PL179196B1 - wyizolowane skrócone bialko kinazy receptorowej BMP,zrekombinowane wektory ekspresyjne komórki gospodarzy,ssacze komórki gospodarzy, sposób wytwarzania skróconego bialka kinazy receptoro-wej BMP, sposób identyfikowania zwiazków oraz sposób otrzymywania przeciwcial PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1 Wyizolowane bialko kinazy receptorowej BMP, lub jego rozpuszczalny fragment, posiadajace sekwencje aminokwasowa przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4 2 Wyizolowana sekwencja DNA kodujaca sekwencje aminokwasowa przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4 lub jej fragment 3 Sekwencja DNA wedlug zastrz 2, znamienna tym, ze jest sekwencja przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 3 4 Wyizolowane skrócone bialko kinazy receptorowej BMP, lub jego rozpuszczalny fragment, posiadajace sekwencje aminokwasowa przedstawiona w sek- wencji o numerze identyfikacyjnym 2 5 Wyizolowana sekwencja DNA kodujaca sekwencje aminokwasowa przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 lub jej fragment 6 Sekwencja DNA wedlug zastrz 5, znamienna tym, ze jest sekwencja przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1 7 Rozpuszczalny fragment wyizolowanego skróconego bialka kinazy receptorowej BMP wedlug zastrz 4, znamienny tym, ze rozpuszczalny fragment posia- da sekwencje aminokwasowa przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6 8 Sekwencja DNA kodujaca sekwencje aminokwasowa przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6 9 Sekwencja DNA wedlug zastrz 8, znamienna tym, ze jest sekwencja przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5 10 Zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierajacy sekwencje DNA kodujaca sekwencje aminokwasowa przedstawiona w sekwencji o numerze identyfi- kacyjnym 4 lub jej fragment 11 Zrekombinowany wektor ekspresyjny wedlug zastrz 10, znamienny tym, ze zawiera sekwencje DNA przedstawiona w sekwencji o numerze identyfi- kacyjnym 3 12 Zrekombinowany wektor ekspresyjny wedlug zastrz 11, znamienny tym, ze wektorem jest plazmid posiadajacy wszystkie cechy charakterystyczne pJT4-J159F zawartego w ATCC numer 69457 13 Zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierajacy sekwencje DNA kodujaca sekwencje aminokwasowa przedstawiona w sekwencji o numerze identyfi- kacyjnym 2 lub jej fragment 14 Zrekombinowany wektor ekspresyjny wedlug zastrz 13, znamienny tym, ze zawiera sekwencje DNA przedstawiona w sekwencji o numerze identyfi- kacyjnym 1 15 Zrekombinowany wektor ekspresyjny wedlug zastrz 14, znamienny tym, ze wektorem jest plazmid posiadajacy wszystkie cechy charakterystyczne pJT6-J159T zawartego w ATCC numer 69474 16 Komorka gospodarza zawierajaca zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierajacy sekwencje DNA kodujaca sekwencje aminokwasowa przedsta- wiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4 lub jej fragment 17 Komorka gospodarza wedlug zastrz 16, znamienna tym, ze zawiera zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierajacy sekwencje DNA przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 3 18 Ssacza komórka gospodarza zawierajaca zrekombinowany wektor ekspresyjny bedacy plazmidem posiadajacym wszystkie cechy charakterystyczne pJT4-J159F zawartego w ATCC numer 69457 19 Ssacza komórka gospodarza wedlug zastrz 18, znamienna tym, ze komórka jest komórka jajnika chomika chinskiego 20 Ssacza komórka gospodarza wedlug zastrz 18, znamienna tym, ze komórka jest komórka COS PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowane białko kinazy receptorowej BMP, lub jego rozpuszczalny fragment, posiadające sekwencję aminokwasowąprzedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4.

179 196

Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowana sekwencja DNA kodująca sekwencję ammokwasowąprzedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 lub jej fragment. Korzystnie sekwencja ta charakteryzuje się tym, że jest sekwencjąprzedstawionąw sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3.

Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowane skrócone białko kinazy receptorowej BMP, lub jego rozpuszczalny fragment, posiadające sekwencję aminokwasowąprzedstawionąw sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2.

Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowana sekwencja DNA kodująca sekwencję aminokwasowąprzedstawionąw sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 lub jej fragment. Korzystnie taka sekwencja DNA charakteryzuje się tym, że jest sekwencjąprzedstawionąw sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1.

Korzystnie rozpuszczalny fragment według wynalazku charakteryzuje się tym, że rozpuszczalny fragment posiada sekwencję aminokwasowąprzedstawionąw sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 6.

Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja DNA kodująca sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 6. Korzystnie taka sekwencja DNA jest sekwencjąprzedstawionąw sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 5.

Przedmiotem wynalazku jest także zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą sekwencję aminokwasowąprzedstawionąw sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 lub jej fragment. Korzystnie zrekombinowany wektor ekspresyjny według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera sekwencję DNA przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3. Korzystniej charakteryzuje się on tym, że wektoremjest plazmid posiadający wszystkie cechy charakterystyczne pJT4-J159F zawartego w ATCC numer 69457.

Przedmiotem wynalazku jest także zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą sekwencję aminokwasowąprzedstawionąw sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 lub jej fragment. Korzystnie zrekombinowany wektor ekspresyjny według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera sekwencję DNA przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1. Korzystniej charakteryzuje się on tym, że wektoremjestplazmid posiadający wszystkie cechy charakterystyczne pJT6-J159T zawartego w ATCC numer 69474.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza zawierająca zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą sekwencję ammokwasowąprzedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 lub jej fragment. Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera zrekombinowany wektor eskpresyjny zawierający sekwencję DNA przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3.

Przedmiotem wynalazku jest także ssacza komórka gospodarza zawierająca zrekombinowany wektor ekspresyjny będący plazmidem posiadającym wszystkie cechy charakterystyczne pJT4-J159F zawartego w ATCC numer 69457. Korzystnie taka komórka jest komórką jajnika chomika chińskiego. Równie korzystnie taka komórka jest komórką COS.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza zawierająca zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą sekwencję ammokwasowąprzedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 lub jej fragment. Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera zrekombinowany wektor eskpresyjny zawierający sekwencję DNA przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1.

Przedmiotem wynalazku jest także ssacza komórka gospodarza zawierająca zrekombinowany wektor ekspresyjny będący plazmidem posiadającym wszystkie cechy charakterystyczne pJT6-J159T zawartego w ATCC numer 69474.

Korzystnie ssacza komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że jest komórkąjajnika chomika chińskiego.

Równie korzystnie ssacza komórka gospodarza według wynalazku charakteryzuje się tym, że jest komórką COS.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania skróconego białka kinazy receptorowej BMP obejmująca ekspresję tego białka w hodowli komórek gospodarza oraz jego izolowa

179 196 nie, charakteryzujący się tym, że stosuje się komórkę gospodarza zawierającązrekombinowany wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującąsekwencję aminokwasowąprzedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 lub jej fragment.

Korzystnie sposób ten charakteryzuje się tym, że stosuje się zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób identyfikowania związków zdolnych do wiązania z białkiem kinazy receptorowej BMP, obejmujący wprowadzanie próbki zawierającej związki do białka kinazy receptorowej BMP i umożliwianie związkom związanie się z białkiem kinazy receptorowej BMP, oraz badanie otrzymywania takiego wiązania, charakteryzujący się tym, że stosuje się białko kinazy receptorowej BMP posiadające sekwencję aminokwasową przedstawionąw sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 bądź jej rozpuszczalnego fragmentu, lub w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 bądź jej rozpuszczalnego fragmentu.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania przeciwciał skierowanych przeciw białku kinazy receptorowej BMP obejmujący immunizację zwierzęcia polipeptydem i odzyskiwanie ze zwierzęcia powstających przeciwciał, charakteryzujący się tym, że do immunizacji stosuje się wyizolowane białko kinazy receptorowej BMP, lub jego rozpuszczalny fragment, posiadające sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4.

Zatem niniejszy wynalazek ujawnia białko kinazy receptorowej BMP lub jego rozpuszczalny fragment. Korzystnie, białko BRK-1 posiada sekwencję aminokwasowąsekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4. Korzystnie, fragment rozpuszczalny posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 6; korzystnie rozpuszczalny fragment koduje sekwencja kwasu nukleinowego przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 5.

Wynalazek ujawnia także sekwencję DNA kodującą białko BRK-1. Sekwencja DNA może być sekwencjągenomowąlub cDNA. Korzystnie sekwencjąDNA jest sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3.

Wynalazek ujawnia także zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą białko BRK-1. Korzystnie, zrekombinowany wektor ekspresyjny jest plazmidem posiadającym wszystkie z charakterystycznych właściwości konstrukcji plazmidowej pJT4-J159F zawartej w ATTC numer 69457.

Wynalazek ujawnia także komórki gospodarza zawierające opisany powyżej zrekombinowany wektor ekspresyjny. Korzystnie, komórką gospodarza jest komórka ssaka, korzystniej, komórka CHO lub COS.

Wynalazek ujawnia także skrócone białko kinazy receptorowej BMK lub jego rozpuszczalny fragment. Korzystnie, t-BRK-1 posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2. Korzystnie, rozpuszczalny fragment t-BRK-1 posiada sekwencję aminokwasowąprzedstawionąw sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 6, korzystnie rozpuszczalny fragment t-BRK-1 jest kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego przedstawionąw sekwencji o. numerze identyfikacyjnym: 5.

Wynalazek ujawnia także sekwencję DNA kodującą t-BRK-1. Korzystnie, sekwencja DNA kodująca t-BRK-1 jest sekwencją o numerze identyfikacyjnym: 1.

Wynalazek ujawnia także zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą t-BRK-1. Korzystnie, zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym jest plazmid posiadający wszystkie z charakterystycznych właściwości konstrukcji plazmidowej p JT6-J159T zawartej w ATCC numer 69474.

Wynalazek ujawnia także komórkę gospodarza zawierającą zrekombinowany wektor ekspresyjny obejmujący t-BRK-1. Korzystnie, komórką gospodarza jest komórka ssacza; korzystniej komórka CHO lub COS.

Wynalazek ujawnia także metodę wytwarzania BRK-1 lub t-BRK-1, obejmującą izolowanie BRK-1 lub t-BRK-1 z opisanych powyżej komórek gospodarza.

Wynalazek ujawnia także metodę identyfikowania związków (np. BMP (korzystnie BMP-2 lub BMP-4) i innych związków dotychczas odkrytych) zdolnych do wiązania białka kinazy receptorowej BMP, obejmującej wprowadzanie próbki zawierającej związki do białka kina

179 196 zy receptorowej BMP i umożliwienie związkom wiązanie z białkiem kinazy receptorowej. Korzystnie białko kinazy receptorowej posiada sekwencję aminokwasowąprzedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 (t-BRK-1) lub jej rozpuszczalny fragment, bądź sekwencję aminokwasowąprzedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 (BRK-1) lub jej rozpuszczalny fragment. Metoda taka jest również użyteczna do określania ilości BMP lub innego związku wiążącego receptor, obecnego w próbce. Na przykład, stężenie BMP w próbce można określić przez oznaczenie z wykorzystaniem znakowanego radioaktywnie receptora, w którym nieznakowane BMP w próbce współzawodniczy ze znakowanym wskaźnikowym BMP o wiązanie z receptorem BRK-1 lub t-BRK-1. Gdy wzrasta ilość BMP w próbce, obniża ono ilość znakowanego BMP, który jest zdolny do wiązania z BRK-1 lub t-BRK-1. Porównanie z krzywą wzorcową przygotowaną dla znanych stężeń nieznakowanego BMP umożliwia dokładne określenie stężenia BMP w próbce. Znakowanie wskaźnikowego BMP przeprowadza się korzystnie przez jodowanie [¹²⁵J]NaJ. BRK-1 lub t-BRK-1 mogą ulegać ekspresji w zewnętrznej błonie stabilnej linii komórkowej lub być dostarczone w postaci rozpuszczalnego fragmentu, bądź rozpuszczalnego fragmentu kowalencyjnie połączonego ze stałym nośnikiem. W przeprowadzanym oznaczeniu nieznakowane BMP z próbki i znakowane wskaźnikowe BMP współzawodniczą o wiązanie z receptorem do chwili osiągnięcia równowagi.

Następnie kompleks receptor-BMP odizołowuje się od wolnego ligandu, na przykład przez odpłukanie (w przypadku przylegającej linii komórkowej), szybkie odsączenie lub odwirowanie (w przypadku linii komórek nie przylegających lub receptora związanego z stałym nośnikiem), bądź precypitację kompleksu receptor-ligand przeciwciałami, glikolem polietylenowym lub innym czynnikiem wytrącającym, a następnie odsączenie lub odwirowanie (w przypadku receptora rozpuszczalnego). Następnie określa się ilość wyznakowanego BMP w kompleksie, zazwyczaj przez pomiar promieniowania gamma, i porównuje ze znanymi wzorcami. Metody te opisano w literaturze dla innych receptorów (Williams, M. Med. Res. Rev., 11: 147184 (1991); Higuchi, M. i Aggarwal, B.B., Anal. Blochem. 204:53-58 (1992); Cain, M.J., R.K. Garlicki RM. Sweetman, J. Cardiovasc. Pharm., 17: S150-S151 (1191), z których każdą włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe) i można je łatwo dostosować do układu receptor BRK-1/BMP. Tę samą technikę można również stosować w badaniach przesiewowych o wysokiej wydajności, w celu identyfikacji związków zdolnych do wiązania z BRK-1 lub t-BRK-1. W takiej metodzie im wyższe jest powinowactwo związku do BRK-1 lub t-BRK-1 (bądź jej rozpuszczalnego fragmentu), tym skuteczniej będzie on współzawodniczył ż wskaźnikiem o wiązanie z receptorem i tym niższe będąpomiary promieniowania kompleksu receptor-ligand. W tym przypadku można porównać serie związków w tym samym zakresie stężenia, aby stwierdzić, który współzawodniczy o wiązanie receptora z najwyższym powinowactwem.

Wynalazek ujawnia także przeciwciała specyficzne wobec BRK-1 lub t-BRK-1 oraz metodę ich wytwarzania.

Korzystnie, do ekspresji BRK-1 lub t-BRK-1 w układach, w których białkowy produkt ma ulegać sekrecji, jak w komórkach ssaków, pierwsze 23 aminokwasy sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 6, tworzą sekwencję sygnałową, która kieruje produkt białkowy do aparatu sekrecyjnego komórki. Następnie produkt białkowy będzie ulegał inkorporacji do błony, jeśli obecna jest domena transbłonowa (jak w t-BRK-1 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2), lub BRK-1 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4)), lub sekrecji, jeśli brak jest domeny transbłonowej (jak w rozpuszczalnej postaci t-BRK-1 lub BRK-1 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6)). Jednakże, aminokwasy tworzące sekwencję sygnałową ulegają na ogół usunięciu przez proteolizę podczas obróbki potranslacyjnej, tak że przewiduje się, że dojrzałe białko po obróbce zaczynać się będzie od aminokwasu Gin 24.

Dla układów ekspresyjnych, w których produkt ulega wewnątrzkomórkowej akumulacji, jak w bakteriach (np. E. coli), aminokwasy tworzące sekwencję sygnałową powinno się korzystnie pominąć i do końca N dodać dodatkową metioninę, służącą jako kodon start.

179 196

Wynalazek ten jest użyteczny do określania, czy ligand, taki jak znany lub przypuszczalny lek, jest zdolny do wiązania i/lub aktywacji receptora BRK-1, kodowanego przez cząsteczkę DNA według niniejszego wynalazku. Transfekcja rzeczoną sekwencją DNA opisanych tu układów komórkowych dostarcza układ oznaczania zdolności ligandów wiązania i/lub aktywacji receptora kodowanego przez wyizolowaną cząsteczkę DNA. Zrekombinowane linie komórkowe, takie jak te tu opisane, użyteczne sąjako hodowle żyjących komórek do oznaczeń wiązania współzawodniczego pomiędzy znanymi i ewentualnymi lekami oraz ligandami, które wiążąsię z receptorem i które znakuje się odczynnikami radioaktywnymi, odczynnikami dającymi sygnał spektroskopowy lub innymi. Preparaty zawierających ligand błon wyizolowanych ze stransfekowanych komórek są również użyteczne do oznaczeń wiązania współzawodniczego. Rozpuszczalne receptory otrzymane z domeny wiążącej ligand receptora można także wykorzystać w badaniach przesiewowych o wysokiej wydajności ewentualnych leków. Funkcjonalne oznaczenia wewnątrzkomórkowego przesyłania sygnałów mogą służyć jako oznaczenia powinowactwa wiązania i skuteczności aktywacji działania receptora. Ponadto, zrekombinowane linie komórkowe można tak zmodyfikować, aby zawierały reporterowy gen połączony w sposób umożliwiający działanie z elementem odpowiedzialnym za odpowiedź, tak że sygnał wysłany przez receptor włącza gen reporterowy. Układ taki jest szczególnie użyteczny w badaniach przesiewowych o wysokiej wydajności ukierunkowanych na identyfikację agomstów receptora. Te zrekombinowane linie komórkowe stanowią „układ odkrywania leków”, użyteczny do identyfikacji naturalnych i syntetycznych związków, z których ewentualnie mogą powstać leki. Takie zidentyfikowane związki można dalej modyfikować, lub stosować bezpośrednio jako związki lecznicze do aktywacji łub hamowania naturalnych funkcji receptora kodowanego przez cząsteczkę DNA.

Stabilne linie komórkowe, w których zachodzi ekspresja dużej ilości BRK-1 lub jej rozpuszczalnej formy sąrównież użyteczne jako źródło białka do oczyszczania receptora. Oczyszczony receptor lub jego formę rozpuszczalną można następnie stosować w badaniach przesiewowych o wysokiej wydajności do opisanych powyżej celów. Oczyszczony receptor lub jego formę rozpuszczalną można również zastosować do określenia struktury kompleksu BMP:BRK-1, używając techniki dyfrakcji promieni X najego kryształach lub NMR, którą można następnie wykorzystać do racjonalnego projektowania agonistów lub antagonistów BMP.

Ujawnione tu sekwencje nukleotydowe, sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1 i sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3, są odpowiednio sekwencjami t-BRK-1 i BRK-1, wyizolowanymi z mysich komórek NIH3T3. Sekwencje te można łatwo zastosować do otrzymania cDNA BRK-1 z innych gatunków, takich jak człowiek. Te sekwencje cDNA można również łatwo zastosować do wyizolowania genomowego DNA BRK-1. Powinno to umożliwić analizę elementów regulujących, kontrolujących ekspresję genu receptora, co może stworzyć nowe możliwości interwencji terapeutycznej. Sekwencje nukleotydowe są również użyteczne do określania rozmieszczenia BRK-1 w tkankach normalnych i w stanach chorobowych, co umożliwia ocenę jej roli fizjologicznej in vivo.

W celu zilustrowania korzystnego rozwiązania niniejszego wynalazku, poniżej są szczegółowo omawiane nie ograniczające przykłady.

Przykład 1

Izolacja fragmentu BRK-1 PCR

Startery PCR projektuje się na podstawie przyporządkowania sekwencji białek kinaz receptorowych aktywiny (Mathews, L.S. i Vale, W.W., Celi 65: 973-982 (1991)) i Daf-1 (Georgi, L.L., Albert, P.S., i Riddle, D.L., Celi 61: 635-645 (1990)) w porównaniu z sekwencjami domen kinazowych bardzo zbliżonych cytozolowych kinaz białkowych raf (Nishida, Y, Hata, M., Toshikazu, A., Ryo, H., Yamagata, M., Shimizu, K., i Nishizuka, EMBO J. 7: 775-781 (1988) Bonner, T.L., Oppermann, H., Seeburg, P., Kerby, S.B., Gunnell, M.A., Young, A.C., i Rapp, U.R., Nucleic Acids Res. 14:1009-1015 (1986)). Przyporządkowanie to wykazuje, że kinazy receptorowe aktywiny i Daf-1 zawierająunikalną wstawkę w domenie kinazowej VI, która jest nieobecna w kinazach raf. W wyniku tego, projektuje się startery do wytwarzania fragmentów, które będą zawierać tę wstawkę i zwiększać prawdopodobieństwa sklonowania kinazy receptorowej, która

179 196 jest bardzo zbliżona do receptorów aktywiny i Daf-1. Starter sensowny projektuje się jako zdegenerowany starter oligonukleotydowy, który będzie kodować sekwencję białka E A/Y V A V K V/I F, stwierdzoną w domenie kinazowej II receptorów aktywiny i Daf-1. ACT2A i ACT2B są nazwami utworzonymi dla tego zestawu zdegenerowanych 5'-końcowych starterów PCR, które przedstawiono na figurze 1. Starter antysensowny projektuje się jako pulę zdegenerowanych starterów oligonukleotydowych, które będą kodować nić antysensowną, odpowiadającą sekwencji białka KPA M/IA/S H R DIK, stwierdzoną w domenie VIB receptorów aktywiny i Daf-1. ACT1A i ACTIB są nazwami utworzonymi dla tego zestawu zdegenerowanych 3'-końcowych starterów PCR, które przedstawiono na figurze 1.

Całkowity RNA izoluje się z mysich komórek NIH3T3 (ATCC CRL 1648) przy użyciu „RNAZOL” (Tel-Test, Friendswood, TX: roztwór do szybkiej izolacji RNA, zawierający tiocjanian guanidyny, fenol i β-merkaptoetanol). Następnie przygotowuje się chromatograficznie poły A-RNA przez chromatografię na oligo(dT)-celulozie (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ). Jednoniciowy DNA tworzy się z 200 ng poliadenylowanego mRNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy (zestaw do syntezy pierwszej nici z Stratagene, La Jolla, CA: zestaw ten zawiera składniki potrzebne do tworzenia cDNA z RNA, obejmujące odwrotną transkryptazę z wirusa mysiej białaczki Maloneya, startery, nukleotydy i bufory). Następnie amplifikuje się część tego materiału (20%) przez reakcję łańcuchowąpolimerazy (dalej w tym opisie PCR), przy użyciu 50 pmoli 5'-końco,wych starterów ACT2A i ACT2B, przedstawionych na figurze 1, oraz 250 pmoli każdego ze starterów 3'-końcowych, ACT1A i ACT IB, przedstawionych na figurze 1. Reakcję tę prowadzi się w objętości końcowej 100 μΐ przy użyciu zestawu „GENE-AMP” (Perkin-Elmer, Norwalk, CT: zestaw zawierający składniki potrzebne do amplifikacji DNA przez reakcję łańcuchową polimerazy, obejmujące „AMPLITAQ”, zrekombinowaną postać polimerazy DNA z Thermus aąuaticus (Perkin-Elmer, Norwalk, CT), nukleotydy i bufory), stosując urządzenie do cyklicznych zmian temperatury Perkin-Elmer. Stosuje się standardowe warunki reakcji PCR: topienia w temperaturze 94°C w ciągu 2 minut, następnie 35 cykli topienia (94°, 30 sekund), łączenia (55°, 30 sekund) i wydłużania (72°C, 30 sekund). Po zakończeniu tej pierwszej reakcji PCR, pobiera się próbkę mieszaniny reakcyjnej o objętości 10 μΐ i poddaje jąkolejnym 35 cyklom amplifikacji ze świeżymi odczynnikami. Następnie, produkty tej ponownej PCR hguje się z wektorem pCR 1000 (Invitrogen, San Diego, CA) do selekcji klonalnej i analizy sekwencji. Tąmetodą izoluje się fragment PCR o długości około 300 bp, którego sekwencja DNA wykazuje silnąhomologię z cDNA genów receptora Daf-ł (Georgi, L.L., Albert, P.S. i Riddle, D.L., Celi, 61: 635-,645 (1990) i receptora aktywiny mysiej typu Π (Mathews, L.S. i Vale, W.W., Celi, 65: 973-982 (1991)).

Przykład 2

Izolacja DNA t-BRK-1

Posiadając fragment PCR, konieczne jest następnie przeszukanie biblioteki cDNA tym fragmentem, w celu wyizolowania klonu receptora o pełnej długości.

Fragment PCR wycina się, oczyszcza przez elektroforezę w żelu i znakuje (a-³²P)-dCTP wykorzystując metodę losowego stosowania starterów przy użyciu „PRIME-IT” Random Primer Labeling Kit (Stratagene, La Jolla, CA: zestaw zawierający składniki potrzebne do losowego znakowania cDNA starterami, obejmujące polimerazę Klenowa pozbawioną aktywności egzonukleazy, losowe startery o długości 9 nukleotydów i bufory). Znakowaną sondę stosuje się następnie do przeszukania biblioteki cDNA przygotowanego z mysich komórek NIH3T3 w wektorze ,Λ ZAP II” (Stratagene, La Jolla, CA: wektor klonujący lambda, do którego można wprowadzać wstawki o długości do 10 kb i który umożliwia automatyczne wycinanie wstawek w plazmidzie „pBLUESCRIPT SK(-)”). Hybrydyzację prowadzi się w ciągu 24-48 godzin w temperaturze 42°C w 5X SSPE (IX SSPE = 0,15 MNaCl, 10 mMNa₂HPO₄ i 1 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)), IX roztworze Denhardta (0,02% albumina surowicy bydlęcej, 0,02% poliwynylopirolidon, 0,02% Ficoll), 100 pg/ml DNA z jąder łososia, 50% formamid. Membrany przemywa się najpierw w temperaturze 42°C, a następnie w temperaturze 55°C w 0,1 X SSPE i 0,2% sodowym siarczanie dodecylu (SDS), a dodatnie łysinki identyfikuje się przez autoradiogra

179 196 fię w temperaturze -70°C na kliszy „KODAK Χ-ΟΜΑΤ AR” (Kodak Rochester, NY: klisza do dokumentacji naukowej) w kasecie z ekranem wzmacniającym. Rozcieńczenie i przeszukanie pozytywnych łysinek pozwala uzyskać wyizolowanego czystego faga, oznaczonego jako J159#7.

Miejsce klonujące w wektorze ,Λ ZAP Π” zawiera sekwencję plazmidu „pBLUESCRIPT SK(-)” (Stratagene, La Jolla CA: tworzący kolonie fagemid o długości 2,96 kb, pochodzący od pUC19). Tę plazmidową sekwencję, zawierającą sklonowaną wstawkę, wycina się z oczyszczonego faga lambda J159#7, przy użyciu faga pomocniczego R408 (Stratagene, La Jolla, CA). W ten sposób uzyskuj e się cDNA t-BRK-1 zsubklonowany w „pBLUESCRIPT SK(-)”. Otrzymany plazmid, który oznaczyliśmy jako pBLUESCRIPT-J159T, jest odpowiedni do analizy sekwencji.

Przykład 3

Analiza sekwencji t-BRK-1

Następnie sekwencjonuje się obie nici wyizolowanego plazmidu pBLUESCRIPT-J159T, zawierającego cDNA t-BRK-1, stosując albo zestaw „SEQUENASE” wersja 2.0 (U.S. Biochemicals, Cleveland, OH: zestaw zawierający składniki do manualnego sekwencjonowania DNA, przy użyciu metody terminacji dideoksynukleotydami, obejmujące „SEQUENASE” (zmodyfikowaną postać polimerazy DNA T7 pozbawioną aktywności egzonukleazy (U.S. Biochemicals, Cleveland, OH), mieszaniny nukleotydów do znakowania i wydłużania, dideoksynukleotydy terminujące, pirofosfatazę i bufory), albo „TAQ DYE DEOXY” Terminator Cycle Seąuencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA: zestaw zawierający składniki do zautomatyzowanego sekwencjonowania DNA przy użyciu metody terminacji dideoksynukleotydami, obejmujące „AMLITAQ”, mieszaninę nukleotydów, znakowane barwnikiem dideoksynukleotydy terminujące i bufory) w sekwenatorze DNA Model 373A (Applied Biosystems, Foster City, CA). Cała sekwencja DNA (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1) posiada otwartą ramkę odczytu o długości 1500 par zasad po kodonie inicjacji ATG.

Porównanie tej sekwencji z sekwencjami znanych kinaz receptorowych z rodziny TGF-β wykazuje silną homo logię, ale wskazuje, że domena kinazowa t-BRK-1 jest znacznie krótsza od domen kinazowych zbliżonych kinaz receptorowych (figura 2). Badania mutacyjne kinazy src dostarczyły informacji, która uściśla minimalną liczbę reszt aminokwasowych, które sąkonieczne przy końcu C domeny kinazowej do funkcjonowania kinazy jako aktywnego enzymu. Delecje aminokwasów przed tym obszarem dają nieaktywne kinazy, przypuszczalnie z powodu destabilizacji struktury kinazowej (Yaciuk, P. i Shalloway, D., Molec. and Celi. Biol., 6: 2807-2819 (1986)). Dlatego, specjaliści w tej dziedzinie generalnie zgadzają się co do tego, że koniec domeny kinazowej występuje przy reszcie hydrofobowej, umiejscowionej o 10 reszt za niezmienną resztą argininy w domenie kinazowej XI dla kinaz tyrozynowych, lub odpowiednio 12-18 aminokwasów za tej niezmienną resztą argininy dla kinaz serynowych/treoninowych (Hanks, S.K. i Quinn, A.M., Meth. Enzymol., 200: 38-62 (1991)). Region ten oznaczono na figurze 2 nawiasem kwadratowym. Kodon stop w t-BRK-1 umiejscowiony jest 20 aminokwasów przed początkiem regionu, który wyznacza koniec domeny kinazowej, i dlatego uważa się, że t-BRK-1 jest klonem skróconego receptora. Dalsze analizy sekwencji ujawniają domniemane nienaruszone połączenie intron-egzon w pozycji 1763, wskazując na możliwość, że RNA matrycowy, który służył jako matryca dla tego cDNA, ulegał niecałkowitemu potranskrypcyjnemu wycinaniu intronów, w taki sposób, że część intronu została włączona do sekwencji.

W końcu N białka zidentyfikowano eukariotyczną sekwencj ę sygnałową z przewidywanym miejscem rozszczepienia pomiędzy aminokwasami 23 i 24 (patrz sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2). Tak więc, oczekuje się, że po obróbce potrahslacyjnej dojrzałe białko zaczynać się będzie od aminokwasu Gln24. Region o wysokiej hydrofobowości pomiędzy aminokwasami 153-176 wskazuje na obecność regionu transbłonowego, który dzieli białko na zewnątrzkomórkową domenę wiążącą Ugand i wewnątrzkomórkową domenę kinazową.

179 196

Przykład 4

Izolacja DNA BRK-1

W celu wyizolowania cDNA BRK-1, który me zawiera przedwczesnego zakończenia w domenie kinazowej, przygotowuje się inną bibliotekę cDNA z szerszą reprezentacją mRNA z poli A+ RNA NIH3T3 (Stratagene, La Jolla, CA). Do syntezy tej biblioteki cDNA, skonstruowanej w „UNI-ZAP XR” (Stratagene, La Jolla, CA: wektor klonujący lambda, pozwalający na konstruowanie bibliotek cDNA o jednej orientacji), wykorzystuje się zarówno sekwencję poli dT, jak i losowy starter. Bibliotekę tę przeszukuje się następnie znakowanym ³²P fragmentem PCR J159 przy użyciu metody losowego stosowania starterów („PRJME-IT” Random Primer Labelmg Kit). Przeszukiwanie i izolację klonów prowadzi się jak opisano powyżej (przykład 2). Otrzymuje się kilka dodatkowych klonów i poddaje je analizie sekwencji.

Przykład 5

Analiza sekwencji BRK-1

Analizę sekwencji klonów prowadzi się przy użyciu „TAQ DYE DEOXY” Terminator Cycle Seąuencing Kit i Applied Biosystems Model 373A DNA Seąuencer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Porównanie sekwencji klonów z sekwencją t-BRK-1 i innych kinaz receptorowych (figura 2) wskazuje, że jeden klon (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 3) zawiera sekwencję kodującą o pełnej długości, bez obecności żadnego intronu, i całą domenę kinazową. Plazmid z tego klonu oznaczono jako pBLUESCRIPT-J159F. Otwarta ramka odczytu ma długość 1596 par zasad i koduje białko o długości 532 aminokwasów, o przewidywanej masie cząsteczkowej około 60.059. Ten cDNA oznaczono jako BRK-1.

J Sekwencja DNA BRK-1 jest identyczna z sekwencją t-BRK-1 w rejonie nukleotydów 1-1483 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3 (nukleotydy 281-1763 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1), i dlatego identyczna pod względem sekwencji aminokwasowej w rejonie aminokwasów 1-491 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 i w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2: Tak więc, sekwencja sygnałowa w końcu N i domena transbłonowa, obserwowane.w t-BRK-1 i opisane w przykładzie 3, są tak samo obecne w BRK-1 o pełnej długości. Cała domena wiążąca ligand jest także identyczna. Sekwencja nukloetydowa t-BRK-1 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1) zawiera wstawkę o długości 90 par zasad (nukleotydy 1764-1853), nieobecnąw sekwencji nukleotydowej BRK-1 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3), która może stanowić część niecałkowicie wyciętego intronu. Od tego miejsca, nukleotydy 1854-2035 sekwencji t-BRK-1 są identyczne z nukleoty darni 1484-1665 sekwencji BRK-1. Zatem, usunięcie wstawki o długości 90 par zasad w t-BRK-1 daje sekwencję kodującą identyczną z sekwencją BRK-1.

Przykład 6

Tworzenie przeciwciał skierowanych przeciw BRK-1

W celu wykazania ekspresji receptora BRK-1, wykazania wiązania ligandu i dla identyfikacji innych białek, które mogą tworzyć kompleksy z BRK-1, wysoce użyteczna jest dostępność przeciwciał swoistych wobec receptora. A zatem, do tego celu wytwarza się poliklonalne surowice odpornościowe królików, stosując dwa antygeny.

Po pierwsze, w E. coli prowadzi się ekspresję dojrzałej zewnątrzkomórkowej domeny wiążącej ligand, obejmującej aminokwasy 24-152 sekwencji o numerze identyfikacyjnymi (lub aminokwasy 24-152 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4), stosując bakteryjny układ ekspresyjny „QIA EXPRESS” (Qiagen, Chatsworth, CA: zestaw do ekspresji wysokich poziomów białek w E. coli, który wbudowuje do białka zakończenie odpowiedzialne za powinowactwo, w postaci sześciu histydyn, dla umożliwienia szybkiego oczyszczania zrekombinowanego białka przez chromatografię chelatacji metalu: zestaw zawiera wektor ekspresyjny pQE-12, plazmid kodujący represor lac, szczepy gospodarza E. coli i żywicę do chelatacji). Część sekwencji nukleotydowej obejmująca nukleotydy 360-746 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1 (lub nukleotydy 80 do 466 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3) amplifikuje się przez reakcję łańcuchowąpolimerazy, przy użyciu starterów, które wprowadzają miejsca Bgl Uw końcach 5' i 3'. Szczegółowo, starterem dla końca 5'jest CCATAGATCTCAGAATCTAGATAGT, a dla końca 3' GGTAAGA

179 196

TCTTCGGATCCTGCCATC. /amplifikowaną wstawkę wprowadza się do wektora PQE12 (Qiagen, Chatsworth, CA), który kieruje ekspresją wstawki z sześcioma histydynami w końcu C białka. Po transformacji tą konstrukcją szczepu E. coli JM101, stransformowany szczep hoduje się w bulionie LB, uzupełnianym w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego izopropylotio-p-galaktozydem (IPTG), który indukuje ekspresję białka kierowaną przez promotor lac. W trzy godziny po dodaniu IPTG, komórki zbiera się przez wirowanie i lizuje w komorze ciśnieniowej „FRENCH” (SLM-Aminco, Urbana, IL: jednostka dyspersyjna do dezintegracji bakterii pod wysokim ciśnieniem przy użyciu prasy hydraulicznej), stosując dwa etapy przy ciśnieniu 16 000 psi. Domenę zewnątrzkomórkową oczyszcza się chromatograficznie na kolumnie do chelatacji z metalicznym niklem, zgodnie z instrukcjami producenta. Dalsze oczyszczenie osiąga się przez chromatografię na preparatywnej kolumnie z odwróconymi fazami C4 (kolumna Waters DeltaPak C4,300 A, 7,8 mm x 30 cm, Millipore, Milford, MA), stosując liniowy gradient 0,05% TFA (kwas trifluorooctowy) w wodzie do 0,05% TFA w 80% acetonitrylu w ciągu 90 minut, z szybkościąprzepływu 2,8 ml/min. Frakcje piku ulegającego elucji przy 38% acetonitrylu łączy się, suszone pod zmniejszonym ciśnieniem i używa do immunizacji trzech królików rasy New Zealand White (Hazleton Washington, Vienna, VA). Antysurowice ocenia się przez blotting typu Western pod względem ich zdolności do wykrywania oczyszczonego antygenu z E. coli. Antysurowicę o najwyższym mianie oznaczono 1353.

Drugi antygen, przeznaczony do rozpoznawania wenątrzkomórkowej domeny kinazowej, tworzy się z peptydu posiadającego identyczną sekwencję aminokwasową do aminokwasów 398-420 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 (lub aminokwasów 398-420 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2), z dodaniem cysteiny przy końcu C, dla umożliwienia koniugacji peptydu: tj. stosując jednoliterowe skróty nazw aminokwasów, LNTRVGTKRYMAPEVLDESLNKNC. Porównanie sekwencji aminokwasowej domeny kinazowej BRK-1 z domeną kinazową białka Raf sugeruje, że ten region BRK-1 odpowiada regionowi kinazy Raf, który użyto do sporządzenia wysoce swoistych przeciwciał (Kolch, W., Weissinger, E., Mischak, H., Troppmair, J., Showalter, S.D., Lloyd, P., Heidecker, G. i Rapp, U.R., Oncogene 5:713-720 (1990)). Peptyd ten koniuguje się standardowymi metodami z hemocyjaniną skałoczepa i stosuje do immunizacji trzech królików rasy New Zealand White (Hazleton Washington, Vienna, VA). Otrzymane antysurowice ocenia się pod względem ich zdolności do rozpoznawania wyjściowego peptydu opłaszczonego na plastiku, przy użyciu testu ELISA z wychwytem przeciwciał (test immunosorbcji z wykorzystaniem reakcji enzymatycznej). Antysurowice oznaczono 1378, 1379 i 1380.

Przykład 7

Ekspresja BRK-1

W celu określenia funkcji BRK-1, konieczne jest przeprowadzenie ekspresji białka i sprawdzenie, czy wiąże ono swoisty ligand. Korzystnie, przeprowadza się to stosując ssacząlinię komórkową, ponieważ maksymalnie zwiększa to szansę ekspresji w błonie komórkowej białka poddanego prawidłowej obróbce potransłacyjnej. W tym celu cDNA BRK-1 subklonuje się w wektorze ekspresyjnym pJT4, tworząc plazmid pJT4-J159F. Wstawkę BRK-1 z pBLUESCRIPT-J159F trawi się endonukleazą restrykcyjną Alf ΠΙ, tworząc przeprowadzony w postać liniowąplazmid z pojedynczym lepkim końcem. Lepki koniec wypełnia się przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy DNA I, tworząc koniec tępy. Przeprowadzony w postać liniowąplazmid trawi się następnie Not I, uwalniając z niego wstawkę. Wektor ekspresyjny pJT4 trawi się Not I i EcoRV i liguje ze wstawką. Tępy koniec utworzony przez reakcję Klenowa jest zgodny z miejscem EcoRV, które jest także tępym końcem; ligacja eliminuje miejsce Eco RV. Otrzymaną konstrukcję przedstawiono na figurze 3.

Wektor pJT4, zoptymalizowany do krótkotrwałej ekspresji w komórkach COS, zawiera wczesny promotor i sekwencję wzmacniającą wirusa cytomegalii, która zapewnia bardzo efektywną transkrypcję matrycowego RNA; element „R” z długiego powtórzenia terminalnego ludzkiego wirusa białaczki komórek T-l, który, jak wykazano, zwiększa dalej poziomy ekspresji (Takebe, Y.,M. Seiki, J.-I. Fujisawa, P. Hoy, K- Yokota, M. YoshidaiN. Arai, Moll. CeliBiol., 8: 466-472 (1988)); miejsce wycinania intronu z SV40, o którym sądzi się, że wzmacnia stabilność

179 196 matrycowego RNA; miejsce wielokrotnego klonowania; sygnał poliadenylacji pochodzący z SV40, który kieruje dołączaniem sekwencji poli A do matrycowego RNA, co jest wymagane dla większości eukariotycznych mRNA; i miejsce początku replikacji SV40, które pozwala na rephkację plazmidu w skrajnie wysokiej liczbie kopii w komórkach zawierających duży antygen T SV40, takich jak komórki COS. Ponadto, dla manipulacji i amplifikacji wektora w bakteriach, zawiera on miejsce początku replikacji E. coli i gen oporności na ampicylinę.

Krótkotrwałą ekspresję BRK-1 przy użyciu pJT4-J159F prowadzi się w komórkach COS-7 (ATCC CRL 1651) stosując elektroporację. Komórki hoduje się do uzyskania spójnej warstwy w podłożu DMA (zmodyfikowane podłoże Eagle Dulbecco) o wysokiej zawartości glukozy, wzbogaconym 5% płodowej surowicy bydlęcej (Hyclone, Logan, Utah), aminokwasami endogennymi (GIBCO, Gaitnersburg, MD) i glutaminą, następnie trypsynizuje się dla uwolnienia komórek z płytki. Oderwane komórki osadza się w wirówce stołowej, następnie ponownie zawiesza się w świeżej pożywce w stężeniu 6,25 χ 10⁶ komórek/ml. Zawiesinę komórek (5 χ 10⁶ komórek, 0,8 ml) przenosi się do kuwety układu do elektroporacji Bio Rad „GENE PULSER” (BioRad, Herculec, CA). Oczyszczony plazmid DNA (10 pg) dodaje się do kuwety, i komórki poddaje się elektroporacji przy 4,0 kV/cm z kapacytancją 25 pFd. Następnie komórki wysiewa się na płytki i umożliwia ich ponowny wzrost. Po 24 godzinach dodaje się świeżąpożywkę. Po 48 godzinach komórki są gotowe do testowania wiązania BMP-4.

Przykład 8

Ekspresja t-BRK-1

Dla ekspresji t-BRK-1, wstawkę cDNA z pBLUESCRIPT-J159T wycina się przy użyciu endonukleaz restrykcyjnych Not I i Xho I i subklonuje w miejscach Not I i Sal I wektora ekspresyjnego pJT6, tworząc konstrukcję pJT6-J159T przedstawioną na figurze 4. Wektor pJT6 jest identyczny z pJT4, opisanym w przykładzie 6, z wyjątkiem odwrotnej orientacji miejsca wielokrotnego klonowania i obecności DNA zwiększającego odległość między miejscami Pst I a Barn HI regionu wielokrotnego klonowania.

Krótkotrwałą ekspresję t-BRK-1 w komórkach COS przy użyciu konstrukcji pJT6-J159T przeprowadza się dokładnie tak, jak opisano powyżej dla BRK-1 (przykład 7).

Przykład 9

Przygotowanie znakowanych radioaktywnie ligandów BMP

Preferowanym znakowanym radioaktywnie ligandem we wszystkich tych badaniach jest BMP-4. BMP-4 znakuje się ¹²⁵J metodą z zastosowaniem chloraminy-T (Frolik, C.A., Wakefield, L.M., Smith, D.M. i Spom, M.B., J. Biol. Chem., 259:10995-11000 (1984)). BMP-4 (2 pg) rozpuszcza się w 5 μΐ 30% acetonitrylu, 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA) oraz dodatkowych 5 μ! 1,5 M fosforanu sodowego, pH 7,4. [¹²⁵J] bez nośnika (1 mCi, 4-10 ul) dodaje się razem z 2μ1 roztworu chloraminy T (100 pg/ml). Dodatkowe 2 μΐ roztworu chloraminy T dodaje się po 2 i 3,5 minutach. Po 4,5 minutach reakcję zatrzymuje się przez dodanie 10 μΐ 50 mM N-acetylotyrozyny, 100 μΐ 60 mM jodku potasu i 100 μΐ 11M mocznika w 1 M kwasie octowym. Po 3,5 minutach inkubacji usuwa się nieprzereagowanyjod na kolumnie do sączenia molekularnego PD-10 (Pharmacia, Piscataway, NJ) w 4 mM HC1, 75 mM NaCl, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Otrzymane znakowane białko w>95% ulega wytrąceniu kwasem trichlorooctowym, co oznacza, że cały [¹²⁵J] jest związany z białkiem i posiada zazwyczaj aktywność właściwą 3000-8000 Ci/mmol.

BMP-2 można wyznakować radioaktywnie w ten sam sposób i stosować jako ligand znakowany radioaktywnie. Jednakże, zastosowanie BMP-2 powoduje bardzo wysokie wiązanie niespecyficzne, przypuszczalnie w wyniku wiązania BMP-2 z białkami matriks pozakomórkowej. Takie niespecyficzne wiązanie można znacznie obniżyć, i tym samym znacznie poprawić użyteczność BMP-2 jako znakowanego radioaktywnie ligandu, przez usunięcie końca aminowego białka, przypuszczalnie dlatego, że powoduje to usunięcie regionu odpowiedzialnego za wiązanie z matriks pozakomórkową. Usunięcia końca aminowego BMP-2 można dokonać przez częściową proteolizę trypsyną (Wozney, J.M., Mol. Rep. Dev., 32: 160-167 (1992)). Pozwala to

179 196 uzyskać pochodną oznaczonąjako „BMP-2 skrócone przez trawienie trypsyną” lub DR-BMP-2. Przygotowywanie i oczyszczanie DR-BMP-2 przeprowadza się w sposób opisany poniżej.

BMP-2 (100-250 pg) rozpuszcza się w 500 μΐ 4 M mocznika, 0,1 MNaĆl, 0,05 M Tris-HCl (pH 8,2). Trypsynę (czysta do sekwencjonowania; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) dodaje się w stosunku trypsyna/BMP-2 1/50 (w/w), i mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37°C w ciągu 2 godzin. Trawienie zatrzymuje się przez dodanie fenylometylosulfonylo fluorku (PMSF) do stężenia końcowego 1 mM i mieszaninę zamraża się i przechowuje w temperaturze -20°C do czasu oczyszczania.

DR-BMP-2 oczyszczany jest z mieszaniny reakcyjnej przez HPCL (wysokosprawna chromatografia cieczowa) z odwróconymi fazami na kolumnie Waters Delta-Pak C4 (5 pm, 300 A, 3,9 x 150 mm: Millipore Corp., Milford, MA). Całą mieszaninę wstrzykuje się bezpośrednio na kolumnę, a DR-BMP-2 eluuje się przy użyciu liniowego gradientu od 0,05% TFA do 0,05% TFA, 60% acetonitrylu w ciągu 80 minut z szybkością przepływu 0,7 ml/min. Większość DR-BMP-2 ulega elucji w postaci wyraźnie zdefiniowanego piku przy około 36% acetonitrylu, jak monitorowano przez pomiar absorbancji przy długości fali 214 nm i po wybarwieniu błękitem Coomassie’go żelu poliakryloamidowego z SDS. PMSF, trypsyną zinaktywowana PMSF i ewentualnie pozostałe nienaruszone BMP-2 ulegają w tych warunkach chromatografii oddzieleniu się od DR-BMP-2. Oczyszczone DR-BMP-2 dzieli się na porcje, suszy pod zmniejszonym ciśnieniem i przechowuje w temperaturze -20°C.

Analiza przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z SDS wykazuje, że masa cząsteczkowa DR-BMP-2 jest obniżona o około 2000 daltonów w porównaniu do BMP-2 w warunkach nieredukujących i o około 1000 daltonów w warunkach redukujących. Zsekwencjonowanie końca aminowego białka wykazuje, że w przybliżeniu 70% DR-BMP-2 rozpoczyna się od Lys290, podczas gdy pozostałe 30% rozpoczyna się od Leu292. Wyniki analizy składu aminokwasowego są całkowicie zgodne z wynikami sekwencjonowania i sugerują, że traktowanie trypsyną nie wpływa na koniec COOH białka. Znakowanie radioaktywne DR-BMP-2 przeprowadza się dokładnie jak opisano dla BMP-4.

Przykład 10

Wiązanie BMP z BRK-1

Wiązanie DR-BMP-2 i BMP-4 z BRK-1 można wykazać trzema różnymi metodami: przez wiązanie znakowanego radioaktywnie BMP z całymi komórkami, kowalencyjne sieciowanie znakowanego radioaktywnie BMP z receptorem oraz immunoprecypitację receptora usieciowanego ze znakowanym ligandem. Te trzy metody opisano szczegółowo poniżej.

Do doświadczeń z wiązaniem z całymi komórkami, komórki COS-7 transfekuje się pJ159F jak opisano w przykładzie 7. Po elektroporacji komórki sieje się w 12-studzienkowych płytkach w ilości 670 000 komórek/studzienkę. Po 24 godzinach wymienia się podłoże, a doświadczenia wiązania przeprowadza się po 48 godzinach. W tym czasie komórki przemywa się raz buforem do wiązania (50 mM bufor Hepes, pH 7,4,128 mMNaCl, 5 mM KC1,5 mMMgSO₄,1,2 mM CaCl₂,2 mg/ml BSA), następnie równoważy w tym samym buforze w temperaturze 4°C w ciągu 30 minut łagodnie wytrząsając. Następnie bufor odciąga się i do każdej studzienki dodaje się 500 μΐ buforu do wiązania (4°C) zawierającego wskaźnikowy [¹²⁵ J]-BMP-4 (100 pM), jak również, w zależności od oznaczenia, różne stężenia nieznakowanego BMP-2, BMP-4 lub innego nieznakowanego ligandu. W celu określenia wiązania niespecyficznego, do buforu do wiązania dodaje się BMP-2 w 10 nM stężeniu końcowym. Dla zapobiegnięcia degradacji ligandu podczas inkubacji dodaje się również mieszaninę inhibitorów proteaz w ilościach pozwalających na uzyskanie stężeń końcowych 10 pg/ml leupeptyny, 10 pg/ml antypainy, 50 pg/ml aprotyniny, 100 pg/ml benzoamidyny, 100 pg/ml sojowego inhibitora trypsyny, 10 pg/mlbestatyny, 10 pg/ml pepstatyny i 300 μΜ PMSF. Komórki inkubuje się w ciągu 4 godzin w temperaturze 4°C z łagodnym wytrząsaniem. Po zakończeniu okresu inkubacji bufor odciąga się i komórki przemywa się czterokrotnie 1 ml buforu do przemywania (50 mM HEPES, pH 7,4,128 mM NaCl, 5 mM KC1, 5 mM MgSO₄,1,2 mM CaCl₂, 0,5 mg/ml BSA). Po odciągnięciu ostatniego przemywania, do każdej studzienki dodaje się 750 μΐ buforu do solubilizacji (10 mM TrisCl, pH 7,4,1 mM EDTA, 1% (v/v) Triton Χ-100) i inkubuje w

179 196 temperaturze pokojowej w ciągu 15 minut. Zsolubilizowane komórki przenosi się następnie do nowych probówek i radioaktywność mierzy w liczniku promieniowania gamma Packard, model 5005 „COBRA” (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL).

Wyniki takiego doświadczenia przedstawiono na figurze 5. Specyficzne wiązanie [¹²⁵J]-BMP-4 z komórkami COS-7 stransfekowanymi cDNA BRK-1 (przy zastosowaniu konstrukcji pJT4-Jl 59F) jest trzykrotnie wyższe od wiązania z kontrolnymi stransfekowanymi komórkami COS-7.

W celu uzyskania bardziej ilościowej charakterystyki wiązania BRK-1, przeprowadza się analizę wysycenia wiązania z komórkami COS-7 stransfekowanymi cDNA BRK-1 z zastosowaniem konstrukcji pJT4-J159F. Wiązanie [^I25J]-BMP-4 bada się w szerokim zakresie stężeń, 10-1000 pM, z wiązaniem niespecyficznym określonym przez zastosowanie 10 nM nieznakowanym BMP-4. Dane wiązania analizowano stosując program LIGAND (wersja 3,0; Elsevier-Biosoft, Cambridge, Wielka Brytania), uzyskując powinowactwo (K_d) BRK-1 wynoszące 5 x 10'·⁰ M, co jest zgodne z zakresem fizjologicznym oczekiwanym dla receptora BMP.

Druga metoda wykazywania wiązania BMP z BRK-1 polega na sieciowaniu znakowanego, radioaktywnie hgandu z receptorem BRK-1. W metodzie tej stosuje się bifunkcjonalny odczynnik sieciujący disukcynimidylosuberan (DSS) (Pierce Chemical, Rockford, IL) do kowalencyjnego sieciowania związanego radioaktywnego ligandu z jego receptorem przez reakcję z wolnymi grupami aminowymi reszt lizyny dwóch białek. Po sieciowaniu białka komórkowe rozdziela się przez elektroforezę żelową i uwidacznia radioaktywne prążki. Wyznakowane prążki odpowiadają receptorowi z selektywnie „ przywiązanym” radioaktywnym ligandem. W procedurze tej komórki transfekuje się pJT4-Jl 59F jak opisano w przykładzie 7, następnie wysiewa na 12-studzienkowe płytki w ilości 670 000 komórek/studzienkę. Po 24 godzinach wymienia się podłoże. Po 48 godzinach od elektroporacji komórki przemywa się, równoważy i inkubuje z [¹²⁵J]-BMP-4 lub [¹²⁵J]-DRBMP-2 i współzawodniczącymi nieznakowanymi Ugandami, jak opisano w tym przykładzie dla badań wiązania z całymi komórkami. Po zakończeniu 4-godzmnej inkubacji z ligandem, komórki przemywa się trzy razy w temperaturze 4°C 2 ml buforu do wiązania posiadającego taki sam skład, jak opisano powyżej, z tym wyjątkiem, że nie dodaje się BSA. Do każdej studzienki dodaje się następnie 1 ml świeżego buforu do wiązania bez BSA, a następnie świeżo przygotowanego DSS do 135 μΜ stężenia końcowego. Po łagodnym zamieszaniu dla wymieszania DSS, płytki inkubuje się w ciągu dokładnie 15 minut w temperaturze 4°C z łagodnym wytrząsaniem. W tym momencie podłoże odciąga się i komórki przemywa 3 ml buforu do uwalniania (10 mM Tris, 0,25 M sacharoza, 1 mM EDTA, 0,3 mM PMSF, pH 7,4). Do każdej studzienki dodaje się dodatkowe 0,75 ml buforu do uwalniania; komórki zdrapuje się do buforu i przenosi do nowych probówek do mikro wirówki. Każdą studzienkę przemywa się następnie dodatkowym 0,5 ml buforu do uwalniania dodawanego do odpowiadającej probówki. Próbki wiruje się (13 000 x g, 15 minut) i odrzuca supematant. Osady rozpuszcza się w 20 μΐ redukującego buforu do próbek (125 mMTrisCl, pH 6,8,1% β-merkaptoetanol, 2% SDS, 0,1% błękit bromofenolowy, 10% glicerol), wytrząsa w ciągu 30-45 minut w temperaturze 4°C, gotuje w ciągu 5 minut i wiruje (13 000 x g, 5 minut). Supematanty nakłada się na 7,5% żele poliakryloamidowe z SDS i poddaje elektroforezie. Żele barwi się w 0,12% błękicie Coomassiego, 5% metanolu, 7% kwasie octowym, odbarwia w 5% metanolu, 7,5% kwasie octowym, następnie suszy pomiędzy arkuszami celofanu. Radioaktywność na wysuszonych żelach uwidacznia się i oznacza ilościowo stosując Phosphorlmager (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) lub poddaje autoradiografii stosując kliszę „KODAK Χ-ΟΜΑΤ AR” (Kodak, Rochester, NY).

Wyniki takiego doświadczenia przedstawiono na figurze 6. Figura 6A przedstawia sieciowanie [¹²⁵J]-BMP-4 z komórkami COS-7 stransfekowanymi BRK-1 z zastosowaniem konstrukcji pJT4-J 159F. Zauważ na ścieżce A obecność znakowanego prążka w pozycji odpowiadającej masie cząsteczkowej 76 800, który odpowiada BRK-1 kowalencyjnie usieciowanej z BMP-4. Prążek ten ulega znacznemu zmniej szeniu w wyniku dodania 10 ηΜ BMP-2 do komórek podczas inkubacji, a jest nieobecny w kontrolnych stransfekowanych komórkach COS. Wskazuje to na specyficzne wiązanie BMP-4 z BRK-1. Ponieważ wyznakowany prążek odpowiada receptorowi

179 196 kowalencyjnie usieciowanemu z BMP-4 (masa cząsteczkowa monomeru 16 400), masę cząsteczkową receptora można oszacować na 60 400, co jest zgodne z sekwencją aminokwasową BRK-1. Figura 6B przedstawia to samo doświadczenie z zastosowaniem jako ligandu [¹²⁵J]-DRBMP-2. Obserwuje się podobny wyznakowany prążek. Jak dla [¹²⁵J]-BMP-4, wyznakowany prążek ulega znacznemu zmniejszeniu w wyniku dodania 10 ηΜ BMP-2 do komórek, i nie występuje w kontrolnych stransfekowanych komórkach. Łącznie dane te wskazują, że zarówno BMP-2, jak i BMP-4 specyficznie wiążą się z BRK-1.

W trzecim sposobie wykazania wiązania BMP z BRK-1, komórki COS stransfekowane cDNA BRK-1 najpierw sieciuje się z [¹²⁵ J]-BMP-4, a następnie poddaje immunoprecypitacji przeciwciałami specyficznymi wobec BRK-1. W procedurze tej komórki COS-7 transfekuje się pJT-J159F j ak opisano w przykładzie 7 i wysiewa na płytki o średnicy 100 mm w ilości 1 x 10⁷ komórek/płytkę. Następnie poddaje się je sieciowaniu [¹²⁵J]-BMP-4, jak opisano w tym przykładzie, z tym wyjątkiem, że inkubację z [¹²⁵J]-BMP-4 i nieznakowanym ligandem przeprowadza się w objętości całkowitej 4 ml, a nie 500 μΐ, i wszystkie pozostałe objętości odpowiednio wzrastają. Po sieciowaniu komórki przemywa się trzykrotnie schłodzoną lodem PBS [solą fizjologiczną zbuforowaną fosforanami], następnie hzuje 4 ml buforu RIP (20 mMTrisCl,pH 8,0, lOOmMNaCl, 1 mMNa2EDTA, 0,5% NomdetP-40, 0,5% deoksycholan sodowy, 10 mM jodek sodowy i 1% albumina surowicy bydlęcej). Lizat wiruje się w stołowej wirówce Beckman GRP przy 3500 obrotów na minutę (3000 x g) w ciągu 10 minut. Supematant przenosi się do nowej probówki i dodaje SDS do 0,1%. Dla usunięcia wszystkich przeciwciał występujących w lizacie, dodaje się 200 μΐ „PANSORBIN” (Calbiochem, La Jolla, CA; 10% roztwór Staphylococcus aureus). Po 30 minutach inkubacji w temperaturze 4°C, lizat wiruje się jak poprzednio i supematant ponownie przenosi do nowej probówki, dzieląc na próbki według potrzeb.

Następnie do probówki dodaje się pierwsze przeciwciało - 1353 dla domeny zewnątrzkomórkowej lub 1378,1379bądź 1380 dla domeny kinazowej - w końcowym rozcieńczeniu 1:100 i inkubuje w ciągu 2 godzin na lodzie. W celu wytrącenia kompleksu antygen: pierwsze przeciwciało dodaje się następnie 50 μΐ „PANSORBIN” i inkubuje w ciągu 30 minut na lodzie. Kompleks osadza się przy 3500 obrotów na minutę (3000 x g) w ciągu 10 minut w wirówce Beckman GRP (Beckman Instruments, Fullerton, CA) i odrzuca się supematant. Osad przemywa się trzy razy buforem RIF zawierającym 0,1% SDS i raz buforem TNEN (20 mM Tns, pH 8,0,100 mMNaCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40). Osad zawiesza się ponownie w 25 μΐ redukującego bufom do próbek. Rozpuszczone białka poddaje się elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z SDS i autoradiografii, jak opisano powyżej dla doświadczeń sieciowania.

Wyniki takiego doświadczenia przedstawiono na figurze 7. Przeciwciała skierowane zarówno przeciw domenie zewnątrzkomórkowej (ścieżka 1), jak i domenie wewnątrzkomórkowej (ścieżki 3-5) wytrącają prążek o masie cząsteczkowej około 81 000. Odejmując masę monomeru BMP-4 (16 400), masę cząsteczkową receptora ocenia się na 64 000, podobną do wyniku otrzymanego w opisanych powyżej doświadczeniach sieciowania. Wszystkie trzy surowice skierowane przeciw domenie zewnątrzkomórkowej wytrącają to samo białko. Ten charakterystyczny prążek nie występuje w kontrolnych komórkach stransfekowanych (ścieżki 2 i 6). Doświadczenie to wykazuje, że usieciowany wyznakowany prążek obserwowany w doświadczeniach sieciowania, taki jak ten przedstawiony na figurze 6, jest immunologicznie zbliżony do BRK-1, ponieważ jest wytrącany przez cztery oddzielne przeciwciała specyficzne wobec BRK-1.

Depozyt t-BRK-1 i BRK-1

E. coli stransformowanąpJT6-J 159T (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1 zsubklonowana w wektorze ekspresyjnym pJT6) zdeponowano w ATCC 20 października 1993 r. i oznaczono numerem dostępu ATCC 69474.

E. coli stransformowanąpBLUESCRIPT-Jl 59T (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1 zsubklonowana w wektorze ekspresyjnym „pBLUESCRIPT SK(-)”) zdeponowano w ATCC 7 października 1993 r. i oznaczono numerem dostępu ATCC 69458.

179 196

E. coli stransformowanąpJT4-J159T (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3 zsubklonowana w wektorze ekspresyjnym pJT4) zdeponowano w ATCC 7 października 1993 r. i oznaczono numerem dostępu ATCC 69457.

Jak wiadomo w nauce, zdarzają się niekiedy błędy w metodac h sekwencjonowania DNA i aminokwasów. Dlatego też, sekwencje kodowane w zdeponowanym materiale włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki, uwzględniając możliwość zdarzenia się błędu w którejkolwiek z sekwencji podanej w pisemnym opisie niniejszego wynalazku. Należy dalej zauważyć, że każdy specjalista w tej dziedzinie powtarzający pracę autorów niniejszego zgłoszenia na podstawie pisemnego ujawnienia, może odkryć jakieś błędy sekwencjonowania stosując rutynowe metody. Depozytu ATCC numer 69457 i ATCC numer 69474 nie należy uważać za uznanie, że zdeponowany materiał ma zasadnicze znaczenie dla praktyki niniejszego wynalazku.

Wszystkie wymienione powyżej w niniejszym opisie publikacje są w ten sposób włączone w jego całość poprzez odnośniki literaturowe.

Jest zrozumiałe, że opisane tu przykłady i rozwiązania podano tylko w celu zilustrowania, i że w ich świetle specjaliście w tej dziedzinie mogą się nasunąć różne modyfikacje lub zmiany, które pozostają w duchu i zakresie tego zgłoszenia oraz zakresie dołączonych zastrzeżeń.

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Cook, Jonathan S.

Correa,Paul E.

Koenig, Beth B.

Rosenbaum, Jan S. Ting, Jerry (ii) TYTUŁ WYNALAZKU:

(iii) LICZBA SEKWENCJI: 6 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: The Procter & Gamble Company (B) ULICA: 11810 East Miami River Road (C) MIEJSCOWOŚĆ: Cincinnati (D) STAN: Ohio (E) KRAJ: Stany Zjednoczone Ameryki (F) ZIP: 45239-8707

179 196 (iv) ZAPIS KOMPUTEROWY:

(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: PC kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1,0, wersja #1,25 (vii) DANE DOTYCZĄCE AKTUALNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZŁOŻENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(viii) INFORMACJE O PEŁNOMOCNIKU:

(A) NAZWISKO: Corstanje, Brahm J.

(B) NUMER REJESTRACYJNY: 34 804 (C) NUMER, NA KTÓRY NALEŻY Się POWOŁYWAĆ/NUMER W

REJESTRZE: 5088 (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON: (513) 627-2858 (B) TELEFAX: (513) 627-0260 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2056 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 291...1793 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKA-

CYJNYM 1:

179 196

CGAATTCCTC GCGCCGTGGG AGGGGCGGCC CGGCCCACCC	CCACGCCCCG	CCCGGGAGGG	60
ACGGGGGGAG AGAGAGCGCG GCGACGGGTA TCTGGGTCAA	AGCTGTTCGG	AGAAATTGGA	120
ACTACAGTTT TATCTAGCCA CATCTCTGAG AATTCTGAAG	AAAGCAGCAG	GTGAAAGTCR	180
TTGCCAAGTG ATTTTGTTCT GTAAGGAAGC CTCCCTCATT	CACTTACACC	AGTGAGACAG	240
CAGGACCAGT CATTCAAAGG GCCGTGTACA GGACGCGTGC	GAATCAGACA	ATG ACT Met Thr	296

i

cag er» Gin Leu

TAC Tyr 5

Thr

TAC ATC

AGA TTA

CTG Leu

GGA Gly

CCC Ala

ćy·

Leu 15

Phe

Ile

Ile

34«

Tyr

Ile

Arg

Leu 10

TCT CAT

GTT

CAA

GGG

CAG

AAT

CTA

GAT

AGT

ATG

CTC

CAT

GGC

ACT

GGT

392

Ser His 20

Val

Gin

Gly

Gin

Asn 25

Leu

Asp

Ser

Met

Leu 30

His

Gly

Thr

Gly

ATG AAA

TCA

GAC

TTG

GAC

CAG

AAG

AAG

CCA

GAA

AAT

GGA

GTG

ACT

TTA

440

Met Lys 35

Ser

Asp

I.eu

Asp 40

Gin

Lys

Lys

Pro

Glu 45

Asn

Gly

Val

Thr

Leu 50

GCA CCA

GAG

GAT

ACC

TTG

CCT

TTC

TTA

AAG

TGC

TAT

TGC

TCA

GGA

CAC

488

Ala Pro

Glu

Asp

Thr 55

Leu

Pro

Phe

Leu

Lys 60

Cys

Tyr

Cys

Ser

Gly 65

His

TGC CCA

GAT

GAT

GCT

ATT

AAT

AAC

ACA

TGC

ATA

ACT

AAT

GGC

CAT

TGC

536

Cys Pro

Asp

Asp 70

Ala

Ile

Asn

Asn

Thr 75

Cys

Ile

Thr

Asn

Gly 80

His

Cys

TTT GCC

ATT

ATA

GAA

GAA

GAT

GAT

CAG

CGA

GAA

ACC

ACA

TTA

ACT

TCT

534

Phe Ala

Ile 85

Ile

Glu

Glu

Asp

Asp 90

Gin

Gly

Glu

Thr

Thr 95

Leu

Thr

Ser

GGG TGT

ATG

AAG

TAT

GAA

GGC

TCT

GAT

TTT

CAA

TGC

AAG

GAT

TCA

CCG

632

Gly Cys 100

Met

Lys

Tyr

Glu

Gly 105

Ser

Asp

Phe

Gin

Cys J10

Lys

Asp

Ser

Pro

AAA GCC

CAG

CTA

CGC

AGG

ACA

ATA

GAA

TGT

TGT

CGG

ACC

AAT

TTG

TGC

680

Lys Ala 115

Gin

Leu

Arg

Arg 120

Thr

Ile

Glu

Cys

Cys 125

Arg

Thr

Asn

Leu

Cys 130

AAC CAG

TAT

TTG

CAG

CCT

ACA

CTG

CCC

CCT

GTT

GTT

ATA

GGT

CCC

TTC

72B

Asn Gin

Tyr

Leu

Gin 13S

Pro

Thr

Leu

Pro

Pro 140

Val

Val

Ile

Gly

Pro 145

Phe

TTT GAT

GGC

AGC

ATC

CGA

TGG

CTG

GTT

GTG

CTC

ATT

TCC

ATG

GCT

GTC

776

Phe Asp

Gly

Ser 150

Ile

Arg

Trp

Leu

Val 155

Val

Leu

Ile

Ser

Met 160

Ala

Val

TGT ATA

GTT

GCT

ATG

ATC

ATC

TTC

TCC

AGC

TGC

TTT

TCC

TAT

AAG

CAT

824

Cys Ile

Val 165

Ala

Met

Ile

Ile

Phe 170

Ser

Ser

Cys

Phe

Cys 175

Tyr

Lys

His

TAT TGT

AAG

AGT

ATC

TCA

AGC

AGG

GGT

CGT

TAC

AAC

CGT

GAT

TTG

GAA

872

Tyr Cys 180

Lys

Ser

Ile

Ser

Set 185

Arg

Gly Arg

Tyr

Asn 190

Arg

Asp

Leu

Glu

CAG GAT

GAA

GCA

TTT

ATT

CCA

CTA

GGA

GAA

TCA

TTG

AAA

GAC

CTG

AIT

920

Gin Asp 195

Clu

Ala

Phe

Ile 200

Pro

Val

Gly

Glu

Ser 205

Leu

Lys

Asp

Leu

Ile 210

GAC CAG

TCC

CAA

AGC

TCT

GGG

AGT

GGA

TCT

GGA

TTG

CCT

TTA

TTG

GTT

963

Asp Gin

Ser

Gin

Ser 215

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser 220

Gly

Leu

Pro

Leu

Leu 225

Val

CAG CGA

ACT

ATT

GCC

AAA

CAG

ATT

CAG

ATG

GTT

CGG

CAG

GTT

GGT

AAA

1016

Gin Arg

Thr

Ile 230

Ala

Lyt

Gin

Ile

Gin 235

Met

Val

Arg

Gin

Val 240

Gly

Lys

GGC CGC

TAT

GGA

GAA

GTA

TGG

ATG

GGT

AAA

TGG

CGT

GGT

GAA

AAA

GTG

1064

Gly Arg

Tyr 245

Gly

Glu

Val

Trp

Met 250

Gly

Lys

Trp

Arg

Gly 255

Glu

Lys

Val

GCT GTC

AAA

GTG

TTT

TTT

ACC

ACT

GAA

GAA

GCT

AGC

TGG

TTT

AGA

GAA

1112

Ala Val 260

Lys

Val

Phe

Phe

Thr 265

Thr

Glu

Glu

Ala

Ser 270

Trp

Phe

Arg

Glu

179 196

ACA GAA ATC TAC CAG ACG GTG TTA ATG CGT CAT GAA AAT ATA CTT GGT1160

Thr Glu Ile Tyr Gin Thr Val Leu Het Arg His Glu Asn Ile LeuGly

275 280 285290

TTT ATA GCT GCA GAC ATT AAA GGC ACT GGT TCC TGG ACT CAG CTG TAT1208

Phe Ile Ala Ala Asp Ile Lys Gly Thr Glv Ser Tm Thr Gin LeuTyr

295 300 305

TTG ATT ACT GAT TAC CAT GAA AAT GGA TCT CTC TAT GAC TTC CTG AAA1256

Leu Ile Thr Asp Tyr His Glu Asn Gly Ser Leu Tyr Asp Phe LeuLys

310 315320

TGT GCC ACA CTA GAC ACC AGA GCC CTA CTC AAG TTA GCT TAT TCT GCT1308

Cys Ala Thr Leu Asp Thr Arg Ala Leu Leu Łys Leu Ala Tyr SerAla

325 330335

GCT TGT GGT CTG TGC CAC CTC CAC ACA GAA ATT TAT GGT ACC CAA GGG1352

Ala Cys Gly Leu Cys His Leu His Thr Glu Ile Tyr Gly Thr GinGly

340 345350

AAG CCT GCA ATT GCT CAT CGA GAC CTG AAG AGC AAA AAC ATC CTT ATT1400

Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Łys Ser Łys Asn Ile LeuIle

355 360 365370

AAG AAA AAT GGA AGT TGC TGT ATT GCT GAC CTG GGC CTA GCT GTT AAA1448

Lys Łys Asn Gly Ser Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala ValŁys

375 380385

TTC AAC AGT GAT ACA AAT GAA GTT GAC ATA CCC TTG AAT ACC AGG GTG1496

Phe Asn Ser Asp Thr Asn Glu Val Asp Ile Pro Leu Asn Thr ArgVal

390 395400

GGC ACC AAG CGG TAC ATG GCT CCA GAA GTG CTG GAT GAA AGC CTG AAT1544

Gly Thr Łys Arg Tyr Het Ala Pro Glu Val Leu Aso Clu Ser LeuAsn

405 410' 415

AAA AAC CAT TTC CAG CCC TAC ATC ATG GCT GAC ATC TAT AGC TTT GGT1592

Łys Asn His Phe Gin Pro Tyr Ile Met Ala Asp Ile Tyr Ser PheGly

420 425430

TTG ATC ATT TGG GAA ATG GCT CGT CGT TGT ATT ACA GGA GGA ATC GTC1640

Leu Ile Ile Trp Glu Het Ala Arg Arg Cys Ile Thr Gly Gly IleVal

435 440 445450

GAG GAA TAT CAA TTA CCA TAT TAC AAC ATG GTG CCC AGT GAC CCA TCC1688

Glu Glu Tyr Gin Leu Pro Tyr Tyr Asn Het Val Pro Ser Asp ProSer

455 460465

TAT GAG GAC ATG CGT GAG GTT GTG TGT GTG AAA CGC TTG CGG CCA ATC1736

Tyr Glu Asp Het Arg Glu Val Val Cys Val Lys Arg Leu Arg ProIle

470 475480

GTG TCT AAC CGC TGG AAC AGC GAT GAA GTA AGT TGG AGC CAA GTC CCT1784

Val Ser Asn Arg Trp Asn Ser Asp Glu Val Ser Trp Ser Gin WalPro

485 490495

GTA AAG TGATGAGTGA GTGCCGAGTT ACTCTGTGCT CACCACACTC TGTTTGCATT1840

Val Łys

500

TATTTCTCTT TAGTGTCTTC GAGCAGTTTT GAAGCTAATG TCAGAATGTT GGGCCCATAA1900

TCCAGCCTCC AGACTCACAG CTTTGAGAAT CAAGAAGACA CTTCCAAAAA TGGTTGAATC1960

CCAGGATGTA AAGATTTGAC AATTAAACAA TTTTGAGGGA GAATTTAGAC TGCAAGAACT2020

TCTTCACCCA AGGAAGGAAT TCCTGCAGGC CCGGGG2056

179 196 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 500 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKA-

CYJNYM 2

Met The Gin Leu Tyr Thr Tyr Ile Arg Leu Leu Gly Ala Cys Leu Phe 15 1015

Ile Ile'Ser His Val Gin Gly Gin Asn Leu Asp Ser Met Leu Bis Gly 20 2530

Thr Gly Met Łys Ser Asp Łeu Asp Gin Lys Lys Pro Glu Asn Gly Val 35 4045

Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr Cys Ser 50 5560

Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr Cya ile Thr Asn Gly 65 70 7580

His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gin Gly Glu Thr Thr Leo 85 9095

Thr Ser Gly Cys Met Łys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe Gin Cys Lys Asp

100

105

110

Ser Pro Łys Ala Gin Łeu Arg Arg Thr Ile Glu Cys Cys Arg Thr Asa

115

120

125

Leu Cys Asn Gin Tyr Leu Gin Pro Thr Łeu Pro Pro Val Val Ile Gly 130 135140

Pro Phe Phe Asp Gly Ser Ile Arg Tip Łeu Val Val Łeu Ile SerMet

145 150 155160

Ala Val Cys Ile Val Ala Met Ile Ile Phe Ser Ser Cys Phe CysTyr

165 170175

Lya His Tyr Cys Lys Ser Ile Ser Ser Arg Gly Arg Tyr Asn Arg Asp 180 185190

Łeu Glu Gin Asp Glu Ala Phe Ile Pro Val Gly Glu Ser Łeu Lye Asp 195 200205

Łeu Ile Asp Gin Ser Gin Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Łeu Pro Leu 210 215220

Leu Val Gin Arg Thr Ile Ala Łys Gin Ile Gin Met Val Arg GinVal

225 230 235240

Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Met Gly Lys Trp Arg GlyGlu

245 250255

Lys Val Ala Val Łys Val Phe Phe Thr Thr Glu Glu Ala Ser Trp Phe 260 265270

Arg Glu Thr Glu Ile Tyr Gin Thr Val Łeu Het Arg His Glu Asn Ile 275 280285

Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Ile Łys Gly Thr Gly Ser Trp Thr Gin 290 295300

Leu Tyr Leu Ile Thr Asp Tyr His Glu Asn Gly Ser Łeu Tyr Asp Phe 305 310 315320

179 196

Leu Lys Cye Ala Thr Leu Asp Thr Arg Ala Leu Leu Lys Leu Ala Tyr 325 330335

Ser Ala Ala Cys Gly Leu Cys His Leu His Thr Glu Ile Tyr Gly Thr 340 345350

Gin Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser Lys Asn Ile 355 360365

Leu Ile Lys Lys Asn Gly Ser Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala 370 375380

Val Lys Phe Asn Ser Asp Thr Asn Glu Val Asp Ile Pro Leg AsaThr

385 390 395400

Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Asp GinSer

405 410415

Leu Asn Lys Asn His Phe Gin Pro Tyr Ile Met Ala Asp Ile Tyr Ser 420 425430

Phe Gly Leu Ile Ile Trp Glu Met Ala Arg Arg Cys Ile Thr Gly Gly 435 440445

Ile Val Glu Glu Tyr Gin Leu Pro Tyr Tyr Asn Met Val Pro Ser Asp 450 455460

Pro Ser Tyr Glu Asp Met Arg Glu Val Val Cys Val Łys Arg LeoArg

465 470 475480

Pro Ile Val Ser Asn Arg Trp Asn Ser Asp Glu Val Ser Trp SerGin

485 490495

Val Pro Val Lys

500 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2402 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: połączenie (111609) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 3:

GAATCAGACA ATG ACT CAG CTA TAC ACT TAC ATC AGA TTA CTG GGA GCC-49

Met Thr Gin Leu Tyr Thr Tyr Ile Arg Leu Leu Gly Ala 1510

TGT CTG TTC ATC ATT TCT CAT GTT CAA GCG CAG AAT CTA GAT AGT ATG37

Cys Leu Phe Ile Ile Ser His Val Gin Gly Gin Asn Leu Asp SerHet

2025

CTC CAT GGC ACT GGT ATG AAA TCA GAC TTG GAC CAG AAG MS CCAGAA

Leu His Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Leu Asp Gin Łys Lys ProGlu

35 4045

11-45

179 196

AAT Asn	GGA GTG ACT TTA GCA CCA GAG GAT ACC TTC CCT TTC TTA AAG TGC	133
Gly	Val	Thr	Leu 50	Ala	Pro	Glu Asp Thr Leu Pro 55	Phe	Len Lys Cys 60
ΤΑΤ	TGC	TCA	GGA	CAC	TGC	CCA	GAT GAT GCT ATT AAT	AAC	ACA TGC ATA	241
Tyr	Cys	Ser	Gly 65	His	Cys	Pro	Asp Asp Ala Ile Asn 70	Asn	Thr Cys Ile 75
ACT	AAT	GGC	CAT	TGC	TTT	GCC	ATT ATA GAA GAA GAT	GAT	CAG GGA GAA
Thr	Asn	Gly 80	His	Cys	Phe	Ala	Ile Ile Glu Glu Asp 85	Asp 90	Gin Gly Glu
ACC	ACA	TTA	ACT	TCT	CGG	TGT	ATG AAG TAT GAA GGC	TCT	GAT TTT CAA	Ξ37
Thr	Thr 95	Leu	Thr	Ser	Gly	Cys 100	Met Lys Tyr Glu Gly 105	Ser	asp Phe Gin
TGC	AAG	GAT	TCA	CCG	AAA	GCC	CAG CTA CGC AGG ACA	ATA	GAA TGT TGT	325
Cys 110	Lys	Asp	Ser	Pro	Lys 115	Ala	Gin Leu Arg Arg Thr 120	Ile	Glu Cys Cys 125
CGG	ACC	AAT	TTG	TGC	AAC	CAG	TAT TTG CAG CCT ACA	CTG	CCC CCT GTT	433
Arg	Thr	Asn	Leu	Cys 130	Asn	Gin	Tyr Leo Gin Pro Thr 135	Leu	Pro Pro Val 140
GTT	ATA	GGT	CCG	TTC	TTT	GAT	GGC ACC ATC CGA TGC	CTG	GTT GTG CTC	481
Val	Ile	Gly	Pro 145	Phe	Phe	Asp	Gly Ser Ile Arg Trp 150	Leu	Val Val Les 155
ATT	TCC	ATG	GCT	GTC	TGT	ATA	GTT GCT ATG ATC ATC	TTC	TCC BGC TGC	53
Ile	Ser	Met 160	Ala	Val	Cys	Ile	Val Ala Met Ile Ile 165	Phe 170	Ser Ser Cys
TTT	TGC	TAT	AAG	CAT	TAT	TGT	AAG AGT ATC TCA AGC	AGG	GGT CGT TAC	577
Phe	Cys 175	Tyr	Lys	His	Tyr	Cys 180	Lys Ser Ile Ser Ser 185	Arg	Gly Arg Tyr
AAC	CGT	GAT	TTG	GAA	CAG	GAT	GAA GCA TTT ATT CCA	GTA	GGA GAA TO	625
Asn 190	Arg	Asp	Leu	Glu	Gin 195	Asp	Glu Ala Phe Ile Pro 200	Val	Gly Glu Ser 205
TTG	AAA	GAC	CTG	ATT	GAC	CAG	TCC CAA AGC TCT GGC	AGT	GGA TCT GGA	673
Leu	Lys	Asp	Leu	Ile 210	Asp	Gin	Ser Gin Ser Ser Gly 215	Ser	Gly Ser Gly 220
TTG	CCT	TTA	TTG	GTT	CAG	CGA	ACT ATT GCC AAA CAG	ATT	CAG ATG GTT	721
Leu	Pro	Leu	Leu 225	Val	Gin	Arg	Thr Ile Ala Lys Gin 230	Ile	Gin Ket Val 235
CGG	CAG	GTT	GGT	AAA	GGC	CGC	TAT GGA GAA GTA TGG	ATG	GGT AAA TGG	769
Arg	Gin	Val 240	Gly	Lys	Gly	Arg	Tyr Gly Glu Val Trp 245	Met 250	Gly Lys Trp
CGT	GGT	GAA	AAA	GTG	GCT	GTC	AAA GTG TTT TTT ACC	ACT	GAA GAA GCT	817
Arg	Gly 255	Glu	Lys	Val	Ala	Val 260	Lys Val Phe Phe Thr 265	Thr	Glu Glu Ala
AGC	TGG	TTT	AGA	GAA	ACA	GAA	ATC TAC CAG ACG GTG	TTA	ATG CGT CAT	865
Ser 270	Trp	Phe	Arg	Glu	Thr 275	Glu	Ile Tyr Gin Thr Val 280	Leu	Met Arg.His 285
GAA	AAT	ATA	CTT	GGT	TTT	ATA	GCT GCA GAC ATT AAA	GGC	ACT GGT TCC	913
Glu	Asn	Ile	Leu	Gly 290	Phe	Ile	Ala Ala Asp Ile Lys 295	Gly	Thr Gly Ser 300
TGG	ACT	CAG	CTG	TAT	TTG	ATT	ACT GAT TAC CM GAA	AAT	GGA TCT CTC	961
Trp	Thr	Gin	Leu 305	Tyr	Leu	Ile	Thr Asp Tyr His Glu 310	Asn	Gly Ser Len 315
TAT	CAC	TTC	CTG	AAA	TGT	GCC	ACA CTA GAC ACC AGA	GCC	CTA CTC AAG	1009
Tyr	Asp	Phe 320	Leu	Lys	Cys	Ala	Thr Leu Asp Thr Arg 325	Ala 330	Leu Leu Lys
TTA	GCT	TAT	TCT	GCT	GCT	TGT	GGT CTG TGC CAC CTC	CAC	ACA GAA ATT	1057
Leu	Ala 335	Tyr	Ser	Ala	Ala	Cys 340	Gly Leu Cys His Leu 345	His	Thr Glu Ile
TAT	GGT	ACC	CAA	GGG	AAG	CCT	GCA ATT GCT CAT CGA	GAC	CTG AAG TC	1205
Tyr 350	Gly	Thr	Gin	Gly	Lys 355	Pro	Ala Ile Ala His Arg 360	Asp	Leu Lys ier 365

179 196

AAA AAC ATC CTT ATT AAG AAA AAT GGA AGT TGC TGT ATT GCT GAC CTG1353

Lya Asn Ile Leu Ile Lys Lys Aan Gly Ser Cys Cys Ile Ala AspLeu

370 37S380

GGC CTA GCT GTT AAA TTC AAC AGT GAT ACA AAT GAA CTT GAC ATS CCC1201

Gly Leu Ala Val Lya Phe Asn Ser Asp Thr Asn Glu Val Asp IlePro

385 390395

TTG AAT ACC AGG GTG GGC ACC AAG CGG TAC ATG GCT CCA GAA GTG CTGΧ249

Leu Asn Thr Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Het Ala Pro Glu ValLeu

400 405410

GAT GAA AGC CTG AAT AAA AAC CAT TTC CAG CCC TAC ATC ATC GCT GAC 35297 Asp Glu Ser Leu Asn Lys Asn His Phe Gin Pro Tyr Ile Met Ala Asp 415 420 425

ATC TAT AGC TTT GGT TTG ATC ATT TGC CAA ATC GCT CGT CGT TGT ATT3345

Ile Tyr Ser Phe Gly leu Ile Ile Trp Glu Met Ala Arg Arg CyeIle

430 435 440445

ACA GGA GGA ATC GTG GAG GAA TAT CAA TTA CCA TAT TAC AAC ATG GTG3393

Thr Gly Gly Ile Val Glu Glu Tyr Gin Leu Pro Tyr Tyr Asn HetVal

450 455460

CCC AGT GAC CCA TCC TAT GAG GAC ATG CGT GAG GTT GTG TGT GTG AAA2441

Pro Ser Asp Pro Ser Tyr Glu Asp Met Arg Glu Val Val Cys ValLys

465 470475

CGC TTG CGG CCA ATC GTG TCT AAC CGC TGG AAC AGC GAT GAA TGT CTT3489

Arg Leu Arg Pro Ile Val Ser Asn Arg Trp Asn Ser Asp Glu Cys Leu

480 485490

CGA GCA GTT TTG AAG CTA ATG TCA GAA TGT TGG CCC CAT AAT CCA GCC1337

Arg Ala Val Leu Lys Leu Met Ser Glu Cys Trp Ala Bis Asn Pro Ala

495 500505

TCC AGA CTC ACA GCT TTG AGA ATC AAG AAG ACA CTT GCA AAA ATG GTT2S85

Ser Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ala Lys Met Val

510 51= 520525

GAA TCC CAG GAT GTA AAG ATT TGACAATTAA ACAATTTTGA GGGAGAATTT2S36

Glu Ser Gin Asp Val Lys Ile 530

AGACTGCAAG AACTTCTTCA CCCAAGGAAT GGGTGGGATT AGCATGGAAT AGGATGTTC&ŁS96

CTTGGTTTCC AGACTCCTTC CTCTACATCT TCACAGGCTG CTAACAGTAA ACCTTACCSC1256

ACTCTACAGA ATACAAGATT GGAACTTGGA ACTTGGAACT TCAAACATGT CATTCTTTATI8K16

ATATGGACAG CTGTGTTTTA AATGTGGGGT TTTTGTGTTT TGCTTTCTIT GTTTTGTTTTΧΒ76

GGTTTTGATG CTTTTTTGGT TTTTATGAAC TGCATCAAGA CTCCAATCCT GATAAGAAGT1336

CTCTGGTCAA CCTCTGGGTA CTCACTATCC TGTCCATAAA GTGGTGCTTT CTGTGAAAGC3396

CTTAAGAAAA TTAATGAGCT CAGCAGAGAT GGAAAAAGGC ATATTTGGCT TCTACCACAS20S6

AAAACATCTG TCTGTGTTCT GTCTTTGTAA ACAGCCTATA GATTATGATC TCTTTGGG»2336

ACTGCCTGGC TTATGATGGT GCACCATACC TTTGATATAC ATACCAGAAT TCTCTCCTGC23376

CCTAGGGCTA AGAACACAAG AATGTAGAGG TTGCACAGGA GGTATTTTGT GACCAGTGGT2X36

TTAAATTGCA ATATCTAGTT GGCAATCGCC AATTTCATAA AAGCCATCCA CCTTGTAGCI2236

GTAGTAACTT CTCCACTGAC TTTATTTTTA GCATAATAGT TGTGAAGGCC AAACTCCATC7356

TAAAGTGTCC ATAGACTTGG ACTGTTTTCC CCCAGCTCTG ATTACC24SD2

179 196 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DłUGOŚĆ: 532 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKA-

CYJNYM 4

Met Thr Gin Leu Tyr Thr Tyr Ile Arg Leu Leu Gly Ala Cye Leu Phe 15 1015

Ile Ile Ser His Val Gin Gly Gin Asn Leu Asp Ser Met Lsa Hio Gly 20 2530

Thr Gly Met Lys Ser Asp Leu Asp Gin Lys Lys Pro Glu Asn Gly Val 35 4045

Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Łys Cys Tyr Cye Ser 50 5560

Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr Cys Ile Thr Asn Gly 65 70 7580

His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gin Gly Glu Thr Thr Leu 85 9095

Thr Ser Gly Cys Het Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe Gin Cys Lys Asp 100 105110

Ser Pre Łys Ala Gin Leu Arg Arg Thr Ile Glu Cys Cys Arg Thr Asn 115 120125

Leu Cys Asn Gin Tyr Leu Gin Pro Thr Leu Pro Pro Val Val Ile Gly 130 135140

Pro Phe Phe Asp Gly Ser Ile Arg Trp Leu Val Val Leu Ile SerIMet

145 ISO 155160

Ala Val Cys Ile Val Ala Met Ile Ile Phe Ser Ser Cys Phe CysTyr

165 170175

Lys His Tyr Cys Lys Ser Ile Ser Ser Arg Gly Arg Tyr Asn Arg Asp 180 185190

Leu Glu Gin Asp Glu Ala Phe Ile Pro Val Gly Glu Ser Leu Łys Asp

195

200

205

Leu Ile Asp Gin Ser Gin Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro Leu 210 215220

Leu Val Gin Arg Thr Ile Ala Łys Gin Ile Gin Met Val Arg GinVal

225 230 235240

Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Met Gly Lys Trp Arg GlyGlu

245 250255

Łys Val Ala Val Łys Val Phe Phe Thr Thr Glu Glu Ala Ser Trp Phe 260 265270

Arg Glu Thr Glu Ile Tyr Gin Thr Val Leu Met Arg His Glu Asn Tle 275 280285

Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Ile Lys Gly Thr Gly Ser Trp Thr Gin 290 295300

179 196

Leu Tyr Leu Ile Thr Aap Tyr His Glu Asn Gly Ser Leu Tyr Asp Phe

305 310 315320

Łeu Lys Cys Ala Thr Leu Asp Thr Arg Ala Łeu Leu Lys Leu Ala Tyr

325 330335

Ser Ala Ala Cys Gly Leu Cys His Leu His Thr Glu Ile Tyr Gly Bhr 340 345350

Gin Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser Lys Asn Ile 355 360365

Łeu Ile Lys Lys Asn Gly Ser Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly Łeu Ala 370 375380

Val Lys Phe Asn Ser Asp Thr Asn Glu Val Asp Ile Pro Leu AsnThr

385 390 395400

Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Asp GluSer

405 410415

Łeu Asn Lys Asn His Phe Gin Pro Tyr Ile Met Ala Asp Ile Tyr Ser 420 425430

Phe Gly Łeu Ile Ile Trp Glu Met Ala Arg Arg Cys Ile Thr Gly Cly 435 440445

Ile Val Glu Glu Tyr Gin Leu Pro Tyr Tyr Asn Bet Val Pro Ser Asp 450 455460

Pro Ser Tyr Glu Asp Met Arg Glu Val Val Cys Wal Lys Arg ŁeuArg

465 470 475480

Pro Ile Wal Ser Asn Arg Trp Asn Ser Asp Glu Cyo Leu Arg AlaWal

485 490495

Łeu Lyo Leu Met Ser Glu Cys Trp Ala His Asn Pro Ala Ser Arg Leo 500 505510

Thr Ala Łeu Arg Ile Łys Lys Thr Łeu Ala Lys Met Wal Clu Ser GŁn 515 520525

Asp Val Łys Ile

530 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DłUGOŚĆ: 446 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 11...466 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKA-

CYJNYM 5:

179 196

GAATCAGACA ATG ACT CAG CTA TAC ACT TAC ATC AGA TTA CTG GGA GCC	49
Met Thr Gin Leu Tyr Thr Tyr Ile Arg Leu Leu Gly Ala 15 10

TGT

CTG

TTC

ATC

ATT

TCT

CAT

GTT

CAA

GGG

CAG

AAT

CTA

GAT

AGT

ATG

97

Cys

Leu

Phe

Ile

Ile

Ser

His

Val

Gin

Gly

Gin

Asn

Leu

Asp

Ser

Met

15

20

25

CTC

CAT

GGC

ACT

GGT

ATG

AAA

TCA

GAC

TTG

GAC

CAG

AAG

AAG

CCA

GAA

145

Leu

His

Gly

Thr

Gly

Met

Lys

Ser

Asp

Leu

Asp

Gin

Lys

Lys

Pro

Gira

30

35

40

45

AAT

GGA

GTG

ACT

TTA

GCA

CCA

GAG

GAT

ACC

TTG

CCT

TTC

TTA

AAG

TGC

193

Asn

Gly

Val

Thr

Leu

Ala

Pro

Glu

Asp

Thr

Leu

Pro

Phe

Leu

Lys

Cys

50

55

60

TAT

TGC

TCA

GGA

CAC

TGC

CCA

GAT

GAT

GCT

ATT

AAT

AAC

ACA

TGC

ATA

241

Tyr

Cys

Ser

Gly

His

Cys

Pro

Asp

Asp

Ala

Ile

Asn

Asn

Thr

Cys

Ile

65

70

75

ACT

AAT

GGC

CAT

TGC

ITT

GCC

ATT

ATA

GAA

GAA

GAT

GAT

CAG

GGA

GAA

289

Thr

Asn

Gly

His

Cys

Phe

Ala

Ile

Ile

Glu

Glu

Asp Asp

Gin

«y

Glu

80

85

90

ACC

A CA

TTA

ACT

TCT

GGG

TGT

ATG

AAG

TAT

GAA

GGC

TCT

GAT

TTT

CAA

337

Thr

Thr

Leu

Thr

Ser

Gly

Cys

Met

Lys

Tyr

Glu

Gly

Ser

Asp

Phe

Gin

95

100

105

TGC

AAG

GAT

TCA

CCG

AAA

GCC

CAG

CTA

CCC

AGG

ACA

ATA

GAA

TGT

TGT

385

Cys

Lys

Asp

Ser

Pro

Lys

Ala

Gin

Leu

Arg

Arg

Thr

Ile

Glu

Cys

Cys

110

115

120

125

CGG

ACC

AAT

TTG

TGC

AAC

CAG

TAT

TTG

CAG

CCT

ACA

CTG

CCC

CCT

GTT

433

Arg

Thr

Asn

Leu

Cys

Asn

Gin

Tyr

Leu

Gin

Pro

Thr

Leu

Pro

Pro

wal

130

135

140

GTT

ATA

GGT

CC

TTC

TTT

GAT

GGC

ACC

ATC

CCA

466

Val

Ile

Gly

Pro

Phe

Phe

Asp Gly

Ser

Ile

Arg

145

150

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DłUGOŚĆ: 152 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKA-

CYJNYM 6:

Met Thr Gin Leu Tyr Thr Tyr Ile Arg Leu Leu Gly Ala Cys Leu Phe 15 1015

Ile Ile Ser His Val Gin Gly Gin Asn Leu Asp Ser Met Leu His Glv 20 25 30'

Thr Gly Met Lys Ser Asp Leu Asp Gin Lys Lys Pro Glu Asn Gly Val 35 4045

Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr Cys Ser 50 5560

179 196

Gly Hia 65

Cys

Pro Asp Asp 70

Ala

Ile

Asn Asn

Thr Cys 75

Ile

Thr

Asn

Gly 80

His

Cys

Phe

Ala

Ile 85

Ile

Glu

Glu

Asp

Asp 90

Gin

Gly

Glu

Thr

Thr 95

Leu

Thr

Ser

Gly

Cys 100

Het

Lys

Tyr

Glu

Gly 105

Ser

Asp

Phe

Gin

Cys 110

Lys

Asp

Ser

Pro

Lys 115

Ala

Gin

Leu

Arg

Arg 120

Thr

Ile

Glu

Cys

Cys 125

Arg

Thr

Asn

Leu

Cys 130

Asn

Gin

Tyr

Leu

Gin 135

Pro

Thr

Leu

Pro

Pro 140

Val

Val

Ile

Gly

Pro 145

Phe

Phe

Asp

Gly

Ser 150

Ile

Arg

179 196

BtarteryACT ΙΑ i ACT IB:

Antysensowne startery pochodzące z sekwencji domeny kinazowej VIB

H H

φ 3 ο Ν (0 C •Η Λ!	I F Η < ' Ο	1 Η < ' Ο
C Φ S	< Ο ί	< ο 5
ο	Μ	1-^
Ό		Ε-
Ή	Ο	0
Π1	Η-1	H
0	ο	Ο
Μ Ο £	ο	0
	Μ	Η
1)	Ε	Ε-1
«Ό	ο	0

0) o ttf N

TS o χ: o o CU

Φ +> Cl Φ 4J ω £ O Μ S ω

I—I Ο 0 < 0 <

Ό

Ο Η F < < Ο

ΕΟ <

ιΓ>

<

CN

Ο <

Η Ο < Η < 0 <

υ

Ε-¹ < <

Ο h Ο <

ω

CN

Ο <

179 196 lid lh r—ł m m ld ld lo u~>

*-D

179 196

179 196

DAF1 NIMVKNDLTCATGDLGLSLSKPEDAASDITANENYKCGTVRYI.APEILNSTMQFTVFESYQCADVYSFSLV 207

179 196

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CO CO CM

179 196

CO

179 196

179 196

Hindlll

SacI

BamHI

Xhol

Pstl

EcoRI

KpnI

Sad

Apal \\ EcoRI ;a p_sli «Ά Smal ''BamHI

Spel

BamHI

BamHI, e_cjxi

KpnI Apal Xhol Sali Ciał Hindlll \ EcoRI \ Smal \ EcoRI

179 196

Porównanie wiązania BMP-4 z transfektonami BRK-1 i kontrolnymi

Spećyficzne wiązanie (DPM) r¹2⁵H BMP-4

MOCK

BRK-1

179 196

Fig. 6A Fig. 6B

179 196 lo ιο co co co σι o o

Γ'- N. CO 00 co CO co co

BRK-1: + 200 kDa-*

97.4 kDa-* kDaecd kinaza

Fig. 7

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (29)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Wyizolowane białko kinazy receptorowej BMP, lub jego rozpuszczalny fragment, posiadające sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4.
2. 2. Wyizolowana sekwencja DNA kodująca sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 lub jej fragment.
3. 3. Sekwencja DNA według zastrz. 2, znamienna tym, że jest sekwencją.przedstawionąw sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3.
4. 4. Wyizolowane skrócone białko kinazy receptorowej BMP, lub jego rozpuszczalny fragment, posiadające sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2.
5. 5. Wyizolowana sekwencja DNA kodująca sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 lub jej fragment.
6. 6. Sekwencja DNA według zastrz. 5, znamienna tym, że jest sekwencjąprzedstawionąw sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1.
7. 7. Rozpuszczalny fragment wyizolowanego skróconego białka kinazy receptorowej BMP według zastrz. 4, znamienny tym, że rozpuszczalny fragment posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 6.
8. 8. Sekwencja DNA kodująca sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 6.
9. 9. Sekwencja DNA według zastrz. 8, znamienna tym, że jest sekwencjąprzedstawionąw sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 5.
10. 10. Zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 lub jej fragment.
11. 11. Zrekombinowany wektor ekspresyjny według zastrz. 10, znamienny tym, że zawiera sekwencję DNA przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3.
12. 12. Zrekombinowany wektor ekspresyjny według zastrz. 11, znamienny tym, że wektorem jest plazmid posiadający wszystkie cechy charakterystyczne pJT4-J159F zawartego w ATCC numer 69457.
13. 13. Zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 lub jej fragment.
14. 14. Zrekombinowany wektor ekspresyjny według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiera sekwencję DNA przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1.
15. 15. Zrekombinowany wektor ekspresyjny według zastrz. 14, znamienny tym, że wektorem jest plazmid posiadający wszystkie cechy charakterystyczne pJT6-J159T zawartego w ATCC numer 69474.
16. 16. Komórka gospodarza zawierająca zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 lub jej fragment.

    179 196
17. 17. Komórka gospodarza według zastrz. 16, znamienna tym, że zawiera zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3.
18. 18. Ssacza komórka gospodarza zawierająca zrekombinowany wektor ekspresyjny będący plazmidem posiadającym wszystkie cechy charakterystyczne pJT4-J159F zawartego w ATCC numer 69457.
19. 19. Ssacza komórka gospodarza według zastrz. 18, znamienna tym, że komórka jest komórkąjąjnika chomika chińskiego.
20. 20. Ssacza komórka gospodarza według zastrz. 18, znamienna tym, że komórka jest komórką COS.
21. 21. Komórka gospodarza zawierająca zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 lub jej fragment.
22. 22. Komórka gospodarza według zastrz. 21, znamienna tym, że zawiera zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1.
23. 23. Ssacza komórka gospodarza zawierająca zrekombinowany wektor ekspresyjny będący plazmidem posiadającym wszystkie cechy charakterystyczne pJT6-J159T zawartego w ATCC numer 69474.
24. 24. Ssacza komórka gospodarza według zastrz. 22, znamienna tym, że komórka jest komórką jajnika chomika chińskiego.
25. 25. Ssacza komórka gospodarza według zastrz. 22, znamienna tym, że komórka jest komórką COS.
26. 26. Sposób wytwarzania skróconego białka kinazy receptorowej BMP obejmująca ekspresję tego białka w hodowli komórek gospodarza oraz jego izolowanie, znamienny tym, że stosuje się komórkę gospodarza zawierającą zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą sekwencję aminokwasowąprzedstawionąw sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 lub jej fragment.
27. 27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że stosuje się zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA przedstawionąw sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3.
28. 28. Sposób identyfikowania związków zdolnych do wiązania z białkiem kinazy receptorowej BMP, obejmujący wprowadzanie próbki zawierającej związki do białka kinazy receptorowej BMP i umożliwianie związkom związanie się z białkiem kinazy receptorowej BMP, oraz badanie otrzymywania takiego wiązania, znamienny tym, że stosuje się białko kinazy receptorowej BMP posiadające sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 bądź jej rozpuszczalnego fragmentu, lub w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 bądź jej rozpuszczalnego fragmentu.
29. 29. Sposób otrzymywania przeciwciał skierowanych przeciw białku kinazy receptorowej BMP obejmujący immunizację zwierzęcia polipeptydem i odzyskiwanie ze zwierzęcia powstających przeciwciał, znamienny tym, że do immunizacji stosuje się wyizolowane białko kinazy receptorowej BMP, lub jego rozpuszczalny fragment, posiadające sekwencję aminokwasową przedstawionąw sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4.

    * * *

    Zakres techniczny

    Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny tworzenia i rozwoju kości. Niniejszy wynalazek szczególnie dotyczy receptora białka morfogenetycznego kości i sekwencji DNA kodującej rzeczony receptor.

    Podstawa wynalazku

    Ludzie i inne zwierzęta stałocieplne mogą cierpieć z powodu licznych chorób dotyczących kości. Zakres takich chorób sięga od złamań kości do chorób wyniszczających, takich jak osteo4

    179 196 poroża. O ile u osobników zdrowych wzrost kości na ogół zachodzi normalnie i złamania gojąsię bez potrzeby interwencji farmakologicznej, w pewnych przypadkach kości mogą stawać się słabsze lub mogą nie goić się właściwie. Na przykład, gojenie może przebiegać powoli w starszym wieku i u pacjentów przechodzących leczenie kortykosteroidami (np. pacjentów po przeszczepach). Osteoporoza jest stanem, w którym tkanka twarda kości zanika nieproporcjonalnie do rozwoju nowej tkanki twardej. Osteoporozę można ogólnie określić jako obniżenie masy kości lub atrofię tkanki szkieletowej, jamy szpikowe i jamki kostne stająsię większe, ilość wiązań włóknistych zmniejsza się, a kość zbita staje się łamliwa. Inną chorobą dotyczącą kości jest zapalenie kości i stawów, które jest chorobą ruchomych stawów, charakteryzującą się degradacją i abrazją chrząstki stawowej, jak również tworzeniem nowej tkanki kostnej przy powierzchni stawów.

    O ile dostępne są różnorodne sposoby leczenia takich chorób dotyczących kości, żaden z tych sposobów nie zapewnia optymalnych wyników. Jedną z trudności jaką napotykają osoby leczące choroby dotyczące kości, jest brak pełnego zrozumienia metabolizmu kości i chorób dotyczących kości. Kluczem do takiego zrozumienia jest zidentyfikowanie i scharakteryzowanie każdego ze składników zaangażowanych we wzroście kości. Wykazano, że białka morfogenetyczne kości (BMP) odgrywają kluczową rolę w tworzeniu i rozwoju kości (Wozney, J.M., Molec. Reproduct. andDevelop. 32,160-167 (1992)).

    Ponadto, rola BMP może nie ograniczać się do ich roli w kościach. Stwierdzenie, że BMP występują w znaczących stężeniach w innych tkankach, takich jak mózg i nerki (Wall, N.A., Blessing, M., Wright, C.V.E. i Hogan, B.L.M., J. Celi Biol. 120,493-502 (1993), Ozkaynak, E., Schnegelsberg, P.N.J., Jin, D.F., Clifford, G.M., Warren, F.D., Drier, E.A. i Oppermann, H., J. Biol. Chem. 267,25220-25227 (1992), Lyons, K.M., Jones, C.M. i Hogan, B.L.M., Trends in Genetics 7,408-412 (1991)) sugeruje, że mogą one odgrywać dodatkowe role w rozwoju i różnicowaniu. Potwierdza to ostatnie stwierdzenie, że BMP sprzyja różnicowaniu komórek nerwowych (Basler, K., Edlund, T., Jessell, T.M. i Yamada, T. Celi 73, 687-702 (1993), Paralkar, V.M„ Weeks, B.S., Yu, Y.M., Kleinman, H.K. i Reddi, A.H. J. Celi Biol. 119, 1721-1728 (1992)).

    Biologiczny wpływ BMP na komórki rozpoczyna się od związania ze specyficznym receptorem BMP błonie komórkowej komórek odpowiadających na BMP. Receptor jest białkiem, zazwyczaj łączącym obie strony błony komórkowej, który wiąże się z ligandem na zewnątrz komórki i w wyniku wiązania przesyła sygnał do wnętrza komórki, co zmienia funkcje komórkowe. W tym przypadku ligandem jest białko BMP, a sygnał indukuje różnicowanie komórki do wytwarzania chrząstki i kości.

    Z powodu zdolności receptora BMP do specyficznego wiązania BMP, kompozycje oczyszczonego receptora BMP będą użyteczne w diagnostycznych oznaczeniach BMP, jak również w indukowaniu tworzenia przeciwciał skierowanych wobec receptora BMP do stosowania w diagnostyce i terapii. Ponadto, kompozycje oczyszczonego receptora BMP można stosować bezpośrednio w leczeniu do wiązania lub usuwania BMP, zapewniając dzięki temu sposób regulowania tworzenia kości i aktywności BMP w rozwoju. Do badań strukturalnych i biologicznych właściwości receptorów BMP oraz roli odgrywanej przez BMP w odpowiedzi różnych populacji komórkowych na BMP podczas stymulacji wzrostu/tworzenia kości, lub do skutecznego stosowania receptora BMP w leczeniu, diagnozie lub oznaczeniu, potrzebne są oczyszczone kompozycje receptora BMP. Kompozycje takie, jednakże, można otrzymać z wydajnością mającą praktyczne znaczenie tylko przez sklonowanie i ekspresję genów kodujących receptory z zastosowaniem technik rekombinacji DNA. Wysiłki w kierunku oczyszczenia receptora BMP do stosowania w analizie biochemicznej lub w kierunku sklonowania i ekspresji genów ssaków kodujących receptory BMP utrudniał brak odpowiedniego źródła białka lub mRNA receptora. Przed niniejszym wynalazkiem, nie były znane żadne linie komórkowe, w których zachodzi konstytutywna i ciągła ekspresja wysokich poziomów receptora BMP, co wykluczało oczyszczenie receptora w celu zsekwencjonowania białka lub skonstruowania bibliotek genetycznych do bezpośredniego klonowania ekspresyjnego. Dostępność sekwencji receptora BMP uczyni możliwym utworzenie linii komórkowych o wysokich poziomach zrekombinowanego receptora BMP do analizy biochemicznej i stosowania w doświadczeniach przeszukiwania.

    179 196

    5.

    W oparciu o powyższe, istnieje potrzeba sekwencji DNA receptora BMP i wyizolowanego białka receptora BMP, kodowanego przez tę sekwencję.

    Cele niniejszego wynalazku

    Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie wyizolowanego białka kinazy receptorowej BMP.

    Celem niniejszego wynalazku jest również dostarczenie sekwencji DNA kodującej białko kinazy receptorowej BMP.

    Celem niniejszego wynalazku jest również dostarczenie zrekombinowanego wektora ekspresyjnego kodującego białko kinazy receptorowej BMP.

    Celem niniejszego wynalazku jest również dostarczenie komórki gospodarza zawierającej zrekombinowany wektor ekspresyjny kodujący białko kinazy receptorowej BMP.

    Celem niniejszego wynalazku jest również dostarczenie metody wytwarzania białka kinazy receptorowej BMP.

    Celem niniejszego wynalazku jest również dostarczenie metody identyfikowania związków zdolnych do wiązania białka kinazy receptorowej BMP.

    Celem niniejszego wynalazku jest również dostarczenie metody określania ilości związku zdolnego do wiązania białka kinazy receptorowej BMP w próbce.

    Celem niniejszego wynalazku jest również dostarczenie przeciwciał specyficznych wobec białka receptora BMP i metody ich wytwarzania.

    Podsumowanie

    Niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanego białka kinazy receptorowej BMP lub jego rozpuszczalnego fragmentu, sekwencji DNA kodującej rzeczone białko kinazy receptorowej BMP lub jego rzeczony rozpuszczalny fragment, zrekombinowanego wektora ekspresyjnego zawierającego rzeczoną sekwencję DNA, komórki gospodarza zawierającej rzeczony zrekombinowany wektor ekspresyjny, metody prowadzenia ekspresji rzeczonego białka kinazy receptorowej BMP lub jego rozpuszczalnego fragmentu, metody identyfikowania związków zdolnych do wiązania rzeczonego białka kinazy receptorowej, metody określania ilości takich związków w próbce i przeciwciał skierowanych wobec rzeczonemu białku kinazy receptorowej BMP lub jego rozpuszczalnemu fragmentowi.

    Krótki opis rysunków

    Figura 1 przedstawia sekwencję DNA zdegenerowanych starterów oligonukleotydowych stosowanych w amplifikacji BRK-1 przez PCR. Zasady nukleotydów adenina, tymina, cytozyna, guanina i inozyna sąprzedstawione przez odpowiednio jednoliterowe kody A, T, C, G i I. ACT1A i ACTIB odnosi się do zestawu zdegenerowanych 3'-końcowych starterów PCR. ACT2A i ACT2B odnosi się do zestawu zdegenerowanych 5'-końcowych starterów PCR.

    Figura 2 jest przyporządkowaniem sekwencji białkowych, porównującym domeny kinaz t-BRK-1 i BRK-1 z innymi przedstawicielami rodziny receptorów TGF-β. DAF-1, kinaza receptorowa Daf-1 z C. elegans (Georgi, L.L., Albert, P.S. i Riddle, D.L. Celi 61, 635-645 (1990)); MACT, receptor aktywiny typu II myszy (Mathews, L.S. i Vale, W.W. Celi 65, 973-982 (1991)); RTGFBR2, receptor TGF-β typu II szczura (Tsuchida, K., Lewis, K.A., Mathews, L.S. i Vale, W.W. Biochem. Biophys. Res. Commun. 191, 790-795 (1993)); MACTR1, receptor aktywiny typu I myszy (Ebner, R., Chen, R. H., Shum, L., Lawrer, S., Zioncheck, T.E, Lee, A., Lopez, A.R. i Derynck, R. Science 260,1344-1348 (1993)); receptory R3, R2 i R4 typu I szczura, hgand nieznany (He, W. W., Gustafson, M.L., Hirobe, S. i Donahoe, P.K. Develop. Dynamics, 196,133-142 (1993)). Klamra wskazuje przewidywany region zakończenia domeny kinazowej dla kinaz z pełnymi takimi domenami.

    Figura 3 przedstawia konstrukcję pJT4-J 159F, stosowanego do ekspresji BRK-1 w komórkach ssaków. CMV - wczesny promotor/sekwencja wzmacniająca wirusa cytomegalii; R - element ,,R” z długiego powtórzenia terminalnego wirusa białaczki komórek T-1, SP - miejsce wycinania intronu z wirusa SV40, T3 - promotor z bakteriofaga T3; T7 - region promotorowy z bakteriofaga T7, poliA region z wirusa S V40 kierujący poliadenylacjąmatrycowego RNA; SV40 ORI - miejsce początku replikacji z wirusa SV40; Amp - gen oporności na ampicylinę do selekcji E. coli.

    179 196

    Figura 4 przedstawia konstrukcję pJT6-J159T, stosowanego do ekspresji t-BRK-1 w komórkach ssaków. Skróty są takie same jak te na figurze 3.

    Figura 5 przedstawia wiązanie [¹²⁵J]-BMP-4 z komórkami COS stransfekowanymi cDNA BRK-1 z zastosowaniem konstrukcji pJT4-J159F. Stężenie [¹²⁵J]-BMP-4 wynosi 100 pM.

    Figura 6 przedstawia sieciowanie znakowanych radioaktywnie BMP z komórkami COS-7 stransfekowanymi cDNA BRK-1. Figura 6A, sieciowanie [¹²⁵J]-BMP-4 z BRK-1. Ścieżki po lewej stronie, komórki COS-7 stransfekowane cDNA BRK-1 z zastosowaniem konstrukcji pJT4-J159F: sieciowanie w nieobecności (-) lub obecności (+) 10 nM nieznakowanego BMP-2. Ścieżki po prawej stronie, kontrolne stransfekowane komórki COS-7: sieciowanie w nieobecności (-) lub obecności (+) 10 nM riieznakowańego BMP-2. Figura 6B, sieciowanie [¹²⁵J]-DR-BMP-2 z BRK-1. Ścieżki po lewej stronie, komórki COS-7 stransfekowane cDNA BRK-1 z zastosowaniem konstrukcji pJT4-J159F: sieciowanie w nieobecności (-) lub obecności (+) 10 nM nieznakowanego BMP-2.

    Figura 7 przedstawia immunoprecypitację BRK-1 ulegającego ekspresji w komórkach COS-7 i hsieciowanego z [¹²⁵J]-BMP-4 . Ścieżki oznaczone „+”, komórki COS-7 stransfekowane cDNA BRK-1 z zastosowaniem konstrukcji pJT4-J159F. Ścieżki oznaczone kontrolne stransfekowane komórki COS-7. Po transfekcji komórki sieciowano z [¹²⁵J]-BMP-4, następnie poddawano immunoprecypitacji stosując wskazane antysurowice. Ścieżki po lewej stronie, antysurbwica 1351, specyficzna wobec domeny zewnątrzkomórkowej (ECD); ścieżki po prawej stronie, antysurowice 1378, 1379 i 1380, wszystkie specyficzne wobec domeny kinazowej.

    Opis

    Niniejszy wynalazek zaspokaja zapotrzebowanie na białko wyizolowanego receptora BMP przez dostarczenie wyizolowanego białka kinazy receptorowej BMP, sekwencji cDNA kodującej rzeczone białko, zrekombinowanego wektora ekspresyjnego zawierającego rzeczoną sekwencję DNA, komórki gospodarza zawierającej rzeczony zrekombinowany wektor ekspresyjny, metody prowadzenia ekspresji rzeczonego białka kinazy receptorowej BMP oraz przeciwciał skierowanych wobec rzeczonego białka kinazy receptorowej BMP.

    W znaczeniu tu stosowanym, „białko kinazy receptorowej BMP-1” lub „BRK-1” oznacza białko'posiadające sekwencję aminokwasowąsekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4, jak również białka posiadające sekwencje aminokwasowe zasadniczo podobne do sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4, i które są aktywne biologicznie pod tym względem, że sązdolne do wiązania receptora BMP-2 i/lub BMP-4, lub przenoszenia sygnału biologicznego zainicjowanego przez związanie cząsteczki BMP-2 lub BMP-4 z komórką, bądź reakcji krzyżowej z przeciwciałami anty-BRK-1 skierowanymi przeciw BRK-1.

    W znaczeniu tu stosowanym, „skrócone białko kinazy receptorowej BMP” lub „t-BRK-1” oznacza białko posiadające sekwencję aminokwasowąsekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2.

    W znaczeniu tu stosowanym, termin „ zasadniczo podobna”, gdy stosuje się go do definiowania sekwencji ammokwasowych lub kwasów nukleinowych, oznacza,· że konkretna sekwencja, której to dotyczy, na przykład sekwencja zmieniona przez mutagenezę, różni się od sekwencji odniesienia jednym lub więcej podstawieniem, delęcjąlub addycją, których wpływem netto jest zachowanie aktywności biologicznej białka BRK-1. Alternatywnie, podjednostki i analogi kwasów nukleinowych są„zasadniczo podobne” do specyficznej sekwencji DNA ujawnionej w niniejszym opisie, jeśli sekwencje DNA na skutek degeneracji kodu genetycznego kodują sekwencję aminokwasową zasadniczo podobną do aminokwasowej sekwencji odniesienia.

    W znaczeniu tu stosowanym, „aktywny biologicznie” oznacza, że konkretna cząsteczka wykazuje wystarczające podobieństwo sekwencji aminokwasowej z ujawnionymi tu rozwiązaniami niniejszego wynalazku, aby była zdolna do wiązania wykrywalnych ilości BNP-2 lub BMP-4, bądź przenoszenia bodźca do komórki, na przykład, będąc składnikiem hybrydowej konstrukcji receptorowej. Korzystnie, aktywne biologicznie BRK-1 lub t-BRK-1 w zakresie niniejszego wynalazku jest zdolne do wiązania [¹²⁵J]-BMP-4 z powinowactwem w zakresie nanomolowym łub subnanomolowym (K_d w przybliżeniu równe 10⁹ M). Korzystnie, powinowactwo wynosi od około 1 x 10‘¹⁰Mdo około 1 x 9‘⁹ M, korzystniej około5 x 10'^l0M,jak określa się metodą analizy wysycema wiązania ujawnioną w przykładzie 10 poniżej.

    179 196

    W znaczeniu tu stosowanym, „rozpuszczalny fragment” odnosi się do sekwencji aminokwasowej odpowiadającej zewnątrzkomórkowemu regionowi BRK-1 lub t-BRK-1. Rozpuszczalne fragmenty obejmują skrócone białka, w których wydeletowano regiony cząsteczki receptora nie wymagane do wiązania BMP. Przykłady takich rozpuszczalnych fragmentów według wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do polipeptydów posiadających sekwencje aminokwasowe zasadniczo podobne do sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 6, reszt aminokwasowych 1-152 przedstawionych w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2, reszt aminokwasowych 1-152 przedstawionych w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4, bądź polipeptydów kodowanych przez reszty kwasów nukleinowych zasadniczo podobnych do sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 5, reszt 291-746 przedstawionych w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1 lub reszt 11-466 przedstawionych w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3.

    W znaczeniu tu stosowanym, „skrócone przez trawienie trypsynąBMP-2” i „DR-BMP-2” dotyczą fragmentu białka BMP-2, w którym koniec aminowy dojrzałego białka BMP-2 usunięto przez łagodne trawienie trypsyną.

    W znaczeniu tu stosowanym, „wyizolowany”, w odniesieniu do białka receptora według niniejszego wynalazku lub sekwencji DNA kodujących rzeczone białko, oznacza, że białko lub sekwencję DNA usunięto ze złożonego środowiska komórkowego, w którym one naturalnie występują, a rzeczone białko ulega ekspresji z rzeczonej sekwencji, gdyjest onapołączona w sposób umożliwiający działanie z odpowiednimi sekwencjami regulującymi, w komórce, w której nie zachodzi jego naturalna ekspresja.

    W znaczeniu tu stosowanym, „połączony w sposób umożliwiający działanie” dotyczy stanu, w którym części liniowej sekwencji DNA są zdolne do wpływania na aktywność innych części tej samej liniowej sekwencji DNA. Na przykład, DNA dla peptydu sygnałowego (lidera sekrecyjnego) jest połączony w sposób umożliwiający działanie z DNA dla polipeptydu, jeśli ulega on ekspresji w postaci prekursora, który uczestniczy w sekrecji polipeptydu; promotor jest połączony w sposób umożliwiający działanie z sekwencjąkodującą, jeśli kontroluje transkrypcję sekwencji; lub miejsce wiązania rybosomu jest połączone w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kodującą, jeśli jest tak umiejscowione, że umożliwia translację. Generalnie, połączony w sposób umożliwiający działanie oznacza sąsiadujący i, w przypadku liderów sekrecyjnych, sąsiadujący w tej samej ramce odczytu.

    W znaczeniu tu stosowanym, „ATCC” oznacza American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.

    W znaczeniu tu stosowanym, „białko morfogenetyczne kości 2” lub „BMP-2” oznacza peptyd kodowany przez sekwencję DNA zawartą w ATCC numer 40345 (patrz ATCC/NIH REPOSITORY CATALOGUE OF HUMAŃ AND MOUSE DNA PROBES AND LIBRARIES, wydanie szóste, 1992, str. 57, dalej w niniejszym opisie „ATCC/NIH REPOSITORY CATALOGUE”). Izolowanie BMP ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 013 649 Wanga, Wozney’a i Rosena, wydanym 7 maja 1991 r., opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 166 058 Wanga, Wozney’a i Rosena, wydanym 24 listopada 1992 r. i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 168 050, Hammondsa i Mansona, wydanym 1 grudnia 1992 r., z których każdy włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.

    W znaczeniu tu stosowanym, „białko morfogenetyczne kości 4” lub „BMP-4” oznacza peptyd kodowany przez sekwencję DNA zawartą w ATCC numer 40342 (patrz ATCC/NIH REPOSITORY CATALOGUE). Izolowanie BMP-4 ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 013 649 Wanga, Wozney’a i Rosena, wydanym 7 maja 1991 r„ włączonym do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy.

    W znaczeniu tu stosowanym, „sekwencja DNA” odnosi się do polimeru DNA, w postaci oddzielnego fragmentu lub składnika większej konstrukcji DNA, który otrzymano z DNA wyizolowanego co najmniej raz w zasadniczo czystej postaci, tj. wolnej od zanieczyszczających materiałów endogennych, i w ilości lub stężeniu umożliwiającym identyfikację, manipulację i odzyskiwanie sekwencji i jej składowych sekwencji nukleotydowych standardowymi metodami

    179 196 biochemicznymi, na przykład z zastosowaniem wektora klonującego. Korzystnie, sekwencje takie dostarcza się w postaci otwartej ramki odczytu, nie przerwanej wewnętrznymi sekwencjami nie ulegającymi translacji (intronami), które zazwyczaj obecne są w genach eukariotycznych. Można również stosować genomowy DNA zawierający stosowne sekwencje. Sekwencje DNA nie ulegającego translacji mogą występować w kierunku 5' lub 3' od otwartej ramki odczytu, gdzie nie zakłócają one manipulacji lub ekspresji regionów kodujących. Sekwencje DNA kodujące białka dostarczone przez ten wynalazek można składać z fragmentów cDNA i krótkich łączników oligonukleotydowych, bądź z serii oligonukleotydów, w celu dostarczenia syntetycznego genu, który jest zdolny do ulegania ekspresji w zrekombinowanej jednostce transkrypcyjnej.

    W znaczeniu tu stosowanym, „ zrekombinowany” oznacza, że białko pochodzi z sekwencji DNA, którą poddano manipulacji in vitro i wprowadzono do organizmu gospodarza.

    W znaczeniu tu stosowanym, „pochodzący z mikroorganizmu” odnosi się do zrekombinowanego białka utworzonego w bakteryjnych lub grzybowych (np. drożdżowych) układach ekspresyjnych.

    W znaczeniu tu stosowanym, „zrekombinowany wektor ekspresyjny” odnosi się do konstrukcji DNA stosowanej do ekspresji DNA, która koduje BRK-1 lub t-BRK-1, i która obejmuje jednostkę transkrypcyjną zawierającą następujące części składowe: 1) elementy genetyczne posiadające rolę regulacyjną w ekspresji genu, na przykład promotory i sekwencje wzmacniające, 2) sekwencję strukturalną lub kodującą która ulega transkrypcji na mRNA i translacji na białko, i 3) odpowiednie sekwencje inicjacji i terminacji transkrypcji i translacji. Elementy strukturalne przeznaczone do stosowania w eukariotycznych układach ekspresyjnych (np. komórkach drożdży, owadów lub ssaków) korzystnie obejmują sekwencję sygnałową w końcu N białka, umożliwiającą transport do błony lub sekrecję zewnątrzkomórkową utworzonego w wyniku translacji białka przez komórkę gospodarza. Alternatywnie, gdy zrekombinowane białko ulega ekspresji bez sekwencji sygnałowej, w celu ekspresji wewnątrz komórki, może ono zawierać N-końcową resztę metioniny. Reszta ta może ewentualnie ulegać następnie odtrawieniu od otrzymanego w wyniku ekspresji zrekombinowanego białka, dostarczając produkt końcowy. Stosując metodologię dobrze znaną w nauce, można konstruować zrekombinowane wektory ekspresyjne według niniejszego wynalazku. Wektory, których zastosowanie w niniejszym wynalazku jest możliwe, obejmują ale nie ograniczają się do: dla komórek ssaków, pJT4 (omawiany dalej poniżej), pCDNA-1 (Ivitrogen, SanDiego, Ca) i pSV-SPORT 1 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD); dla komórek owadów, wektory bakulowirusowe pBlueBac ΠΙ lub pBlueBacHis (Invitrogen, San Diego, Ca); a dla komórek bakteryjnych, pET-3 (Novagen, Madison, WI). Sekwencja DNA kodująca BRK-1 lub t-BRK-1 może być obecna w wektorze połączonym w sposób umożliwiający działanie z elementami regulującymi. W jednym rozwiązaniu niniejszego wynalazku, ssacze komórki gospodarzy korzystnie transfekuje się konstrukcją plazmidową pJT4-J159F, uzyskując w ten sposób ekspresję BRK-1. W innym rozwiązaniu niniejszego wynalazku, ssacze komórki gospodarzy korzystnie transfekuje się konstrukcjąplazmidowąpJT6-J 159T, uzyskując w ten sposób ekspresję t-BRK-1. Transfekcję zrekombinowanymi cząsteczkami można przeprowadzić stosując metody dobrze znane w nauce.

    W znaczeniu tu stosowanym, „komórka gospodarza” oznacza komórkę zawierającązrekombinowany wektor ekspresyjny według niniejszego wynalazku. Komórki gospodarzy mogą być stransfekowane stabilnie lub przejściowo zrekombinowanym plazmidem ekspresyjnym, lub zainfekowane zrekombinowanym wektorem wirusowym. Komórki gospodarzy obejmują komórki prokariotyczne, takie jak Escherichia coli, układy grzybowe, takie jak Saccharomyces cerevisiae, ciągłe linie komórkowe pochodzące z owadów, takie jak SF-9 i SF-21, oraz ciągłe ssacze linie komórkowe, takie jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) i stransformowane, SV-40 komórki nerki afrykańskiego koczkodana zielonego (COS).