli), replikację od 2 pm DNA· pochodzenia drożdżowego (S. cerevisiae) oraz gen LEU2 do selekcjonowania w drożdżach pochodzenia drożdżowego (S. cerevisiae). Kaseta ekspresji zawiera promotor drożdżowej dehydrogenazy alkoholowej I (ADC) oraz flankujący terminator transkrypcji (ADCI) funkcjonalnie połączony z genem dehydrogenazy D-arabitolowej K. terrigena.

Szczep Saccharomyces cerevisiae GRF18 (MATa, leu-2-3,112, his3-11,15) oraz S. cerevisiae DBY746 (ATCC 44773; MATa, leu2-3,112, his3-Al, ura3-52 trpl-289) zastosowano jako gospodarze do transformowania opisanym powyżej wektorem ekspresji dehydrogenazy D-arabitolowej pYARD, uzyskując takie same wyniki. Transformację przeprowadzono standardową procedurąz chlorkiem litu (Ito i inni, J. Bacteriol. 153: 163-160 (1983)), stosując marker LEU2 pYARD do selekcji transformantów. Transformanty hodowano na ciekłej pożywce w minimalnym ośrodku: 0,67% drożdżowych zasad azotowych („Difco”), 2% D-glukozy, 100 mg/litr histydyny i tryptofanu, w 30°C przez noc z wytrząsaniem. Komórki odwirowano, zawieszono w minimalnej objętości 0,1 M fosforanu sodowego buforowanego do pH 6,8, zawierającego 1 mM NAD+ i rozbito 0,5 mm kuleczkami szklanymi w aparacie typu młyna perełkowego Bead beater („Biospec products”) przez 6 minut z chłodzeniem lodem. Aktywność dehydrogenazy D-arabitolowej oznaczono w sposób opisany powyżej. W doświadczeniach tych zastosowano ekstrakt komórek K. terrigena hodowanych na D-arabitolu zastosowano jako dodatni materiał kontrolny, a DBY746 transformowany pAAH5 jako ujemny materiał kontrolny. Wyniki podane w tabeli 2 wykazują, że gen dehydrogenazy D-arabitolowej wydzielony z K. terrigena ulega skutecznie ekspresji w drożdżach.

Tabela 2

Szczep drobnoustrojowy	Aktywność dehydrogenazy D-arabitolowe (jednostki przyjęte arbitralnie)
K. terrigena Phpl	3,5
DBY746 [pYARD]	1,0
DBY746 [pAAH5]	0,00

Przykład 3. Konstrukcja wektorów drożdżowych do nadekspresji genów dehydrogenazy ksylitolowej i dehydrogenazy D-arabitolowej

Znaną sekwencję nukleotydową genu XYL2 drożdży (Pichia stipitis), kodującego dehydrogenazę ksylitolową [Kotter i inni, Curr. Genet. 18:493-500 (1990)] zastosowano do zsyntetyzowania oligonukleotydów do klonowania tego genu metodą polimerazowej reakcji łańcuchowej. Dwa oligonukleotydy: CGAATTCTAGACCACCCTAAGTCGTCCC (5'-oligonukleotyd) [SEQ ID No. 1] i TTCAAGAATTCAAGAAACTCACGTGATGC (3'-oligonukleotyd) [SEQ ID No. 2] przeznaczono do wprowadzenia dogodnych miejsc restrykcyjnych Xbal i EcoRI na końce 5'- i 3'- produktu PCR. 5'-oligonukleotyd przyłącza się w pozycji 1-24 XYL2, a 3'-oligonukleotyd przyłącza się w pozycji 1531-1560, zgodnie z numeracjąużytą przez K ottera i innych, Curr. Genet. 18: 493-500 (1990).

Pichia stipitis CBS6054 (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, PO Box 273,3740 AG Baam, Holandia) hodowano przez noc na pożywce YEPD (1 % ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% D-glukozy), po czym komórki odwirowano, przemyto raz 1 M roztwó178 040 rem sorbitolu zawierającym 2 mM EDTA, pH 7,5, ponownie zawieszono w tym samym roztworze i strawiono środkiem Lysicate (Sigma). Trawienie kontrolowano śledząc gęstość optycznąprzy 600 nm przy rozcieńczeniu 1:1000 zawiesiny komórek w 2% SDS. Trawienie zakończono, gdy wielkość ta spadła do około 1/7 wielkości wyjściowej. Zawiesinę sferoplastów przemyto następnie 4 razy 1 M roztworem sorbitolu. Sferoplasty poddano lizie w 1% SDS i zadano 200 pg/ml proteinazy K w 37°C na 30 minut. Po jednokrotnej ekstrakcji fenolem i dwukrotnej chloroformem kwasy nukleinowe strącono etanolem i ponownie rozpuszczono w niewielkiej ilości buforu TE. Integralność chromosomowego DNA sprawdzono przeprowadzając elektroforezę na żelu agarozowym. Średnia wielkość fragmentu DNA przekraczała 50 kb. PCR przeprowadzono stosując polimerazę Tag DNA (Boehringer) w buforze dostawcy. Zastosowano cykl termiczny: 93°C - 30 s, 55°C - 30 s i 72°C - 60 s. Produkt PCR wyekstrahowano chloroformem, wytrącono etanolem i strawiono EcoRI i Xbal w standardowych warunkach. Po oczyszczaniu na żelu agarozowym fragment DNA klonowano do pUC18 rozciętego Xbal i EcoRI (plazmid pUC(XYL2)). Przeprowadzona następnie analiza restrykcyjna potwierdziła, że mapa restrykcyjna klonowanego fragmentu odpowiada sekwencji nukleotydów genu XYL2 P stipitis.

Plazmidy drożdżowe do nadekspesji dehydrogenazy D-arabitolowej i dehydrogenazy ksylitolowej skonstruowano w sposób przedstawiony na fig. 3 i 4. W celu zmienienia flankujących miejsc restrykcyjnych kasety ekspresji dehydrogenazy D-arabitolowej w plazmidzie pYARD całą kasetę wycięto stosując trawienie BamHI przeprowadzono klonowanie do pUC18 strawionego za pomocą BamHI. Uzyskany plazmid pUC(YARD) strawiono za pomocą Sali i EcoRI, po czym sam fragment DNA o 2 kb wydzielono metodą preparatywnej elektroforezy na żelu agarozowym. Fragment ten zligowano z fragmentem Hindlll-EcoRI DNA o 1,6 kb wydzielonym z plazmidu pUC(XYL2) i fragmentem wektora wrzecionowego E. coli-drożdżowego pJDB207 o

6.6 kb (J.D. Beggs, Nature 275: 104-109 (1978)) strawionego za pomocąHindIII i SalI. Plazmid pJDB(AX)-16 wydzielono po transformacji E. coli powyższą mieszaniną ligacyjną. Plazmid ten jest zdolny do replikacji zarówno w E. coli jak i w Saccharomyces cerevisiae. W S. cerevisiae nadzoruje on wysoki poziom syntezy zarówno dehydrogenazy D-arabitolowej jak i dehydrogenazy ksylitolowej. Plazmid pSRT(AX)-9 zsyntetyzowano w wyniku ligowania fragmentu Sali o

4.7 kb z plazmidu pJDB(AX)-9 i liniowej formy plazmidu pSRT303D (Jeampipatkul i inni, Mol. Gen. Genet. 206: 88-94 (1987)) uzyskaną w wyniku częściowej hydrolizy za pomocą Sali.

Przykład 4. Konstrukcja szczepów drożdży wydzielających ksylitol

Przeprowadzono transformowanie Zygosaccharomyces rouxii ATCC 13356 plazmidem pSRT(AX)-9 nieznacznie zmieniając uprzednio opisaną metodę (K. Ushio i inni, J. Ferment. Technol. 66: 481-488 (1988)). W skrócie Z. rouxii hodowano przez noc na pożywce YEPD (uzyskując hodowlę o gęstości optycznej 3-5 przy 600 nm), po czym komórki zabrano stosując wirowanie z małą prędkością, przemyto dwukrotnie 1M roztworem sorbitolu z 1 mM EDTA, pH 7,5, ponownie zawieszono tym samym roztworze o objętości równej 1/5 wyjściowej objętości hodowli, zawierającym 1%o 2-merkaptoetanolu i przeprowadzono trawienie w temperaturze pokojowej za pomocą środka lysicate (Sigma). Przebieg trawienia śledzono pobierając odpowiednią próbkę zawiesiny komórek, którą rozcieńczano 1%o roztworem SDS i mierzono gęstość optyczną rozcieńczonej próbki przy 600 nm. Gdy wielkość ta spadła do 1/7 wielkości wyjściowej, trawienie kończono chłodząc zawiesinę w lodzie, po czym przemywano ją (10 minut wirowania w 0°C z szybkością 1000 obrotów/minutę) roztworem sorbitolu ją aż do pozbycia się wykrywalnego zapachu merkaptoetanolu. Sferoplasty przemyto jeden raz zimnym 0,3 M roztworem chlorku wapniowego w 1 M sorbitolu i ponownie zawieszono w tym samym roztworze o objętości równej 1/4 wyjściowej objętości hodowli. Próbki po 200 μΐ tej zawiesiny i 10-20 (ig plazmidowego DNA wymieszano i inkubowano w 0°C przez 40 minut. Do zawiesiny sferoplastów dodano 0,8 ml schłodzonego w lodzie 50% roztworu PEG-6000, zawierającego 0,3 M chlorek wapnia i inkubację w obniżonej temperaturze kontynuowano przez 1 godzinę. Sferoplasty zatężono stosując wirowanie z szybkością4000 obrotów/minutę przez 10 minut w laboratoryjnej wirówce, zawieszono w 2 ml YEPD zawierającego 1 M sorbitol i pozostawiono do regeneracji na

178 040 noc w temperaturze pokojowej. Zregenerowane komórki posiano na płytkach YEPD zawierających 50-100 pg/ml gentamycyny i inkubowano w 30°C przez 4-6 dni.

Transformanty hodowano w ciekłej pożywce YEPD, po czym ekstrakty komórkowe uzyskane w sposób opisany w przypadku S. cerevisiae (przykład 2) i oznaczono aktywności dehydrogenazy D-arabitolowej i dehydrogenazy ksylitolowej. Wyniki tych pomiarów porównano z podobnymi pomiarami wykonanymi dla innych organizmów w tabeli 3. Wykazują one, że obydwa geny skutecznie wykonują ekspresję w Z. rouxii.

Komórki Z. rouxii ATCC 13356 transformowane pSRT(AX)-9 hodowano przez 2 dni w 50 ml YEPD zawierającej 50 pg/ml gentamycyny, po czym zebrano je i zastosowano do zaszczepienia 1000 ml YEPD zawierającej 25% wag. D-glukozy i 50 pg/ml gentamycyny. Hodowlę prowadzono w 100 ml kolbie na wytrząsarce obrotowej (200 obrotów/minutę) w 30°C. W innym doświadczeniu (doświadczenie 2) zastosowano tą samą pożywkę bez ekstraktu drożdżowego (pożywka niskofosforanowa). Zawartość ksylitolu w bulionie pożywkowym oznaczano standardowymi metodami HPLC i chromatografii gazowej. Wyniki podano w tabeli 4. Nie wykryto ksylitolu w ośrodku hodowli nietransformowanych Z. rouxii hodowanych na tej samej pożywce (bez gentamycyny).

Tabela 3

Aktywności dehydrogenazy D-arabitolowej i dehydrogenazy ksylitolowej w różnych organizmach i szczepach

Organizm i szczep	Plazmid (*)	Dehydrogenaza D-arabitolowa (IU/mg białka)	Dehydrogenaza ksylitolowa (IU/mg białka)
Klebsiella terrigena Phpl	-	0,48	NW (**)
S. cerevisiae DBY746	-	0,00	<0,01
S. cerevisiae DBY746	pJDB(YARD)	3,0	<0,01
S. cerevisiae DBY746	pJDB(AX)-16	1,9	1,2
Z. rouxii ATCC 13356	-	0,00	<0,02
Z. rouxii ATCC 13356	pSRT(AX)-9	1,3	0,7

(*) Plazmidy wytwarzają w wyniku ekspresji następujące enzymy: pJDB(YARD) - dehydrogenaza D-arabitolowa pJDB(AX)-16 - dehydrogenaza D-arabitolowa i dehydrogenaza ksylitolowa pSRT(AX)-9 - dehydrogenaza D-arabitolowa i dehydrogenaza ksylitolowa (**) NO- nie oznaczano

Tabela 4

Wytwarzanie ksylitolu przez Z. rouxii ATCC 13356 zawierające plazmid pSRT(AX)-9 (g/litr)

Czas hodowli (godziny)	Doświadczenie 1 ośrodek z ekstraktem drożdżowym	Doświadczenie 2 ośrodek bez ekstraktu drożdżowego
0	0,0	0,0
48	7,7	0,5
144	7,5	6,1

W podobny sposób skonstruować można szczepy wytwarzające ksylitol z innych źródeł węgla. Tak np. Candida tropicalis są zdolne do przekształcania n-alkanów w D-arabitol (K. Hattori i T. Suzuki, Ąrgic. Biol. Chem. 38: 1875-1881 (1974) z dobrą wydajnością. Fragment Sali o

4,7 kb z plazmidu pJDB(AX)-9 można wstawić do plazmidu pCU1 (L. Haas i inni, J. Bacteriol. 172: 4571-4577 (1990)) i zastosować do transformowania szczepu S. topicalis SU-2 (ura3). Tą samą kasetę ekspresji można również transformować w prototropowym szczepie C. tropicalis na wektorze plazmidu zawierającym dominujący selektywny marker.

178 040

Przykład 5. Konstrukcja integracyjnego dominującego wektora selekcyjnego do ekspresji dehydrogenazy arabitolu i dehydrogenazy ksylitolu i transformacji Torulopsis candida

Chromosomowe DNA wydzielono z T. candida (ATCC 20214) sposobem zbliżonym do standardowej procedury opisanej w przypadku S. cerevisiae. Jednakże wytwarzanie sferoplastów T. candida wymaga wysokiego stężenia środka Lysicate (Sigma) - około 50 000 U/10 g komórek oraz długiego czasu inhibitowania - od kilku godzin do trwającego całą noc inkubowania w temperaturze pokojowej w celu osiągnięcia skutecznej lizy ścianki komórkowej. Jako bufor przy otrzymywaniu sferoplastów zastosowano 1 M sorbitol zawierający 1 mM EDTA i 1% merkaptoetanol, pH 8. Sferoplasty przemyto trzykrotnie tym samym buforem (bez merkaptoetanolu) i wykonano lizę w 15 ml 1% SDS. Po lizie komórek przeprowadzono natychmiast dwie ekstrakcje fenolem, po czym DNA strącono dodając 2 objętości etanolu i mieszaninę odwirowano (5 minut, 10 000 obrotów/minutę). DNA przemyto dwukrotnie 70% etanolem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. DNA rozpuszczono w 5 ml 10 mM buforu tris-HCl zawierającego 1 mM EDTA, dodano RNAzę A do stężenia 10 pg/ml i roztwór inkubowano przez 1 godzinę w 37°C. Integralność DNA potwierdzono wykonując elektroforezę na żelu agarozowym z zastosowaniem nierozciętego /.-DNA jako wzorca ciężaru cząsteczkowego.

200 (g chromosomowego DNA T. candida rozcięto HindIII i EcoRI i produkt trawienia wprowadzono do otworu o średnicy 6 cm w bloku (8 x 15 x 0,8 cm) 0,7% preparatywnego żelu agarozowego i przeprowadzono rozdzielanie metodą elektroforezy. Pasek o szerokości 1 cm wycięto z żelu i rozmazano na dodatnio naładowanej membranie nylonowej (Boehringer 1209 299). Rozmaz zaszczepiono sondąw postaci fragmentu DNA o 10 kb z rDNA Zygosaccharomyces bailii wyciętym za pomocą Sali z plazmidu pAT68 (K. Sugihara i inni, Agric. Biol. Chem. 50(6): 1503-151 (1986)). Sonda była znaczona i rozmazy wywołano stosując zestaw DIG DNA Labeling and Detection Kit (Boehringer 1093 657), zgodnie z instrukcjami producenta. Zaobserwowano 3 pasma hybrydyzacji odpowiadające fragmentom DNA o około 4,5, 2,7 i 1,1 kb. Wykorzystując rozmaz jako wzorzec pasmo odpowiadające największemu (4,5 kb) fragmentowi hybrydyzowanego DNA odcięto od reszty preparatywnego żelu, wykonano elektroelucję DNA, który następnie zligowano z pUC19 rozciętym za pomocą EcoRI i HindIII.

Mieszaninę po ligowaniu zastosowano do transformowania E. coli. Transformowane bakterie posiano na naładowaną membranę nylonową (Bio-Rad 162-0164) leżącą na agarowej powierzchni płytki zawierającej pożywkę LB i ampicylinę. Po inkubowaniu przez 24 godziny w 37°C membranę podniesiono i przeprowadzono lizę in situ kolonii bakteryjnych, zgodnie z instrukcjami producenta. Na ma potrzeby wykonywać repliki płytki, gdyż E. coli penetruje przez tego typu membranę i po podniesieniu filtru widoczny jest ślad każdej kolonii bakteryjnej na powierzchni agaru. Membranę zaszczepiono sondą w postaci tego samego fragmentu rDNA Z. bailii, stosując ten sam zestaw wykrywania DIG co poprzednio. Zidentyfikowano szereg dodatnich klonów (około 2-5% wszystkich klonów). Analiza restrykcyjna minipreparatów plazmidowych z 8 hybrydyzacyjnie-dodatnich i 4 hybrydyzacyjnie-ujemnych klonów, z wykorzystaniem mieszaniny EcoRI, HindIII i EcoRY. Wszystkie hybrydyzacyjnie-dodatnie klony dawały identyczne restrykcyjne wzory fragmentów (z charakterystycznymi fragmentami o 0,55 i 1,5 kb), podczas gdy takie same wzory dla hybrydyzacyjnie-ujemnych klonów były za każdym razem inne. Plazmidowe DNA z jednego z hybrydyzacyjnie-dodatnich klonów wydzielono w skali preparatywnej i nazwano pTCrDNA. Wywnioskowano, że klonowany kawałek stanowił fragment rDNA T. candida, gdyż 1) hybrydyzuje silnie z rDNA Z. bailii oraz 2) ulega klonowaniu z produktu trawienia częściowo wzbogaconego chromosomowego DNA T. candida z dużą częstotliwością (wiadomo, że rDNA jest reprezentowany przez około 100 kopii w komórce drożdży). Częściową mapę restrykcyjną klonowanego fragmentu DNA przedstawiono na fig. 5.

Plazmid łączący fragment rDNA T. candida z dominującym markerem selekcji skonstruowano w sposób następujący. Plazmid pUT332 (A. Gatignol i inni, Gene 91: 35-41 (1990)) rozcięto za pomocą HindIII i KpnI, po czym fragment DNA o 1,3 kb wydzielono metodą elektroforezy na żelu agarozowym i zligowano z fragmentem HindIII-EcoRI o 4,5 kB z pTCrDNA i pUC19 strawionego za pomocąEcoRI i KpnI (fig. 6). Następnie przeprowadzono transformację miesza22

178 040 niny po ligowaniu do E. coli i klon zawierający plazmid pTC(PHLE) zidentyfikowano na podstawie analizy restrykcyjnej.

PTC(PHLE) częściowo strawiono za pomocą Sali i liniową formę plazmidu oczyszczono metodą elektroforezy na żelu agarozowym. Zligowano ją z fragmentem Sali o 5 kb, wydzielonym z pJDB(AX)-16 (przykład 2). Plazmid pTC(AX) zidentyfikowano wśród klonów otrzymanych po transformowaniu mieszaniny z ligowania w E. coli (fig. 6). Plazmid ten zawiera następujące elementy funkcyjne:

a) bakteryjny gen oporności na fleomycynę pod kontrolą promotora drożdżowego i terminator transkrypcji umożliwiający bezpośrednią selekcję komórek drożdży transformowanych przez ten plazmid;

b) fragment rDNA T. candida stanowiący cel homologicznej rekombinacji z chromosomem T. candida i zwiększający wydajność transformowania;

c) kasetę ekspresji dla genów dehydrogenazy arabitolu i dehydrogenazy ksylitolu, zapewniającą syntezę dwóch enzymów na drodze konwersji arabitol-ksylitol.

Przykład 6. Transformacja T. candida i analiza wytwarzania ksylitolu

Plazmid pTC(AX) zastosowano do transformowania szczepu Torulopsis candida ATCC 20214. T. candida hodowano przez 36 godzin na pożywce YEPD zawierającej 10% glukozy. Komórki odwirowano (2000 obrotów/minutę przez 10 minut w 4°C) i przemyto 3 razy sterylnym 1 M sorbitolem. Osad komórkowy zawieszono w równej objętości zimnego 1 M sorbitolu, po czym próbki po 200 μΐ wymieszano z pUT(AX) DNA (20-100 pg) i przeniesiono je do schłodzonych w lodzie kuwet do elekroporacji z 2 mm szczeliną elektrodową i przeprowadzono elektroporację w aparacie Invitrogen ElectroPorator przy następującym nastawie: napięcie 1800 V, pojemność 50 pF, rezystancja równoległa 150 Ω. Komórki przeniesiono do 2ml YEPD zawierającego 1 M sorbitol i inkubowano przez noc w 30°C w wytrząsarce. Transformowane komórki odwirowano z niewielką prędkością, po czym wysiano na płytki zawierające ośrodek YEPD odmiareczkowany do pH 7,5 i zawierający 30 pg/ml fleomycyny. Płytki inkubowano w 30°C przez 7-10 dni. Większość kolonii drożdży, które rozwinęły się w tym czasie, stanowiły mutanty tła, gdyż podobna liczba kolonii pojawiła się na płytkach kontrolnych (zawierających komórki poddane podobnej obróbce, ale bez dodawania DNA). W celu odróżnienia rzeczywistych transformantów od mutantów spontanicznych, chromosomowe DNA wydzielono z 72 odrębnych kolonii drożdży wykorzystując procedurę pomniejszania skali zastosowaną do wydzielania chromosomowego DNA T. candida, opisaną powyżej. Po 10 jog każdego z uzyskanych preparatów pocięto za pomocą EcoRI i BamHI. Produkty trawienia rozdzielono na 1⁰% żelu agarozowym, po czym rozmazano na dodatnio naładowanej membranie nylonowej w sposób opisany w przykładzie 5. Rozmazy zaszczepiono sondą DNA z plazmidu pADH (przykład 2), który zawierał sekwencje dehydrogenazy arabitolowej i sekwencje pUC, ale nie zawierał fragmentów DNA pochodzącego z drożdży (aby uniknąć hybrydyzacji między możliwymi homologicznymi sekwencjami drożdżowymi). Sonda była znaczona i rozmazy wywołano stosując zestaw DIG DNA Labeling and Detection Kit (Boehringer 1093 657). Wykryto tylko jeden klon (T. candida: pTC(AX)) z sygnałem hybrydyzacyjnym kompatybilnym ze strukturą transformowanego plazmidu (3 pasma w zakresie 2-3 kb), co świadczy o bardzo małej wydajności transformowania. Dodatni sygnał hybrydyzacyjny wykryto w jeszcze jednym klonie, z tym jednak, że miejsce jedynego pasma hybrydyzacji (około 5-7 kb) wskazywało, że albo tylko fragment pTC(AX) zintegrował się w chromosomie drożdży, albo w miejscu integracji wystąpiło przegrupowanie. Przyjęto, że plazmid zintegrował się z chromosomem T. candida. Założenie to zgodne jest z obserwacją, po hodowaniu w nieselektywnej pożywce i klonowaniu wszystkie klony T. candida:: pTC(AX) zachowują fenotyp oporności na fleomycynę. Transformant T. candida:: pTC(AX) hodowano na pożywce YEPD zawierającej 10% glukozy przez 36 godzin, po czym aktywność dehydrogenazy arabitolowej i dehydrogenazy ksylitolowej oznaczono w sposób opisany w przykładzie 4. Wyniki zamieszczono w tabeli 5.

178 040

Tabela 5

Aktywność dehydrogenazy arabitolowej i dehydrogenazy ksylitolowej w dzikim T. candida i w szczepie transformowanym za pomocą pTC(AX) (IU/mg białka)

T. candida	Dehydrogenaza arabitolowa	Dehydrogenaza ksylitolową
Typ dziki	0,02	0,03
Transformant	0,03	0,05

Aktywność dehydrogenazy ksylitolowej nie zwiększyła się znacząco w porównaniu z poziomem aktywności endogennej dehydrogenazy ksylitolowej T. candida. Aktywność kodowanej przez plazmid dehydrogenazy arabitolowej (EC 1.1.1.11) trudno było odróżnić od aktywności endogennej synonimicznej, ale odmiennej dehydrogenazy arabitolowej (wytwarzającej rybulozę, EC 1.1.1). Jedyny pewny wniosek z tego doświadczenia stanowi to, że poziom ekspresji dla obydwu enzymów był znacznie niższy niż w Z. rouxii. Próby zwiększenia liczby kopii plazmidu i poziomu ekspresji dwóch dehydrogenaz przez zintegrowany plazmid w wyniku hodowania T. candida:: pTC(AX) na pożywce o zwiększonym stężeniu fleomycyny nie dały pozytywnych wyników.

Zbadano wytwarzanie ksylitolu przez T. candida:: pTC(AX) po hodowaniu na pożywce YEPD zawierającej 10% glukozy przez 5-7 dni. W trzech odrębnych doświadczeniach transformant wytworzył 1,1, 1,6 i 0,9 g ksylitolu/litr, natomiast metodą HPLC nie wykryto ksylitolu w ośrodku hodowli dzikiego T. candida. Granica wykrywalności przyjętej metody analizy wynosi poniżej 0,1 g/litr-. Można w.związku z tym wyciągnąć wniosek, że wytwarzanie ksylitolu przez T. candida:: pTC(AX) jest zdeterminowane przez plazmid.

Przykład 7. Transformacja Candida polymorpha z genami dehydrogenazy arabitolowej i dehydrogenazy ksylitolowej

W celu wprowadzenia genów dehydrogenazy arabitolowej i dehydrogenazy ksylitolowej do Candida polymorpha wyizolowano mutant genu dekarboksylazy fosforanu orotydyny (poniżej określany skrótem URA3) wykorzystując zmodyfikowaną metodę Boeke'go i innych (J.D. Boeke i inni, Mol. Gen. Genet. 197:345-346 (1984)). Szczep C. polymorpha ATCC 20213 hodowano przez 24 godziny na YEPD, komórki odwirowano (2000 obrotów/minutę, 10 minut), przemyto dwa razy wodą i zawieszono w 3 objętościach sterylnego 0,1 M fosforanu sodowego jako buforu o pH 7,0. Dodano metanosulfonian etylu do uzyskania stężenia 1 % i komórki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Reakcję przerwano przenosząc komórki do 0,1 M roztworu tiosiarczanu sodowego i przemyto je.trzykrotnie sterylną wodą. Komórki poddane mutagenezie przeniesiono do 0,5 litra YEPD i hodowano w 30°C z wytrząsaniem przez 2 dni. Drożdże odwirowano, przemyto dwa razy wodą i przeniesiono do 1 litra pożywki zawierającej 0,7% drożdżowych zasad azotowych (Difco), 2% glukozy (pożywka SC), po czym prowadzono inkubację na wytrząsarce obrotowej przez 24 godziny w 30°C. Do hodowli dodano 1 mg nystatyny i inkubowanie kontynuowano przez 4 godziny. Komórki poddane działaniu nystatyny oddzielono od pożywki przez odwirowanie, przemyto dwa razy wodą i przeniesiono do 1litra pożywki SC zawierającej 50 mg uracylu/litr. Komórki inkubowano na wytrząsarce obrotowej przez 5 dni, po czym posiano je na płytki z pożywkąSC zawierającą50 mg uracylu/litr i 1 g/litr kwasu fluoroorotynowego. Po inkubowaniu płytek przez 2 tygodnie w 30°C uzyskano około 400 kolonii opornych na kwas fluoroorotynowy, po czym wszystkie zbadano pod względem auksotropii uracylowej. Wydzielono 5 klonów zależnych od uracylu. Jednakże 3 klony rozwijały się również na pożywce nie zawierającej uracylu, choć ze zmniejszoną szybkością. Dwa klony (nazwane C. polymorpha U-2 i C. polymorpha U-5) wykazujące wyraźny fenotyp zależności od uracylu zastosowano w doświadczenia transformowania.

Klonowanie genu C. polymorpha URA3 przeprowadzono z wykorzystaniem konwencjonalnej strategii. Chromosomowy DNA wydzielono sposobem opisanym w przykładzie 5. dNa częściowo pocięto za pomocąSau3A i rozfrakcjonowano na żelu agarozowym. Zebrano szereg

178 040 frakcji i ich rozrzuty wielkości cząsteczek oznaczono metodą analitycznej elektroforezy na żelu. W doświadczeniach klonowania wykorzystano frakcje o 5-10 kb. Wektor zastosowany do konstrukcji biblioteki, pYEpl3 (Broach i inni, Gene 8: 121-133 (1979)) zawierał gen LEU2 S. cerevisiae, 2 ppochodzący z replikacji i unikatowe miejsce restrykcyjne dla BamHI. Wektor rozcięto za pomocą BamHI, oczyszczono metodą elektroforezy na żelu agarozowym i odfosforylowano za pomocą bakteryjnej fosfatazy alkalicznej. Zbadano szereg niezależnych preparatów wektorów zmieniając warunki ligowania (stosunek wektora do insertu i objętość mieszaniny reakcyjnej) w doświadczeniach w małej skali, w celu zoptymalizowania z uwagi na największą liczbę transformantów i najwyższy procentowy udział zrekombinowanych klonów (analizowany metodą analizy restrykcyjnej minipreparatów plazmidowych z przypadkowych klonów). Przeprowadzono ligowanie w dużej skali w zoptymalizowanych warunkach, a następnie transformowanie w szczepie E. coliXLl-BLUE. Skonstruowana biblioteka zawierała około 15 000 pierwotnych transformantów, spośród których około 90% zawierało inserty.

Przeprowadzono transformowanie szczepu drożdży DBY746 (MATa, leu2-3,112, his3-Al, trp 1-289, ura3-52) biblioteką genową C. polymoroha. Każdy zbiór biblioteki transformowano odrębnie w S. cerevisiae stosując około 20 pg plazmidowego DNA i wykonując po transformacji posiew na jednej płytce uzupełnionej o uracyl, tryptofan i histydynę (np. stosując jedynie selekcję leucynową). Na każdej płytce otrzymano 3 000 -10 000 transformantów drożdży. Następnie wykonano posiew z repliką transformantów drożdży na płytkach z minimalną pożywką uzupełnioną o tryptofan i histydynę (płytki minus uracyl). Kontrolne repliki wykonano na płytkach z histydynąi histydyną minus uracyl. Wykonano także kontrolne repliki na płytkach histydyna-minus i tryptofan-minus. Prawie na każdej płytce znajdowało się odjednego do 4 klonów niezależnych od uracylu. Uzyskano również izolaty niezależne od histydyny i niezależne od tryptofanu, z tym że liczba takich izolatów była 2-3 razy mniejsza niż w przypadku izolatów URA3.

Plazmidy z 6 klonów niezależnych od uracylu uwolniono w E. coli, wydzielono w skali preparatywnej i zastosowano do powtórnego transformowania DBY746 do prototrofii leucynowej. Następnie sprawdzono 10-20 przypadkowych kolonii z każdej transformacji pod względem zależności od uracylu. Pięć z sześciu uwolnionych plazmidów transformowało DBY746 do fenotypu Leu+ Ura⁺. Analiza restrykcyjna pięciu wymienionych plazmidów potwierdziła występowanie bardzo podobnych wzorów restrykcyjnych. Wzory te były zbyt skomplikowane, aby można było wykonać niedwuznaczną mapę restrykcyjną klonowanego fragmentu. Stwierdzono jednak, że trawienie za oomocąHinaIΠ powoduje wydzielenie we wszystkich klonach fragmentu pokrywającego większość insertu DNA (około 4,5 kb). Fragment taki z jednego z izolatów C. pslymsrpha - pCP291 - oczyszczono metodą elektroforezy na żelu agarozowym i subklonowano w pJDB(AX) częściowo strawionym za pomocą Hindlll. Strukturę ' plazmidu pCPU(AX) wydzielonego w wyniku tego eksperymentu klonowania przedstawiono na fig. 7A.Z.

Przeprowadzono próby transformowania zarówno C. oolymorohα U-2 jak i C. polymoiOha U-5 w takich samych warunkach elektroporowania, jak w przykładzie 6. Elektroporowane komórki po wytrząsaniu przez noc w YEPD zawierającym 1 M sorbitol posiano na płytki z pożywką SC. Po inkubowaniu przez 10 dni w 30°C zaobserwowano około 100 kolonii na płytce zawierającej C. po^mo^a U-5 transformowane za pomoc:^pCPU(AX); natomiast liczba kolonii na płytce kontrolnej (zawierającej komórki tego samego szczepu poddane podobnej obróbce, ale bez dodawania DNA) wynosiłajedynie 14. W przypadku C. pol^o^ha U-5 nie stwierdzono znacznego wpływu w eksperymencie transformowania w porównaniu z płytką kontrolną (bez DNA). Trzy przypadkowe klony z płytki ze stransformowanym C. polymorpha U-2 najpierw rozmazano na świeżej płytce z pożywką SC, po czym rozmazy te zastosowano do zaszczepiania 100 ml pożywki YEPD zawierającej 15% glukozy. Hodowle kontrolne zaszczepiono C. polymorohα U-2. Po inkubowaniu na wytrząsarce obrotowej (200 obrotów/minutę) w 30°C przez 10 dni zawartość ksylitolu w ośrodku hodowli oznaczano metodą HPLC. Wyniki doświadczenia przedstawiono w tabeli 6.

178 040

Tabel a 6

Wytwarzanie ksylitolu przez C. polymorpha transformowane pCPU(AX)

Szczep	Ksylitol (mg/ml)
C. polymorpha U-2	0,0
C. polymorpha: :pCPU(AX)-l	0,5
C. polymorpha: :pCPTJ(AX)-2	0,0
C. polymorpha: :pCPU(AX)-3	2,1

Zaobserwowano znaczne wahania w poziomie wytwarzanego ksylitolu przez różne klony. Może to być spowodowane integracją plazmidu pCPU(AX) w różnych loci chromosomu C. polymorpha. Szczep C. polymorpha: :pCPU(AX)-2 jest prawdopodobnie rewertantem, a nie rzeczywistym transformantem. Jednakże doświadczenia te wyraźnie wykazują, że drogę przemiany arabitol-ksylitol można również wprowadzić do C. polymorpha.

Przykład 8. Klonowanie enzymów utleniającej drogi przemiany pentoza-fosforan i ich nadekspresja w drożdżach osmofilowych

Pierwszy enzym utleniającej drogi przemiany pentoza-fosforan - dehydrogenaza 6-fosforanu D-glukozy kodowana jest w S. cerevisiae przez gen ZWF1. Sekwencja tego genu jest znana (T. Nogae i M. Johnston, Gene 96: 161-19 (1990); D. Thomas i inni, The EMBO J. 10: 547-553 (1991)). Gen obejmujący kompletny obszar kodowania, 5'-niekodujący obszar o 600 bp i 3'-niekodujący obszar o 450 bp klonowano metodą PCR z wykorzystaniem dwóch oligonukleotydów: CAGGCCGTCGACAAGGATCTCGTCTC (5'-oligonukleotyd) [SEQ ID No. 3] oraz AATTAGTCGACCGTTAATTGGGGCCACTGAGGC (3'-oligonukleotyd) [SEQ ID No. 4], 5'-oligonukleotyd przyłącza się w pozycjach 982-1007, a 3'-oligonukleotyd przyłącza się w pozycjach 3523-3555, zgodnie z numeracją dehydrogenazy 6-fosforanu D-glukozy podanej przez T. Noage i M. Johnstona, Gene 96: 161-19 (1990). Chromosomowy DNA wydzielono ze szczepu S. cerevisiae GRF18 metodą opisaną w przykładzie 3. Parametry PCR były takie same jak w przykładzie 3. Amplifikowany fragment DNA zawierający gen ZWF1 strawiono za pomocą Sali i klonowano w pUC 19 strawionym tą samąrestryktazą, uzyskując plazmid pUC(ZWF). Identyczność klonowanego genu potwierdziła analiza restrykcyjna.

Drugi enzym drogi przemiany pentoza-fosforan, dehydrogenaza kwasu 6-fosfoglukonowego, kodowany jest w E. coli przez gen gnd. Sekwencja nukleotydowa tego genu jest znana (M.S. Nasoff i inni, Gene 27:253-264 (1984)). W celu klonowania genu gnd z E. coli chromosomowy DNA wydzielono ze szczepu E. coli HB101 metodą identyczną do zastosowanej przy wydzielaniu DNA Klebsiella terrigena (przykład 1). Oligonukleotydy (GCGAAGCTTAAAAATGTCCAAGCAACAGATCGGCG [SEQ ID No 5] i GCGAAGCTTAGATTAATCCAGCCATTCGGTATGG [SEQ ID No 6]) do amplifikacji PCR genu gnd przeznaczono do amplifikacji tylko kodującego obszaru i wprowadzenia miejsc HindIII bezpośrednio w górę od kodonu inicjowania i bezpośrednio w dół od kodonu stopu. 5'-oligonukleotyd przyłącza się w pozycjach 56-78, a 3'-oligonukleotyd przyłącza się w pozycjach 1442-1468 zgodnie z numeracją dehydrogenazy kwasu 6-fosfoglukonowego podaną przez M.S. Nasoff i innych, Gene 27: 253-264 (1984). Amplifikowany fragment DNA strawiono za pomocą HindIII i zligowano ze strawionym za pomocą Hindlll wektorem pUC19. 10 niezależnych, pozornie identycznych klonów uzyskanego plazmidu pUC(gnd) połączono. Przeprowadzono to w celu uniknięcia ewentualnych problemów związanych z błędami w sekwencjach, które mogły zostać wprowadzone w czasie amplifikacji PCR. Wykonano fuzję obszaru kodowania genu gnd z promotorem ADCI S. cerevisiae i terminatorem transkrypcji przenosząc fragment HindIII o 1,4 kb ze zbioru pUC(gnd) do wektora ekspresji pAAH5 (G. Ammerer, Meth. Enzymol. 101C: 192-203 (1983)). Wykonano transformację szeregu niezależnych klonów uzyskanego plazmidu pAAH(gnd) do szczepu S. cerevisiae GRF18 zgodnie z procedurąz chlorkiem litu (Ito i inni, J. Bacteriol. 153: 163-168 (1983)) i w transformantach oznaczono aktywność dehydrogenazy 6-fosfo-D-glukonianu. We wszystkich transformantach

178 040 aktywność dehydrogenazy 6-fosfo-D-glukonianu szereg razy wyższa niż w nietransformowanym gospodarzu, co wskazuje na to, że przeprowadzić można skuteczną ekspresję bakteryjnej dehydrogenazy 6-fosfo-D-glukonianu w drożdżach. Do dalszych konstrukcji wybrano klon pAAH(gnd) zapewniając największą aktywność w drożdżach. Klonowanie genów ZWF1 i gnd oraz konstrukcję plazmidu pAAH(gnd) przedstawiono na fig. 8 i 8a.

W celu zapewnienia równoczesnej nadekspresji zarówno genów dehydrogenazy 6-fosforanu glukozy jak i dehydrogenazy 6-fosfo-D-glukonianu w osmofilowych drożdżach jako gospodarzu skonstruowano plazmid pSRT(ZG). Sposób wykonania konstrukcji plazmidu przedstawiono na fig. 9. W skrócie kasetę ekspresji dehydrogenazy 6-fosfo-D-glukonianu z plazmidu pAAH(gnd) przeniesionojako fragment BamHI DNA o 3,1 kb do uUC 19 rozciętego za pomocą BamHI. Uzyskany plazmid pUC(ADHgnd) rozszczepiono za pomocą SacI i XbaI, po czym fragment . DNA o 3,1 kb oczyszczano metodą elektroforezy na żelu agarozowym. Fragment ten zligowano równocześnie z dwoma innymi fragmentami DNA: z fragmentem pUC(ZWF) o 2,5 kb, uzyskanym w wyniku trawienia za pomocą SacI i częściowego trawienia za pomocą PstI, oraz z fragmentem wektorowym plazmidu pSRT(AX)-9 (przykład 3) strawionym za pomocąPstI i XbaI. Strukturę uzyskanego plazmidu pSRT(ZG) potwierdzono wykonuj ąc analizę restrykcyjną. Po transformowaniu Z. rouxii ATCC 13356 za pomocąpSRT(ZG) (sposobem opisanym w przykładzie 4) w transformowanym szczepie oznaczono aktywność dehydrogenazy 6-fosforanu D-glukozy i dehydrogenazy 6-fosfo-D-glukonianu. Obydwa enzymy wykazują w przybliżeniu 20 razy wyższe aktywności w szczepie transformowanym niż w nietransformowanym szczepie kontrolnym (tabela 7). Podobne metody można zastosować do uzyskania nadekspresji dwóch genów kodujących enzymy części utleniającej drogi przemiany pentoza-fosforan w innych gatunkach drożdży. Jednak w związku z tym, że brakjest wektorów, które można utrzymywać jako pozachromosomowe plazmidy w większości gatunków drożdży z wyjątkiem Saccharomyces lub Zygosaccharomyces, integracyjna transformacja stanowi jedyny użyteczny sposób w przypadku takich gospodarzy. Korzystny tym wektorów integracyjnych stanowią wektory przeznaczone do integracji w rybosomowym locus DNA, gdyż wektory tego typu zapewniają dużą liczbę kopii integracyjnych i w efekcie wysoki poziom ekspresji (T.S. Lopes i inni, Gene 79: 199-206 (1989)).

Tabela 7

Aktywność dehydrogenazy 6-fosforanu D-glukozy i dehydrogenazy 6-fosfo-D-glukonianu w Z. rouxii ATCC 13356 transformowanym za pomocą pSRT(ZG) i w nietransfonnowanym szczepie kontrolnym (pmole/minutę*mg białka)

Szczep drożdży	Dehydrogenaza D-glukozy-6-P	Dehydrogenaza 6-P-glukonianu
Z. rouxii (nietransformowany)	0,33	0,45
Z. rouxii [pSRT(ZG)]	7,3	7,7

Przykład 9. Konstrukcja mutantów transketolazy w drożdżach

Mutanty transketolazy w drożdżach najdogodniej uzyskać można metodą miejscowo ukierunkowanego rozbicia genu, choć można również wykorzystać znane sposoby mutagenezy chemicznej. W celu zastosowania techniki rozbijania genu zazwyczaj konieczne jest zastosowanie homologicznego genu transketolazy klonowanego z gatunków drożdży, w których mutacja jest pożądana, choć czasami można również zastosować heterologiczny klon z bardzo blisko spokrewnionych gatunków. Sekwencja genu transketolazy z S. cerevisiae jest znana (T.S. Fletcher i I.L. Kwee, biblioteka sekwencji EMBL DNA, ID:SCTRANSK, dostępna pod nr M63302). Wykorzystując taką sekwencję gen transketolazy S. cerevisiae klonowano metodą PCR. Oligonukleotydy AGCTCTAGAAATGACTCAATTCACTGACATTGATAAGCTAGCCG [SEQ. ID No 7] i GGAGAATTCAGCTTGTCACCCTTATAGAATCGAATGGTCTTTTG [SEQ ID No 8] oraz chromosomowy DNA z S. cerevisiae (wydzielony w sposób opisany powyżej) zastosowano do amplifikacji fragmentu DNA zawierającego gen transketolazy. 5'-oligonukleotyd przyłącza się

178 040 w pozycji 269-304, a 3'-oligonukleotyd przyłącza się w pozycji 2271 -2305, zgodnie z podaną numeracją dla transketolazy (T.S. Fletcher i I.L. Kwee, biblioteka sekwencji EMBL DNA, ID:SCTRANSK, dostępna pod nr M63302). Fragment strawiono zapomocąXbaI i EcoRI i przeprowadzono klonowanie w pUC 19 rozszczepionym tymi samymi enzymami. Analiza restrykcyjna uzyskanego plazmidu pUC(TKT) potwierdziła identyczność klonowanego fragmentu DNA. Plazmid ten rozcięto za pomocą BgIII i ClaI i duży fragment DNA oczyszczono metodą elektroforezy na żelu agarozowym. Fragment ten zligowano z dwoma fragmentami DNA wydzielonymi z plazmidu pUT332 (A. Gatiniol i inni, Gene 91: 35-41 (1990)): fragmentem Clal-Pstl zawierającym gen URA3 i część 3' genu oporności na bleomycynę, oraz fragment BamHI-Pstl DNA zawierający promotor drożdżowego TEF1 (czynnika 1 wydłużenia transkrypcyjnego) i część 5' sekwencji kodującej gen oporności na bleomycynę. Po transformowaniu E. coli powyższą mieszaniną ligacyjnąi analizie restrykcyjnej klonów plazmidowych wydzielono plazmid pTKT(BLURA). Plazmid ten zawiera sekwencję kodującą genu transketolazy S. cerevisiae, w której fragment o 90 kb między miejscami ClaI i BgIII zastąpiony został fragmentem pUT332 zawierającym dwa markery rozróżnialne w S. cerevisiae - gen URA3 i gen oporności na bleomycynę pod kontrolą promotora TEF 1 i terminatora transkrypcji CYC 1. Plazmid zastosowano do transformowania szczepu S. cerevisiae DBY746 (ATCC 44773; MATahis3Al leu2-2,112, ura3-52 trpl-289) do uzyskania oporności na fleomycynę (10 pg/ml fleomycyny w pożywce YEPD) metodą z chlorkiem litowym (Ito i inni, J. Bacteriol. 153: 163-168(1983)). Transformanty zbadano pod względem prototropii uracylowej i zdolności wzrostu na D-ksylulozie. Pięć klonów URA3, spośród których 3 wykazywały zmniejszony wzrost na D-ksylulozie, hodowano w 100 ml pożywkach, po czym ekstrakty komórkowe przygotowano w wyniku wytrząsania z kulkami szklanymi i w surowych ekstraktach oznaczono aktywność transketolazy. Test przeprowadzono w buforze, 0,1 M glicylo-glicynie, pH 7,6, zawierającym 3 mM chlorek magnezowy, 0,1 mM pirofosforan tiaminy, 0,25 mM NADh i 0,2 mg/ml albuminy z surowicy bydlęcej. Bezpośrednio przed pomiarem do 1 ml powyższego buforu dodano 3 pl roztworu zawierającego 0,5 M 5-fosforan D-ksylulozy i 0,5 M 5-fosforan rybozy, a następnie 7,5 U izomerazy fosforanu triozy i 1,5 U dehydrogenazy α-gliceofosforanowej (obydwa z Sigma). Reakcję zainicjowano dodając odpowiednią próbkę surowego ekstraktu i śledzono ją rejestrując spadek gęstości optycznej przy 340 nm. Jako próbkę kontrolną zastosowano ekstrakt komórkowy szczepu DBY746. Aktywność transketolazy w surowym ekstrakcie z DBY746 i w dwóch transformantach rosnących w sposób niezakłócony na D-ksylulozie można było łatwo zmierzyć uzyskując około 0,25 U/mg białka. Trzy transformanty o osłabionym wzroście na D-ksylulozie wykazywały aktywność transketolazy poniżej granicy wykrywalności zastosowanej metody (co najmniej 20 razy mniej niż w przypadku szczepu dzikiego). Aktywności dehydrogenazy 6-fosforanu D-glukozy i dehydrogenazy 6-fosfo-D-glukonianu oznaczono również w dla sprawdzenia, czy przy przygotowaniu ekstraktów komórkowych nie nastąpiła dezaktywacja enzymów. Aktywności tych dwóch enzymów były bardzo zbliżone we wszystkich sześciu szczepach. Z tego względu wyciągnięto wniosek, że trzy klony źle rosnące na D-ksylulozie zawierająmutację genu transketolazy. Wzrost szczepów z rozbitym genem transketolazy był również nieznacznie zahamowany w syntetycznej pożywce nie zawierającej aromatycznych aminokwasów, fenyloalaniny i tyrozyny, choć w tym przypadku wpływ był mniejszy niż wpływ mutacji na wykorzystanie D-ksylulozy.

Geny transketolazy z innych gatunków drożdży mogą być dogodnie klonowane w wyniku komplementacji mutacji transketolazowej w szczepach S. cerevisiae opisanych powyżej. Korzystnie klonowanie można przeprowadzić konstruując bibliotekę genów szczepu drożdży nie należących do Saccharomyces w odpowiednim wektorze (np. w dobrze znanym plazmidzie YEpl3), transformując tą bibliotekę do szczepu S. cerevisiae zawierającego mutację transketolazy (np. do mutantów uzyskanych w wyniku rozbicia genu w sposób opisany powyżej) i dokonując selekcji z uwagi na odtworzony wzrost na D-ksylulozie. Plazmidowy DNA można uwolnić z takich D-ksylulozo-dodatnich transformantów i zastosować do transformowania tego samego szczepu biorczego. Wszystkie klony z tej transformacji powinny dobrze rozwijać się na D-ksylulozie. W transformantach można oznaczyć aktywność transketolazy i jej ponowne wystąpienie

178 040 w znacznym poziomie może służyć jako potwierdzenie identyczności klonowanego genu. Dodatkowe i ostateczne potwierdzenie uzyskać można sekwencjonując krótkie odcinki klonowanego DNA i znajdując fragmenty sekwencji homologiczne z sekwencjątransketolazy S. cerevisiae lub wykazując hybrydyzację fragmentu klonowanego DNA z autentycznym klonem transketolazowym z S. cerevisiae. Procedura klonowania może być również oparta na hybrydyzacji DNA jako podstawowej metodzie selekcjonowania klonów zawierających gen transketolazy z biblioteki genów drożdży nie należących do Saccharomyces. Fragment genu transketolazy S. cerevisiae wykorzystać można jako sondę w doświadczeniu hybrydyzacji kolonii lub łysinki, a klony wykazujące silny sygnał hybrydyzacji można dokładniej zanalizować wykonując częściowe sekwencjonowanie.

Ze względu na metodę zastosowaną do klonowania genu transketolazy z wybranych gatunków drożdży następny etap w uzyskiwaniu mutacji w genie transketolazy w tych drożdżach jest taki sam. Klonowany fragment DNA powinien zostać scharakteryzowany poprzez wykonanie częściowej mapy restrykcyjnej oraz korzystnie przez zlokalizowanie kodującego obszaru w genie transketolazy. Następnie kawałek DNA, który może działać jako marker selekcjonujący w wybranych drożdżach wstawia się do fragmentu DNA zawierającego gen transketolazy, nie bliżej niż kilkaset bp od każdego z końców tego fragmentu. Kasetę zawierającąbakteryjny gen fleomycyny pod kontrolą silnego promotora drożdżowego, taką j ak wyżej opisana kaseta z plazmidu pUT332, można np. wykorzystać w przypadku wielu gatunków drożdży jako dominujący selektywny marker. Istotne jest, aby insercję fragmentu DNA zawierającego selekcjonujący marker wykonać w taki sposób, by obszar kodujący gen transketolazy został albo rozbity przez wstawiany DNA, albo, korzystnie, żeby wstawiany fragment DNA zastępował (część) obszaru kodującego. Taką konstrukcję DNA można następnie zastosować do rozbicia chromosomowej kopii genu transketolazy w wybranych drożdżach metodą zbliżoną do metody opisanej powyżej przy wytwarzaniu transketolazowej mutacji w S. cerevisiae. Zastosować można dowolny odpowiedni sposób transformacji, przy czym do korzystnych sposobów należy transformacja protoplastu i elektroporowanie. Selekcję klonów zawierających rozbity gen transketolazy można przeprowadzić w sposób podobny do opisanego powyżej w odniesieniu do S. cerevisiae. Ponadto wykorzystać można analizę struktury chromosomowego obszaru transketolazy metodą hybrydyzacji Southema jako metodę wariantową lub oprócz innych metod.

Przykład 10. Klonowanie genu D-rybulokinazy

Korzystny sposób klonowania genu D-rybulokinazy jest zbliżony do metody opisanej w przykładzie 1 w odniesieniu do klonowania dehydrogenazy D-arabitolowej. Wiadomo, że gen D-rybulokinazy w szeregu bakteriach takich jak E. coli lub Klebsiella aerogenes stanowi część operonu wykorzystania rybitolu (T. Loviny i inni, Biochem. J. 230: 579-585 (1985)). Wiadomo ponadto, że szczepy E. coli B nie zawierają tego operonu i z tego względu nie sązdolne do wykorzystywania rybitolu jako źródła węgla. W związku z tym szczep E. coli B (taki jak zwykłe szczepy laboratoryjne HB101 i JM 103 oraz szczepy, które można transformować z wysoką wydajnością takie jak SCS-1 lub XL1-Blue ze Stratagene) można transformować biblioteką genową bakterii wykorzystujących rybitol, skonstruowaną w dowolnym odpowiednim wektorze, korzystnie w pUC19. Niepatogeniczne gatunki bakterii takie jak Klebsiella terrigena, stanowią korzystne źródło organizmów do wydzielania genu D-rybulokinazy. Następnie można wybrać transformanty E. coli, które sązdolne do rozwoju na minimalnej pożywce zawierającej rybitol jako jedyne źródło węgla. Plazmidowy DNA z takich rybitolo-dodatnich klonów można następnie wydzielić i zastosować do powtórnego transformowania szczepu E. coli B. Wszystkie transformanty po takim powtórnym transformowaniu powinny być zdolne do rozwoju na rybitolu jako jedynym źródle węgla. Następnie wykonać można mapę restrykcyjną klonowanego insertu. Wykorzystując taką mapę przygotować można różne delecyjne pochodne wyjściowego klonu i zanalizować je pod względem zachowania operonu rybitolu przeprowadzając wyżej opisany test działania. Przeprowadzić można szereg kolejnych delecji w celu zmniejszenia wielkości fragmentu DNA przenoszącego operon rybitolu do 3,5-4 kb (wielkość operonu w K. aerogenes). Na koniec ustalić można (częściową) sekwencję nukleotydową genu D-rybulokinazy i zastosować

178 040 do wycięcia obszaru kodującego tego genu wykorzystując odpowiednie występujące w naturze miejsca restrykcyjne lub stosując znane techniki PCR do wprowadzenia takich miejsc. Wykonać można ekspresję genu D-rybulokinazy w innych gospodarzach, korzystnie w drożdżach, metodami obejmującymi standardowe etapy takie jak fuzja obszaru kodującego genu D-rybulokinazy z odpowiednim promotorem i terminatorem transkrypcji, przeniesienie kasety ekspresji do wektora nadającego się do transformowania w wybranym gospodarzu, wytworzenie transformantów i na koniec sprawdzenie wydajności ekspresji D-rybulokinazy.

Przykład 11. Klonowanie i nadekspresja genu D-rybulozo-5-fosforano-3 -epimerazy

Metoda wydzielania homogenicznej D-rybulozo-5-fosforano-3-epimerazy z drożdży piekarskich (drożdże przemysłowe Saccharomyces cerevisiae) jest znana (W.T. Williamson i inni, Met. Enzymol. 9:605-608 (1966)). Enzym można wydzielić, ajegoN-końcowe i częściowo wewnętrzne sekwencje aminokwasów można ustalić ogólnie znanymi sposobami. Te uzyskane częściowe sekwencje aminokwasów można następnie zastosować do generowania metodąokreślanąjako odwrotna translacja sekwencji oligonukleotydów, które można następnie wykorzystać do zainicjowania polimerazowej reakcji łańcuchowej. Fragmenty DNA wygenerowane metodą PCR można zastosować jako sondy hybrydyzacyjne do selekcjonowania biblioteki genów drożdży w aspekcie kopii o pełnej długości genu D-rybulozo-5-fosforano-3-epimerazy. Korzystny sposób wykonania nadekspresji genu D-rybulozo-5-fosforano-3-epimerazy w innych gospodarzach drożdżowych obejmuje klonowanie go w wektorze, który zawiera wielką liczbę kopii w pożądanym gospodarzu (np. w wektorze pSRT303D w przypadku Z. rouxii). Inny i bardziej wydajny sposób wykonania nadekspresji obejmuje ustalenie co najmniej częściowej sekwencji nukleotydowej genu D-rybulozo-5-fosforano-3-epimerazy wokół kodonu startu translacji i wykorzystanie tej informacji do wydzielania sekwencji kodującej gen D-rybulozo-5-fosforano-3-epimerazy i dokonania jego fuzji z promotorem znanym z tego, że wydajnie działa w wybranym gospodarzu.

Przykład 12. Klonowanie genu D-ksylulokinazy i konstruowanie mutantów D-ksylulokinazy

Sposoby klonowania D-ksylulokinazy (EC 2.7.1.17) z różnych gatunków drożdży zostały opisane (N.W.Y. Ho i inni, Enzyme Microbiol. Technol. 11: 417-421 (1989); P.E. Stevis i inni, Applied and Environmental Microbiol. 53: 2975-2977 (1978). Opisano również sposób konstruowania mutacji D-ksylulokinazy w S. cerevisiae przez rozbicie genu (P.E. Stevis i inni, Appl. Biochem. Biotechnol. 20: 327-334 (1989)). Podobne metody wykorzystać można do konstruowania mutantów D-ksylulokinazy w innych drożdżach. W przypadku rodzajów drożdży innych niż S. cerevisiae markerami genetycznymi stosowanymi do rozbijania genu D-ksylulokinazy są korzystnie dominujące markery oporności na antybiotyki (patrz przykład 9). Można także zastosować klasyczne metody konstrukcji mutantów oparte na mutagenezie chemicznej (np. obróbka metanosulfonianem etylu lub akryflawiną) lub fizycznej (promienie nadfioletowe, promienie rentgenowskie). Wzbogacanie w mutant można osiągnąć hodując komórki poddane mutagenezie na D-ksylulozie jako jedynym źródle węgla w obecności antybiotyku (takiego jak nystatyna), który zabija tylko rosnące komórki. Niezdolność mutantów D-ksylulokinazy do wykorzystywania D-ksylulozy jako jedynego źródła węgla przy wzroście wykorzystać można do selekcjonowania mutantów.

Przykład 13. Szczepy wytwarzające ksylitol przez D-arabitol ze zwiększoną wydajnością

W przykładzie 4 opisano sposób konstruowania szczepu drożdży zdolnego do wytwarzania ksylitolu z strukturalnie niespokrewnionych źródeł węgla takich jak D-glukoza według drogi przemiany, w której D-arabitol wykorzystywanyjestjako podstawowy związek pośredni. W celu zwiększenia wydajności ksylitolu w fermentacjach z udziałem szczepu wykorzystującego taką „D-arabitolową drogę przemiany” należy zwiększyć wydajność D-arabitolu. Droga przemiany prowadząca od D-glukozy do D-arabitolu u drożdży wytwarzających D-arabitol została opisana (J.M. Ingram i inni, J. Bacteriol. 89: 1186-1194 (1965)). D-arabitol wytwarzany jest z 5-fosforanu D-rybulozy w wyniku odfosforylowania i redukcji reduktazę D-rybulozową połączoną z NADPH. Powstawanie 5-fosforanu D-rybulozy z 6-fosforanu D-glukozy w dwóch kolejnych nieodwracalnych etapach odwodornienia z udziałem dehydrogenazy 6-fosforany D-glukozy

178 040 i dehydrogenazy 6-fosfo-D-glukonianu stanowi powszechnie występującą drogę przemiany określanąjako gałąź utleniająca drogi pentoza-fosforan (albo bocznik monofosforanu heksozy). W nieutleniającej gałęzi przemiany pentoza-fosforan 5-fosforan D-rybulozy ulega odwracalnej izomeracji do 5-fosforanu D-rybozy i 5-fosforanu D-ksylulozy. 5-fosforan D-rybozy i 5-fosforan D-ksylulozy metabolizowane sąnastępnie przez transketolazę. W związku z tym przeprowadzić można mutację transketolazy w szczepie drobnoustrojowym wytwarzającym D-arabitol, co spowoduje zwiększenie wydajności przemiany 5-fosforanu D-rybulozy w D-arabitol. W przykładzie 9 opisano sposób wytwarzania mutantów transketolazy. Dalsze zwiększenie wydajności D-arabitolu osiągnąć można, gdy zwiększy się maksymalnie szybkość biosyntezy 5-fosforany D-rybulozy w wyniku nadekspresji dwóch genów kodujących enzymy utleniającej gałęzi drogi przemiany pentoza-fosforan w sposób opisany powyżej (przykład 8). Następnie można przeprowadzić transformację szczepów zoptymalizowanych tym sposobem pod względem wydajności D-arabitolu zrekombinowanymi sekwencjami DNA przenoszącymi geny dehydrogenazy ksylitolowej i dehydrogenazy D-arabitolowej (przykłady 3 i 4) uzyskując szczep o zwiększonej wydajności wytwarzania ksylitolu.

Przykład 14. Szczepy wytwarzające ksylitol w innych drogach przemiany

Sposoby przedstawione w przykładach 4 i 13 stanowią najprostsze metody konstruowania szczepów drobnoustrojowych zdolnych do przekształcania D-glukozy i innych źródeł węgla w ksylitol. W metodach tych wykorzystuje się występującą w przyrodzie drogę przemiany prowadzącą do powstawania D-arabitolu z różnych źródeł węgla oraz wydłużenie tej drogi o dwie reakcje przekształcania D-arabitolu w ksylitol. Jednakże droga taka nie stanowi jedynej drogi przemiany. Można również skonstruować inne drogi przemiany prowadzące do ksylitolu jako końcowego produktu metabolizy, nie obejmujące D-arabitolu jako związku pośredniego. I tak drogę przemiany do ksylitolu z tego samego prekursora, 5-fosforanu D-rybulozy można realizować w różnych łańcuchach reakcji. 5-fosforan D-rybulozy można wydajnie przekształcić w 5-fosforan D-ksylulozy za pomocą D-rybulozo-5-fosforano-3-epimerazy (przykład 11), a jeśli zapobiegnie się dalszej konwersji 5-fosforanu D-ksylulozy poprzez mutację genu transketolazy, nagromadzony 5-fosforan D-ksylulozy może zostać odfosforylowany przez tą samą niespecyficzną fosfatazę co 5-fosforan D-rybulozy (M.J. Ingram i inni, J. Bacteriol. 89: 1186-1194 (1965)) i zredukowany do ksylitolu przez dehydrogenazę ksylitolową(przykład 3). Realizacja tej drogi przemiany może dodatkowo wymagać dezaktywacji genu D-ksylulokinazy (przykład 12), aby zmniejszyć straty energii związane z jałowąpętlą5^fosforan D-ksylulozy—> D —>-ksyluloza 5-fosforan D-ksylulozy. Dodatkowa zmiana genetyczna - wprowadzenie i (nad)ekspresja genu D-rybokinazy (EC 2.7.1.47) może zminimalizować równoczesne wytwarzanie D-arabitolu przez takie szczepy wiążąc D-rybulozę wytworzoną przez niespecyficzną fosfatazę. D-rybuloza może zostać z powrotem przekształcona w fosforan D-rybulozy, a następnie w 5-fosforan D-ksylulozy.

Przykład 15. Stabilność zrekombinowanego szczepu Z. rouxii i wytwarzanie ksylitolu w warunkach hodowli w fermentatorze

Stabilność wytwarzania ksylitolu podczas długo prowadzonej hodowli sprawdzono zarówno w selektywnych warunkach (stosując selektywnąpożywkę: YEPD zawierający 50 mg/litr G418 i 30% glukozy) oraz w warunkach nieselektywnych (stosując tą samą pożywkę, ale bez G418). Pojedynczy świeżo otrzymany transformant Z. rouxii ATCC 13356 [pSRT(AX)-9] hodowano w 200 ml YEPD zawierającego G418. Komórki przeniesiono do 50% roztworu gliceryny i zamrożono w porcjach po 1ml w -70°C. 4 zamrożone próbki Z. rouxii [pSRT(AX)-9] zastosowano do zaszczepienia dwóch 50 ml hodowli z selektywną pożywką i dwóch z nieselektywnąpożywką. Po osiągnięcie przez hodowle stacjonarnej fazy wzrostu (50-60 godzin w 30°C przy 200 obrotów/minutę) pobrano próbki w celu oznaczenia zawartości pentytolu metodąHPLC i po 1ml hodowli zastosowano do zaszczepienia kolejnych 50 ml tej samej (selektywnej lub nieselektywnej) pożywki. Cykl wzrost/rozcieńczanie powtórzono jeszcze 4 razy. Warunki w tym doświadczeniu przybliżały rozwój zrekombinowanego szczepu od standardowego zamrożonego materiału inokulacyjnego w fermentatorze w dużej skali. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono w tabeli 8. Zgodnie z przewidywaniami stabilność zrekombinowanego szczepu jest wy178 040 ższa w pożywce selektywnej. Jednakże nawet na pożywce nieselektywnej spadek wydajności ksylitolu można było wykryć dopiero po około 20 pokoleniach. W warunkach selektywnych wytwarzanie ksylitolu przebiegało w sposób stabilny dla około 30 pokoleń.

Próbkę zamrożonego preparatu bazowego transformowanego szczepu Z. rouxii zastosowano do zaszczepienia 2-litrowego fermentatora zawierającego 1 litr pożywki o następującym składzie (na litr): 0,1 g NaCl, 6,8 g fosforanu potasu, 0,5 g siarczanu amonu, 20 g ekstraktu drożdżowego i 400 g glukozy, 50 mg G481, pH 6,0. Warunki hodowli były następujące: szybkość napowietrzania 0,5 objętości/minutę, mieszanie 400 obrotów/minutę, temperatura 30°C.

Na figurze 10 przedstawiono przebieg zużywania się glukozy i nagromadzania się ksylitolu w funkcji czasu fermentacji. Pokazano również stężenie rozpuszczonego tlenu odzwierciedlające zdolność hodowli drożdży do oddychania. Zaobserwowano występowanie pozornie dwufazowego wzrostu: w pierwszej fazie po około 40 godzinach osiągnięte zostaje plateau stężenia glukozy i ksylitolu (w tym momencie zużyta zostaje mniej niż połowa glukozy), natomiast drugą fazę obserwuje się po około 200 godzinach, gdy procesy zużycia glukozy i wytwarzania ksylitolu wyrównują się. Ostateczne stężenie ksylitolu wyniosło 15 g/litr i było prawie dwa razy większe niż stężenia uzyskiwane przy prowadzeniu fermentacji w kolbie. Dwufazowy wzrost ze znacznym okresem indukcji wskazuje, że wybrano spontaniczny mutant (prawdopodobnie wykazujący wyższą tolerancję na alkohol niż szczep macierzysty). W celu sprawdzenia tej hipotezy wydzielono pojedynczy klon z hodowli w punkcie końcowym pracy fermentatora. Izolat ten hodowano w fermentatorze w warunkach takich samych, jak opisane powyżej. Wyniki tego doświadczenia (fig. 11) potwierdziły, że w rzeczywistości wydzielono mutant zdolny do pełnej asymilacji 400 g/litr glukozy w ciągu około 60 godzin. Doświadczenie to wykazało również, że szczep Z. rouxii wytwarzający ksylitol może również przyswajać ksylitol, gdy cała glukoza w ośrodku hodowli zostanie zużyta.

Tabela 8

Stabilność wytwarzania ksylitolu przez szczep Z. rouxii ATCC 13356 [pSRT(AX)-9] w warunkach seryjnej hodowli (g/litr, unormowano w odniesieniu do całkowitej wydajności pentytolu)

	Warunki hodowli
Kolejne rozcieńczenie nr	Hodowla nr	selektywne	nieselektywne
1	1	8,3	8,6
	2	8,9	8,6
2	1	8,9	8,9
	2	8,5	8,4
3	1	8,5	8,3
	2	8,6	8,2
4	1	8,7	8,0
	2	8,6	6,9
5	1	8,6	7,6
	2	8,1	5,6
6	1	7,0	7,0
	2	6,9	2,4

Wszystkie odsyłacze wprowadza się jako źródło literaturowe. Po zapoznaniu się z pełnym opisem wynalazku dla specjalistów zrozumiałe jest, że zakres jego można realizować w szerokim równoważnym zakresie stężeń, parametrów itp. bez naruszenia zakresu wynalazku lub jakichkolwiek jego rozwiązań.

178 040

Zestawienie sekwencji (1) Informacja ogólna (i) Zgłaszający

Anu M. Harkki Andrey N. Myasnikov Juha H.A. Apajalahti Ossi A. Pastinen (ii) Tytuł wynalazku: Sposób wytwarzania ksylitolu (iii) Liczba sekwencji: 8 (iv) Adres do korespondencji:

(A) Adresat:

(B) Ulica:

(C) Miasto:

(D) Stan:

(E) Kraj:

(f) Kod pocztowy (ZIP):

(v) Postać odczytywana komputerowo:

(A) : Typ nośnika: dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM (c) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: PatentIn Release # 1,0, wersja # 1.25 (vi) Dane dotyczące obecnego zgłoszenia (A) Numer zgłoszenia: PCT (będzie przyznany) (B) Data zgłoszenia: równocześnie (C) Klasyfikacja (vi) Dane dotyczące wcześniejszego zgłoszenia:

(A) Numer zgłoszenia: US 08/110 672 (B) Data zgłoszenia: 24 sierpnia 1993 (vi) Dane dotyczące wcześniejszego zgłoszenia:

(A) Numer zgłoszenia: US 07/973 325 (b) Data zgłoszenia: 05 listopada 1992 (viii) Informacje o rzeczniku/pełnomocniku (A) Nazwisko (B) : Numer rejestracyjny (C) Numer sprawy u rzecznika (ix) Informacji o łąccności:

(A) Telefon:

(B) Telefaks:

(2) Informacja dotycząca sekwencji nr 1 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 28 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: obojętna (D) Topologia: obojętna (xi) Opis sekwencji: SEQ ID No. 1:

CGAATTCTAG ACCACCCTAA GTCGTCCC

178 040 (2) Informacja dotycząca sekwencji nr 2 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 29 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: obojętna (D) Topologia: obojętna (xi) Opis sekwencji: SEQ ID No. 2:

TTCAAGAATT CAAGAAACTC ACGTGATGC (2) Informacja dotycząca sekwencji nr 3 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 26 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: obojętna (D) Topologia: obojętna (xi) Opis sekwencji: SEQ ID No. 3:

CAGGCCGTCG ACAAGGATCT CGTCTC (2) Informacja dotycząca sekwencji nr 4 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 33 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: obojętna (D) Topologia: obojętna (xi) Opis sekwencji: SEQ ID No. 4:

AATTAGTCGA CCGTTAATTG GGGCCACTGA GGC (2) Informacja dotycząca sekwencji nr 5 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 35 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: obojętna (D) Topologia: obojętna (xi) Opis sekwencji: SEQ ID No. 5:

GCGAAGCTTA AAAATGTCCA AGCAACAGAT CGGCG 35 (2) Informacja dotycząca sekwencji nr 6 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 34 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: obojętna (D) Topologia: obojętna (xi) Opis sekwencji: SEQ ID No. 6:

GCGAAGCTTA GATTAATCCA GCCATTCGGT ATGG (2) Informacja dotycząca sekwencji nr 7 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 44 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: obojętna (D) Topologia: obojętna

178 040 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID No. 7:

AGCTCTAGAA ATGACTCAAT TCACTGACAT TGATAAGCTA GCCG 44 (2) Informacja dotycząca sekwencji nr 8 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 44 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: obojętna (D) Topologia: obojętna (xi) Opis sekwencji: SEQ ID No. 8:

GGAGAATTCA GCTTGTCACC CTTATAGAAT CGAATGGTCT TTTG 44

- sekwencje bakteryjne O terminator transkrypcji

Λ/γη 2μ DNA ^{ADC 1} i Promotor ADC 1 I I Gen LEU 2

1¾aen dehydrogenazy arabitolowej

FIG. 2

178 040

Μ

Ο

4J •Η •ο ϋ

m ο

LU

<0 ·Η C ·π -η υ

178 040

FIG. .4

178 040

EcoRI SacI Smal Apal Xbal Scal

HindIII

FIG .5 kb

178 040

178 040 σ

c

σ ε

to ο

σ to

CC ο

UJ _ο s<—

U178 040

2uDNA

178 040

5' oligo

3'- oligo chromosomowe DNA S. cerevisiae

PCR

Soli i_

Soli

I pUCI9 amplifikowany fragment DNA

kb

FIG. 8

178 040

5' oligo

3'-oligo chromosomowe DMA Escherichia coli

Hindlll

PCR

Hindlll amplifikowany fragment DNA

Hindlll fragment o 1,4 kb pUC19

Hindlll

Hindlll, fragment o 1,4 kb pAAH5Hindlll

BomHI

FIC5. 8A

178 040

(Λ

CL

FIG. 9

178 040

Glukoza (g/l)

178 040

Glukoza (g/L)

Czas (h) (g/l)

FIG. 11

178 040

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (23)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania ksylitolu przez zrekombinowanego gospodarza polegający na genetycznym modyfikowaniu natywnego organizmu, prowadzeniu hodowli tego organizmu, oraz izolowaniu ksylitolu, znamienny tym, że:

   (a) drobnoustrojowego gospodarza produkującego arabitol transformuje się DNA kodującym dehydrogenazę D-arabitolu (EC 1.1.1.11) i ewentualnie DNA kodującym dehydrogenazę ksylitolu (EC 1.1.1.9);

   (b) hoduje się zrekombinowanego gospodarza z etapu (a) wykorzystując jako źródło węgla D-heksozy takie jak: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza, lub ich mieszaniny, lub polimer lub oligomer zawierający takąD-heksozę, lub D-arabitol, etanol lub glicerol, uzyskując jako produkt ksylitol; oraz (c) wydziela się ksylitol wytworzony w etapie (b).
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że arabitol stanowi związek pośredni w wymienionej drodze przemian.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że natywnego gospodarza stanowią drożdże wytwarzające arabitol lub grzyb wytwarzający arabitol.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że inaktywuje się aktywność D-ksylulokinazy (EC 2.7.1.17) gospodarza.
5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że inaktywuje się aktywność transketolazy (EC 2.2.1.1) gospodarza.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inaktywuje się aktywność transketolazy (EC 2.2.1.1) i D-ksylulokinazy (EC 2.7.1.17) gospodarza.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że drożdże wybrane są z grupy obejmującej Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha, Torulopsis candida, Pichia farinosa i Torulospora hansenii, a grzyby wybrane są z grupy obejmującej Dendryphiella salina i Schizophyllum commune.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako drożdże stosuje się Zygosaccharomyces rouxii.
9. 9. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy zdolny do produkcji ksylitolu wykorzystujący jako źródło węgla D-heksozy takie jak: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza, lub ich mieszaniny, łub polimer lub oligomer zawierający takąD-heksozę, lub D-arabitol, etanol lub glicerol, transformowany DNA kodującym dehydrogenazę D-arabitolu (EC 1.1.1.11) i ewentualnie DNA kodującym dehydrogenazę ksylitolu (EC 1.1.1.9).
10. 10. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 9, znamienny tym, że aktywność D-ksylulokinazy (EC 2.7.1.17) została zinaktywowana.
11. 11. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 9, znamienny tym, że aktywność transeketolazy (EC 2.2.1.1) została zinaktywowana.
12. 12. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 22, znamienny tym, że aktywności D-ksylulokinazy (EC 2.7.1.17) i transketolazy (EC 2.2.1.1) zostały zinaktywowane.
13. 13. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 9, albo 10, albo 11, albo 12, znamienny tym, że natywnego gospodarza drobnoustrojowego stanowią drożdże wytwarzające arabitol lub grzyb wytwarzający arabitol.
14. 14. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 13, znamienny tym, że drożdże wybrane są z grupy obejmującej Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha, Torulopsis candida, Pichia farinosa i Torulospora hansenii, a grzyby wybrane są z grupy obejmującej Dendryphiella salina i Schizophyllum commune.

    178 040
15. 15. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 14, znamienny tym, że drożdże stanowi Zygosaccharomyces rouxii.
16. 16. Sposób wytwarzania ksylitolu przez gospodarza drobnoustrojowego polegający na genetycznym modyfikowaniu natywnego organizmu, prowadzeniu hodowli tego organizmu, oraz izolowaniu ksylitolu, znamienny tym, że (a) hoduje się drobnoustrojowego gospodarza transformowanego genem kodującym dehydrogenazę ksylitolową (EC 1.1.1.9); dehydrogenazę D-glukozo-6-fosforanową (EC 1.1.1.44), 3-epimerazę D-rybulozo-5-fosforanową (EC 5.1.3.1) i/lub D-rybulokinazę (2.7.1.47), wykorzystując jako źródło węgla D-heksozy takie jak: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza, lub ich mieszaniny, lub polimer lub oligomer zawierający takąD-heksozę lub D-arabitol etanol lub glicerol, uzyskując jako produkt ksylitol; oraz (b) wydziela się ksylitol wytworzony w etapie (a).
17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że jako gospodarza drobnoustrojowego stosuje się gospodarza z inaktywowaną aktywnością transketolazy (EC 2.2.1.1).
18. 18. Sposób według zastrz. 16, albo 17, znamienny tym, że jako gospodarza drobnoustrojowego stosuje się gospodarza z inaktywowaną aktywnością ksylulokinazy (EC 2.7.1.17).
19. 19. Sposób według zastrz. 17, albo 18, znamienny tym, że jako gospodarza drobnoustrojowego stosuje się gospodarza transformowanego genem kodującym niespecyficzną fosfatazę katalizującą defosforylację D-ksylulozofosforanu do D-ksylulozy.
20. 20. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy zdolny do produkcji ksylitolu wykorzystujący jako źródło węgla D-heksozy takie jak: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza, lub ich mieszaniny, albo polimer lub oligomer zawierający taką D-heksozę, albo etanol lub glicerol, transformowany genem kodującym dehydrogenazę ksylitolową (EC 1.1.1.9), dehydrogenazę D-glukozo-6-fosforanową (EC 1.1.1.49), dehydrogenazę 6-fosfo-D-glukonianową EC 1.1.1.44), D-rybulozo-5-fosforano-3-epimerazę (EC 5.1.3.1), i/lub D-rybulokinazę (EC 2.7.1.47).
21. 21. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 20, znamienny tym, że aktywność transketolazy (EC 2.2.1.1) została zinaktywowana.
22. 22. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 20 albo 21, znamienny tym, że aktywności D-ksylulokinazy (EC 2.7.1.17) została zinaktywowana.
23. 23. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 20, albo 21, znamienny tym, że gospodarz jest transformowany genem kodującym niespecyficzną fosfatazę katalizującą defosforylację D-ksylulozofosforanu do D-ksylulozy.

    Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania ksylitolu i zrekombinowanego gospodarza drobnoustrojowego. Ogólnie wynalazek dotyczy genetycznie zmodyfikowanych drobnoustrojów do wytwarzania użytecznych związków chemicznych (inżynierii metabolicznej), a w szczególności konstruowania szczepów drobnoustrojowych na drodze manipulacji genetycznej, tak że sąone zdolne do przekształcania łatwo dostępnych źródeł węgla takich jak D-glukoza w cenniejszy produkt, np. ksylitol.

    Ksylitol jest związkiem chemicznym o poważnym znaczeniu jako specjalny środek słodzący. Jest on w przybliżeniu tak słodki jak sacharoza, nietoksyczny i nie jest rakotwórczy. Obecnie ksylitol wytwarza się w wyniku chemicznego uwodornienia D-ksylozy. D-ksylozę uzyskuje się z hydrolizatów różnych materiałów roślinnych, w których zawsze występuje ona w mieszaninie z innymi pentozami i heksozami. Oczyszczanie ksylozy, a także ksylitolu stanowi w związku z tym znaczny problem. Znanych jest szereg sposobów tego typu. Przykładowo wymienić można procesy ujawnione w opisach patentowych USA nr 3 784 408, 4 066 711,

    4 075 406 i 4 008 285.

    Redukcję D-ksylozy do ksylitolu można również przeprowadzić na drodze mikrobiologicznej z wykorzystaniem szczepów naturalnych (M.F.S. Barbosa i inni, J. Industrial Microbiol. 3:241-251 (1988) lub szczepów uzyskanych metodami inżynierii genetycznej (J. Hallbom i inni,

    178 040

    Biotechnology 9:1090-1095 (1991)). Jednakże uzyskanie substratu, D-ksylozy w postaci odpowiedniej do przeprowadzenia fermentacji drożdżowej stanowi również poważny problem, gdyż tanie źródła ksylozy takie jak ług siarczynowy z produkcji pulpy i papieru, zawierąjązanieczyszczenia, które inhibitują rozwój grzybów.

    Cennym alternatywnym sposobem wytwarzania ksylitolu byłoby wytwarzanie go na drodze fermentacji taniego i łatwo dostępnego substratu, takiego jak D-glukoza. Jednakże nie sąznane drobnoustroje, które wytwarzają w znacznych ilościach ksylitol w czasie jednostopniowej fermentacji dowolnego znanego źródła węgla, innego niż D-ksyloza i D-ksyluloza, które są strukturalnie bardzo zbliżone do ksylitolu.

    Z drugiej strony wiele drobnoustrojów, zwłaszcza drożdży osmofilowych, np. Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha i Torulopsis candida, wytwarzają znaczne ilości bardzo zbliżonego pentytolu, D-arabitolu z D-glukozy (D.H. Lewis i D.C. Smith, New Phytol. 66: 143-184 (1967)). Wykorzystując taką właściwość drożdży osmolitycznych H. Onishi i T. Suzuki opracowali sposób przekształcania D-glukozy w ksylitol na drodze trzech kolejnych fermentacji (Appl. Microbil. 18:1031-1035 (1969)). W procesie tym D-glukozę przekształca się najpierw w D-arabitol na drodze fermentacji ze szczepem drożdży osmolitycznych. Następnie D-arabitol utlenia się do D-ksylulozy w wyniku fermentacji z Acetobacter suboxydans. Na koniec D-ksylulozę redukuje się do ksylitolu w trzeciej fermentacji z wykorzystaniem jednego z wielu szczepów drożdży zdolnych do redukowania D-ksylulozy do ksylitolu.

    Oczywistą wadą takiego sposobu jest to, że obejmuje on 3 różne etapy fermentacji, z których każdy trwa 2-5 dni; konieczne sąponadto dodatkowe etapy takie jak sterylizacja i usuwanie komórek, co zwiększa koszty procesu. Wydajność etapu fermentacji jest niska, a ilość produktów ubocznych jest znaczna. W związku z tym w dalszym ciągu istnieje zapotrzebowanie na sposoby opłacalnego wytwarzania ksylitolu przez układy mikrobiologiczne z łatwo dostępnych substratów.