PL180681B1

PL180681B1 - Nowe zwiazki, pochodne Q6 -alkiloguaniny, sposób ich wytwarzania i kompozycja farmaceutyczna zawierajaca te zwiazki PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL180681B1
Application number: PL94311950A
Authority: PL
Inventors: Thomas Brian Mcmurry; Robert Stanley Mcelhinney; Joan Elizabeth Mccormick; Rhoderick Hugh Elder; Jane Kelly; Geoffrey Margison; Joseph Anthony Rafferty; Amanda Jean Watson; Mark Andrew Willington
Original assignee: Cancer Res Campaign Tech
Priority date: 1993-06-08
Filing date: 1994-06-08
Publication date: 2001-03-30
Also published as: NO313331B1; HUT74574A; PT702683E; CZ323395A3; HU9503522D0; EP0702683A1; EP0702683B1; CZ290951B6; SK154795A3; CA2164847A1; AU697977B2; FI955906A7; CN1145622A; SK282621B6; AU6805994A; NZ266527A; CN1048493C; ATE250060T1; PL311950A1; DE69433161T2

Abstract

1 . Nowe zwiazki, pochodne Q6 -alkiloguaniny o wzorze I: w którym Y oznacza H lub skladnik cukrowy wybrany sposród rybozylu i deoksyrybozylu; R' oznacza H lub metyl, R oznacza (i) 5-czlonowy pierscien heterocykliczny z co najmniej jednym heteroatomem wybranym spo- sród O, N i S, ewentualnie skondensowany z pierscieniem benzenowym lub pirydynowym, lub 6-czlonowy pierscien heterocykliczny z co najmniej jednym atomem N, przy czym grupa cykliczna moze byc ewentualnie podstawiona w pierscieniu (pierscieniach) heterocyklicznym i/lub w pier- scieniu karbocyklicznym grupami wybranymi sposród grup C1-C5 alkilowych, chlorowców, grupy cyjanowej, nitrowej lub COOR5, w której R5 oznacza H lub C 1 -C5 alkil, lub (ii) naftyl; i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe związki, pochodne Q⁶-alkiloguaniny, sposób ich wytwarzania i kompozycja farmaceutyczna zawierająca te związki. Konkretnie wynalazek dotyczy pochodnych guaniny zawierających podstawniki heteroalkilowe lub naftylowe w pozycji Q⁶. Związki te wykazują zdolność usuwania aktywności alkilotransferazy Q⁶alkiloguanino-DNA (ATaza) w komórkach nowotworowych.

180 681

Proponowano stosowanie Q⁶-alkilowych pochodnych guaniny, które mają zdolność usuwania aktywności alkilotransferazy Q⁶-alkiloguaniny-DNA, w celu zwiększenia skuteczności chemioterapeutycznych środków alkilujących stosowanych do niszczenia komórek nowotworowych. Istnieje dowód na to, że w komórkach ssaków toksyczne i mutagenne działanie środków alkilujących jest w dużej mierze konsekwencją alkilowania guaniny w DNA w pozycji Q⁶. W reperacji Q⁶-alkiloguaniny bierze udział ATaza, białko reperacyjne, które działa na £r-alkilowane reszty guaniny przez stechiometryczne przenoszenie grupy alkilowej do reszty cysteiny w aktywnym miejscu białka reperacyjnego w procesie autoinaktywacji. Znaczenie ATazy w ochronie komórek przed biologicznym działaniem środków alkilujących jest wyraźnie demonstrowane przez przenoszenie i ekspresję klonowanych genów ATazy lub cDNA do komórek z niedoborem ATazy: nadaje to odporność na różne środki, głównie te, które metylują lub chloroetylują DNA. Mechanizm niszczenia komórek przez Q⁶-metyloguaninę w komórkach z niedoborem ATazy nie jest jeszcze jasny, natomiast wiadomo, że niszczenie przez Q⁶-chloroetyloguaninę zachodzi przez tworzenie się poprzecznych wiązań między nićmi DNA z resztą cytozyny w nici komplementarnej poprzez produkt przejściowy etanoguaninę, proces, któremu zapobiega usuwanie grupy chloroetylowej z udziałem ATazy lub tworzenie się kompleksu.

Badano stosowanie Q⁶-metyloguamny i Q⁶-n-butyloguaniny do usuwania aktywności ATazy (Dolan i in., Cancer Res., (1986), 46, str. 4500; Dolan i in., Cancer Chemother. Pharmacol., (1989), 25, str. 103. Proponowano stosowanie Q⁶-benzyloguaniny do usuwania aktywności w celu nadania komórkom ekspresjonującym ATazę większej podatności na wpływy cytotoksyczne środków chloroetylujących (Moschel i in., J. Med. Chem., 1992, 35, 1186). Opis patentowy USA nr 5 091 430 i międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 91/13898 (Moschel i in.) ujawniają sposób obniżania poziomu alkilotransferazy Q⁶-alkiloguaniny-DNA w komórkach nowotworowych gospodarzą który polega na podawaniu gospodarzowi skutecznej ilości kompozycji zawierającej Q⁶-benzylowanąpochodną guaniny o następującym wzorze:

OR^a

Z w którym Z oznacza wodór lub

a R^a oznacza grupę benzylową lub podstawioną grupę benzylową. Grupa benzylowa może być podstawiona w pozycji orto-, meta- lub para- takim podstawnikiem jak chlorowiec, grupa nitrową grupa arylowa taka jak fenylowa lub podstawiona fenylowa, grupa alkilowa o 1-4 atomach węgla, alkoksylową o 1-4 atomach węgla, alkenylowa zawierająca do 4 atomów węgla, alkinylowa zawierająca do 4 atomów węgla, grupa aminowa, monoalkiloaminowa, dialkiloaminowa, trifluorometylową hydroksylowa, hydroksymetylowa i SO_nR^b, w której n oznacza 0, 1, 2 lub 3, a R^b oznacza wodór, alkil o 1-4 atomach węgla lub aryl. Mi Young Chae i in. w J. Med. Chem., 1994, 37, 342-347, publikacji opublikowanej po dacie pierwszeństwa niniejszego zgłoszenią opisuje testy przeprowadzane z analogami Q⁶-benzyloguaniny z bardzo dużymi grupami podstawionymi w pozycji 9 pierścienia benzenowego. Opisany tam związek nr 6 jest Q -(2-pirydylometylo)guaniną która w tym zgłoszeniu jest określana jako

180 681

Q⁶-(2-pikolilo)guanina. Jednak w części tej publikacji zatytułowanej jako Wyniki i Dyskusje, na str. 342-343 związek nr 6 nie jest przedstawiony jako budzący szczególne zainteresowanie, ale jest w grupie „pozostałych związków”, które „wykazują aktywność przejściową” (str. 343 w. 12-15). Autorzy potwierdzają swoje wcześniejsze obserwacje (J. Med. Chem., 1972, 35, 4486), że tylko alkil lub benzyl jako podstawniki guaniny w pozycji Q⁶ skutecznie inaktywują ATazę (str. 343, w. 21-23).

Ze stosowaniem Q-benzyloguaniny jako inaktywatorem ATazy związane są pewne ograniczenia. Związek ten jest trwalszy niż byłoby to potrzebne, co prowadzi do długiego czasu jego przebywania w organizmie osobnika, któremu się go podąje. Poziom jego potencjalnej toksyczności, również w kombinacji ze środkami chloroetylującymi prawdopodobnie związany z tym czasem trwałości, również jest niekorzystny.

Związki według wynalazku mają charakterystykę inaktywacji ATazy różniącą się od Q⁶-benzyloguaniny, a w niektórych przypadkach mają aktywność do 8 razy większą niż aktywność Q -benzyloguaniny. Stwierdzono też, że inny jest - półokres trwania i toksyczność. Celem wynalazku jest zatem dostarczenie nowych związków, które nadają się do usuwania aktywności ATazy w celu zwiększenia działania chemioterapeutycznych środków takich jak przeciwnowotworowe środki chJoroetylujące i metylujące.

Innym celem wynalazku jest dostarczenie kompozycji farmaceutycznych zawierających związki, które usuwają aktywność ATazy.

Wynalazek dotyczy Q⁶-podstawionych pochodnych guaniny o wzorze I:

OCHRR

Y w którym Y oznacza H lub składnik cukrowy wybrany spośród rybozylu i deoksyrybozylu;

R' oznacza H lub metyl;

R oznacza (i) 5-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym heteroatomem wybranym spośród O, N i S, ewentualnie skondensowany z pierścieniem benzenowym lub pirydynowym, lub 6-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym atomem N, przy czym grupa cykliczna może być ewentualnie podstawiona w pierścieniu (pierścieniach) heterocyklicznym i/lub w pierścieniu karbocyklicznym grupami wybranymi spośród grup C1-C5 alkilowych, chlorowców, grupy cyjanowej, nitrowej lub COOR⁵, w której R⁵ oznacza H lub C1-C5 alkil, lub (ii) naftyl;

i ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

R może odpowiednio oznaczać 5- lub 6-członowy pierścień heterocykliczny lub jego benzenową pochodną, przy czym w tym drugim przypadku ugrupowanie Q⁶-alkiloguaniny może być związane z R albo przez pierścień heterocykliczny albo benzenowy.

Korzystnie, R oznacza pierścień 5-członowy zawierający S lub O, z drugim skondensowanym pierścieniem lub bez takiego drugiego pierścienia.

Korzystnie, R oznacza pierścień heterocykliczny, zawierający co najmniej jeden atom S, bardziej korzystnie R oznacza 5-członowy pierścień heterocykliczny, zawierający co najmniej jeden atom S, a najkorzystniej R oznacza pierścień tiofenu lub jego podstawioną pochodną.

Alternatywnie, R może oznaczać pierścień heterocykliczny zawierający co najmniej jeden atom tlenu, zwłaszcza 5-członowy pierścień heterocykliczny zawierający co najmniej jeden atom tlenu, a konkretnie R może oznaczać pierścień furanu lub jego podstawionej pochodnej.

180 681

R może oznaczać alternatywnie pierścień heterocykliczny zawierający co najmniej jeden atom N, zwłaszcza R może oznaczać 6-członowy pierścień heterocykliczny zawierający co najmniej jeden atom N, a zwłaszcza R może oznaczać pierścień pirydynowy.

Przykłady związków według wynalazku (razem ze związkami B.4214 i B.4218, które nie są objęte niniejszym wynalazkiem są przedstawione w tablicy 1.

Alternatywnie, R może oznaczać pierścień heterocykliczny zawierający co najmniej jeden atom tlenu, zwłaszcza 5-członowy pierścień heterocykliczny zawierający co najmniej jeden atom tlenu, a konkretnie R może oznaczać pierścień furami lub jego podstawionej pochodnej.

R może oznaczać alternatywnie pierścień heterocykliczny zawierający co najmniej jeden atom N, zwłaszcza R może oznaczać 6-członowy pierścień heterocykliczny zawierający co najmniej jeden atom N, a zwłaszcza R może oznaczać pierścień pirydynowy. W definicji Y termin „podstawione pochodne” obejmuje podstawienie jedną lub więcej z następujących grup: hydroksylowa, alkoksylową, aminowa, alkiloaminowa, amidowa lub ureido.

180 681

Tablica 1

Β.4203

Q⁶-furfuryloguanina

Β. 4205

Q⁶-tenyloguanina

Β. 4206

Q⁶-(3-tienylometylo)guanina

Β. 4209

Q⁶-(3-furyiom.etylo)guanina

Β. 4210

Q⁶- (2-pikolilo) guanina

180 681

Β. 4211 Ο⁶-(3-pikolilo)guanina

Β. 4212 Q⁶-piperonyloguanina

Β. 4213 Q⁶-(2-naftylometylo)guanina

B. 4214 DL-Q⁶- (α-metylobenzylo) guanina

B. 4217 DL-Q⁶-(α-metylotenylo) guanina

180 681

Β. 4218

Q⁶- (2-metylobenzylo) guanina

Β. 4219

DL-Q⁶- [1- (3-tienylo)etylo] guanina

Β. 4220

£)⁶- (5-metylotenylo) guanina

OG.

Β. 4221

Q⁶- (5-metylofurfurylo) guanina

Β. 4222

Q⁶- (3-metylotenylo) guanina

Β. 4226

O⁶- (2-benzo [b] tienylometylo) guanina

OG

180 681

Β. 4229 Q⁶- (5-metoksykarbonylofurfurylo)guanina

O

B. 4234 O⁶- (5-karboksyfurfuryio)guanina

B. 4265 Q⁶-(1-naftyloiuetylo) guanina

B. 4266 Q⁶-(2-benzofuranylometylo)guanina

180 681

Β. 4268 Q⁶-piperonyloguanozyna

Β. 4269 Q⁶-(5-bromotenylo)guanina

B. 4271 O⁶-(5-azapiperonylo)guanina

B. 4273 Q⁶-(5-cyjanofurfurylo)guanina

B. 4274 Q⁶-(5-oksazolilometylo)guanina

O

B. 4275 O⁶- (5-tiazolilom.etylo) guanina

180 681

Β. 4277 Q⁶-(4-pikolilo)guanina

B. 4278 Q⁶-(l-metylo-4-nitropirol-2-ilometylo)guanina

B. 4279 Q⁶-tenyloguanozyna

180 681

Spośród związków w tablicy 1 związki B. 4214 i B. 4218 nie są związkami według wynalazku. Związek B. 4210 (to jest związek o wzorze I, w którym R oznacza 2-pirydyl, R' oznacza H i Y oznacza H) nie jest korzystnym związkiem według wynalazku.

Szczególnie korzystne są następujące związki według wynalazku:

B. 4205 Q⁶-tenyloguanina,

B. 4206 Q⁶-(3-tienylometylo)guanina,

B. 4212 Q⁶-piperynyloguanina,

B. 4226 Q⁶-(2-benzo[b]tienylometylo)guanina,

B. 4266 Q⁶-(2-benzofuranylometylo)guanina,

B. 4275 Q⁶-(5-tiazolilometylo)guanina i związki, w których heterocykliczny pierścień w R jest podstawiony chlorowcem, grupą cyjanową lub estrową a mianowicie:

B. 4229 Q⁶-(5-metoksykarbonylofurfurylo)guanina,

B. 4269 Q⁶-(5-bromotenylo)guanina,

B. 4273 Q⁶-(5-cyjanofurfurylo)guanina.

Innymi korzystnymi związkami są:

B. 4209 Q⁶-furylometyloguanina,

B. 4276 Q⁶-(2-benzo[b]tienylometylo)guanozyna,

B. 4277 Q⁶-(4-pikolilo)guanina.

Najkorzystniejszymi związkami według wynalazku są takie, które inaktywują ATazę in vitro i/lub w komórkach ssaków i/lub przeszczepy obcogatunkowe nowotworów bardziej efektywnie niż Q⁶-benzyloguanina (BeG) i które uczulają komórki ssaków i/lub przeszczepy obcogatunkowe nowotworów na niszczący albo hamujący wpływ nitrozomoczników i/lub środków metylujących bardziej niż BeG. Korzystne związki powinny również posiadać, w porównaniu z BeG, zmniejszoną toksyczność w stosunku do tkanek normalnych i/lub całego organizmu gdy są zastosowane w połączeniu z tymi czynnikami. Korzystne związki same powinny być nietoksyczne albo wykazywać toksyczność mniejszą od minimalnej w dawkach potrzebnych do inaktywacji ATazy, jak również żaden z produktów hydrolizy korzystnego związku, jeżeli jest on niestabilny, nie powinien być toksyczny. Jakkolwiek wynalazek nie jest ograniczony przez żadną teorię, może być pożądane, by korzystne związki były mniej stabilne niż BeG, tak, że podlegają samorzutnemu rozkładowi chemicznemu wkrótce po tym jak osiągną maksymalną inaktywację ATazy: w ten sposób każde działanie procesu metabolicznego, który mógłby działać na związek tworząc toksyczną pochodną, byłoby zminimalizowane. Korzystne związki powinny być mniej zdolne do uczulania ludzkiego szpiku albo innych normalnych komórek na toksyczne efekty środków alkilujących, tak, że nie powinny pogarszać znanej toksyczności ani powodować nowych toksyczności tych środków w normalnych ludzkich tkankach.

Korzystne związki, według wynalazku, obejmują te, które posiadają względnie niskie wartości I₅o w tablicy 4 (np. poniżej 1,0 μΜ, a zwłaszcza poniżej 0,04 μΜ) i/lub wykazują względnie krótki okres półtrwania w Buforze I (przedstawiającym warunki dla testu in vitro) i/lub roztworze fizjologicznym soli buforowanym fosforanem (PBS) (przedstawiającym warunki w ośrodku fizjologicznym) w tablicy 4 (np. poniżej 20 godzin w Buforze I albo poniżej 16 godzin w PBS).

Względnie krótki okres półtrwania może być uznany jako wskazówka, że związek według wynalazku powinien być mniej stabilny niż Q⁶-benzyloguanina z powodu reaktywności RR'CH- i powinien dążyć do rozerwania przez hydrolizę w ośrodku fizjologicznym.

Wpływ grupy RR'CH- w związkach o wzorze I umożliwiającej im działanie jako inhibitory ATazy określany jest czynnikami elektronowymi, sterycznymi i fizykochemicznymi. Czynniki steryczne mogąbyć związane z właściwościami otoczenia miejsca receptora cysternowego w ATazie. Korzystnie R' oznacza H. Stwierdzono, że drugi atom węgla przyłączony do Q⁶ (jak w związkach DL B.4214 albo B.4217) znacznie zmniejsza aktywność inaktywującą, prawdopodobnie z powodu ładunku podstawnika.

180 681

Korzystnie grupa cykliczna R nie posiada grupy metylowej w sąsiadującej pozycji (jak w B.4222) jakkolwiek wpływ sąsiadującego podstawnika jest wyraźnie mniejszy gdy R jest heterocykliczne, niż w izomerach naftylowych B.4213 i B.4265.

Czynniki fizykochemiczne jak stabilność, rozpuszczalność i rozdział woda-lipid są istotne dla selekcji związków do zastosowań in vivo, wpływając, przykładowo, na postać recepturową, absorpcję i transport. Na wybór związków może mieć wpływ ich różne rozmieszczenie w różnych tkankach.

Przedmiotem wynalazku są również kompozycje farmaceutyczne zawierające związki o wzorze 1, w którym Y, R i R' mająznaczenie określone powyżej, albo ich farmaceutycznie dopuszczalną sól i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę. Ewentualnie kompozycja może również zawierać środek alkilujący jak np. środek chloroetylujący albo metylujący.

Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania związków o wzorze I, określonym powyżej, obejmującego następujące etapy: reakcję wodorku sodu z roztworem związku o wzorze RR'CHOH (w którym R i R' mająznaczenie jak określono wyżej) w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w temperaturze pokojowej lub poniżej temperatury pokojowej; dodawanie chlorku 2-amino-N,N,N-trimetylo-lH-puryno-6-aminiowego albo rybozydu 2amino-6-chloropuryny; traktowanie mieszaniny reakcyjnej słabym kwasem i eterem oraz ekstrahowanie żądanego produktu.

Wynalazek opisany jest bardziej szczegółowo w nawiązaniu do dołączonych rysunków, w których:

Figura 1 przedstawia wykres procentowy resztkowej aktywności oczyszczonej rekombinowanej ludzkiej ATazy po inkubacji z różnymi stężeniami różnych inaktywatorów. Każdy z punktów przedstawia średnią z trzech pomiarów. Linia przy aktywności resztkowej 50% jest stosowana do wyliczenia wartości I50, tzn. stężenia inaktywatora wymaganego do wywołania 50% zmniejszenia aktywności ATazy.

Figura 2 przedstawia dwa wykresy procentu wzrostu komórek w stosunku do stężenia środka alkilującego (gg/ml), pokazujące działanie uczulające Q⁶-benzyloguaniny (BeG) i Q⁶tenyloguaniny (B.4205) w dwóch różnych stężeniach (0,1 i 1,0 μΜ) na uczulenie komórek Raji na BCNU. Linia przy 90% wzrostu jest wykorzystana do wyliczenia wartości D90, tzn. dawki BCNU, przy której wystąpił 90% wzrost w porównaniu z nietraktowaną niczym kontrolą, tzn. nastąpiło 10% zahamowanie wzrostu.

Figura 3 przedstawia cztery wykresy procentu wzrostu komórek w stosunku do stężenia środka alkilującego (μΜ) pokazujące wpływ BeG i B.4205 w czterech różnych stężeniach (0,1, 0,5,1,0 i 5,0 μΜ) na uczulenie komórek Raji na temozolomid.

Figura 4 jest wykresem ekstrapolowanym z figury 3 wartości D50 (μΜ) (tzn. dawki temozolomidu, przy której występowało 50% wzrostu w porównaniu z nietraktowaną kontrolą) w stosunku do stężenia inaktywatora (μΜ).

Figura 5 przedstawia dwa wykresy procentu wzrostu komórek w stosunku do stężenia inaktywatora, pokazujące hamujący wzrost wpływ Q⁶-furfuryloguaniny (B.4203) i B.4205 na komórki V79 chomika chińskiego (RJKO) i ich podlinię (+120).

Figura 6 przedstawia dwa wykresy procentu wzrostu komórek w stosunku do stężenia inaktywatora, pokazujące hamujący wzrost wpływ Β.4203Ϊ B.4205 na dwa podklony Xeroderma pigmentosum.

Figura 7 przedstawia cztery wykresy procentu wzrostu komórek w stosunku do stężenia inaktywatora (μΜ), pokazujące hamujący wzrost wpływ B.4203, B.4205 B.4212 (Q⁶piperonyloguaniny) i B.4226 (Q⁶-[2-benzo(b)tienylometylo]guaniny na wzrost komórek Raji.

Figura 8 jest diagramem aktywności ATazy (fin/mg) w stosunku do czasu (godziny) pokazującym usuwanie aktywności ATazy w przeszczepie obcogatunkowym A375 u myszy nagich, dla nietraktowanych kontroli, kontroli traktowanych olejem kukurydzianym i ekstraktów traktowanych BeG (30 mg/kg) i B.4205 (30 mg/kg).

Figury od 9 do 13 przedstawiają wykresy wyników badań nad przeszczepami obcogatunkowymi. W każdej z figur górny wykres przedstawia procent objętości guza w stosunku do czasu (dni) dla przeszczepów obcogatunkowych nowotworu A375 u myszy nagich traktowanych samym BCNU, BeG w połączeniu z BCNU i B.4205 w połączeniu z BCNU. Dolny wy

180 681 kres w każdej z figur pokazuje liczbę myszy, które przeżyły w każdej z grup w stosunku do czasu (dni) po traktowaniu przedstawionym w górnym wykresie.

Szczegółowe dane dla każdej z figur sąjak poniżej.

Figura	Myszy	Stężenie BCNU (mg/kg)	Inaktywator (mg/kg)
9	ASU	ok 15	60
10	ASU	25	60
11	OLAĆ	10	30
12	ASU	16	60
13	ASU	16	60

Figura 14 przedstawia trzy wykresy procentu przeżywalności w stosunku do stężenia temozolomidu (μΜ), pokazujące przeżywalność komórek szpiku po traktowaniu inaktywatorem (10 μΜ) albo DMSO (kontrola) w połączeniu z rosnącymi dawkami temozolomidu.

Sposoby prowadzenia wynalazku

Q⁶-heteroarylowe pochodne guaniny, które mają zdolność inaktywowania ATazy można syntetyzować, dostosowując standardowe odpowiednie sposoby wytwarzania, jak przedstawiono poniżej.

Chlorek 2-N,N,N-trimetylo-lH-puryn-6-aminiowy wytworzono zgodnie ze sposobem opisanym przez Kiburisa i in., J. Chem. Soc. (C), 1971, 3942. Szczegóły dotyczące warunków reakcji tej czwartorzędowej soli z solą sodową tlenku benzylu (z wytworzeniem Q⁶-benzyloguaniny) nie ujawnione przez MacCossa, Chena i Tolmana w Tetrahedron Lett., 1985, 26, 1815, przedstawili MacCoss, Tolman, Wagner i Hannah, w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 184 473, ale me były one odpowiednie do wytwarzania stosunkowo wrażliwych analogów, tak więc twórcy opracowali standardową metodę wytwarzania.

Standardowe wytwarzanie -hetaryloalkiloguanin (wzór I,y = H)

Do roztworu RR'CHOH (56 mmoli, ok. 5 ml) w DMSO (5 ml) dodano wodorku sodu (60% roztwór w oleju; 0,8 g, 20 mmoli) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Dla stałych alkoholi lub alkoholi o wyższym ciężarze cząsteczkowym, zamiast 5 ml można stosować do 10 ml DMSO. Dodano chlorku 2-amino-N,N,N-trimetylo-lHpuryn-6-aminiowego i mieszano dalej przez następną 1 godzinę. Zmiany w widmie UV zakończyły się (X_max 312—>284 nm), po czym prawie klarowny roztwór potraktowano kwasem octowym (1,7 ml). Po oziębieniu i rozcieńczeniu eterem (300 ml), mieszaninę pozostawiono (na 2 godziny) i zebrano substancję stałą (A). Po roztarciu z wodą otrzymano produkt. Drugą frakcję uzyskano po odparowaniu przesączu z eteru-DMSO i roztarciu pozostałości kolejno z eterem i z wodą. Alternatywnie produkt można ekstrahować z substancji stałej (A) ciepłym acetonitrylem. Rekrystalizowane związki wykazują w TLC pojedynczą plamkę (C₆H₆-MeOH, 4:1) i są charakteryzowane za pomocą analizy i widm NMR. Często zawierają rozpuszczalnik z krystalizacji. Temperatury topnienia i dane analityczne podano w tablicy 2, a dane UV i ^]H NMR w tablicy 3. Widma NMR mierzono na aparatach Bruker WOP80 lub MSL 300.

Tę standardową procedurę wytwarzania (z odmianami wskazanymi za pomocą symboli w tablicy 2) stosowano do wytworzenia związków wymienionych w tablicach 2a i 3 a. W związkach B.4217 i B.4219 R' oznacza metyl, w pozostałych związkach R' oznacza H. Q⁶-benzyloguaninę i związki B.4214, B.4218 i B.4231 wymienione w poniższej tablicy 4 i stosowane w testach porównawczych, wytworzono również stosując ten standardowy sposób wytwarzania.

Zmiany wskazane w tablicy 2 za pomocą symboli, są następujące. .

a. Do wytwarzania tego związku stosowano 5 mmoli wodorku sodu na 1 mmol czwartorzędowej soli. Gdy stosuje się standardową ilość (2 mmole), po obróbce można odzyskać 40% czwartorzędowej soli.

b. Związek ten wytworzono przez hydrolizę estru metylowego B.4229 (145 mg, 0,5 mmola) w 2-metoksyetanolu (2,5 ml) i wodzie (2,5 ml), po obróbce 2 M NaOH (2,5 ml) przez

180 681 godziny w temperaturze pokojowej. Po zobojętnieniu kwasem octowym (0,32 ml, 5,5 mmola), łagodnym odparowaniu, roztarciu z wodą (3 ml) i przesączeniu, uzyskano substancję stałą, która po ekstrahowaniu gorącym metanolem dała kwas B.4234.

c. Wartości podane jako wymagane odniesione są do monohydratu mieszaniny 4 części soli sodowej kwasu i 3 części kwasu; obliczono: Na, 4,3%, znaleziono: Na, 4,44%.

d. Stosowano 3 mmole alkoholu RCH2OH na mol czwartorzędowej soli zamiast standardowej ilości 5,6 ml.

e. Dla alkoholi zbyt wrażliwych na wodorek sodu w DMSO w temperaturze pokojowej, wytworzono RCH2ONa w DMF (2,5 ml w -10°C; 3 mmole RCH2OH, 2 mmole wodorku sodu). Po 15-20 minutach dodano 1 mmol czwartorzędowej soli i mieszano dalej przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej.

f. Produkty ekstrahowano acetonitrylem.

Wytwarzanie rybozydów (wzór I, Y - rybozyl)

Roztwór alkoholanu, wytworzony jak opisano powyżej w Standardowej Procedurze z wodorku sodu (60% roztwór w oleju, 120 mg, 3 mmole) i RR'CHOH (4,6 mmola) w suchym DMSO (2 ml), traktowano w ciągu godziny rybozydem 2-amino-6-chloropuryny (302 mg, 1 mmol) i mieszano przez 5 minut w temperaturze pokojowej, po czym przez 15 minut w 6065°C. Zmiana w widmie UV wskazała zakończenie reakcji (X_max 312—>284 nm). Po oziębieniu, dokładnym roztarciu z eterem (100 + 15 ml) i przesączeniu otrzymano substancję stałą którą potraktowano wodą (10 ml). pH obniżono z 11 do 8 krótko przepuszczając CO2. Materiały nieorganiczne usunięto przez przesączenie, a wysuszoną pozostałość rekrystalizowano z metanolu (porcje 4 x 10 ml, każda zawierająca kroplę pirydyny). Po odparowaniu prawie całego metanolu i dodaniu nieznacznej ilości eteru, otrzymano prawie czysty produkt, co potwierdzono TLC (CóHg-MeOH 4:1). Produkt rekrystalizowano z metanolu ze śladową ilością pirydyny, rozpuszczając i zatężając w temperaturze poniżej 40°C, czasem z dodatkiem na końcu nieznacznej ilości eteru.

Procedurę tę stosowano do wytwarzania związków wymienionych w tablicach 2b i 3b. Śladowe zanieczyszczenia są trudne do usunięcia, ale widma NMR pokazują że nukleozydy są czyste w ok. 90%. Wydajności sięgają rzędu 30-40%.

180 681

Tablica 2a

z

o

29,24 29,17

28,45 28,63

25,67 25,07

30,25 30,29

32,79 33,47

32,50 33,47

23,64 23,44

23,99 24,05

26,96 28,80

27,10

liza

a

ch

4,00 4,19

CM MD CM

OO O\ ΟΟ_Λ *©

4,16 3,92

4,73 4,41

4,78 4,41

4,48 4,22

4,58 4,50

4,40 4,24

4,33

Ana

o

oo

2 o θ' o tO) Uty

48,40 48,78

O MD^ en

52,07 51,93

52,85 52,60

52,53 1 52,60

52,22 52,25

65,91 65,97

50,39 50,57

50,59

t>

Ό CS _

bi paru

•b? pun<

Ό § cr

*ο § +

be pun<

•be punc

punc

Uh 01

λ ol

t, ol

Λ ¢5

Λ 01

λ ol

λ

O a

Z O w

K O

Ο a

O a

'O N

o

cm «—4

1—H

2

Γ4

CM

en

£

O

on O

(Z) O

Ο

θ

O

o

O

CZ) O o

(Z1 O

z

%

o

z

Z

K

%

a ©

κ

a

<5

ο

u

o

u

(□o) ud<

Ó5 a

091 pc •.euo¹

00

O

• S S 2 S n

tżj 00 8 o o <D

eokreśl niowo <

205

191

220-2;

226-2;

195-1S

224-2;

150

H S,

Z

z t <Λ

* &

i a 5 s

ił CL η* N O ^u

K o

K o <D

a ο

κ ο ο

a o <υ

HO

eCN

*-g

2

w

2

w

2

W

2

β 2 Μ» C w

o <υ co « N > 2 ~

μί

CM

en

p u S ΰ ce ^# & c

en

00

MD

IT)

CM

un

% w

7H-

s

O)

‘χ

Λ •8

Έ' <L>

*>>

etyl

nyl^f

□ety

O CL

β o

β

8 o

ote

c

bi

b

θ'

ο b

Έ ,24

o ^4

c g

iftyl

etyl

ϋ ZJ

i

teny

3-tie

<3 en

cl CM

Ł en

pipę

S CM

ε ά

l-(3

Nr anego rązku

en o

•n o

V© O

Q\ ο

Ο

es

O\ i

* g

CM m

CM

CM Tt ίΏ

CM

CM τΤ m

CM TT W

B.42

180 681

c.d tablicy 2a

O ł—H

•

27,47 27,56

•

21,47 21,26

21,86 22,14

22,68 22,90

22,81 | 22,79

22,53 22,35

20,81 21,47

27,94 28,22

29,82 30,65

35,50 35,52

Ch

1

4,81 4,76

1

4,49 4,59

o CN

3,52 3,40 l

4,85 4,92

oo cd °°o

2,52 2,47

3,86 3,89

o rc*ę γ*ί

3,70 3,62

00

1

52,18 51,98

i

53,93 54,69

45,88 45,57

42,69 43,20

64,37 64,48

57,31 57,50

36,81 36,82

50,27 50,40

48,25 48,19

OO oo MD \D

r-

1

>und *1

t

§ σ

5 Z

§ σ

•bi punc

: bi punc

bs punc

i b; punc

bi punc

•bs punc

Pu, Pi

Fu, pi

Pu, ci

pU, pi

Pi Pi

Λ Pi

Pu, Pi

tu, Pi

Pu, Pi

o

O i¹vd o

5 · MeOH

· 1,5 H,O

δ E

• 0,5 MeOH

, · MeOH

π

, · 0,25 EtOH

O E

0,25 H₂0

o :z

iN₅O₂

O

ιιΝ₅0ί

iN₅O₄

O

O !Z

i |N₅O₂

O Ό Z o

O Z

O Ό

E

ί

E

%

E

oo E

u

<5

o

O

<5

o

<5

O

j 140

ślona

00 o

6 <u © a CD ca

c>

o CN

00 o>

o 00

O

00 ^ramem)

MD

ΜΊ

O •N £ i£

O <D

Nieokre

00 O\

120-1 (z musów

ó CN

Powyżę

196-1

170-1

230-2

91-1 (z musów

180-2

δ

Z u

E O

w o

E O

E o

E O

HO'

o

W o

E 2

HO^;

1

s

S

2

W

w

2

cd

σ\ CN

00 CD

O CN

00

cp

JD

00 MD

Ό

IT)

CN CD

&

o ΰ

l o

Έ·

CN

5-metylotenyl^f

5-metylofurfuryl^f

3-metylotenyl

2-benzo[b]tienylon

5-metoksykarbony

5-karboksyfurfuryl

1-nafty lometyl

2-benzofuranylom<

5-bromotenyl—

δ* o δ & Ł <υ $ <A

5-cyjanofttrfiiryl-

5-oksazolilometyl^d

B4220

B4221

B4222

B.4226

B.4229

B.4234

B.4265

B4266

B.4269

B4271

B4273

B.4274

180 681

c.d. tablicy 2a

O	IZ?	34,48 34,71	32,49 32,87
	3,73 3,53	4,19 4,16	4,17 4,06
00	42,14 42,02	54,82 54,55	44,17 44,29
	Π3		Π3
c-	§ =r	•bi un<	§ &
	ol	Pi	Cu Pi
	o		O
	« un		W νγ
M2	θ'		O
		O	o
	o Ό Z	<	'z
	oc K		H
	o	U	U
		o
	o	Ol	o
	CM	5?	CM t
	190		140
		O«
		K	K
	O	2	O
		2	S
		CM	CM
	’Τ		CM
			Ul “cl
			s o
			7-jojk
	£>		3-4-mtrof
	o
	o N	1	&
		o.	S r-H
	B.4275	oj PQ	oo CM ffi

Analiza	Z		15,12 15,45	18,83 15,65	18,48 18,03
E		4,58 5,11	4,47 4,73	o r- in τΤ
O		00 o θ'	50,75 ^Ί 50,98 J	46,67 1 46,39
		Found Req	Found Req	Found Req.
Wzór		O K d Z a oo <5	C₁₉Hi₉N₅O₅S · H₂O	C₁₅Hi7N₅O₅S · 0,5 H₂O
Temp topn. (rozkład) (°C)		od 150 (z musowaniem)	140-155	od 120 (z musowaniem)
Rozpuszczalnik do rekrystalizacji		MeOH	MeOH- et er	1 MeOH- et er \
% wydajności w przeliczeniu na solwat
O⁶-podstawmk RR*CH-		piperonyl	2-benzo[b] tienylometyl	tenyl
Nr badanego związku	Rybozydy	B.4268	I B.4276	i B 4279

Found = Znaleziono, Req = Obliczono

180 681

Tablica 3a

MS, (CD₃)₂SO], J (Hz)

3,1), 7,71 (d, J 1,5), 7,81 (s), 12,42 (bs)

J 3,5, 1,2), 7,56 (dd, J 5,1, 1,2), 7,84 (s), 12,47 (bs)

J 4,8, 2,9), 7,62 (bs), 7,80 (s), 12,40 (bs)

7,82 (s), 7,83 (bs), 12,41 (bs)

4,8, 1,2), 12,47 (bs)

,01 (dt, J 7,9,1,8), 8,62 (dd, J 4,8,1,8), 8,80 (bs), 12,48 (bs)

tt .0 CD

, 7,24 (m), 7,49 (m), 7,81 (s), 12,40 (bs)

, 7,50 (m), 7,82 (s), 12,37 (bs)

7,08 (d), 7,81 (s), 12,41 (bs)

,0), 7,81 (s), 12,44 (bs)

d,J5,0), 7,80 (s), 12,44 (bs)

85 (m), 12,47 (bs)

d,J3,4), 7,83 (s), 12,45 (bs)

7,85 (s), 12,53 (bs)

(s), 7,89 (m), 8,11 (m), 12,44 (bs)

δ_Η [ppm z Tl

, 1,5), 6,66 (d, J

DD* DD ✓ CD r?

, 1,2), 7,54 (dd,

^1 LO MD

(s), 8,58 (dd, J

00 00 0?

m), 7,79 (s), 12

1, 12,47 (bs)

J 6,6), 7,01 (m)

6 UD^ LO*

CD* DD* 0 MD*

CD *—>l Dj 's—z' UD LO*

UD 0 UD* ►-»1 DD*

(s), 7,83 (s), 7,1

d, J 3,4), 7,32 (

6,87 (d, J 3,3),

Cl 00^ MD >-nl DD

(dd, J 3,1.

(dd, J5,l.

8> f ‘PP)

^>1 DD*

(m), 7,84

cs* »1 'd' DD

(s), 6,95 (

s, s 00*

? MD*

σ UD LO*

'tt' UD CN^ LO*

(m), 6,27

(s), 6,91 (

(m), 7,60

(s), 6,87 (

CD^ CD* p*

(m), 7,72

Cs

s

ND CN

UD Ό

0 UD

Os

CN

'tt'

UD CN

00 CD

OL CD

00 LO

0© UD

Ό

Γ-

LO

LO*

CN

O CN

δ

MD*

MD

Γ-

LO*

O

tt

tt^

ftt^

e

LO*

ud

'tt'

^tt^

tt.

CN CD

o CD

CN

MD CN

CN

LO

CN O

00 CN

LO

UD^'

CD

O MD

00 CD

O UD

jn

MD CD

LO

ND*

ND

LO*

MD*

MD

•“»1

t—>|

H-il

UD

LO

UD*

LO

tt,

ftt^

tt,

TT

DD*

T

^tt^

CD

δ

00 UD

00 CD

δ

dt

δ

CN

00 CN

00 CS

00

CN 00

CD

LO Ol

UD*

ud

UD*

UD

CN

UD*

CD*

UD

UD*

H) (nm)

UD 00

!84

oo

00

UD CN ©O LO CN

-O tt 00 CD CN

OO

CN OO

00

CD OO

>84

OO

CD OO

7,282

T: 241, 300w)

:o sh I: 259)

>80 1. 256)

293 sh

O o s

CD

243,:

242,:

245,:

247,: >69sh,

245,2( !70sh,

242,:

244,:

243,:

CN CS

246,:

240,:

244,:

40,26'

00

251,28 (RCH₂OI

0*0 CN K

CD OO

J

CS

(R( 262,

(R(

CS

RR'CH-

tyl

0 furfuryl

O⁶-podstawnik

CN

furfuryl

tenyl

3-tienylometyl

3-furylometyl

2-pikolii

3-pikolil

piperonyl

2-naftylometyl

a-metylotenyl^f

O p c? 2 CD,

5-metylotenyl

5-metylofurfuryl

3-metylo tenyl

2 -benz[b] tieny lome

5-metoksykarbonyl

5-karboksyfurfuryl

1-naftylometyl

ó Z

CD O

UD O

MD p

0 0

0

r-H

CN

CD

>19

0c<

CN

CS CN

LO CS

Os CN

>65

tt

Tt

tJ·

Tt

H

ca

m

ca

«

ca

180 681

τ	5,62 (s), 6,40 (s), 7,13 (s), 7,27 (dt, J 7,3, 1,1), 7,34 (dt, J 7,3, 1,3), 7,65 (m), 7,68 (m), 7,85 (s), 12,48 (bs)	5,62 (s), 6,36 (s), 7,17 (ABq, J 3,7), 7,85 (s), 12,47 (bs)	5,40 (s), 6,18 (s), 6,39 (s), 7,48 (d, J 1,8), 7,83 (s), 12,46 (bs) 1 __________________________________________________________	5,53 (s), 6,42 (s), 6,99 (d, J 3,5), 7,67 (d, J 3,5), 7,87 (s), 12,52 (bs)	5,58 (s), 6,38 (s), 7,44 (s), 7,85 (s), 8,45 (s), 12,48 (bs)	5,76 (s), 6,42 (s), 7,85 (s), 8,14 (s), 9,13 (s), 12,49 (bs)	5,58 (s), 6,34 (s), 7,47 (d, J 5,7), 7,88 (s), 8,60 (d, J 5,7), 12,51 (bs)	3,78 (s), 5,46 (s), 6,40 (s), 6,98 (s), 7,84 (s), 8,08 (s), 12,49 (bs)
	246,278,284 (RCH₂OH: 246, 275w, 283w)	247,284 (RCH₂OH: 246)	241,290 (RCH₂OH: 234, । 294)	248,286 (RCH₂OH· 248)	243,286 __________ . .1	244,286	244,265sh,286	244,285,320sh (RCH₂OH: 280, 320)
Ol	i 2-benzofiiranylo-metyl	5-bromotenyl	5-azapiperonyl 1	5 -cyj anofurfuryl	5-oksazolilometyl	5-tiazohlometyl	4-pikolil	1 -metylo-4-mtropirol-2-ilometyll
—<	B.4266	B.4269	B4271	B4273	B4274	B4275	B4277	B.4278

180 681

δ_Η [ppm z TMS; (CD₃)₂SO], J (Hz)		3,53 and 3,62 (2 x dd, J 11,9, 3,75), 3,89 (q, J 3,5), 4,10 (dd, J 4,9, 3,5), 4,45 (t, J 5,5), 5,1 (bs), 5,38 (s), 5,78 (d, J 6,0), 6,02 (s), 6,51 (s), 6,93 (d, J 7,7), 7,00 (dd, J 7,7, 1,5), 7,10 (d, J 1,5), 8,10 (s)	3,57 and 3,67 (2 x m), 3,91 (q, J 3,6), 4,12 (q, J 5,2), 5,16 (m), 5,45 (d, J 6,2), 5,83 (s + m), 6,61 (s), 7,40 (m), 7,63 (s), 7,88 (m), 7,97 (m), 8,16 (s)	3,57 and 3,64 (2 x m), 3,92 (q, J 3,5), 4,13 (m), 4,49 (q, J 5,2), 5,16 (m), 5,45 (m), 5,70 (s), 5,81 (d, J 6,0), 6,57 (s), 7,07 (dd, J 5,1, 3,5), 7,34 (d, J 0,9), 7,60 (d, J 1,3), 8,14 (s), 12,40 (bs)
^„(MeOH) (nm)		246,287 (RCH₂OH: 240,288)	241,252,269,287 (RCH₂OH. 241,262, 289, 300w)	248,285
O⁶-podstawnik		piperonyl	2-benzo[b]tienylometyl	tenyl
Nr badanego związku	Rybozydy	B.4268	B4276	B4279

180 681

Wyjściowe alkohole RR'CHOH zazwyczaj wytwarza się przez redukcję odpowiednich aldehydów, często dostępnych w handlu, borowodorkiem sodu. W przypadku prekursorów estru B.4229 i nitrylu B.4273 stosowano inne postępowanie. Sacharozę przekształcono¹ za pomocą 5-chlorometylofurfuralu w 5-hydroksymetylofurfural. W wyniku utleniania² tego aldehydu otrzymano kwas karboksylowy, który estryfikowano sposobem podanym przez Bocchi i in.³, z wytworzeniem 5-(hydroksymetylo)furanokarboksylanu metylu⁴, wymaganego do wytworzenia B.4229. Oksym⁵ aldehydu odwodniono sposobem opisanym przez Carotti i in.⁶, a surowy produkt traktowano stężonym wodnym roztworem amoniaku w metanolu, po czym ekstrahowano do dichlorometanu. Po destylacji uzyskano alkohol 6-cyjanofurfurylowy⁷, wymagany dla B.4273.

Dla B.4266 prowadzono reakcję Vilsmeiera⁸ z benzofuranem i uzyskano 2-aldehyd, który zredukowano do żądanego alkoholu⁹, a dla B.4266 prowadzono litowanie i obróbkę dimetyloformamidem, z wytworzeniem 2-aldehydu i następnie alkoholu¹⁰.

Dla B.4274 utleniano winian dimetylu¹¹ do glikoksylanu metylu, który poddano reakcji¹² z izocyjankiem tosylometylu, uzyskując oksazolo-5-karboksylan metylu¹⁷. Związek ten zredukowano wodorkiem litowo-glinowym sposobem według Fallab¹⁴ do alkoholu¹⁵.

Dla B.4275 poddano reakcji bromomalonoaldehyd¹⁶ i tiomocznik i wytworzono 2aminotiazolo-5-karboksyaldehyd¹⁷. Po deaminowaniu azotynem amylu¹⁷, a następnie redukcji borowodorkiem sodu otrzymano 5-hydroksymetylotiazol¹⁴.

Dla B.4271 wytworzono alkohol 5-azapiperonylowy (temp. topn. 82-84°C; znaleziono: C, 54,60; H, 4,58’ N, 9,09; C7H7NO3; obliczono: C, 54,90; H, 4,61; N, 9,15%) z odpowiadającego aldehydu¹ .

Dla B.4278 nitrowano¹⁹ l-metylopirolo-2-karboksyaldehyd i zredukowano go do alkoholu²⁰ borowodorkiem sodu.

Jako konkretny przykład, opisane obecnie będzie wytwarzanie Q⁶-tenyloguaniny (B.4205).

Wytwarzanie θ’-tenyloguaniny

Roztwór alkoholu tenylowego (3,18 ml, 33,6 mmola) w DMSO (3 ml) po starannym wymieszaniu, traktowano borowodorkiem sodu (60% roztwór w oleju; 0,48 g, 12 mmola). Po upływie 1 godziny dodano chlorku N-trimetylo-lH-puryno-6-aminiowego (1,37 g, 6 mmoli) i mieszano przez następną 1 godzinę. Dodano kwasu octowego (1,0 ml), szybko oziębiono i mieszaninę rozcieńczono eterem (180 ml). Po 1-2 godzinach zebrano substancję stałą (2,09 g). Po odparowaniu eteru z przesączu i oddestylowaniu DMSO i nadmiaru alkoholu tenylowego (temp, wrzenia 48-57°C/0,2 mm), uzyskano pozostałość, którą roztarto z eterem i otrzymano drugą frakcję substancji stałej (0,36 g). Połączone substancje stałe roztarto z wodą (6 ml) i uzyskano produkt (1,335 g, 90%) wykazujący mocną plamkę w TLC (CgHg-MeOH, 4:1) z jedynie śladowymi zanieczyszczeniami. Po rozpuszczeniu w gorącym etanolu (30 ml), oczyszczeniu przez przesączenie przez Celit i zatężeniu (do 10 ml) na wyparce obrotowej, uzyskano produkt B.4205 (1,125 g, 71% produktu zawierającego 1/3 EtOH na 1 mol w postaci solwatu).

Związki o wzorze I, w którym Y oznacza rybozył lub deoksyrybozyl (nukleozydy) wytwarza się sposobami analogicznymi do syntezy rybozydu Q-benzyloguaniny i 2deoksyrybozydu (Moschel i in., 1992, cf. Gao, Fathi, Gaffhey i in., J. Org. Chem., 1992, 57,6954; Moschel, Hudgins and Dipple, J. Amer. Chem. Soc., 1981, 103, 5489) (patrz wytwarzanie rybozydów powyżej).

Możliwość zastosowania w przemyśle

Ilość stosowanego związku, będącego przedmiotem wynalazku, zmienia się w zależności od efektywnej ilości potrzebnej do traktowania komórek nowotworowych. Odpowiednie jest takie dawkowanie, przy którym stężenie związku według wynalazku w komórce nowotworowej powoduje usunięcie aktywności ATazy, np. około od 1 do 2000 mg/kg, a korzystnie od 1 do 800 mg/kg, szczególnie od 1 do 120 mg/kg, przed chemioterapią środkiem alkilującym.

Kompozycja farmaceutyczna, będąca przedmiotem wynalazku, może być formułowana w postaciach konwencjonalnych z użyciem konwencjonalnych zarobek, jak to opisano przykładowo w WO 91/13898, treść którego załączona jest jako odnośnik. Kompozycja może zawierać inaktywator według wynalazku ze środkiem alkilującym; albo kompozycja może

180 681 obejmować dwie części, z których jedna zawiera inaktywator, zaś druga zawiera środek alkilujący. Sposób podawania związków, według wynalazku, gospodarzowi, może być również sposobem konwencjonalnym, jak przykładowo opisany w WO 91/13898. Do podawania inaktywatora według wynalazku, pacjentom, kompozycja farmaceutyczna może odpowiednio zawierać inaktywator w odpowiednim nośniku, jak np. 40% glikolu polietylenowym 400 w roztworze soli, albo w soli fizjologicznej, albo 3% etanolu (w roztworze soli) do podawania dożylnego, albo w postaci proszku w odpowiednich kapsułkach do podawania doustnego.

Środki alkilujące mogą być podawane według znanych technik i w konwencjonalnych formach recepturowych, jak to opisano, przykładowo, w WO 91/13898 albo korzystnie jako pojedyncza dawka po lub w ciągu 24 godzin, ale korzystnie do 2 godzin po podaniu środków inaktywujących ATazę oraz również w dawkach niższych niż stosowane w standardowych schematach. Zmniejszenie dawki może być konieczne ponieważ inaktywatory, jak się oczekuje, zwiększają toksyczność środków alkilujących. Przykłady środków chloroetylujących obejmują l,3-bis-(2-chloroetylo)-l-nitrozomocznik (BCNU), l-(2-chloroetylo)-3-cykloheksylo-l-nitrozomocznik (CCNU), fotemustynę, mitozolomid i clomeson oraz opisane wMcCormick, Mcllhinney, McMurry i Maxwell, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1991, 977 i Bibby, Double, McCormick, Mcllhenney, Radacic, Pratesi i Dumont, Anti-Cancer Drug Design, 1993, 8, 115. Przykłady środków metylujących obejmują temozolomid (Patent Wielkiej Brytanii GB 2 104 522) i dakarbazynę, prokarbazynę i streptozocynę.

METODY

Oczyszczanie rekombinowanych ATaz

Klonowanie cDNA i nadekspresję ludzkich ATaz opisano poprzednio²³. Oczyszczanie rekombinowanych białek uzyskano bądź przez chromatografię powinowactwa na kolumnie z DNA-celulozy, jak to opisano w Wlikinson i in.²⁵’²⁶, albo przez chromatografię jonowymienną na DEAE-celulozie. W tym ostatnim przypadku, białko ATazy oczyszczano częściowo przez precypitację siarczanem amonu (30-60%) i dializowano wobec 10 mM TRIS-HC1 pH 7,5, 1 mM DTT, 2 mM EDTA, 10% glicerolu, przed nałożeniem na kolumnę z DEAEcelulozy. ATazę eluowano gradientem NaCl od 0 do 0,1 M. Oczyszczone białko ludzkiej ATazy zachowuje aktywność dłużej niż rok podczas przechowywania w wysokim stężeniu w temperaturze -20°C w Buforze I [50 mM TRIS-HC1 (pH 8,3), 3 mM ditiotreitol, 1 mM EDTA] i może być odmrażane i zamrażane kilkakrotnie bez znaczącej utraty aktywności.

Inkubacja z inaktywatorami i test ATazy

Badane związki rozpuszczono w DMSO w stężeniu końcowym 10 mM i rozcieńczono bezpośrednio przed użyciem w Buforze I zawierającym 1 mg/ml albuminy surowicy wołowej (IBSA). Rekombinowaną ATazę rozcieńczono w IBSA i miareczkowano w celu przeprowadzenia w warunkach ograniczanych ATazą a nie substratem. W każdym teście inkubowano stałą ilość ATazy (60-75 finoli) z różnymi ilościami Q⁶-benzyloguaniny albo badanego związku w objętości końcowej 200 μΐ IBSA zawierającego 10 pg DNA grasicy cielęcej w 37°C przez godzinę. Dodawano substrat DNA metylowanego [³H] (100 pl zawierające 6,7 pg DNA i 100 finoli Q⁶-metyloguaniny) i prowadzono inkubację w 37°C przez godzinę, dopóki reakcja się nie zakończyła. Po kwaśnej hydrolizie DNA, jak to opisano uprzednio²¹, odzyskiwano białko metylowane [³H] i oznaczano przez zliczanie scyntylacyjne w fazie płynnej. Próbki zwykle badano w powtórzeniach, zaś doświadczenia powtarzano kilkakrotnie. I50 oznacza stężenie inaktywatora potrzebne do wywołania 50% zahamowania aktywności ATazy.

Hodowla komórek i przygotowanie wyciągów

Komórki ssaków hodowano w standardowych warunkach. Przykładowo, komórki Raj i (ludzka linia limfoblastoidalna z chłoniaka Burkitta) hodowano w zawiesinie w pożywce RPMI z dodatkiem 10% surowicy końskiej. Komórki A375M są ludzkimi komórkami czerniaka, z których wykonywano przeszczepy obco gatunkowe, opisane niżej, po wstrzyknięciu podskórnym myszom nagim; komórki WiDr są hnią ludzkich komórek raka okrężnicy; komórki Hamster+120 są podlinią linii V79 fibroblastów płuc chomika chińskiego, wyselekcjonowaną mitozolomidem, zwaną RJKO; komórki Yoshida są linią komórkową szczurzego mięsakoraka, zaś YRbus jest jego oporną na busulfan podlinią; komórki XP są transformowaną SV40 linią fibroblastów pochodzących ze skóry pacjenta z Xeroderma pigmentosum, komórki

180 681 pHMGAT2b są klonem tych komórek transfekowanych wektorem ekspresyjnym komórek ssaków, zawierającym cDNA ludzkiej ATazy i komórki pHMGla są klonem transfekowanym samym wektorem ekspresyjnym (tzn. nie zawierającym cDNA ludzkiej ATazy). Peletki komórek zawieszono w zimnym (4°C) Buforze I zawierającym 2 pg/ml leupeptyny i sonikowano przez 10 sekund amplitudą 12 μ. Po schłodzeniu na lodzie, komórki sonikowano przez dalsze 10 sekund przy 18 μ. Bezpośrednio po sonikacji dodano 8,7 mg/ml fenylometanosulfonylofluorku w etanolu i produkt sonikacji odwirowano przy 15000 g przez 10 minut w 4°C w celu żwirowania peletki resztek komórkowych. Nadsącz zachowano w celu oznaczenia aktywności ATazy (patrz niżej).

Stabilność inaktywatorów w 37°C

Inaktywatory (10 mM w DMSO) rozcieńczono do 0,1 mM w podgrzanym odgazowanym Buforze I (1 mM EDTA, 50 mM TRIS-HC1 pH 8,3) albo PBS (pH 7-7,2). PBS (roztwór fizjologiczny soli buforowany fosforanem) stanowił 0,8% NaCl, 0,02% KC1, 0,15% Na₂H₂PO4, 0,02% KH₂PO4, pH 7,2. Próbki przenoszono bezpośrednio do spektrofotometru CARY13 (blok kuwet utrzymywano w temp. 37°C) i skanowano przy odpowiedniej długości fali (zgodnie z właściwościami widmowymi związku) w 3-10 minutowych odstępach czasu przez 80 godzin. Wyniki wyrażono jako procent zmiany absorbancji w stosunku do czasu i ekstrapolowano z niego wartości Ti/₂ (półokres trwania).

Inaktywacja aktywności ATazy w komórkach ssaków

Komórki rozcieńczono do 10⁶/ml w pożywce hodowlanej zawierającej odpowiednie stężenie inaktywatora albo odpowiednią ilość nośnika (DMSO). Po inkubacji w 37°C przez 2 godziny komórki zbierano przez odwirowanie, przepłukiwano dwukrotnie PBS, zaś powstałą peletkę komórek (1-2 x 10⁷/peletkę) przechowywano w -20°C. Aktywność ATazy oznaczano, jak to opisano wyżej, w powtórzeniach ekstraktów sonikowanych komórek i wyrażano jako procent aktywności resztkowej w oparciu o aktywność obecną w nietraktowanej kontroli (przykładowo 350-450 fin/ml w komórkach Raji). Wartości I50 (tzn. stężenie inaktywatora potrzebne do zmniejszenia aktywności ATazy o 50%) ekstrapolowano z tych danych.

Uczulanie komórekRaji i A375M na BCNUi temozolomid

Uczulenie komórek Raji na wpływ cytotoksyczny BCNU i temozolomidu po 2 godzinach traktowania inaktywatorem badano testem ΧΤΤ²². Pokrótce, komórki posiano w gęstości 1000 komórek/studzienkę w płytce 96-studzienkowej i inkubowano w 37°C przez 30 minut przed dodaniem pożywki zawierającej odpowiednie stężenie inaktywatora, bądź odpowiednią objętość nośnika. Po 2 godzinach inkubacji w 37°C, dodawano pożywkę zawierającą rosnące dawki BCNU, temozolomidu albo odpowiednią objętość nośnika i pozostawiano komórki na 6 dni. Po tym czasie dodawano roztwór ΧΤΤ i inkubowano przez dalsze 4 godziny w 37°C. Powstały formazan, czerwono-pomarańczowy produkt reakcji oznaczano mierzeniem absorbcji przy długości fali 450 nm w czytniku płytek.

Uczulenie komórek A375M na cytotoksyczny wpływ BCNU badano w teście MTT²⁴różniącym się od opisanego wyżej testu ΧΤΤ jak następuje. Komórkom A375M (1000 na studzienkę) pozwolono rosnąć przez 24 godziny, a następnie traktowano inaktywatorem, a następnie po 2 godzinach BCNU. Po 6 dniach dodawano roztwór MTT (4 mg/ml) i inkubowano komórki przez 3 godziny w 37°C. Pożywkę aspirowano, zaś powstałe purpurowe kryształy formazanu rozpuszczano w DMSO (120 μΐ) i mierzono żywotność komórek przez oznaczenie absorpcji przy długości fali 540 nm przy użyciu czytnika płytek.

Z tych danych określano procent wzrostu komórek względem studzienek kontrolnych dla zakresu dawek BCNU albo temozolomidu zarówno w obecności jak i pod nieobecność inaktywatora. Uczulenie Raji na BCNU (D9₀ ^c/D90^[) określano przez podzielenie D₉₀ (tzn. dawki, przy której występował 90% wzrost w stosunku do nietraktowanej kontroli, tzn. 10% zahamowanie wzrostu) wyliczonych dla danych z zastosowaniem samego BCNU (Dgo⁰) przez BCNU z inaktywatorem (D90¹). Wartość jeden (1) wskazywała więc na brak uczulenia przez inaktywator. Uczulenie Raji na temozolomid i uczulenie A375M na BCNU oznaczono przy użyciu odpowiednich wartości D50 (tzn. dawek, przy których występowało 50% zahamowania wzrostu).

180 681

Wrażliwość komórek ssaków na inaktywatory albo produkty ich hydrolizy

W celu określenia wpływu na wzrost komórek, komórki Xeroderma pigmentosum i komórki V79 chomika chińskiego eksponowano na rosnące stężenia (do 600 μΜ) wybranych inaktywatorów przez 2 godziny w 37°C. W pewnych przypadkach inaktywatorom pozwalano ulec hydrolizie w 37°C. przez 20 godzin, a następnie dodawano do komórek Raji w celu określenia stopnia, do którego produkty rozkładu czynników mogą zahamować wzrost komórek. Po 6 dniach określano nadmiar wzrostu komórek jak to opisano wyżej.

Uczulanie komórek szpiku na temozolomid (test GM-CFC)

Do testu komórek tworzących kolonie granulocytamomakrofagalne (GM-CFC) uzyskano próbki ludzkiego szpiku od pacjenta poddawanego kardiotorakochirurgii. Po usunięciu erytrocytów z próbki, komórki wysiewano w gęstości 1-2 x 10⁵/ml w pożywce Iscove’a o osmolamości równej 300 mOsM zawierającej 10 μΜ inaktywator albo odpowiednią objętość DMSO, 20% płodowej surowicy cielęcej, 10% pożywki uwarunkowanej 5637 jako źródło czynników wzrostowych i 0,3% agaru noble, w 1 ml szalkach Petriego zawierających odpowiednią dawkę temozolomidu i inkubowano w 37°C w atmosferze 5% CO₂ i 95% powietrza. Po 9 dniach liczono kolonie zawierające więcej niż 50 komórek. Kolonie oznaczały komórki prekursorowe linii granulocytamomakrofagalnej (huGM-CFC). Przeżywalność wyrażano jako % liczby kolonii przy zerowej dawce temozolomidu.

Badania nad przeszczepami obcogatunkowymi

Zwierzęta

Bezgrasicze samce myszy szczepu BALB/c (bezgrasicze nu/nu) ważące między 25 a 35 g, uzyskano z kolonii wsobnej Paterson Institute for Cancer Research, Christie Hospital NHS Trust, Wilmslow Road, Manchester M20 9ΒΧ, England (myszy ASU). Zwierzęta trzymano w jałowym otoczeniu do czasu wymaganego przez eksperymenty. W jednym z doświadczeń użyto myszy uzyskanych z Harlan-Olac, Harlan UK Limited, Shaw’s Farm, Blackthom, Bicester, Οχοη. ΟΧ6 OPT, England (myszy OLAĆ). Myszy te ważyły między 17 a 23 g 1, jak stwierdzono, były bardziej wrażliwe na toksyczny wpływ połączonego traktowania (inaktywator i BCNU). Z tego powodu podawano niższe dawki.

Komórki

Komórki A375M (ludzki czerniak) hodowano w DMEM zawierającym 10% płodowej surowicy wołowej. Komórki przygotowano do zaszczepienia in vivo przez inkubację z 0,01% trypsyną.

Guzy

Komórki (10⁶) w 100 μΐ PBS wstrzykiwano podskórnie w prawy bok 8-10 tygodniowych bezgrasiczych myszy nu/nu. Komórkom tym pozwalano rozwinąć się w guz przez 3-4 tygodnie w celu pasażowania na zwierzęta doświadczalne. Kawałki guza mierzące 2 mm x 2 mm x 2 mm wszczepiano podskórnie w prawy bok. Zwierzęta te były gotowe do doświadczeń z zastosowaniem inaktywatora po 7-10 dniach.

Traktowanie lekami

Myszy nu/nu traktowano 30 albo 60 mg/kg Q⁶-benzyloguaniny albo B.4205 albo odpowiednią kontrolą nośnika (i.p.) 60-90 minut przed podaniem 10-25 mg/kg BCNU (i.p.). Q⁶-benzyloguaninę i B.4205 przygotowano jako roztwór 5 mg/kg w oleju kukurydzianym, zaś BCNU (2 mg/ml) w PBS + 3% etanol.

Pomiar guza

Pomiary ksenoprzeszczepu guza wykonywane były co 1 -2 dni przez pracowników przy użyciu cyfrowej suwmiarki. Objętość guza obliczana była według wzoru (h x w χ 1) π/6. Zwierzęta doświadczalne były również ważone co 1-2 dni. Pomiary kontynuowano dopóki guzy u zwierząt kontrolnych nie osiągnęły maksymalnej dopuszczalnej objętości (tzn. 1 cm x 1 cm χ 1 cm).

W tablicach 4, 5 i 6 przedstawione są dane fizyczne, biochemiczne i in vivo dla każdego z inaktywatorów. Wymienione testy są objaśnione w części zatytułowanej „Metody”.

180 681

Tablica 4

O 9 o Q

1,0 μΜ

Ch

*3,8 ± 1,8

8,0

6,0

2,8

10,7

2,9

o_

CM

10,0

2,5

zL Ul θ'

OO

θ' Ή G> CN

CN

<o 1—

1—

Ch r—M

X^ r—<

ci

Uczulanie Raji 0,1 μΜ

r-

θ' Ή Ch

X ci

00

X 1-H

ui 1—<

ci

CM

ł“<

<o

1-H

x~

CN^

Tl/2 (h) w PBS

x

X Λ

θ'

X θ'

X Λ

X A

CM θ'

X A

CN θ'

X A

x

X A

Raji I₅₀(μΜ)

O θ'

^r o, θ'

cm G> θ'

X o θ'

UC θ'

o A

Ul <O θ'

cc O θ'

A

O*

X o_ θ'

uc θ'

Tl/2 (h) w buforze I

't

τΤ X Λ

3 A

cc

CN

o 00 Λ

cc F^-H

o?

(Wił) °T

cc

o θ'

CN CN

cc o θ'

00 o o

O θ'

uc θ'

Ul cc

cc τΓ θ'

CM O θ'

Ul o

O X A

O o Ul A

oo Ul

Ul oo

Ch

O T-Ή

Ul Χ^ θ'

cc θ'

Ch θ'

O X

C. cz.

CN

F 4

Ch 1—

o CN

cm CN

Ch CM

cc CN

CN

Ul CM

Ch Ch CM

Ch. CN

X X CN

X CN

Ul Ul CM

X CN

«X CM

o X CN

CM CC

X

o co CM

Inaktywator

ce s i o a <υ X Ol

Λ .2 s a o Ol

B 4203 O⁶-furfuryloguamna 1/2 H₂0 1

B 4205 O⁶-tenyloguanina 1/3 EtOH

B 4206 O⁶-(3-tienylometylo)guanina · 1/3 MeOH

B.4209 O⁶-(3-furylometylo)guanina

B 4210 O⁶-(2-pikohlo)guanma 1/2 H₂O

B 4211 0⁶-(2-pikolilo)guamna 1/2 H₂O

B 4212 O⁶-piperynyloguamna 1/2 H₂0

B 4213 O⁶-(2-naftylometylo)guanina

B.4214 O⁶-(a-metylobenzylo)guanina

B .4217 DL-O⁶-(a-metylotenylo)guanina

CS G £ CS 3 0JO 8 <υ X o (D s CL o¹O oo CN CQ

B.4219 DL-O⁶-[l-(3-tienylo)etylo]guamna

B 4220 O⁶-(5-metylotenylo)guanina

B.4221 O⁶-(5-metylofurfiirylo)guanina 1/2 H₂O

B.4222 O⁶-(3-metylotenylo)guanina

B 4226 O⁶-(2-benzo[b]tienylometylo)guamna · 1 MeOH

B 4229 O⁶-(5-metoksykarbonylofurfurylo)guamna · 1,5 H₂0

B.4231 O⁶-(2-metoksybenzrylo)guanina 1/2 H₂O

180 681 cd tablic'

O\

1,0

00

<o T“H

r-

Mi

<o Λ

Mi Λ

00

Mi Λ

O

Mi

Λ

O

TT

O Mi

rC

O

0,035

jn θ'

0,0045

m CN <o

0,006

θ'

0,033

θ'

Cl θ'

IC) θ'

Ch θ'

Mi

CC

cc

Mi

00

Mi

s

CM

00

r*i

CC

rc

CM

CN

CM

Tt

CN

CM

rc

—

>-karboksyfurfurylo)guanma

l-naftylometylo)guaruna 1/2 MeOH

ł-benzofuranylometylo)guanma · 1 MeOH

tperonyloguanozyna · 2 LEO

5-bromotenylo)guamna

5-azapiperonylo)guanma 1/4 EtOH

5-cyjanofurfurylo)guanina · H₂O

5-oksazolilometylo)guanina · 1/4 EtOH

>-tiazohlometylo)guanina 1/2 H₂0

l-benzo[b]tienylometylo)guanozyna · H₂0

-pikohloguamna

OS g c 3 on o CM Έ h CU s o £ w 8

nyloguanozyna 1/2 H₂O

9*

Tj

tu w

Ol

o Ol «η kQ

O Ol Ό Mi

o Ol 00 Mi

Ol o. Mi

Ol T“H

Ol m

Ol

Ol UD

Ol o

₉O LL<

o Ol 00

Ol O\

m

ffl

β

Μ β

ffl

m

ζτ m

¢0

n

m

O

180 681

Tablica 5

Inaktywacja ATazy w komórkach ssaków I₅₀ (μΜ)

Inaktywator	Lima komórkowa
Chomik +120	Szczur Yoshida	Człowiek XP	Człowiek RAJI	Człowiek WiDr
Q⁶-benzyloguanina	0,20	0,14	0,07	0,10	>0,90
B4203	0,12	0,06	0,06	0,04	0,08
B4205	0,03	0,02	0,03	0,02	0,02

Tablica 6

Uczulanie A375M (D₆₀ ')

Inaktywator	0,5 μΜ	1,0 μΜ	5,0 μΜ
Q⁶-benzyloguanina	3,1	3,3	4,2
Q⁶-alhloguamna	1,3		1,9
B4203	2,0		2,5
B4205	2,8	2,3	3,5
B.4206	3,3		4,6
B4209		2,5
B4210		1,5
B.4212	2,3		2,5
B.4213		2,0
B.4220		1,3
B4221		Ι,ο
B4222		1,4
B4226	3,8		4,5
B.4229		1,8
B.4234		0,8
B.4266	6,3		6,3

Figura 1 pokazuje wynik testu inaktywacji ATazy in vitro przy użyciu 4 związków. B.4206 był nieco bardziej efektywny niż BeG, ale B.4212 i B.4205 były wyraźnie lepsze w warunkach zastosowanych w teście. B.4203 nie był tak efektywny jak BeG.

Figura 2 pokazuje, że 0,1 μΜ inaktywator, B.4205 był bardziej efektywny niż BeG w uczulaniu komórek Raji na hamujący wzrost wpływ BCNU; przy stężeniu 0,1 μΜ, B.4205 i BeG były podobnie efektywne w tym względzie.

Figura 3 pokazuje, że przy stężeniu 0,1 μΜ, B.4205 był bardziej efektywny niż BeG w uczulaniu komórek Raji na hamujący wzrost wpływ temozolomidu, ale że w miarę wzrostu dawki inaktywatorów, uczulanie przez BeG stawało się bardziej efektywne, podczas gdy B.4205 zostawało takie same. Ten brak odpowiedzi na dawkę z użyciem B.4205, a wyraźna odpowiedź na dawkę z użyciem BeG jest jeszcze wyraźniejsza na figurze 4.

Figura 5 pokazuje, że B.4203 w nadmiernych dawkach rzędu 100 μΜ (tzn. przynajmniej 100x wyższych niż dawka I50 tego związku) powodował pewne zahamowanie wzrostu komórek B79, nie obserwowano takiego efektu z B.4205 aż do maksymalnych stosowanych stężeń.

180 681

Figura 6 pokazuje, że komórki XP były tak samo wrażliwe na hamujący wzrost wpływ B.4203 jak V79, ale były od nich wrażliwsze na wpływ B.4205. Jednakże, dawki konieczne do zahamowania wzrostu były przynajmniej 100x wyższe niż niezbędne do inaktywacji ATazy. Może być uznane, że niezbieżny wpływ hamujący wzrost wywierany przez te inaktywatory nie powinien wpływać znacząco na uczulanie komórek na hamujący wzrost wpływ środków alkilujących.

Figura 7 pokazuje, że spowodowano znaczący wpływ hamujący wzrost u komórek Raji gdy dane związki poddano hydrolizie (patrz Metody) przed dodaniem ich do komórek dalszego dodania środków alkilujących. W podanych warunkach doświadczalnych, nie oczekiwano wpływu produktów dekompozycji czynników na zahamowanie wzrostu obserwowane z użyciem połączenia tych czynników i środków alkilujących.

Figury od 8 do 13 pokazują bardziej szczegółowo wyniki badania z użyciem przeszczepów obcogatunkowych. Usunięcie i odzyskiwanie aktywności ATazy w następstwie ekspozycji na Q⁶-benzyloguaninę albo B.4205 mierzono w ekstraktach przeszczepów obcogatunkowych nowotworu A375 (fig. 8) wykonanych z tkanek zwierząt zabitych 2 i 24 godziny po podaniu inaktywatora.

Figury 8-13 wskazują na uczulenie ksenoprzeszczepów nowotworu A375 u myszy nagich przez Q⁶-benzyloguaninę albo B.4205 w połączeniu z BCNU jak to opisano w rozdziale Metody. W każdej z figur górny wykres przedstawia procent wzrostu objętości guza w stosunku do czasu trwania doświadczenia. Dolny wykres pokazuje liczbę zwierząt w każdej z grup i liczbę zwierząt, które przeżyły po leczeniu. Wykres pokazuje, że B.4205 jest porównywalny z Q-benzyloguaniną (BeG) w zmniejszaniu objętości guza i jest znacząco mniej toksyczny w połączeniu z BCNU niż BeG w połączeniu z BCNU. U pacjentów ludzkich, skórny czerniak złośliwy jest leczony BCNU, szczególnie w USA (Balch, C.M., Houghton, A., Peters, L. (1989) „Cutaneous Melanoma” w Cancer: Principles and Practise of Onkology, De Vita, V.T., Helman, S. i Rosenberg, S.A. (wyd), str. 1499-1542, Lippincott: Philadelphia), tak więc przeszczepy obcogatunkowe ludzkiego czerniaka rosnące na myszach nagich stanowią model zwierzęcy o dużym znaczeniu klinicznym.

Figura 14 pokazuje wyniki nad uczulaniem ludzkich komórek szpiku na temozolomid jak to opisano wyżej w rozdziale Metody. Komórki szpiku uzyskano od trzech pacjentów oznaczonych odpowiednio jako C, D i E. Krzywe przeżywalności pokazują wpływ cytotoksyczny połączonego traktowania inaktywatorem i temozolomidem. Jest pożądane by ten wpływ zmniejszyć. Wyniki u pacjentów C i E pokazują, że B.4205 wykazywał mniejszy wpływ uczulający niż Q⁶-benzyloguanina (Q⁶BeG); u pacjenta D nie było różnic ale wynik ten uważany jest jako normalna odmienność w badaniach naukowych na materiale ludzkim.

Tablica 7 pokazuje wpływ cytotoksyczny samego inaktywatora na komórki szpiku uzyskane od pacjentów od A do E, włączywszy tych samych pacjentów od C do E z figury 17. Wyniki dla B.4205 są porównywalne z uzyskanymi dla Q⁶-benzyloguaniny. Odnotować należy, że komórki pacjenta B były prawie dwukrotnie bardziej czułe na BeG jak i na B.4205 w porównaniu z innymi próbkami.

Tablica 7

Toksyczność inaktywatora (10 μΜ) dla komórek szpiku

Pacjent	Data doświadczenia	Liczba kolonii jako % kontroli (tzn bez inaktywatora)
Q⁶-benzyloguanma	B4205
A	05/02/93	95	91
B	25/03/93	46	46
C	17/05/93	88	97
D	05/05/93	88	118
E	05/05/93	89	89

180 681

Podsumowanie wyników

1) Wszystkie związki badano na ich zdolność do inaktywacji rekombinowanej ludzkiej ATazy w standardowych warunkach w teście in vitro. W warunkach tych dwa ze związków (B.4214 i B.4217) nie inaktywowały ATazy aż do najwyższych stosowanych stężeń ale były to związki, w których R' oznacza metyl. Pozostałe związki inaktywowały ATazę z wartościami I50 zawierającymi się od 0,0045 do 95 μΜ. Osiem związków (B.4205, B.4206, B.4212, B.4226, B.4266, B.4269, B.4273, B.4275) posiadało wartości I50 niższe niż BeG (tablica 4).

2) Inaktywatory ulegają hydrolizie w roztworach wodnych w różnym tempie (półokres trwania od 0,17 do > 80 godzin) ale nie jest to związane z ich efektywnością jako inaktywatory ATazy (tablica 4).

3) Związki, które były aktywne w inaktywacji ATazy in vitro (I50 <1,0 μΜ) inaktywowały również ATazę w komórkach ludzkich z wartościami I50, które były generalnie tylko nieznacznie (średnio około 1,5 raza) wyższe niż określone przy użyciu białka rekombinowanego w teście in vitro (tablica 4).

4) B.4205 inaktywował ATazę w komórkach ludzkich, szczurzych i chomika chińskiego z podobną efektywnością (wartości I50 0,02-0,03). Dla B.4203 zakres wynosił 0,04-0,12. W użytych liniach komórkowych B.4205 i B.4203 były do 7-krotnie bardziej efektywne niż BeG (tablica 5).

5) B.4203 i B.4205 były toksyczne dla badanych komórek XP, zaś B.4203 był toksyczny dla komórek V79, ale wyłącznie w stężeniach przynajmniej 100-krotnie wyższych od tych, przy których obserwowano uczulenie na BCNU (fig. 5 i 6).

6) Związki, które były bardziej efektywne w inaktywacji ATazy in vitro (I50 <1,0 μΜ) iw komórkach Raji (I50 < 1,0 μΜ) uczulały również komórki Raji i A375M na hamujący wzrost wpływ BCNU, gdzie był badany (tablica 4).

7) Przy stężeniach inaktywatora rzędu 0,1 μΜ, B.4205 był bardziej efektywny niż BeG w uczulaniu komórek Raji na hamujący wzrost wpływ temozolomidu (fig. 3).

8) Test in vitro może być zastosowany do przewidywania, które związki będą najprawdopodobniej efektywne w uczulaniu komórek ssaków na hamujący wzrost wpływ BCNU i pokrewnych związków cytotoksycznych.

9) B.4205 był podobnie lub nieco mniej efektywny niż BeG w uczulaniu przeszczepów obcogatunkowych ludzkiego czerniaka rosnących na myszach nagich, na hamujący wzrost wpływ BCNU (fig. od 9 do 13).

10) B.4205 był tak samo efektywny jak BeG w inaktywacji ATazy w przeszczepach obcogatunkowych czerniaka ludzkiego rosnących na myszach nagich (fig. 8).

11) Test in vitro i/lub test usuwania ATazy w ksenoprzeszczepach może być zastosowany w celu przepowiedzenia, które związki są najprawdopodobniej efektywne w uczulaniu przeszczepów obcogatunkowych czerniaka na hamujący wzrost wpływ BCNU i pokrewnych związków cytotoksycznych.

12) W przeciwieństwie do BeG, który powodował śmierć do 70% traktowanych nim zwierząt, B.4205 wywierał bardzo mały wpływ na wrażliwość myszy nagich noszących przeszczep obcogatunkowy ludzkiego czerniaka, na ostrą toksyczność BCNU w zastosowanych warunkach (fig. od 9 do 13).

13) BeG uczulał GM-CFC w trzech próbkach ludzkiego szpiku na toksyczny wpływ temozolomidu, ale w dwóch z tych próbek B.4205 wywoływał słabe lub żadne uczulenie. Test ten może być więc stosowany do przewidywania prawdopodobnego wpływu mielosupresyjnego inaktywatorów ATazy podczas stosowania klinicznego w połączeniu z BCNU i pokrewnymi środkami (fig. 14).

180 681

LITERATURA

1. W.N. Haworth i W.G.M. Jones, L Chem. Soc., 1944, 667.

2. T. Reichstein, Helv. Chim. Acta, 9, 1926, 1066.

3. V. Bocchi, G. Casnati, A. Dossena i R. Marchelli, Synthesis, 1979, 961.

4. P.A. Finan, J. Chem. Soc.. 1963, 3917; J.A. Moore i J.E. Kelly, J. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed„ 22, 1984, 863.

5. J. Kiermayer, Chemiker-Zeitung, 19,1985, 1004.

6. A. Carotti, F. Campagna i R. Ballini, Synthesis, 1979, 56.

7. A.J. Floyd, R.G. Konsman, Y. Roshan-Ali and D.W. Brown, Tetrahedron. 39, 1983, 3881.

8. V.T. Suu, N.P. Buu-Hoi and N.D. Xuong, Buli. Soc. Chim. France, 1962, 1875.

9. T. Reichstein and L. Reichstein, Helv. Chim. Acta, 13, 1930,1275.

10. H. Takeshita, H. Mametsuka i H. Motomura, J. Heterocycl. Chim.. 23, 1986, 1211.

11. F.J. Wolf and J. Weijlard, Org, Synth.. Coli. Vol. 4, 1963,124.

12. A.M. van Leusen, B.E. Hoogenboom i H. Siderius, Tetrahedron Lett., 1972, 2369.

13. A. Maąuestiau, R. Flammang i F.B. Abdelouahab, Heterocycles, 29,1989, 103.

14. S. Fallab, Helv. Chim. Acta, 35,1952, 215.

15. A.S. Kende, K. Kawamura i R.J. DeVita, L Amer. Chem. Soc.. 112,1990, 4070.

16. S. Trofimenko, L Org. Chem.. 28,1963, 3243.

17. I. Sawhney i J.R.H. Wilson (Shell Internationale), EP. 395 174, 1989 (Chem. Abs.. 114, 14341 Os).

18. F. Dallacker, P. Fechter i V. Mues, Z. Naturforsch.. 34b, 1979, 1729.

19. P. Foumari, Buli. Soc. Chim. France, 1963, 488.

20. L. Grehn, Chem. Ser., 16,1980, 72.

21. Morten, J.E.N. & Margison, G.P (1988) Carcinogenesis 9, 45-49.

22. Scudiero, D.A., Shoemaker, R.J., Pauli, K.D., Monks, A., Tiemey, S., Nofziger, T.H., Currens, M.J., Seniff, D. & Boyd, M.R. (1988), Cancer Research 48, 4827-4833.

23. Fan, C.-Y., Potter, P.M., Rafferty, J.A., Watson, A.J., Cawkwell, L., Searle, P.F., O’Connor, P.J., Margison, G.P. (1991) Nucleic Acids Res., 18, 5723-5727.

24. Carmichael, J., DeGraff, W.G., Gazdar, A.F., Minna, J.D., Mitchell, J.B. (1987), Evałuation of a tetrazolium based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing, Cancer Res., 47: 936-942.

25. Wilkinson, M.C., Potter, P.M., Cawkwell, L., Georgiadis, P., Patel, D., Swann. P.F. and Margison, G.P. (1989), Nucleic Acids Res., 17, 8475-8484.

26. Wilkinson, M.C., Cooper, D.P., Southan, C., Potter, P.M. & Margison, G.P. (1990), Nucleic Acids Res., 18, 13-16.

180 681 ν B4203

Percenłage AcłMIy Remalnlng Procent pozostałej aktywności

ng. 1

180 681

ν Β4205(0.1)

w.

-| I I : j I-----1-----ι-----1-----,-----1

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

BONU (pg/ml)

ν 84205(1.0)

-j---1---1---1---1---1---J—!---[—।---1

0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

BCNU (pg/ml)

Fig. 2

180 681

ν Β4205 (0.5) — 1 I fi ·ρι 1 1 I | T I 1 I [ ΊΤ I I | I 1 1-1 [

20 40 60 80 100

TEMOZOLOMID (μΜ) ^{r 1 1 1} | ‘ I ι I [ Γ1 I 1 j I I 1 I | '1 I I I |

Ο 20 40 60 80 100

TEMOZOLOMID (μΜ)

_t . ι { 1-1·^ < | r > τ· ι

20 40 60 80 100

TEMOZOLOMID (μΜ)

-f-r-T-r-pr-r-T-i-^^

20 40 60 80 100

TEMOZOLOMID (μΜ)

Fig. 3

180 681 $50 (μΜ)

Fig. 4

180 681

Β4205 (_μΜ)

Fig. 5

180 681

Ο χρ pHMG clone 1a • XP pHMGhAT clone 2b

B4203 (μΜ)

B4205 (μΜ)

Fig. 6

180 681

Β4203

2. Β4205

—

0.0

-J----->-----[-----.-----;-----1 I ·

0.2 0 4 0.6 0.8 1.0

10-0.0 “1—'—i—¹—i—<—i—'—J

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

1NACTIVATOR (μΜ)

INACTIVATOR (μΜ)

INAKTYWATOR

4. B4226

3. B4212

100

o o

co o (K NJ

CO O Cd N

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 wo-F

Τ'

Ϊ

10-0.0 “I—'—l—’--1—’—i—’—l

0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 !NACTlVATOR (μΜ)

INAKTYWATOR

INACTIVATOR (μΜ)

INAKTYWATOR

Fig. 7

180 681

-C

300 φ Ε i—

oiej 30 mg/kg 30 mg/kg kukurydziany

Fig. 8

180 681

700 η

600 ASU MICE MYSZY ASU BCNU APPROX. 15 mg/kg INACTIVATOR 60 mg/kg__

INAKTYWATOR

CO N 3 60

I ¹ T¹ i i ¹ ‘ i ‘ i ¹ i ł । ł

2 4 6 8 10 12 14 16 18 •N 0) N

o. UL! φ 2 £ Ξ

Ό----O-—Ο^-ΟΌ-ΟΟ-Ό-Ό-Ό-Ο-ΟΟ

BCNU + B4205

BCNU

N CO >> E c0 JO N O

BCNU + BeG

12 14 16 18

TIME (Days)

CZAS (DNI)

Fig. 9

180 681

700 η

600 --INĄKTYWATOR

ASU MICE * MYSZY ASU BONU 25 mg/Kg INACTIVATOR 60 mg/kg

A U tt U n u

H j-r i ψ¹ s y 1¾ φ φ ψ BCNU + BeG

2 4 6 8 10 12 14

TIME (Days)

CZAS (DNI)

Fig. 10

180 681

2 4 6 8 1012141618202224262830

η

- ----®----®-----Ο----®

- 'ν— V— Α7-----V— -ν-ν

10 (00-0-0—ο-ο-ο—-ο—ο-—ο-ο-ο

6 4 2 0 i ¹ I ¹ I ¹ Ί ¹¹ I ^r I ¹ Γ·· Γ ¹ i ¹ I ¹ I 'I ‘‘ Ί ¹ 1 ¹ I ¹ 1

BCNU + BeG

BCNU + Β4205

BCNU

2 4 6 8 1012141618202224262830

Fig. 11

TIME (days)

CZAS (dni)

180 681 % Objętość guza Liczba myszy, które przeżyły % TUMOUR VOLUME

No. SURVIVING MICE

1100 η

1000

900 i

800 ~

700 i

600 i

ASU MICE MYSZY ASU

BCNU 16 mg/kg _T

INACTIVATOR 60 mg/kg______ΐΝΑΚΤΥ iATOR

500 ~

400 ~

300 ~

200 -i

100

T· 0

BONU + B4205 θ BONU

20 25

X BCNU + BeG

V BCNU + B4205 ® BCNU + BeG O BCNU

......^.. t · l ¹ ' ^{1 1} 1 ¹ ' ¹ ' ¹ j l - I j I I , ,

5 10 15 20 25 30

TIME (Days)

CZAS (dni)

Fig. 12

180 681 % Objętość guza Liczba myszy, które przeżyły % TUMOUR VOLUME

No. SURVIVING MICE

1200 1000 ASU MICE Myszy ASU BCNU 16 mg/kg INACTIVATOR 60 mg/kg

INAKTYWATOR

800 -

BCNU

BCNU + BeG

BCNU + B4205 π

I ' · i ' I ł ł i ¹ ł J ł 'T ¹ 1 ‘ T' i ‘ 1

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

O BCNU

V BCNU + B4205 ® BCNU + BeG

TIME (days)

CZAS (dni)

Fig.13

180 681

ι I ι ι ρ ι ι I Γ|τ ri i | r ι ι ι । ι ι ι ι ।

10 20 30 40 50

Temozolomid (μΜ)

I I I I I | I I I Ι |ΤΓΙΓρ·Γη Ί |ΤΙ III I I I I | 0 10 20 30 40 50 60

Temozolomid· (μΜ)

10 20 30 40 50 60

Temozolomid (μΜ)

Fig. 14

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Nowe związki, pochodne Q⁶-alkiloguaniny o wzorze I:

OCHRR'

Y (I) w którym Y oznacza H lub składnik cukrowy wybrany spośród rybozylu i deoksyrybozylu;

R' oznacza H lub metyl;

R oznacza (i) 5-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym heteroatomem wybranym spośród O, N i S, ewentualnie skondensowany z pierścieniem benzenowym lub pirydynowym, lub 6-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym atomem N, przy czym grupa cykliczna może być ewentualnie podstawiona w pierścieniu (pierścieniach) heterocyklicznym i/lub w pierścieniu karbocyklicznym grupami wybranymi spośród grup C1-C5 alkilowych, chlorowców, grupy cyjanowej, nitrowej lub COOR⁵, w której R⁵ oznacza H lub C1-C5 alkil, lub (ii) naftyl;

i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
2. Związek według zastrz. 1, w którym Y oznacza H lub rybozyl, R' oznacza H lub metyl, R oznacza (i) 5-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym heteroatomem wybranym spośród O, N i S, ewentualnie skondensowany z pierścieniem benzenowym lub pirydynowym, lub 6-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym atomem N, przy czym grupa cykliczna może być ewentualnie podstawiona w pierścieniu (pierścieniach) heterocyklicznym i/lub w pierścieniu karbocyklicznym grupami wybranymi spośród grup C1-C5 alkilowych, chlorowców, grupy cyjanowej, nitrowej lub COOR⁵, w której R⁵ oznacza H lub C_rC₅ alkil, lub (ii) naftyl;

i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
3. Związek według zastrz. 1, w którym Y oznacza H lub rybozyl, R' oznacza H łub metyl, R oznacza (i) 5-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym heteroatomem wybranym spośród O, N i S, ewentualnie skondensowany z pierścieniem benzenowym lub pirydynowym, lub 6-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym atomem N, przy czym grupa cykliczna może być ewentualnie podstawiona w pierścieniu (pierścieniach) heterocyklicznym grupami wybranymi spośród grupy metylowej, chlorowców, grupy cyjanowej, nitrowej lub COOR⁵, w której R⁵ oznacza H lub metyl, lub (ii) naftyl;

i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

180 681
4. Związek według zastrz. 1, w którym Y oznacza H lub rybozyl, R' oznacza H lub metyl, R oznacza (i) 5-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym heteroatomem wybranym spośród O, N i S, ewentualnie skondensowany z pierścieniem benzenowym lub pirydynowym, lub 6-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym atomem N, przy czym grupa cykliczna może być ewentualnie podstawiona w pierścieniu (pierścieniach) heterocyklicznym grupami wybranymi spośród grupy metylowej, atomu bromu, grupy cyjanowej, nitrowej lub COOR⁵, w której R⁵ oznacza H lub metyl, lub (ii) naftyl;

i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
5. Związek według zastrz. 1, w którym Y oznacza H lub składnik cukrowy wybrany spośród rybozylu i deoksyrybozylu;

R' oznacza H lub metyl;

R oznacza (i) 5-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym heteroatomem wybranym spośród O, N i S, ewentualnie skondensowany z pierścieniem benzenowym lub 6-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym atomem N, przy czym grupa cykliczna może być ewentualnie podstawiona w pierścieniu (pierścieniach) heterocyklicznym i/lub w pierścieniu karbocyklicznym grupami wybranymi spośród grup C1-C5 alkilowych, chlorowców, grupy cyjanowej, lub (ii) naftyl;

i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
6. Związek według zastrz. 5, w którym R oznacza pierścień tiofenu ewentualnie podstawiony.
7. Związek według zastrz. 5, w którym R oznacza pierścień furanu ewentualnie podstawiony.
8. Związek według zastrz. 5, którym jest Q⁶-tenyloguanina.
9. Związek według zastrz. 5, którym jest Q⁶-(3-tienylometylo)guanina.
10. Związek według zastrz. 5, którym jest Q⁶-piperonyloguanina.
11. Związek według zastrz. 5, którym jest Q⁶-furfuryloguanina.
12. Związek według zastrz. 5, którym jest Q⁶-(3-furylometylo)guanina.
13. Związek według zastrz. 1, którym jest Q⁶-(2-benzo[b]tienylometylo)guanina.
14. Związek według zastrz. 1, którym jest Q⁶-(2-benzofuranylometylo)guanina.
15. Związek według zastrz. 1, którym jest Q⁶-(5-tiazolilometylo)guanina.
16. Związek według zastrz. 1, którym jest Q⁶-(5-metoksykarbonylofurfurylo)guanina.
17. Związek według zastrz. 1, którym jest Q⁶-(5-bromotenylo)guanina.
18. Związek według zastrz. 1, którym jest Q⁶-(5-cyjanofurfurylo)guanina.
19. Związek według zastrz. 1, którym jest Q⁶-(benzo[b]tienylometylo)guanozyna.
20. Związek według zastrz. 1, którym jest Q⁶-(4-pikolilo)guanina.
21. Związek według zastrz. 5, którym jest Q⁶-(2-naftylometylo)guanina.
22. Sposób wytwarzania pochodnych Q⁶-alkiloguaniny o wzorze I:

OCHRR'

Y w którym Y oznacza H lub składnik cukrowy wybrany spośród rybozylu i deoksyrybozylu; R' oznacza H lub metyl;

180 681

R oznacza (i) 5-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym heteroatomem wybranym spośród O, N i S, ewentualnie skondensowany z pierścieniem benzenowym lub pirydynowym, lub 6-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym atomem N, przy czym grupa cykliczna może być ewentualnie podstawiona w pierścieniu (pierścieniach) heterocyklicznym i/lub w pierścieniu karbocyklicznym grupami wybranymi spośród grup C1-C5 alkilowych, chlorowców, grupy cyjanowej, nitrowej lub COOR⁵, w której R⁵ oznacza H lub C1-C5 alkil, lub (ii) naftyl;

znamienny tym, że poddaje się reakcji wodorek sodu z roztworem związku o wzorze RR'CHOH, w którym R i R' mają podane wyżej znaczenia, w organicznym rozpuszczalniku, dodaje się chlorku 2-amino-N,N,N-trimetylo-lH-puryno-6-aminiowego lub rybozydu 2-amino6-chloropuryny, traktuje się słabym kwasem i eterem i ekstrahuje się żądany produkt.
23. Sposób wytwarzania pochodnych Q⁶-alkiloguaniny o wzorze I:

OCHRR'

Y (I) w którym Y oznacza H lub składnik cukrowy wybrany spośród rybozylu i deoksyrybozylu;

R' oznacza H lub metyl;

R oznacza (i) 5-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym heteroatomem wybranym spośród O, N i S, ewentualnie skondensowany z pierścieniem benzenowym lub 6 członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym atomem N, przy czym grupa cykliczna może być ewentualnie podstawiona w pierścieniu (pierścieniach) heterocyklicznym i/lub w pierścieniu karbocyklicznym grupami wybranymi spośród grup C1-C5 alkilowych, chlorowców, grupy cyjanowej, lub (ii) naftyl;

znamienny tym, że poddaje się reakcji wodorek sodu z roztworem związku o wzorze RR'CHOH, w którym R i R' mają podane wyżej znaczenia, w organicznym rozpuszczalniku, dodaje się chlorku 2-amino-N,N,N-trimetylo-lH-puryno-6-aminiowego lub rybozydu 2 amino6-chloropuryny, traktuje się słabym kwasem i eterem i ekstrahuje się żądany produkt.
24. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera pochodną Q⁶-alkiloguaniny o wzorze I:

OCHRR'

Y (I) w którym Y oznacza H lub składnik cukrowy wybrany spośród rybozylu i deoksyrybozylu; R' oznacza H lub metyl;

180 681

R oznacza (i) 5-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym heteroatomem wybranym spośród O, N i S, ewentualnie skondensowany z pierścieniem benzenowym lub pirydynowym, lub 6-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym atomem N, przy czym grupa cykliczna może być ewentualnie podstawiona w pierścieniu (pierścieniach) heterocyklicznym i/lub w pierścieniu karbocyklicznym grupami wybranymi spośród grup C1-C5 alkilowych, chlorowców, grupy cyjanowej, nitrowej lub COOR⁵, w której R⁵ oznacza H lub C1-C5 alkil, lub (ii) naftyl;

lub jej farmaceutycznie dopuszczalną sól jako substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.
25. Kompozycja według zastrz. 24, znamienna tym, że zawiera dodatkowo środek alkilujący.
26. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że jako środek alkilujący zawiera 1,3-bis-(2-chloroetylo)-1 -nitrozomocznik (BCNU).
27. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że jako środek alkilujący zawiera temozolomid.
28. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera pochodną Q⁶-alkiloguaniny o wzorze I:

OCHRR'

Y w którym Y oznacza H lub składnik cukrowy wybrany spośród rybozylu i deoksyrybozylu;

R' oznacza H lub metyl;

R oznacza (i) 5-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym heteroatomem wybranym spośród O, N i S, ewentualnie skondensowany z pierścieniem benzenowym lub 6-członowy pierścień heterocykliczny z co najmniej jednym atomem N, przy czym grupa cykliczna może być ewentualnie podstawiona w pierścieniu (pierścieniach) heterocyklicznym i/lub w pierścieniu karbocyklicznym grupami wybranymi spośród grup Cj-Cs alkilowych, chlorowców, grupy cyjanowej, lub (ii) naftyl;

lub jej farmaceutycznie dopuszczalną sól jako substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.
29. Kompozycja według zastrz. 28, znamienna tym, że zawiera dodatkowo środek alkilujący.
30. Kompozycja według zastrz. 29, znamienna tym, że jako środek alkilujący zawiera 1,3-bis-(2-chloroetylo)-1 -nitrozomocznik (BCNU).
31. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że jako środek alkilujący zawiera temozolomid.

* * *