PL179952B1 - Collagen containing preparation for controllable release of active substances and method of obtaining same - Google Patents

Abstract

1. Preparat kolagenowy do kontrolowanego uwalniania substancji czynnych, znamien- ny tym, ze zawiera mieszanine nierozpuszczalnych w kwasie frakcji kolagenu, skladajaca sie z wysoko molekularnej frakcji kolagenu, o ciezarze czasteczkowym rzedu 106 da, sta- bilizujacej strukture preparatu, oraz z nisko molekularnej frakcji kolagenu, o ciezarze czasteczkowym rzedu 105 da, kontrolujacej predkosc uwalniania. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest preparat kolagenowy do kontrolowanego uwalniania substancji czynnych.

W procesie wytwarzania preparatów farmaceutycznych lub kosmetycznych, zawierających substancje czynne, stosuje się szereg polimerów, które powinny nadawać określonym postaciom preparatów żądane właściwości, w zależności od miejsca ich podawania. Środki opatrunkowe i materiały wszczepialne powinny być dopasowane do powierzchni ciała, na którą są nakładane, oraz nie powinny przeszkadzać komórkom ciała (przykładowo, takim jak keratynocyty, fibroblasty lub komórki śródbłonkowe) w ich działaniu i aktywności. Wybór możliwych do stosowania polimerów ogranicza się zatem do tych polimerów, które wykazują doskonałą tolerancję w kontakcie z tkanką łączną i korzystnie ulegają rozkładowi biologicznemu.

Wśród polimerów spełniających powyższe wymagania, najkorzystniejszy jest kolagen, główna proteina tkanki łącznej, ze względu na biologicznątolerancję i zdolność rozkładu wytwarzanych z niego preparatów. W przeważającej części takie preparaty kolagenowe stosowane są bez dalszych dodatków do nakładania na zranienia. Nie brak jednak prób wprowadzenia substancji biologicznie aktywnych w kolagenowe osnowy różnych postaci i oddziaływanie na uwalnianie takich substancji, które z reguły następuje przez rozpuszczenie i/lub enzymatyczne rozkładanie kolagenowej osnowy nośnej, poprzez rodzaj, strukturę i skład osnowy.

Wytwarzanie osnowy kolagenowej, przykładowo ujawnione w opisach patentowych US 5 024 841, US 4 789 663, US 4 774 091, US 4 563 350, US 5 246 457 lub w opisie EP 429 438, polega na stosowaniu roztworów rozpuszczalnego w kwasie kolagenu pozbawionego telopeptydu. Z tego kolagenu uzyskuje się rekonstytuowane włókienka za pomocą dializy, przesunięć wartości współczynnika pH lub za pomocą innych sposobów. Następnie włókienka przerabia się korzystnie w porowatą osnowę różnymi sposobami. Uzyskane preparaty wprawdzie mogą mieć doskonałą tolerancję biologiczną (ponieważ złożone są one z czystego kolagenu), jednakże z uwagi na zastosowanie w nich rozpuszczalnego kolagenu maj ątę wadę, że opóźnienie uwalniania substancji czynnej jest możliwe tylko w ograniczonym zakresie.

Opóźnienie uwalniania substancji czynnej z powyższych preparaaów można osiągnąć przez zmniejszenie rozpuszczalności osnowy kolagenowej na skutek zastosowania środków

179 952 sieciujących lub wiążących, przykładowo ujawnionych w opisach US 4 409 332, DE 2 843 963, WO 93/00890 lub WO 85/04413, przez zastosowanie środków lakujących, przykładowo ujawnionych w DE 3 841 397, lub przez połączenie rozpuszczalnego w wodzie kolagenu z innymi polimerami, korzystnie z naturalnymi polimerami anionowymi lub ich pochodnymi. Ze względu na obecność w powyższych wyrobach dodatkowych składników należy brać pod uwagę dodatkowe ryzyko związane z ich toksycznością, którego nie można nie doceniać zwłaszcza przy stosowaniu znanych środków sieciujących kolagen.

Dalsza możliwość opóźniania uwalniania substancji czynnych opisana jest w EP 518,697. Z kolagenu rozpuszczalnego w wodzie i/lub nierozpuszczalnego w wodzie wytwarza się przy tym laminaty, które złożone sąz jednej lub kilku warstw zbiornikowych zawierających substancję czynną oraz z warstwy opóźniającej oddawanie substancji czynnej. Laminaty takie mogą w porównaniu z poprzednio wymienionymi preparatami pozwalać na opóźnienie uwalniania przy zmniejszeniu do minimum ryzyka toksyczności, jednakże mają tę wagę, że są bardzo kosztowne w produkcji, a ponadto przyleganie warstw do siebie można osiągnąć tylko w przypadku wilgotnych folii. Suche folie, jakie stosuje się bezwarunkowo w przypadku substancji czynnych skłonnych do rozkładu, nie mogą być przykładowo spajane z takimi laminatami.

Opóźnienie uwalniania substancji czynnych nie jest jednak pożądane w każdym przypadku. EP 224,453 opisuje osnowę kolagenową, która w przeważającej części złożona jest z nierozpuszczalnego w wodzie, usieciowanego kolagenu, a dodatkowo zawiera rozpuszczalny w wodzie kolagen nieusieciowany. W preparatach kosmetycznych, np. w maskach na twarz ten rozpuszczalny kolagen działajako substancja czynna, która po nałożeniujest wyzwalana przez naturalna wilgoć skóry lub przez silne zwilżenie preparatu i wywiera działanie na skórę. Do celów farmaceutycznych można do preparatu wprowadzić substancje czynne, które po nałożeniu są bardzo szybko wyzwalane i uwalniane z osnowy kolagenowej wraz z rozpuszczalnym kolagenem. Tego rodzaju preparat kolagenowy może być użyteczny wtedy, gdy szybkie uwalnianie jest pożądane i celowe.

Mechanizmy opóźniania lub przyspieszania uwalniania substancji czynnej z preparatów·' kolagenowych zostały opisane na wiele różnych sposobów. Jednakże każdy z tych preparatów·' kolagenowych według stanu techniki ze względu na stały określony skład stwarza tylko jedną możliwość oddziaływania na uwalnianie, a zatem określony profil uwalniania, który zawsze jest dopasowany do specyficznego rozwiązania problemu, np. do określonej substancji czynnej lub określonej grupy substancji czynnych, określonej zasady terapeutycznej lub określonego schorzenia. Z żadnym z preparatów kolagenowych według stanu techniki nie można osiągnąć celowego, a przy tym uniwersalnego sterowania uwalniania substancji czynnych, to znaczy zmiennego i indywidualnego dopasowania kinetyki uwalniania substancji czynnych do różnych postawionych problemów, z możliwością odpowiedniego uwzględniania czynników takich jak różne właściwości substancji czynnych oraz różnice w rozpoczęciu oddziaływania i w czasie trwania oddziaływania.

Celem wynalazku było zatem opracowanie preparatu kolagenowego, nadającego się nie tylko do określonej substancji czynnej, określonej kombinacji substancji czynnych lub określonego profilu uwalniania, lecz przede wszystkim nadającego się do kontrolowanego podawania różnorodnych substancji czynnych z różnorodnych postaci podawania.

Preparat kolagenowy do kontrolowanego uwalniania substancji czynnych według wynalazku, charakteryzuje się tym, że zawiera mieszaninę nierozpuszczalnych w kwasie frakcji kolagenu, składającą się z wysokomolekularnej frakcji kolagenu, o ciężarze cząsteczkowym rzędu 10⁶ da, stabilizującej strukturę preparatu, oraz zniskomolekularnej frakcji kolagenu, o ciężarze cząsteczkowym rzędu 10⁵ da, kontrolującej prędkość uwalniania.

Ponadto, preparat zawiera korzystnie substancje pomocnicze, takie jak środki regulacji lepkości, spoiwa, środki zatrzymujące wilgoć, zmiękczacze, środki przyspieszające penetrację, środki konserwujące, środki dezynfekcyjne, regulatory wartości współczynnika pH, przeciwutleniacze, stabilizatory substancji czynnej, oleje, tłuszcze, woski, stabilizatory emulsji, substancje zapachowe, barwniki i/lub obojętne wypełniacze.

179 952

Korzystnie, kalogen zawarty w preparacie według wynalazku jest pozbawionym telopeptydów, rodzimym, nieusieciowanym kolagenem typu 1, a zwłaszcza, jest produktem alkalicznego roztwarzania skóry cielęcej.

Preparat kolagenowy według wynalazku, który korzystnie jest bioadhezyjny, występuje zwłaszcza w postaci proszków, pudrów, mikrocząsteczek, włókien, kłaczków, pianek, gąbek, igieł, pręcików, tabletek, żelów, kremów, jednowarstwowych folii lub laminatów.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że preparat według wynalazku nadaje się do kontrolowanego uwalniania różnych substancji czynnych, przy czym dla uzyskania żądanej kinetyki uwalniania preparat może zawierać kombinacje różnych postaci leków.

Sposób wytwarzania preparatu kolagenowego może obejmować suszenie w stanie rozpylonym, suszenie przez wymrażanie, powlekanie lub odlewanie z przeprowadzanym następnie suszeniem, metody polegające na rozdzieleniu faz i metody koacerwacyjne, zagęszczanie lub napełnianie pojemników.

Zdolność preparatu do kontrolowanego uwalniania substancji czynnych zależy od wzajemnego stosunku nierozpuszczalnych w kwasie kolagenów o różnym rozkładzie ciężarów cząsteczkowych.Uwalaiaaie substancji czynnych może być również kontrolowane poprzez rozpuszczanie, pęcznienie lub erozję preparatu kolagenowego. Ponadto, kontrolowane uwalnianie substancji czynnej jest również możliwe w wyniku biologicznego rozkładu preparatu kolagenowego.

Preparat kolagenowy według wynalazku nadaje się do kontrolowanego uwalniania substancji czynnej do ran, jak również do nienaruszonej skóry. Ponadto, preparat kolagenowy może służyć do wszczepiania lub inicjowania substancji czynnej w żywym organizmie.

Znane preparaty kolagenowe do oddawania substancji czynnych wykonane są zasadniczo z kolagenu rozpuszczalnego w kwasach, to znaczy kolagenu, który łatwo rozpuszcza się w rozcieńczonych kwasach przy pH 2. Taki kolagen rozpuszczalny w kwasach można różnymi sposobami izolować z szeregu tkanek pochodzenia zwierzęcego i roślinnego.

W odróżnieniu od powyższych kolagenów rozpuszczalnych w kwasach, nierozpuszczalny w kwasach kolagen (stosowany w preparacie według wynalazku), kiedy występuje w dyspersji wodnej nie daje się przeprowadzić do roztworu nawet przez dodanie stężonego kwasu octowego. Kolagen ten jest korzystnie kolagenem rodzimym, który w przeważającej części występuje jako kolagen typu I, a w mniejszej części jako kolagen typu III. Nazwa kolagen rodzimy odnosi się do cząsteczki kolagenu, która ma niezmienną trój spiralną strukturę poczwórną.

Nierozpuszczalny kolagen może być otrzymywany sposobem ujawnionym w DE-OS 3 034 273, US 4 021 522 lub DE-OS 2 716 602, przez alkaliczne pozyskiwanie z materiału biologicznego różnego pochodzenia. Korzystnie, jako materiał wyjściowy jest stosowana skóra sześciomiesięcznych cieląt. W przeciwieństwie do zwykle stosowanych tkanek i części ciała bydła, świń lub koni, stosowanie skóry cieląt zapewnia, że materiał wyjściowy jest o określonej, niezmiennej jakości, co z kolei zapewnia aiezawodaąpowtarzalność opisanych poniżej etapów procesu, przedstawionego szczegółowo w przykładzie 1. Ze skóry cielęcej najpierw mechanicznie usuwa się sierść i tłuszcz. Następnie ekstrahowane są i odrzucane rozpuszczalne kolageny i niekolagenowe rozpuszczalne składniki tkanki łącznej. W następnym etapie tkankę łączną traktuje się najpierw wodnym roztworem alkalicznego wodorotlenku, korzystnie wodorotlenku sodowego, i siarczanu alkalicznego, korzystnie siarczanu sodowego, a następnie wodnym roztworem siarczanu alkalicznego w celu zmydlenia i odłączenia tłuszczu skóry oraz aby uzyskać sterowane spęcznienie włókien kolagenu. Oddzielane są przy tym również końcowe niespiralne części cząsteczek kolagenu, tzw. telopeptydy, które są przeważnie odpowiedzialne za antygenowe właściwości obcopochodnego kolagenu. Ponadto przez traktowanie roztworem wodorotlenku alkalicznego i siarczanu alkalicznego lub czystym roztworem siarczanu alkalicznego w zależności od stężenia i czasu oddziaływania roztworu następuje rozdzielenie określonej części międzycząsteczkowych wiązań kolagenu w zespole włóknistym spęczonej tkanki łącznej. Te wiązania międzycząsteczkowe kolagenu nie są atakowane, tak że spiralna struktura cząsteczki pozostaje zachowana. Tak przetworzona tkanka łączna jest w kilku etapach przepłukiwana wodą i roz179 952 cieńczonymi kwasami, oczyszczana i neutralizowana, a następnie rozdrabniana mechanicznie i dyspergowana w wodzie.

Decydującym etapem dla wyizolowania stosowanego według wynalazku kolagenu nierozpuszczalnego w kwasach, o różnych rozkładach ciężaru cząsteczkowego, jest celowe alkaliczne rozszczepianie międzycząsteczkowych wiązań kolagenu. Jeżeli przykładowo umożliwi się oddziaływanie wodnego roztworu 9,75% wodorotlenku sodowego i 9,2% siarczanu sodowego przez 48 h na spęczonątkankę łączną, wówczas po zdyspergowaniu w wodzie nierozpuszczalny kolagen przy analizie HPLC (system kolumn Biosil TSK-400 + Biosil TSK-125; Eluent 0,5 m bufor z octanu amonowego pH 6,7; detektor ultrafioletu 275 nm, zakres czułości 0,02 AUFS) przy ocenie na podstawie chromatogramu protein wzorcowych ma średni ciężar cząsteczkowy około 420 000. Jeżeli natomiast spęczoną tkankę łączną traktuje się przez 12 h wodnym roztworem zawierającym tylko 5% wodorotlenku sodowego i 9,2% siarczanu sodowego, wówczas rozszczepionych będzie wyraźnie mniej wiązań międzycząsteczkowych, a nierozpuszczalne skupienia cząsteczek otrzymane po zdyspergowaniu w wodzie wykazuj ąprzy analizie średni ciężar cząsteczkowy około 2 500 000. Różnice te mają wpływ na parametry płynięcia, a zatem na obrabialność zawiesin nierozpuszczalnego kolagenu. Podczas gdy zawiesina zawierająca 5% niskocząsteczkowego, nierozpuszczalnego kolagenujest wprawdzie lepką, ale jeszcze swobodnie płynącąmasą, granica płynięcia zawiesiny wysokocząsteczkowego, nierozpuszczalnego kolagenu wynosi około 2,5%.

Zmiennymi czynnikami sposobu roztwarzania, poprzez zmienianie których można osiągnąć różne rozkłady ciężaru cząsteczkowego, są zatem stężenie i czas oddziaływania wodorotlenku sodowego. Im większe jest stężenie wodorotlenku sodowego i/lub im dłuższy jest czas oddziaływania wodorotlenku sodowego, tym mniejszy jest średni ciężar cząsteczkowy wyizolowanego, nierozpuszczalnego w kwasach kolagenu, i odwrotnie. Aby można było przedstawić zależność pomiędzy uzyskiwanym ciężarem cząsteczkowym a wymienionymi warunkami roztwarzania, np. w postaci krzywej, jeden z czynników oddziaływania, a więc stężenie lub czas oddziaływania, musi być stały, natomiast drugi zmienia się. Jest to wprawdzie zasadniczo możliwe, ale z punktu widzenia produkcji w pr^^myśle mało celowe, ponieważ przykładowo sama swobodna zmiana czasu oddziaływania z reguły nie jest możliwa. Przez bardzo długie czasy oddziaływania przy odpowiednio niskim stężeniu wodorotlenku sodowego przykładowo ulegają przedłużeniu czasy pracy maszyn i czas pracy personelu, co z punktu widzenia kosztów produkcji nie jest możliwe do zaakceptowania. Z drugiej strony bardzo krótkie czasy oddziaływania, uwarunkowane potrzebnym wtedy większym stężeniem wodorotlenku sodowego, prowadzą do zwiększonego zużycia urządzeń produkcyjnych, np. systemów przewodów i filtrów, co również jest nie do przyjęcia ze względu na związane z tym zwiększenie kosztów produkcji. Konieczny czas oddziaływania wodorotlenku sodowego i stężenie wodorotlenku sodowego trzeba zatem dla każdego zadania indywidualnie określić doświadczalnie tak, aby zarówno z punktu widzenia wymagań dotyczących postaci leku, a zwłaszcza kinetyki uwalniania substancji czynnej jak i z punktu widzenia opłacalności osiągnąć optimum.

Różnice w rozkładzie masy cząsteczkowej nierozpuszczalnego kolagenu mają znaczny wpływ na właściwości preparatów kolagenowych wytworzonych z niego przez wyschnięcie. W przykładzie 2 przedstawiono, że wytworzona przez suszenie sublimacyjne pianki z nierozpuszczalnego kolagenu o różnych rozkładach mas cząsteczkowych wykazują w zależności od stosunku mieszania bardzo różne właściwości rozpadu. Podczas gdy pianki ze 100 procentowego niskocząsteczkowego, nierozpuszczalnego kolagenu w sztucznej wydzielinie rany o współczynniku pH 6,4 rozpadają się całkowicie już po 45 minutach, w takich samych warunkach pianki ze 100 procentowego wysokocząsteczkowego, nierozpuszczalnego kolagenu nie rozpadają się jeszcze nawet po 10 dniach.

Przykład ten wykazuje, że stosowanie wysokomolekularnych agregatów kolagenowych ma wyraźnie stabilizujący wpływ na piankę, co wyraża się w znacznie przedłużonym przyjmowaniu wydzieliny i pęcznieniu oraz w bardzo silnie opóźnionym rozpadzie. Stabilizacja kształtu dzięki wysokiemu naturalnemu stopniowi usieciowania kolagenu ma przede wszystkim z toksy6

179 952 kologicznego punktu widzenia tę decydującą zaletę, że nie sąjuż potrzebne dodatkowe manipulacje mające na celu wzmocnienie struktury, takie jak np. garbowanie i sieciowanie. Produkt doznaje swej stabilizacji kształtu tylko przez to, że zostaje w znacznym stopniu zachowana pierwotna czwartorzędowa struktura kolagenu, taka jak istnieje w skórze.

Pianki kolagenowe, które są wytwarzane zawsze tylko z jednego podstawowego typu nierozpuszczalnego kolagenu, wykazują więc wyraźne różnice, np. jeśli chodzi o interakcję z wydzieliną rany. Jednakże tego rodzaju monopreparaty, jak juz objaśniono, tylko w specjalnych oddzielnych przypadkach mogą być dostosowane do profilu wymagań na produkt kolagenowy, wynikających z określonego przeznaczenia. Natomiast przedmiotowy wynalazek stwarza podwójnym sposobem możliwość dopasowania właściwości preparatu kolagenowego zawsze dokładnie do określonego profilu wymagań stawianych produktowi. Po pierwsze, rozkład masy cząsteczkowej nierozpuszczalnego kolagenu można bezstopniowo zmieniać w bardzo szerokich ramach przez celowe sterowanie rozrywania wiązań międzycząsteczkowych. Po drugie, przez mieszanie tych odmian nierozpuszczalnego kolagenu o w każdym przypadku odmiennych rozkładach masy cząsteczkowej można ustawiać potrzebne właściwości produktu. Jest to wyraźne np. przy kontynuacji wymienionego już przykładu 2 na podstawie rozpadu suszonych przez sublimację pianek, kiedy to przed wysuszeniem nierozpuszczalny kolagen o średniej masie cząsteczkowej około 420.000 i nierozpuszczalny kolagen o średniej masie cząsteczkowej około 2.500.000 miesza się w różnych stosunkach. Czasy rozpadu zawsze stopniowo maleją dla różnych wartości współczynnika pH przy stopniowym zwiększaniu procentowego udziału nierozpuszczalnego kolagenu o mniejszej średniej masie cząsteczkowej.

Dokładne ustawianie właściwości produktu zgodnie z profilem wymagań optymalnym pod względem terapii ma znaczenie przede wszystkim w terapii farmaceutycznymi substancjami czynnymi.

Ponieważ kolagenowy preparat według wynalazku znajduje zastosowanie korzystnie na skórze, na zewnętrznych i wewnętrznych zranieniach oraz w wewnętrznych tkankach i jamach ciała przez implantację lub iniekcję, substancje czynne, które może zawierać preparat kolagenowy, są korzystnie substancjami czynnymi do podawania na skórę lub poprzez skórę, substancjami czynnymi do leczenia zranień i kontynuacji procesu leczenia zranień oraz substancjami czynnymi, które są zwykle podawane za pomocą preparatów do implantacji lub iniekcji.

Do dermatologicznego leczenia lokalnych schorzeń skórnych stosuje się lokalne anastetyki, lokalne antybiotyki, środki antyseptyczne, przeciwgrzybiczne, antyhistaminowe oraz leki zmniejszające swędzenie, środki keratolityczne i leki wypalające, wirusostatyki, środki przeciwko świerzbowi, steroidy oraz różne substancje do leczenia trądzika, łuszczycy lub fotodermatozy. Do substancji czynnych podawanych doskórnie należą np. steroidalne i niesteroidalne środki przeciwreumatyczne, substancje powodujące przekrwienie lub wazoprotektory i środki powodujące zwężenie naczyń stosowane w leczeniu schorzeń naczyniowych. Do substancji czynnych podawanych przezskórnie należąprzykładowo środki neuroleptyczne, przeciwdepresyjne, uspokajające, hipnotyczne, psychostymulujące, analgetyki, środki powodujące odprężenie mięśni, środki przeciwko chorobie Parkinsona, blokery splotów nerwowych, sympatomimetyki, alfasympatolityki, betasympatoliki, antysympatotoniki, antydiabetyki, leki stosowane w chorobie wieńcowej, antyhipertoniki, antyastmatyki lub diuretyki. Preparat kolagenowy według wynalazku może znaleźć zastosowanie również na skórze w preparatach kosmetycznych, np. w postaci piankowych masek lub cienkich warstewek do leczenia np. starzejącej się skóry, zmarszczek lub nieczystej skóry, do pielęgnacji ciała, do usuwania owłosienia, do zmniejszania wydzielania potu lub ochrony przed światłem.

Substancje czynne, które są stosowane w preparatach kolagenowych według wynalazku na zewnętrznych i wewnętrznych zranieniach, są to korzystnie substancje powstrzymujące krwawienie, wśród których szczególną rolę odgrywa sam kolagen, substancje oczyszczające rany, takie jak np. enzymy, środki antyseptyczne, środki dezynfekcyjne i antybiotyki, oraz substancje wspomagające leczenie rany, które pobudzają granulację, wzbudzają powstawanie nowych naczyń lub wspomagaj ątworzenie się nabłonka. Spośród substancji czynnych wspomagających le179 952 czenie rany coraz większe znaczenie zyskują biologicznie aktywne peptydy i proteiny, które rozwijąjąwysokąaktywnośćjużprzy bardzo małych stężeniach i w większości wytwarzane sąza pomocą technologii rekombinacyjnych. Do tych substancji, dla których preparat kolagenowy według wynalazku stanowi szczególnie odpowiedni układ przenoszenia i podawania, należątzw. czynniki wzrostu, jak czynnik wzrostu na podstawie płytek (Platelet derived growth factor, w skrócie PDGF), czynnik wzrostu naskórka (Epidermal growth factor, w skrócie EGF), czynnik wzrostu komórek śródbłonka na podstawie płytek (Platelet derived endothelial cell growth factor, w skrócie PD-ECGF), czynnik wzrostu kwasotwórczego fibroblastu (acidic Fibroblast growth factor, w skrócie aFGF), czynnik wzrostu zasadotwórczego fibroblastu (basic Fibroblast growth factor, w skrócie bFGF), czynnik wzrostu przekształcania a (Transforming growth factor a, w skrócie THF a), czynnik wzrostu przekształcania b (Transforming growth factor b, w skrócie THF b), czynnik wzrostu keratynocytu (Keratinocyte growth factor, w skrócie KGF), czynnik wzrostu insulinopodobny 1 (Insulin-like growth factors 1, w skrócie IGF1), czynnik wzrostu insulinopodobny 2 (Insulin-like growth factors 2, w skrócie IGF2), oraz czynnik martwicy nowotworu (Tumor necrosis factor, w skrócie TNF).

Do substancji czynnych, które są podawane pozajelitowo za pomocą preparatu kolagenowego według wynalazku, należą przykładowo antybiotyki, antyseptyki, anastetyki, analgetyki o różnej mocy, cytostatyki, hormony, steroidy, środki komórkobójcze, przykładowo, takie jak interleukina, interferon i czynniki stymulujące kolonie, czynniki wyzwalające hormony i hamujące wyzwalanie hormonów, prostaglandyna, enzymy oraz czynniki wzrostu, zwłaszcza osteoindukcyjne działające czynniki wzrostu kości.

Przy stosowaniu preparatów zawierających substancje czynne ważnym zagadnieniem jest opracowanie odpowiednich formulacji (postaci), z których substancja czynna jest uwalniana w sposób pozwalający na optymalne działanie preparatów zawierających substancje czynne, umożliwiających również leczenie. Wiele substancji czynnych, zwłaszcza wymienione biologicznie aktywne peptydy i proteiny, ma wewnątrz ciała jedynie krótki czas półtrwania i dlatego środki te trzeba często wymagają wielokrotnego podawania w ciągu dnia.

W związku z powyższym, coraz większe znaczenie mają nośniki substancji czynnych, które uwalniają substancje czynne z opóźnieniem lub w sposób kontrolowany. Preparaty kolagenowe według przedmiotowego wynalazku umożliwiają, za pomocą stosunkowo niewielu podstawowych modułów formulacyjnych układów nośnikowych, które są bardzo elastyczne pod względem możliwości ich stosowania i wytwarzania, rozwiązanie problemu związanego z odpowiednim uwalnianiem substancji czynnych. Mechanizmy, które nadającharakterystykę kinetyce uwalniania substancji czynnej, mogą być kontrolowane przez domieszanie nierozpuszczalnego kolagenu o różnej masie cząsteczkowej i odpowiednie formowanie preparatu kolagenowego. Czynniki te wpływają na strukturę i gęstość polimerowego szkieletu kolagenowego, a ponadto mają wpływ na liczbę i rozmieszczenie hydrofitowych, hydrofobowych i jonowych miejsc wiązania wzdłuż szkieletu polimerowego. Ponieważ substancja czynna jest zamknięta nie tylko w pustych przestrzeniach preparatu kolagenowego według wynalazku, ale również może być adsorbowana na powierzchni szkieletu kolagenowego, siła wiązania pomiędzy kolagenem a substancją czynną, a więc również warunki uwalniania substancji czynnej są miarodajne określane przez zależności jonowe oraz przemienne oddziaływania hydrofitowe i hydrofobowe.

Przy podawaniu naskórnym, śródskórnym i przeskórnym substancji czynnej, za pomocą preparatu kolagenowego według wynalazku, na warunki uwalniania substancji czynnej mają wpływ (oprócz struktury, gęstości i aktywności wiązania preparatu kolagenowego) rozpuszczalność substancji czynnej w tym preparacie, stopień obciążenia i stopień nasycenia oraz prędkość dyfuzji substancji czynnej wewnątrz preparatu.

W przypadku preparatów kolagenowych służących do oddawania substancji czynnej na zewnętrznych lub wewnętrznych zranieniach oraz przy preparatach kolagenowych do implantacji lub iniekcji, na uwalnianie substancji czynnej mają wpływ jeszcze dalsze czynniki.

Do kontrolowanego uwalniania substancji czynnej z preparatów kolagenowych według wynalazku, w przypadku gdy te preparaty stykają się z płynem ustrojowym, może być wykorzy8

179 952 stana prędkość i zakres przyjmowania cieczy, a więc zdolność do pęcznienia i rozkładu preparatu kolagenowego. Obok rozpadu preparatu kolagenowego jako mechanizm sterujący uwalnianiem przy zetknięciu się z cieczą ustrojową wchodzi w grę przede wszystkim wyzwalanie substancji czynnej z preparatu kolagenowego przez ciecz ustrojowąoraz dyfuzja substancji czynnej z rdzenia preparatu kolagenowego za pośrednictwem cieczy do powierzchni granicznej tego preparatu. Ponadto na uwalnianie ma wpływ biologiczny rozkład preparatu kolagenowego przez hydrolizę i oddziaływanie enzymatyczne przy kontakcie z cieczą ustrojową. Na podstawie przykładu 2 przedstawiono już dużą szerokość pasma wzajemnego oddziaływania pomiędzy cieczą a preparatami pochodzącymi ze zmieszania nierozpuszczalnego kolagenu o różnych rozkładach masy cząsteczkowej. Wjako sposób te wzajemne oddziaływania działają we współdziałaniu z jednym lub z kilkoma wymienionymi czynnikami mającymi wpływ na kinetykę uwalniania substancji czynnej, przedstawiono w przykładach 3 i 4. Widać również, że stosunek mieszania nierozpuszczalnego kolagenu o różnych rozkładach masy cząsteczkowej w znaczący sposób określa kinetykę uwalniania substancji czynnej. Dzięki temu istnieje możliwość, by przy danej substancji czynnej i przy zadanym uwalnianiu w jednostce czasu dopasować celowo preparat kolagenowy do żądanych parametrów, aby w ten sposób po podaniu uzyskać optymalne terapeutycznie dozowanie substancji czynnej w przewidzianym czasie stosowania. Jeżeli w przypadku postaci leku wybranej w przykładach 3 i 4, wytworzonej z opisanych w przykładzie 1 preparatów z nierozpuszczalnego kolagenu o różnych rozkładach mas cząsteczkowych, substancja czynna będzie oddawana w czasie stosowania 24-48 godzin, wówczas stosunek mieszania niskocząsteczkowego i wysokocząsteczkowego, nierozpuszczalnego kolagenu nie powinien być mniejszy niż 3 do 1. Jeżeli z drugiej strony uwalnianie substancji czynnej z porównywalnej postaci leku ma być równomierne w czasie stosowania 7-14 dni, wówczas stosunek mieszania niskocząsteczkowego i wysokocząsteczkowego, nierozpuszczalnego kolagenu nie powinien być większy niż 1 do 3.

W przykładach tych celowo badano tylko czyste preparaty kolagenowe plus substancja czynna, aby możliwości sterowania preparatów pochodzących ze zmieszania nierozpuszczalnego kolagenu o różnych rozkładach masy cząsteczkowej były wolne od wpływów innych substancji pomocniczych. W praktyce dość trudno jest jednak poradzić sobie bez dodatkowych substancji rozpuszczalnych w wodzie lub dyspergowalnych w wodzie, ponieważ oprócz wymagań dotyczących uwalniania substancji czynnej z reguły, zależnie od przeznaczenia, stawiane są również wymagania dotyczące właściwości manipulowania i stabilności preparatu złożonego z kolagenu i substancji czynnej.

Tego rodzaju substancjami pomocniczymi mogą być dodatkowe polimery, które przykładowo służą jako środki regulacji lepkości przy stosowaniu preparatów ciekłych lub jako spoiwa przy postaciach stałych, jak np. pochodne celulozy, pochodne skrobi, pochodne galaktomannanu, dekstryny, roślinne polisacharydy, jak alginiany, pektyny, karagen lub ksantan, chitosan, proteiny, glikoproteiny, proteoglikany, glukozoaminoglikany, alkohol poliwinylowy, pirolidon, pirolidon poliwinylowy, kopolimery pirolidon winylowy-octan winylowy, glikol polietylenowy, poliakrylany i polimetakrylany, polilaktydy i poliglikolidy oraz kwasy poliaminowe.

Jako dalsze substancje pomocnicze preparat kolagenowy może zawierać

- Środki zatrzymujące wilgoć, jak przykładowo glicerynę, sorbitol, glikol polietylenowy, glikol polipropylenowy.

- Zmiękczacze, jak np. estry kwasu cytrynowego, estry kwasu winowego lub estry glicerynowe.

- Przyspieszacze penetracji, jak przykładowo siarczany alkilowe, sulfoniany alkilowe, mydła alkaliczne, sole kwasów tłuszczowych metali wielowartościowych, betainy, aminotlenki, estry kwasów tłuszczowych, mono-, dwu- lub trójglicerydy, alkohole o długich łańcuchach, sulfotlenki, estry kwasu nikotynowego, kwas salicylowy, N-metylopirolidon, 2-pirolidon lub mocznik.

- Środki konserwujące, przykładowo zawierające p-Cl-krezol, alkohol fenyloetylowy, alkohol fenoksyetylowy, chlorobutanol, ester metylowy kwasu 4-hydroksybenzoesowego,

179 952 ester propylowy kwasu 4-h.ydroksybenzoesowego, chlorek alkilobenzylodwumetyloamoniowy, chlorek cetylopirydyniowy, dwuoctan chloroheksydowy lub dwuglukonian chloroheksydynowy, etanol lub glikol propylenowy.

- Środki dezynfekcyjne, przykładowo, halogeny, jak poliwidon-jod, związków chlorowców, jak podchloryn sodowy lub p-toluenosulfonian sodowy, środki utleniające, jak nadtlenek wodoru lub nadmanganian potasu, arylowe związki rtęci, jak boran fenylo-rtęciowy lub merbromin, alkilowe związki rtęci, jak tiomersal, organiczne związki cyny, jak benzoesan trój -n-butylocynowy, białkowe związki srebra, jak białkowy acetylotaninian srebra, alkohole, jak etanol, n-propanol lub izopropanol, fenole, jak tymol, o-fenylofenol, 2-benzylo-4-chlorofenol, heksachlorofen lub heksylorezorcyna, albo organiczne związki azotu, jak 8-hydroksychinolina, chlorokwinaldol, kliokwinol, etakrydyna, heksetydyna, chloroheksydyna lub ambazon.

- Regulatory współczynnika pH, przykładowo, bufor glicynowy, bufor cytrynianowy, bufor boranowy, bufor fosforanowy lub bufor kwas cytrynowy-fosforan.

- Przeciwutleniacze, przykładowo, kwasy askorbinowe, palmitynian askorbilowy, octan tokoferolowy, gallusan propylowy, butylohydroksyanizol lub butylohydroksytoluen.

- Stabilizatory substancji czynnych, jak mannit, glukoza, laktoza, fruktoza, sacharoza.

- Substancje pomocnicze zdolne do emulgowania, jak oleje, tłuszcze i woski.

- Środki zapachowe, barwniki, substancje czyszczące, substancje do pielęgnacji ciała.

- Stabilizatory emulsji, jak np. niejonowe emulgatory, amfoteryczne emulgatory, kationoaktywne emulgatory i anionoaktywne emulgatory.

- Wypełniacze, jak przykładowo mikrokrystaliczna celuloza, tlenek glinu, tlenek cynku, dwutlenek tytanu, talk, dwutlenek krzemu, krzemian magnezowy, krzemian magnezowo-glinowy, kaolin, hydrofobowa skrobia, stearynian wapnia lub fosforan wapnia.

Substancje pomocnicze mogą być przykładowo przed procesem wytworzenia leku rozpuszczane, dyspergowane lub emulgowane w zawiesinach nierozpuszczalnego kolagenu. Mogą być one jednak również po zakończeniujednego z opisanych poniżej procesów formowania pierwotnego mieszanin nierozpuszczalnego kolagenu dopiero w późniejszych fazach wytwarzania leku wprowadzane w konwencjonalny i znany dla danego procesu wytwarzania sposób.

Te postacie wykonania, w których mogą być stosowane mieszaniny nierozpuszczalnego kolagenu o różnych rozkładach masy cząsteczkowej w celu sterowanego oddawania substancji czynnych, są wybitnie złożone i dlatego nie mogą być obszernie przedstawione.

Te postacie wykonania preparatu kolagenowego według wynalazku mogąbyć wytwarzane według różnych znanych fachowcom sposobów z mieszanin zawiesin nierozpuszczalnego kolagenu o różnych rozkładach masy cząsteczkowej, np. przez suszenie rozpyleniowe, suszenie sublimacyjne, nakładanie powłok lub odlewanie z późniejszym suszeniem, sposób z rozdzielaniem faz i koacerwacjądla cząstek lub emulgowanych kropelek, suszenie i zagęszczanie oraz zwykłe napełnianie pojemników, takich jak tubki i w rezultacie uzyskuje się np. proszki, pudry, mikrocząstki, włókna, kłaczki, pianki, gąbki, igiełki, pręciki, tabletki, żele, kremy, jednowarstwowe folie lub laminaty. Korzystnymi postaciami wykonania są suszone rozpyleniowo mikrocząstki, suszone sublimacyjnie pianki i żelowate folie wytworzone przez powlekanie.

Wprowadzanie substancji czynnej w preparat kolagenowy według wynalazku może być przeprowadzane w ten sposób, że substancję czynną rozpuszcza się lub dysperguje w gotowej mieszaninie zawiesin nierozpuszczalnego kolagenu o różnych rozkładach mas cząsteczkowych przed procesem formowania preparatu. Jeżeli trzeba wprowadzać więcej niż jedną substancję czynną, wówczas można je oddzielnie od siebie rozpuszczać lub dyspergować również przed operacją mieszania w oddzielnych frakcjach nierozpuszczalnego kolagenu. Substancję czynną można jednak wprowadzać na lub do preparatu również po przeprowadzonym procesie formowania preparatu przez powlekanie, natryskiwanie, impregnowanie, zanurzanie lub inne sposoby adsorpcji.

Możliwe postacie wykonania, odpowiednie sposoby wytwarzania i sposoby wprowadzania substancji czynnej można jednak również łączyć ze sobą w celu uzyskania określonych właściwości.

179 952

Preparat kolagenowy według wynalazku może przykładowo zawierać rozpuszczalną w cieczy ustrojowej lub przynajmniej pęczniejącą osłonkę z nierozpuszczalnego kolagenu o małej średnicy masie cząsteczkowej w postaci gąbki lub folii oraz zdyspergowany w niej mikrocząsteczkowy preparat z nierozpuszczalnego kolagenu o dużej średniej masie cząsteczkowej. Przy wprowadzaniu tylko jednej substancji czynnej zewnętrzna faza gąbczasta lub foliowa służy do szybkiego uwalniania substancji czynnej, aby szybko osiągnąć przynajmniej niezbędne stężenie substancji czynnej, po czym następuje wolniejsze, bardziej równomierne uwalnianie substancji czynnej z wewnętrznej cząsteczkowej fazy w celu utrzymywania niezbędnego stężenia substancji czynnej przez czas podawania. Tego rodzaju profile uwalniania mogą być osiągane również z innymi postaciami preparatu, jak np. włókna w hydrożelu, gąbczaste emulsje oleju w wodzie, zagęszczone mieszaniny na tabletki przeznaczone do wszczepiania, wielowarstwowe folie, kombinacje folii i pianek itd.

Tego rodzaju wielofazowe preparaty mogą być również zastosowane wtedy, gdy pożądane jest uwalnianie różnych substancji czynnych w różnych punktach w czasie z różnymi prędkościami uwalniania lub kiedy jedna lub więcej substancji czynnych powinno być uwalniane fazowo, to znaczy z odstępami pozbawionymi uwalniania.

Substancja czynna A może być przy tym przykładowo zawarta w łatwo rozpuszczalnej, szybko uwalnianej fazie zewnętrznej, natomiast substancja czynna B jest zawarta w trudno rozpuszczalnej, wewnętrznej fazie uwalnianej z opóźnieniem i zatrzymywanej w kontrolowany sposób. Jeżeli potrzebny jest fazowy profil uwalniania tylko jednej substancji czynnej, wówczas faza zewnętrzna i faza wewnętrzna mogą uwalniać substancję czynną np. z jednakową kinetyką. Faza wewnętrzna byłaby jednak w takim przypadku osłonięta płaszczowo warstwą nierozpuszczalnego kolagenu pozbawionego substancji czynnej, która po rozpuszczeniu fazy zewnętrznej lub po wyczerpaniu w niej substancji czynnej sama musi pęcznieć lub rozpuszczać się, aby mogło nastąpić uwalnianie substancji czynnej z tej fazy wewnętrznej. Dzięki takiemu układowi można otrzymać interwał, w którym nie będzie uwalniania żadna substancja czynna.

Przy stosowaniu preparatu kolagenowego według wynalazku do podawania naskórnego, śródskórnego lub przezskórnego farmaceutycznych substancji czynnych lub kosmetycznych substancji aktywnych korzystnie są płaskie postacie wykonania, takie jak folie, membrany lub cienkie gąbki. Takie płaskie postaci wykonania mogą być złożone z laminatów, które przykładowo zawierają również pozbawione substancji czynnej warstwy zaporowe, przepuszczalne warstwy rozdzielające, membrany sterujące i warstwy klejowe. W poszczególnych warstwach lub pomiędzy nimi mogą być umieszczone substruktury, takie jak np. płytki, prosz.ek, mikrocząstki lub kropelki oleju, aby osiągnąć kinetykę uwalniania odpowiednią dla jednej lub kilku substancji czynnych. Korzystnie tego rodzajujedno lub wielowarstwowe preparaty kolagenowe do wymienionych zastosowań, np. w celu zabezpieczenia przed wyschnięciem lub rozwojem zarazków, są w znany sposób wyposażone w warstwę spodniąi na przeciwległej stronie w odłączalną warstwę ochronną. przy czym ta warstwa spodnia i warstwa ochronna mogą być złożone z materiałów znanych fachowcom, które są przykładowo stosowane przy formułowaniu plastrów lub taśm klejących.

W korzystnej postaci wykonania preparatu kolagenowego według wynalazku do stosowania na zewnętrzne rany oraz wnętrza ciała postać preparatu jest porowata są tak dobrane, że możliwe jest wnikanie w ten preparat komórek, np. fibroblastów lub osteoblastów, przy czym komórkom tym nadawana jest orientacja strukturalna, która sprowadza się zwłaszcza do podobnego do naturalnej tkanki łącznej stopnia uporządkowania kolagenu w preparacie według wynalazku. Wrastanie komórek może być przykładowo potrzebne dla rozkładu preparatu lub do oddawania lub osadzania substancji, które są przykładowo potrzebne do regeneracji tkanki lub do unaczynienia tkanki, która powinna wystąpić zamiast preparatu kolagenowego według wynalazku.

W innej korzystnej postaci wykonania przeznaczonej do stosowania na ranach lub wewnątrz ciała preparat kolagenowy według wynalazku jest przez domieszanie substancji pomocniczych, np. karboksymetylocelulozy, kwasu poliakrylowego, tragakantu, alginianu sodo179 952 wego lub hydroksypropylocelulozy, ustawiany tak, że jest on bioadhezyjny, to znaczy, że preparat ten na skutek sił występujących na granicy faz przez określony czas uzyskuje przyczepność do tkanki powierzchniowej w miejscu zastosowania, aby zwiększyć przez to czas przebywania w miejscu zastosowania lub w miejscu resorpcji.

Przykłady

1. Wytwarzanie nierozpuszczalnego kolagenu ze skóry cielęcej

1.1 .Obróbka za pomocą Ca(OH)₂ 1 % w H₂0 100 h

Obróbka za pomocą NH₄Cl 3% w H₂0 1 h

Obróbka za pomocą NaOH 5% + Na₂S0₄ 9,2% w H₂0 12 h

Obróbka za pomocą Na₂S04 1 M w H₂0 0,5 h

Obróbka za pomocą HCl 1% w H20 1,5 h

Obróbka za pomocą H202 0,5% w H20 6 h

Po mechanicznym rozdrobnieniu i zdyspergowaniu w H2O (pH 6,0) nierozpuszczalny kolagen ma średnią masę cząsteczkową około 2.500.000. Stężenie kolagenu wynosi 0,75%.

1.2 Jak a), z następującą różnicą:

Obróbka za pomocą Ca(OH)21% w H20 77 h

Obróbka za pomocąNaOH 9,75% + Na2SO4 9,2% w H₂O 48 h

Po mechanicznym rozdrobnieniu i zdyspergowaniu w H20 (pH 6,0) nierozpuszczalny kolagen ma średnią masę cząsteczkową około 420.000. Stężenie kolagenu wynosi 0,75%.

2. Wy twarzaniepazbawionego snbsoancjic aynnejlio fili zaU z zntcszanin. zawito zan według

1.1 i 1.2 oraz określanie czasu rozpadu w miesonyiyie buforowej przy różnych wartościach pH.

Zostały wytworzone następujące mieszaniny zawiesin według 1.1 i 1.2:

Zawiesina 1,1 Zawiesina 1,2

A	100%	0%
B	75%	25%
C	50%	50%
D	25%	75%
E	0%	100%

Po 24 g miesznniy A-E wprowadzono do głęboko tłoczonych części o wymiarach 6 x 4 x 1,5 cm, wymrożono udarowo i w ciągu 60 minut doprowadzono do temperatury -50°C. Następnie mieszeyiyy te suszono sublimacyjnie.

Dla uzyskanych gąbek (wymiary 6 x 4 x 0,8 cm) oznaczano przy lekkim mieszaniu czasu rozpadu próbki 100 ml w następujących mieszaninach buforowych:

pH 3: Mieszjyώla buforowa kwas cybynowy/chtorek sodn/wodorotlenek z dodatkiem środka grzybobójczego pH 5: Kwas octowy (0,1 MI), oclam sodu (0,2 MI) pH 6,4: SzU.ιcoyja wydztoiżna rany (j^b^z albuminy) pH 7,5: Kwaśny ((Νοηο potasu/NaOH (OJ M/0,1 MI) Wyniki: Mieszanina pH roztworu buforowego 3 5 6,4 7,5
A	2 h 15 min	> 10 d	> 10 d	> 10 d
B	1 h 10 min	3 d	3 d	2 d
C	1 h	24 h	24 h	6 h
D	20 min	4 h 10 min	4 h 30 min	1 h45 min
E	2 min	35 min	45 min	15 min

3. WytwMzagtoljyfiSizatów z cWrem promytowym Wymsu wahy droksybenz.onbywego i określanie uwelyienie.

W mieszaninach A-E według przykładu 2 rozpuszczono w każdym przypadku 0,275% (w odniesieniu do zawiesiny) propylowego estru kwasu p-hydroksybenzoesowego. Po 10 g tych mieszanin wprowadzono w głęboko ciągnione części według przykładu 2, zamrożono uderzeniowo, w ciągu 60 minut ochłodzono do temperatury -50°C i następnie wysuszono sublimacyjnie.

179 952

Około 30 mg (teoretyczna zawartość estru propylowego kwasu p-hydroksybenzoesowego 6,1 mg) wynikowych liofilizatów (ciężar gąbki około 135 mg, teoretyczna zawartość estru propylowego kwasu p-hydroksybenzoesowego 27,5 mg) wprowadzono do urządzenia mieszającego i wymieszano w 500 ml 0,05 N wodorotlenku sodowego przy temperaturze 37°C zprędkością obrotową 45 obr/min. Po 4 godzinach za każdym razem pobrano 10 ml uwalnianego czynnika. Zawartość substancji czynnej oznaczano fotometrycznie w zakresie ultrafioletu względem wzorca 294 nm o grubości warstwy 1 cm.

Wyniki:

Mieszanina ABC DE

Uwalniana substancja czynna (mg) 2,1 2,7 3 ,4 3,8 * *Nie można było oznaczyć, ponieważ liofilizat uległ całkowitemu rozpadowi

4. Wytwarzanie liofilizatów z chlorowodorkiem lidokainy i określanie uwalniania.

W każdej z mieszanin A-E z przykładu 2 rozpuszczono 0,042% (w odniesieniu do zawiesiny) chlorowodorku lidokainy. Po 24 g każdej z tych mieszanin wprowadzono w głęboko ciągnione części według przykładu 2, zamrożono udarowo, ochłodzono w ciągu 60 minut do temperatury -50°C i następnie wysuszono sublimacyjnie.

Każdy z uzyskanych liofilizatów (ciężar gąbki około 250 mg, teoretyczna zawartość chlorowodorku lidokainy 10 mg) wprowadzono w urządzenie mieszające i unieruchomiono za pomocą siatki na dnie naczynia. Do urządzenia dodano 350 ml wody o temperaturze 37°C i mieszano z prędkością 45 obr/min. Po 24 godzinach pobrano próbki uwalnianego czynnika. Zawartość substancji czynnej oznaczano przy 262,5 nm z grubością warstwy 1 cm fotometrycznie w zakresie ultrafioletu z oceną na podstawie krzywej wzorcowej.

Wyniki:

Mieszanina Uwolniona substancja czynna

A 1,2 mg

B 5,1 mg

C 7,,4 mg

D 8,8 mg

E 10,0 mg

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Preparat kolagenowy do kontrolowanego uwalniania substancji czynnych, znamienny tym, że zawiera mieszaninę nierozpuszczalnych w kwasie frakcji kolagenu, składającą się z wysokomolekularnej frakcji kolagenu, o ciężarze cząsteczkowym rzędu 10⁶ da, stabilizującej strukturę preparatu, oraz z niskomolekularnej frakcji kolagenu, o ciężarze cząsteczkowym rzędu 10⁵ da, kontrolującej prędkość uwalniania.
2. 2. Preparat kolagenowy według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera substancje pomocnicze, takie jak środki regulujące lepkość, spoiwa, środki zatrzymujące wilgoć, zmiękczacze, środki pospieszające penetrację, środki konserwujące, środki dezynfekcyjne, regulatory pH, przeciwutleniacze, stabilizatory substancji czynnej, oleje, tłuszcze, woski, stabilizatory emulsji, substancje zapachowe, barwniki i/lub obojętne wypełniacze.
3. 3. Preparat kolagenowy według zastrz. 1, znamienny tym, że nierozpuszczalny kolagen jest pozbawionym telopeptydów, rodzimym, nieusieciowanym kolagenem typu 1.
4. 4. Preparat kolagenowy według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że nierozpuszczalny kolagen jest produktem alkalicznego roztwarzania skóry cielęcej.