PL180020B1

PL180020B1 - Novel synthetic peptide, lubgs surfactant containing such peptide and agent for treating respiratory insufficiency syndrome

Info

Publication number: PL180020B1
Application number: PL94314872A
Authority: PL
Inventors: Tsunetomo Takei; Eiji Ohtsubo; Hirosi Ohkawa
Original assignee: Mitsubishi Tokyo Pharm Inc; Mitsubishi Tokyo Pharmaceuticalsinc
Priority date: 1993-12-08
Filing date: 1994-12-07
Publication date: 2000-12-29
Also published as: US5827825A; NZ277095A; JP3644035B2; ATE234865T1; WO1995015980A1; NO962403L; CZ162396A3; FI962355L; KR960706507A; EP0733645A4; BG62777B1; HU9601563D0; CN1057099C; PT733645E; NO962403D0; DE69432313D1; CN1136813A; SK71496A3; FI962355A7; ES2189825T3

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy syntetyczny peptyd, peptyd do syntezy, sposób wytwarzania syntetycznego peptydu, surfaktant płuc i środek leczenia zespołu niewydolności oddechowej.

Zespół niewydolności oddechowej jest chorobą polegającą na zmniejszeniu aktywności powierzchniowej pęcherzykówphicnych z powodu braku surfaktanta płuc. Prowadzi to do zapadania się pęcherzyków, co z kolei powoduje ciężkąniewydołność oddechową. Zespół występuje często wśród niedojrzałych noworodków i jest przyczyną znacznej śmiertelności. Wiadomo, że kompozycje zawierające surfaktant płuc sąniezwykle efektywne w zespole niewydolności oddechowej noworodków.

Dorośli są również dotknięci hipoksemią spowodowaną różnymi przyczynami i znane są liczne przypadki, w których, na zdjęciach rengenowskich klatki piersiowej, widoczne są w obu płucach cienie o wyglądzie „potłuczonego szkła” oraz występuje niewydolność mimo kontrolowania oddechu przy użyciu respiratora, itp. Ueda i wsp. (w: Hiromoto) Yasuda, „Biosurfactants. rozdz. 3. Medical Practices Using Surfactants. dział 1. Cłinical Applications of Surfactants.V. Aspiration Pneumonia and Surfactants.” str. 184, 1990, Science Forum, Co. Ltd.) donoszą o dwóch przypadkach zapalenia płuc u dorosłych (przypadki.· (1) zapalenie płuc spowodowane aspiracjągazowego azotanu i (2) nawracające zachłysrowe zapalenie płuc spowodowane guzem mózgu, powodujące hipoksemię i prowadzące do pogorszenia stanu ogólnego i niewydolności

180 020 oddechowej), w których uzyskano znacznąpoprawę i zachowanie życia pacjentów przez wstrzyknięcie surfaktantu płuc do dróg oddechowych pacjentów. Pooperacyjna niewydolność oddechowa może wystąpić po operacjach serca, ponieważ w trakcie operacji zatrzymany jest oddech. Opisywano również wpływ surfaktantu płuc na te zaburzenia oddechowe (Shuichi Nosaka i in., Journal of Japanese Medical Society for Biological Interface, vol. 22, str. 66,1991).

Tak więc, terapia substytucyjna polegająca na podawaniu egzogennego surfaktantu płuc przez drogi oddechowe wykazuj e znaczny wpływ leczniczy na zespół niewydolności oddechowej.

Znaleziono ostatnio 4 typy apoproteiny, które są wyjątkowe do stosowania w surfaktantach płuc ssaków. Jestto surfaktantowaapoproteina Ai apoproteinaD, które są hydrofitowe, oraz apoproteina B (określana dalej jako SP-B) i apoproteina C (określana dalej jako SP-C), które są hydrofobowe (Toyoaki Akino i Yoshio Kuroki, Respiration and Circulation, Vol. 38, nr 18, strona 722,1990; Hiromoto Yasuda i in., Biosurfactants: Rozdział 2. The Biochemistry of Surfactants Surfactants and Apoproteins, strona 131,1990, Science Forum, Co Ltd.).

SP-C (sekwencja nr 1), pochodząca z płuc ludzkich, składa się z 35 aminokwasów ijest wysoce hydrofobowąapoproteiną, którajest bogata w walinę i jako N-końcowy aminokwas zawiera fenyloalaninę.

SP-C wyizolowana z płuc wołu (sekwencja nr 2), świni (sekwencja nr 3), szczura itd., również składa się z 34 do 35 aminokwasów i aczkolwiek sekwencje aminokwasów przy N-końcu są różne dla różnych gatunków, wykazują one wyjątkowo wysoką homologię z ludzką SP-C.

W japońskiej publikacji patentowej nr Hei-3-502095 ujawniono również, że syntetyczny peptyd (sekwencja nr 4) z wymienioną poniżej sekwencją 32 aminokwasów, stanowiącą część struktury SP-C, jest minimalną jednostką wykazującą wysoką aktywność powierzchniową, oraz że mieszaniny tego peptydu i lipidów są skuteczne przeciwko zespołowi niewydolności oddechowej, a porównanie aktywności powierzchniowej tej minimalnej jednostki peptydu z innym syntetycznym peptydem o krótszej sekwencji aminokwasowej wykazuje, że zmniejszenie aktywności powierzchniowej nie jest związane z brakiem konkretnego aminokwasu, lecz z redukcją długości łańcucha peptydowego.

Niektórzy z twórców obecnego wynalazku stwierdzili uprzednio, że mieszaniny syntetycznego peptydu (określanego dalej jako TP-C), którego struktura stanowi część struktury SP-C, i lipidu są skuteczne w leczeniu zespołu niewydolności oddechowej, i ubiegali się o patent na ten przedmiot (japońskie zgłoszenie patentowe nr Hei-5-518188).

Jeśli chodzi o wytwarzanie syntetycznych peptydów, ogólnie wiadomo, że wraz z wydłużeniem aminokwasowej sekwencji peptydu, częściej podczas produkcji ma miejsce wytwarzanie defektywnych peptydów, trudniejsze staje się wyizolowanie i oczyszczanie, wydłuża się czas wymagany do wytwarzania oraz staje się trudniejsza produkcja na wielką skalę, itd.

Również, ze względu na zachowanie jakości, kompozycje surfaktantów płuc są często sporządzane w postaci suchych kompozycji proszkowych do podawania w postaci zawiesin w soli fizjologicznej. Dla poprawienia zdolności surfaktantów płuc do tworzenia zawiesin proponowano sposoby takie jak dodawanie środków zawieszających, takich jak mannitol (japońskie zgłoszenie patentowe nr Hei-1-60451) oraz lifiolizację przy początkowej temperaturze zamrażania od -1 do -10°C. Ponieważ jednak sposoby te są skomplikowane, pożądane jest opracowanie prostszych sposobów wytwarzania takich środków.

Kompozycja surfaktanta płuc (określana dalej jako S-35), wytwarzana przez połączenie SP-C z mieszaniną lipidów obejmującą fosfogliceryd choliny, fosfolipid kwasowy i analog kwasu tłuszczowego, ma wyjątkowo słabą zdolność tworzenia dyspersji w soli fizjologicznej, co powoduje, że trudno jest wytworzyć zawiesinę, która byłaby wystarczająco jednorodna do stosowania jako kompozycja. Powodem tego jest tworzenie wiązań disulfidowych przez reszty cysternowe w peptydzie, co sprawia, że peptyd charakteryzuje wysoka kohezja a sam surfaktant płuc jest silnie hydrofobowy.

180 020

Ponieważ TP-C wykazuje niską rozpuszczalność w zwykłych rozpuszczalnikach, do wytworzenia kompozycji surfaktanta płuc konieczne było zastosowanie kwasu trifluorooctowego (TFA). Tak więc, z TP-C związany jest problem, który polega na tym, że usunięcie możliwej dużej ilości TFA wymaga długiego czasu na zatężanie i suszenie, a zawiesina surfaktanta płuc zakwasza się podczas wytwarzania w związku z obecnością resztkowego TFA.

Ujawnienie wynalazku

Twórcy obecnego wynalazku, rozważając powyższe, wnikliwie badali syntetyczne peptydy i dokonali wynalazku po stwierdzeniu, że nowe syntetyczne peptydy (określane dalej jako „syntetyczne peptydy według wynalazku”), które zawierają podanąponiżej sekwencję aminokwasów z hydrofilowączęściąpeptydowąo specyficznej sekwencji przy N-końcu i hydrofobową część peptydową obejmującą głównie Leu i/lub Nie przy C-końcu, są łatwe do wyizolowania i oczyszczania, mogą być wytwarzane na skalę przemysłową, są dobrze rozpuszczalne w kwasie mrówkowym, TFA, trifluoroetanolu, sulfotlenku dimetylu (DMSO), chloroformie, mieszaninach chloroformu i metanolu, etylenochlorohydrynie i tetrahydrofuranie, a zwłaszcza, w porównaniu z syntetycznymi SP-C i TP-C, wykazują bardzo wysoką rozpuszczalność w metanolu. Twórcy obecnego wynalazku stwierdzili również, że surfaktanty płuc wytworzone z syntetycznych peptydów według wynalazku i mieszanin lipidów, nawet wytwarzane metodązwykłej liofilizacji prowadzonej w -20°C lub poniżej i bez dodawania środka zawieszającego, wykazują zdolność do tworzenia jednorodnej zawiesiny, w porównaniu z S-35 lub syntetycznymi surfaktantami płuc (określanymi dalej jako „SF-3”; japońska publikacja patentowa nr Hei-2-87685) zawierającymi jedynie mieszaninę lipidów obejmującą fosfogliceryd choliny, fosfolipid kwasowy i analog kwasu tłuszczowego, lub w porównaniu z substancją (określaną dalej jako „S-TA”; japońska publikacja patentowa nr Sho-61 -9924) zawierającą wraz z kwasem tłuszczowym substancję obejmującą fosfolipid, obojętny lipid, całkowity cholesterol, węglowodany i niewielkie ilości białek obecnych w płucach ssaków, a ponadto wykazująsilnąaktywność powierzchniową która jest równoważna aktywności S-35, S-TA lub surfaktanta płuc obejmującego TP-C i mieszaninę lipidów.

Nowy syntetyczny peptyd według wynalazku ma następującą sekwencję:

Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W, w której Xaa może nie występować lub może oznaczać Cys lub Ser, N-koniec peptydu ewentualnie jeszcze zawiera dodatkowo aminokwas lub aminokwasy wybrane z grupy obejmującej Cys i Ser i kombinację Cys lub Ser z sekwencjąPhe-Gly-Ile-Pro, przy czym grupa dołowa lub hydroksylowa obecna w tym peptydzie może być acylowana kwasem tłuszczowym o 14-18 atomach węgla lub może być acetoamidometylowana; Xbb oznacza His lub Asn, Xcc oznacza Leu lub Ile, a W oznacza część hydrofobowąpeptydu obejmującą 12-20 reszt Leu i/lub Nie i ewentualnie 1 -5 reszt wybranych spośród Ile, Val, Nva i Trp oraz na końcu C ewentualnie grupę o sekwencji Gly-Ala-Leu-Leu lub Gly-Ala-Leu-Leu-Met-Gly-Leu,

Korzystnie peptydy według wynalazku mają sekwencję przedstawioną jedną z sekwencji nr 5-19.

Korzystnym peptydem jest S-acetoamidometolowany peptyd o sekwencji nr 8 lub S-palmitoilowany peptyd o sekwencji nr 9.

Syntetyczne peptydy według wynalazku zawierają grupę peptydową wykazującą dobrą hydrofilowość i silną aktywność powierzchniową w połączeniu z mieszaninami lipidów, nawet po dodaniu, usunięciu lub zastąpieniu jednego lub wiecej występujących w nim aminokwasów.

Syntetyczny peptyd według wynalazku można wytwarzać chemicznie lub metodami inżynierii genetycznej, a ze względu na izolowanie i oczyszczanie korzystne są sposoby chemiczne.

Chemiczne metody wytwarzania syntetycznego peptydu według wynalazku obejmująmetody wydłużania krok po kroku oraz metody kondensacji fragmentów, obejmujące syntezę w fazie ciekłej i syntezę w fazie stałej, takie jak metoda azydkowa, metoda chlorków kwasowych,

180 020 metoda bezwodników kwasowych, metoda mieszanych bezwodników, metoda z DCC, metoda estrów aktywnych (metoda z estrem p-nitrofenolowym, z estrem p-hydroksysukcynimidu, karboimidazolem, itd.), metody utleniania-redukcji oraz metoda aktywowania z użyciem DCC.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania syntetycznych peptydów według wynalazku na drodze kondensacji fragmentów, w której hydrofitowy peptyd z chronionym N-końcem i chronionymi funkcyjnymi łańcuchami bocznymi służy jako związek wyjściowy i określany jest dalej jako peptyd do syntezy.

Peptyd do syntezy określony sekwencją

Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg, w której Xaa może nie występować lub może oznaczać Cys łub Ser, Xbb oznacza His lub Asn, Xcc oznacza Leu lub Ile, przy czym N-koniec peptydu ewentualnie jeszcze zawiera dodatkowo aminokwas lub aminokwasy wybrane z grupy obejmującej Cys i Ser i kombinację Cys lub Ser z sekwencjąPhe-Gly-Ile-Pro, wchodzi również w zakres wynalazku. W peptydzie do syntezy N-końcowe i funkcyjne łańcuchy boczne są chronione.

Metoda kondensacji fragmentów, w porównaniu ze sposobem wydłużania krok po kroku, zapewnia łatwiejsze oczyszczanie żądanej substancji i jest bardziej odpowiednia do syntezy na skalę przemysłową, jak również zapewnia uniknięcie strat spowodowanych nieoczekiwanymi błędami. Syntetyczne peptydy według wynalazku wytwarzać można przez kondensowanie hydrofobowej części W z uprzednio wytworzoną hydrofitowym peptydem do syntezy z chronionym N-końcem i chronionymi funkcyjnymi łańcuchami bocznymi metodą syntezy w fazie ciekłej lub w fazie stałej. Grupy ochronne dla N-końca i funkcyjnych łańcuchów bocznych nie są szczególnie ograniczone i są to typowe grupy ochronne stosowane w syntezie peptydów. Do końcowych grup aminokwasowych jako grupy ochronne stosować można 9-fluorenylometyloksykarbonyl (Fmoc), 2-chlorobenzyloksykarbonyl (2-CLZ) lub t-butyloksykarbonyl (Boc), jako grupy ochronne dlaLys stosować można Fmoc, Boc, grupę karbobenzoksy (Z) lub grupę tosylową (Tos), jako grupy ochronne dla His stosować można Trt, Fmoc, Boc, Dnp, Bom, Bzl lub Tos, zaś jako grupy ochronne dla Arg stosować można Mtr, Pmc, Mts lub Tos. Korzystne peptydy do syntezy, które stosować można jako związki wyjściowe w sposobie wytwarzania syntetycznego peptydu według wynalazku obejmują Fmoc-pro-Val-His (Trt)-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr), Fmoc-Pro-Vał-Asn-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr) orazFmoc-Pro-Val-Asn-Ile-Lys(Boc)-Arg(Mtr).

Surfaktant płuc określany dalej jako „surfaktant według wynalazku” obejmuje nowy syntetyczny peptyd według wynalazku oraz mieszaninę lipidów zawierającą fosfogliceryd choliny, fosfolipid kwasowy i kwas tłuszczowy lub jego analogi, takie jak sole metali alkalicznych kwasów tłuszczowych, estry alkilowe kwasów tłuszczowych, estry kwasów tłuszczowych i gliceryny i amidy kwasów tłuszczowych oraz mieszaniny dwóch lub więcej z powyższych oraz alkohole tłuszczowe i aminy tłuszczowe.

Korzystne jest takie ustalenie składu kompozycji, aby stosunki wagowe każdego ze składników w odniesieniu do całkowitej suchej masy produktu końcowego wynosiły 0,1-5% (wag./wag.) dla syntetycznego peptydu, 50,6-80,5% (wag./wag.) dla fosfoglicerydu choliny, 4,5-37,6% (wag./wag.) dla fosfolipidu kwasowego i 4,6-24,6% (wag./wag.) dla analogu kwasu tłuszczowego.

Przykłady fosfoglicerydów choliny, które są odpowiednie do stosowania w surfaktancie według wynalazku, obejmują l,2-diacyloglicero-(3)-fosfocholiny, takie jak 1,2-dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholina (dipalmitoilofosfatydylocholina), 1,2-distearynoiloglicero-(3)-fosfocholina, 1 -palmitoilo-2-stearynoiloglicero-(3)-fosfocholina i 1 -stearynoilo-2-palmitoiloglicero-(3)-fosfocholina, itd.; l-alkilo-2-acyloglicero-(3)-fosfocholina, taka jak 1- heksadecylo-2-palmitoiloglicero-(3)-fosfocholina i l-oktadecylo-2-palmitoiloglicero-(3)-fosfocholina, itd.; oraz l,2-dialkiloglicero-(3)-fosfocholiny, takie jak l,2-diheksadecyloglicero-(3)-fosfocholma, itd. Ponieważ dla wymienionych wyżej związków występują izomery optyczne związane z drugim

180 020 atomem węgla w reszcie glicerynowej, dowolne z postaci izomerycznych D-, L- oraz DL- mogą być stosowane w surfaktantach według wynalazku. Ponadto, jako fosfoglicerydy choliny, oprócz wymienionych powyżej pojedynczych związków, stosować można również mieszaniny zawierające dwie lub więcej różnych 1,2-diacyloglicero-(3)-fosfocholin z grupami acylowymi, korzystnie z dwoma nasyconymi grupami acylowymi, o 12 do 24 atomach węgla, lub mieszaniny takich mieszanin i pojedynczego związku.

Przykłady odpowiednich fosfolipidów kwasowych obejmują kwas 1,2-diacyklo-sn-glicero-(3)-fosforowy (kwas L-a-fosfatydylowy), l,2-diacylo-sn-glicero-(3)-fosfo-L-seiynę (fosfatydyloserynę), l,2-diacylo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerynę (fosfatydyloglicerynę) i 1,2-diacylo-sn-glicero-(3)-fosfo-(l)-L-mio-inozytol (fosfatydyloinozytol). Pierwsza i druga pozycja w tych związkach może być podstawiona tymi samymi lub różnymi grupami acylowymi. Korzystnie, grupa acylowa zawiera 12 do 24 atomów węgla.

Jako wolny kwas tłuszczowy stosować można kwas mirystynowy, kwas palmitynowy i kwas stearynowy, aczkolwiek korzystny jest kwas palmitynowy.

Jako sole wymienionych wyżej wolnych kwasów tłuszczowych można stosować sole metali alkalicznych z kwasem tłuszczowym, takie jak sole sodowe, potasowe, magnezowe i wapniowe, przy czym korzystny jest palmitynian sodu. Jako estry alkilowe kwasu tłuszczowego stosować można niższe estry alkilowe o 1 do 4 atomach węgla w grupie alkilowej, ale korzystny jest palmitynian etylu. Jako estry kwasu tłuszczowego i gliceryny stosować można estry monoglicerynowe, spośród których korzystny jest monpalmitynian.

Jako alkohole tłuszczowe stosować można alkohole zawierające 14 do 18 atomów węgla, przy czym korzystny jest alkohol heksadecylowy. Jako alifatyczne aminy stosować można aminy zawierające 14 do 18 atomów węgla, przy czym korzystna jest heksadecyloamina.

Wspomniane powyżej fosfoglicerydy choliny, fosfolipidy kwasowe i analogi kwasu tłuszczowego mogą być produktami wyizolowanymi z roślin dla zwierząt, półsyntetycznymi lub wytworzonymi na drodze syntezy chemicznej i jako takie stosować można produkty dostępne w handlu.

Surfaktant według wynalazku wytworzyć można na drodze suszenia i zestalenia pod zmniejszonym ciśnieniem mieszaniny roztworów peptydu według wynalazku i wspomnianej powyżej mieszaniny lipidów i zawieszenia otrzymanej pozostałości w odpowiednim ciekłym ośrodku zawieszającym i liofilizacji.

Przykłady rozpuszczalników, które można stosować do wytworzenia roztworu peptydu według wynalazku, obejmująkwas mrówkowy, TFA, trifluoroetanol, DMSO, mieszaninę chloroformu i metanolu, chloroform, metanol, etylenochlorohydrynę i tetrahydrofuran.

Przykłady rozpuszczalników, które mogą być stosowane do wytworzenia roztworu mieszaniny lipidów, obejmują chloroform i mieszaninę chloroformu i metanolu [1:2 - 5:1 (obj^obj.)].

Przykłady ciekłych ośrodków zawieszających obejmują wodę i mieszaniny wody i etanolu [4:1,20:1, (obj./obj.)], a korzystne są mieszaniny wody i etanolu. Zawieszanie prowadzi się w czasie 5-60 minut, a korzystnie przez 15 -30 minut w temperaturze 30-60°C. a korzystnie w 40-50°C.

Wytworzony tym sposobem surfaktant według wynalazku zawiera niewielką ilość resztkowej wody, co jest nieuniknione. Tak więc, korzystnie surfaktant suszy się, aż zawartość resztkowej wody wyniesie 5,0% (wag./wag.) lub mniej w stosunku do całkowitego ciężaru surfaktanta. Gdy surfaktant zostanie wysuszony do tego poziomu, w przypadku stosowania mieszaniny etanolu i wody, resztkowy etanol stanie się niewykrywalny.

Z suchych proszkowych kompozycji surfaktanta według wynalazku można wytwarzać jednorodne zawiesiny i dyspersje w roztworze zawierającym sól jednowartościowego lub dwuwarrościowego meiaiii o odpowiednim fizjologicznie stężeniu, np. 0,9% uulutku sodu lub 1,5 mM chlorku wapnia, lub w roztworze buforu filologicznego zawierającym takie sole, sto

180 020 sując wytrząsanie ręczne, lub mieszarkę o zmiennej szybkości lub urządzenie generujące ultradźwięki.

Poniżej opisane są aktywność powierzchniowa, zdolność do tworzenia zawiesin i właściwości farmakologiczne surfaktanów według wynalazku wytworzonych opisanym powyżej sposobem.

(1) Aktywność powierzchniowa (1) Efekt zmniejszenia napięcia powierzchniowego

Zmniejszenie napięcia powierzchniowego mierzono sposobem według Tanaka i in. (Journal of Japanese Medical Society for Biological Interface, vol. 13, nr 2, strona 87, 1982).

Zawiesinę surfaktanta według wynalazku wkroplono do roztworu soli fizjologicznej (o powierzchni 54,0 cm²), tak, że na 1 cm² przypadał 1,0-2,0 pg surfaktanta według wynalazku. Powierzchnię tę ściskano i rozszerzano w zakresie 54,0-21,6 cm² w czasie 2 do 5 minut, i w sposób ciągły mierzono napięcie powierzchniowe w temperaturze 37°C stosując urządzenie do pomiaru powierzchni Wilhem/a (produkcji Kyowa Interface Science Co., Ltd). Maksymalne napięcia powierzchniowe wynosiły 24,7 - 34,1 mN/m, a minimalne 0,2-8,7 mM/m, co wskazuje, że surfaktanty według wynalazku mają wpływ na zmniejszenie napięcia powierzchniowego soli fizjologicznej.

Tą samą metodą mierzono wpływ SF-3 na zmniejszenie napięcia powierzchniowego i stwierdzono, że maksymalne napięcia powierzchniowe wynoszą26,8-50,3 mN/m, a minimalne 1,0 do 13,5 mN/m.

Napięcie powierzchniowe samej soli fizjologicznej w temperaturze 37°C wynosiło 70,5 mN/m.

(2) Zdolności do rozprzestrzeniania na powierzchni rozdziału faz gaz-ciecz.

Zawiesinę surfaktanta według wynalazku wkroplono na powierzchnię soli fizjologicznej, tak że na 1 cm² powierzchni soli fizjologicznej przypadało 0,8-1,5 pg surfaktanta i od momentu wkroplenia zawiesiny mierzono metodązpionowąpłytką zmieniające się w czasie napięcia powierzchniowe. Temperatura przy pomiarze wynosiła 37°C.

Stan równowagi odnosi się do czasu liczonego od momentu wkroplenia próbki, który potrzebny jest aby napięcie powierzchniowe osiągnęło wyznaczoną wartość i wartość taka nazywana jest napięciem powierzchniowym zrównoważonym.

Surfaktanty według wynalazku w krótkim czasie 30-60 sekund wytworzyły błonę na powierzchni rozdziału faz gaz-ciecz i obniżyły napięcie powierzchnie do 26,7-34,3 mN/m.

Tą samą metodą mierzono efekt rozprzestrzeniania się na powierzchni rozdziału faz gazciecz SF-3, i pomiary te wykazały, że napięcie powierzchniowe wynosiło 38,1-52,9 mN po 120 sekundach.

Wyniki te wskazują że surfaktant według wynalazku szybko przenika do powierzchni faz gaz-ciecz i gwałtownie obniża napięcie powierzchniowe.

(3) Zdolność do adsorbowania się na powierzchni rozdziału faz gaz-ciecz

W temperaturze 37°C sporządzono zawiesiny w soli fizjologicznej, zawierające 0,2-1,0 mg surfaktanta według wynalazku na 1 ml i mierzono szybkość adsorpcji zawieszonych surfaktantów do powierzchni rozdziału faz gaz-ciecz soli fizjologicznej.

Zdolność do adsorpcji mierzono zgodnie z metodą Kinga i in. (American Journal of Physiology, nr 223, strona 715,1972).

Zawiesinę wstrzyknięto na dno teflonowego pojemnika o średnicy 5 cm zawierającego sól fizjologiczną którą mieszano za pomocą mieszadła magnetycznego. Zdolność do absorpcji wyznaczono na podstawie zmian w napięciu powierzchniowym po zakończeniu mieszania.

Surfaktant według wynalazku obniżył napięcie powierzchniowe do wartości pomiędzy 28,3 i 36,8 mN/m w czasie 30 do 100 sekund po zaprzestaniu mieszanią i po czym napięcie to utrzymało się na stałym poziomie.

180 020

Wskazuje to, że surfaktanty według wynalazku, w warunkach zawieszenia, przepływają! adsorbująsię na powierzchni rozdziału faz gaz-ciecz w 30 do 100 sekund, tworząc powłokę o silnej aktywności powierzchniowej.

Tą samą metodą dokonano pomiarów dla SF-3 i wykazały one, że stałe napięcie powierzchniowe od 42,2 do 58,3 mN/m uzyskano w czasie 150 sekund lub dłuższym.

Oznacza to, że adsorpcja na granicy rozdziału faz gaz-ciecz jest mniejsza dla SF-3 niż dla surfaktanta według wynalazku, a surfaktant według wynalazku ma silna zdolność do promowania absorpcji powierzchniowej.

(2) Zdolność do tworzenia zawiesin

Badania na zdolność surfaktantów płuc do tworzenia zawiesin prowadzono zgodnie z metodą opisaną w japońskiej publikacji wzoru użytkowego nr Hei-4-76965.

Zdolność do tworzenia zawiesin oceniano na podstawie wydajności dyspersji w konkretnym czasie po rozpoczęciu procesu zawieszania i na podstawie maksymalnej ilości zdyspergowanych cząstek w 2 minuty po rozpoczęciu procesu zawieszania.

Badania na wydajność dyspersji prowadzono w następujący sposób. 60 mg każdego z surfaktantów płuc umieszczono w 20 ml fiolkach. Następnie do każdej z tych fiolek dodano 2 ml soli fizjologicznej i fiolki umieszczono w wytrząsarce typu Iwaki KM Shaker-V-S (produkcji Iwaki Sangyo Co. Ltd.) i wytrząsano z szybkością270 potrząśnięć/minutę. Dyspersję każdej próbki obserwowano wizualnie za pomocąszkła powiększającego co 30 sekund po pierwszych 2 minutach od rozpoczęcia wytrząsania, co 1 minutę pomiędzy 2 i 4 minutą od rozpoczęcia wytrząsania i co 10 minut po 4 minutach od rozpoczęcia wytrząsania.

Dla każdego podanego czasu stan dyspersji oceniały 2 osoby, przy czym każda z tych osób oceniała 10 próbek. Próbki uważano za zawieszone, gdy wewnątrz fiolki nie zauważono małych kawałeczków i gdy kompozycja była jednorodnie zdyspergowana w soli fizjologicznej, tworząc białą, jednolitą zawiesinę.

Każda z oceniających osób określała wydajności dyspersji dla konkretnego czasu, podając je jako procent próbek, w których wytworzyła się zawiesina w stosunku do całkowitej liczby (10 fiolek) próbek i wskazano je jako średnie wartości wyznaczonych przez dwie osoby.

Maksymalną ilość zdyspergowanych cząstek mierzono, jak następuje. 60 mg każdego z surfaktantów płuc umieszczono w 20 ml fiolkach. Następnie do każdej z tych fiolek dodano 2 ml soli fizjologicznej i fiolki w sposób ciągły wytrząsano, w opisanych uprzednio warunkach. Następnie za pomocąmikroskopu wyszukano największe cząstki i mierząc suwmiarką wyznaczono ich średnice. Stwierdzono w ten sposób, że surfaktanty według wynalazku w większości w ciągu 2 minut były zawieszone, a maksymalna wielkość ich cząstek wynosiła 0,8 mm lub mniej, co wskazuje, że mają one dobrą zdolność do tworzenia zawiesin.

(3) Właściwości farmakologiczne (1) Ostra toksyczność

Ostrą toksyczność surfaktantów według wynalazku mierzono wykorzystując 5-tygodniowe samce myszy ICR oraz szczurów rasy Wister. Wartości LD₅₀ przy dawce doustnej i dootrzewnowej wynosiły dla myszy 2,4-10,0 g/kg i 1,0-5,0 g/kg, odpowiednio, a dla szczurów 1,5-5,0 g/kg i 1,5-2,5 g/kg, odpowiednio.

(2) Toksyczność podostra

Surfaktanty według wynalazku podawano dootrzewnowe dorosłym szczurom Wister w dawkach dziennych 300-600 mg/kg przez 1 miesiąc. Nie zaobserwowano żadnych widocznych zmian w wadze szczurów i żadnych odchyleń w badaniu histologicznym.

(3) Wpływ na utrzymanie objętości pęcherzykowej

Niedorosłe płody królicze podczas 27-dniowej ciąży, nie wytwarzają prawie wcale żadnych surfaktantów płuc i dlatego wykazująone niedobór surfaktanta płuc. Tak więc są stosowane jako wzorce zwierzęce do badania zespołu niewydolności oddechowej u noworodków.

180 020

Stosowano 5 płodów króliczych w 27 dniowym okresie ciąży i przy różnych wartościach ciśnienia powietrza w temperaturze 37°C mierzono objętość powierzchni pęcherzykowej (określanej tutaj jako objętość płuc).

Płodom nacięto szyj e i stosuj ąc nanometr wodny połączony z tchawicą w sposób ciągły dokonywano pomiarów od 5 minuty po podaniu drogą oddechową surfaktanta według wynalazku. Następnie zwiększono ciśnienie powietrza do 30 cm H₂O za pomocą dwukanałowej pompy ze strzykawką nr 940 (produkcji Harvard Ćo., USA), aby zwiększyć pęcherzyki. Następnie ciśnienie zredukowano to 0 cm H₂O zmniejszając pęcherzyki i mierzono objętość płuc przy różnych ciśnieniach H₂O. Następnie wyznaczono pojemność płuc w milimetrach na 1 kg wagi (ml/kg).

Surfaktanty według wynalazku (60 mg/kg) podawano przez bezpośrednie wstrzyknięcie do dróg oddechowych 0,05-0,5 ml zawiesin surfaktanta w soli fizjologicznej o stężeniu 1,0-60% (wag./obj.).

Objętość płuc w momencie gdy ciśnienie zostało zmniejszone do 5 cm H₂O wskazuje czynnościową objętość zalegającą, a im większa jest ta objętość, tym większa aktywność surfaktanta płuc.

Kontrolnie, zamiast surfaktanta według wynalazku podawano sól fizjologiczną. Pojemność płuc (przy 5 cm H₂O) w kontrolnej grupie noworodków króliczych wynosiła 1-5 ml/kg, co dowodzi, że pęcherzyki prawie nie powiększyły się.

Płody królicze po pełnym 30-dniowym okresie ciąży mają normalne poziomy surfaktanta płuc. Objętość ich płuc (przy 5 cmH₂O) wynosi 35-53 ml/kg, co wskazuje, że pęcherzyki sąw odpowiednim stopniu rozszerzone i może odbywać się normalne oddychanie.

Gdy podawano SF-3, objętość płuc (przy 5 cm H₂O) niedojrzałych płodów wynosiła 15-25 ml/kg, co świadczy o niedostatecznym rozszerzeniu pęcherzyków.

W przypadku podawania surfaktantów według wynalazku, objętość płuc (przy 5 cm H₂O) wynosiła 39-55 ml/kg, co dowodzi, że surfaktanty według wynalazku poprawiają objętość płuc niedojrzałych płodów do normalnego poziomu.

Jak opisano powyżej, syntetyczne peptydy według wynalazku wykazują silne działanie zwiększające aktywność powierzchniową mieszaniny lipidów. Tak wiec, możliwe staje się wytworzenie środków terapeutycznych obejmujących syntetyczne peptydy według wynalazku i mieszaninę lipidów, do leczenia zespołu niewydolności oddechowej, które są skuteczne jeśli chodzi o ich aktywność powierzchniową, zdolność tworzenia zawiesin i własności farmakologiczne.

Kompozycje zawierające jako składnik aktywny surfaktant według wynalazku, mogą być również stosowane do leczenia innych chorób, w których surfaktanty płuc majądziałanie lecznicze, takich jak pooperacyjna niewydolność oddechowa, astma, zapalenie oskrzeli, martwicze zapalenie jelit u noworodków, wrzody żołądka i dwunastnicy, choroby dróg oddechowych wywołane przez wirusy, niedrożność przewodu Eustachiusza, a także w zapobieganiu niedrożności jajowodów i pooperacyjnym zrostom organów oraz jako środki wykrztuśne.

Środki lecznicze według wynalazku do leczenia zespołu niewydolności oddechowej zawierają 50-1000 mg surfaktanta według wynalazku na dawkę do stosowania dla dzieci i 500-5000 mg na dawkę do stosowania dla dorosłych. Dawki takie sporządza się przez zawieszenie w wodzie, soli fizjologicznej lub buforach, itd., które są fizjologicznie tolerowane, w stężeniu 1,0-10,0% (wag./obj.). Stosuje się je przez podanie w ciągu 72 godzin od wystąpienia objawów niewydolności oddechowej przez wstrzyknięcie lub rozpylanie do dróg oddechowych 1 do 10 razy. Kompozycje można również wdychać, gdy sporządzone są one w postaci proszku i bez zawieszania. Dawki, sposoby stosowania i częstotliwości mogą zmieniać się stosownie do objawów występujących u pacjenta i współistniejącego leczenia.

Środki do leczenia według wynalazku mogą w razie potrzeby zawierać, takie substancje farmaceutyczne, jak środki stabilizujące, substancje konserwujące, środki regulujące izotonicz

Π ność, środki buforujące, środki zawieszające, przeciwutleniacze oraz surfaktanty i leki takie jak środki rozszerzające oskrzela, środki przeciwalergiczne, cytostatyczne, przeciwwirusowe, przeciwzapalne i przeciwgrzybicze.

Dawki występować mogąw postaci ciekłej lub w postaci proszku. Środki lecznicze według wynalazku można pakować w szczelne pojemniki, takie jak fiolki i ampułki i przechowywać jako sterylne kompozycje. Najkorzystniejszy sposób przeprowadzenia wynalazku.

Poniżej wynalazek zostanie opisany bardziej szczegółowo w odniesieniu do następujących przykładów.

(1) Wytwarzanie peptydu

W poniższych przykładach, ciężar cząsteczkowy zsyntetyzowanego peptydu mierzono metodą spektrometrii mas z bombardowaniem szybkimi atomami (FABMS). Stosowano analizator mas JMS-S102A (produkcji JEOL. Ltd.), a jako źródło jonów stosowano pistolet cezowy (10KeeV).

Przykład 1

Peptyd (peptyd A) przedstawiony [sekwencjąnr 5] syntetyzowano na powierzchni żywicy fenyloacetoamidometylowej (PAM) metodą syntezy w fazie stałej, zgodnie ze sposobem opisanym w „The Peptides” (wyd. E, Gross i J. Meinenhofe J., autorzy G. Barany i R. Merrifield, vol. 2, strony 1-284, A-cademic Press, Nowy Jork 1980).

C-końcową resztę leucyny przekształcono w t-butyloksykarbonylo-leucynę (Boc-Leu) i związano z żywicąPAM poprzez wiązanie oksymetylofenyloacetamidometylowe. Po związaniu C-końca, żywicę Boc-Leu-PAM (0,70 mola/g, 0,35 g) przeniesiono do naczynia reakcyjnego syntetyzerapeptydów (Model 990E, Beckman Instruments, Inc.) Następnie aminokwasy, do których przyłączono grupy ochronne, dodano w kierunku N-końca na powierzchni żywicy stosując metodę z symetrycznym bezwodnikiem i wytworzono całkowicie chroniony peptyd-O-żywica. Przy kondensacji argininy prowadzono podwójne sprzęganie stosując N,N-dicykloheksylokarbodiimid/hydroksybenzotriazol [Connie i in., Chem. Ber., 103,788-798 (1970)].

N-końcowe grupy aminowe wszystkich aminokwasów chroniono grupą ochronną Boc, a funkcyjne łańcuchy boczne, przed użyciem aminokwasów w reakcji, chroniono następującymi grupami:

Arg-Tos: (tosyl)

Lys-2CLZ: (2-chlorobenzyloksykarbonyl)

Cys-4MeBzl: (4-metylobenzyl)

His-Tos: (toksyl)

Reakcje kondensacji prowadzoną metodą Kaisera z użyciem ninhydryny. Całkowicie chroniony peptyd-O-żywica (155 g) poddano spęcznianiu przez 5 minut w dichlorometanie. Następnie usunięto grupy ochronne N-οι- Boc za pomocą TFA zawierającego 1% (obj./obj.) indolu i 0,1% (obj./obj.) etanoditiolu. Następnie peptyd odszczepiono od żywicy, traktując przez 60 minut w temperaturze 0°C niechroniony peptyd-O-żywica bezwodnikiem fluorowodoru (HF) (11 ml), do którego dodano p-krezolu (1 ml), p-tiokrezolu (0,2 g) i DMSO (1 ml).

HF i DMSO oddestylowano pod próżnią w temperaturze 0°C. Usunięty peptyd i żywicę przemyto trzy razy zimnym eterem dietylowym (15 ml) i usunięty peptyd ekstrahowano przemywając cztery razy zimnym TFA (5 ml). Ekstrakty natychmiast przesączono i dodano wody z lodem (150 ml), aby wytrącić surowy peptyd. Surowy peptyd odwirowano przy 1000 x g w temperaturze 0°C przez 30 minut i odzyskano w postaci osadu. Osad ten przemyto eterem dietylowym (15 ml). Po powtórzeniu operacji przemywania z użyciem eteru dietylowego, octanu etylu i destylowanej wody, otrzymano 84 g peptydu A.

Ten surowy peptyd rozpuszczono w 50% wodnym roTtworze DMSO i oczyszczono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (HPLC), stosując μ-Bondaspheres i kolumnę C8-300 do zebrania surowego peptydu A.

180 020

Eluowanie prowadzono przez 5 minut, stosując jako eluent 50% wodny roztwór acetonitrylu, zawierający 0,1% TFA. Następnie przez 30 minut prowadzono eluowanie, z użyciem liniowego gradientu stężenia powyższych eluentów i 80% wodny roztwór acetonitrylu, zawierający 0,1% TFA.

Obecność peptydu w eluacie określono przy 245 nm (spektrometr; Japan Spectroscopic Co., ltd. Model 870-UV) z refraktometrem różnicowym (ShimadzuManufacturing Corporation, Model RIG-6A).

FABMS (M + IT); 3837,1 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 3835,9).

Przykład 2

Peptyd (peptydB) o sekwencji nr 6 syntetyzowano metodą syntezy w fazie stałej z zastosowaniem układu do syntezy mulipeptydów w fazie stałej,,,Kokku-San” (nazwa handlowa, Kokusan Chemical Wbrks Co. Ltd.), i zgodnie ze sposobem opisanym w „Solid Phase Peptide Synthesis - APractical Approach”, E. Atherton i R.C. Sheppard (strony 25-189, Oxford University Press, Oxford) i przez Kenichi Akagi i in. (Chem. Pharm. Buli., 37(10), strony 2661-2664, 1989).

Jako żywicę wyjściową stosowano żywicę Ν-α-9-fluorenylometyloksykarbonylo-lecyno-O-żywicę (Fmoc-Leu-O-żywica) (0,20 mmola/0,5 g), w której Ν-α-9-fluorenylometyloksykarbonylo-leucyna (Fmoc-Leu) jest związana z kopolimerem 4-(hydroksymetylo)fenoksymetylowym (styren 1% diwinylobenzen). Żywicę tę poddawano spęcznieniu przez 20 minut z Ν,Ν-dimetylofoimamidem (DMF), po czym przemyto cztery razy DMF. Następnie dodano 20% roztworu piperydyny w DMF i mieszaninę wytrząsano, aby usunąć grupy ochronne. Operacje tę powtórzono trzy razy, aby całkowicie usunąć grupy ochronne. Następnie trzykrotnie przemyto DMF, trzy razy N-metylo-2-pirolidonem i ponownie trzy razy DMF, aby usunąć nadmiar piperydyny w żywicy. W tym momencie sprawdzono obecność piperydyny stosując papierek wskaźnikowy do pomiaru pH.

Następnie dodano DMF (6 ml), Fmoc-Leu (0,5 mmola), N-hydroksybenzotriazolu (0,5 mmola) i N,N'-diizopropylokarbodiimidu (0,5 mmola) i mieszaninę wytrząsano przez 90 minut, aby przeprowadzić reakcję kondensacji. Następnie żywicę przemyto cztery razy DMF, aby usunąć nadmiar reagentów. Reakcję kondensacji sprawdzono za pomocątestu Kaiseraz użyciem ninhydryny.

Kontynuowano syntezę dodając aminokwasy krok po kroku w kierunku N-końca na powierzchni żywicy, tworząc tym samym peptyd-O-żywica z N-końcem i całkowicie chronionymi grupami funkcyjnymi.

Reakcje kondensacji dla wprowadzenia Arg, Lys, His, Pro i Cys prowadzono dwa razy, przez 120 minut każdą.

Następnie do chronionego peptydu-O-żywicy dodano 20% roztworu pirydyny w DMF, aby usunąć grupę ochronną Fmoc przy N-końcu. Potem peptyd -O-żywicę przemyto sześć razy DMF i sześć razy metanolem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Do wysuszonego peptydu-O-żywicy (100 mg) podczas mieszania i oziębiania lodem dodano następnie m-krezolu (0,2 ml), 1,2-etanoditiolu (0,5 ml), tioanizolu (1,2 ml), TFA (7,5 ml) i bromku trimetylosililu (1,4 ml). Mieszaninę mieszano przez 120 minut, oziębiając lodem, aby usunąć grupy ochronne z funkcyjnych łańcuchów bocznych i aby usunąć peptyd z żywicy, po czym przesączono przez filtr szklany (G3). Przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do około 5 ml, stosując wyparkę. Dodano eteru dietylowego i wytrącił się peptyd. Zebrano osad peptydu na filtrze szklanym (G3), przemyto pięć razy eterem dietylowym i po wysuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano 60 mg peptydu B.

Przed użyciem aminokwasów w reakcji N-końcowe grupy aminowe wszystkich aminokwasów chroniono grupami Fmoc, a funkcyjne łańcuchy boczne chroniono następującymi grupami:

Arg-Mtr: (4-metoksy-2,3,6-trimetylobenzenosulfonyl)

180 020

Lys-Boc: (t-butyloksykarbonyl)

Cys-Trt: (trityl)

His-Trt: (trityl)

Około 100 mg surowego peptydu rozpuszczono w TFA (1 ml) i dodano czterokrotną ilość rozpuszczalnika jako ruchomej fazy, to znaczy 10 mM β-merkaptoetanolu w mieszaninie TFAdichlorometan (5:95, obj./obj.), aby przygotować 20 mg/ml próbkę roztworu do oczyszczenia metodą HPLC, z zastosowaniem kolumny Asahipak GS-510 (Φ 7,5 x 50 mm) (nazwa handlowa; Asahi Chemical Industry Co. Ltd.), i w ten sposób zebrano surowy peptyd B.

Jako eluent stosowano 10 mM β-merkaptoetanol w mieszaninie TFA i dichlorometanu (5:95, obj./obj.) i eluowanie prowadzono z szybkością przepływu 0,8 ml/min przez 80 minut. Obecność peptydu w eluacie określano przy 245 nm (spektrofotometr; Japan Spectroscopic Co., Ltd. Model 870-UV) z refraktometrem różnicowym (Shimadzu Corporation, Model RID-6A).

FABMS (M + H⁺); 3017,9 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 3016,9).

Przykład 3

Peptyd (peptyd C) o [sekwencji nr 7] wytworzono w ten sam sposób jak wprzykładzie 2.

FABMS (M + H⁺); 3116,0 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 3115,1).

Przykład 4

Peptyd (peptyd D) o [sekwencji nr 8] wytworzono w ten sam sposób jak w przykładzie 2.

FABMS (M + H⁺); 2663,7 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 2662,5).

Przykład 5

Peptyd (peptyd E) o [sekwencj i nr 9] wytworzono w ten sam sposób j ak w przykładzie 2.

FABMS (Μ + H⁴); 2211,2 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 2209,9).

Przykład 6

Peptyd(peptydF) o [sekwencjinr 10] wytworzono wtensamsposóbjakwprzykładzie2.

FABMS (M + H⁺); 2647,5 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 2646,4).

Przykład 7

Peptyd (peptyd G) o [sekwencji nr 11 ] wytworzono w ten sam sposób jak wprzykładzie 2.

FABMS (M + H⁺); 3018,1 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 3016,9).

Przykład 8

Peptyd (peptyd H) o [sekwencji nr 12] syntetyzowano metodą syntezy w fazie stałej stosując układ do syntezy multipeptydów w fezie stałej w ten sam sposób jak w przykładzie 2.

Jak żywicę wyjściową stosowano Ν-α-9-fluorenylometyloksykarbonylo-norleucyno-O-żywica (Fmoc-Nle-O-żywica) (0,20 mmola/0,5 g). Żywicę tę poddano spęcznianiu przez 20 minut z DMF, po czym cztery razy przemyto DMF. Następnie dodano 20% roztworu piperydyny w DMF i mieszaninę wytrząsano, aby usunąć grupy ochronne. Operację tę powtórzono trzykrotnie, aby grupy ochronne zostały całkowicie usunięte. Następnie dziewięć razy przemyto DMF, aby usunąć nadmiar piperydyny w żywicy. W tym momencie sprawdzono obecność resztkowej piperydyny stosując papierek wskaźnikowy do kontrolowania pH.

Następnie dodano DMF (6 ml), Fmoc-Nle (0,5 mmola), N-hydroksybenzotriazolu (0,5 mmola) i Ν,Ν'-diizopropylokarbodiimidu (0,5 mmola) i mieszaninę wytrząsano przez 90 minut, aby przeprowadzić reakcję kondensacji. Żywicę przemyto cztery razy DMF, aby usunąć nadmiar reagentów. Reakcję kondensacji badano metodą Kaisera z użyciem ninhydryny.

Kontynuowano kondensację, krok po kroku dodając aminokwasy w kierunku N-końca na powierzchni żywicy, wytwarzając w ten sposób peptyd-O-żywicę z całkowicie chronionymi grupami N-końcowymi i funkcyjnymi.

Aby wprowadzić Arg, Lys, His, Pro i Cys reakcję kondensacji prowadzono dwukrotnie, za każdym razem przez i 20 minut.

Następnie do chronionego peptydu-O-żywicy dodano 20% roztworu pirydyny w DMF, aby usunąć grupy ochronne Fmoc przy N-końcu. Peptyd -O-żywicę przemyto następnie trzy razy

180 020

DMF i sześć razy metanolem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Do wysuszonego peptydu-O-żywicy (100 mg) podczas mieszania i oziębiania lodem dodano następnie m-krezolu (0,2 ml), 1,2-etanoditiolu (0,5 ml), tioanizolu (1,2 ml), TFA (7,5 ml) i bromku trimetylosililu (1,4 ml). Mieszaninę mieszano przez 120 minut, oziębiając lodem, aby usunąć grupy ochronne z funkcyjnych łańcuchów bocznych i aby usunąć peptyd z żywicy, po czym przesączono przez filtr szklany (G3). Przesącz zatęźono po zmniejszonym ciśnieniem do około 5 ml, stosując wyparkę. Dodano eteru dietylowego i wytrącił się peptyd. Zebrano osad peptydu na filtrze szklanym (G3), przemyto pięć razy eterem dietylowym i po wysuszeniu pod zmniej szonym ciśnieniem otrzymano 65 mg peptydu H.

Arg-Mtr: (4-metoksy-2,3,6-trimetylobenzenosulfonyl)

Lys-Boc: (t-butyloksykarbonyl)

Cys-Trt: (trityl)

His-Boc: (t-butyloksykarbonyl)

Około 100 mg peptydu rozpuszczono w 3 ml mieszaniny rozpuszczalników chloroformu i metanolu (C/M) 2:1 (obj./obj.). Następnie próbkę oczyszczono na kolumnie Sephadex LH-60 (Φ 2,5 cm x 90 cm), którązrównowaźonąmieszaninąrozpuszczalników C/M 2:1 (obj./obj.) i zebrano surowy peptyd H.

Obecność peptydu w eluacie określono przy 245 nm (spektrofotometr; Japan Spectroscopic Co., Ltd. Model 870-UV) z refraktometrem różnicowym (Shimadzu Corporation, Model RID-6A).

FABMS (M + H⁺); 2663,6 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 2662,5).

Przykład 9

Peptyd (peptyd I) o [sekwencji nr 13] wytworzono w taki sam sposób jak wprzykładzie 8. FABMS (M + H⁺); 2560,4 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 2559,3).

Przykład 10

Peptyd (peptyd J) o [sekwencji nr 14] wytworzono w taki sam sposób jak w przykładzie 8. FABMS (M + H⁺); 2663,8 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 2662,5).

Przykład 11

Peptyd (peptydK) o [sekwencjinr 14] wytworzono wtaki sam sposóbjakwprzykładzie 2. FABMS (M + EU); 2663,5 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 2662,5).

Przykład 12

Peptyd (peptyd L) o [sekwencji nr 16] wytworzono w taki sam sposób jak w przykładzie 2. FABMS (M + H⁺); 2503,6 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 2502,4).

Przykład 13

Peptyd (peptyd M) o [sekwencji nr 17] wytworzono w taki sam sposóbjakwprzykładzie 2. FABMS (M + H⁺); 2736,7 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 2735,5).

Przykład 14

Peptyd (peptydN) o [sekwencji nr 18] wytworzono wtaki sam sposóbjakwprzykładzie2. FABMS (M + H⁺); 2640,4 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 2639,4).

Przykład 15

Peptyd (peptyd O) o [sekwencjinr 19] wytworzono wtaki sam sposóbjakwprzykładzie 8. FABMS (M + HU); 2640,3 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 2639,4).

Przykład 16

Fmoc-Pro-Val-His(Trt)-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr)

Tytułowy peptyd (peptyd P) syntetyzowano metodą syntezy w fazie stałej, stosując Peptide Synthesizer System 9050 (Millipore Corp.).

180 020

Przykład 19

Peptyd R wytworzono przez estryfikowanie grup tiolowych peptydu E za pomocą kwasu palmitynowego, zgodnie z metodą opisanąprzez Sarin, Virender i Kumar (EP 0 458 167A1).

FABMS (M + M⁺); 2448,5 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 2448,3).

Przykład porównawczy 1

Peptyd (peptyd S), o [sekwencji nr 20] wytworzono w ten sam sposób, jak wprzykładzie 2.

FABMS (M + M⁺); 3793,8 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 2792,6).

Przykład porównawczy 2

Peptyd (peptyd T), o [sekwencji nr 21 ] wytworzono w ten sam sposób, jak w przykładzie 2.

FABMS (M + M⁺); 3018,3 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 3016,9).

Analiza składu aminokwasów syntetycznych peptydów według wynalazku.

Syntetyczne peptydy według wynalazku poddano hydrolizie kwasowej, stosując 12N roztwór HC1-TFA [2:1, (obj./obj.)], zawierający 5% (wag./obj.) ], fenolu, w warunkach próżni i w temperaturze 150°C, przez 1,2,4,6,12,24,48 i 72 godziny, i produkty hydrolizy, po usunięciu kwasu, poddano analizie, stosując urządzenie Shimadzu Automatic Amino Acid Analysis System (LC-9A). Trp z peptydu M poddano hydrolizie zasadowej stosując 4,2 N wodny roztwór wodorotlenku sodu przez 16,24 i 32 godziny, po czym zobojętniono HC1 i analizowano, stosując Amino Acid Analysis System. Skład aminokwasów, wyliczony na podstawie wartości aminokwasów, która wskazuje wyższe odzyski przy hydrolizie w czasie 1 do 72, wykazuje wartości zasadniczo zgodne z wartościami wyliczonymi na podstawie wzorów chemicznych.

Wyniki przedstawiono w tabeli 1.

Peptyd

Aminokwi	A	B	c	D	E	F	G	H	I	J	K	L	M	N	0	S	T
Lys	1,1	0,9	1,0	0,8	0,9	1,0	0,7	0,7	1,1	1,1	0,9	13	0,9	1,1	0,9	1,3	0,9
Arg	1,0	1,1	0,9	0,8	0,9	0,7	0,8	0,9	1,0	0,9	1,0	l,o	1,1	1,1	1,2	1,0	13
His	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	-	-	1,0	1,0
Gly	33	1,2	-	-	-	-	1,1	-	-	-	-	-	-	-	-	1,1	1,0
Ser	-		-	-	-	0,8	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Cys	1,9	1,3	1,0	0,9	1,1	-	0,8	0,7	-	0,7	0,9	0,8	0,6	0,7	0,8	0,6	0,8
Ala	0,9	1,0	-	-	-	-	0,8	-	-	-	-	-	-	-	-	1,1	0,9
Val	0,9	1,0	0,8	0,9	0,8	1,2	0,8	0,8	0,9	1,1	1,0	3,9	0,9	1,0	0,9	16,5	0,9
Leu	19,5	18,7	20,5	16,8	13,1	16,9	3,1	1,1	0,9	8,9	13,6	11,8	15,7	16,8	-	2,8	2,7
Ile	1,0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	2,9	-	-	-	0,9	-	15,6
Met	1,1
Pro	23	13	0,9	0,7	0,8	0,8	0,7	0,9	0,8	0,9	1,1	0,8	1,0	1,2	1,0	1,0	1,0
Phe	0,9
Nie	-	-	-	-	-	-	15,7	15,9	16,1	7,9	-	-	-	-	15,8	-	-
Nva												2,1
Trp													-0,9
Asx														1,0	1,0	-	-

(Wartości podane są dla peptydów. w których zawartość His wynosi 1.0. z wyjątkiem peptydów N i O. dla których podane są wartości dla przypadku, gdy Asx wynosi 1,0)

180 020

Jako żywicę wyjściową stosowano N-a-9-fluorenylometylokarbonylo-N-G>4-metoksy-2,3,6-trimetylobenzenosulfonylo-arginino-O-źywicę (Fmoc-Arg(Mtr)-O-żywica (0,20 mmola), w której N-a-9-fhiorenylometylokarbonylo-N-m4-metoksy-2,3,6-trimetylobenzenosulfonylo-arginina jest przyłączona do 2-metoksy-4-alkoksybenzyloalkohol-żywicy (żywica Sasrin, nazwa handlowa firmy Bachem Co., Ltd.), a aminokwasy dodawano krok po kroku w kierunku N-końca na powierzchni żywicy, zgodnie z protokołem Pęptide Synthesizer System 9050, aby wytworzyć związek peptyd-O-żywica z całkowicie chronionymi grupami N-końcowymi i funkcyjnymi.

Następnie całkowicie chroniony związek peptyd-O-żywica przemyto pięć razy metanolem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie do suchego związku peptyd-O-żywica (330 mg) podczas mieszania i oziębiania lodem, dodano roztworu TFA-dichlorometan (1:99, obj./obj.). Mieszaninę mieszano oziębiając w lodzie przez 30 minut, po czym w temperaturze pokojowej przez 90 minut, aby usunąć peptyd z żywicy, wraz z grupami ochronnymi jeszcze przyłączonymi do peptydu. Następnie mieszaninę przesączono przez filtr szklany (G3), a przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do objętości około 5 ml, przy użyciu wyparki. Następnie dodano eteru dietylowego, aby wytrącić peptyd. Osad peptydu zebrano na filtrze szklanym (G3), po czym przemyto pięć razy eterem dietylowym i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. W ten sposób otrzymano 180 mg peptydu P.

Arg-Mtr: (4-metoksy-2,3,6-trimetylobenzenosulfonyl)

Lys-Boc: (t-butyloksykarbonyl)

His-Trt: (trityl)

Do surowego peptydu dodano roztworu TFA-dichlorometan (1:99, obj./obj.), aby przygotować 10 mg/ml próbki roztworu, który poddano oczyszczeniu metodąHPLC, stosując kolumnę Asahipak GS-510 (Φ 21,5 x 500 mm) (nazwa handlowa; Asahi Chemical Industry Co. Ltd.) i zebrano surowy peptyd P.

Jako eluent stosowano roztwór TFA-dichlorometan (1:99, obj./obj.), a elucję prowadzono przy szybkości przepływu 8,1 ml/min. przez 120 minut. Obecność peptydu w eluacie określano przy 245 nm (spektrofotometr; Japan Spectroscopic Co., Ltd. Model 870-UV) z refraktometrem różnicowym (Shimadzu Corporation, Model RID-6A).

FABMS (Μ + M⁴); 1405,0 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 1403,8).

Przy kład 17

H-Nle-(Nle)14-Nle-O-żywica syntetyzowano zgodnie z metodą syntezy multipeptydów w fazie stałej, jak w przykładzie 8.

Następnie, po dodaniu do syntetyzowanego H-Nle(Nle)14-Nle-O-żywica DMF, zamiast Fmoc-Arg(Mtr) dodano peptydu P.

Następnie dodano N-hydroksybenzotriazolu i Ν,Ν'-diizopropylokarbodiimidu i mieszaninę wytrząsano przez 8 godzin. Reakcję kondensacji prowadzono 2 razy. Reakcję sprawdzono metodą Kaisera z użyciem ninhydryny.

Następnie, zgodnie ze sposobem opisanym w przykładzie 8, usunięto grupy ochronne grup funkcyjnych, a peptyd usunięto z żywicy i oczyszczono metodą HPLC i otrzymano peptyd I o [sekwencji nr 13].

FABMS (M + M⁺); 2560,2 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 2559,3).

Przykład 18

Peptyd (peptyd Q), zawierający grupy tiolowe z peptydu D, w postaci acetoamidometylowanej (ACM), wytworzono w taki sam sposób jak w przykładzie 4, ale zamiast Fmoc-Cys (Trt) stosowano Fmoc-Cys(ACM).

FABMS (M+ H⁺); 2734,7 (wyliczony ciężar cząsteczkowy: 2733,6).

180 020 (2) Wytwarzanie surfaktantów według wynalazku

Surfaktanty według wynalazku wytworzono przez zmieszanie peptydów według wynalazku z trzema składnikami lipidowymi, fosfoglicerydem choliny, fosfolipidem kwasowym i analogiem kwasu tłuszczowego.

Przykład 20

Wyjałowione porcje l,2-dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholiny (1350 mg), 1,2-diacylo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-gliceryny (z grupą acylową zawierającą 14-24 atomów węgla; wytwarzana przez Sigma Chemical Co., Ltd.) (450 mg) i kwasu mirystynowego (200 mg) w temperaturze pokojowej rozpuszczono w mieszaninie chloroformu i metanolu [2:1, (obj./obj.)], (1000 ml), a 25 mg peptydu A rozpuszczono w TFA (1,0 ml). Roztwory te zmieszano razem, a następnie wysuszono i zestalono pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskanąpozostałość zawieszono w mieszaninie woda-etano [9:1, (obj./obj.)] (100 ml) w ciągu 15 minut w temperaturze 40°C. Po zamrożeniu tej zawiesiny w -50°C i wysuszeniu przez 36 godzin pod próżnią pod ciśnieniem 85-100 gHg, otrzymano surfaktant (2070 mg) w postaci białego proszku.

W proszku tym nie stwierdzono wykrywalnych ilości etanolu, a zawartość poszczególnych składników w odniesieniu do całkowitego ciężaru surfaktanta wynosiła: 65,2% (wag./wag.) dla l,2-dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholiny, 21,7% (wag./wag.) dla l,2-diacylo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-gliceryny, 9,7% (wag./wag.) dla kwasu mirystynowego, 1,2% (wag./wag.) dla peptydu A i 2,2% (wag./wag.) dla wody.

Przykład 21 l,2-dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholinę (300,0 mg), l,2-diacylo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerynę (z grupąacylowązawierającą 14-24 atomów węgla; wytwarzanąprzez Sigma Chemical Co. Ltd.) (100,0 mg) i kwas palmitynowy (40,0 mg) rozpuszczono w mieszaninie chloroformu i metanolu [2:1, (obj./obj.)] (300 ml) i 10,0 mg peptydu B rozpuszczono w mieszaninie chloroformu i metanolu [2:1, (obj./obj.)] (2,0 ml). Roztwory te zmieszano razem, a następnie wysuszono i zestalono pod zmniejszonym ciśnieniem. Przez 20 minut w temperaturze 45°C wytworzono zawiesinę uzyskanej pozostałości w mieszaninie woda-etanol [9,1, (obj ./obj.)] (100 ml). Po zamrożeniu tej zawiesiny w -60° i wysuszeniu przez 40 godzin podpróżniąpod ciśnieniem 60-110 μHg, otrzymano 459,1 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

W proszku tym nie stwierdzono wykrywalnych ilości etanolu, a zawartość poszczególnych składników w odniesieniu do całkowitego ciężaru surfaktanta wynosiła: 65,3% (wag./wag.) dla l,2-dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholiny, 21,8% (wag./wag.) dla l,2-diacylo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-gliceryny, 8,7% (wag./wag.) dla kwasu palmitynowego, 2,2% (wag./wag.) dla peptydu B i 2,0% (wag./wag.) dla wody.

Przykład 22 l,2-dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholinę (280,0 mg), l,2-dilauroilo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerynę (120,0 mg) i kwas palmitynowy (27,0 mg) rozpuszczono w mieszaninie chloroformu i metanolu [2:1, (obj ./obj.)] (150 ml) i w mieszaninie chloroformu i metanolu [2:1, (obj ./obj.)] (0,5 ml) rozpuszczono 2,8 mg peptydu C. Roztwory te zmieszano razem, a następnie wysuszono i zestalono pod zmniejszonym ciśnieniem. Przez 45 minut w temperaturze 40°C wytworzono zawiesinę uzyskanej pozostałości w mieszaninie woda-etanol [8:2 (obj./obj.)] (100 ml). Po zamrożeniu tej zawiesiny w -65° i wysuszeniu przez 36 godzin pod próżniąpod ciśnieniem 50-80 μHg, otrzymano 437,6 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

W proszku tym nie stwierdzono wykrywalnych ilości etanolu, a zawartość poszczególnych składników w odniesieniu do całkowitego ciężaru surfaktanta wynosiła: 64,0% (wag./wag.) dla l,2-dipahnitoiloglicero-(3)-fosfocholiny, 27,4% (wag./wag.) dla l,2-dilauroilo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-gliceryny, 6,2 (wag./wag.) dla kwasu palmitynowego, 0,6% (wag./wag.) dla peptydu C i 1,8% (wag./wag.) dla wody.

180 020

Przykład 23

Powtórzono te same czynności, jak w przykładzie 21, ale zamiast peptydu B stosowano peptyd D, a zamiast l,2-diacylo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-gliceryny (z grupą acylową zawierającą 14-24 atomów węgla, produkowanej przez Sigma Chemical Co., Ltd.) stosowano 1-palmitoilo-2-oleilo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerynę, i wytworzono 451,9 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

W proszku tym nie stwierdzono wykrywalnych ilości etanolu, a zawartość poszczególnych składników w odniesieniu do całkowitego ciężaru surfaktanta wynosiła: 66,4% (wag./wag.) dla l,2-dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholiny, 22,1% (wag./wag.) dla l-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-gliceryny, 8,9 (wag./wag.) dla kwasu palmitynowego, 2,2% (wag./wag.) dla peptydu D i 0,4% (wag./wag.) dla wody.

Przykład 24 l,2-dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholinę (320,0 mg), l,2-dimirystoilo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerynę (80,0 mg) i kwas palmitynowy (60,0 mg) rozpuszczono w mieszaninie chloroformu i metanolu [1:1, (obj ./obj.)] (200 ml), a peptyd E rozpuszczono w TFA (0,2 ml), Roztwory te zmieszano razem, a następnie wysuszono i zestalono pod zmniejszonym ciśnieniem, przez 60 minut w temperaturze 45°C wytworzono zawiesinę uzyskanej pozostałości w mieszaninie woda-etanol [10:1, (obj ./obj .)](50 ml). Po zamrożeniu tej zawiesiny w -45° i wysuszeniu przez 24 godziny pod próżnią pod ciśnieniem 50-110 μ Hg, otrzymano 479,2 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

W proszku tym nie stwierdzono wykrywalnych ilości etanolu, a zawartość poszczególnych składników w odniesieniu do całkowitego ciężaru surfaktanta wynosiła: 66,8% (wag./wag) dla l,2-dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholiny, 16,7% (wag./wag.) dla 1,2-dimirystoilo-sn-glicero-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-gliceryny, 12,5% (wag./wag.) dla kwasu palmitynowego, 2,9% (wag./wag.) dla peptydu E i 1,1% (wag./wag.) dla wody.

Przykład 25

Powtórzono te same czynności, jak w przykładzie 21, ale zamiast peptydu B (10,0 mg) stosowano peptyd F (22,0 mg) i zamiast 1,2-diacylo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-gliceryny (z grupąacylową zawierającą 14-24 atomów węgla; wytwarzanej przez Sigma Chemical Co., Ltd.) stosowano l,2-distearoilo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerynę, i wytworzono 463,9 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

W proszku tym nie stwierdzono wykrywalnych ilości etanolu, a zawartość poszczególnych składników w odniesieniu do całkowitego ciężaru surfaktanta wynosiła: 64,7% (wag./wag.) dla l,2-dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholiny, 21,6% (wag./wag.) dla l,2-distearoilo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-gliceryny, 8,6% (wag./wag.) dla kwasu palmitynowego, 4,7% (wag./wag.) dla peptydu F i 0,4% (wag./wag.) dla wody.

Przykład 26

Powtórzono te same czynności, jak w przykładzie 21, ale zamiast peptydu B stosowano peptyd G i wytworzono 454,1 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

W proszku tym nie stwierdzono wykrywalnych ilości etanolu, a zawartość poszczególnych składników w odniesieniu do całkowitego ciężaru surfaktanta wynosiła: 66,1% (wag./wag.) dla l,2-dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholiny, 22,0% (wag./wag.) dla l,2-acylo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-gliceryny ( z grupą acylową zawierającą 14-24 atomów węgla; produkcji Sigma Chemical Co., Ltd.), 8,8% (wag./wag.) dla kwasu palmitynowego, 2,2% (wag./wag.) dla peptydu G i 0,9% (wag./wag) dla wody.

Przykład27

1,2 -dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholinę (210 mg), l,2-diacylo-sn-glicero-(3)-fostb-sn-glicerynę (z grupą acylową zawierającą 14-24 atomów węgla; produkcji Sigma Chemical Co., Ltd.) (90,0 mg) i kwas stearynowy (33,0 mg) rozpuszczono w mieszaninie chloroformu i metano

180 020 lu [3:1, (obj ./obj.)](100 ml), apeptyd Η (1,9 mg) rozpuszczono w metanolu (0,5 ml). Roztwory te zmieszano razem, a następnie wysuszono i zestalono pod zmniejszonym ciśnieniem. Przez 15 minut w temperaturze 50°C wytworzono zawiesinę uzyskanej pozostałości w mieszaninie woda-etanol [9:1, (obj ./obj.)] (90 ml). Po zamrożeniu tej zawiesiny w -55°C i wysuszeniu przez 28 godzin pod próżnią, pod ciśnieniem 100-120 μHg, otrzymano 340,2 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

W proszku tym nie stwierdzono wykrywalnych ilości etanolu, a zawartość poszczególnych składników w odniesieniu do całkowitego ciężaru surfaktanta wynosiła: 61,7% (wag./wag.) dla l,2-dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholiny, 26,5% (wag./wag.) dla l,2-diacylo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-gliceryny, 9,7% (wag./wag.) dla kwasu stearynowego, 0,5% (wag./wag.) dla peptydu H i 1,6% (wag./wag.) dla wody.

Przykład 28 l,2-dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholinę (210,0 mg), l,2-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-(3)-fosfo-L-serynę (90,0 mg) i kwas palmitynowy (33,0 mg) rozpuszczono w mieszaninie chloroformu i metanolu [4:1, (obj./obj.)] (100 ml), apeptydI (11,0) rozpuszczono w TFA (0,5 ml). Roztwory te zmieszano razem, a następnie wysuszono i zestalono pod zmniejszonym ciśnieniem. Przez 25 minut w temperaturze 45°C wytworzono zawiesinę uzyskanej pozostałości w mieszaninie woda-etanol [9:1 (obj./obj.)] (110 ml). Po zamrożeniu tej zawiesiny w -55°C i wysuszeniu przez 28 godzin pod próźniąpod ciśnieniem 100-120 μHg, otrzymano 348,7 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

W proszku tym nie stwierdzono wykrywalnych ilości etanolu, a zawartość poszczególnych składników w odniesieniu do całkowitego ciężaru surfaktanta wynosiła: 60,2% (wag./wag.) dla l,2-dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholiny, 25,8% (wag./wag.) dla l-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-(3)-fosfo-L-seryny, 9,5% (wag./wag.) dla kwasu palmitynowego, 3,2% (wag./wag.) dla peptydu I i 1,3% (wag./wag.) dła wody.

Przykład 29

Powtórzono te same czynności, jak w przykładzie 21, ale zamiast peptydu B stosowano peptyd J, i otrzymano 459,3 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

Przykład 30

Powtórzono te same czynności, jak w przykładzie 21, ale zamiast peptydu B stosowano peptyd K, i otrzymano 452,5 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

Przykład 31

Powtórzono te same czynności, jak w przykładzie 21, ale zamiast peptydu B stosowano peptyd L, i otrzymano 456,6 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

Przykład 32

Powtórzono te same czynności, jak w przykładzie 21, ale zamiast peptydu B stosowano peptyd M, i otrzymano 453,9 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

Przykład 33

Powtórzono te same czynności, jak w przykładzie 21, ale zamiast peptydu B stosowano peptyd N, i otrzymano 452,5 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

Przykład 34

Powtórzono te same czynności, jak w przykładzie 21, ale zamiast peptydu B stosowano peptyd O, i otrzymano 458,1 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

Pr zykład 35 l-dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholinę (30,0 mg), l,2-diacylo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-glicerynę (z grupą acylową zawierającą 14-24 atomów węgla; wytworzonąprzez Sigma Chemical Co., Ltd.) (10 mg) i kwas palmitynowy (4,0 mg) rozpuszczono w mieszaninie chloroformu i metanolu [2:1, (obj./obj.)](30 ml), a peptyd Q rozpuszczono również w mieszaninie chloroformu i metanolu [2:1, (obj./obj.)] (2,0 ml). Roztwory te zmieszano razem, a następnie wysuszono i ze

180 020 stalono pod zmniejszonym ciśnieniem. Przez 20 minut w temperaturze 45°C wytworzono zawiesinę uzyskanej pozostałości w mieszaninie woda-etanol [9:1 (obj./obj.)] (10 ml). Po zamrożeniu tej zawiesiny w -60°C i wysuszeniu przez 36 godzin pod próżniąpod ciśnieniem 60-120 gHg, otrzymano 45,4 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

W proszku tym nie stwierdzono wykrywalnych ilości etanolu, a zawartość poszczególnych składników w odniesieniu do całkowitego ciężaru surfaktanta wynosiła: 66,1% (wag./wag.) dla l,2-dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholiny, 22,0% (wag./wag.) dla l,2-diacylo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-gliceryny, 8,8% (wag./wag.) dla kwasu palmitynowego, 2,2% (wag./wag.) dla peptydu Q i 0,9% (wag./wag.) dla wody.

Przykład 36

Powtórzono te same czynności, jak w przykładzie 35, ale zamiast peptydu Q stosowano peptyd R, i wytworzono 45,7 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

Pr zykład porównawczy 3

Powtórzono te same czynności, jak w przykładzie 21, ale zamiast peptydu B (10 mg) w mieszaninie chloroformu i metanolu [2:1, (obj./obj.)] (2,0) stosowano roztwór peptydu S (10,0 mg) w TFA (0,3 ml). Wytworzono 455,2 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

W proszku tym nie stwierdzono wykrywalnych ilości etanolu, a zawartość poszczególnych składników w odniesieniu do całkowitego ciężaru surfaktanta wynosiła: 65,9% (wag./wag.) dla l,2-dipalmitoiloglicero-(3)-fosfocholiny, 22,0% (wag./wag.) dla l,2-acylo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-gliceryny (z grupą acylową zawierającą 14-24 atomów węgla, wytworzonej przez Sigma Chemical Co., Ltd.), 8,8% (wag./wag.) dla kwasu palmitynowego, 2,2% (wag./wag.) dla peptydu S i 1,1% (wag./wag.) dla wody.

Przykład porównawczy 4

Powtórzono te same czynności, jak w przykładzie 21, ale zamiast peptydu B (10 mg) w mieszaninie chloroformu i metanolu [2:1, (obj./obj.)] (2,0) stosowano roztwór peptydu T (10,0 mg) w TFA (0,3 ml). Wytworzono 456,0 mg surfaktanta w postaci białego proszku.

W proszku tym nie stwierdzono wykrywalnych ilości etanolu, a zawartość poszczególnych składników w odniesieniu do całkowitego ciężaru surfaktanta wynosiła: 65,8% (wag./wag.) dla l,2-dipahnitoiloglicero-(3)-fosfocholiny, 21,9% (wag./wag.) dla l,2-acylo-sn-glicero-(3)-fosfo-sn-gliceryny ( z grupą acylową zawierającą 14-24 atomów węgla, wytworzonej przez Sigma Chemical Co., Ltd.), 8,8% (wag./wag.) dla kwasu palmitynowego, 2,2% (wag./wag) dla peptydu T i 1,3% (wag./wag) dla wody.

W tabeli 2 przedstawiono wyniki badań surfaktantów według wynalazku na aktywność powierzchniową i wpływ na utrzymanie objętości powierzchni pęcherzyków.

Potencjalne zastosowanie w przemyśle

Jak opisano powyżej, nowe syntetyczne polipetydy według wynalazku są łatwe do wyizolowania i oczyszczenia, mogą być wytwarzane metodami umożliwiającymi produkcję na skalę przemysłową, mają wysoką rozpuszczalność w podstawowych rozpuszczalnikach, wykazują zdolność do tworzenia jednorodnych zawiesin i w porównaniu w konwencjonalnymi kompozycjami wykazują tak samo silne działanie powierzchniowe.

Tak więc, środki według wynalazku wykorzystać można jako środki lecznicze w leczeniu zespołu niewydolności oddechowej, który jest chorobąpowodującąpoważne zaburzenia oddechowe.

180 020

Tab e 1 a 2

Aktywność powierzchniowa i efekt utrzymywania objętości pęcherzyków dla surfaktantów według wynalazku

Nr przykładu	Aktywność powierzchniowa	Efekt utrzymywania objętości pęcherzyków
Efekt obniżania napięcia powierzchniowego	Rozprzestrzenianie się granicy rozdziału faz gaz-ciecz	Zdolność do absorpcji na granicy rozdziału faz gaz-ciecz
Max nN/m	Min mN/m	Czas zrównoważenia sek	Napięcie powierzchni zrównoważone mN/m	Czas zrównoważenia sek	Napięcie powierzchni zrównoważone mN/m	Objętość płuc przy 5 cm H₂O ml/kg
20	29,0	0,2	30	27,5	65	30,3	48
21	24,7	0,5	30	26,7	30	29,2	55
22	32,6	4,3	60	33,1	90	34,8	41
23	26,8	2,5	40	28,5	50	32,3	51
24	33,1	7,3	60	33,5	100	34,6	39
25	33,7	7,4	60	32,8	100	34,2	39
26	27,2	U	60	28,3	40	29,9	49
27	27,2	8,7	60	27,5	50	28,3	46
28	34,1	3,9	60	34,3	95	36,8	40
29	28,0	0,8	30	27,6	30	29,9	53
30	31,5	1,6	50	28,0	80	32,1	47
31	34,2	1,2	60	33,1	100	34,5	40
32	33,7	3,0	30	31,6	60	33,9	44
33	28,7	3,2	30	26,9	50	30,2	51
34	30,8	2,1	50	29,8	70	31,9	49
35	30,1	2,5	40	30,4	50	31,7	49
36	33,4	3,9	60	31,3	90	32,9	45
Porównawczy 3	40,1	10,3	90	37,2	180	41,5	28
Porównawczy 4	39,0	2,5	95	36,4	150	39,7	29

180 020

Tablica Sekwencji

Sekwencja Nr: 1

Długość sekwencji: 35

Postać sekwencji: aminokwas

Topologia: prostółańcuchowa Rodzaj sekwencji: peptyd Sekwencja

Phe Gly Ile Pro Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Yal ¹ 5 10 15

Val Val Val Val Val Leu Ile Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu 20 25 30

Met Gly Leu

Sekwencja Nr: 2

Długość sekwencji: 34

Postać sekwencji: aminokwas

Topologia: prostołańcuchowa

Rodzaj sekwencji: peptyd

Sekwencja

Leu He Pro Cys Cys Pro Val

5

Val Val Yal Val Leu Leu Yal

Asn Ile Lys Arg Leu Leu Ile Yal Yal

15

Yal Val Ile Yal Gly Ala Leu Leu Met

180 020

Sekwencja Nr: 3

Długość sekwencji: 35

Postać sekwencji: aminokwas Topologia: prostołańcuchowa Rodzaj sekwencji: peptyd Sekwencj a

Leu Arg Ile Pro Cys Cys Pro Val Asn Leu Lys Arg Leu Leu Yal Yal ¹ 5 10 15

Val Yal Val Val Val Leu Val Yal Val Yal Ile Val Gly Ala Leu Leu 20 25 30

Met Gly Leu

Sekwencja Nr: 4

Długość sekwencji: 32 Postać sekwencji: aminokwas Topologia: prostołańcuchowa Rodzaj sekwencji: peptyd Sekwencja

Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Yal Val Val Yal Yal 15 10 15

Yal Leu Ile Val Val Yal Ile Yal Gly Ala Leu Leu Met Gly Leu His

25 30

Sekwencja Nr: 5

Długość sekwencji: 35

180 020

Phe Gly Ile Pro Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu 20 25 30

Met Gly Leu

Sekwencja Nr: 6

Długość sekwencji: 27

Postać sekwencji: aminokwas

Topologia: prostołańcuchowa Rodzaj sekwencji: peptyd Sekwencja

Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu

25

Sekwencja Nr: 7

Długość sekwencji: 27

Postać sekwencji: aminokwas

Topologia: prostołańcuchowa

Rodzaj sekwencji: peptyd

Sekwencja

Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu

180 020

Sekwencja Nr: 8 Długość sekwencji: 23 Postać sekwencji: aminokwas Topologia: prostołańouchowa Rodzaj sekwencji: peptyd Sekwencja

Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 20

Sekwencja Nr: 9 Długość sekwencji: 19 Postać sekwencji: aminokwas Topologia: prostołańcuchowa Rodzaj sekwencji: peptyd Sekwencja

Cys Pro Yal His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Leu Leu Leu

Sekwencja Nr: 10

Długość sekwencji: 23 Postać sekwencji: aminokwas Topologia: prostołańcuchowa Rodzaj sekwencji: peptyd Sekwencja

Ser Pro Yal His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 20

180 020

Sekwencja Nr: 11

Długość sekwencji: 27

Postać sekwencji: aminokwas

Topologia: prostółańcuchowa Rodzaj sekwencji: peptyd Sekwencja

Cys Pro Val His Leu Lys Arg Nie Nie Nie Nie Nie Nie Nie Nie Nie 15 10 15

Nie Nie Nie Nie Nie Nie Nie Gly Ala Leu Leu

25

Sekwencja Nr: 12

Długość sekwencji: 23 Postać sekwencji: aminokwas Topologia: prostółańcuchowa Rodzaj sekwencji: peptyd Sekwencja

Cys Pro Val His Leu Lys Arg Nie Nie Nie Nie Nie Nie Nie Nie Nie 15 10 15

Nie Nie Nie Nie Nie Nie Nie 20

Sekwencja Nr: 13

Długość sekwencji: 22 Postać sekwencji: aminokwas Topologia: prostołańcuchowa

180 020

Rodzaj sekwencji: peptyd

Sekwencja

Pro Val His	Leu Lys Arg Nie Nie Nie Nie Nie Nie Nie Nie Nie Nie
1 Nie Nie	Nie	5 Nie Nie Nie 20	10	15
Cys 1 Nie	Pro Nie	Val Nie	Sekwencja Nr: 14 Długość sekwencji: 23 Postać sekwencji: aminokwas Topologia: prostołańcuchowa Rodzaj sekwencji: peptyd Sekwencja His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu 5 10 Nie Nie Nie Nie 20	Leu	Leu	Leu	Leu 15	Nie
			Sekwencja Nr: 15 Długość sekwencji: 23 Postać sekwencji: aminokwas Topologia: prostołańcuchowa Rodzaj sekwencji: peptyd Sekwencj a
Cys 1 Ile	Pro Leu	Val Leu	His Leu Lys Arg Leu 5 Leu Leu Ile Leu 20	Leu Ile Leu 10	Leu	Leu	Leu	Leu 15	Leu

180 020

Sekwencja Nr: 16 Długość sekwencji: 23 Postać sekwencji: aminokwas Topologia: prostołańcuchowa Rodzaj sekwencji: peptyd Sekwencj a

Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Nva Leu Val 15 10 15

Leu Nva Leu Leu Leu Leu Val 20 Sekwencja Nr: 17 Długość sekwencji: 23 Postać sekwencji: aminokwas Topologia: prostołańcuchowa Rodzaj sekwencji: peptyd Sekwencja

Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp

Sekwencja Nr: 18 Długość sekwencji: 23 Postać sekwencji: aminokwas Topologia: prostołańcuchowa Rodzaj sekwencji: peptyd Sekwencja

Cys Pro Val Asn Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 20

180 020

Sekwencja Nr: 19

Długość sekwencji: 23

Postać sekwencji: aminokwas Topologia: prostołańcuchowa Rodzaj sekwencji: peptyd Sekwencja

Cys Pro Yal Asn Ile Lys Arg Nie Nie Nie Nie Nie Nie Nie Nie Nie 15 10 15

Nie Nie Nie Nie Nie Nie Nie

Sekwencja Nr: 20

Długość sekwencji: 27

Cys 1	Pro	Yal	His	Leu Lys Arg Yal Yal Yal Yal Yal Yal Yal Yal Yal
5	10	15
Yal	Yal	Yal	Yal 20	Yal Yal	Yal	Gly Ala 25	Leu	Leu

Sekwencja Nr: 21

Długość sekwencji: 27

Postać sekwencji: aminokwas

180 020

Topologia: prostołańcuchowa

Rodzaj sekwencji: peptyd

Sekwencja

Cys Pro Val His Leu Lys Arg Ile Ile Ile Ile Ile Ile Ile Ile Ile

10 15

Ile Ile Ile Ile Ile Ile Ile Gly Ala Leu Leu

25

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Nowy syntetyczny peptyd o następującej sekwencji: Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys- Arg-W, w której Xaa może nie występować lub może oznaczać Cys lub Ser, N-koniec peptydu ewentualnie jeszcze zawiera dodatkowo aminokwas lub aminokwasy wybrane z grupy obejmującej Cys i Ser i kombinację Cys lub Ser z sekwencjąPhe-Gly-Ile-Pro, przy czym grupa holowa lub hydroksylowa obecna w tym peptydzie może być acylowana kwasem tłuszczowym o 14-18 atomach węgla lub może być acetoamidometylowana; Xbb oznacza His lub Asn, Xcc oznacza Leu lub Ile, a W oznacza część hydrofobowąpeptydu obejmującą 12-20 reszt Leu i/lub Nie i ewentualnie 1 -5 reszt wybranych spośród De, Val, Nva i Trp oraz na końcu C ewentualnie grupę o sekwencji Gly-Ala-Leu-Leu lub Gly-Ala-Leu-Leu-Met-Gly-Leu.
2. Peptyd według zastrz. 1, który ma sekwencję przedstawioną jedną z sekwencji nr 5-19 albo który jest S-acetoamidometylowaną formą peptydu o sekwencji nr 8 lub S-palmitoilowaną formą peptydu o sekwencji nr 9.
3. Peptyd do syntezy, o sekwencji Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg, w której Xaa może nie występować lub może oznaczać Cys lub Ser, Xbb oznacza His lub Asn, Xcc oznacza Leu lub Ile, przy czym N-koniec peptydu ewentualnie jeszcze zawiera dodatkowo aminokwas lub aminokwasy wybrane z grupy obejmującej Cys i Ser i kombinację Cys lub Ser z sekwencjąPhe-Gly-Ile-Pro, w którymN-końcowe i funkcyjne łańcuchy boczne sąchronione.
4. Ppetyd według zastrz. 3, którym jest Fmoc-Pro-Val-His(Trt)-Leu-Lys-(Boc)-Arg(Mtr), Fmoc-Pro-Val-Asn-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr)lubFmoc-Pro-Val-Asn-Ile-Lys(Boc)-Arg(Mtr).
5. Sposób wytwarzania syntetycznego peptydu o następującej sekwencji: Xaa-ProVal-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W, w której Xaa może nie występować lub może oznaczać Cys lub Ser, N-koniec peptydu ewentualnie jeszcze zawiera dodatkowo aminokwas lub aminokwasy wybrane z grupy obejmującej Cys i Ser i kombinację Cys lub Ser z sekwencjąPhe-Gly-Ile-Pro, przy czym grupa holowa lub hydroksylowa obecna w tym peptydzie może być acylowana kwasem tłuszczowym o 14-18 atomach węgla lub może być acetoamidometylowana; Xbb oznacza His lub Asn, Xcc oznacza Leu lub Ile, a W oznacza część hydrofobowąpeptydu obejmującą 12-20 reszt Leu i/lub Nie i ewentualnie 1 -5 reszt wybranych spośród Ile, Val, Nva i Trp oraz na końcu C ewentualnie grupę o sekwencji Gly-Ala-Leu-Leu lub Gly-Ala-Leu-Leu-Met-Gly-Leu, znamienny tym, że kondensuje się hydrofobowączęść syntetycznego peptydu, W określonąpowyżej zpeptydem do syntezy o sekwencji Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg, w której Xaa może nie występować lub może oznaczać Cys lub Ser, Xbb oznacza His lub Asn, Xcc oznacza Leu lub He, przy czym N-koniec peptydu ewentualnie jeszcze zawiera dodatkowo aminokwas lub aminokwasy wybrane z grupy obejmującej Cys i Ser i kombinację Cys lub Ser z sekwencjąPhe-Gly-Ile-Pro, w którym N-końcowe i funkcyjne łańcuchy boczne sąchronione, albo prowadzi się metodę wydłużania łańcucha „krok po kroku”.
6. Surfaktant płuc, znamienny tym, że obejmuje syntetyczny peptyd o następującej sekwencji:

Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W, w której Xaa może nie występować lub może oznaczać Cys lub Ser, N-koniec peptydu ewentualnie jeszcze zawiera dodatkowo aminokwas lub aminokwasy wybrane z grupy obej

180 020 mującej Cys i Ser i kombinację Cys lub Ser z sekwencjąPhe-Gly-Ile-Pro, przy czym grupa dołowa lub hydroksylowa obecna w tym peptydzie może być acylowana kwasem tłuszczowym o 14-18 atomach węgla lub może być acetoamidometylowana; Xbb oznacza His lub Asn, Xcc oznacza Leu lub Ile, a W oznacza część hydrofobowąpeptydu obejmującą 12-20 reszt Leu i/lub Nie i ewentualnie 1 -5 reszt wybranych spośród Ile, Val, Nva i Trp oraz na końcu C ewentualnie grupę o sekwencji Gly-Ala-Leu-Leu lub Gly-Ala-Leu-Leu-Met-Gly-Leu, fosfogliceryd choliny, fosfolipid kwasowy i kwas tłuszczowy lub jego analogi, takie jak sole metali alkalicznych kwasów tłuszczowych, estry alkilowe kwasów tłuszczowych, estry glicerynowe kwasów tłuszczowych, amidy tłuszczowe, mieszaniny tych składników oraz alkohole tłuszczowe i aminy tłuszczowe.
7. Środek terapeutyczny do leczenia zespołu niewydolności oddechowej, znamienny tym, że jako składnik aktywny zawiera surfaktant płuc obejmujący syntetyczny peptyd o następującej sekwencji:

Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W, w której Xaa może nie występować lub może oznaczać Cys lub Ser, N-koniec peptydu ewentualnie jeszcze zawiera dodatkowo aminokwas lub aminokwasy wybrane z grupy obejmującej Cys i Ser i kombinację Cys lub Ser z sekwencjąPhe-Gly-Ile-Pro, przy czym grupa dołowa lub hydroksylowa obecna w tym peptydzie może być acylowana kwasem tłuszczowym o 14-18 atomach węgla lub może być acetoamidometylowana; Xbb oznacza His lub Asn, Xcc oznacza Leu lub Ile, a W oznacza część hydrofobowąpeptydu obejmującą 12-20 reszt Leu i/lub Nie i ewentualnie 1 -5 reszt wybranych spośród De, Val, Nva i Trp oraz na końcu C ewentualnie grupę o sekwencji Gly-Ala-Leu-Leu lub Gly-Ala-Leu-Leu-Met-Gly-Leu, fosfogliceryd choliny, fosfolipid kwasowy i kwas tłuszczowy lub jego analogi, takie jak sole metali alkalicznych kwasów tłuszczowych, estry alkilowe kwasów tłuszczowych, estry glicerynowe kwasów tłuszczowych, amidy tłuszczowe, mieszaniny tych składników oraz alkohole tłuszczowe i aminy tłuszczowe oraz zawiera konwencjonalne farmaceutycznie dopuszczalne dodatki.

* * *