PL180871B1

PL180871B1 - Sposób wytwarzania kwasu 4-metylotio-2-hydroksy-masłowego

Info

Publication number: PL180871B1
Application number: PL95319298A
Authority: PL
Inventors: Olivier Favre-Bulle; Marie-Claude Bontoux; Denis Largeau; André Ariagno
Original assignee: Rhone Poulenc Nutrition Animal
Priority date: 1994-09-22
Filing date: 1995-09-19
Publication date: 2001-04-30
Also published as: DE69506430T2; RU2144959C1; CN1077599C; FI971198A7; DK0782629T3; US5814497A; AU699625B2; EP0782629A1; FI971198L; CN1158640A; DE69506430D1; AU3476495A; UA48953C2; SK37697A3; BR9509176A; NZ292559A; EP0782629B1; JPH10507631A; HU220860B1; ATE174059T1

Abstract

1. Sposób wytwarzania racemicznego kwasu 4-metylotio-2-hydroksymaslowego, zna- mienny tym, ze 4-metylotio-2-hydroksy-butyronitryl poddaje sie hydrolizie za pomoca ni- trylazy wybranej sposród komórek Alcaligenes faecalis ATCC-8750, Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM BP-3857, lub Gordona terrae FERM- BP-4535. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu 4-metylotio-2-hydroksymasłowego poprzez hydrolizę 4-metylotio-2-hydroksybutyronitrylu za pomocą nitrylazy jako katalizatora hydrolizy grupy nitrylowej do grupy karboksylowej. W szczególności dotyczy on zastosowania nitrylazy wybranej spośród nitrylaz mikroorganizmów Alcaligenes faecalis złożonych pod numerem ATCC 8750, Rhodococcus sp. HT 29-7 złożonych pod numerem FERM BP-3857 lub Gordona terrae MA-1 złożonych pod numerem FERM BP-4535.

Nitrylazę Alcaligenes faecalis opisano np. w opisach patentowych europejskich i japońskich opublikowanych pod numerami EP 348 901 i JP 03 224 496, obydwu udzielonych firmie ASAHI. W tych opisach, a zwłaszcza w europejskim, nitrylaza jest użyta do wytwarzania racemicznych kwasów optycznie czynnych wychodząc z nitryli. Korzystne nitryle wyjściowe są podstawione i mają łańcuch alkilowy zawierający korzystnie 1 do 3 atomów węgla lub grupę aromatyczną. Przykład 11 wyżej wspomnianego opisu patentu europejskiego opisuje hydrolizę nitrylu kwasu migdałowego racemicznego przez Alcaligenes faecalis; kwas migdałowy R-(-) otrzymuje się przy nadmiarze enancjomerycznym 91%. Opis patentowy europejski 486 289 i jego odpowiednik amerykański US 5 326 702 firmy NITTO CHEMICAL opisują zastosowanie

180 871

Alcaligenes sp. BC35-2 (FERM nr 11265 lub FERM-BP-3318) do hydrolizy nitrylu kwasu migdałowego w obecności siarczynu; kwas migdałowy otrzymuje się w tym przypadku przy nadmiarze enancjomerycznym około 98%.

Opis patentowy JP 04 341 185 firmy ASAHI opisuje ponadto wytwarzanie i zastosowanie nitrylazy Acaligenes facalis ATCC 8750 do rozwiązania problemów związanych z wytwarzaniem związków optycznie czystych wychodząc z ich racemicznego nitrylu racemicznego. Nitrylaza enancjoselektywna opisana w opisie patentowym japońskim cytowanym powyżej jest zdolna najbardziej korzystnie do hydrolizowania 2-hydroksynitrylu o następującym wzorze ogólnym (I) w kwas 2-hydroksykarboksylowy o następującym wzorze (II)

OH

R-Ć-CN (I) i

H

OH

I

R-C—COOK (||)

H w których R oznacza aryl ewentualnie podstawiony lub grupę heterocykliczną ewentualnie podstawioną. W tym opisie patentowym wskazuje się, że hydroliza nitrylu kwasu migdałowego przez wspomnianą nitrylazę pozwala otrzymać 100% nadmiaru enancjomerycznego kwasu R-(-) migdałowego. W przykładzie 5 wskazano, że wspomniana nitrylaza może być wykorzystana do hydrolizy nitryli alifatycznych takich jak waleronitryl, akrylonitryl, 2-chlorowcopropionitryle i chloroacetonitrile. Nie podano szczegółów odnośnie enancjoselektywności tej hydrolizy nitryli alifatycznych o centrum asymetrii.Ten tekst podaje także, że nitrylaza Alcaligenes faecalis ma optimum aktywności przy pH zawartym między 6.5 i 8.0, a temperatura stosowania wspomnianego enzymu powinna zawsze, według tego odsyłacza, być poniżej 45°C.

Zaskakująco okazało, że gdy wspomniany enzym Alcaligenes faecalis ATCC 8750, został użyty do hydrolizy 4-metylotio-2-hydroksybutyronitrylu, przeprowadził tę hydrolizę bez żadnej selektywności z punktu widzenia czystości optycznej. Enzym ten hydrolizuje wspomniany nitryl tworząc mieszaninę racemiczną dwóch kwasów bez żadnej przewagi jednego lub drugiego z izomerów.

Nitrylaza Rhodococcus sp. HT 29-7 złożona pod numerem FERM BP-3857 jest opisana np. w opisach patentowych europejskim i amerykańskim opublikowanych pod numerami, odpowiednio, EP 610 049 i US 5 296 373, w obydwu przypadkach udzielonych firmie NITTO. W tych opisach patentowych, a zwłaszcza w opisie amerykańskim nitrylaza jest użyta do wytworzenia z nitryli racemicznych nośnika grupy fenylowej kwasów optycznie czynnych. Nitryle wyjściowe wszystkie mają ugrupowanie aromatyczne, dotyczy to zasadniczo hydrolizy nitrylu kwasu migdałowego lub jego pochodnych podstawionych w pierścieniu aromatycznym. Przykład 1 opisu patentowego amerykańskiego wspomnianego wyżej opisuje hydrolizę nitrylu kwasu migdałowego racemicznego przez Rhodococcus sp. HT 29-7; kwas migdałowy R-(-) otrzymuje się przy nadmiarze enancjomerycznym 100%. Przykład 2 opisuje hydrolizę podstawionych w pierścieniu pochodnych nitrylu kwasu migdałowego, nadmiar enancjomeryczny pochodnej kwasu migdałowego także wynosi 100%; tak samo jest, gdy przeprowadza się hydrolizę nitryli aldehydu benzoesowego.

Patent europejski 610 049 firmy NITTO CHEMICAL opisuje użycie Rhodococcus sp.. HT 29-7 (FERM BP-3857), Alcaligenes sp. BC35-2 (FERM BP-3318) lub Brevibacterium acetylicum IAM 1790 do hydrolizy α-hydroksynitryli podstawionych w pozycji γ pierścieniem aromatycznym do optycznie czynnego kwasu α-hydroksykarboksylowego podstawionego

180 871 grupą fenylową. Kwasy otrzymane przy użyciu Rhodococcus sp. HT 29-7 wykazują wciąż zmienne nadmiary enancjomeryczne stosownie do wyjściowego nitrylu i obecności lub nieobecności kwasu fosforowego (pH ustalone około 8,2).

Nieoczekiwanie okazało się, że gdy wspomniany enzym Rhodococcus sp. HT 29-7 (FERM BP-331 8), użyty jest do hydrolizy 4-metylotio-2-hydroksybutyronitrylu, przeprowadza tę hydrolizę bez żadnej selektywności z punktu widzenia enancjomerycznego. Enzym ten hydrolizuje wspomniany nitryl tworząc mieszaninę racemiczną dwóch kwasów bez żadnej przewagi jednego lub drugiego z izomerów.

Nitrylaza Gordona terrae MA-1 złożona pod numerem FERM BP-4535 jest opisana w opisie patentowym europejskim 0 610 048 w zastosowaniu do hydrolizy nitryli - nośników grupy fenylowej w pozycji y i grupy hydroksylowej w pozycji a do odpowiedniego kwasu optycznie czynnego. Nadmiar enancjomeryczny we wszystkich przykładach zmienia się między 92 i 100%.

Nieoczekiwanie okazało się, że gdy wspomniany enzym Gordona terrae MA-1 złożony pod numerem FERM BP-4535, użyty jest do hydrolizy 4-metylotio-2-hydroksybutyronitrylu, przeprowadza tę hydrolizę bez żadnej selektywności z punktu widzenia enancj omerycznego. Enzym ten hydrolizuje wspomniany nitryl tworząc mieszaninę racemicznądwóch kwasów bez żadnej przewagi jednego lub drugiego z izomerów.

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania racemicznego kwasu 4-metylotio-2-hydroksymasłowego przez hydrolizę racemicznego 4-metylotio-2-hydroksybutyronitrylu za pomocą nitrylazy z następujących mikroorganizmów: Alcaligenes faecalis złożony pod numerem ATCC 8750, Rhodococcus sp. HT 29-7 złożony pod numerem FERM BP-3857 lub Gordona terrae MA-1 złożony pod numerem FERM BP-4535.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku, mikroorganizm może być użyty takim jaki jest lub jako immobilizowany na podłożach dobrze znanych specjaliście z dziedziny techniki. Skądinąd informacja genetyczna kodująca enzym może być przeniesiona z mikroorganizmu macierzystego (takiego jak A. faecalis ATCC8750) do mikroorganizmu takiego jak Bacillus subtilis.

Odmiana sposobu wynalazku polega na użyciu w odpowiedniej ilości, w miejsce mikroorganizmu, jego enzymu wolnego lub immobilizowanego, całkowicie lub częściowo oczyszczonego. Zastosowanie 4-metylotio-2-hydroksybutyronitrilu umożliwia wytworzenie hydroksyanalogu racemicznej metioniny. Ta technologia wytwarzania pochodnych metioniny pozwala na uniknięcie tworzenia w znacznych ilościach mineralnych produktów wtórnych, których odpady stwazają coraz więcej problemów z powodu ograniczeń dotyczących ochrony środowiska. Enzymy te w ramach niniejszego wynalazku wykazują aktywność nitrylazy w obszarze pH między 4 i 11 i optimum aktywności przy pH między 5 i 9. Ich optymalna temperatura stosowania jest zawarta między 30 i 60°C, zwłaszcza między 30 i 50°C. Korzystnie pracuje się przy stężeniu nitrylu w roztworze wyjściowym zawartym między 10 mmoli i 400 mmoli na litr, a zwłaszcza między 50 i 200 mmoli na litr. Stężenie soli amonowej otrzymanego kwasu ma mały wpływ na aktywność enzymu, gdy jest mniejsze od 2 moli na litr ijest ono korzystnie zawarte między 0,1 i 1,5 moli na litr. Wynalazek będzie pełniej opisany za pomocą następujących przykładów, które nie powinny być uważane jako ograniczenie wynalazku.

Przykład 1

Mikroorganizm Alcaligenes faecalis ATCC 8750 hodowano w następującym ośrodku:

Octan amonu 10 g/l

Ekstrakt drożdży 5 g/l

Pepton 5 g/l

K₂HPO₄ 5 g/l

MgSO₄ -7H2O 0,:2 g/l

FeSO4 YH2O 30 mg/l

NaCl 1 g/l

Benzonitryl 0,5 g/l pH 7,:2

180 871

Hodowlę prowadzono w 30°C w kolbach Erlenmeyera (2 litry) zawierających 600 ml ośrodka. Całość mieszano (150 obr/min) przez 30 h. Osad komórkowy odzyskano, przemyto roztworem NaCl 9 g/l, a następnie wymrożono.

Warunki wykonania hydrolizy butyronitrylu:

4-metylotio-2-hydroksybutyronitryl 50 mM

Komórki 5 mg/ml

Bufor fosforanowy 200 mM

Temperatura 30°C

Czas trwania 4 h

Badanie kinetyki hydrolizy 4-metylotio-2-hydroksybutyronitrilu pokazuje wytwarzanie liniowe 2,8 pmoli hydroksyanalogu metioniny na 1 h i na 1 mg suszonych komórek. Nadmiar enancjomeryczny utworzonego kwasu zmierzono za pomocą chromatografii cieczowej, wynosi on 0% dla wydajności kwasu 80%.

Przykład 2

Oceniono trwałość enzymu badając kinetykę produkcji hydroksyanalogu metioniny przez 180 h przy użyciu wolnych komórek.

Warunki wykonania były następujące:

4-metylotio-2-hydroksybutyronitryl 100 mM

Komórki 10 rng/rm.

Bufor fosforanowy 300 mM 5 ml

Temperatura 25 °C

Nitryl dodano sekwencyjnie (100 mmoli) po zużyciu nitrylu. Tworzenie odpowiedniego kwasu podano w tabeli.

Czas	Utworzony kwas (mmole/litr)	Aktywność (gmole/h mg susz. komórek)
0	0	0
2 h	39	1,7
17 h	230	1,3
24 h	312	1,7
47 h	466	1,2
70 h	556	0,4
172 h	860	0,6
180 h	940	0,6

Aktywność początkowa wynosi 2 pmole/h.mg komórek suszonych. Przykład ten dowodzi trwałości enzymu pomimo obecności silnych stężeń kwasu (0,9 mol hydroksyanalogu metioniny).

Przykład 3

Trwałość enzymu w funkcji ilości substratu i ilości utworzonego kwasu także zmierzono w następujących warunkach.

Trwałość enzymu w funkcji ilości substratu:

Nitryl por. tabela wyników

Komórki 10 mg/ml

Bufor fosforanowy 300 mM, pH 7,0 5 ml

Temperatura 25 °C

Czas trwania 1 h

180 871

Stężenie nitrylu (mM)	Aktywność (gmoli/h. mg komórek susz.)
50	2
100	2
150	2
200	2
500	0

Trwałość enzymu w funkcji ilości utworzonego kwasu

Warunki wykonania:

Nitryl 50 mM

Komórki 2,5 mg/ml

Bufor fosforanowy 100 mM pH 7,0 1 ml

Temperatura 30°C

Czas trwania 2 h

Stężenie kwasu (mM)	Aktywność (gmoli/h. mg komórek susz.)
0	3,2
100	4,5
200	3,8
300	4,1
400	4
500	4
600	3,4
700	2,8

Przykład 4

Oczyszczanie nitrylazy

Komórki Alcaligenes faecalis hodowano 24 h w 30°C w ośrodku opisanym w przykładzie 1.

Po odwirowaniu hodowli osad wprowadzono do buforu pH 7,5 (25 mM trisHCl, 10% (wag./obj.) gliceryny). Na zawiesinę komórkową podziałano ultradźwiękami, a następnie odwirowano, by otrzymać ekstrakt nieoczyszczony. Na ekstrakt nieoczyszczony podziałano siarczanem amonu aż do 30% nasycenia. Otrzymany osad ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w buforze pH 7,5, a następnie dializowano przy użyciu 2 litrów tego samego buforu przez noc.

Otrzymany roztwór wprowadzono na kolumnę anionowymienną. Q Sepharose Fast Flow HR 26/10® wstępnie zrównoważoną buforem pH 7,5. Frakcję aktywną wymyto przy użyciu gradientu 0 do 1 M NaCl.

Frakcje aktywne wprowadzono na kolumnę anionowymierniąMono Q HR 5/5® wstępnie zrównoważoną buforem pH 7,5. Nitrylazę wymyto za pomocą gradientu 0 do 1M NaCl. Na koniec, frakcje aktywne połączono, następnie dodano do nich 1M siarczanu amonu. Roztwór ten wprowadzono na kolumnę z oddziaływaniami hydrofobowymi „Phenyl sepharose” HR 5/5® wstępnie zrównoważoną buforem pH 7,5 z dodatkiem 1 M (NH4LSO4. Frakcję aktywną wymyto przy użyciu gradientu 1 do 0 M siarczanu amonu.

Ciężar cząsteczkowy proteiny oznaczono przez filtrację żelową. Wynosi on około 260 kDa. Na żelu SDS-PAGE, zaobserwowano pojedyncze pasmo o 43 kDa (czystość 95%). Kinetyka hydrolizy 4-metylotio-2-hydroksybutyronitrilu do hydroksyanalogu metioniny przy użyciu nitrylazy A. faecalis jest liniowa.

180 871

Czas (h)	Aktywność (pmol/h. mg prot.)	RR (%)
0	0	1
0,5	150	3
1	171	5
21,5	150	68
24,8	150	77
29	150	87

Przykład 5. Wpływ pH Warunki wykonania:

Nitryl

Proteina

Bufor octanowy 100 mM, Bufor fosforanowy 100 mM, Bufor TRIS-HCl 100 mM, Bufor boranowy 100 mM, Temperatura

Czas trwania mM 50 pg/ml pH 4 do 5 pH 6 do 7, 1 ml pH 8 do 9 pH 10 do 11

30°C 1 do 2 h

pH	Aktywność (pmol/h. mg proteiny)
4	0
5	42
6	232
7	272
8	405
9	412
10	158
11	0

Przykład 6. Wpływ temperatury

Warunki wykonania:

Nitryl 50 mM

Proteina 50 pg/ml

Bufor fosforanowy 100 mM, pH 7,0

Temperatury zmienne 4°C do 60°C

Czas trwania 1 h

Optymalną temperaturą działania enzymu jest 50°C.

Temperatura (°C)	Aktywność (pmol/h.mg proteiny)
4	45
10	67
20	140
30	272
40	419
50	570
60	333

180 871

Przykład porównawczy z nitrylem kwasu migdałowego. Warunki wykonania:

Nitryl kwasu migdałowego 7 mM

Proteina 5 pg/ml

Bufor fosforanowy 100 mM, pH 7,0 1 ml

Temperatura 30°C

Czas (min)	Aktywność (pmol/h.mg prot.)	ee
15	1000	1
60	1030	1

Oczyszczona nitrylaza jest zatem enancjoselektywna w przypadku nitrylu kwasu migdałowego lecz nie w przypadku 4-metylotio-2-hydroksybutyronitrylu.

Przykład 7. Hydroliza 4-metylotio-2-hydroksybutyronitrylu przez Rhodococcus HT 29-7 FERM BP-3857

Mikroorganizm Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM BP-3857 hodowano w następującym ośrodku:

Gliceryna

Ekstrakt drożdży (DIFCO) KH₂PO₄

Na₂HPO₄ · 12H2O Na2SO₄MgCl2 CaCl2

MnSO4 •HjO FeSO4 -7H2O ZnSO4 •7H₂O Benzonitryl •6H₂O •2H₂O g// g// g//

4,4 g/l 2,8 g/l 0,85 g/l 0,05 g/l 0,033 g/l 0,013 g/l 0,005 g/l 0,5 g/l

100 mM 15 ml pH 7,5

Hodowlę prowadzono w 30°C w kolbach Erlenmeyera (2 litry) zawierających 600 ml ośrodka. Całość mieszano (150 obr/min) przez 140 h. Osad komórkowy odzyskano, przemyto roztworem NaCl (9 g/l), a następnie wymrożono.

Wpływ pH na hydrolizę.

Warunki wykonania:

4-metylotio-0-hydroksybutyromtryl

Gęstość optyczna przy 660 nm pH 4 do 5 pH 6,0 do 7,0 pH 8,0 do 9,0 pH 10,0 do 11,0

Czas trwania

30°C

10h

pH	Wydajność kwasu
1	2
4	0%
5	100%
6	100%
7	100%

180 871 ciąg dalszy tabeli

1	2
8	100%
9	100%
10	20%
11	0%

Przykład 8. Wpływ stężenia substratu

Trwałość enzymu w funkcji ilości substratu także zmierzono w następujących warunkach:

4-metylotio-2-hydroksybutyronitryl por. tabela wyników

Gęstość optyczna przy 660 nm 20

Bufor fosforanowy 30θ mM pH, 7,0 5 ml

Temperatura 30°C

Czas trwania 2 h

Stężenie nitrylu (mM)	Wydajność kwasu
50	90%
100	44%
200	22%
300	10%
400	0%
500	0%

Przykład 9. Trwałość enzymu w funkcji ilości utworzonego kwasu

Warunki wykonania:

4-metylotio-2-hydroksybutyronitryl 100 nMI

Gęstość optyczna przy 660 nm 15

Bufor fosforanowy l00 mM pH 7,0 1 ml

Temperatura 30°C

Czas trwania 6 h

Stężenie kwasu (mM)	Wydajność kwasu
0	100%
200	100%
400	100%
600	100%
800	100%
1000	100%

Przykład 10

Nadmiar enancjomeryczny

4-metylotio-2-hydroksybutyronitryl Gęstość optyczna przy 660 nm Bufor fosforanowy 100 mM Temperatura

140 mM -4 pH 7,0 1 ml

20°C

180 871

Czas inkubacji	Wydajność kwasu	Czystość optyczna
2 h	15%	0
6 h	50%	0
24 h	100%	0

Badanie kinetyki hydrolizy 4-metylotio-2-hydroksybutyronitrylu wykazuje liniowe wytwarzanie hydroksyanalogu metioniny na h i na mg komórek suszonych. Nadmiar enancjomeryczny utworzonego kwasu zmierzono za pomocą chromatografii cieczowej; wynosi on 0% przy wydajności kwasu zmieniającej się od 15% do 100%.

Przykład 11. Wpływ temperatury

Warunki wykonania:

4-metylotio-2-hydroksybutyronitryl 100 mM

Gęstość optyczna przy 660 nm 15

Bufor fosforanowy 100 mM pH 7,0 1 ml

Temperatura patrz tabela

Czas trwania 6 h

T(°C)	Wydajność kwasu
10	70%
20	100%
30	100%
40	100%
50	31%
60	15%

Przykład 12. Hydroliza 4-metylotio-2-hydroksybutyronitrylu

Warunki wykonania:

4-metylotio-2-hydroksybutyronitryl 23 mM

Gęstość optyczna przy 660 nm 15

Bufor fosforanowy 100 mM, pH 7,0 1 ml

Temperatura 30°C

Czas (h)	Wydajność kwasu	Nadmiar enancjomeryczny
0,5	40%	b.d.
1	51%	0,12
2	62%	b.d.
5	78%	0,15

Przykład 13

Warunki hodowli użyte w przypadku Gordona terrae MA-1 (FERM BP-4535) były następujące:

Gliceryna	10 g/l
Ekstrakt drożdży	0,4 g/l
K₂HPO₄	6,8 g/l
Na^PO₄ · 12H₂O	7,1 g/l
Na2SO₄	2,8 g/l

180 871

MgCl₂ -6H₂O

CaCl₂ -2HO

MnSO₄ · H2O

FeCl₃

ZnSO4

Benzonitryl pH

0,4 g/l mg/l mg/ml

0,6 mg/l

0,3 mg/l

0,5 g/l

7,2

Aktywność enzymu

Hodowane komórki przemyto, a następnie użyto w obecności hydroksymetylotiobutyronitrylu dla dozowania aktywności.

Warunki wykonania:

[nitryl] = 23 mM [komórki] = 6,8 g/l Bufor fosforanowy pH 7,0; 35°C

Figura 3: Hydroliza cyjanohydryny AMTP przez Gordona terrae MA-1

Kinetyka hydrolizy hydroksymetylotiobutyronitrylu jest liniowa. Początkową szybkość oceniono jako 13 mmol/h.g CS

Przykład 14. Wpływ stężenia cyjanohydryny AMTP na aktywność nitrylazy. Określono wpływ stężenia początkowego hydroksymetylotiobutyronitrylu na aktywność nitrylazy; wyniki podano w poniższej tabeli.

Warunki wykonania:

[komórki] = 5,1 g/l

Bufor fosforanowy 100 mM pH 7,0 35°C

Kinetykę zbadano po 0,5, 1, 2 i 3 h.

Stężenie nitrylu (mM)	Aktywność (mmol/h. g CS)
50	14
100	13
200	15
300	0
400	0

Aż do 200 mM, aktywność mało się zmieniała ze stężeniem substratu.

180 871

Przykład 15. Wpływ stężenia hydroksyanalogu metioniny na aktywność nitrylazy W próbie tej zbadano wpływ stężenia hydroksy-4-metylotio-2-butanokarboksylanu amonu na aktywność nitrylazy.

Warunki wykonania:

[komórki] = 5 g/l [nitryl] = 100 mM

Bufor fosforanowy 100 mM, pH 7,0 35°C

Stężenie karboksylanu amonu zmieniało się między 0 i 1,5 M.

Stężenie kwasu	Aktywność
(mol/l)	(pmol/h.mg CS)
0	9,4
0,5	14
1	19
1,5	15

Stężenie hydroksy-4-metylotio-2-butanokarboksylanu amonu nie zmienia wcale aktywności początkowej szczepu Gordona terrae HT29-7.

Przykład 16. Wpływ pH i temperatury Warunki wykonania:

[nitryl] = 100 mM [komórki] = 7,5 g/l

Bufor octanowy 100 mM, pH 4 do 5

Bufor fosforanowy 100 mM, pH 6 5o 7 Bufor Tris-HCT 100 mM, pH 8do 9

Bufor boranowy 100 mM, pH 10 do 11; 3

30°C; badanie kinetyki po 1, 2, 4 i 6 h.

pH	Aktywność (mmol/h. g CS)
4	0,6
5	2,5
6	7,8
7	9,6
8	15,3
9	18
10	5,7
11	11

Optymalne pH w naszych warunkach wykonania odpowiada w przybliżeniu 8-9. Wpływ temperatury na aktywność nitrylazy Gordona terrae MA-1.

Warunki wykonania:

[nitryl] = 100 mM [komórki] = 7,5 g/l

Bufor fosforanowy 100 mM, pH 7,0

Badanie kinetyki po 1 h.

180 871

T(°C)	Aktywność (mmol/h. g CS)
10	0,6
20	2,3
30	3,2
40	3,4
50	3,5
60	1,9

Temperatura optymalna wynosi około 40-50°C.

180 871

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania racemicznego kwasu 4-metylotio-2-hydroksymasłowego, znamienny tym, że 4-metylotio-2-hydroksy-butyronitryl poddaje się hydrolizie za pomocą nitrylazy wybranej spośród komórek Alcaligenes faecalis ATCC-8750, Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM BP-3857, lub Gordona terrae FERM- BP-4535.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pH ośrodka jest zawarte między 4 i 11, korzystnie między 5 i 9.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że temperatura hydrolizy jest zawarta między 40°C i 60°C, korzystnie między 30°C i 50°C.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitrylu w roztworze wyjściowym jest zawarte między 10 i 400 mmoli, korzystnie między 50 i 200 mmoli na litr.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego w roztworze jest zawarte między 10 i 2000 mmoli na litr, korzystnie między 100 i 1500 mmoli na litr.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się nitrylazę pochodzącą z komórek Alcaligenes faecalis ATCC-8750.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się nitrylazę pochodzącą z komórek Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM BP-3857.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się nitrylazę pochodzącą z komórek Gordona terrae FERM BP-4535.
9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje pH ośrodka zawarte między 7 i 11, korzystnie między 7 i 9.
10. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje pH ośrodka zawarte między 5 i 9.
11. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że temperatura hydrolizy jest zawarta między 40°C i 60°C.
12. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że temperatura hydrolizy jest zawarta między 30°C i 50°C.