JPH09501839A - プロスタグランジンレセプターｅｐ▲下２▼をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規なプロスタグランジンレセプターを同定し、レセプターをコードしているＤＮＡを単離し、精製し、配列決定し、宿主細胞中で発現させた。新規なプロスタグランジンレセプターをコードしているこのＤＮＡ及びレセプターを発現する宿主細胞をプロスタグランジンレセプターのモジュレーターを選定するために使用する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称 プロスタグランジンレセプターＥＰ₂をコードするＤＮＡ発明の背景 プロスタグランジン(ＰＧ)Ｅ₂の生理作用は、(１種または複数の)プロスタグ ランジンＥレセプターとの相互作用を介して伝達される。ＥＰレセプターにはＥ Ｐ₁、ＥＰ₂及びＥＰ₃の３つのサブタイプが存在する(Ｃｏｌｅｍａｎら，１９８ ９の総説参照)。これらの３つのサブタイプの全部がＰＧＥ₂に対して高い親和性 を示すが、種々のアゴニスト及びアンタゴニストに対する夫々の親和性は異なっ ており、異なる二次形質導入メカニズムを介して夫々の作用を発揮する。即ち、 ＥＰ₁レセプターの活性化はＩＰ₃及び細胞内カルシウムの増加に関連し、ＥＰ₂ レセプターの活性化は細胞内の環状ＡＭＰを増加させ、ＥＰ₃レセプターの活性 化は細胞内の環状ＡＭＰを減少させる。この一群のうちで現在までにマウスＥＰ₂ (Ｈｏｎｄａら，１９９３)、マウスＥＰ_3α及びＥＰ_3β(Ｓｕｇｉｍｏｔｏら， １９９２；Ｓｕｇｉｍｏｔｏら，１９９３)だけがクローニングされている。Ｅ Ｐ₂レセプターは、ヒト及び他の動物の小腸、腎臓、胃、筋肉、眼、子宮、胸腺 及び気管のような多様な細胞中 に普通に見出される。プロスタグランジンＥＰ₂がＥＰ₂レセプタータンパク質に 結合すると、細胞内ｃＡＭＰレベルの増加が誘発される。このシグナルに対して 組織は例えば平滑筋弛緩のような応答を生じる。 ＥＰ₂レセプターの機能活性は、モルモット回腸の環状筋、ネコ気管、モルモ ット気管のような組織調製物並びにリンパ球及び砕骨細胞のような細胞調製物を 用いて研究されている。ＥＰ₂レセプター活性の上記のような研究方法にはいく つかの欠点があり、例えば、異なるリガンド結合特性を有する複数の異なってい るが近縁のレセプター集団を含む調製物が必要であり、このため、絶対力価及び 選択性の測定が極めて難しくなっている。更に、組織に含まれるＥＰ₂レセプタ ーが極めて低レベルであり、また、組織サンプルが必要なので化合物をヒトＥＰ₂ レベルのエフェクターとして十分に試験することができない。発明の概要 ＥＰ₂と呼ばれる新規なプロスタグランジンレセプタータンパク質をヒト細胞 から単離及び精製した。全長ＥＰ₂タンパク質をコードするＤＮＡ分子を単離及 び精製し、ヌクレオチド配列を決定した。ＥＰ₂をコードするＤＮＡを 発現ベクターにクローニングした。これらの発現ベクターは組換え宿主細胞に導 入されると組換え宿主細胞に機能性ＥＰ₂レセプタータンパク質を発現させる。 新規なＥＰ₂タンパク質、ＥＰ₂をコードするＤＮＡ、発現ベクター及び組換えＥ Ｐ₂を発現する組換え宿主細胞は、ＥＰ₂レセプター活性調節剤の選定に有用であ る。 ＥＰ₂レセプター調節剤の選定のために、組換えＥＰ₂を発現する宿主細胞を利 用する方法も開示している。ＥＰ₂活性調節剤は、プロスタグランジン関連疾患 の治療及びＥＰ₂レセプターに対するプロスタグランジンの作用を調節するため に有用である。図面の簡単な説明 図１は、ＥＰ₂レセプタータンパク質の推定された完全アミノ酸配列（１Ｃ） 及びＥＰ₂レセプタータンパク質をコードする完全ＤＮＡ配列（１Ａ及び１Ｂ） を示す。 図２は、ＥＰ₂ｃＤＮＡを注入したアフリカツメガエル卵母細胞中のプロスタ グランジンＥ₂レセプターの発現を、卵母細胞に１.６ｎｇのＥＰ₂ｃＤＮＡと２. ５ｎｇのＣＦＴＲ ｃＤＮＡとを注入して−６０ｍＶの固定電圧をかけたときに １ｎＭのＰＧＥ₂の浴潅流によって惹起された内 向きのｃＡＭＰ依存性Ｃｌ^-電流(図で下向きの移動)によって示す。 図３は、(ＣＦＴＲ＋アンチセンスｈＥＰ₂)ｃＤＮＡを注入した卵母細胞中の ＩＢＭＸ誘発ＣＦＴＲ媒介Ｃｌ^-電流を示しており、１μＭ及び３μＭのＰＧＥ₂ に対する応答の欠如が認められる。 図４では、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ−ｈＥＰ₂をトランスフェクトしたＣＯＳ−Ｍ₆ 膜に対する〔³Ｈ〕ＰＧＥ₂特異的結合の競合を、４Ａでは、１０ｐＭ〜１０ｍＭ のＰＧＥ₂(●)、ＰＧＥ₁(○)、１７−フェニル−トリノールＰＧＥ₂(■)，イロ プロスト(□)、ＰＧＦ_2α(◆)、ＰＧＤ₂(◇)及びＵ４６６１９(▲)の存在下、４ Ｂでは、１００ｐＭ〜１００μＭのＭＢ２８７６７(●)、ミソプロストル(○)、 ブタプロスト(■)、ＡＨ６８０９(□)及びＳＣ１９２２０(◆)の存在下、に行っ た〔³Ｈ〕ＰＧＥ₂結合アッセイで示す。発明の詳細な説明 本発明は、ＥＰ₂と呼ぶ新規なプロスタグランジンレセプターをコードするｃ ＤＮＡに関する。本発明はまた、組換え発現プラスミド中でクローニングされた ＥＰ₂コーディングＤＮＡを発現する組換え宿主細胞に関する。本発明は また、ＥＰ₂レセプター活性を調節する物質のスクリーニング方法に関する。本 発明のＤＮＡはＥＰ₂産生細胞から単離されるものである。本文中で使用される ＥＰ₂なる用語は、プロスタグランジン分子に特異的に結合し得るＧタンパク質 結合レセプターを意味する。 ＥＰ₂を産生し得る哺乳類細胞の非限定例としては、小腸、腎臓、胃、血管平 滑筋、眼、胎盤、子宮、リンパ球、砕骨細胞及び気管気管支樹に由来の細胞があ る。ＥＰ₂を産生する形質転換哺乳類細胞系の非限定例は、肥満細胞腫Ｐ−８１ ５細胞である。本発明の好ましい細胞は、正常なヒト腎臓及び肺細胞であり、最 も好ましい細胞はヒト胸腺細胞である。 ＥＰ₂ ｃＤＮＡを単離するために他の細胞及び細胞系も適宜使用し得る。適当 な細胞は、細胞表面のＥＰ₂をスクリーニングすることによって選択し得る。Ｅ Ｐ₂活性の検出方法は当業者に公知であり、レセプターに特異的な放射性標識リ ガンドの結合を測定する。このアッセイでＥＰ₂活性を有している細胞はＥＰ₂ ｃＤＮＡの単離に適しているであろう。 ＥＰ₂ ｃＤＮＡをクローニングするためには多様な方法 があり、そのいずれも使用し得る。これらの方法の非限定例としては、適当な発 現ベクター系中でＥＰ₂含有ｃＤＮＡライブラリーを構築した後に行うＥＰ₂ ｃ ＤＮＡの直接機能的発現がある。別の方法では、バクテリオファージまたはプラ スミドシャトルベクター中で構築されたＥＰ₂含有ｃＤＮＡライブラリーをＥＰ₂ タンパク質のアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブによ ってスクリーニングする。好ましい方法は、バクテリオファージまたはプラスミ ドシャトルベクター中で構築されたＥＰ₂含有ｃＤＮＡライブラリーをＥＰ₂タン パク質をコードする部分ｃＤＮＡによってスクリーニングする方法である。この 部分ｃＤＮＡは、プロスタグランジンＥＰ₂レセプターに近縁の他のＧタンパク 質結合レセプターの既知のアミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプライマー を設計して行うＥＰ₂ ＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅によって得られる 。 他の種類のライブラリー、及び、他の細胞または細胞種から構築されたライブ ラリーもＥＰ₂をコードするＤＮＡの単離に使用できることは容易に理解されよ う。他の種類のライブラリーの非限定例としては、他の細胞または細胞 系由来のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムＤＮＡライブラリーがある。 適当なｃＤＮＡライブラリーがＥＰ₂活性を有する細胞または細胞系から調製 され得ることは容易に理解されよう。ＥＰ₂ ｃＤＮＡの単離に用いるｃＤＮＡラ イブラリーの調製に使用する細胞または細胞系を選択するためには、先ず、本発 明で使用する上述のごとき既知の標識リガンド結合アッセイを用いて細胞関連Ｅ Ｐ₂活性を測定する。 ｃＤＮＡライブラリーの調製は、当業界で公知の標準方法で行う。公知のｃＤ ＮＡライブラリー構築方法は例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ,Ｔ.,Ｆｒｉｔｓｃｈ,Ｅ .Ｆ.,Ｓａｍｂｒｏｏｋ,Ｊ.,Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ(Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ,１９８２) に記載されている。 また、ＥＰ₂をコードするＤＮＡが適当なゲノムＤＮＡライブラリーから単離 できることも容易に理解されよう。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当業界 で公知の標準方法で行うことができる。公知のゲノムＤＮＡライブラリ ーの構築方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓらの前掲書に記載されている。 好ましい方法の１つによってＥＰ₂遺伝子をクローニングするためには、ＥＰ₂ または相同タンパク質のアミノ酸配列またはＤＮＡ配列の情報が必要である。こ れを得るために、ＥＰ₂タンパク質または相同タンパク質を精製し、自動配列分 析装置によって部分的アミノ酸配列を決定する。全アミノ酸配列を決定する必要 はなく、ＥＰ₂ ＤＮＡの部分的フラグメントのＰＣＲ増幅用に６〜８個のアミノ 酸の２つの領域の直鎖状配列を決定すればよい。 適当なアミノ酸配列が同定されたら、これらをコードし得るＤＮＡ配列を合成 する。遺伝子コードは縮重性なので、特定アミノ酸をコードする２つ以上のコド ンを使用でき、従って、同様のＤＮＡオリゴヌクレオチドのセットのいずれか１ つによってアミノ酸配列をコードし得る。セットの１つの成員だけがＥＰ₂配列 に等しいであろうが、セットの他の成員も不適正対合のＤＮＡオリゴヌクレオチ ドではあるがＥＰ₂ ＤＮＡにハイブリダイズし得るかも知れない。即ち、不適正 対合のＤＮＡオリゴヌクレオチドであっても、ＥＰ₂をコードするＤＮＡの同定 及び単離ができるほど十 分にＥＰ₂ ＤＮＡにハイブリダイズできることがある。 好ましい方法の１つを用い、ＥＰ₂をコードするｃＤＮＡクローンを、ポリメ ラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)に基づく技術とｃＤＮＡライブラリースクリーニングと を用いる２段階方法で単離する。第一段階では、精製されたＥＰ₂または相同タ ンパク質からのＮＨ₂末端及び内部のアミノ酸配列情報を使用してＥＰ₂特異的Ｄ ＮＡフラグメント増幅用の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。第二 段階では、ｃＤＮＡライブラリーから全長ｃＤＮＡを単離するプローブとして使 用するためにこれらのフラグメントをクローニングする。 ＥＰ₂をコードするほぼ全長のｃＤＮＡの配列を表１に示し、クローンＥＰ₂と 命名した。クローン化ｃＤＮＡから推定されるＥＰ₂のアミノ酸配列を表２に示 す。決定されたｃＤＮＡ配列を検討すると、約４８８個のアミノ酸から成るタン パク質をコードする単一の大きい読み取り枠の存在が判明する。 上述の方法によって得られたクローン化ＥＰ₂ ｃＤＮＡを、適当なプロモータ ーと他の適当な転写調節因子とを含む発現ベクター中で分子クローニングによっ て組換え発現 させ、原核細胞または真核細胞から成る宿主細胞に移入して組換えＥＰ₂を産生 させる。このような操作に関する方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓらの前掲書に記載さ れており、当業界でよく知られている。 本文中の発現ベクターとは、適当な宿主中でのクローン化ＤＮＡの転写及びそ れらのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列と定義される。このようなベクターは 、細菌、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞のような多様な宿主中で真核 細胞ＤＮＡを発現させるために使用できる。 特殊設計のベクターにより、細菌−酵母または細菌−動物細胞のような宿主間 でＤＮＡをシャトルさせ得る。適正に構築された発現ベクターは、宿主細胞中で 自律複製するための複製起点と、選択可能マーカーと、限定数の有用な制限酵素 部位と、高コピー数能力と、活性プロモーターとを含む必要がある。プロモータ ーなる用語は、ＤＮＡに結合しＲＮＡ合成を開始することをＲＮＡポリメラーゼ に指令するＤＮＡ配列と定義される。ｍＲＮＡ合成を高頻度で開始させるプロモ ーターを強力プロモーターと呼ぶ。発現ベクターの非限定例としては、クローニ ングベクター、修飾されたクローニングベクター、特別に設計されたプラス ミドまたはウイルスがある。 組換えＥＰ₂を哺乳類細胞中で発現させるために種々の哺乳類発現ベクターを 使用し得る。組換えＥＰ₂発現に適当な市販の哺乳類発現ベクターの非限定例は 、ｐＭＣ１ｎｅｏ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)、ｐＸＴ１(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)、 ｐＳＧ５(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ(Ｉｎｖ ｉｔｒｏｇｅｎ)、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ(ＡＴＣＣ３７５９３)、ｐＢＰＶ −１(８−２)(ＡＴＣＣ３７１１０)、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ(３４２−１２) (ＡＴＣＣ３７２２４)、ｐＲＳＶｇｐｔ(ＡＴＣＣ３７１９９)、ｐＲＳＶｎｅｏ (ＡＴＣＣ３７１９８)、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ(ＡＴＣＣ３７１４６)、ｐＵＣＴａ ｇ(ＡＴＣＣ３７４６０)、ＩＺＤ３５(ＡＴＣＣ３７５６５)及びワクシニアウイ ルス転移ベクターｐＴＭ１である。 また、宿主細胞中で発現するようにＥＰ₂をコードするＤＮＡを発現ベクター 中でクローニングしてもよい。宿主細胞は原核細胞または真核細胞のいずれでも よく、その非限定例としては、細菌、酵母、並びに、ヒト、ウシ、ブタ、サル、 齧歯類などに由来の細胞系を非限定例とする哺乳類 細胞、ショウジョウバエに由来の細胞系を非限定例とする昆虫細胞がある。市販 されている適当な哺乳類種に由来の細胞系の非限定例としては、ＣＶ−１(ＡＴ ＣＣ ＣＣＬ７０)、ＣＯＳ−１(ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０)、ＣＯＳ−７(ＡＴＣ Ｃ ＣＲＬ１６５１)、ＣＨＯ−Ｋ１(ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１)、３Ｔ３(ＡＴＣＣ ＣＣＬ９２)、ＮＩＨ／３Ｔ３(ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５８)、ＨｅＬａ(ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)、Ｃ１２７１(ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１６)、ＢＳ−Ｃ−１(ＡＴＣＣ Ｃ ＣＬ２６)及びＭＲＣ−５(ＡＴＣＣ ＣＣＬ１７１)がある。 形質転換、トランスフェクション、感染、プロトプラスト融合、電気穿孔法、 などを非限定例とする多くの方法のいずれかによって発現ベクターを宿主細胞に 導入し得る。発現ベクター含有細胞を個別に分析してＥＰ₂タンパク質産生の有 無を決定する。ＥＰ₂を発現する細胞の同定は、抗ＥＰ₂抗体との免疫反応性、宿 主細胞関連ＥＰ₂活性の存在、などを非限定例とする複数の手段によって行うこ とができる。 また、ｉｎｖｉｔｒｏ産生した合成ｍＲＮＡを用いてＥＰ₂ ＤＮＡを発現させ てもよい。合成ｍＲＮＡは、小麦 胚芽エキス、網状赤血球抽出物を非限定例とする種々の無細胞系に効率よく翻訳 され得、また、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションなどを非限定例と する細胞ベースの系にも効率よく翻訳され得る。カエル卵母細胞へのマイクロイ ンジェクションが好ましい。 最適レベルのレセプター活性及び／またはＥＰ₂タンパク質を生じる(１つまた は複数の)ＥＰ₂ ｃＤＮＡ配列を決定するために構築されるＥＰ₂ ｃＤＮＡ分子 の非限定例としては、ＥＰ₂ ｃＤＮＡの全長読み取り枠、及び、レセプタータン パク質の特異的ドメインまたはタンパク質の転位ドメインだけをコードするｃＤ ＮＡ部分を含む種々の構築物がある。すべての構築物は、ＥＰ₂ ｃＤＮＡの５' 及び／または３'の非翻訳領域を全く含まないか、またはその全部もしくは一部 を含むように設計され得る。ＥＰ₂活性及びタンパク質発現のレベルは、これら の構築物を単独でまたは組み合わせて適当な宿主細胞に導入した後で決定し得る 。一過性アッセイで最適発現を生じるＥＰ₂ ｃＤＮＡカセットを決定した後、こ のＥＰ₂ ｃＤＮＡ構築物を、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、大腸 菌及び酵母細胞などを非限定例とする多様な発現ベクター(組換え ウイルスも含む)に移入する。 哺乳類細胞トランスフェクタントにおけるＥＰ₂レセプター活性のレベル及び ＥＰ₂タンパク質のレベルを以下の方法で検定する。ＥＰ₂レセプター活性を検定 するためには、標識リガンドを細胞に直接導入し、ＥＰ₂発現細胞に対するリガ ンドの特異的結合量を測定する。レセプター活性に関する結合アッセイは、当業 界で公知である(Ｆｒｅｙら,１９９３,Ｅｕｒ.Ｊ.Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.２４４, ｐｐ２３９−２５０)。 宿主細胞中のＥＰ₂タンパク質のレベルは、イムノアフィニティ法及び／また はリガンドアフィニティ法を非限定例とする種々の方法によって定量される。Ｅ Ｐ₂特異的アフィニティビーズまたはＥＰ₂特異的抗体を使用して、³⁵Ｓ−メチオ ニン標識または非標識ＥＰ₂タンパク質を単離する。標識したＥＰ₂タンパク質を ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。非標識ＥＰ₂タンパク質はＥＰ₂特異的抗体 を使用するウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイによって検出 する。 宿主細胞中のＥＰ₂の発現後に、ＥＰ₂タンパク質を回収して、ＥＰ₂特異的リ ガンドに結合し得る活性形のＥＰ₂を 得る。複数のＥＰ₂精製手順を適宜利用できる。組換えＥＰ₂は、界面活性剤可溶 化、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、 ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラ フィーなどを非限定例とする標準分離方法の種々の併用または単独使用によって 細胞膜から精製され得る。 更に、組換えＥＰ₂は全長新生ＥＰ₂またはＥＰ₂のポリペプチドフラグメント に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体によって作製されたイ ムノアフィニティカラムの使用によって他の細胞性タンパク質から分離され得る 。 ＥＰ₂に単一特異的な抗体は、ＥＰ₂に反応性の抗体を含む哺乳類坑血清から精 製されるか、またはＫｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ,Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７(１９７５)の方法を用いてＥＰ₂と反応性のモノクローナル抗体 として調製される。本文中で使用される単一特異的抗体なる用語は、ＥＰ₂に対 して均一な結合特性をもつ単一抗体種または多重抗体種を意味する。本文中で使 用される均一結合なる用語は、上記のようなＥＰ₂関連の抗体種が特異的抗原ま たはエピトープに結合する能力を意味 する。免疫アジュバントを任意に併用した適当な濃度のＥＰ₂またはＥＰ₂タンパ ク質の配列に由来のペプチドによってマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤ ギ、ウマなどの動物を免疫感作してＥＰ₂特異的抗体を増産させる。 最初の免疫感作に先立ってプレ免疫血清を収集する。各動物に、約０.１μｇ 〜約１,０００μｇのＥＰ₂またはＥＰ₂近縁ペプチドを、許容される免疫アジュ バントと共に投与する。このような許容されるアジュバントの非限定例は、フロ インド完全アジュバント、フロインド不完全アジュバント、ミョウバン沈降物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ を含む油中水エマルジョン及び ｔＲＮＡである。初期免疫感作では、好ましくはフロインド完全アジュバント中 の酵素を、皮下(ＳＣ)、腹膜組織(ＩＰ)または双方の経路で多数部位に注射した 。各動物を、定期的、好ましくは毎週１回採血して抗体価を測定する。初期免疫 感作後、動物を任意に追加免疫し得る。追加免疫注射として通常は、フロインド 不完全アジュバント中のＥＰ₂またはＥＰ₂近縁ペプチドを同じ経路で動物に投与 する。追加免疫注射は、最大力価が得られるまで約３週毎に投与する。各追加免 疫のほぼ７日後毎または単一免疫感作後のほぼ毎 週一回ずつ動物を採血し、血清を収集し、アリコートを約−２０℃で保存する。 ＥＰ₂またはＥＰ₂タンパク質の配列に由来のペプチドと反応性のモノクローナ ル抗体(ｍＡｂ)は、近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃをＥＰ₂またはＥＰ₂ 近縁ペプチドで免疫感作することによって調製する。上記のような許容されるア ジュバントを等容量で添加した約０.５ｍｌのバッファまたは生理食塩水中の約 １μｇ〜約１００μｇ、好ましくは約１０μｇのＥＰ₂またはＥＰ₂近縁ペプチド によってＩＰまたはＳＣ経路でマウスを免疫感作する。フロインド完全アジュバ ントが好ましい。マウスに対して、０日目に初期免疫感作し、約３〜約３０週維 持する。免疫マウスに対して、リン酸塩緩衝生理食塩水のようなバッファ溶液中 の約１μｇ〜約１００μｇのＥＰ₂追加免疫を静脈内(ＩＶ)経路で１回以上投与 する。抗体陽性マウスのリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を、当業界で公知の 標準手順によって免疫マウスの脾臓を摘出することによって採取する。脾臓リン パ球と適当な融合相手好ましくは骨髄腫とを、安定なハイブリドーマを形成し得 る条件下に混合することによってハイブリドーマ細胞を産生する。融合相手の非 限定例と しては、マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４及 びＳｐ２／０があり、Ｓｐ２／０が好ましい。抗体産生細胞及び骨髄腫細胞を分 子量約１,０００のポリエチレングリコール中で約３０％〜約５０％の濃度で融 合させる。融合したハイブリドーマ細胞を、ヒポキサンチン、チミジン及びアミ ノプテリンを補充したダルベッコ改質イーグル培地(ＤＭＥＭ)中で当業界で公知 の手順で増殖させることによって選択する。約１４日、１８日及び２１日目に増 殖陽性ウエルから上清流体を収集し、ＥＰ₂またはＥＰ₂近縁ペプチドを抗原とし て用いる固相イムノラジオアッセイ(ＳＰＩＲＡ)のようなイムノアッセイによっ て抗体産生をスクリーニングする。また、培養流体をオクタロニー沈降アッセイ で試験してｍＡｂのイソタイプを決定する。抗体陽性ウエルからのハイブリドー マ細胞をＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ,Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ,Ｔｉ ｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ, Ｋｒｕｓｅ ＆ Ｐａｔｅｒｓｏｎ編,Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ,１９７３の 軟寒天法のような方法によってクローニングする。 プリスチン感作したＢａｌｂ／ｃマウスに対して、その 約４日後に約２×１０⁶〜約６×１０⁶ハイブリドーマ細胞をマウスあたり約０. ５ｍｌの量で注射することによってモノクローナル抗体をｉｎ ｖｉｖｏで産生 させる。細胞移入の約８〜１２日後に腹水を収集し、当業界で公知の方法でモノ クローナル抗体を精製する。 抗ＥＰ₂ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生では、十分な量の特異的ｍＡｂを得る ために約２％のウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させ る。当業界で公知の方法でｍＡｂを精製する。 腹水またはハイブリドーマ培養流体の抗体価は、沈降、受動凝集、エンザイム リンクトイムノソルベント抗体アッセイ法(ＥＬＩＳＡ)及びラジオイムノアッセ イ法(ＲＩＡ)などを非限定例とする種々の血清学的または免疫学的アッセイによ って決定する。体液または組織及び細胞抽出物中のＥＰ₂の存在を検出するため にも同様のアッセイを使用する。 単一特異的抗体を産生するための上記の方法がＥＰ₂ポリペプチドフラグメン トまたは全長ＥＰ₂ポリペプチドに特異的な抗体を産生するために使用できるこ とは容易に理解されよう。 抗体をＡｆｆｉｇｅｌ−１０(Ｂｉｏｒａｄ)に添加することによってＥＰ₂抗 体精製カラムを作製し得る。Ａｆｆｉｇｅｌは、抗体とアガロースゲルビーズ支 持体とが共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドでプレ活性化 したゲル支持体である。次に抗体をスペサーアームとのアミド結合によってゲル に結合させる。次に１Ｍの塩酸エタノールアミン(ｐＨ８)によって残りの活性化 エステルの反応を停止させる。カラムを水、０.２３Ｍの塩酸グリシン(ｐＨ２. ６)で順次洗浄して、非結合抗体または不要タンパク質を除去する。次に、界面 活性剤のような適当な膜可溶化剤を加えたリン酸塩緩衝生理食塩水(ｐＨ７.３) 中でカラムを平衡させ、ＥＰ₂またはＥＰ₂フラグメントを含有する細胞培養上清 または細胞抽出物をゆっくりとカラムに通す。次に、界面活性剤のような適当な 膜可溶化剤を加えたリン酸塩緩衝生理食塩水で、光学密度(Ａ₂₈₀)がバックグラ ウンドに下がるまでカラムを洗浄し、界面活性剤のような適当な膜可溶化剤を加 えた０.２３Ｍの塩酸グリシン(ｐＨ２.６)を用いてタンパク質を溶出させる。精 製したＥＰ₂タンパク質を次に、界面活性剤のような適当な膜可溶化剤を加えた リン酸塩緩衝生理食塩水に対して 透析する。 本発明のプロスタグランジンレセプターをコードするＤＮＡの適当な単離方法 の１つでは、他のＧタンパク質結合レセプターから得られたアミノ酸及び／また はＤＮＡ配列情報を利用する。他のプロスタグランジンレセプターはＧタンパク 質に結合することが分かっているので、トランスメンブラン及び／または細胞質 ドメインのようなある種の領域またはドメインは新規なレセプターの単離プロー ブを産生するために十分なある程度の相同を有していると予想される。 プロスタグランジン及びロイコトリエンはＧタンパク質結合したレセプターを 介して夫々のシグナルを形質導入することが分かっている。種々の組織中に存在 するＰＧＨ₂／トロンボキサンＡ₂、ＰＧＩ₂、ＰＧＥ₂、ＰＧＤ₂、ＰＧＦ_2α、Ｌ ＴＢ₄及びＬＴＤ₄に対する種々のレセプターに関する記載が存在する。いくつか のレセプターは可溶化され部分的に精製されており(Ｄｕｔｔａ−Ｒｏｙ,Ａ.Ｋ. ら,(１９８７)ＪＢＣ,２６２,ｐｐ.１２６８５；Ｔｓａｉ,Ａ.Ｌ.ら,(１９８９) ,ＪＢＣ,２６４,ｐｐ６１；１６８−Ｗａｔａｎｂｅ,Ｔ.ら,(１９９０),ＪＢＣ,２６５ ,ｐｐ.２ １２３７)、ヒト血小板ＴＸＡ₂レセプターは見掛け均一まで精製された(Ｕｓｈ ｉｋｕｂｉ,Ｆ.ら,(１９８９),ＪＢＣ,２６４,ｐｐ.１６４９６)。精製されたト ロンボキサンレセプターは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で約５７ｋＤａを 中心とする極めて広いバンドを示した。部分的配列情報のために十分なタンパク 質が得られた。 これらのレセプターが一次構造において近縁であるという仮定のもとに他のエ イコサノイドレセプター遺伝子を相同スクリーニングによって単離する方法を採 用した(Ｓｕｇｉｍｏｔｏ,Ｙ.ら,(１９９２),ＪＢＣ,２６７,ｐｐ.６４６３)。 これらのレセプターはＧタンパク質結合レセプタースーパーファミリーに属する ので、トランスメンブラン領域及び細胞質ドメイン中に相同領域が存在する公算 が大きい。従って、プロスタグランジンレセプターに近縁の種々の既知のＧタン パク質結合レセプターは、トランスメンブラン領域のような、レセプタータンパ ク質をコードする探索中のＤＮＡの相同を有し易い領域に対するＤＮＡプローブ として使用し得る。 このレセプターのＣ末端の１６５個のアミノ酸領域をコードするマウスＥＰ₂ レセプターｃＤＮＡの０.６８ｋｂの フラグメントを使用して、ヒト肺ライブラリーをスクリーニングし、このライブ ラリーから全長ヒトＥＰ₂ ｃＤＮＡを単離した。この１．９５８ｋｂのｃＤＮＡ クローンは４８８アミノ酸のタンパク質をコードしている。このタンパク質をＥ Ｐ₂レセプターと命名した。他の多くのＧタンパク質結合レセプターと同様に、 ＥＰ₂レセプターはいくつかの特徴を共有している。第一に、推定される細胞外 アミノ末端のＡｓｎ⁷及びＡｓｎ¹⁷⁷に２つのＮ結合グリコシル化(糖付加)部位が 存在するという可能性を含む。第二に、細胞外ループ１及び２に保存システイン 残基が検出される。Ｃ末端全体及び第三の細胞質ループに多数のセリン残基、タ ンパク質キナーゼリン酸化可能部位が存在する。ＥＰ₂レセプターは、トランス メンブラン₃にカチオン性アミノ含有リガンドと結合するレセプターに特徴的な アスパラギン酸残基を含んでいないが、トランスメンブラン７の内部には既知の エイコサノイドレセプターのすべてにおいて検出される保存アルギニン(３１５ 位)を含む。 本発明の新規なプロスタグランジンレセプターは、レセプター活性調節化合物 を選定するアッセイ手順で使用するのに適している。本文中に記載されたレセプ ター活性の調 節は、レセプターの阻害または活性化を意味し、また、レセプター活性の正常な 調節に対する直接または間接の影響を意味する。レセプター活性調節化合物とし ては、アゴニスト、アンタゴニスト、及び、レセプター活性の調節に直接または 間接の影響を与える化合物がある。 レセプターのモジュレーターを選定するアッセイ手順で使用するための本発明 のプロスタグランジンレセプターは、天然型ソース及び組換えソースのいずれか ら得られてもよい。プロスタグランジンレセプターのモジュレーターを選定する アッセイ手順は一般には、本発明のプロスタグランジンレセプターと、プロスタ グランジンレセプターのモジュレーターを含むと推定される被検化合物またはサ ンプルを用いる。被検化合物またはサンプルを、例えば天然型または組換え型の 精製レセプタータンパク質、天然型または組換え型のレセプター産生細胞の継代 細胞画分、及び／または天然型または組換え型のレセプターを発現する全細胞に 対して直接試験し得る。試験化合物またはサンプルは既知の標識または非標識の レセプターリガンドの存在または非存在下にレセプターに添加され得る。被検化 合物またはサンプルの調節活性は、レセプターに対する結合、レセプタ ーの活性化、レセプター活性の阻害、レセプターに対する他の化合物の結合の阻 害もしくは増進、レセプター調節の修飾または細胞内活性の修飾に関する被検化 合物またはサンプルの能力を分析することによって決定され得る。 ＥＰ₂レセプター活性のモジュレーターの選定は、ＥＰ₂レセプター活性が関与 する疾患状態の治療に有用である。他の化合物は、レセプターの活性を刺激また は阻害するために有用であろう。ＥＰ₂レセプターの選択的アゴニストまたはア ンタゴニストは、炎症、疼痛反応及び発熱に伴う浮腫の治療に有用であろう。ま た砕骨機能、従って骨吸収、Ｔ及びＢ−リンパ球機能、従って免疫反応、血管網 、気管気管支網のような平滑筋弛緩、新生及び転移性腫瘍増殖、などのモジュレ ーターとして有用であろう。ＥＰ₂をコードするＤＮＡ分子の単離及び精製は、 ＥＰ₂レセプターの組織分布の確定、疾患状態におけるＥＰ₂レセプター発現の変 化の研究、ＥＰ₂レセプター活性を調節する化合物の選定方法の確立に有用であ ろう。 以下の実施例は本発明の例示であり、本発明はこれらの実施例に限定されない 。実施例１ ＥＰ₂ ｃＤＮＡのクローニング マウス肥満細胞腫Ｐ−８１５細胞の全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによってマウス ＥＰ₂の部分ｃＤＮＡ(６８０ｂｐ)を採取し、クローニングした。このマウスＥ Ｐ₂フラグメントを使用して、標準方法(Ｓａｍｂｒｏｏｋら,１９８９,Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,２ｎｄ Ｅｄ.,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ,Ｎ.Ｙ.)を用いてヒト肺λｇｔ１０ライブラリー(Ｃ ｌｏｎｔｅｃｈ,Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ,ＣＡ)をスクリーニングするための³²Ｐ標識 ｃＤＮＡプローブを作製した。 このスクリーニングから１．９５８ｋｂのｃＤＮＡクローンをプラーク精製し 、プレート溶菌法(Ｓａｍｂｒｏｏｋら,前掲書)によってＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡのサブクローニング及び配列決定 Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ配列決定キット(Ｐｈａｒｍａｃｉａ)を用いて配列 決定を行うために、１．９５８ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント(ＥＰ₂)をｐＳＫ ベクター(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ,Ｌａ Ｊｏｌｌａ,ＣＡ)にサブクローニ ングした。ＫＳ及びＳＫプライマー(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ,Ｌａ Ｊｏｌｌａ,Ｃ Ａ)または決定された配列から生成したプライマーを用いて双方の鎖を完全に配 列決定した。ＥＰ₂のヌクレオチド配列を表１に示す。コードされたタンパク質 のアミノ酸配列を表２に示す。配列決定された１.９５８ｋｂのフラグメント(Ｅ Ｐ₂；図１)はヒトＥＰ₁、ＥＰ₃及びトロンボキサンレセプターｃＤＮＡとの配列 相同を含み、Ｇタンパク質結合レセプターに特有の推定ヘプタヘリカル構成が明 らかであった。長い読み取り枠(１４６４ｂｐ)を決定すると、これは、予測され た相対分子量５３,１１５を有する４８８アミノ酸のポリペプチドであった。開 始コドンとなるＡＴＧは、翻訳開始用のＫｏｚａｋコンセンサス配列に適正対合 する(Ｋｏｚａｋ,１９８９,Ｊ.Ｃｅｌｌ.Ｂｉｏｌ.１０８,ｐｐ２２９−２４１) 。予測された開始コドンの８６ｂｐ上流に枠に合致するＴＧＡ終止コドンを含む 、３８８ｂｐの５'−非翻訳配列が存在する。実施例２ ｐｃＤＮＡＩａｍｐ−ＥＰ₂発現ベクターの構築 １．５０７ＫｂのＦｓｐ１−Ｓｃａ１ヒトＥＰ₂ ｃＤＮ ＡフラグメントをｐｃＤＮＡＩａｍｐのＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングし、 ＰＳｔＩ消化によって正しい配向を確認した。 実施例３ 大腸菌発現ベクター中のＥＰ₂ ｃＤＮＡのクローニング ｐＥＴシリーズ(Ｎｏｖａｇｅｎ)を非限定例とする大腸菌発現ベクターにＥＰ₂ 発現カセットを移入し、組換えＥＰ₂を大腸菌中で産生させる。ｐＥＴベクター は、厳密に調節されたバクテリオファージＴ７プロモーターの調節下にＥＰ₂発 現を維持する。誘導性ｌａｃプロモーターによって駆動されるＴ７ ＲＮＡポリ メラーゼ遺伝子の染色体コピーを含む大腸菌宿主にこの構築物を移入した後、適 正なｌａｃ基質(ＩＰＴＧ)を培養物に添加すると、ＥＰ₂の発現が誘導される。 発現したＥＰ₂のレベルを前述のアッセイによって決定する。 ＥＰ₂の完全読み取り枠をコードしているｃＤＮＡをｐＥＴ １１ａのＮｄｅ Ｉ部位に挿入する。正の配向の構築物を配列解析によって同定し、これを用いて 発現宿主菌株ＢＬ２１を形質転換させる。次に、形質転換体をＥＰ２タンパク質 産生用培養物に接種する。培養物はＭ９またはＺＢ培地中で増殖し得る。これら の培地の配合組成は当業界で公知である。ほぼＯＤ₆₀₀＝１.５になるまで増殖さ せた後、１ｍＭのＩＰＴＧによってＥＰ₂の発現を３７℃で３ 時間誘発する。ＥＰ₂レセプター結合活性はこれらの細胞からの膜画分中で検出 されるであろう。実施例４ アフリカツメガエル卵母細胞マイクロインジェクションによる合成ＥＰ₂ ｍＲＮ Ａのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳及び哺乳類細胞中での発現 合成ｍＲＮＡ産生用のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ベクター(ｐＧＥＭシリーズ、Ｐｒ ｏｍｅｇａ)にＥＰ₂ ｃＤＮＡ構築物を結合させる。 ＥＰ₂ ｍＲＮＡをコードしている二重鎖ＤＮＡを、バクテリオファージプロモ ーターを含むプラスミドベクターにクローニングし、ＥＰ₂をコードするクロー ン化ＤＮＡを含むプラスミドベクターを直鎖化し、プラスミドベクターのバクテ リオファージプロモーターを特異的に認識するバクテリオファージ由来のＤＮＡ 依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてクローン化ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写す ることによって、十分な量の合成ｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ産生させる。 バクテリオファージのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるバ クテリオファージプロモーターを含 む種々のプラスミドベクターが入手可能であり、その非限定例としては、ｐＳＰ ６４、ｐＳＰ６５、ｐＳＰ７０、ｐＳＰ７１、ｐＳＰ７２、ｐＳＰ７３、ｐＧＥ Ｍ−３Ｚ、ｐＧＥＭ−４Ｚ、ｐＧＥＭ−３Ｚｆ、ｐＧＥＭ−５Ｚｆ、ｐＧＥＭ− ７Ｚｆ、ｐＧＥＭ−９Ｚｆ及びｐＧＥＭ−１１Ｚｆがあり、これらのプラスミド の全シリーズはＰｒｏｍｅｇａから市販されている。 ＥＰ₂ ＤＮＡのクローニングに好都合な好適なベクターの１つ以上の利用可能 な制限エンドヌクレアーゼクローニング部位を利用し、ＥＰ₂をコードする二重 鎖ＤＮＡを適正な配向でバクテリオファージプロモーター含有ベクターにクロー ニングする。ＥＰ₂ ＤＮＡを結合したベクターを使用して細菌を形質転換させ、 クローナル単離物について適正配向のＥＰ₂ ＤＮＡを含むベクターの存在を分析 する。 ＥＰ₂をコードするＤＮＡを適正配向で含むベクターを同定し単離した後、Ｅ Ｐ₂転写ユニットよりも下流の部位の制限エンドヌクレアーゼによってそれを破 壊することなくこのベクターを開裂して直鎖化する。直鎖化したプラスミドを単 離及び精製し、ＥＰ₂ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒ ｏ転写用鋳型として使用する。 次に、鋳型ＤＮＡを、ＤＮＡ鋳型を転写してＥＰ₂ ｍＲＮＡを形成させる反応 混合物中のバクテリオファージ特異的ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと混合す る。バクテリオファージ特異的ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとしては数種類 が入手可能であり、その非限定例としては、Ｔ３、Ｔ７及びＳＰ６ ＲＮＡポリ メラーゼがある。次に、合成ＥＰ₂ ｍＲＮＡを単離し精製する。 ｍＲＮＡの安定性を改良するためには、５'末端キャップ構造と３'ポリＡテー ルとを含有するｍＲＮＡを合成するのが有利であろう。キャップ構造、すなわち ７−メチルグアノシンは、ＤＮＡ鋳型を含む反応混合物に７−メチルグアノシン を添加するだけでｍＲＮＡの５'末端に組込むことができる。ＤＮＡ依存性ＲＮ ＡポリメラーゼはｍＲＮＡを合成するときに５'末端にキャップ構造を取込む。 ポリＡテールは多くのｃＤＮＡ中で天然に発生することが知られているが、ＤＮ Ａ鋳型の３'端にポリＡテールをコードするＤＮＡ配列を挿入するだけでｍＲＮ Ａの３'末端に付加できる。 単離し精製したＥＰ₂ ｍＲＮＡを無細胞系または細胞ベ ース系を用いて翻訳する。無細胞系の非限定例としては、ウサギ網状赤血球溶解 物及び小麦胚芽エキス(双方ともＰｒｏｍｅｇａ及びＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎ ｕｃｌｅａｒから市販されている)があり、細胞ベース系の非限定例としては、 アフリカツメガエル卵母細胞へのマイクロインジェクションがある。アフリカツ メガエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが好ましい。 アフリカツメガエル卵母細胞に十分な量の合成ＥＰ₂ ｍＲＮＡを微量注入して ＥＰ₂タンパク質を産生させる。微量注入した卵母細胞をインキュベートしてＥ Ｐ₂ ｍＲＮＡを翻訳させ、ＥＰ₂タンパク質を形成する。 これらの合成ｍＲＮＡを標準手順〔Ｇｕｒｄｏｎ,Ｊ.Ｂ.ａｎｄ Ｗｉｃｋｅｎ ｓ,Ｍ.Ｄ.Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ.１０１：３７０−３８６,(１９ ８３)〕によってアフリカツメガエル卵母細胞(５〜６期)に注入する。卵母細胞 を回収し、以下のようにしてＥＰ₂発現の有無を分析する。実施例５ アフリカツメガエル卵母細胞中のｐｃＤＮＡＩａｍｐ−ＥＰ₂発現 標準外科手順(Ｃｏｌｍａｎ,Ａ.,１９８４：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａ ｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ,ＩＲ Ｌ Ｐｒｅｓｓ)を用いて雌アフリカツメガエル成体から卵母細胞を採取した。卵 胞細胞を除去するために、Ｃａ²⁺非含有のＮＤ９６溶液(９６ｍＭのＮａＣｌ、 ２ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２.５ｍＭのピルビ ン酸ナトリウム、０.５ｍＭのテオフィリン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン ＋１.８ｍＭのＣａＣｌ₂を含むｐＨ７.６のＮＤ９６)中で、新しく調製したコラ ゲナーゼ(２ｍｇ／ｍｌ、２型、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｌ Ｃｏｒｐ.,Ｆｒｅｅｈｏｌｄ,ＮＪ)によって卵母細胞を２〜３時間処理した 。卵胞を除去した５〜６期の卵母細胞を選択し、ＮＤ９６溶液に維持した。卵母 細胞の核に１.６ｎｇのｐｃＤＮＡＩａｍｐ−ＥＰ₂と２.５ｎｇのｐｃＤＮＡＩ ａｍｐ−ＣＦＴＲとを注入し、次いでアゴニストで攻撃する前に１８℃で４８時 間インキュベートした。ＣＦＴＲ(嚢胞性線維症トランスメンブラン調節物質、 ｃＡＭＰ依存性Ｃｌ^-チャンネル)はこれらの卵母細胞中のＥＰ₂レセプターと同 時発現し、細胞内ｃＡＭＰのレベル 変化の指標となる。機能性活性をＰＧＥ₂−誘導ＣＦＴＲ媒介Ｃｌ^-電流の測定値 から決定した。卵母細胞を０.５ｍｌの潅流室に入れ、Ｔｕｒｂｏ ＴＥＣ ０１ Ｃ増幅器(ＮＰＩ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ,Ｇｅｒｍａｎｙ)を使用し、−６０ｍ Ｖの固定電圧をかけた(３ＭのＫＣｌを充填した０.５〜２.０ＭＷ抵抗のマイク ロ電極を用いる)。リガンド含有溶液を潅流させ、電流応答を記録した。 １ｎＭのＰＧＥ₂アゴニストの潅流は、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ−ＥＰ₂とｐｃＤＮ ＡＩａｍｐ−ＣＦＴＲとを注入した卵母細胞中で顕著な電流応答を生じ、これは 、このクローンがｃＡＭＰシグナル発生経路に結合する機能性ＥＰ₂レセプター をコードしていることを証明する(図３)。１μＭのＰＧＦ_2αに対する応答は、 ＥＰ₂レセプターサブタイプについて予想されたようにはるかに微弱であった。 対照卵母細胞(ＣＦＴＲ単独注入またはＣＦＴＲとアンチセンスＥＰ₂ ｃＤＮＡ との併用注入)ではこのような応答は観察されなかった(図４)。この力価の順位 は、ＥＰ₂レセプターに関して報告されている順位と一致している〔Ｃｏｌｅｍ ａｎら,１９９１〕。実施例６ 哺乳類発現ベクター中のＥＰ₂ ｃＤＮＡのクローニング 強力な汎用哺乳類プロモーター類を含む以下のベクター：ｐＢＣ１２ＢＩ〔Ｃ ｕｌｌｅｎ,Ｂ.Ｒ.Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ.１５２：６８４−７０ ４ １９８８〕、ｐＥＥ１２(ＣｅｌｌＴｅｃｈ ＥＰ０ ３３８ ８４１)、並びに 、その誘導体ｐＳＺ９０１６−１及びｐ９０１９に、ＥＰ₂ ｃＤＮＡ発現カセッ トを適切な制限エンドヌクレアーゼ部位で結合させる。ｐ９０１９は、ｈＣＭＶ ＩＥプロモーター、ポリリンカー及びＳＶ４０ポリＡ因子を、ＳＶ４０初期プロ モーターによって駆動されるジヒドロ葉酸レダクターゼの突然変異遺伝子(ｍＤ ＨＦＲ)(Ｓｉｍｏｎｓｅｎ,Ｃ.Ｃ．＆ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ,Ａ.Ｄ.,Ｐｒｏｃ.Ｎａ ｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２４９５−２４９９〔１９８３〕)から成 る選択可能マーカー／増幅系と共に含む哺乳類発現ベクターの構築物である。Ｓ Ｖ４０ポリアデニル化配列は、ｐＤ５(Ｂｅｒｋｅｒ ＆ Ｓｈａｒｐ,Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄ Ｒｅｓ.１３：８４１−８５７〔１９８５〕)を鋳型として用いるプラ イマー１３９７８−１２０及び１３９７７８−１２１によって定められるＰＣＲ 反応によって生じる。得られた０.２５ＫｂのＰＣＲ産物をＣｌａＩ 及びＳｐｅＩによって消化し、同様に消化しておいたｐＥＥ１２の６.７Ｋｂの フラグメントに結合させる。得られたプラスミドをＢｇｌII及びＳｆｉＩによっ て消化してＳＶ４０初期プロモーターの３'部分とＧＳｃＤＮＡとをベクターか ら遊離させる。プラスミドｐＦＲ４００(Ｓｉｍｏｎｓｅｎら,前出)から単離し た０.７３ＫｂのＳｆｉＩ−ＸｈｏIIのフラグメントを上記の５.６Ｋｂのベクタ ーに結合させてＳＶ４０初期プロモーターを再構成し、ｍｄＨＦＲ遺伝子を挿入 する。このプラスミドをｐ９０１９と命名する。ｐＳＺ９０１６−１はｈｕＣＭ ＶＩＥプロモーターがＨＩＶ ＬＴＲで置換されている以外はｐ９０１９に等し い。このベクターは、ｐ９０１９をＸｂａＩ及びＭｌｕＩで消化してｈｕＣＭＶ ＩＥプロモーターを除去することによって構築される。ＨＩＶ−１ ＬＴＲ(Ｃｕ ｌｌｅｎ,Ｃｅｌｌ ４６：９７３〔１９８６〕)の一部を含むベクターｐＣＤ２ ３に見出される残基−１１７〜＋８０からのＨＩＶ ＬＴＲプロモーターを、オ リゴヌクレオチドプライマーを用いてプラスミドｐＣＤ２３からＰＣＲ増幅する 。用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、産生物の５'側の末端にＭｌｕ Ｉ及びＳｐｅＩ制限部位を付加する。 他方、３'側にはＨｉｎｄIII及びＸｂａＩ部位が付加されている。得られた０. ２ＫｂのＰＣＲ産生物を酵素ＭｌｕＩ及びＸｂａＩによって消化した後、フラグ メントをアガロースゲル精製し、４.３Ｋｂのプロモーター非含有ＤＮＡフラグ メントに結合させてベクターｐＳＺ９０１６−１を作製する。 ＥＰ₂ ｃＤＮＡをプロモーターに対して正の配向で含むカセットをプロモータ ーの３'の適切な制限部位に結合させ、制限部位マッピング及び／または配列決 定によって同定する。これらのｃＤＮＡ発現ベクターを、ＣＯＳ−７(ＡＴＣＣ ♯ＣＲＬ１６５１)、ＣＶ−１〔Ｓａｃｋｅｖｉｔｚら,Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８ ：１５７５(１９８７)〕、２９３Ｌ細胞(ＡＴＣＣ♯ＣＲＬ６３６２)を非限定例 とする種々の宿主細胞に、電気穿孔または化学的手順(カチオン性リポソーム、 ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム)を非限定例とする標準法によって導 入する。トランスフェクト細胞及び細胞培養抽出物を採取し、上記の方法でＥＰ₂ 発現を分析し得る。 哺乳類の一過性発現に使用されるすべてのベクターは、ＥＰ₂を発現する安定 な細胞系を樹立するために使用でき る。発現ベクターにクローニングされた非改変ＥＰ₂ ｃＤＮＡ構築物は、細胞内 ＥＰ₂タンパク質を産生するように宿主細胞をプログラムすると予期される。ト ランスフェクション宿主細胞の非限定例としては、ＣＶ−１〔Ｓａｃｋｅｖｉｔ ｚら,前出〕、ｔｋ−Ｌ〔Ｗｉｇｌｅｒら,Ｃｅｌｌ １１：２２３(１９７７)〕 、ＮＳ／Ｏ及びｄＨＦｒ−ＣＨＯ〔Ｋａｕｆｍａｎ ＆ Ｓｈａｒｐ,Ｊ.Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ.１５９：６０１,(１９８２)〕がある。 ＥＰ₂ ｃＤＮＡ含有ベクターと、Ｇ４１８、アミノグリコシドホスホトランス フェラーゼ、ｐＬＮＣＸ〔Ｍｉｌｌｅｒ,Ａ.Ｄ．＆ Ｒｏｓｍａｎ Ｇ.Ｊ.,Ｂｉ ｏｔｅｃｈ Ｎｅｗｓ ７：９８０−９９０(１９８９)〕、ヒグロマイシン、ヒグ ロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ、ｐＬＧ９０〔Ｇｒｉｔｚ,Ｌ．＆ Ｄ ａｖｉｅｓ,Ｊ.,ＧＥＮＥ ２５：１７９(１９８３)〕；ＡＰＲＴ、キサンチン− グアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼ、ｐＭＡＭ(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ)〔 Ｍｕｒｒａｙら,Ｇｅｎｅ ３１：２３３(１９８４)〕を非限定例とする薬剤選択 プラスミドとのコトランスフェクションによって、安定にトランスフェクトされ たクローンを選択し得る。ＥＰ₂のレベルを前述のアッセ イによって定量する。 できるだけ大量のＥＰ₂を合成する哺乳類細胞クローンを産生するために、Ｅ Ｐ₂ ｃＤＮＡ構築物を、増幅可能な薬剤耐性マーカーを含有するベクターに結合 させる。これらの構築物を細胞に導入した後、プラスミド含有クローンを適当な 作用剤で選択し、漸増用量の作用剤中で選択することによって高コピー数プラス ミドの超発現クローンを単離する。以下の系を使用する：ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞 にトランスフェクトされメトトレキセート中で選択された突然変異ＤＨＦＲ遺伝 子を含む９０１６または９０１９プラスミド〔Ｓｉｍｏｎｓｏｎら,前出〕；Ｎ Ｓ／Ｏ細胞にトランスフェクトされメチオニンスルホキシミン中で選択されたグ ルタミンシンテターゼ遺伝子を含むｐＥＥ１２プラスミド(Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ特許出願２０８９／１０４０４）；及びＡＰＲＴ及 びＴＫ欠失Ｌ細胞中でチミジンキナーゼ遺伝子〔Ｃｏｌｂｅｒｅ ＆ Ｇａｒｏｐ ｉｎ,Ｆ.,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.７６：３７５５(１９７９)〕を 含むｐＤＬＡＴ−３とコトランスフェクトされ、ＡＰＲＴ(０.０５ｍＭのアザセ リン、０.１ｍＭのアデニン、４μｇ／ｍｌのアデノシン)中で選 択され、ＨＡＴ(１００μＭのヒポキサンチン、０.４μＭのアミノプテリン、１ ６μＭのチミジン)中で選択された９０１６または他のＣＭＶプロモーターベク ター。実施例７ ＣＯＳ−Ｍ６細胞中のＥＰ₂レセプターの発現及び〔³Ｈ〕ＰＧＥ₂結合アッセイ 最近クローン化されたヒトプロスタグランジンＥ₂(ＥＰ₂)レセプターをｐｃＤ ＮＡＩａｍｐプラスミド(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)にサブクローニングし、ＤＥＡ Ｅ−デキストラン法を用いてＣＯＳ−Ｍ６細胞にトランスフェクトした。細胞を ７２時間培養し、次いで採取し、窒素キャビテーションによる細胞の溶解後に分 画遠心法(１,０００×ｇで１０分間、次いで１００,０００×ｇで３０分間)によ って膜を調製した。１.０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、０.３ｎＭの 〔³Ｈ〕ＰＧＥ₂及び１００,０００×ｇ膜画分からの１２〜１５μｇのタンパク 質を含む１０ｍＭのＭＥＳ／ＫＯＨ ｐＨ６.０中で、〔³Ｈ〕プロスタグランジ ンＥ₂(〔³Ｈ〕ＰＧＥ₂)結合アッセイを実施した。３０℃で４５分間のインキュ ベーション後、４℃で洗浄バッファ(０．０１％のウシ血清アルブミン含有の１ ０μＭのＭＥＳ ／ＫＯＨ(ｐＨ６.０))に予浸したＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｂフィルターを通す高 速濾過によって結合放射性リガンドと遊離放射性リガンドとを分離した。フィル ターを約１６ｍｌの洗浄バッファで洗浄し、フィルターに結合した残留〔³Ｈ〕 ＰＧＥ₂を液体シンチレーションカウンティングによって定量した。２μＭのＰ ＧＥ₂の存在下で測定した全結合と非特異的結合との差を特異的結合と定義した 。 クローン化したヒトＥＰ₂レセプターをＣＯＳ−Ｍ６細胞にトランスフェクト し、トランスフェクト細胞から調製した膜に〔³Ｈ〕ＰＧＥ₂結合アッセイを実施 した。競合アッセイでは、ＰＧＥ₂とＰＧＥ₁とが最も有効な競合リガンドであり 、ＩＣ₅₀の値が１ｎＭであった(図４)。プロスタグランジン及び近縁類似体の力 価の順位は、ＰＧＥ₂＝ＰＧＥ₁＞＞フェニル−トリノールＰＧＥ₂＞イロプロス ト＞ＰＧＦ_2α＞ＰＧＤ₂＝Ｕ４６６１９であった。Ｕ４６６１９及びイロプロス トはトロンボキサン及びプロスタサイクリンの安定な類似体であり、夫々ＴＰ及 びＩＰレセプターに同等の力価を示す。更に、ＥＰ₃アゴニストＭＢ２８７６７ のＥＰ₂に対する力価はＥＰ₃に対する力価の約１／３０であり、ＥＰ₁アンタゴ ニストＡＨ６８０９及びＳＣ１９ ２２０はＥＰ₂に対して実質的に不活性であり、ＥＰ₂アゴニストであるブタプロ ストは比較的不活性であり、ＩＣ₅₀は３０μＭであった。胃腸保護物質であるミ ソプロストールのＩＣ₅₀は６.０３μＭであった。ＥＰ₂レセプターに関する力価 のこの順位は従来の薬理試験で予測されていた。実施例８ 昆虫細胞中の発現用のバキュロウイルス発現ベクター中のＥＰ₂ ｃＤＮＡクロー ニング ＡｃＮＰＶウイルスのゲノムに由来のバキュロウイルスベクターが昆虫細胞の Ｓｆ９系(ＡＴＣＣ ＣＲＬ＃１７１１)中でｃＤＮＡの高レベル発現を与えるよ うに設計した。ＥＰ₂ ｃＤＮＡを発現する組換えバキュロウイルスを以下の標準 法で産生する(ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｍａｘｂａｃ Ｍａｎｕａｌ)。ＥＰ₂ ｃＤ ＮＡ構築物を、ｐＡＣ３６０及びｐＢｌｕｅＢａｃベクター(ＩｎＶｉｔｒｏｇ ｅｎ)のような種々のバキュロウイルス転移ベクター中の多面性プロモーターの 下流に結合させる。バキュロウイルス転移ベクターとのコトランスフェクション 後に相同組換えによって組換えバキュロウイルスを作製し、Ｓｆ９細胞中でＡｃ ＮＰＶゲノムＤＮＡを直鎖化する〔Ｋｉｔｔｓ,Ｐ.Ａ.,Ｎｕｃ.Ａｃｉｄ.Ｒｅｓ .１８：５６６７(１９９０)〕。感染細胞中に封入体が存在しないことによって 組換えｐＡＣ３６０ウイルスを確認し(Ｓｕｍｍｅｒｓ,Ｍ.Ｄ．＆ Ｓｍｉｔｈ, Ｇ.Ｅ.,Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｅｘｐ.Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌ ｅｔｉｎ Ｎｏ.１５５５)、組換えｐＢｌｕｅＢａｃウイルスをβ−ガラクトシ ダーゼ発現に基づいて同定する(Ｖｉａｌａｒｄら,１９９０,Ｊ.Ｖｉｒｏｌ.,６ ４ ,ｐｐ３７−５０)。ｓｆ９細胞のプラーク精製及びＥＰ₂組換えバキュロウイ ルス感染後に、ＥＰ₂発現を上述のアッセイによって測定する。 ＥＰ₂の全読み取り枠をコードするｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃIIのＢａｍＨ Ｉ部位に挿入する。多面性プロモーターに対して正の配向の構築物を配列解析に よって同定し、直鎖状ＡｃＮＰＶの野生型ＤＮＡの存在下にＳｆ９細胞のトラン スフェクトに使用する。 活性ＥＰ₂の標品は感染細胞の膜と結合して検出される。膜調製物は感染細胞 から標準手順で調製される。実施例９ 酵母発現ベクター中のＥＰ₂ ｃＤＮＡのクローニング 異種タンパク質の細胞内発現を指令するように設計された発現ベクターに最適 ＥＰ₂ ｃＤＮＡ構築物を挿入した後、酵母Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で組換え ＥＰ₂を産生させる。細胞内発現のためには、ＥｍＢＬｙｅｘ４などのベクター をＥＰ₂シストロンに結合させる〔Ｒｉｎａｓ Ｕ.ら,Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ ８：５４３−５４５(１９９０)；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ Ｂ.ら,Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅ ｍ.２６５：４１８９−４１９２(１９８９)〕。発現されたＥＰ₂のレベルを前述 のアッセイで決定する。実施例１０ 組換えＥＰ₂の精製 組換えによって産生したＥＰ₂を抗体アフィニティクロマトグラフィーによっ て精製し得る。 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによって予め活性化したゲル支持体で あるＡｆｆｉｇｅｌ−１０(Ｂｉｏｒａｄ)に、抗体とアガロースゲルビーズ支持 体との共有結合が形成されるように抗ＥＰ₂抗体を添加することによってＥＰ₂抗 体アフィニティカラムを作製する。次にスペーサーアームを介したアミド結合に よって抗体をゲルに結合させる。次に、１Ｍの塩酸エタノールアミン(ｐＨ８)に よっ て残りの活性化エステルの反応を停止させる。カラムを水、０.２３Ｍの塩酸グ リシン(ｐＨ２.６)によって順次洗浄して非結合抗体または不要タンパク質を完 全に除去する。次に、界面活性剤のような適当な膜可溶化剤を加えたリン酸塩緩 衝生理食塩水(ｐＨ７.３)中でカラムを平衡させ、可溶化ＥＰ₂を含有する細胞培 養上清または細胞抽出物をゆっくりとカラムに通す。次に、界面活性剤を加えた リン酸塩緩衝生理食塩水によって光学密度(Ａ₂₈₀)がバックグラウンドに下がる までカラムを洗浄し、界面活性剤を加えた０.２３Ｍの塩酸グリシン(ｐＨ２.６) でタンパク質を溶出させる。精製されたＥＰ₂タンパク質を次に、界面活性剤を 加えたリン酸塩緩衝生理食塩水に対して透析する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/566 15/09 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/566 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ａ６１Ｋ 39/395 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 アダム，モハメツド カナダ国、ケベツク・アシユ・９・ジエ・ ２・イクス・２、カークランド、リバーウ ツド・グルーブ・18 (72)発明者 バステイーン，リソン カナダ国、ケベツク・ジエ・０・ペー・ １・ベ・０、セイント・ラザレ、ラデイソ ン・ストリート・931 (72)発明者 グレゴリツク，リチヤード カナダ国、ケベツク・アシユ・９・アー・ ２・ペー・８、ドラール・デ・オルモー、 ブレントウツド・27 (72)発明者 ミーターズ，キヤサリン カナダ国、ケベツク・アシユ・２・イク ス・１・ドウブルベー・４、モントリオー ル、ミルトン・570、アパートメント・18 (72)発明者 ラツシユモア，トーマス・エイチ アメリカ合衆国、ペンシルベニア・19440、 ハツトフイールド、デイーア・ラン・ロー ド・1400 (72)発明者 ソウヤー，ニコル カナダ国、ケベツク・ジエ・７・ベ・８・ ウー・９、ピンコート、レイシン・ストリ ート・65

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．プロスタグランジンに特異的に結合することを特徴とする単離及び精製され たプロスタグランジンＥＰ₂レセプター。 ２．アミノ酸配列 (配列番号２) によって特徴づけられた請求項１に記載の単離及び精製されたプロスタグランジ ンレセプタータンパク質。 ３．請求項２に記載のアミノ酸配列によって特徴づけられたプロスタグランジン レセプタータンパク質をコードしている単離及び精製されたＤＮＡ分子。 ４．プロスタグランジンレセプタータンパク質をコードしている単離及び精製さ れたＤＮＡ分子であって、前記ＤＮ Ａ分子がヌクレオチド配列 (配列番号１) によって特徴づけられたＤＮＡ分子。 ５．組換え宿主細胞中でプロスタグランジンレセプタータンパク質を発現させる ための請求項４のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。 ６．組換えプロスタグランジンレセプタータンパク質を発現させるための請求項 ５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。 ７．組換え宿主細胞中でプロスタグランジンレセプタータンパク質を発現させる 方法であって、 (ａ)請求項５に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞に移入し、 (ｂ)プロスタグランジンレセプタータンパク質が発現ベクターから発現し得る条 件下に段階(ａ)の宿主細胞を培養する方法。 ８．プロスタグランジンレセプター活性のモジュレーターを選定する方法であっ て、 (ａ)プロスタグランジンレセプター活性のモジュレーターを、請求項２に記載の アミノ酸配列の全部または一部によって特徴づけられるプロスタグランジンレセ プターと組み合 わせ、 (ｂ)プロスタグランジンレセプターに対するモジュレーターの効果を測定する方 法。 ９．請求項１に記載のアミノ酸配列によって特徴づけられるプロスタグランジン レセプタータンパク質に特異的に結合する抗体。