TR201808404T4 - Bir rekombinant suş aracılığıyla glikozdan ksilitol üretimi. - Google Patents

Bir rekombinant suş aracılığıyla glikozdan ksilitol üretimi. Download PDF

Info

Publication number
TR201808404T4
TR201808404T4 TR2018/08404T TR201808404T TR201808404T4 TR 201808404 T4 TR201808404 T4 TR 201808404T4 TR 2018/08404 T TR2018/08404 T TR 2018/08404T TR 201808404 T TR201808404 T TR 201808404T TR 201808404 T4 TR201808404 T4 TR 201808404T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
xylitol
specific
arabitol
ohmeri
nadph
Prior art date
Application number
TR2018/08404T
Other languages
English (en)
Inventor
Defretin Sophie
Gerard Tania
Heysen Arnaud
schaefer Astrid
Diefenbacher Melanie
Chang Yiming
HONDA MALCA Sumire
Schwab Markus
THOR Friederike
Original Assignee
Roquette Freres
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roquette Freres filed Critical Roquette Freres
Publication of TR201808404T4 publication Critical patent/TR201808404T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01009—D-Xylulose reductase (1.1.1.9), i.e. xylitol dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/0101—L-Xylulose reductase (1.1.1.10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01011—D-Arabinitol 4-dehydrogenase (1.1.1.11)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Mevcut buluş, ksilitol üretimine yönelik rekombinant bir mikrobiyal konak ile ilgilidir, rekombinant mikrobiyal konak substrat olarak D-arabitol kullanan ve ürün olarak D-ksiluloz üreten bir NAD + -spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz (EC 1.1.1.11) kodlayan bir nükleik asit dizisi ve substrat olarak D-ksiluloz kullanan ve ürün olarak ksilitol üreten bir NADPH- spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan bir nükleik asit dizisi içerir.

Description

TARIFNAME BIR REKOMBINANT sus ARACILIGIYLA GLIKOZDAN KSILITOL ÜRETIMI Bulus Sahas: Mevcut bulus ksilitolün üretimine yönelik genetigi degistirilmis mikroorganizmalar kullanFmTta dair bir yöntem ve bir adFmda kolay bir sekilde temin edilebilen D-glikoz gibi karbon kaynaklarîiü ksilitole dönüstürebilen genetigi degistirilmis bir mikroorganizmanît hazIIanmasIia dair bir yöntem ile ilgilidir. Bulusun Altyapßü Ksilitol, hijyen ve nutrasötik formülasyonlar ve ürünlerde uygulamalara sahip olan, (CHOH)3(CH20H)2 formülünün bir polialkol ve seker alkolüdür (alditol). Ksilitol, yaklasik olarak sakkaroz kadar tatli iolan %33 daha az kaloriye sahip diyabetik bir tatlandinici olarak kullan Iin. Diger dogal veya sentetik tatlandinicilarn aksine, ksilitol düzenli kullanimda tasiyiolarl Iüçte bire azaltma aracliglyla dis saglig. için etkin bir sekilde yararm T ve remineralizasyona yard rmcm T. Ksilitol, birçok meyve ve sebzenin liflerinde dogal olarak düsük konsantrasyonlarda bulunur ve mBI kabugu ve seker kamßEküspesi ve hus agacügibi fibröz materyalin yanßîa çesitli yumusak meyveler, yulaflar ve mantarlardan özütlenebilir. Ancak, endüstriyel üretim ksiloza hidrolizlenen ve katalitik olarak ksilitole hidrojenlenen, sert agaçlar veya mîsl koçanlarIidan özütlenen ksilandan (bir hemiselüloz) baslar. Ksiloz ve ayr ca ksilitolün saflastrlmas dolaysyla büyük ölçüde bir sorun ortaya olarak bahsedilebilir. D-ksilozun ksilitole indirgenmesi ayrI3a dogadan (dogal sus suslar[)] izole edilen maya suslarüveya genetigi degistirilmis suslar kullanEtarak mikrobiyolojik bir proseste elde edilebilir. Ancak, kagt hamuru ve kagiti proseslerinden sülfit likörü gibi pahali iolmayan ksiloz kaynaklaaniLm maya büyümesini inhibe eden safszlklar içermesi nedeniyle maya fermentasyonuna yönelik uygun bir formda substratini, D-ksilozun, elde edilmesi bir sorundur. Ksilitolün üretimine yönelik cazip bir alternatif yöntem, D-glikoz gibi ucuz ve kolay bir sekilde temin edilebilen substratît fermantasyonu aracmîggila elde edilmesidir. Teknigin durumunda, D-ksiloz ve D-ksiluloz haricinde yaygît herhangi bir karbon kaynagnîi tek-admilübir fermantasyonu sîasîida belirli miktarlarda ksilitol üretebildigi açklanan birkaç rekombinant mikroorganizma mevcuttur. Bu rekombinant mikroorganizmalar, özellikle ozmofilik mayalar, örnegin Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha ve Toru/opsis candida baslang çta D- glikozdan D-arabitol olan pentitol ile yak ndan iliskili bir ksilitolün kaydadeger miktarlariri n üreticileri olarak bilinir (Lewis D.H. & Smith D.C., 1967, New Phytol. 66:143-184). Dolayßjila uluslararas: patent basvurusu WO 94/10325 D-ksiluloz veya D-ksiloz haricinde ve bunlarli polimerileri veya oligomerleri veya karSEhlarjharicinde karbon kaynaklarEi üzerinde büyümesi durumunda ksilitol üretebilen bu tür rekombinant konaklarîi olusturulmaslia yönelik yöntemler saglar. Mevcut patent basvurusunda, bu amaç istenen heterolog genlerin yerlestirilmesi ve ifade edilmesi araCJJgS/Ia istenen mikroorganizmann tercihen dogal olusumlu bir maya mikroorganizmasnmi metabolizmasnLni modifikasyonu aracUJgLyla elde edilir. Bu amaç ayrica dogal halindeki bu tür mikroorganizmaya homolog olan belirli genlerin aktivitesi veya ifadesini asini iifade etmek ve/veya etkisizlestirmek amaciyla bu tür istenen mikroorganizmann metabolizmasin n daha fazla modifikasyonu araciligiyla Ksilitol üretimine yönelik bu patent basvurusunda saglanan yöntem degistirilmis bir D- arabitol biyosentez yolunu kullanmgstî ve bu tür yol, D-ksiluloz olusturan D-arabitol dehidrojenaz:(EC 1.1.1.11) ve ksilitol dehidrojenazlia (EC 1.1.1.9) yönelik kodlama yapan genlerin bir D-arabitol üreten mikroorganizmaya yerlestirilmesi ve as rI [ifadesi araciligiyla önceden mevcut olan D-arabitol yolunun genisletilmesi aracLLLgLyla büyük oranda degistirilmistir. Ancak, WO 94/10325 içinde açlklanan deneylerdeki ksilitol verimi, maya ekstraktlîia sahip bir ortam içinde 48 saatlik yetistirme akabinde yalnmca yaklask olarak 7.7 g/l olmustur. Bu birinci sonucu optimize etmeye çalßmak üzere, WO 94/10325 içinde mutajenez veya gen bozulmasükullanttarak transketolaza (EC 2.2.1.1) yönelik kodlama yapan genler ve/veya D-ksilulokinaza (EC 2.7.1.17) yönelik kodlama yapan genin etkisizlestirilmesi ve ayria pentoz-fosfat yolunun oksidatif dal" enzimlerine yönelik kodlama yapan genlerin ve spesifik olarak bu tür mikroorganizmalar içindeki D-glikoz-6- fosfat dehidrojenaz (EC 1.1.1.49) ve/veya 6-fosfo-D-glukonat dehidrojenaz (EC 1.1.1.44) ve/veya D-ribuloz-S-fosfat epimeraz geninin (EC 5.1.3.1) as rl !ifade edilmesi önerilmistir. Ancak, hangi genetik kombinasyonun kullanildrgrl fark etmeksizin, ksilitol titresi herhangi bir zaman 9 g/I'den fazla olmamßtl. ve ksilulokinaZIi aktarIdgDgenetigi degistirilmis bir maya olan Pischia stipitis'ten izole edilen NADP'ye spesifik ksilitol dehidrojenazLÜa yönelik bir geni açklar. Dolayls yla, bunun üretimini optimize etmek ve böylece bunu ticari olarak faydal lhale getirmek amaciyla ksilitol üreten suslarln daha iyi bir genetik manipülasyonuna yönelik giderilmemis bir ihtiyaç mevcuttur. Bulusun K_sa Agklamasn Mevcut bulus ksilitol üretebilen bir rekombinant konak hücre ile ilgilidir, burada söz konusu konak hücre asagidaki unsurlari içerir: substrat olarak D-arabitol kullanan ve ürün olarak D-ksiluloz üreten bir NAD+- spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz (EC 1.1.1.11) kodlayan heterolog bir nükleik asit dizisi; ve substrat olarak D-ksiluloz kullanan ve ürün olarak ksilitol üreten bir NADPH- spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan heterolog bir nükleik asit dizisi. Tercihen, konak hücre tek bir karbon kaynagDolarak D-arabitolü tüketmez. Daha çok tercih edildigi üzere, konak hücre bakteri, mantar ve mayadan seçilir. Tercih edilen bir düzenlemede, konak hücre ozmofilik veya ozmotolerant bir maya, özellikle Pichi'a ohmerfdir. Tercihen, NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz (EC 1.1.1.11) E. coli'"dendir. Daha çok tercih edildigi üzere, NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz (EC 1.1.1.11) SEQ bir dizi içerir veya bundan olusur. Tercih edilen bir düzenlemede, NAD+-spesifik D- veya bundan olusur. Tercihen, NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz, NADH ila NADPH araslida kofaktör özgüllügünün degistirilmesine yönelik mutasyona ugratIan Pichia stipi'ti's veya Gluconobacter oxydans"dan bir ksilitol dehidrojenazdl. Daha çok tercih edildigi üzere, NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz SEQ ID No 5 veya 8'in dizisini veya amino asitlerin 1-3 eklemesi, sübstitüsyonu veya delesyonu ile bir dizi içerir veya bundan olusur. Tercih edilen bir düzenlemede, NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazLlkodlayan dizi, SEQ ID No 6 veya 9`un dizisini içerir veya bundan olusur. Tercihen, konak hücre 48 saatlik bir kültür akabinde süpernatant içinde en az 15 g/I'Iik bir ksilitol titresi üretebilir. Mevcut bulus ayrEta istemler 1-13'ten herhangi birine göre bir rekombinant konak hücre kültürlenmesi ve ksilitolün geri kazanmnasmEiçeren, ksilitol üretilmesine yönelik bir yöntem ile ilgilidir. Ek olarak, mevcut basvuru SEO ID No 1, 3, 7 ve 9'dan olusan gruptan seçilen bir nükleik asit dizisini içeren veya bundan olusan bir nükleik asit, söz konusu nükleik asidi içeren bir ifade kaseti veya vektörünü aç klar. Son olarak, mevcut bulus ksilitol üretilmesine yönelik mevcut bulusa göre bir rekombinant konak hücrenin kullanmîrile ilgilidir. Bulusun DetayFAgiklamasiT Tan mnlar Burada kullanIdgDüzere, "D-ksiloz ve D-ksiluloz haricinde bir karbon kaynagü ile D- ksiloz ve D-ksiluloz veya bunun polimerleri veya oligomerleri veya karLSLnnlarLi(örnegin ksilan ve hemiselüloz) haricinde ksilitol üretimine yönelik bir karbon substratl !ifade edilir. Karbon kaynagi !tercihen D-glikoz ve çesitli D-glikoz içeren suruplarl ive D- glikozun diger sekerler ile karls mlarinii içerir. Burada kullan Tdgiîüzere, "gen" ile bir proteine yönelik kodlama yapabilen bir nükleik asit dizisi, özellikle bir DNA dizisi ifade edilir. Burada kullanIdEgDüzere, "vektör" ile bir konak hücreye genetik bilgi, spesifik olarak DNA'yDtasÜabilen bir plazmid veya herhangi bir diger DNA dizisi ifade edilir. Vektör ayrîia vektör ile aktarIan hücrelerin tanEnlanmasna kullanEna yönelik uygun bir markör veya raportör ve bir veya daha fazla prokaryotik veya ökaryotik konaklarda vektörün korunmasüve replikasyonunu saglayan replikasyon kökenlerini içerir. Bir dairesel DNA olan bir vektördür. Burada kullanlldlg üzere, "ifade vektörü" ile bir vektöre benzeyen ancak, bir konaga transformasyonu akabinde, buna klonlanan bir gen veya kodlama yapan nükleik asidin ifadesini destekleyen bir vektör ile ifade edilir.KIonlanan gen veya kodlama yapan nükleik asit genellikle vektör aracmgýla veya klonlanan genin rekombinant yapßü aracmggrla saglanabilen, promotör dizileri gibi belirli kontrol dizilerinin kontrolü aItÜJia yerlestirilir (diger bir deyisle çalßabilir bir sekilde baglanl). Ifade kontrol dizileri, vektörün bir prokaryotik veya ökaryotik konakta çalßabilir bir sekilde baglîgeni ifade etmek üzere tasarlanlp tasarlanmad glrta bagl olarak degisecektir ve ek olarak arttlnlci l elemanlar gibi transkripsiyonel elemanlar_ (aks yukaru aktivasyon dizileri) ve sonlandlnma dizileri ve/veya translasyonel baslatma ve sonlandlnma alanlarini! lçerebilir. Burada kullanTdgFlüzere, "konak" ile rekombinant materyalin alml'srlveya tasl'ycßm olarak kullanilan prokaryotik veya ökaryotik bir hücre ifade edilir. Burada kullanühtgüüzere, "Pentoz-Fosfat Yolunun Oksidatif Dalü ile D-glikoz-ö-fosfat dehidrojenaz (EC 1.1.1.44) aracltggla katalizlenen reaksiyonlar gibi oksidatif reaksiyonlar: katalizleyen ve pentoz fosfatlar: olusturmak üzere heksoz substratlarü kullanan pentoz-fosfat kese yolunun parçasiüiçerdigi ifade edilir. Pentoz- fosfat yolunun (bu ayrca D-glikozdan net riboz olusumunu katalizler) "oksidatif olmayan" fosfat-3-epimeraz (EC 5.1.3.1) ve transaldolaz (EC 2.2.1.2) aracllg yla katalizlenen reaksiyonlar gibi oksidatif olmayan izomerizasyonlar ile karakterize edilir. Bakinilz Biological Chemistry, H.R. Mahler & E.H.Cordes, Harper & Row, publishers, New York, Burada kullanEIdEgDüzere, "kodlama yapan nükleik asit" ile bir nükleik asit molekülü (tercihen DNA) ifade edilir. Kodlama yapan nükleik asit bir proteini kodlayabilir ve birçok kaynaktan hazllanabilir. Bu kaynaklar genomik DNA, CDNA, sentetik DNA ve bunlarîi kombinasyonlarnjçerir. Burada kullanIdEgD üzere, "heterolog" bir gen veya kodlama yapan dizinin genetik mühendisligi aracuLglyla hücreye yerlestirilmesini ifade ettigi anlaslm. Bu, epizomal veya kromozomal formda mevcut olabilir. Gen veya kodlama yapan dizi yerlestirildigi konak hücreden farkl .bir kaynaktan meydana gelebilir. Ancak, bu ayrica yerlestirildigi konak hücre ile ayni ltürden gelebilir fakat dogal olmayan ortami !nedeniyle heterolog olarak düsünülür. Örnegin, kendi dogal promotörü olmayan bir promotörün kontrolü altîîda olmas: kendi dogal konumundan farkljbir konumda yerlestirilmesi nedeniyle, gen veya kodlama yapan dizi heterolog olarak refere edilir. Konak hücre heterolog genin yerlestirilmesi öncesinde genin endojen bir kopyasnüiçerebilir veya endojen bir kopya içermeyebilir. Bulusun amacl'l Bulusa göre, spesifik bir mikrobiyal konagin dogal metabolik yollar ksilitol üretimi haricindeki amaçlara yönelik karbon kullanim nl !azaltmak veya ortadan kaldirmak amacFyla manipüle edilir. Bu tür bir genetigi degistirilmis konak susu böylece yüksek bir verim ile bir fermantasyon adEhîtda ksilitol üretebilir. Örnegin, süpernatant içinde 48 saatlik kültür akabinde ksilitol titresi 15 g/I'den fazladl. Bulusun pratik uygulamaslida, bulusun genetigi degistirilmis konagiayrEta, yalnlca D- ksiloz ve/veya D-ksilulozdan olmamak üzere D-glikoz gibi yapßal olarak iliskili olmayan karbon kaynaklaanidan ksilitol sentezleme yetenegi ile karakterize edilir. Tercihen, bulusun genetigi degistirilmis konagi layr ca sentezlenen ksilitolü ortama salgilayabilir. Spesifik olarak, örneklendirilen ve tercih edilen düzenlemelerde, bulusun genetigi degistirilmis konagüarabitolün ksilitol olusumunda bir ara ürün oldugu bir yol ile karakterize edilir. Buna göre, bulusun rekombinant konak susu asagîzlaki genetik degisimler ile karakterize edilir: (1) NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktaz (D-ksiluloz-olusturma) aktivitesine sahip bir proteini kodlayan heterolog bir nükleik asit konak hücreye yerlestirilmistir - böylece D-arabitolün D-ksiluloza dönüsümü saglanin; ve (2) NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz aktivitesine sahip bir proteini kodlayan heterolog bir nükleik asit konak hücreye yerlestirilmistir - böylece D-ksilulozun ksilitole dönüsümü saglan r. Mikroorganizmalarüii secimi Mevcut bulusa yönelik uygun mikroorganizmalar veya konak suslarüglikozdan D- arabitol üretebilir. Daha özellikle, bunlar yüksek ozmotik basinç ortam' altinda glikozdan kaydadeger miktarlarda D-arabitol üretebilir. glikoz içeren ortam-refere etmek amaçlanm. bir mikroorganizma veya konak susun yglîji kosullarîida %25 D-glikoz içeren bir ortam içinde 100g/L D-arabitol üretmesi durumunda bir mikroorganizma veya konak susun kaydadeger miktarlarda D-arabitol ürettigi düsünülür. Glikozden kaydadeger miktarlarda D-arabitol üretebilen konak sus örnekleri, ozmofilik veya ozmotolerant mayalar'+ özellikle Pichia, Kodamaea, Candida, Zygoaccharomyces, Debaromyces, Metschni'kowia ve Hansenu/a türlerine ait olanlari;l veya D-arabitol üreten mantarlari,i özellikle Dendiyphie/Ia ve Schizophy/Ium türlerine ait olanlari, özellikle Dendryphiella salina ve Schizophyllum commune'yi içerir. Pichia cinsi mikroorganizmalarm örnekleri Pichi'a ohmeri', Pichia stipitis, Pichi'a farinosa, Pichia hap/ophila'yü içerir. Candid& cinsi mikroorganizmalarîi örnekleri Candida polymorpha ve Candida tr0pi'calis'i içerir. Zygoaccharomyces cinsi mikroorganizmalarîii örnekleri Zygoaccharomyces rouxii'yi içerir. Diger örnekler Torulopsi's candida ve Torulaspora hansen/i'yi içerir. Metschnikowia cinsi mikroorganizmalarn örnekleri Metschnikowi'a pulcherrima, Metschnikowia reukaufi'i', Metschnikowi'a bicuspidata, Metschni'kowi'a Iunata ve Metschnikowia zobellii'yi içerir. Spesifik suslar olarak, Metschnikowi'a zobe/Iii' ATCC 22302 ve Metschnikowia pulcherrima FERM BP- 7161"den bahsedilebilir. Bu suslar, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu'ndan elde Devletleri. Metschni'kowia pulcherrima FERN BP-7161 orijinal olarak, tevdi numarasi 1 Enstitüsü, Endüstriyel Bilim ve Teknoloji Ajansü Uluslararasü Ticaret ve Endüstri Japonya) tevdi edilmistir ve 15 Mayß 2000'de Budapeste Antlasmasmia baglüolarak orijinal tevdisinden uluslararasEltevdiye aktarImîstI ve tevdi numarasîFERM BP-7161 olarak tevdi edilmistir. Spesifik bir aç da, mikroorganizma erisim numarasi IFERM BP- Mikroorganizmann, D-arabitol üretme kapasitesini arttinmak ve/veya ksilitol üretiminden ayerir amaca yönelik D-arabitol kullanma kapasitesini azaltmak amacýla genetigi degistirilebilir. Bulusa yönelik olarak, konak sus avantajIZbir sekilde spesifik metabolik özellikleri aractligwla seçilir: - bu, yukarîja detaylandIIdEgD üzere, özellikle yüksek ozmotik basliç ortam: örnegin %10-60 D-glikoz ve tercihen %25 D-glikoz içeren ortam altIida glikozdan kaydadeger miktarlardaki D-arabitolün bir üreticisi olabilir ("Normal" ortam genellikle - bu, tek bir karbon kaynagi olarak D-arabitol tüketmeyebilir; - bunun redoks dengesi, karsillk gelen ketopentoz/pentoz alkol dönüsümüne yönelik gereken kofaktörlerin olusumunu saglar. Bulusun bir düzenlemesinde, ozmofilik maya Pichia ohmeri (ve bunun mutajeneze ugrayan türevleri) bir model ve tercih edilen bir konak olarak kullanmnßtl. Pichia ohmeri' baslanggta salataltß tuzlu suyunda izole edilmistir ve yaygmi olarak tursular, kabuklar ve meyvelerin fermentasyonuna yönelik gida endüstrisinde kullanmnßtl. Pichia, Zygosaccharomyces, Debaromyces ve Hansenula gibi maya türlerinin, Saccharomyces cerevisiae'nli aksine düsük su aktivitesi olan ortamlarda büyüyebildigi teknikte uzman bir kisi taraanidan bilinir. Bu ozmotolerant veya ozmofilik mayalar, enzimleri koruyan ve dengeleyen gliserol, D-arabitol, eritritol ve manitol gibi uygun çözünen madde biriktirir, böylece ozmotik büyüme kosullar nda hücresel fonksiyonlari l saglar. Üretilen polioller ayr ca redoks dengelemesinde bir rol oynar. Tercih edilen bir açEla, mikroorganizma Pichia ohmeri'dir. AsIIida, konak sus Pichia ohmeri 'nin ana karakteristigi, gliserol ve D-arabitol üreten Zygosaccharomyces rouxii'nin aksine uygun çözünen madde olarak yalnâca D-arabitol üretmesidir. Ek olarak, glikozdan D-arabitole metabolik yol Pichia ohmeriâde iyi bilinir. Zygoaccharomyces rouxii'de (J.M.INGRAM and W.A.WOOD, 1965, Journal of ak si,i iki NADPH molekülünün beraberinde gelen üretimi ile D-Glikozu D-ribuloz-5-P`ye dönüstürmek üzere Pentoz-Fosfat Yolunun (PPP) oksidatif parças ndan geçer. D- ribuloz-5-P, D-ribuloza defosforile edililir ve akabinde D-arabitole indirgenir. Pichia ohmeri'de konak susunda, Pentoz Fosfat Yolu (PPP) oldukça aktiftir ve %507den fazla oldugu saptanm :stl Redoks reaksiyonlarlîlve enzim/eri Bir reaksiyondan digerine elektronlarît tasýmmar: olarak söz konusu redoks reaksiyonlarIida islev gösteren kofaktörler NADH ve NADPH, birçok biyolojik fonksiyon için gereklidir. Termodinamik bir itici kuvvet saglamak üzere NADPH/NADP+ çiftinin, NADH/NAD+ çiftinden daha fazla indirgenmis bir halde korundugunun farkinda olunarak, hücrelerin iki redoks çifti NADH/NAD* ve NADPH/NADP+'nin metabolik dengesini korumasi gerekir. Çogunlukla oksitlenmis form NAD+ halinde bulunan NADH, besinlerden oksidatif enerji sallm na dahil oldugu katabolik reaksiyonlarda ana ko- faktördür. NADH'm aksinde, NADPH yalnFZca anabolik reaksiyonlarda veya oksidatif stres anlarlida yeniden oksitlenir. Redoks reaksiyonlari :içeren herhangi bir metabolik mühendislik stratejisi bu hücresel kßttlamalar altlida fonksiyon göstermek zorundadl. Bu, bulusun amacîolan genetigi degistirilmis susta gerçeklestirilmistir. Bulusçu tarafidan bulundugu üzere, özellikle "Contribution a I'étude du metabolisme des pentitols chez Pichia ohmeri" (Sophie Huchette, University of Sciences and Technics of Lille, 1992) baslikli iPhD Tezi içinde, ketopentozlarin oksidoredüksiyonuna dahil edilen reaksiyonlar n iki farkli Enzim taraf ndan katalizlendigi gösterilmistir. Böylece, konak sus D-ribulozdan D-arabitol olusturan ve D-ksilulozdan ksilitol olusturan, bir NADPH-spesifik D-ketopentoz-oksidoredüktaz olarak tanmîlanan bir enzime sahiptir. Konak sus ayrEa smasüla D-ribuloz ve D-ksilulozdan ribitol ve ksilitol olusturan bir NADH-spesifik D-ketopentoz-oksidoredüktaza sahiptir. Bu enzim, Pichia stipi'tis'ten (XYL2) iyi bilinen NAD+-spesifik ksilitol dehidrojenaz E.C 1.1.1.9'a yaklid I. D-ksilulozun aksine yalnîca intraselüler D-ribulozun temin edilebilmesi nedeniyle, konak sus NADPH/NADP+ redoks çiftini dogrudan D-ribulozdan D-arabitolün sitosolik olusumu aracuLgLyla NADPH'nin yeniden oksidasyonu ile dengeler. Akabinde, D- arabitol bir pasif difüzyon vasitas yla s vi besiyerine salg Ianin. Bulusçular Pichia ohmeri"nin NADH- veya NADPH-spesifik-D-ketopentoz- oksidoredüktaz vasitasyla bu polioli üretmek üzere tüm enzimatik araçlara sahip olmasîhalinde dahi, intraselüler D-ksilulozdeki eksikligin konak sus aracIEgSirla ksilitol üretimi olmamasîia yönelik temel neden olacagîitbulmustur. Aslîida, sitosolik D-arabitolün D-ksiluloz ve NADH'ye dönüstürülmesini saglayan NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktaz (D-ksiluloz-olusturma) aktivitesine (E.C.1.1.1.11) sahip bir proteini kodlayan bir geni, dogal sus konak susu Pichi'a ohmerfye klonlanmak seçilmistir. Böylece, intraselüler D-ksiluloz genetigi degistirilmis susta mevcut hale getirilir ve intrinsik NADH- ve NADPH-spesifik-D-ketopentoz-oksidoredüktaz arac Iigvyla azaltlabilir. Ancak, sus D-ksilulozü etkili bir sekilde ksilitole dönüstürebilen endojen enzimlerden yoksundur. Dolaysza, heterolog bir ksilitol dehidrojenazmyerlestirmek amaciýla susun genetigini degistirmek gereklidir. Patent WO 94/10325 içinde, ksilitol üretimi saglanarak ve önceki metabolik adjn aracmgwla üretilen NADH oksidasyonu ile NADH/NAD+ redoks çifti dengelenerek, Pichia stipitis'ten (XYL2) NAD+-spesifik Ksilitol dehidrojenazj(E.C 1.1.1.9) klonlamak tercih edilmistir. Ancak daha önce belirtildigi üzere, sonuçlar gerçekten tatmin edici degildir. Bulusçular, NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaza sahip mutasyona ugramis bir proteini kodlayan bir genin klonlanmas araciligiyla, D-ribulozdan D-arabitolün intrinsik üretimi araciligiyla gerçeklestirildigi gibi NADPH/NADP+ redoks çiftini dengelemek üzere D- ksilulozun ksilitole dönüstürüldügünü bulmustur. NADPH-spesifik D-ketopentoz-oksidoredüktazli D-arabitole yönelik düsük afinitesi nedeniyle, Pichia ohmeri dogal tip konak sus ekstraselüler D-arabitolü tüketmez. Genetigi degistirilmis susa bir NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksid0redüktaz (D-ksiluloz- olusturma) aktivitesinin yerlestirilmesi nedeniyle, sN' besiyeri içinde üretilen D-arabitol sitosolik D-arabitol ile ayn ;sekilde degistirilmis sus tarafmidan iyi bir sekilde tüketilebilir. Sonuç olarak, ksilitol intraselüler ve ekstraselüler D-arabitolden ayn zamanda üretilir. Bunun üretimi, araci? D-arabitolün dßarlýa aktarilmasmidan tamamen kaçmimak amaciyla ksilitol yolu genislemesinin etkinliginin arttltlmasüaraclgýla arttltlabilir. Böylece, D-glikozdan yalnâca D-arabitol ile ayn: fizyolojik etkiye sahip ksilitol üretilebileoektir. Bu gelisme genetik modifikasyonlarît, ayrßa kültür kosullarliîi adaptasyonunun sonucu olabilir. Konak susta klonlanacak iki enzimatik aktivitenin seçimi Bu iki enzimatik aktivitenin seçimi, yukarida açlklandigiiüzere bunlarin kofaktör özgüllügü ile desteklenir. Birinci enzim D-arabitolü D-ksiluloza oksitler. Iki tip D-arabitol dehidrojenaz bilinir: D-ksiluloz-olusturan (EC 1.1.1.11) (D- arabinitol:NAD+ 4-0ksidoredüktaz) ve D-ribuloz-olusturan (EC 1.1.1.250). Aksi belirtilmedikçe, burada ifade edilen D-ksiluloz-olusturan arabitol dehidrojenazdl ve burada arabitol dehidrojenaz olarak refere edilir. D-ribuloz-olusturan dehidrojenazlar dogal sus mayalarda ve mantarlarda bulunur. D-ksiluloz-olusturan arabitol dehidrojenaz baslLcta bakterilerde bilinir. Örnegin, bunlar Enterobacteriaceae, özellikle E. coli, Klebsieila aerogenes ve Aerobacter aerogenes susu PRL-R3, Gluconobacter oxydans ve ek olarak ayrioa Pichia stipitis içinde tan mlanmjst r. Özellikle, Klebsiella pneumoniae (# 052720), Raistonia solanacearum (# P, E. coli (# tabanlida refere edilir. Mevcut bulusun amaçlarmia yönelik, Escherichia coli, NAN-spesifik D-arabitol 4- oksidoredüktaz (D-ksiluloz-olusturma) geninin tercih edilen kaynagII. Daha spesifik olarak, bunun amino asit dizisi SEQ ID No 2 içinde aç klanin. Özellikle, SEQ lD No'lar 1 ve 3 Escherichia Gol/"nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksxidoredüktazLikodIayan nükleik asitleri aç klar. Kodlama dizisi, bunun kodon Özgüllügü göz önüne aliriiarak Pichia ohmeri'ye yönelik optimize edilmistir. Ikinci enzim D-ksilulozu ksilitole dönüstürür. Çogu maya ve mantarîi endojen bir ksilitol dehidrojenaz (EC 1.1.1.9) genine sahip olmasîia ragmen, bunlarli NADH'den NADPH'ye kofaktör özgüllügündeki degisim mevcut bulusun uygulanmasna yönelik gereklidir. AslIida, mevcut bulus bir kilit noktasü bir NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kullanmaktI. Ek olarak, bu enzim tercihen konakta asIEifade edilir. Birçok ksilitol dehidrojenaz bilinir ve birkaç bilimsel makale kofaktör özgüllügünün NADH'den NADPH'ye nasili degistirilecegini açiklar. Watanabe et al (J; Biol. Chem.i dizisi SEQ ID No 5'te açiklan I. Bir NADPH kofaktör özgüllügüne sahip Gluconobacter oxydans'mi (D38S/M39R) ksilitol dehidrojenazîimi bir ikili mutantü Ehrensberger et al No 8'de açI NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan Pichia sti'piti's XYL2 nükleik asit dizisinin mutasyonu ve klonlanmas: bulusçular tarafmdan hazIIanmßtI. Özellikle, SEO ID No'lar 4 ve 6 Pichia stipiti's'in spesifik NADPH ksilitol dehidrojenaznukodlayan nükleik asitleri açiklar. Alternatif olarak, bulusçular ayrica NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan Gluconobacter oxydans nükleik asit dizisinin mutasyonu ve klonlamas riii i gerçeklestirmistir. Özellikle, SEQ ID No'lar 7 ve 9 Gluconobacter oxydans'ît NADPH`ye spesifik ksilitol dehidrojenazîiükodlayan nükleik asitleri açiklar. Kodlama dizisi, bunun kodon özgüllügü göz önüne almiarak Pichia ohmeri'ye yönelik optimize edilmistir. Ifade kaseti, vektör ve rekombinant konak hücre Belirli bir açda, mevcut açmlama SEQ ID No 1, 3, 7 ve 9'dan olusan gruptan seçilen Pichia ohmeri 'ye yönelik optimize edilen bir kodlama dizisini içeren bir nükleik asit ile Ayriîta bu, SEQ ID No 1, 3, 7 ve 9'dan olusan gruptan seçilen Pichia ohmeri "ye yönelik optimize edilen bir kodlama dizisini içeren bir nükleik asidi içeren bir ifade kaseti ile Bu ayrEa SEQ lD No 4'ün nükleik asit yapßîve söz konusu nükleik asit yapßnüçeren bir nükleik asit ile ilgilidir. Ek olarak, bir rekombinant vektör, özellikle söz konusu nükleik asit veya ifade kasetini içeren bir ifade vektörü ile ilgilidir. Genel olarak, bir ifade kaseti bir proteine gen transkripsiyonu ve translasyonuna yönelik gerekli tüm elemanlari içerir. Özellikle bu, bir promotör, istege bagli olarak bir arttin ci,i bir transkripsiyon sonland nioi ive translasyona yönelik elemanlari i içerir. Daha özellikle, NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazini ifadesini kontrol etmek üzere kullaniian promotör kuvvetli bir ifadeyi yönlendirmek üzere seçilir. AsIIida, bu enzim tercihen konak hücrede asî: ifade edilir. Bu tür promotörler teknikte iyi bilinir. Örnegin, promotör P. ohmeri ribuloz redüktaz promotörü (poRR) veya P. ohmeri fosfogliserat kinaz (poPGKl) olabilir. Bu, bir rekombinant vektör, özellikle bir NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktaz kodlayan bir nükleik asit ve NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan bir nükleik asit içeren bir ifade vektörü ile ilgilidir. Bu ayrma, bir rekombinant vektör, özellikle bir NAV-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz kodlayan bir nükleik asit içeren bir ifade vektörü ve bir rekombinant vektör, özellikle NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan bir nükleik asit içeren bir ifade vektörü içeren bir kit ile ilgilidir. Tercihen, söz konusu NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksid0redüktaz ve NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz yukarmia açiklanan enzimler arasmdan seçilir. Özellikle, söz konusu NAV-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktaz, SEQ ID No 2'nin bir amino asit dizisini veya amino asitlerin 1-3 eklemesi, sübstitüsyonu veya delesyonu ile bir dizi içerir veya bundan olusur. Özellikle, söz konusu NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz, SEQ ID No 5 veya 8'in bir amino asit dizisini veya amino asitlerin 1-3 eklemesi, sübstitüsyonu veya delesyonu ile bir dizi içerir veya bundan olusur. Tercih edilen bir vektör bir plazmiddir. Uygun plazmidler teknikte uzman kisiler tarafndan iyi bilinir ve örnegin Örneklerde spesifik olarak açlklananlar arasndan seçilebilir. Bulusun genetigi degistirilmis konagEilk olarak uygun promotörlerin kontrolü altnda NAD*-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz ve NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaza yönelik kodlama yapan genlerin bir rekombinant vektöre klonlanmasEaracmggila üretilir ve transformasyon araCJJgîyla D-arabitol üreten organizmann konak hücrelerine yerlestirilir. Mevcut bulus bir NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktaz (EC 1.1.1.11) kodlayan heterolog bir nükleik asit dizisi ve bir NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan heterolog bir nükleik asit dizisi içeren rekombinant veya genetigi degisen bir konak hücre ile ilgilidir. NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksid0redüktaz, substrat olarak D-arabitol kullanin ve ürün olarak D-ksiluloz üretir. NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz, substrat olarak D-ksiluloz kullanm ve ksilitol üretir. NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz ve NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktaz kodlayan dizi epizomal olabilir veya konak hücrenin kromozomu ile birlestirilebilir. AslIida, genetik olarak stabil transformantlar tercihen bir vektör kullanan transformasyon sistemleri aracmgßlla olusturulur, böylece istenen bir DNA konak kromozomu ile birlestirilir. Bu tür birlesme hücre içinde yeniden meydana gelir veya kromozomlardaki DNA dizilerinin birlesmesini gelistiren DNA elemanlarîile, fonksiyonel olarak kendisini konak kromozomuna ekleyen bir vektör ile transformasyon araclgjila desteklenebilir. Konak hücre yukarida detaylandlnllan mikroorganizmalar aras ndan seçilir. Tercih edilen bir düzenlemede, konak hücre Pichia ohmerfdir. Mevcut bulus ksilitol üretilmesine yönelik bir kültür ortam nda rekombinant veya genetigi degisen konak hücrenin kültürlenmesi ve üretilen ksilitolün yeniden kazanmnasîiüiçeren bir yöntem ile ilgilidir. Tercihen, kültür ortamü uygun karbon kaynagüile mikroorganizmayüsaglar. Karbon kaynagütercihen D-glikoz ve çesitli D- glikoz içeren suruplarîve D-glikozun diger sekerler ile karîsmnlarîiüiçerir. Yöntem ayrCa ksilitolün bir saflast rma ad mini` içerebilir. Bu tür genetigi degistirilmis suslar arac Ilg yla üretilen ksilitol, teknikte bilinen herhangi bir teknige göre bulusun konaklarlnn ortamindan saflastinllabilir. Örnegin, buraya referans ile eklenen US 5,081,026 ksilitolün maya kültürlerinden kromatografik aermasFriFaçiRlar. Böylece, fermantasyon admnmdan, ksilitol US 5,081,026 içinde açklandgü üzere kromatografik admnlar, akabinde kristalizasyon kullanmarak kültür ortammidan saflastlmabilir. Bulusun diger karakteristik özellikleri ve avantajlarüasagßlaki Örneklerin okunmasü üzerine belirgin olacakti. Ancak bunlar, burada yalnîca bir açklama olarak saglanl ve en Ilandmîzüdegildir. Sekiller ve diziler Sekil 1: 12 ABYWMP: Yaninda Ascl ve Sphl restriksiyon alanlarlrli m bulundugu E. colilden sentezlenen NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazin restriksiyon haritasi? Sekil Za: Iig7.78: Pichia stipiti's'ten NADH-spesifik ksilitol dehidrojenazm restriksiyon haritasi] Sekil 2b: 12AALQTP: Yari Iida Hindlll ve Sacll restriksiyon alanlarIiIi bulundugu Pichi'a stipi'tis'ten sentezlenen NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz. Sekil 3: 13AAYSYP: Yanîida Ascl ve Sphl restriksiyon alanlarmît bulundugu Gluconobacter oxydans"tan sentezlenen NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazm restriksiyon haritasD Sekil 4: YanLnida örtüsme PCR'sini kullanan bir poRR promotörü ve sonlandinicisi ibulunan bir açik okuma çerçevesinden olusan bir ifade kasetinin Sekil 5: 12 AAMCJP: Yan nda HindIII ve Sacll restriksiyon alanlarini n bulundugu Pseudomonas cichorii'den sentezlenen tagatoz-B-epimerazim restriksiyon haritasü Sekil 6: poLEU2 ve poURA3 seçim markörleri ile P, ohmeri mekik vektörlerinin Sekil 7: pEVE2523: Yannda bir P. ohmeri ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve sonland rcisirii'n bulundugu Pseudomonas cichorii'nin tagatoz-S- epimeraszmi açU& okuma çerçevesini içeren klonlanmLs bir ifade kaseti ile, P. ohmeri poURA3 ifade vektörü pEVE2523,ün restriksiyon haritasi.! Sekil 8: pEVE2560: Yaninda bir P. ohmeri ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve sonland Tîzßl'riît bulundugu Pseudomonas cichorii'nin tagatoz-S- epimerazmil'rl açik okuma çerçevesini içeren klonlaans` bir ifade kaseti ile, P. ohmeri' poLEU2 ifade vektörü pEVE2560Üi restriksiyon haritasü Sekil 9: Gluconobacter oxydans NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaziîi asîü ifadesine yönelik bir P. ohmeri vektörünün olusumu. Sekil 10: pEVE3284: Yanîida bir P. ohmeri ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve sonlandîîzßliîi bulundugu Gluconobacter oxydans'ît NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazîiü içeren klonlanmîs bir ifade kaseti ile, P. ohmeri' pEVE3284 ifade vektörünün restriksiyon haritasLJ Sekil 11: Pichia sti'pi'tis NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazini as r› ifadesine yönelik bir P. ohmeri' vektörlerinin olusumu. markörü ile yaninda bir P. ohmeri ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve sonlandmmßmm bulundugu Pichia stipitis'in NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazîtü içeren klonlanmîs bir ifade kaseti ile, P. ohmeri pEVE2562/pEVE2564 ifade vektörlerinin restriksiyon haritasi Sekil 13: Pichia stipiti's NADH-spesifik ksilitol dehidrojenazli asî: ifadesine yönelik bir P. ohmeri' vektörünün olusumu. Sekil 14: pEVE2563: Yanîida bir P. ohmeri ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve sonlandlliîzßm bulundugu Pichia stipiti's'in NADH-spesifik ksilitol dehidrojenaZIiEiçeren klonlanmß bir ifade kaseti ile, P. ohmeri pEVE2563 ifade vektörünün restriksiyon haritasLJ Sekil 15: Bir poURA3 seçim markörü kullan larak P. ohmeri ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve sonlandlnlcini n kontrolü altinda E. coli NAV-spesifik D- arabitol 4-oksidoredüktazmi asini iifadesine yönelik bir P. ohmeri vektörünün Sekil 16: pEVE2839: Yan Itda bir P. ohmeri ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve sonlandlmîsmili bulundugu E. Coli'nin NAN-spesifik D-arabitol 4- oksidoredüktazmüiçeren klonlanmß bir ifade kaseti ile, P. ohmeri pEVE2839 ifade vektörünün restriksiyon haritasü Sekil 17: Bir poURA3 seçim markörü kullanilarak P. ohmeri' fosfogliserat kinaz (poPGK1) promotörü ve transketolaz (poTKL) sonland r"ClSl Ikontrolü altinda E. coli NAV-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktazm asLIJLiifadesine yönelik bir P. ohmeri vektörünün olusumu. Sekil 18: pEVE promotörü ve ribuloz redüktaz (poRR) sonlandmmêmm bulundugu E. coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktazmýiçeren klonlanmS bir ifade kaseti ile, P. ohmeri pEVE3102 ifade vektörünün restriksiyon haritas: Sekil 19: pEVE promotörü ve bir transketolaz (poTKL) sonlandîîzßüve bir poURA3 seçim markörünün bulundugu E. co/i'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktazDD içeren klonlanmS bir ifade kaseti ile, P. ohmeri pEVE3123 ifade vektörünün restriksiyon haritasü Sekil 20: Bir poLEU2 seçim markörü kullanilarak P. ohmeri fosfogliserat kinaz (poPGK1) promotörü ve transketolaz (poTKL) sonland r'ClSl Ikontrolü altinda E. 001/ NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksid0redüktazin asini iifadesine yönelik bir P. ohmeri' vektörünün olusumu. Sekil 21: pEVE promotörü ve bir transketolaz (poTKL) sonlandmmil ve bir poLEU2 seçim markörünün bulundugu E. coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktazhü içeren klonlant bir ifade kaseti ile, P. ohmeri' pEVE3157 ifade vektörünün restriksiyon haritasD DIZI LISTESI SEQ ID Açmlama Yanlida Ascl ve Sphl restriksiyon alanlarliîî bulundugu E. coli'den NAD+- spesifik D-arabitol 4-oksid0redüktazrkodlayan dizi E. Gol/"den NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktazn amino asit dizisi E. Gol/"den NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktaz kodlayan dizi Yaninda Hi'ndlll ve Sacll restriksiyon alanlar nlni bulundugu Pichi'a stipitis'ten NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazi kodlayan dizi SEO ID Açmlama P. stipitis'ten NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazîi amino asit dizisi 6 Pichia stipitisiten NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazjodlayan dizi 7 Yanlida Ascl ve Sphl restriksiyon alanlarînli bulundugu Gluconobacter oxydans"tan NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz] kodlayan dizi 8 Gluconobacter oxydans'tan NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazin amino asit 9 Gluconobacter oxydans'tan NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazH kodlayan Pseudomonas cichori'i' ST24'ün tagatoz-B-epimerazît:kodlayan dizi 11 Pseudomonas cichorii ST24'ün tagatoz-S-epimerazîim amino asit dizisi ÖRNEKLER Örnek 1. Genetik mühendisligine vönelik tercih edildigi üzere bir Pichia ohmeri susunun seçimi Konak susu seçimi olarak, Pichi'a ohmeri': yüksek ozmotik basliç ortamü örnegin %10-60 D-glikoz ve tercihen %25 D-glikoz içeren ortam alt nda glikozdan kaydadeger miktarlardaki arabitolün bir üreticisidir ("Normal" ortam genellikle %2-3 glikoz içerir.) gerekli kofaktörlerin olusumunu saglayan bir redoks dengesine sahiptir. Performanslarlîlmi bir açklamasHolarak, asagmaki tablo Pichfa ohmeri'nin arabitolün metabolik yoluna dahil olan enzim aktivitelerini gösterir (Sophie HUCHETTE Thesis, 1992) Heksoz Monofosfat Yolu:GIikoz-ö-P ila D-Ribuloz-5-P ve D-Ksiluloz-5-P PPPlnin, ayrßa Heksoz Monofosfat Yolu (HMP) olarak adlandlman oksidatif parçasÇ NADPH üreten yoldur. GIikoz-G-P dehidrojenaz (E.C.1.1.1.49) ve 6-P-Glukonat dehidrojenaz (E.C.1.1.1.44) olan iki NADP+-bagmnlüenzim, 1 mol D-ribuloz-5-P içinde 1 mol glikoz-G-P'nin oksidasyonuna kat Un ve 2 mol NADPH olusturur. P. ohmeri ATCC 20209'da Heksoz Monofosfat Yolu Enzim/er Spesifik aktivite U/mg NADP+ GGP dehidrojenaz 1.5 NADP+ 6PG dehidrojenaz 0.55 Bir birim enzim aktivitesi, ham ekstrakt n mLtsi bas;` na dakika bas na 1 pmol NAD(P)H veya NAD(P)+'nm tüketimi olarak tanînlanmrstm Bir birim spesifik aktivite, ham ekstraktaki proteinlerin mg'si basima bir birim enzim aktivitesi olarak tan m/anm st r. Asagmlaki enzimlerin kinetik parametreleri belirlenmistir: D-ribuloz-5-P 3-epimeraz (E.C fosfatazlar (EC. 3.1.3.2). P. ohmeri ATCC 20209ida substrat olarak D-Ribuloz-5-P kullanan enzimlerin kinetik parametreleri Enzim/er KM mM VM U/mg D-Riboz-5-P keto-izomeraz 0.35 1.8 Asit fosfataz 4.3 0.65 Bir birim enzim aktivitesi, ham ekstraktîi mL'si basîia dakika basî'ra 1 pmol NAD(P)H veya NAD(P)+,nm tüketimi olarak tanm/anmßtm Bir bir/`m spesifik aktivite, ham ekstraktaki proteinlerin mg'si basima bir birim enzim aktivitesi olarak tan m/anm st r. P. ohmeri ATCC 20209*da substrat olarak D-Ksiluloz-S-P kullanan enzimlerin kinetik parametreleri Enzim/er KM mM VM U/mg P. ohmeri ATCC 20209`da substrat olarak D-Ksiluloz-S-P kullanan enzimlerin kinetik parametreleri Enzim/er KM mM VM U/mg D-Ribuloz-5-P 3-epimeraz 6.6 0.7 Transketolaz (D-riboz-5-P) 0.2 0.9 Transketolaz (Eritroz-4-P) 0.6 1.45 Asit fosfataz 16 0.1 1 Bir birim enzim aktivitesi, ham ekstratin mLjsi baslna dakika bas na 1 pmol NAD(P)H veya NAD(P)+'n`n tüketimi olarak belirlenmistir. Bir birim spesifik aktivite, ham ekstraktaki proteinlerin mg'si basima bir birim enzim aktivitesi olarak tan mlanm st r. transketolizasyon vasîaswla PPP'nin oksidatif olmayan parçaslîia etkili bir sekilde girer. Sonuç olarak, D-ksiluloz-S-P, D-ksiluloza defosforilasyonuna yönelik mevcut degildir. NADH ve NADPH spesifik D-Ketopentoz-oksidoredüktazlar D-Ribuloz ve D-Ksiluloz, D-Ribuloz-S-P ve D-Ksiluloz-S-P'nin defosforilizasyonu araciliglyla üretilir. Michaelis-Menten sabitleri, her bir substrata ve karsilik gelen maksimum h zlara yönelik NADH ve NADPH-D-ketopentoz-oksidoredüktazlar n afinitelerine dikkat çeker. P. ohmeri ATCC 20209'un NADH-spesifik D-ketopentoz-oksidoredüktaz nini kinetik parametreleri Substrat KM mM VM U/mg D-Ribuloz 90 1 Ribitol 16 0.16 D-Ksiluloz 5 0.6 P. ohmeri ATCC 20209'un NADH-spesifik D-ketopentoz-oksidoredüktazIiIi kinetik parametreleri Substrat KM mM VM U/mg KsiIitol 7 0.2 Bir birim veya enzim aktivitesi, ham ekstratm mL'si basma dakika basma 1 pmol NAD(P)H veya NAD(P)+'nIn tüketimi olarak belirlenmistir. Bir birim spesifik aktivite, ham ekstraktaki proteinlerin mg'si basmia bir birim enzim aktivitesi olarak tan mlanm sti ri. Sras yla D-ribuloz ve D-ksilulozdan ribitol ve ksilitol olusturan NADH-spesifik D- ketopentoz-oksidoredüktaz, D-ksiluloza yönelik D-ribulozdan daha yüksek afinite gösterir. Ters reaksiyon, bu iki poliol üzerindeki konak susun iyi büyümesini açiklayarak ksilitol ve ribitole yönelik iyi bir afinite gösterir. P. ohmeri ATCC 202095un NADPH-spesifik D-ketopentoz-oksidoredüktazTim kinetik parametreleri Substrat KM mM VM U/mg D-Ribuloz 72 3.4 D-Arabitol 1300 0.8 D-Ksiluloz 262 1.5 KsiIitoI 200 0.15 Bir birim enzim aktivitesi, ham ekstraktîi m1_ 'si basîia dakika basîia 1 ,umol NAD(P)H veya NAD(P)+'nm tüketimi olarak tanînlanmßtm. Bir birim spesifik aktivite, ham ekstraktaki proteinlerin mg'si basma bir birim enzim aktivitesi olarak tanînlanmgstî. D-ribulozdan D-arabitol ve D-ksilulozdan ksilitol olusturan NADPH-spesifik D- ketopentoz-oksidoredüktaz, D-ribuloza yönelik D-ksilulozdan daha yüksek bir afinite gösterir. Ters reaksiyon, bu poliol üzerinde konak susun büyümemesini aç klayarak D- arabitole yönelik oldukça düsük bir afinite gösterir. Konak sustan iki ketopentoz-oksidoredüktaz, Ingram and Wood, 1965 (Journal of önceki enzimlerden farki` olarak karakterize edilmistir. Asl nda, Saccharomyces rouxii'de, D-ribuloz ve NADHide herhangi bir ileri reaksiyon saptanmamLstLij ve NADPH ile D-arabitolde bir geri reaksiyon saptanm st r. Haldane iliskisi i'n vivo enzim kinetik davran SIarFrli ?Öngörün Haldane sabitlerinin belirlenmesi: NADH-spesifikD-Ketopentoz-oksidoredüktaz SubstratIÜrün Keq mil/f1 D-RIbuIOZ/Ribitol 78 D-KSIIUIOZ/KSIIIIOI 104 Haldane sabitlerinin belirlenmesi: NADPH-spesifikD-Ketopentoz-oksidoredüktaz SubstratlÜrün Keq mll/r1 D-Ribuloz/D-Arabitol 104 D-KSIIUIOZ/KSIIIIOI 24 Iki enzim geri reaksiyon (pentitol indirgemesi) yerine ileri reaksiyonu (D-ketopentoz oksidasyonu) tercih eder. Konak sustaki PPP oldukça etkilidir ve 2 mol NADPH tüketilen 1 mol glikozdan olusturulur. Sonuç olarak, NADPH anabolik reaksiyonlar ve sürdürme reaksiyonlarln'n her ikisine yönelik fazla miktarda mevcut olacaktin. Konak sus, NADPH/NADP+ redoks çiftini dengelemek üzere D-ribulozdan D-arabitol veya D-ksilulozdan ksilitol üretmek zorundadin. NADPH-spesifik D-ketopentoz-oksidoredüktaz üzerinde NADP+ inhibitör etkisi in vitro olarak belirlenmistir. NADPhnIi fazla eklenmesi durumunda aktivite %80 daha azdl. Bu konsantrasyonun intraselüler NADP* konsantrasyonu ile uyumlu olmamasühalinde dahi, bu sonuç NADPH-spesifik D-ketopentoz oksidoredüktazn NADPH/NADP+ redoks çiftinin dengesindeki rolünün genel bir degerlendirmesini verir. D-ksiluloz-5-P'nin PPP'nin oksidatif olmayan parças na girmesinden dolay ' D- ksilulozun mevcut olmamasü nedeniyle konak sus yalnzca D-ribulozdan D-arabitol D-arabitol üretimi ile NADPH/NADP+ redoks dengesi arasinda baglanti,l GIikoz-ö-P dehidrojenazn as rll ifadesinin D-arabitol üretimine etkisinin degerlendirilmesi araclllglýla konak hücrede gösterilmistir. Böylece, elde edilen sus konak sus ile karsllastTTdgmtda 1.5 kat daha yüksek bir GGPDH aktivitesine sahiptir ve %10 daha fazla D-arabitol üretir (FR 2772788). Örnek 2. Pichia ohmeri kodon kullanmiü P. ohmeri 'nin kodon kullanînümevcut DNA ve bes P. ohmeri geninin karsmJK gelen amino asit dizisinden belirlenmistir: transketolaz, glikoz-ö-fosfat dehidrojenaz (FR 2772788), ribuloz redüktaz, beta-izopropilmalat dehidrojenaz - LEU2 (Piredda and (Piredda and Gaillardin, 1994, yukarida). Ayri [her bir gen, tek bir amino asit kodlayan nükleotid üçlülerine ayrllmistin. Bes gen toplam 2091 kodondan olusmustur. Her bir amino aside yönelik, bes gende mevcut her bir kodon sayBDsaymnßtI, 2091 ile bölünmüstür ve 1000 ile çarpüînßtî. Bu sekilde, 1000 kodondaki spesifik bir kodon smlEgZhesaplanmßtm. P. Ohmeri'nin ön kodon kullanEnîl'ablo 7'de belirtilir. P. stipi'tis'ten ksilitol dehidrojenaz haricindeki, P. ohmeri'de ifade edilen tüm heterolog genler bu tablo ve httpz//qenomes.urv.es/OPTIMIZER/ sitesinden elde edilen Optimizer program kullanilarak kodon ile optimize edilmistir. Elde edilen dizi, enzim kodlayan dizinin ilgili 5' ve 3" uçlar ndaki restriksiyon enzimlerine yönelik tanEria alanlarmili manuel eklenmesi akabinde gen sentezine yönelik gönderilmistir. Tablo 7. 5 kodlama dizisinden (CDS) derive edilen P. ohmerfnin kodon kullanmnü tablosu Pichia ohmeri [gbpln]: 5 CDS (2091 kodon) alanlar: [üçlü] [slslk: binde] ([sayL1J) .5( .1( 64.1( .5( 12.0( 27.7( .6( 14.3( 27.3( 19.1( 21.5( .6( 23.4( 12.0( 34.0( 22.0( 24.4( 46.9( 27.7( 11.0( Örnek 3. E. coli bakteriyel NAN-spesifik ksiluloz-olusturma) geninin klonlanmasi l 27.3( .8( 12.4( 17.7( 29.2( 11.0( 64.1( 23.0( .9( 18.7( 46.9( 12.9( 26.3( 60.7( .5( 12.0( D-arabitol 4-oksidoredükctaz (g E. Gol/'den NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz aItD kodlayan bir DNA fragman: SEQ ID NO: 1'in verilen dizisinin verilen dizisine göre kimyasal olarak sentezlenmistir (GeneArt® Gene Synthesis, Life Technologies, Regensburg, Almanya). altD genine yönelik kodlama yapan AF378082.1 dizisinin (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucc0re/AF378082 sitesinden elde edilmistir) nükleotitleri 1441 ila 2808, sablon olarak kullanilmFStT ve httpz//qenomes.urv.es/OPT|MIZER/ sitesinden elde edilen Optimizer program :kullanttarak örnek 2'nin Tablo 7'sine göre P. ohmeri ATCC 20209'da kullan Ina yönelik kodon optimizasyonuna tabi tutulmustur. Ortaya çERan dizinin 5' ve 3' uçlarlida, smaswla restriksiyon enzimleri Ascl (GGCGCGCC) ve Sphl'nin (GCATGC) tanmna alanlarmia yönelik kodlama yapan nükleotitler daha fazla klonlamayj Ek olarak, bir adenozin Üçlüsü mayalarlrl Kozak-benzeri dizilerinde -3 pozisyonundaki bir adenozini açiklamak üzere baslangiç ATG'nin önüne eklenmistir. Son dizi (SEQ ID NO: 1) akabinde senteze yönelik verilmistir (GeneArt, Regensburg, Almanya). E. Gol/"den NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz kodlayan sentezlenen DNA fragmaanir pMK-RQ derive vektörde 5 pg Iiyofilize plazmid DNA olarak verilmistir (12ABYWMP, Sekil 1). Daha fazla alt-klonlamaya yönelik, gen Ascl ve Sphl enzimleri ile restriksiyon kesimi aracmgwla saIIimzstI (New England Biolabs, lpswioh, Massachusetts). Örnek 4. Pichia stipitis NADH ve NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazli mutajenezi ve klonlanmasi i Pichia stipitis NADH-spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin klonlanmasi l Ksilitol dehidrojenaz kodlayan maya (Pichia stipitis) geni XYL2'nin bilinen nükleotit plazmidik vektör lig 7.78 içinde klonlanmßtl (bu patentin örnek 4 ve Sekil 7'sine bakiniz). Vektörün restriksiyon haritas Sekil 2a'da gösterilir. Pichia stipitis NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin mutajenezi ve klonlanmasl i Pichia stipi'ti's'ten NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz XYL2 kodlayan bir DNA fragman: SEQ ID NO: 4)'ün dizisine göre kimyasal olarak sentezlenmistir (GeneArt® Gene Synthesis, Life Technologies, Regensburg, Almanya): XYL2 genine yönelik kodlama yapan dizi X55392.1'in (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucc0re/X55392.1 sitesinden elde edilmistir) nükleotitleri 319 ila 1410 sablon olarak kullanImßtI. dehidrojenaz n kosubstrat tercihi yay mlanan dört amino asit mutasyonunun yerlestirilmesi araclllgiyla NADH'den NADPH'ye degistirilebilir: edilen P22144 protein dizisine bagl`olarak numaralandmma). karsml's gelen dizide GCT, AGA, TCA ve AGA ile manuel olarak yeri degistirilmistir. Ek olarak, restriksiyon enzimleri Hindlll (AAGCTT) ve Sacll'nin (CCGCGG) tanmna alanlarlia yönelik kodlama yapan nükleotitler, daha fazla klonlamayükolaylastlmak amacßlla ilgili 5' ve 3' uçlarda manuel olarak dahil edilmistir. Ayrica, bir adenozin üçlüsü mayalarin Kozak-benzeri dizilerinde -3 pozisyonundaki bir adenozini açiklamak üzere baslangiç ATG'nin önüne eklenmistir. Son dizi (SEO ID NO: 4) senteze yönelik verilmistir (GeneArt, Regensburg, Almanya). P. stipitis'ten NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan sentezlenmis DNA fragman: bir pMA-T derive vektörde 5 pg liyofilize plazmid DNA olarak verilmistir (12AALQTP, Sekil 2b). Örnek 5. GIuconob_acter oxyigms NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaLz qeninin mutaienezi ve klonlanmasi'i Gluconobacter oxydanstan NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz th kodlayan bir DNA fragman , SEQ ID NO: 7'nin verilen dizisine göre kimyasal olarak sentezlenmistir (GeneArt® Gene Synthesis, Life Technologies, Regensburg, Almanya). th genine yönelik kodlama yapan ABOQ1690.1 dizisinin (http:l/www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ABOQ1690.1 sitesinden elde edilmistir) nükleotitleri 1063 ila 1851 sablon olarak kullan Im :stî ve httpzl/genomes.urv.es/OPTIMIZER/ sitesinden elde edilen Optimizer programD kullanmarak Tablo Tye (Örnek 2) göre P. ohmeri ATCC 20209'da kullanmna yönelik kodon optimizasyonuna tabi tutulmustur. özgüllügü yayimlanan iki amino asit mutasyonunun yerlestirilmesi aracilig yla NADH'den NADPH'ye degistirilebilir: D38S/M39R (http://www.uniprot.orq/uniprot/QBGR61 sitesinden elde edilen QBGR61 protein dizisine baglFblarak numaralandmma). Buna göre, D38 ve M39'a yönelik kodlama yapan kodonlarîi smasßila, karSJJR gelen dizide TCT ve AGA ile manuel olarak yeri degistirilmistir. Ek olarak, restriksiyon enzimleri Ascl (GGCGCGCC) ve Sphllnin (GCATGC) tanEna alanlarlia yönelik kodlama yapan nükleotitler, daha fazla kIonIamayEkolaylastImak amacßtla ilgili 5' ve 3' uçlarda manuel olarak dahil edilmistir. Aeroa, bir adenozin üçlüsü mayalarLm Kozak-benzeri dizilerinde -3 pozisyonundaki bir adenozini açiklamak üzere baslangiç ATG'nin önüne eklenmistir. Son dizi (SEQ ID NO: 7) senteze yönelik verilmistir (GeneArt, Regensburg, Almanya). G/uconobacter oxydans'tan NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan sentezlenmis DNA fragmanübir pMA-T derive vektörde 5 ug liyofilize plazmid DNA olarak verilmistir (13AAYSYP, Sekil 3). Daha fazla alt klonlamaya yönelik, gen Ascl ve Sphl enzimleri ile restriksiyon kesimi aracEEgQla salmimßtî (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts). Örnek 6. poURA3 secim markörü kullan Tarak heteroloq qen ifadesine yönelik bir P. ohmeri vektörünün olusumu Asagldaki unsurlar ile degistirilebilen bir vektörün klonlanmasizl - açIg okuma çerçevesi ve - sonlandetEla-Iemanlar üç farklEfragmanIi ard SI( iki örtüsme PCR'si aracmgglla gerçeklestirilmistir (Sekil 4). Vektör orijinal olarak, rekombinant Pichia ohmeri' susunda tagatoz 3-epimeraz geninin klonlanmas _ve asIIJfadesini test etmek üzere bir ifade modeli olarak planlanmstm. Asaglda açlklanacagi lüzere, tagatoz 3-epimeraz geni, bu ayni iekleme alanlarin n kullanilmas araclllgiyla söz konusu herhangi bir genin klonlanmaslni saglayarak spesifik Ascl - Sphl restriksiyon alanlar kasetine klonlanmlstin. Klonlama asagIaki yöntem araCJJgSIla tasarlanmßtî. Birinci bir PCR'de (PCR1), yari mida Spel ve Ascl alanlarE(primer dizisinde aItElçizilidir) bulunan P. ohmeri*nin 490 bp uzunlugunda bir ribuloz redüktaz promotör fragmanD asagmlaki unsurlar kullan Iarak amplifiye edilmistir: - primer EV2960: GAACTAGTGGATCCGTAGAAATCTTG (SEO ID No 12) - primer EV2961: CTTTGTTCATTTTGGCGCGCCTTTTAGTTTAATAAGGGTCCGTG (SEO ID No 13) Ek olarak, revers primer EV2961'in 5' ucunda, tagatoz-S-epimeraz geninin 5' ucunu temsil eden 13 nükleotit uzunlugunda bir fragman eklenmistir. Ascl alanIiIi 8 nükleotidi ve ribuloz redüktaz promotörünün 3' ucunun takip eden 10 nükleotidi ile birlikte bu fragmana, PCR1 fragmaninimi asagida açiklanan PCR2 fragman_ile kaynastmiimasna yönelik örtüsme olarak ihtiyaç duyulmustur. P. ohmeri' ATCC 20209'un genomik DNA'si sablon olarak kullanilmistin. Tam hßmsantrifüjleme akabinde, 0.5 pl süpernatant PCR'ye yönelik kullanilinßtl'ri. Bu amaca yönelik, yeni ekim yapilan koloni 30 pl %02 SDS içinde yeniden süspanse edilmistir ve 4 dakika boyunca 95°C'de ßîmnßtî. Sablon, uygun 1X tampon içinde 0.02 U/pl iProofTIVI polimeraz (BlO-RAD. Hercules. California) ile her bir dNTP'nin 200 uM'si ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon karßînüçinde amplifiye edilmistir. PCR 98°C'de 30 saniyelik bir baslangk; denatürasyon admL,J akabinde 98°C'de 10 bir nihai genlesme adimi iile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1'Iik bir agaroz jel üzerinde ayrilmvst r, özütlenmistir ve ZymocleanT'V' Jel DNA Geri Kazan m Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullanilarak saflastinilm str. Ikinci bir PCR'de (PCR2), yanIida Ascl ve Sphl alanlar:(primer dizisinde altüçizilidir) bulunan Pseudomonas cichor/i' ST24`ün tagatoz-3-epimerazliîli 911 bp uzunlugunda bir fragman :asag Baki unsurlar kullan [tarak amplifiye edilmistir: - primer EV2962: AAACTAAAAGGCGCGCCAAAATGAACAAAGTTGGCATG (SEO ID No 14) ve - primer EV2963: TTCTCTTCGAGAGCATGCTCAGGCCAGCTTGTCACG (SEQ ID No Primer EV2962'nin 5, ucu ribuloz redüktaz promotörünün 3' ucunu temsil eden 9 nükleotit uzunlugunda bir fragman içerir. Ascl alanîili 8 nükleotidi ve tagatoz-S-epimeraz açi: okuma çerçevesinin takip eden 12 nükleotidi ile birlikte bu fragman, PCR2 ürününün daha önce açmlanan PCR1 ürününe kaynast rmak üzere örtüsme PCR'sine yönelik kullanilin. Ek olarak, revers primer EV2963`ün 5` ucu P. ohmeri'nin ribuloz redüktaz sonlandlnlolsmilni 5' ucunu temsil eden 12 nükleotit uzunlugunda bir fragman içerir. Sphl alanîtFrl 6 nükleotidi ve tagatoz-3-epimeraz açk okuma çerçevesinin 3' ucunun takip eden 12 nükleotidi ile birlikte bu fragmana, PCR2'nin asagîla açIglanan PCR3lün PCR fragman jle kaynastlmnasma yönelik örtüsme olarak ihtiyaç duyulur. Sablon olarak, sentezlenmis bir Pseudomonas cichorii' ST24'ün tagatoz-S-epimeraz geni kopyasîiüiçeren 25 ng vektör12AAMCJP (Sekil 5) (GeneArt, Regensburg, Almanya) kullanImStm (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/A8000361 sitesinden Sablon, uygun 1X tampon içinde 0.02 U/pl iProofTM polimeraz (BlO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTP'nin 200 uM'si ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon karls mi içinde amplifiye edilmistir. PCR 98°C'de 30 saniyelik bir baslangg denatürasyon adînü akabinde 98°C'de 10 bir nihai genlesme adEnElle gerçeklestirilmistir. Üçüncü bir PCR'de (PCR3), yanîtda Sphl ve Sacll alanlarü(primer dizisinde altü çizilidir) bulunan P. Ohmerilni'n ribuloz redüktaz sonlandIßIiIi 380 hp uzunlugunda bir fragman :asag Ilaki unsurlar kullan [Barak amplifiye edilmistir: - primer EV - primer EV PCR ürün %1'Iik bir agaroz jel üzerine ayrImîstI, özütlenmistir ve ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanm Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California kullan larak saflastmumstm. Primer EV2964'ün 5' ucu, Sphl alan mm 6 nükleotidi ve P. ohmeri'nin ribuloz redüktaz sonlandmmlîliîi takip eden 12 nükleotidi ile birlikte PCR3'ün daha önce açfRIanan PCR2`ye kaynastmMasFrla yönelik kullanTan tagatoz-S-epimeraz açfk okuma çerçevesinin 3' ucunun 12 nükleotit uzunlugunda bir fragmanîiEiçerir. P. ohmeri' ATCC 20209'un genomik DNA'sîsablon olarak kullanmnßtî. Tam hâlü santrifüjleme akabinde, 0.5 pl süpernatant PCR,de kullanmnßtl. Bu amaca yönelik, yeni ekim yapman koloni 30 ul %02 SDS içinde yeniden süspanse edilmistir ve 4 dakika boyunca 95°C'de ßîmnßtl. Sablon, uygun 1X tampon içinde her bir dNTP'nin 200 uMisi, her bir primerin 0.5 uM'si ve olusan bir reaksiyon karis ml içinde amplifiye edilmistir. PCR 98°C'de 30 saniyelik bir baslangß denatürasyon adTnÜ akabinde 98°C'de 10 bir nihai genlesme admnElile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1'Iik bir agaroz jel üzerinde ayrEtmStI, özütlenmistir ve ZymocleanTIVI Jel DNA Geri Kazanîn Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullan Barak saflastltlrn IStI. Üç ayrüPCR fragmanîtli kaynastltlrnasüasagmlaki sekilde gerçeklestirilmistir: PCR1 PCR reaksiyonunda sablon olarak kullanümstm. Yukarida açklanan primer tasarimdan kaynaklanan, iki fragmandaki 30 nükleotit uzunlugunda bir homolog segment kaynastrima reaksiyonunda örtüsme olarak kullanilmist r. Bu sekilde, yanmda Spel ve Ascl alanlaerulunan P. Ohmeri'nin bir ribuloz redüktaz promotöründen olusan 1.4 kb uzunlugunda bir fragman, Pseudomonas cichorii ST24`ün tagatoz-3-epimerazIiIi açEE okuma çerçevesine kaynastlmn @tl Sablonlar, uygun 1X tampon içinde her bir dNTP'nin 200 uM'si, her bir primerin olusan bir reaksiyon karis mi içinde amplifiye edilmistir. PCR 98°C'de 30 saniyelik bir baslangß denatürasyon ad_ml`,i akabinde 98°C'de 10 bir nihai genlesme adiîinüile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1'lik bir agaroz jel üzerinde ayrffmîstî, özütlenmistir ve ZymocleanT'VI Jel DNA Geri Kazanîn Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullan Barak saflastlilm :sti SaflastIIan fragman ikinci bir örtüsme PCRtsinde PCR3 ürününe kaynastiilrnßtî. Her edilmistir. Yukarida aç klanan primer tasarimdan kaynaklanan, iki fragmandaki 30 nükleotit uzunlugunda bir homolog segment kaynastirimada örtüsme olarak kullanilm stiri. Bu sekilde, yan hda Spel ve Ascl bulunan P. ohmeri"nin bir ribuloz redüktaz promotörü ve yanlida Ascl ve Sphl alanlarübulunan Pseudomonas cichorii ST24'ün tagatoz-3- epimerazmili açik okuma çerçevesinden olusan 1.8 kb uzunlugunda bir fragman, P. ohmeri'nin ribuloz redüktaz sonlandIEiBIia kaynastlilrn St!. Sablonlar, uygun 1X tampon içinde her bir dNTP'nin 200 uM'si, her bir primerin olusan bir reaksiyon karßînüçinde amplifiye edilmistir. PCR 98°Cde 30 saniyelik bir baslangiç denatürasyon adimi,i akabinde 98°Cde 10 bir nihai genlesme adimi iiIe gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1'lik bir agaroz jel üzerinde ayrilm st r, özütlenmistir ve ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazan m Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullan [Barak saflastlElTn IstI. Yanmda bir ribuloz redüktaz promotörü ve sonlandIEßD bulunan Pseudomonas cichorii' ST24'ün tagatoz-3-epimerazIiIi 1.7 kb uzunlugunda bir fragmanli olusan nihai PCR ürünü, restriksiyon enzimleri Spel ve Sacll (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts) (Sekil 6) ile parçalanm'st r, jelle saflastinilmist r ve T4 DNA Iigaz (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts) kullanuarak bir lig7.78 vektörü omurgasLnlri 9.8 kb uzunlugunda izole SpeI/Sacll fragman ile bir gece boyunca 16°C'de baglanmistln. Ligasyon kariSFrrfile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Ciara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanttarak izole edilmistir. Saflastlm'nß plazmid DNA restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth. Balgach, Isviçre) aracmgglla daha fazla karakterizasyona yönelik kullanmnßtî. Yeni klonlanmß ifade plazmidi pEVE2523 (Sekil 7) replikasyonun bir bakteriyel (E. coli) kökeni ve bir ampisilin rezistans geni, maya (P. ohmeri) otonom replikasyon dizisi mayada seçime yönelik ve poURA3 (P. ohmeri) geninden olusan bir mekik E. coli - P. ohmeri' vektörüdür. Ayrica, bu Pseudomonas cichoriiinin (Ascl ve Sphl restriksiyonu vasltlas yla degistirilebilir) tagatoz-3-epimerazliii`n bir açik okuma çerçevesinin yaninda bulunan degistirilebilir bir P. ohmeri ribuloz redüktaz promotör elemanü (Spel ve Ascl restriksiyonu vasttasjila) ve sonlandIEtZeleman (Sphl ve Sacll vas Iasýla) içerir. Örnek 7. QOLEU2 seçim markörü kullanIarak heterolog_gen ifa_desine vönelik Q P. ohmeri vektörünün olm Ikinci bir P. ohmeri ifade vektörünün olusumuna yönelik, daha önce Örnek 6'da açklanan plazmid pEVE2523iün (Sekil 7) ifade kaseti P. ohmeri poLEU2 seçim markörü (Sekil 6) içeren bir vektöre klonlanmist r. Spel ve Sacll (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts) ile kesilmis vektör pEVE2523'ün (Sekil 7) küntlesmis bir 1.7 kb fragman dolgu olarak kullanilm st r. Küntlesme oda slaklEgIlida 15 dakika boyunca Küntlesme Enzim Karßînümew England Biolabs, lpswich, Massachusetts), akabinde 70°C'de 10 dakika boyunca enzimlerin @Elle etkisizlestirmesi ile gerçeklestirilmistir. Vektör omurgasü Sa/I (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts) ile dogrusallast rllan, küntlestirilen ve Antarktik fosfataz (New England Biolabs, Ipswioh, Massachusetts) kullanuarak 1 saat boyunca 37°C'de defosforile edilen bir poARS vektöründen (pligS - FR2772788) elde edilmistir. Jelle saflastrlan dolgu ve ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanlm Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanan vektör omurgasî T4 DNA Iigaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) kullanilarak ile oda smaklfgmida 1 saat boyunca baglanmßtm Ligasyon karßlîhîile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Ciara. California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullanmarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracmgiýla daha fazla karakterizasyona yönelik kullanImßtI. Yeni klonlanmis ifade plazmidleri pEVE2560 (Sekil 8) replikasyonun bir bakteriyel (E. 0011) kökeni ve bir ampisilin rezistans geni, maya (P. ohmeri) otonom replikasyon dizisi mayada seçime yönelik ve poLEU2 (P. ohmeri) geni içeren bir mekik E. coli - P. ohmeri vektörüdür. Ayrßa, yanlida bir P. ohmeri ribuloz redüktaz promotörü ve sonlandîmîsübulunan Pseudomonas cichorii'nin tagatoz-S-epimerazlimi açtR okuma çerçevesi, Ascl ve Sphl restriksiyonu vasttas Sila degistirilebilir. Örnek 8. GIuconobgcter oxyd_ans NA_DPH-spesifik ksilitol glehidroienazmi asIE ifadesine yönelik bir P. ohmeri vektörünün olusumu Gluconobacter oxydans NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazmi asm'_ifadesine yönelik bir P. ohmeri vektörü olusturulmustur. Ifade vektörüne klonlamaya yönelik, Gluconobacter oxydans NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan DNA fragmani,l Ascl ve Sphl restriksiyon enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile kesme araclggila vektör 13AAYSYP'den (Sekil 3) salîtmîstl. 803 bp fragman ZymocleanTM Jel DNA Geri KazanIn Kiti (Zymo Research Corporation, Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 9) kullanilarak 2 saat boyunca oda smaklLgJJida pEVE2523"ün (Sekil 7) 9.8 kb Ascl/Sphl ile parçalanan ve jelle saflastinilan vektör omurgasinia baglanm stin. Ligasyon karßîhîile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Clara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyT'V' Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanrtarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracmgmla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çÜian plazmid pEVE3284 (Sekil 10) yan Iida P. ohmeri"nin bir ribuloz redüktaz promotörü ve sonlandmmß: ve poURA3 seçim markörü bulunan Gluconobacter oxydans'Lri kodon-optimizeli NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaszJçerir. Örnek 9. Pichia stipiijs NADPH-spesifik ksilitol dehidroienagîi asmüifadesine yönelik bir P. ohmeri vektörünün olusumu Ifade vektörüne alt-klonlamaya yönelik, Pichia stipitis'ten NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan DNA fragmanmli yan Iîda Ascl ve Sphl restriksiyon alanlarliîi bulunmas :gerekir. Bu amaca yönelik: - EV3101 primer bir Ascl alanü (altü çizili) içeren AAGGCGCGCCAAA ATGACTGCTAACCCTTCC (SEO ID No 18) ve - EV3102 primer bir Sphl (alti çizili) içeren GAGCATGCTTACTCAGGGCCGTCAATG (SEO ID No19) sablon olarak 30 ng vektör 12AALQTP (Sekil 2b) ile bir PCR reaksiyonunda kullantlhißtî. Sablon, uygun 1X tampon içinde 0.02 U/ul iProofTM polimeraz (BIO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTP'nin 200 pM'si ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon karls mi içinde amplifiye edilmistir. PCR 98°C'de 30 saniyelik bir baslanglç denatürasyon ad mi,i akabinde 98°C'de 10 bir nihai genlesme admnFiIe gerçeklestirilmistir. 1.1 kb PCR ürünü %1'lik bir agaroz jel üzerinde ayrImStI, özütlenmistir, ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanmn Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) ve Ascl ve Sphl (New England Biolabs. lpswich, Massachusetts) ile parçalanan restriksiyon kullanmarak saflastIImStI. DNA Clean & ConcentratorTM-S Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) ile kolon saflastlma akabinde, T4 DNA Iigaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 11) kullanIarak slIasjila, 2 saat boyunca oda scaklLg'nda pEVE2523'ün (Sekil 7) 10.6 kb Asal/Sphl ile parçalanan ve jelle saflastlnllan vektör omurgasl ive pEVE2560'n (Sekil 8) 11.8 kb AscI/Sphl ile parçalanan ve jelle saflast r lan vektör omurgaslnia baglanmlstir. Ligasyon karISlm. ile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Clara, California) transformasyonu akabinde, plazmid DNA izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracmgiglla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çÜian plazmidler pEVE yanmida P. ohmeri'nin bir ribuloz redüktaz promotörü ve sonlandlîißüve smaswla poURA3 veya poLEU2 seçim markörü bulunan Pichi'a stipiti's'in kodon optimizeli NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaZIi Eiçerir. Örnek 10. Pichia stipitis NADH-spesifik ksilitol dehidrojenazîi asI: ifadesine yönelik bir P. ohmeri vektörünün olusumu Ifade vektörüne alt-klonlamaya yönelik, Pichia stipitis'ten NADH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan DNA fragmanmli yanîîda Ascl ve Sphl restriksiyon alanlarliît bulunmasîgerekir. Bu amaca yönelik: e bir Ascl alani I (alti I çizili) içeren EV3101 (AAGGCGCGCCAAA ATGACTGCTAACCCTTCC) (SEO ID No 18) ve - bir Sphl (alti çizili) içeren EV (SEO ID No 19) sablon olarak 30 ng vektör Iig7.78 (Sekil 2a) ile bir PCR reaksiyonunda kullanffmßtlî. Sablon, uygun 1X tampon içinde 0.02 U/ul iProofTM polimeraz (BIO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTP'nin 200 uM'si ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon karßînüçinde amplifiye edilmistir. PCR 98°C'de 30 saniyelik bir baslanglgt denatürasyon adînü akabinde 98°C'de 10 bir nihai genlesme adlml lle gerçeklestirilmistir. 1.1 kb PCR ürünü %1'Iik bir agaroz jel üzerinde ayr lmistln, özütlenmistir, ZymocleanTN' Jel DNA Geri Kazanlm Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) ve Ascl ve Sphl (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile parçalanan restriksiyon kullanmarak saflastmmnßtl. DNA Clean & ConcentratorTM-S Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) ile kolon saflastlma akabinde, T4 DNA Iigaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 13) kullan Iarak 2 saat boyunca oda smakltgîida pEVE2560 "It (Sekil 8) 10.5 kb AscI/Sphl ile parçalanan ve jelle saflastlman vektör omurgaslia baglanmßtl. Ligasyon karISlm ile XL10 Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Ciara, California) transformasyonu akabinde, plazmid DNA izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) araclligiyla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çtkan plazmid pEVE2563 (Sekil 14) yan Iida P. ohmeri"nin bir ribuloz redüktaz promotörü ve sonlandIElSElve poLEU2 seçim markörü bulunan Pichi'a stipitisin kodon optimizeli NADH-spesifik ksilitol dehidrojenazlijçerir. Örnek 11. E. coli NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaziîii asî'_ ifadesine yönelik P. ohmeri vektörlerinin olusumu E. coli NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz n asin ifadesine yönelik bir P. ohmeri vektörü olusturulmustur. Ifade vektörüne klonlamaya yönelik, kodon-optimizeli E. co/i NAN-spesifik D-arabitol 4- oksidoredüktaz kodlayan DNA fragmanü Ascl ve Sphl restriksiyon enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile kesme aracmgßlla vektör 12ABYWMP'den (Sekil 1) salîtmîstm. 1.4 kb fragman ZymocleanT'V' Jel DNA Geri Kazanmn Kiti (Zymo Research Corporation, Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 16) kullanilarak 2 saat boyunca oda sicakllg nida pEVE25237ün (Sekil 7) 9.8 kb AscI/Sphl ile parçalanan ve jelle saflastinilan vektör omurgasinia baglanm stin. Ligasyon kariSFrrFile XL10 Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Ciara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanilarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracmgwla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çikan plazmid pEVE2839 (Sekil 15) yan Iida P. ohmeri"nin bir ribuloz redüktaz promotörü ve sonlandIEBÜve poURA3 seçim markörü bulunan kodori -optimizeli E. 001/ NAV-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktazUçerir. P. ohmeri ribuloz redüktaz promotörüne ek olarak, E. Coli'den NAD+-spesifik D-arabitol promotörü ve transketolaz (poTKL) sonland r c sirti n kontrolü altinida klonlanmistin. Klonlama, ilk olarak poPGK1 promotörü ile ribuloz redüktaz promotörünün degistirilmesi, akabinde poTKL sonland Ißßlia yönelik ribuloz redüktaz sonlandlßlimi bir degisimi aracmgwla iki ardîsm ad Inda gerçeklestirilmistir. P. ohmeri poPGK1 promotörünün 611 hp uzunlugunda bir fragmani IP. ohmeri'nin genomik DNA'sLnidan asag daki unsurlar kullanLlarak amplifiye edilmistir: - bir Spel alani l (alt çizili) içeren primer EV ve e bir Ascl alan * (alti çizili) içeren primer EV3178 (CACTGGCGCGCCTTTTGTGTGGTGGTGTCC) (SEQ ID No 21). Tam hülüsantrifüjleme akabinde, 0.5 ul süpernatant PCR'ye yönelik kullanmnßtl. Genomik DNA sablonu 30 pl %02 SDS içinde yeni ekim yapÜhn bir koloninin yeniden süspanse edilmesi ve 95°C'de 4 dakika boyunca Emmnasüaracjgýla hazilanmßtî. Amplifikasyon 1X tampon içinde 0.02 U/ul iProofT'V' polimeraz (BlO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTPlnin 200 uMisi ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon karls mi Içinde gerçeklestirilmistir. PCR 96°C'de 2 dakikalik bir baslang ç denatürasyon ad ml,l akabinde 96°C'de 10 nihai genlesme admnElle gerçeklestirilmistir. PCR ürün %1'lik bir agaroz jel üzerine ayrImStm, özütlenmistir ve ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanma Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullanIarak saflastllmnßt. Amplifiye edilmis 610 bp uzunlugundaki poPGK1 promotör fragman jSpel ve Ascl (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmasna tabi tutulmustur ve T4 DNA Iigaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil SpeI/Ascl ile parçalanan ve jelle saflastinilan vektör omurgasinia baglanm stin. Ligasyon karßlîhîile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Clara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullanilarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgaoh, Isviçre) aracillglyla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çkan plazmid pEVE3102 (Sekil 18) yanlnida P. ohmeriinin bir fosfogliserat kinaz (poPGKi) promotörü ve bir ribuloz redüktaz sonland rcisi lve poURA3 seçim markörü bulunan kodon-optimizeli E. co/i NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazm Sonraki admnda pEVE3102'nin ribuloz redüktaz sonlandIEbBZP. ohmeri'nin tranketolaz (poTKL) sonland IßBIia yönelik degistirilmistir. P. ohmeri poTKL sonlandîîißliîi 213 bp uzunlugunda bir fragmanDP. ohmeri'nin genomik DNA'sIidan asag daki unsurlar kullanilarak amplifiye edilmistir: - bir Sphl alani i (alt çizili) içeren primer EV ve - bir Sacll alan . (alt. çizili) içeren primer EV3818 (TAGGTCCGCGGGAGCTTCGTTAAAGGGC) (SEQ ID No 23). Genomik DNA sablonu yukarmla açEltlandgîüzere hazIIanmStI. Amplifikasyon 1X tampon içinde 0.02 U/ul iProofTM polimeraz (BlO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTP'nin 200 uM'si ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon karßînüçinde gerçeklestirilmistir. PCR 96°Cide 2 dakikalik bir baslangî; denatürasyon adînü akabinde 96°C'de 10 nihai genlesme adimi [ile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1'lik bir agaroz jel üzerinde ayr lm stln, özütlenmistir ve ZymocleanTNI Jel DNA Geri Kazanlm Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanilarak saflast riilm st r. Amplifiye edilmis 213 bp uzunlugundaki poTKL sonlandIEDfragman Sphl ve Sacll (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmasîia tabi tutulmustur ve T4 DNA ligaz (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts) (Sekil SphI/Sacll ile parçalanan ve jelle saflastlnllan vektör omurgaslnia baglanm stln. Ligasyon karistm ile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Clara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyT'V' Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanilarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracmgiýla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çJ'san plazmid pEVE3123 (Sekil 19) yanmida P. ohmeri'nin bir fosfogliserat kinaz (poPGK1) promotörü ve transketolaz (poTKL) sonlandIEßEve poURA3 seçim markörü bulunan kodon-optimizeli E. coli NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktazü Bir plazmidden diger bir seçim kullanilarak E. coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4- oksidoredükctazini ifade edebilmek amaciyla, pEVE31237ün poURA3 markörü, poLEU2 markörüne yönelik degistirilmistir. Bu amaca yönelik, poURA3 markörü Psil ve Afel (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalama aracmglýla vektör pEVE3123'ten (Sekil 19) salnmßtî 9.1 kb vektör omurgaSZZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanîn Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanIarak jelle saflastllmnßt, 15 dakika boyunca oda smakltgînda Küntlesme Enzim KarISInD kiti (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile küntlestirilmistir, akabinde 10 dakika boyunca 70°C'de enzimler @D ile etkisizlestirilmistir ve Antarktik fosfataz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) kullanilarak 1 saat boyunca 37°C'de defosforile edilmistir. Dolgu olarak, Asel ve Afel restriksiyon parçalama aracllgiyla vektör pEVE2560'dan (Sekil 8) sallnian poLEU2 markörünün 3 kb küntlesmis ve jelle saflastinilan bir fragmani 1 kullanm'nßtî. Fragmanlarît Iigasyonu T4 DNA ligaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 20) kullanEarak 2 saat boyunca oda sîiaklglida gerçeklestirilmistir. Ligasyon karßmfîile XL10 Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Ciara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyT'V' Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullanilarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracillgiyla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çkan plazmid pEVE3157 (Sekil 21) yanmda P. ohmeri'ni'n bir fosfogliserat kinaz (poPGK'I) promotörü ve transketolaz (poTKL) sonland IEBDve poLEU2 seçim markörü bulunan kodon-optimizeli E. coli NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazü Örnek 12. Plazmidik E. coli NAN-spesifik _D-arapitol 4-oksic_loredüktaz]i ve Pichia ohmeri susu ATCC 20209'daki glazmidik Pichia stigitis NAQPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz qeninin ifadesi Arabitolün ksilitole biyosentetik dönüsümüne yönelik, NAD+-spesifik E. coli D-arabitol 4- oksidoredüktaz ve P. Stipitisiin NADP-spesifik ksilitol dehidrojenazlni ni eszamanli l ifadesi gereklidir. Birinci enzim ksiluloz olusumuna yol açar ve ikincisi ksilulozu ksilitole dönüstürür. ATCC 20209'dan derive ve Iösin ve urasile (Piredda and Gaillardin, 1994, yukarmi'a) yönelik oksotrofik olan P. ohmeri' susu SRLU (MATh' leu2 ura3) asagmlaki plazmidler ile transformasyon aracmggila ksilitol salgüayan bir maya susunun olusumuna yönelik konak olarak kullanJmStI: - pEVEJ ve - sus EYS2755'e yol açan pEVE2564 (P. stipitisîn NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz.) Ek olarak, bir kontrol (WO 94/10325'in ilkesi izlenerek) olarak P. Stipitis'in NADH- spesifik dogal sus ksilitol dehidrojenazlijfade eden bir sus ayrIa asag Baki plazmidler ile olusturulmustur: - SRLU konak içinde sus EY82962iye yol açan pEVE2563 (P. stipit/'s'in NADH- spesifik dehidrojenazi)l. dönüstürülen suslar: - pEVE2564 (P. sripitis'in NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazü ayrma üretilmistir. Maya transformasyonu asagmlaki modifikasyonlar ile temel olarak Green et al. (Green E.D., Hieter, P., and Spencer F. A., Chapter 5 in Genome Analysis: A Laboratory Manual, Vol. 3, Cloning Systems, Birren et al. (eds.), Cold Spring Harbor Press, New York, 1999) sferoplast hale getirme yöntemi arac Ilg yla gerçeklestirilmistir: Lyticase yerine, Zymolyase 1OOT sferoplastlarln olusturulmasina yönelik kullanilmlst r ve enzim ile inkübasyon, Zymolyase islemi öncesinde hücre süspansiyonunun OD'si orijinal OD'nin %20-30'una ulasana kadar 37°C'de gerçeklestirilmistir. KBacasü P. ohmeri' hücreleri YPD ortam: (Maya ekstraktü%1 (w/v), Pepton %2 (w/v), Dekstroz %2 (w/v)) içinde bir gece boyunca 30°C'de 3-5 araslida bir nihai ODaoo'e büyütülmüstür. 200 ODGOO birimleri santrifüjleme aracmgßila toplanmßtl, bir kere su ve 1 M sorbitol ile ymanmßtî ve SCE tamponunda (1 M sorbitol, 100 mM sitrik asit trisodyum tuz dihidrat, 10 mM EDTA) 70 ODs/ml'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edilmistir. DTT ve Zymolase (LuBio Science, Luzern, Isviçre) sLijasLyla 10 mM ve 0.5 U/OD'lik bir nihai konsantrasyona eklenmistir ve karis m yavas çalkalama ile 37°C'de inkübe edilmistir. Hücre duvar parçalanmasin n akabinde su içinde seyreltilen solüsyonun optik yogunlugu ölçülmüstür. Bu degerin orijinalin %80'ine düsmesi durumunda, parçalanma dikkatli santrifüjleme ve 1 M sorbitol ve STC tamponu (0.98 M sorbitol, 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM CaCIz) ile ykama aracEEgQla sonlandllmnßt. Sferoplastlar dikkatli bir sekilde 50 pg/ml dana-timüsü DNA's:(CaIbiochem/VWR, Dietikon, Isviçre) içeren STC tamponu içinde 200 OD/ml'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edilmistir. 100 pl'lik alikuotlar 100-200 ng plazmid DNA ile kar stln lmistin ve 10 dakika boyunca oda sicakliginida inkübe edilmistir. 1 ml PEG solüsyonu (% süspansiyona eklenmistir, 10 dakika boyunca inkübe edilmistir ve pelletlenmistir. Sferoplastlar %25 YPD ve 7 mM CaCI2 içeren 1 M*Iik bir sorbitol solüsyonunun 1 ml'si içinde 1-2 saat boyunca 30°C'de yeniden olusturulmustur. Yeniden olusturulmus hücrelere 7 ml 50°C sßakltgîida üst agar (amino asitler olmadan Noble agar) eklenmistir ve karLSLm önceden L3LUMLS, sorbitol içeren seçmeli plakalara (amino asit olmadan %067 maya nitrojen bazl,l IÖsin/urasiI/histidin/triptofan/metiyonin sorbitol, pH5.8) esit bir sekilde dökülmüstür. Plakalar 3-5 gün boyunca 30°C'de inkübe edilmistir. Transformantlar uygun seçmeli plakalar üzerinde yeniden seçilmistir. Olusturulan her bir sus arabitol, ksilitol ve ribitol üretimine yönelik üçlüler halinde test edilmistir. Bu amaca yönelik klonlar ilk olarak bir gece boyunca 30°C'de çimlenme ortamü(amino asitler olmadan %067 maya nitrojen baz: lösin/urasiI/histidin/triptofan/metiyonin içinde yetistirilmistir. Bu bir gecelik kültürden, üretim ortamindaki (amino asitler olmadan %067 maya nitrojen baz; Iösin/urasiI/histidin/triptofan/metiyonin olmadan %013 drop-out toz; baslangg OD600'ünde inoküle edilmistir. Bu kültür 48 saat boyunca 37°C'de yetistirilmistir ve süpernatantlarli arabitol, ksilitol ve ribitol konsantrasyonlar bir Aminex® HPX-87 kolonu (Bio-Rad, Hercules, California) ve bir Waters® TQ-Detector (üçlü bir kuadrupol dedektöre baglanan Acquity® UPLC, Waters, Milford, Massachusetts) ve mobil faz olarak %100 su ile izokratik kosullar kullanilarak HPLC/MS araclllg yla belirlenmistir. Test edilen tüm suslarýpoliol titreleri Tablo 8'de gösterilir. P. stipitis'in NADH- ve NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazHve/veya E. coli'nin NAD+- spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktazüile dönüstürülen P. ohmeri SRLU suslarnîi poliol üretimi (üçlülerin ortalamasj Sus Arab/to! (g/L) Ksili'to/ (g/L) Ribi'tol (g/L) SRLU 32.9±2.4 nd nd nd - saptanmamstr P. stipitis'in NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz nin kullaniml,l dogal sus NADH- spesifik enzim ile karsilastinlldigvnda ksilitol titrelerine kaydadeger bir artmaya yol açar. Örnek 13. Pichia ohmeri'de plazmidik Gluconobacter oxydans NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin ifadesi P. stipiti's'in NADP-spesifik ksilitol dehidrojenazîiükullanan bir ksilitol üreten susa ek olarak G. oxydans'îi NADP-spesifik ksilitol dehidrojenazliîifade eden ikinci bir sus tasarlanmîstl. ATCC 20209'dan derive ve Iösin ve urasile (Piredda and Gaillardin, 1994, yukarmla) yönelik oksotrofik olan P. ohmeri susu SRLU (MATh' Ieu2 ura3) sus EY33324'e yol açan plazmidler pEVE ve pEVE ile transformasyon araciligiyla ksilitol salgilayan bir maya susunun olusumuna yönelik konak olarak kullanilmist r. dönüstürülen suslar: - pEVEi ve - pEVE ayrma üretilmistir. YukarLdaki suslaani olusumuna yönelik kullan lan E. coli D-arabitol 4-oksid0redüktaz, P. stipi'tis'in ksilitol dehidrojenazirii ifade eden suslarda kullanilan poRR promotörünün aksine poPGK1 promotörü araciligiyla kontrol edilir. Ancak, bir promotör etkisini hariç tutmak ve dolaysiyla, P. stipitis'ten karslik gelen enzimleri ifade edenler ile birlikte G. oxydans'dan ksilitol dehidrojenaz ifade eden suslarda poliol seviyelerini karsIastmabilmek üzere, ek bir sus olusturulmustur. Bu sus EY82963 asagElaki unsurlar ile SRLU konagIiIi dönüstürülmesi aracmgýla elde edilmistir - pEVEi ve - pEVE2564 (P. stipi'tis'ten NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz& Maya transformasyonu Örnek 12'de aç kland gi iüzere gerçeklestirilmistir. Olusturulan her bir sus Örnek 12'de açiklandig üzere arabitol, ksilitol ve ribitol üretimine yönelik üçlüler halinde test edilmistir. Test edilen tüm suslarîi poliol titreleri Tablo 9'da gösterilir. G. oxydans'mi NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazüve/veya E. coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazüile dönüstürülen P. ohmeri SRLU suslarlili poliol üretimi (üçlülerin ortalamasj nd - saptanmam st r Arabitol (g/L) 32.9±2.4 29.0±3.8 32.8±0.6 26.3±1.7 27.3±2.5 Ksi/i'tol (g/L) 1.5±0.3 21.1±1.1 17.7±1.7 Ribitol (g/L) 1.8±0.4 1.2±O.1 13.9±0.7 G. oxydans`tan (EY83324) NADPH-Spesifik ksilitol dehidrojenazîfade eden suslardaki ksilitol titreleri, P. stipitis'ten (EY82963) karSJJE gelen enzimi ifade eden suslarlikine benzerdir. Ancak, G. oxydans enzimi daha düsük ribitol titrelerine yol açar, böylece ksiluloze dogru daha yüksek bir substrat özgüllügü gösterir. TR TR TR TR TR TR TR TR

Claims (1)

1.
TR2018/08404T 2014-06-18 2014-06-18 Bir rekombinant suş aracılığıyla glikozdan ksilitol üretimi. TR201808404T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14305934.3A EP2957640B1 (en) 2014-06-18 2014-06-18 Production of xylitol from glucose by a recombinant strain

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201808404T4 true TR201808404T4 (tr) 2018-07-23

Family

ID=50981446

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/08404T TR201808404T4 (tr) 2014-06-18 2014-06-18 Bir rekombinant suş aracılığıyla glikozdan ksilitol üretimi.
TR2019/09794T TR201909794T4 (tr) 2014-06-18 2015-06-17 Bir rekombinant suş aracılığıyla glikozdan ksilitol üretimi.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2019/09794T TR201909794T4 (tr) 2014-06-18 2015-06-17 Bir rekombinant suş aracılığıyla glikozdan ksilitol üretimi.

Country Status (14)

Country Link
US (2) US10494614B2 (tr)
EP (2) EP2957640B1 (tr)
JP (1) JP6537534B2 (tr)
KR (1) KR102496301B1 (tr)
CN (1) CN106661540B (tr)
CA (1) CA2952709C (tr)
DK (2) DK2957640T3 (tr)
ES (2) ES2673865T3 (tr)
MX (2) MX374308B (tr)
PL (2) PL2957640T3 (tr)
RU (1) RU2693593C2 (tr)
SG (1) SG11201610417XA (tr)
TR (2) TR201808404T4 (tr)
WO (1) WO2015193350A1 (tr)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11419903B2 (en) 2015-11-30 2022-08-23 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US11844720B2 (en) 2011-02-04 2023-12-19 Seed Health, Inc. Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis
US12279989B2 (en) 2011-02-04 2025-04-22 Seed Health, Inc. Method and system for increasing beneficial bacteria and decreasing pathogenic bacteria in the oral cavity
US11951139B2 (en) 2015-11-30 2024-04-09 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US12257272B2 (en) 2015-12-24 2025-03-25 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual
US12533312B2 (en) 2011-02-04 2026-01-27 Seed Health, Inc. Method and system for preventing sore throat in humans
US11998479B2 (en) 2011-02-04 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for addressing adverse effects on the oral microbiome and restoring gingival health caused by sodium lauryl sulphate exposure
US11951140B2 (en) 2011-02-04 2024-04-09 Seed Health, Inc. Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease
US11839632B2 (en) 2013-12-20 2023-12-12 Seed Health, Inc. Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris
US12329783B2 (en) 2013-12-20 2025-06-17 Seed Health, Inc. Method and system to improve the health of a person's skin microbiome
US11529379B2 (en) 2013-12-20 2022-12-20 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing colorectal cancer in an individual human being
US11998574B2 (en) 2013-12-20 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for modulating an individual's skin microbiome
US11833177B2 (en) 2013-12-20 2023-12-05 Seed Health, Inc. Probiotic to enhance an individual's skin microbiome
US11672835B2 (en) 2013-12-20 2023-06-13 Seed Health, Inc. Method for treating individuals having cancer and who are receiving cancer immunotherapy
US11826388B2 (en) 2013-12-20 2023-11-28 Seed Health, Inc. Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation
US12246043B2 (en) 2013-12-20 2025-03-11 Seed Health, Inc. Topical application to treat acne vulgaris
US11980643B2 (en) 2013-12-20 2024-05-14 Seed Health, Inc. Method and system to modify an individual's gut-brain axis to provide neurocognitive protection
US11213552B2 (en) 2015-11-30 2022-01-04 Joseph E. Kovarik Method for treating an individual suffering from a chronic infectious disease and cancer
US12005085B2 (en) 2013-12-20 2024-06-11 Seed Health, Inc. Probiotic method and composition for maintaining a healthy vaginal microbiome
US11969445B2 (en) 2013-12-20 2024-04-30 Seed Health, Inc. Probiotic composition and method for controlling excess weight, obesity, NAFLD and NASH
US11026982B2 (en) 2015-11-30 2021-06-08 Joseph E. Kovarik Method for reducing the likelihood of developing bladder or colorectal cancer in an individual human being
US11642382B2 (en) 2013-12-20 2023-05-09 Seed Health, Inc. Method for treating an individual suffering from bladder cancer
EP2957640B1 (en) * 2014-06-18 2018-03-14 Roquette Freres Production of xylitol from glucose by a recombinant strain
CN108977432B (zh) * 2018-07-27 2021-04-06 浙江工业大学 重组大肠杆菌固定化细胞及在利用木糖母液生产木糖醇中的应用
CN114929870B (zh) * 2019-12-18 2024-04-30 埃沃尔瓦公司 宿主细胞及其用于产生核糖醇和其他单糖的用途
CN113025516A (zh) 2020-12-28 2021-06-25 浙江华康药业股份有限公司 一种利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法
CN113151367A (zh) * 2021-05-10 2021-07-23 湖北工业大学 一种自我保护的鲁氏结合酵母从头合成木糖醇的发酵方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4008285A (en) 1974-04-22 1977-02-15 Melaja Asko J Process for making xylitol
US4075406A (en) 1974-04-22 1978-02-21 Suomen Sokeri Osakeyhtio Process for making xylose
WO1990008193A1 (en) 1989-01-17 1990-07-26 Suomen Xyrofin Oy Method for the production of xylitol from mixtures containing xylose
FR2652589B1 (fr) 1989-10-04 1995-02-17 Roquette Freres Procede de fabrication de xylitol et de produits riches en xylitol.
ATE184917T1 (de) * 1992-11-05 1999-10-15 Xyrofin Oy Rekombinante methode und wirt zur herstellung von xylitol
FR2765589B1 (fr) 1997-07-03 1999-09-17 Roquette Freres Fragment d'adn comprenant le promoteur de la ribulose reductase nadph specifique de yamadazyma ohmeri, vecteur le contenant et procede de preparation de proteines utilisant ce vecteur
JPH11266888A (ja) * 1997-10-17 1999-10-05 Ajinomoto Co Inc キシリトールの製造法
FR2772788B1 (fr) 1997-12-19 2000-11-17 Roquette Freres Procede pour accroitre la production de certains polyols par une souche osmotolerante
JP2000295994A (ja) * 1999-02-09 2000-10-24 Ajinomoto Co Inc キシリトールの製造法
JP2001008682A (ja) 1999-06-24 2001-01-16 Ajinomoto Co Inc Ｄ−アラビトール、ｄ−キシルロース及びキシリトールの製造法
EP1075795B1 (en) * 1999-08-10 2003-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing xylitol of high purity
EP1254244B1 (en) * 2000-01-21 2010-04-14 Danisco A/S Manufacture of five-carbon sugars and sugar alcohols
JP4453869B2 (ja) * 2004-06-25 2010-04-21 信和化工株式会社 変異型キシリトールデヒドロゲナーゼ酵素、これを産生する微生物、該酵素または微生物を用いたキシリトールをキシルロースに変換する方法
JP5219074B2 (ja) * 2008-01-24 2013-06-26 独立行政法人産業技術総合研究所 キシロース発酵能が優れた六炭糖・五炭糖同時発酵酵母およびそれを用いたエタノールの高効率生産方法
KR101175418B1 (ko) * 2009-11-30 2012-08-20 전남대학교산학협력단 신규한 자일리톨 탈수소효소 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법
CN101880643B (zh) * 2010-06-03 2012-04-25 南京工业大学 氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其构建方法
CN102796797B (zh) * 2012-08-09 2014-07-09 山东天力药业有限公司 微生物转化葡萄糖制备木糖醇及其中间体d-木酮糖的方法及所用的菌种
EP2957640B1 (en) * 2014-06-18 2018-03-14 Roquette Freres Production of xylitol from glucose by a recombinant strain

Also Published As

Publication number Publication date
CN106661540B (zh) 2021-02-09
MX2020002674A (es) 2020-07-22
DK2957640T3 (en) 2018-06-25
EP3158074A1 (en) 2017-04-26
CA2952709C (en) 2022-11-08
US10494614B2 (en) 2019-12-03
CN106661540A (zh) 2017-05-10
RU2017101446A3 (tr) 2018-10-26
JP2017518066A (ja) 2017-07-06
EP2957640B1 (en) 2018-03-14
BR112016029704A2 (pt) 2017-10-24
RU2693593C2 (ru) 2019-07-03
MX374308B (es) 2025-03-06
KR102496301B1 (ko) 2023-02-07
EP3158074B1 (en) 2019-04-24
ES2673865T3 (es) 2018-06-26
CA2952709A1 (en) 2015-12-23
PL3158074T3 (pl) 2019-10-31
US20200032224A1 (en) 2020-01-30
US20170130209A1 (en) 2017-05-11
MX2016016923A (es) 2017-04-27
JP6537534B2 (ja) 2019-07-03
RU2017101446A (ru) 2018-07-18
KR20170020362A (ko) 2017-02-22
ES2733650T3 (es) 2019-12-02
PL2957640T3 (pl) 2018-09-28
EP2957640A1 (en) 2015-12-23
SG11201610417XA (en) 2017-01-27
DK3158074T3 (da) 2019-07-22
TR201909794T4 (tr) 2019-07-22
WO2015193350A1 (en) 2015-12-23
US10829742B2 (en) 2020-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201808404T4 (tr) Bir rekombinant suş aracılığıyla glikozdan ksilitol üretimi.
EP0672161B1 (en) Recombinant method and host for manufacture of xylitol
US7109010B2 (en) Methods and materials for the synthesis of organic products
JP3433295B2 (ja) キシリトールの製造のための組換え方法および宿主
JP5320692B2 (ja) 酵母及びｌ−乳酸の製造方法
JP2009528041A (ja) 生物変換により芳香族分子を産生するためのシステム
US6723540B1 (en) Manufacture of xylitol using recombinant microbial hosts
US6924131B2 (en) Xylitol dehydrogenase of acetic acid bacteria and gene thereof
Povelainen et al. Production of d‐arabitol by a metabolic engineered strain of Bacillus subtilis
JP2008043325A (ja) 温度感受性アルコール脱水素酵素を有する酵母及び有機酸の製造方法
JP3968918B2 (ja) 酢酸菌のキシリトールデヒドロゲナーゼ及びその遺伝子
BR112016029704B1 (pt) Produção de xilitol a partir de glicose por uma cepa recombinante
Jeffries Shi et al.
Blalock Expression of pyruvate decarboxylase in a gram positive host: Sarcina ventriculi pyruvate decarboxylase versus other known pyruvate decarboxylases