PL180874B1 - Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby, której mediatorem jest VCAM-1 - Google Patents

Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby, której mediatorem jest VCAM-1

Info

Publication number
PL180874B1
PL180874B1 PL95317193A PL31719395A PL180874B1 PL 180874 B1 PL180874 B1 PL 180874B1 PL 95317193 A PL95317193 A PL 95317193A PL 31719395 A PL31719395 A PL 31719395A PL 180874 B1 PL180874 B1 PL 180874B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
vcam
acid
pdtc
expression
cells
Prior art date
Application number
PL95317193A
Other languages
English (en)
Other versions
PL317193A1 (en
Inventor
Russell M. Medford
R.Wayne Alexander
Sampath Parthasarathy
Bobby V. Khan
Margaret K. Offerman
Original Assignee
Univ Emory
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Emory filed Critical Univ Emory
Publication of PL317193A1 publication Critical patent/PL317193A1/xx
Publication of PL180874B1 publication Critical patent/PL180874B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/16—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms acylated on ring nitrogen atoms
    • C07D295/20—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms acylated on ring nitrogen atoms by radicals derived from carbonic acid, or sulfur or nitrogen analogues thereof
    • C07D295/21—Radicals derived from sulfur analogues of carbonic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/145—Amines having sulfur, e.g. thiurams (>N—C(S)—S—C(S)—N< and >N—C(S)—S—S—C(S)—N<), Sulfinylamines (—N=SO), Sulfonylamines (—N=SO2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/265—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carbonic, thiocarbonic, or thiocarboxylic acids, e.g. thioacetic acid, xanthogenic acid, trithiocarbonic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/325—Carbamic acids; Thiocarbamic acids; Anhydrides or salts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C333/00—Derivatives of thiocarbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C333/02—Monothiocarbamic acids; Derivatives thereof
    • C07C333/04—Monothiocarbamic acids; Derivatives thereof having nitrogen atoms of thiocarbamic groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C333/00—Derivatives of thiocarbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C333/02—Monothiocarbamic acids; Derivatives thereof
    • C07C333/08—Monothiocarbamic acids; Derivatives thereof having nitrogen atoms of thiocarbamic groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C333/00—Derivatives of thiocarbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C333/14—Dithiocarbamic acids; Derivatives thereof
    • C07C333/16—Salts of dithiocarbamic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/7056—Selectin superfamily, e.g. LAM-1, GlyCAM, ELAM-1, PADGEM
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/323—Arteriosclerosis, Stenosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/20—Oxygen containing
    • Y10T436/200833—Carbonyl, ether, aldehyde or ketone containing
    • Y10T436/201666—Carboxylic acid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Abstract

Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby, której me- diatorem jest VCAM-1 zawierajacej znany nosnik i/lub substancje pomocnicza oraz substan- cje czynna, znamienny tym, ze (i)oznacza sie czy substancja ta hamuje utlenianie wielonienasyconego kwasu tluszczo- wego, a nastepnie ocenia sie stopien utleniania wielonienasyconego kwasu tluszczowego, a nastepnie (ii)laczy sie substancje czynna, która hamuje utlenianie wielonienasyconego kwasu tluszczowego w etapie (i) z farmaceutycznie dopuszczalnym nosnikiem i/lub substancja pomocnicza do podawania doustnego, pozajelitowego, podskórnego, doskórnego lub miejscowego, przy czym substancja czynna, która zapobiega lub minimalizuje utlenianie wie- lonienasyconego kwasu tluszczowego jest zawarta w ilosci 0,5-500 mg/kg ciezaru ciala. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby, której mediatorem jest VCAM-1, a więc kompozycji do leczenia miażdżycy i innych chorób sercowo-naczyniowych oraz zapalnych.
Adhezja leukocytów (krwinek białych) do śródbłonka stanowi podstawowe, wczesne zjawisko w wielu różnych stanach zapalnych, do których należy miażdżyca, choroby autoimmunologiczne oraz zakażenia bakteryjne i wirusowe. Rekrutacja leukocytów do śródbłonka zaczyna się wtedy, gdy indukowalne receptory cząsteczki adhezyjnej na powierzchni komórek śródbłonka reagują z odpowiadającymi im przeciwreceptorami na komórkach immunologicznych. O tym, które typy leukocytów (monocyty, limfocyty czy neutrofile) ulegająrekrutacji, decydują komórki śródbłonka naczyniowego przez selektywną ekspresję swoistych cząsteczek adhezyjnych, takich jak cząsteczka adhezji komórkowej naczyń - 1 (VCAM-1), cząsteczka adhezji międzykomórkowej -1 (ICAM-1) i E-selektyna. Na najwcześniejszym etapie powstawania uszkodzenia miażdżycowego zachodzi miejscowa ekspresja VCAM-1 na śródbłonku i selektywna rekrutacja leukocytów jednojądrzastych wywołujących ekspresję przeciwreceptora integryny VLA-4. Ponieważ selektywna ekspresja VLA-4 zachodzi na monocytach i limfocytach, ale nie na neutrofilach, VCAM-1 odgrywa istotną rolę w regulowaniu selektywnej adhezji leukocytów jednojądrzastych. W wyniku następczego przejścia leukocytów w piankowate makrofagi, zachodzi synteza różnorodnych cytokin zapalnych, czynników wzrostu i chemicznych czynników przyciągających, które umożliwiają rozprzestrzenienie rekrutacji leukocytów i płytek krwi, namnażanie komórek mięśni gładkich, aktywację komórek śródbłonka i syntezę macierzy pozakomórkowej, charakterystyczne dla dojrzewania blaszki miażdżycowej.
VCAM-1 ulega ekspresji w hodowli ludzkich komórek śródbłonka naczyniowego po aktywacji lipopolisacharydem (LPS) i cytokinami takimi, jak interleukina 1 (IL-1) i czynnik martwicy nowotworu (TNF-α). Czynniki te nie są selektywne dla aktywacji ekspresji komórkowych cząsteczek adhezyjnych. Schemat I przedstawia proces aktywacji cytokinami genu ekspresji YCAM-l w komórkach śródbłonka naczyniowego.
180 874
Schemat I
l.Cytokina wiąże się zę swym rprsntnrpni z·?;—i··,·.
2.Aktywowany t receptor wytw.\. sygnał wewnątrzkomórkowy
3.Aktywacja transkrypcyj nego □iałka regulacyj nego
4.Przemieszczeni do jądra
9. Obróbka posttransla-j cyjna / 5.Wiązanie specyficzny /elementem wzmacnia] ΐ)ΝΑ na promotor z VCAM-I
10. Włączenie VCAM-I do błony
Translacja do białka
.Obróbka
-RNA
Błona komórkowa
Regulacja aktywacji cytokinami genu ekspresji cząsteczki adhezji komórkowej naczyń - 1 (VCAM-1) przez czynniki regulacyjne wrażliwe na reakcje utleniania i redukcji (reakcje redox), takie jak - NF - kp, w komorkach śródbłonka naczyniowego (IkB stanowi podjednostkę hamującą; NF - kβ stanowi czynnik jądrowy - kB; NH3 oznacza koniec aminowy białka, a RNA Pol II stanowi polimerazę II RNA).
Analiza cząsteczkowa elementów regulacyjnych na ludzkim genie VCAM-1, kontrolujących jego ekspresję, pozwala sądzić, że istotną rolę we wrażliwej na reakcję redox ekspresji genu VCAM-1 odgrywa czynnik jądrowy - kB (NF - kp), transkrypcyjny czynnik regulacyjny, lub NF - k β - podobne białko wiążące. Czynniki transkrypcyjne stanowią białka aktywujące (lub hamujące) ekspresję genu wewnątrz jądra komórki poprzez przyłączanie się do swoistych sekwencji DNA, zwanych “czynnikami wzmacniającymi”, położonymi zwykle obok regionu genu, zwanego “promotorem”, od którego rozpoczyna się synteza RNA. Czynnik jądrowy - kB stanowi powszechnie ulegający ekspresji wielopodjednostkowy czynnik transkrypcyjny, aktywowany w komórkach kilku typów przez szeroką i różnorodną grupę czynników zapalnych, takich jak TNF-α i L-1p, endotoksyny bakteryjne i wirusy RNA. Odgrywa on kluczową rolę w mediacji sygnałów zapalnych i innych sygnałów stresowych do jądrowego systemu regulacji. Jakkolwiek nieznane sąścisłe sygnały biochemiczne, aktywujące NF.-kB, ten czynnik transkrypcyjny może sprowadzać do jednego szlaku cząsteczkowego liczne czynniki ryzyka i “sprawcze” czynniki miażdżycy, takie jak hiperlipidemia, palenie papierosów, nadciśnienie tętnicze i cukrzyca.
Co ważne, aktywacja NF-kB w komórkach śródbłonka naczyń przez różne sygnały może być swoiście hamowana przez przeciwutleniacze, takie jak N-acetylocysteina i dwutiokarbaminian pirolidynowy (por. U. S. S. N. 07/969 934). Odkrycie tego zjawiska doprowadziło do wysunięcia hipotezy, że rodniki tlenowe odgrywają istotną rolę w aktywacji NF-kB poprzez niesprecyzowany mechanizm redox. Ponieważ element zwiększający NF-kB - podobny reguluje również transkrypcję promotora VCAM-1 w sposób związany z wrażliwością na reakcje redox, stres oksydacyjny w uszkodzeniu miażdżycowym może odgrywać rolę w regulacji ekspresji genu VCAM-1 poprzez to transkrypcyjne białko regulujące, wrażliwe na reakcje redox.
Uważa się, że modyfikacja lipoproteiny o małej gęstości (LDL) do oksydacyjnie zmodyfikowanej LDL (ox-LDL) poprzez reaktywne postacie tlenu stanowi główne zjawisko,
180 874 powodujące powstawanie i szerzenie się miażdżycy. Steinberg i wsp. N. Engl. J. Med. 1989; 320:915-924. Utleniona LDL stanowi złożoną strukturę, utworzonąz co najmniej kilku chemicznie odrębnych materiałów utlenionych, z których każdy, oddzielnie lub w połączeniu, jest zdolny do modulacji ekspresji genu aktywowanej przez cytokinę cząsteczki adhezyjnej. Wodorotlenki kwasów tłuszczowych, takie jak wodorotlenek linoleilowy (13-HPODE), wytwarzają się z wolnych kwasów tłuszczowych wskutek działania lipoksygenaz i stanowią ważny składnik utlenionej LDL.
Twierdzi się, że generacja lipidów utlenionych wytwarza się poprzez działanie układu lipoksygenazy komórkowej i że utlenione lipidy są następnie przenoszone na LDL. Zachodzi zatem reakcja szerzenia się wewnątrz LDL w ośrodku, katalizowana przez metale przejściowe i/lub związki sulfhydrylowe. W uprzednich badaniach wykazano, że modyfikacja kwasów tłuszczowych hodowli komórek śródbłonka może zmieniać ich podatność na uraz oksydacyjny. Dodanie nasyconych lub jednonienasyconych kwasów tłuszczowych do hodowli komórek śródbłonka zmniejsza ich podatność na uraz oksydacyjny, natomiast dodanie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA) zwiększa tę podatność na uraz oksydacyjny.
Stosując analizę HPLC z odwróconymi fazami natywnych i zmydlonych ekstraktów lipidowych LDL, wykazano, że 13-HPODE stanowi dominujący utleniony kwas tłuszczowy w lDl utlenionej przez aktywowane monocyty ludzkie. Przewlekłe narażenie na utlenione LDL stanowi sygnał oksydacyjny dla komórek śródbłonka naczyniowego, prawdopodobnie poprzez swoisty wodorotlenek kwasu tłuszczowego, który wybiórczo zwiększa ekspresję genu indukowanej przez cytokinę VCAM-1.
Poprzez niedokładnie jeszcze zdefiniowany mechanizm, obszary ściany naczyniowej, predysponowane do miażdżycy, preferencyjnie wychwytują krążącą LDL. Poprzez nie w pełni poznany szlak komórki śródbłonka mięśni gładkich i/lub komórki zapalne powodują następnie przejście LDL w ox-LDL. W przeciwieństwie do LDL, wychwytywanej przez receptor LDL, monocyty chciwie wychwytują ox-LDL poprzez receptor “wymiatacza”, którego ekspresja, w przeciwieństwie do ekspresji receptora LDL, nie jest hamowana w miarę wzrostu poziomu lipidów wewnątrzkomórkowych. Tak więc, monocyty nadal wychwytują ox-LDL i przekształcają się w wypełnione lipidami piankowate komórki makrofagowe, wytwarzające pasmo tłuszczowe.
Biorąc pod uwagę, że choroby sercowo-naczyniowe stanowią obecnie główną przyczynę zgonu w Stanach Zjednoczonych, oraz to, że 90% chorób sercowo-naczyniowych rozpoznaje się obecnie jako miażdżycę, istnieje wyraźna potrzeba, wynalezienia nowych sposobów i środków farmaceutycznych do leczenia tych chorób. Dla osiągnięcia tego celu ważne jest zidentyfikowanie i manipulacja swoistymi utlenionymi związkami biologicznymi, działającymi jako wybiórcze regulatory ekspresji mediatorów procesu zapalnego, a w szczególności, VCAM-1. Celem bardziej ogólnym jest zidentyfikowanie wybiórczych sposobów hamowania ekspresji genów wrażliwych na reakcje redox lub aktywacji wrażliwych na reakcje redox genów, które ulegają hamowaniu.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby, której mediatorem jest VCAM-1, zawierającej znany nośnik i/lub substancję pomocniczą że (i) oznacza się czy substancja ta hamuje utlenianie wielonienasyconego kwasu tłuszczowego, a następnie ocenia się stopień utleniania wielonienasyconego kwasu tłuszczowego, a następnie (ii) łączy się substancję czynną, która hamuje utlenianie wielonienasyconego kwasu tłuszczowego w etapie (i) z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i/lub substancjąpomocnicządo podawania doustnego, pozajelitowego, podskórnego, doskómego lub miejscowego, przy czym substancja czynna, która zapobiega lub minimalizuje utlenianie wielonienasyconego kwasu tłuszczowego jest zawarta w ilości 0,5-500 mg/kg ciężaru ciała.
W sposobie tym oznacza się substancję, która wybiórczo hamuje VCAM-1.
Kompozycja wytworzona sposobem według wynalazku znajduje zastosowanie do leczenia schorzenia lub zaburzenia, występującego u ludzi, w którego powstawaniu ma udział ekspresja lub hamowanie genu wrażliwego na reakcje redox, a więc do leczenia miażdżycy i innych chorób sercowo-naczyniowych i zapalnych.
180 874
Stwierdzono, że wielonienasycone kwasy tłuszczowe (“PUFA”) i ich wodorotlenki (“oxPUFA”), stanowiące ważne składniki oksydatywnie zmodyfikowanych lipoprotein o małej gęstości (LDL), zwiększają ekspresję VCAM-1, lecz nie zwiększają ekspresji wewnątrzkomórkowej cząsteczki adhezyjnej-1 (ICAM-1) ani E-selektyny w ludzkich komórkach śródbłonka aorty, poprzez mechanizm, którego mediatorem nie sącytokiny ani inne sygnały niecytokinowe. Stanowi to podstawowe odkrycie ważnego i nieznanego uprzednio szlaku biologicznego odpowiedzi immunologicznych, których mediatorem jest VCAM-1.
Nijograniczającj przykłady związków zwiększających ekspresję genu powierzchni komórki VCAM-1, lecz nie ICAM-1 ani E-selektyny, stanowią kwasy linolowy, kwas linolenowy, kwas arachidowy, wodorotlenek linoleilowy (13-HPODE) i wodorotlenek arachidonowy (15-HPETE). Nasycone kwasy tłuszczowe (takie jak kwas stearynowy) i jednonienasycone kwasy tłuszczowe (takie jak kwas oleinowy) nie indukują ekspresji VCAM-1, ICAM-1 ani E-selektyny.
Indukcja VCAM-1 poprzez PUFA i ich wodorotlenki kwasów tłuszczowych jest hamowana przez przeciwutleniacz ditiokarbamianin pirolidynowy (PDTC). Wskazuje to, że mediatorem indukcji jest utleniona cząsteczka sygnałowa, i że indukcja nie zachodzi, gdy utlenianie tej cząsteczki jest blokowane (to znaczy, utlenienie nie zachochi), odwracane (to znaczy, cząsteczka sygnałowa ulega redukcji) lub wtedy, gdy uniemożliwia się interakcje tego sygnału, zmodyfikowanego przez reakcje redox, z jego celem regulacyjnym.
Komórki przewlekle narażone na wyższy od prawidłowego poziom wielonienasyconych kwasów tłuszczowych lub ich utlenionych odpowiedników mogą dawać początek nieprawidłowej odpowiedzi immunologicznej, pozostającej w dysproporcji do obecnego zagrożenia, prowadząc do stanu chorobowego. Nadmierne uwrażliwienie komórek śródbłonka naczyniowego na PUFA i ox-PUFA może przyspieszać tworzenie się, na przykład, blaszki miażdżycowej.
W oparciu o te odkrycia zapewnia się sposób leczenia miażdżycy, restenozy po angioplastyce, chorób naczyń wieńcowych, dusznicy bolesnej i innych chorób sercowo-naczyniowycj, jak również chorób zapalnych nie obejmujących układu sercowo-naczyniowego, których mediatorem jest VCAM-1, przy czym sposób ten polega na usunięciu, zmniejszeniu stężenia lub zapobieganiu wytwarzania się utlenionych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, takichjaknp. (lecz nie ograniczonych do nich) utleniony kwas linolowy (C18 Δ9’12), linolenowy (C18 Δ6·9·12), arachidonowy (C20 δ5’8>π·14) i eikozatrienowy (C20 Δ^44).
Nieograniczające przykłady chorób zapalnych nie obejmujących układu sercowo-naczyniowego, których mediatorem jest VCAM-1, stanowią reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, dychawica oskrzelowa, zapalenie skóry i stwardnienie rozsiane.
Metoda ta stanowi znaczący postęp w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych, ponieważ wybiega poza obecnie stosowane sposoby, skierowane jedynie na hamowanie postępu choroby, i przy właściwym jej stosowaniu zapewnia możliwość zachowawczego “wyleczenia” miażdżycy poprzez zapobieganie tworzeniu się nowych blaszek i powodowanie zaniknięcia blaszekjuż powstałych.
W alternatywnym wykonaniu zapewnia się sposób hamowania ekspresji genu wrażliwego na reakcje redox lub aktywacji genu hamowanego we wrażliwym na reakcje redox szlaku, polegający na podawaniu skutecznej ilości substancji zapobiegającej utlenianiu sygnału, a typowo, utlenianiu wielonienasyconego kwasy tłuszczowego. Przykładowe geny wrażliwe na reakcje redox, związane z prezentacją odpowiedzi immunologicznej, stanowią, lecz nie są do nich ograniczone, geny powodujące ekspresję cytokin biorących udział w inicjowaniu odpowiedzi immunologicznej (np. IL-1 β), chemiczne środki przyciągające, ułatwiające migrację komórek zapalnych do miejsca uszkodzenia (np. MCP-1), czynniki wzrostu (np. IL-6 i receptor trombiny) i cząsteczki adhezyjne (np. VCAM-1 i E-selektyna).
Zapewnia się również sposoby badań przesiewowych do wykrywania zaburzeń, których mediatorem jest VCAM-1, lub gen wrażliwy na reakcje redox, polegające na ilościowym oznaczeniu zastępczych markerów choroby. W jednym z wykonań ocenia się poziom utlenionego wielonijnasyconjgo kwasu tłuszczowego lub innych odpowiednich markerów; w tkance lub we krwi, na przykład, gospodarza, jako środek oceny “środowiska oksydacyjnego” gospodarza i
180 874 wrażliwości gospodarza na choroby, których mediatorem jest gen wrażliwy na reakcje redox lub VCAM-1.
W innym wykonaniu ocenia się ilościowo poziom krążących lub znajdujących się na powierzchni komórki VCAM-1 lub innego odpowiedniego markera i wpływ na ten poziom podawania odpowiedniego przeciwutleniacza.
W jeszcze innym wykonaniu ocenia się uwrażliwienie komórek śródbłonka naczyniowego gospodarza na wielonienasycone kwasy tłuszczowe lub ich utlenione odpowiedniki. Można to osiągnąć np. wystawiając gospodarza na działanie PUFA lub ox-PUFA i porównując otrzymane stężenie VCAM-1 na powierzchni komórki lub krążącego, lub innego markera zastępczego z normą populacyjną. W jeszcze innym wykonaniu zapewnia się modele in vivo miażdżycy lub innych chorób serca lub chorób zapalnych, których mediatorem jest VCAM-1, poprzez podawanie zwierzętom-gospodarzom nadmiernej ilości PUFA lub utlenionego wielonienasyconego kwasu tłuszczowego dla wywołania choroby. Zwierzęta te można stosować w badaniach klinicznych dla dalszego dokładniejszego poznania tych zaburzeń.
W jeszcze innym wykonaniu wynalazku związki ocenia się ze względu na ich zdolność do leczenia zaburzeń, których mediatorem jest VCAM-1, na podstawie ich zdolności do hamowania utleniania wielonienasyconego kwasu tłuszczowego, lub interakcji PUFA lub ox-PUFA z białkiem docelowym.
Można to osiągnąć poprzez narażenie gospodarza, na przykład człowieka lub zwierzęcia, np. myszy, na wysoki poziom PUFA lub ox-PUFA i następnie ocenę terapeutycznej skuteczności związku badanego w oparciu o jego zdolność do zmniejszania stężenia VCAM-1 krążących lub osadzonych na powierzchni komórek. Zamiast tego można stosować badanie przesiewowe in vitro, oparte na zdolności związku badanego do zapobiegania utlenianiu PUFA lub interakcji PUFA lub ox-PUFA z białkiem docelowym w obecności substancji utleniającej, takiej jak metal, np. miedź, lub enzymu, takiego jak peroksydaza, lipoksygenaza, cyklooksygenaza lub cytochrom P-450.
W innym wykonaniu, komorki śródbłonka naczyniowego wystawia się na działanie TNF-α lub innego materiału indukującego VCAM-1 przez odpowiedni czas, a następnie uszkadza się je odpowiednimi środkami, np. poprzez sonikację lub zamrażanie-rozmrażanie. Izoluje się przedziały cytozolowe i błonowe. Wyznakowane radioaktywnie PUFA dodaje się do określonych ilości przedziałów. Bada się zdolność płynu do przemiany PUFA w ox-PUFA w obecności lub w nieobecności związku badanego. Zamiast układu komórek uszkodzonych można stosować komórki nienaruszone.
Doustne podawanie ditiokarbaminianu pirolidynowego (PDTC) w dawce 25-50 mg/kg/dzień dramatycznie hamowało miażdżycorodne tworzenie pasm tłuszczowych, zapalenie monocytowo-makrofagowe tętnic, ekspresję śródbłonkowego VCAM-1 i w zasadzie normalizowało zależnąod śródbłonka funkcję relaksacji u królików o indukowanej dietąhipercholesterolemii, u których poziom cholesterolu wynosił powyżej 1000 mg/dl. W tych samych dawkach inne domniemane środki terapeutyczne, takie jak przeciwutleniacze probucol i witamina E, nie wywierały działania na tworzenie blaszek w tym modelu.
W doświadczalnym modelu miażdżycy, zależne od śródbłonka zwiotczenie tętnic przywraca się poprzez podawanie PDTC. W modelu króliczym z hipercholesterolemią indukowaną dietą, doustne podawanie PDTC w dawce 25-50 mg/kg/dzień powodowało powrót zależnej od śródbłonka reaktywności naczyń. Określano to poprzez badania z pierścieniem skurczowym aorty pobranej od zwierząt kontrolnych i zwierząt badanych. U pacjentów z miażdżycą zjawisko to manifestuje się jako normalizacja reaktywności naczyń obwodowych w odpowiedzi na przekrwienie, mierzone nieinwazyjnymi badaniami przepływu metodą Dopplera. Stanowi to wystandaryzowane, powszechnie dostępne i łatwe do wykonania badanie, które można wykorzystać do dobrania dawek doustnych w taki sposób, aby uzyskać skuteczne stężenie leku we krwi. PDTC działa jako lek przeciwniedokrwienny, szybko normalizując patologiczne zmniejszenie zależnego od śródbłonka rozszerzenia naczyń tętniczych charakterystyczne dla chorób sercowo-naczyniowych i miażdżycy. Ta poprawa przepływu krwi w naczyniach widocz180 874 na jest jako poprawa w zakresie objawów i ograniczonej przez niedokrwienie zdolności do wysiłku, oraz zapewnia nieinwazyjną ocenę ochrony naczyń. Do innych klinicznych objawów zaburzeń zależnego od śródbłonka rozszerzenia naczyń należy impotencja.
Cząsteczkowy układ czynników regulacyjnych kontrolujący transkrypcję genu VCAM-1 stanowi nowy układ czynników transkrypcyjnych, utworzony z podjednostek p65 i p50 z rodziny NF-kB/Rel, sprzężony krzyżowo z podjednostkami c-fos i c-jun z rodziny AP-1. Zarówno z badaniach struktury, jak i w badaniach czynności dowiedziono, że te czynniki AP-1 odgrywają ważną rolę w regulacji promotora VCAM-1, co prawdopodobnie ma kluczowe znaczenie w terapeutycznej regulacji ekspresji genu VCAM-1. Po raz pierwszy wykazano zatem rolę czynnościową tego sprzężonego krzyżowo układu transkrypcyjnego w regulacji genu endogennego.
Krótki opis rysunków
Figura 1 stanowi wykres ekspresji na powierzchni komórki (O. D. 450 nm) VCAM-1 w ludzkich komórkach śródbłonka aorty w zależności od liczby godzin narażenia na cytokinę TNF-α (kółko zamalowane); kwas linolowy (trójkąt zamalowany); i wodorotlenek linoleilowy (13-HPODE, kwadrat zamalowany); oraz przy braku narażenia na te substancje (kontrola, kwadrat niezamalowany).
Figura 2 stanowi wykres ekspresji na powierzchni komórki (O. D. 450 nm) VCAM-1 w ludzkich komórkach śródbłonka aorty przy ich narażeniu na kwas linolowy (trójkąt zamalowany); i wodorotlenek linoleilowy (13-HPODE, kwadrat zamalowany) w zależności od stężenia kwasu tłuszczowego (μΜ).
Figura 3 stanowi wykres kolumnowy ekspresji na powierzchni komórki (O. D. 450 nm) VCAM-1, ICAM-1 i E-selektyny w ludzkich komórkach śródbłonka aorty przy ich narażeniu na cytokinę TNF-α, kwas stearynowy, kwas oleinowy, kwas linolowy; kwas linolenowy i kwas arachidonowy.
Figura 4 stanowi wykres kolumnowy ekspresji na powierzchni komórki (O. D. 450 nm) VCAM-1 w ludzkich komórkach śródbłonka aorty przy ich narażeniu na kwas linolowy, 13-HPODE, kwas arachidonowy, wodorotlenek kwasu arachidonowego (15-HPETE) z (kolumny zamalowane na czarno) lub bez (kolumny zakreskowane) przeciwutleniaczem ditiokarbaminianem pirolidynowym.
Figura 5 przedstawia autoradiogram wykazujący ostrą indukcję mRNA VCAM-1 przez kwas linolowy i 13-HPODE. HAEC narażano, lub nie, na kwas linolowy (7,5 μM), 13-HPODE (7,5 μM) lub TNF-α (100 U/ml). Wyizolowano RNA całkowite i dokonano podziału na frakcje zależnie od wielkości poprzez denaturację, elektroforezę na 1% żelu agarozowo-formaldehydowym, przeniesienie na nitrocelulozę i hybrydyzację do ludzkiego, wyznakowanego 32P cDNA A) VCAM-1 - swoistego B) β-aktyno - swoistego. Po przepłukaniu, filtry poddano ekspozycji na kliszę rentgenowską w temperaturze -70°C z jednym ekranem intensyfikującym przez 24 godziny. Identyfikacja pasm: 1) kontrola 2) kwas linolowy (ekspozycja udarowa, 8-godzinna) 3) kwas linolowy (ekspozycja 48-godzinna) 4) 13-HPODE (ekspozycja udarowa, 8-godzinna) i 5) TNF-α (100 U/ml, ekspozycja 4-godzinna).
Figura 6 przedstawia autoradiogram wykazujący, że indukcja mRNA VCAM-1 przez wielonienasycone kwasy tłuszczowe nie zależy od syntezy białek komórkowych. HAEC poddawano ekspozycji na kwas linolowy (7,5 μM) lub arachidonowy (7,5 (M) w obecności lub w nieobecności cykloheksymidu (10 μg/ml) przez 4 godziny, a następnie poddawano obróbce, tak jak to opisano na fig. 5.
Figura 7 przedstawia autoradiogram wykazujący, że kwas linolowy indukuje aktywację transkrypcyjnąpromotora VCAM-1 poprzez wrażliwy na reakcje redox czynnik NF-kB - podobny. HAEC rozszczepiono w takim stosunku, aby uzyskać około 60% konfluencję na 100 mm płytkach do hodowli tkankowych. HAEC transfekowano 30 μg plazmidu VCAMCAT p288, VCAMCAT p85 lub pSV2CAT, stosując technikę koprecypitacji fosforanu wapniowego z użyciem standardowych metod. Po 24-godzinnym okresie regeneracji HAEC poddano, lub nie, obróbce wstępnej 50 μM PDTC i po 30 minutach ekspozycji na kwas linolowy (7,5 μΜ) lub TNF-α (100 U/ml), dodawano bezpośrednio do płytek. Po 18 godzinach wytworzono wyciągi komórko8
180 874 we przez szybkie zamrażanie-rozmrażanie w 0,25 M Tris, pH 8,0. Białka z poszczególnych wyciągów komórkowych badano pod kątem aktywności acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT), jak to opisywano uprzednio (Ausubel, 1989) (Ac, chloramfenikol acetylowany, N, nieacetylowany).
Figura 8 przedstawia płytkę z żelem akrylamidowym wykazującą, że wielonienasycone kwasy tłuszczowe aktywują aktywność NF-kB - podobnego wiązania DNA, blokowaną przez przeciwutleniacz PDTC. Konfluentne HAEC w pożywce zawierającej 4% FBS (jak to opisano na fig. 1) poddano, lub nie, obróbce wstępnej PDTC (50 pM) przez trzydzieści minut, a następnie trzygodzinnej ekspozycji na, odpowiednio, kwas linolowy (7,5 pM), kwas oleinowy (7,5 pM), lub TNF-α (100 U/ml). Pięć mikrogramów wyciągu jądrowego inkubowano z dwuniciową wtVCAM-1, wyznakowaną 32P, frakcjonowano ze względu na wielkość na 4% natywnym żelu akrylamidowym, i poddano ekspozycji na kliszę autoradiograficzną w temperaturze -70°C przez 18 godzin. Oznaczono dwa pasma A i C, odpowiadające aktywności NF-kB - podobnej. W komórkach kontrolnych (nie poddanych obróbce) obserwowano słabe pasmo B.
Figury 9A i 9b stanowią wykresy kolumnowe względnie reaktywnych na kwas tiabarbiturowy substancji (O. D. 532 nm) kwasu arachidonowego i 15-HPETE w obecności lub nieobecności PDTC. Próba reaktywności na kwas tiabarbiturowy (TBARS) pozwala zmierzyć zdolność utleniającą materiału w bezkomórkowym, nie zawierającym pożywki, środowisku.
Figura 10 przedstawia autoradiogram mRNA, uzyskany jak to opisano poniżej, hybrydyzowany do wyznakowanego 32p, swoistego dla VCAM-1 cDNA (Płytka A), cDNA swoistego dla E-selektyny (ELAM-1) (Płytka B) lub cDNA swoistego dla ICAM-1 (Płytka C). Po 30-minutowej obróbce wstępnej 50pM soli sodowej ditiokarbaminianu pirolidynowego (PDTC), komórki HUVE (ludzkie komórki żyły pępkowej) poddano działaniu IL-1b (10 U/ml) w stałej obecności 50 pM PDTC. W oznaczonych punktach czasowych dokonano izolacji całkowitego RNA i frakcjonowania ze względu na wielkość 20 pg materiału poprzez denaturację elektroforezy na 1% żelu agarozowo-formaldehydowym, przeniesienie na nitrocelulozę, hybrydyzację, jak to opisano powyżej, i uwidocznienie przez autoradiografię. Pasmo 1- godzina 0, Pasma 2,4,6, 8, - tylko OL-1 przez, odpowiednio, 2,4, 8 i 24 godziny. Pasma 3, 5, 7,9 - IL-1 i PDTC przez, odpowiednio, 2, 4, 8 i 24 godziny.
Figura 11 przedstawia autoradiogram mRNA, uzyskanego według powyższego opisu, hybrydyzowanego do wyznakowanego 32P, swoistego dla VCAM-1 cDNA (Kolumna A), cDNA swoistego dla E-selektyny (ELAM-1) (Kolumna B) lub cDNA swoistego dla ICAM-1 (Kolumna C). Komórki HUVE poddano obróbce wstępnej wskazanymi stężeniami PDTC, a następnie działaniu IL- 1b w obecności PDTC przez cztery godziny, i badano pod kątem akumulacji mRNA VCAM-1 metodą hybrydyzacji filtra technikąNorthem. Pasmo 1 -kontrola, pasmo 2-IL-1 (10 u/ml),pasmo3-IL-lb + PDTC(0,05 pM),pasmo4-IL-1 LB + PDTC (0,5 pM), pasmo 5-IL-1b + PDTC (5,0 pM), pasmo 6 - IL-lb + PDTC (50,0 pM), pasmo 7 - IL-lb + PDTC (100 pM).
Figura 12 przedstawia autoradiogram mRNA, uzyskanego według powyższego opisu, hybrydyzowanego do wyznakowanego 32p, swoistego dla VCAM-1 cDNA (Kolumna A), cDNA swoistego dla E-selektyny (ELAM-1) (Kolumna B) lub cDNA swoistego dla ICAM-1 (Kolumna C). Komórki HUVE poddano obróbce wstępnej według opisu z fig. 9, 50 pM PDTC, poddano czterogodzinnej ekspozycji na niżej wskazane środki, i badano ze względu na akumulację mRNAVCAM-1 (Kolumna A) i ICAM-1 (Kolumna B). Pasmo 1- TNFa (100 U/ml), pasmo 2 TNFa + PDTC, pasmo 3 - lipopolisacharyd (LPS) (100 ng/ml), pasmo 4 - LpS + PdTc, pasmo 5 - poli(I:C) (100 mg/ml), pasmo 6 - poli(I:C) + PDtC.
Figura 13 stanowi wykres względnej ekspresji VCAM-1 i ICAM-1 na powierzchni komórki w obecności (kolumny ciemne) lub nieobecności (kolumny jasne) PDTC i w obecności różnego rodzaju bodźców indukujących. Konfluentne HUVE poddano, lub nie, obróbce wstępnej (tylko cTl) przez 30 minut 50 pM PDTC, a następnie eksponowano przez określony czas na określone środki w obecności lub nieobecności (tylko CTL) PDTC. Ekspresję na powierzchni komórek określano poprzez pierwotne wiązanie z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi swoiście przeciwko VCAM-1 (4B9) i ICAM-1 (84H10), a następnie wiązanie
180 874 wtórne ze znakowanymi peroksydazą chrzanową przeciwciałami kozimi, skierowanymi przeciwko przeciwciałom mysim (IgG). Ocenę ilościowąprzeprowadzono, określając konwersję kalorymetryczną przy 450 nm TMB. Figura 13 wskazuje, że wielokrotne sygnały regulacyjne indukcjąVCAM-1, lecz nie ICAM-1, w ludzkich komórkach śródbłonka naczyniowego poprzez wspólny, wrażliwy na ditiokarbaminian szlak.
Figura 14 stanowi wykres względnej ekspresji VCAM-1 powierzchni komórkowej (O. D. 595 nm) w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępkowej, aktywowanych TNFa, w stosunku do stężenia różnych przeciwutleniaczy. (PDTC stanowi sól sodowa ditiokarbaminianu N-pirolidynowego; DETC stanowi N,N-dwuetylo-N-karboditiolan sodowy, zwany również dwuetyloditiokarbammianem sodowym, NAC stanowi N-acetylocysteina, a DF stanowi desferoksymina).
Figura 15 stanowi wykres względnej ekspresji VCAM-1 powierzchni komórkowej (O. D. 595 nm) w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępkowej, aktywowanych TNFa, w obecności określonej ilości różnych przeciwutleniaczy. (PDTC stanowi sól sodowa ditiokarbaminianu N-pirolidynowego; DIDTC stanowi N,N-dwuetylo-N-karboditiolan sodowy, SarDTC stanowi N-metylo-N-karboksymetylo-N-karboditiolan sodowy; IDADTC stanowi N,N-dwu(karboksymetylo)-N-karboditiolan trójsodowy, MGDTC stanowi N-metylo-D-glukamino-N-karboditiolan sodowy, MeOBGDTC stanowi N-(4-metoksybenzylo)-D-glukamino-N-karboditiolan sodowy; DEDTC stanowi N,N-dwuetylo-N-karboditiolan sodowy; Di-PDTC stanowi N,N-dwuizopropylo-N-karboditiolan sodowy, NAC stanowi N-acetylocysteina).
Figura 16 stanowi wykres odsetka komórek Molt-4 wiążących się z komórkami HUVE po stymulacji, lub bez stymulacji, TNFa (100 U/ml) przez sześć godzin w obecności lub w nieobecności PDTC.
Figura 17 ilustruje strukturę chemiczną następujących czynnych ditiokarbaminianów: pirolidyno-N-karboditiolan sodowy, N-metylo-N-karboksymetylo-N-karboditiolan sodowy, N,N-dwu(karboksymetylo)-N-karboditiolan trójsodowy, N-metylo-D-glukamino-N-karboditiolan sodowy, N,N-dwuetylo-N-karboditiolan sodowy (dwuetyloditiokarbaminian sodowy) i N,N-dwuizopropylo-N-karboditiolan sodowy.
Figura 18 stanowi wykres kolumnowy wpływu PDTC na tworzenie się fluorescencyjnych związków addycyjnych BSA i 13-HPODE, według pomiaru w jednostkach fluorescencyjnych, w stosunku do mikromolowego stężenia PDTC. Jeden mikromol 13-HPODE inkubowano z 200 mikrograrnami BSA w obecności PDTC przez sześć dni. Fluorescencję mierzono w 430-460 nm ze wzbudzeniem w 330-360 nm.
Figura 19 stanowi wykres wpływu PDTC na tworzenie się fluorescencyjnych związków addycyjnych BSA i ox-PUFA w zależności od długości fali (nm) i stężenia PDTC. W miarę wzrostu PDTC zmniejsza się zawartość fluorescencyjnych związków addycyjnych.
Figura 20 stanowi wykres wpływu PDTC na utlenienie LDL przez peroksydazę chrzanową (HRP), mierzony wzrostem O. D. (234 nm) w zależności od czasu (minuty) dla zmiennego stężenia PDTC. Stwierdzono, że po okresie inkubacji PDTC hamuje utlenianie LDL przez HRP w sposób zależny od stężenia.
Figura 21 stanowi wykres wpływu PDTC na indukowane cytokinami tworzenie się ox-PUFA w ludzkich komórkach śródbłonka aorty. Jak to wskazano, zarówno TNF-α, jak i IL-1B powoduje utlenienie kwasu linolowego do kwasu oksylinolowego. PDTC wyraźnie zmniejsza utleniacze.
Szczegółowy opis wynalazku
I. Definicje
W rozumieniu niniejszego opisu, termin “wielonienasycony kwas tłuszczowy” (zwany również “PUFA”) oznacza kwas tłuszczowy (typowo C8 do C24), posiadający co najmniej dwa wiązania alkenylowe; do grupy tej należą, lecz nie jest ona do nich ograniczona, kwas linolowy (Cj8 A9’12), linolenowy (C18 A6>912), arachidonowy (C28^5,8’11,14) i eikozatrienowy (C2q A8i1>14). Termin “utleniony wielonienasycony kwas tłuszczowy” oznacza nienasycony kwas tłuszczowy, w którym co najmniej jedno wiązanie alkenylowe zostało przekształcone w nadtlenek. Nieograniczające przykłady stanowią:
180 874
13-HPODE
ΌΟΗ
15-HPETE
OOH '’ΠΟΗ
Termin “alkil”, w rozumieniu niniejszego opisu,jeżeli nie określono inaczej, oznacza nasycony węglowodór Ctdo C10, o łańcuchu prostym, rozgałęzionym lub cyklicznym (w przypadku węglowodorów C5 łub wyższych) (lub niższy alkil, np. C do C5; do grupy tej należy grupa metylowa, etylowa, propylowa, izopropylowa, butylowa, izobutylowa, t-butylowa, pentylowa, cyklopentylowa, izopentylowa, neopentylowa, heksylowa, izoheksylowa, cykloheksylometylowa, 3-metylopentylowa, 2,2-dwumetylobutylowa i 2,3-dwumetylobutylowa). Grupa alkilowa może być ewentualnie podstawiona przy dowolnym z atomów węgla jedną lub więcej resztą dobraną z grupy, do której należy grupa hydroksylowa, aminowa i grupa aminowa z jednym lub dwoma podstawnikami, przy czym podstawnik stanowi niezależnie grupa alkilowa, arylowa, alkoarylowa lub aroalkilowa; arylowa, alkoksylowa, aryloksylowa, nitrowa, cyjanowa, kwas sulfonowy, siarczan, kwas fosfoniowy, fosforan, lub fosfonian, niezabezpieczona lub zabezpieczona, jeśli jest to niezbędne, jakjest to wiadome specjalistom, i jak to opisali np. Greene i wsp., “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley and Sons, wydanie drugie, 1991.
Termin “grupa alkenylową”, w rozumieniu niniejszego opisu, jeżeli nie określono inaczej, oznacza węglowodór C2 do C^, o łańcuchu prostym, rozgałęzionym lub cyklicznym, z co najmniej jednym wiązaniem podwójnym.
Termin “grupa alkinylową”, w rozumieniu niniejszego opisu, jeżeli nie określono inaczej, oznacza węglowodór C2 do C10, o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, z co najmniej jednym wiązaniem potrójnym.
Termin “grupa aroalkilowa” oznacza grupę arylową z co najmniej jednym podstawnikiem alkilowym.
Termin “grupa alkoarylowa” oznacza grupę alkilowaz co najmniej jednym podstawnikiem arylowym.
Termin “grupa chlorowcowa” (alkilowa, alkenylową lub alkinylową) oznacza grupę alkilową, alkenylową lub alkinylową, w której co najmniej jeden z atomów wodoru w grupie zastąpiono atomem chlorowca.
Termin “grupa arylowa”, w rozumieniu niniejszego opisu, jeżeli nie określono inaczej, oznacza grupę fenylową, bifenylową lub naftylową, korzystnie, grupę fenylową. Grupa arylowa może być ewentualnie podstawionajedną lub więcej resztą dobraną z grupy, do której należy grupa alkilowa, hydroksylowa, aminowa, alkiloaminową, aryloaminową, alkoksylowa, aryloksylowa, nitrowa, cyjanowa, kwas sulfonowy, siarczan, kwas fosfoniowy, fosforan lub fosfonian, CO2H lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, CO2 (alkilowa, arylowa, alkoarylowa lub aroalkilowa) lub glukozamina, niezabezpieczona lub zabezpieczona, jeśli jest to niezbędne, jak jest to wiadome specjalistom, i jak to opisali np. Greene i wsp., “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley and Sons, wydanie drugie, 1991.
Termin “grupa alkoksylowa”, w rozumieniu niniejszego opisu, jeżeli nie określono inaczej, oznacza cząstkę struktury -O-alkilowej.
Termin “grupa acylowa”, w rozumieniu niniejszego opisu, oznacza grupę o wzorze C(O)R', w którym R' stanowi grupa alkilowa, arylowa, alkoarylowa lub aroalkilowa.
Termin “grupa heteroarylowa lub heteroaromatyczna”, w rozumieniu niniejszego opisu, oznacza cząstkę aromatyczną, zawierającą co najmniej jeden atom siarki, tlenu lub azotu w pierścieniu aromatycznym. Nieogranicząjące przykłady stanowią grupa fenazynowa, fenotiazyno180 874 wa, furylowa, pirydylowa, pirymidylowa, tienylowa, izotiazolilowa, imidazolilowa, tetrazolilowa, pirazynylowa, benzofuranylowa, benzotiofenyowa, chinolilowa, izochinolilowa, benzotienylowa, izobenzofurylowa, pirazołilowa, indolilowa, izoindolilowa, benzoimidazolilowa, purynylowa, morfolinylowa, karbozolilowa, oksazolilowa, tiazolilowa, izotiazolilowa, 1,2,4-tiadiazolilowa, izooksazolilowa, pirolilowa, pirazolilowa, chinoazolinylowa, pirydazynylowa, pirazynylowa, cynnolinylowa, ftalazynylowa, chinoksalinylowa, ksantynylowa, hipoksantynylowa, pterydynylowa, 5-azacytydynylowa, 5-azauracylilowa, triazolopirydynylowa, imidazolopirydynylowa, pirolopirymidynylowa, pirazolopirymidynylowa, adeninowa, N6-alkilopurynowa, N6-benzylopurynowa, N6-chlorowcopurynowa, N6-winylopurynowa, N6-acetylenopurynowa, N6-acylopurynowa, N6-hydroksyalkilopurynowa, N6-tioalkilopurynowa, tyminowa, cytozynowa, 6-azapirymidynowa, 1-merkaptopyrmidynowa, uracylowa, Ns-alkilopirymidynowa, N5-benzylopirymidynowa, N5-chlorowcopirymidynowa, N5-winylopirymidynowa, N5-acetylenopirymidynowa, N5-acylopirymidynowa, N5-hydroksyalkilopurynowa i N6-tioalkilopurynowa, i izoksazolilowa. Grupa heteroaromatyczna może być ewentualnie podstawiona, tak jak to opisano powyżej dla grupy arylowej. Pierścień heteroaromatyczny może być całkowicie lub częściowo uwodorniony, jeśli jest to korzystne. Zamiast pirydyny można stosować np. dihydropirydynę, przy czym przykład ten nie jest ograniczający. Tlenowe i azotowe grupy funkcyjne mogą być zabezpieczone, jeśli jest to konieczne lub korzystne, w czasie sekwencji reakcji. Odpowiednie grupy zabezpieczające są dobrze znane specjalistom, i stanowi je grupa trójmetylosililowa, dwumetyloheksylosililowa, t-butylodwumetylosililowa i t-butylodwufenylosililowa, tritylmetylowa, alkilowa, grupa acylowa, jak np. acetylowa lub propionylowa, metylosulfonylowa i p-toluilosulfonylowa.
Termin “grupa hydroksyalkilowa”, w rozumieniu niniejszego opisu, oznacza grupę alkilową C, do C6, w której co najmniej jeden z atomów wodoru przyłączony do dowolnego atomu węgla został zastąpiony grupą hydroksylową.
Termin “przeciwutleniacz tiolowy” oznacza zawierający atom siarki związek opóźniający utlenianie.
Termin “farmaceutycznie dopuszczalna pochodna” oznacza pochodną związku czynnego, która, po podaniu organizmowi, jest zdolna do uwalniania, bezpośrednio lub pośrednio, związku macierzystego, lub która sama wykazuje aktywność.
Termin “farmaceutycznie dopuszczalny kation” oznacza cząstkę organiczną lub nieorganiczną, naładowaną dodatnio, która może być podawana w połączeniu ze środkiem farmaceutycznym, na przykład, jako przeciwkation w soli. Farmaceutycznie dopuszczalne kationy są znane specjalistom, i stanowią je, lecz nie są one do nich ograniczone, jon sodowy, potasowy i aminy czwartorzędowe.
Termin “fizjologicznie odszczepialna grupa opuszczająca” oznacza cząstkę, która może ulec odszczepieniu in vivo od cząsteczki, do której jest przyłączona, i stanowi, lecz nie jest do nich ograniczona, anion organiczny lub nieorganiczny, grupę acylową (włączając w to, lecz nie jest ona do niej ograniczona, grupę (alkilo)C(O), np. grupę acetylową, propionylową i butyrylową), grupę alkilową, fosforanową, siarczanową lub sulfonianową.
Termin “enancjomerycznie wzbogacona kompozycja lub związek” oznacza kompozycję lub związek zawierający co najmniej 95%, korzystnie co najmniej 97, 98, 99 lub 100%o wagowo pojedynczego enancjomeru związku.
Termin “aminokwas” oznacza syntetyczne i naturalnie występujące aminokwasy, włączając w to, lecz nie są one do nich ograniczone, grupę alanylową, walinylową, leucynylową, izoleucynylową, prolinylową, fenyloalaninylową, tryptofanylową, metioninylową, glicynylową serynylową treoninylową, cysteinylową, tyrozynylową, asparaginylową, glutaminylową, aspartoilową glutaoilową, lizynylową, argininylową i histydynylową.
Termin “cząstka łącząca” w rozumieniu niniejszego opisu, oznacza dowolną grupę dwuwartościową, łączącą dwie reszty chemiczne, włączając w to, lecz nie są one do nich ograniczone, grupę alkilową, alkenylową, alkinylową arylową, polialkilenooksylową(np. -[(CH2)nO-]n-), -C,_6alkoksy-C,.,0alkilo-, C1.6alkilotio-C,.,0alkilo-, -NR3-, i -^(C'HOH)nCH2OH, w których n może wynosić niezależnie 0, 12, 3, 4, 5 lub 6.
180 874
II. Identyfikacja kdec^ioutycl·^ i nieutienionych o^!^y^lonw;nc^syc(n^ycyc l^ahik^ i^łuózczc^usycki jako bezpośrednich mediatorów ekspresji VCAM-1
Dla ustalenia, czy PUFA lub utlenione PUFA działająjako bezpośredni immunomodulator ekspresji genu komórek śródbłonka, wcześnie pasażowane ludzkie komórki śródbłonka aorty (HAEC) hodowano przez osiem godzin w pożywkach i surowicy i eksponowano na kwasy tłuszczowe nasycone (kwas stearynowy), jednonienasycone (kwas oleinowy) i wielonienasycone (kwas linolowy i arachidonowy); jak również na wodorotlenki kwasów tłuszczowych linolowego (13-HPODE) lub arachidonowego (15-HPETE). HAEC eksponowano również zamiast tego na działanie cytokiny czynnika martwicy nowotworu-α.
HAEC eksponowano na kwas linolowy lub 13-HPODE przez różne okresy czasu, do 48 godzin, a następnie badano ze względu na ekspresj ę V CAM-1 na powierzchni komórki testem ELISA. Wyniki porównano z wynikami uzyskanymi przy ekspozycji HAEC na cytokinę TNF-α (100 U/ml) przez takie same okresy czasu. Ekspresja VCAM-1 w HAEC inkubowanych z kwasem linolowym lub 13-HPODE ulega przejściowo zwiększeniu. Ekspresja osiąga wartości szczytowe po około 8-9 godzinach, znaczącą ekspresję stwierdza się po 24 godzinach, po czym maleje ona po upływie 48 godzin. Kinetyka indukcji VCAM-1 przez zarówno kwas linolowy, jak i 13-HPODE jest bardzo podobna do kinetyki TNF-α, a zatem mechanizmy, poprzez które wielonienasycone kwasy tłuszczowe indukująVCAM-1 wydająsię być podobne do mechanizmów TNF-α.
Przeprowadzono również badania zależności odpowiedzi od dawki kwasu linolowego i 13-HPODE na ekspresję genu VCAM-1 po 8 godzinach. Stwierdzono, że 7,5 μM stanowi najniższą dawkę szczytową, przy której kwas linolowy i 13-HPODE znacząco indukują ekspresję genu VCAM-1.
Badano następnie, czy krótkotrwała inkubacja komórek śródbłonka z wielonienasyconymi kwasami tłuszczowymi indukuje również ekspresję ICAM-1 i E-selektyny. Stwierdzono, że wielonienasycone kwasy tłuszczowe linolowy i arachidonowy indukują ekspresję genu na powierzchni komórki do wartości około 59% indukowanej przez TNF ekspresji genu VCAM-1. Stwierdzono natomiast, że ani ICAM-1, ani E-selektyna nie ulegały indukcji tymi kwasami tłuszczowymi. Przeciwnie, nasycony kwas tłuszczowy - kwas stearynowy - i jednonienasycony kwas tłuszczowy - kwas oleinowy - nie indukowały ekspresji VCAM-1, ICAM-1 ani E-selektyny. Ekspresję genu VCAM-1 obserwowano również po inkubacji HAEC z utlenionymi metabolitami kwasu linolowego (13-HPODE) i kwasu arachidonowego (15-HPETE).
Dla zbadania, czy stres oksydacyjny w komórkach śródbłonka, spowodowany przez wielonienasycone kwasy tłuszczowe i ich utlenione metabolity, indukuje VCAM-1 poprzez mechanizm wrażliwy na reakcje redox, HAEC poddano obróbce wstępnej przeciwutleniaczem ditiokarbaminianem pirolidynowym (PDTC, 50 μM) przez 30 minut, a następnie komórki inkubowano niezależnie z kwasem linolowym, kwasem arachidonowym, 13-HPODE i 15-HPETE (po 7,5 (M) przez 8 godzin. Stwierdzono, że PDTC hamował ekspresję genu VCAM-1 indukowaną przez wielonienasycone kwasy tłuszczowe i ich utlenione odpoweidniki. Wskazuje to, że mediatorem indukcji jest utleniona cząsteczka sygnałowa, i że indukcja nie zachodzi, kiedy utlenianie cząsteczki jest blokowane (to znaczy, utlenienie nie zachodzi), odwracane (to znaczy, cząsteczka sygnałowa ulega redukcji) lub wtedy, gdy uniemożliwia się jej interakcję z białkiem docelowym, być może poprzez układ redox. Dla określenia, czy selektywna indukcja VCAM-1 przez PUFA i ich utlenione metabolity zachodzi na poziomie mRNA, HAEC inkubowano z kwasem linolowym lub 13-HPODE. Kwas linolowy i 13-HPODE indukowały akumulację mRNA VCAM-1, zbliżoną poziomem do indukowanej przez TNF-α. Przeciwnie, nie stwierdzono indukcji ekspresji genu ICAM-1 ani E-selektyny na poziomie mRNA w HAEC inkubowanych z kwasem linolowym lub 13-HPODE. Wyniki te są podobne do obserwowanych na poziomie powierzchni komórki. Wskazują one, że pretranskrypcyjne mechanizmy regulacyjne pełnią rolę mediatora indukcji ekspresji genu VCAM-1 przez wielonienasycone kwasy tłuszczowe i ich utlenione metabolity. Niezbędne było również określenie, czy wielonienasycone kwasy tłuszczowe działająjako sygnał pierwotny, czy też poprzez białko regulacyjne wykorzystujące cytokinę
180 874
IL-4 w indukcji ekspresji genu VCAM-1. W celu zbadania, czy nowo wytworzone białka, takie jak IL-4, biorą udział w wytwarzaniu i ekspresji genu VCAM-1, indukowanej przez PUFA, takie jak kwas linolowy, HAEC inkubowano z 13-HPODE (7,5 pM) i eksponowano na inhibitor syntezy białka, cykloheksymid. Nie stwierdzano hamowania akumulacji mRNA VCAM-1 przez cykloheksymid w HAEC inkubowanych z 13-HPODE. Mierzono również testem ELISA wytwarzanie IL-4 przez HAEC inkubowane z kwasami linolowym lub arachidonowym i ich utlenionymi metabolitami. Nie stwierdzano zwiększenia wydzielania IL-4 przez HAEC inkubowano z tymi PUFA lub ich utlenionymi metabolitami.
W uprzednich pracach wykazano, poprzez badania nad delecjąi promotorami heterologicznymi, że cytokiny i nie-cytokiny aktywują ekspresję genu VCAM-1 w komórkach śródbłonka co najmniej częściowo w sposób transkrypcyjny poprzez dwa NF-kB - podobne elementy wiążące DNA. Wykazano również, że PDTC hamuje ekspresję genu VCAM-1 poprzez wrażliwy na reakcje redox czynnik NF-kB - podobny. Dla określenia, czy wielonienasycone kwasy tłuszczowe indukują aktywację transkrypcyjną ludzkiego promotora VCAM-1 w podobnym mechanizmie, dokonano przejściowej transfekcji chimerycznego genu reporterowego p288 VCAM-CAT, zawierającego współrzędne —288 do +22 ludzkiego promotora VCAM-1. Dodanie kwasu linolowego (7,5 pM) zwiększało aktywność promotora VCAM-1, która dwukrotnie przewyższała aktywność kontroli i wynosiła około 60% maksymalnego sygnału indukowanego przez TNF-α. Podobne wyniki uzyskano przy zastosowaniu minimalnego indukowalnego cytokinami promotora genu VCAM-1 (p85 VCAM-CAT), zawierającego miejsca -77 i -63 bp - podobne. Ani kwas linolowy, ani TNF-α nie wykazywały żadnego wpływu na aktywność przy zastosowaniu konstytutywnie ulegającej ekspresji sekwencji pSV2 CAT. PDTC hamowało aktywację transkrypcyjną obu sekwencji promotorowych VCAM-1 indukowaną przez kwas linolowy. Dane wskazują, że analogicznie do TNF-α, wielonienasycone kwasy tłuszczowe, takie jak kwas linolowy, indukują aktywację transkrypcyjną VCAM-1 poprzez wrażliwy no reakcje redox mechanizm NF-kB - podobny.
Dla określenia, czy wielonienasycone kwosy tłuszczowe i ich utlenione metabolity regulują aktywność promotora VCAM-1 poprzez NF-kB - podobny transkrypcyjny czynnik regulacyjny, badono wyciągi jądrowe z HAEC ze względu no oktywność wiązania DNA do oligonukleotydu dwuniciowego, zawierającego NF -kB - podobne elementy promotorowe V CAM-1, położone w miejscach -77 i -63. Jak to przedstawiono na fig. 7, dwa pasma A i C, ukazujące aktywność NF-kB - podobną, ulegały indukcji w odpowiedzi no trzygodzinną ekspozycję na kwas linolowy (7,5 pM). Podobne wyniki uzyskano po ekspozycji no cytokinę TNF-α (100 U/ml). W komórkach kontrolnych (nie poddowanych obróbce) stwierdzono słabe pasmo B. Nie stwierdzano indukcji wiązania NF-kB - podobnego przez jednonienasycony kwas tłuszczowy - kwas oleinowy. Wstępna trzydziestominutowa obróbka komórek PDTC hamowała aktywność wiązania kompleksu A i C DNA po aktywacji kwasem linolowym. Wyniki te są zbliżone do uprzednio publikowanych obserwacji, że PDTC blokuje aktywację ekspresji genu VCAM-1 w HUVEC poprzez hamowanie' aktywacji tych NF-kB - podobnych białek wiążących DNA.
Przykład 1. Wpływ utlenionych i nieutlenionych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych na kinetykę aktywacji ekspresji genu VCAM-1
Ludzkie komórki śródbłonka aorty (HAEC) posiewano na 96-zagłębieniowj płytki i inkubowano z kwasem linolowym (7,5 pM), 13-HPODE(7,5 pM) lub TNF-α (100 U/ml) w pięciu różnych punktach czasowych do 48 godzin. HAEC, uzyskane z Clonetics (Boston, mA) hodowano na pożywce Medium 199 z dodatkiem 20% bydlęcej surowicy płodowej (FBS), 16 U/ml heparyny, 10 U/ml naskórkowego czynnika wzrostu, 50 jogml dodatku wzrostowego dla komórek śródbłonka, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, i 100 pg/ml streptomycyny. Na jeden dzień przed doświadczeniem, komórki umieszczono w pożywce zawierającej 4% FBS. Konfluentne HAEC inkubowano przez okres do 48 godzin z TNF-α (100 U/ml), lub kwasami stearynowym, oleinowym, linolowym, linolenowym lub arachidonowym (7,5 pM). Podobne doświadczenie prowadzono z różnymi dawkami kwasu linolowego lub 13-HPODE przez czas 8 godzin (1 -60 pM) (fig. 2). Oceny ilościowej dokonano przez oznaczenie konwersji kolorymetrycznej w 450 nm TMB. Doświadczenia prowadzono w trzech egzemplarzach (n=3 dla każdej wartości doświa14
180 874 dczalnej). * - wartość różniąca się (p <0,05) od Kontroli. Jak to ukazano na fig. 1, zarówno kwas linolowy, jak i 13-HPODE indukowały ekspresję VCAM-1. W dziesięć godzin po ekspozycji, ilość VCAM-1 na powierzchni komórki, indukowana przez kwas linolowy i 13-HPODE, wynosiła powyżej połowy wartości indukowanej przez cytokinę TNF-α.
Jak to ukazano na fig. 2, indukcja VCAM-1 przez kwas linolowy i 13-HPODE jest zależna od stężenia. Przy stężeniu tych związków wynoszącym od 2 do 10 pM, obserwuje się gwałtowny wzrost ilości indukowanej VCAM-1 powierzchni komórki, która następnie utrzymuje się na w przybliżeniu stałym poziomie do stężenia wynoszącego co najmniej 100 pM. Należy zauważyć, że stężenie PUFA wskazane na fig. 2 dodaje się do stężenia endogennie stwierdzanego w HAEC.
Przykład 2. Wielonienasycone kwasy tłuszczowe indukują ekspresję genu VCAM-1, lecz nie ICAM-1 ani E-selektyny
Testem ELISA mierzono ekspresję VCAM-1, ICAM-1 i E-selektyny na powierzchni komórki HAEC. HAEC, uzyskane z Clonetics (Kahfomia) hodowano w Medium 199 z dodatkiem 20% bydlęcej surowicy płodowej (FBS), 16 U/ml heparyny, 10 U/ml naskórkowego czynnika wzrostu, 50 pg/ml dodatku wzrostowego dla komórek śródbłonka, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, i 100 pg/ml streptomycyny. Na jeden dzień przed doświadczeniem, komórki umieszczono w pożywce zawierającej 4% FBS. Konfluentne HAEC inkubowano, lub nie, przez 8 godzin z TNF-α (100 U/ml), lub jednym z kwasów; stearynowym, oleinowym, linolowym, linolenowym lub arachidonowym (7,5 pM). Ekspresję na powierzchni komórki A) VCAM-1B) ICAM-1 i C) E-selektyny oznaczono przez wiązanie pierwotne z przeciwciałami mysimi, skierowanymi swoiście przeciwko VCAM-1, ICAM-1 i E-selektynie, a następnie wtórne wiązanie z ze znakowanymi peroksydazą chrzanową przeciwciałami kozimi, skierowanymi przeciwko przeciwciałom mysim (IgG).
Ocenę ilościową przeprowadzono, określając konwersję kolorymetryczną przy 450 nm TMB. Doświadczenia prowadzono w trzech egzemplarzach (n=4 dla każdej wartości doświadczalnej). * - wartość różniąca się (p <0,05) od Kontroli.
Jak to ukazano na fig. 3, kwas linolowy, kwas linolenowy i kwas arachidonowy znacząco indukowały ekspresję VCAM-1, lecz nie indukowały ekspresji na powierzchni komórki ICAM-1 ani E-selektyny. Ani kwas stearynowy, ani kwas oleinowy nie indukowały ekspresji VCAM-1, ICAM-1 ani E-selektyny'. TNF-α silnie indukował ekspresje wszystkich trzech cząsteczek powierzchni komórki.
Przykład 3. Przeciwutleniacz PDTC hamuje indukcję VCAM-1 wywoływaną przez wielonienasycone kwasy tłuszczowe i ich utlenione metabolity
Konfluentne HAEC poddano obróbce wstępnej w obecności lub w nieobecności PDTC (soli sodowej ditiokarbaminianu pirolidynowego, 50pM) przez trzydzieści minut. Komórki inkubowano następnie przez osiem godzin z TNF-α (100 U/ml), kwasem linolowym lub arachidonowym (7,5 pM); lub wodorotlenkami kwasów tłuszczowych 13-HPODE (7,5 pM) lub 15-HPETE (7,5 pM). Ekspresję VCAM-1 na powierzchni komórki mierzono testem ELISA, jak to opisano w przykładzie 1. Doświadczenia prowadzono w trzech egzemplarzach (n=4 dla każdej wartości doświadczalnej). * - wartość różniąca się (p < 0,05) od Kontroli.
Jak to ukazano na fig. 4, PDTC hamuje indukcję VCAM-1 przez kwas linolowy, 13-HPODE, kwas arachidonowy i 15-HPETE.
Przykład 4. Ostra indukcja mRNA VCAM-1 przez kwas linolowy i 13-HPODE
HAEC eksponowano na kwas linolowy (7,5 pM) lub 13-HPODE (7,5 pM). Wyizolowano RNA całkowite, dokonano podziału 20 pg na frakcje zależnie od wielkości poprzez denaturację, elektroforezę na 1% żelu agarozowo-formaldehydowym, przeniesienie na nitrocelulozę i hybrydyzację do ludzkiego, wyznakowanego 32P cDNA A) VCAM-1 - swoistego B) β-aktyno - swoistego, i przeprowadzono uwidocznienie przez autoradiografię. Po przepłukaniu, filtry poddano ekspozycji na kliszę rentgenowską w temperaturze -70°C z jednym ekranem intensyfikującym przez 24 godziny. Identyfikacja pasm: 1) kontrola 2) kwas linolowy (ekspozycja udarowa, 8-godzinna) 3) kwas linolowy (ekspozycja 48-godzinna) 4) 13-HPODE (ekspozycja udarowa, 8-godzinna) i 5) TNF-α (100 U/ml), ekspozycja 4-godzinna).
180 874
Jak to ukazano na fig. 5, zarówno kwas linolowy, jak i 13-HPODE indukowały wytwarzanie mRNA dla VCAM-1 przez osiem godzin. Po 48 godzinach, kwas linolowy nie powodował już indukcji mRNA VCAM-1.
Przykład5. Indukcj a mRNA VCAM-1 przez PUFA nie zależy od syntezy b i ale k komórkowych
HAEC eksponowano na kwas linolowy lub arachidonowy (7,5 pM) w obecności lub w nieobecności cykloheksymidu (10 pg/ml) przez okres 4 godzin. Wyizolowano RNA całkowite, dokonano podziału 20 pg na frakcje zależnie od wielkości poprzez denaturację, elektroforezę na 1% żelu agarozowo-formaldehydowym, przeniesienie na nitrocelulozę i hybrydyzację do ludzkiego, wyznakowanego 32P cDNA A) VCAM-1 - swoistego B) β-aktyno - swoistego, i przeprowadzono uwidocznienie przez autoradiografię. Po przepłukaniu, filtry poddano ekspozycji na kliszę rentgenowską w temperaturze -70°C z jednym ekranem intensyfikującym przez 24 godziny.
Jak to ukazano na fig. 6, indukcja VCAM-1 przez kwasy linolowy i arachidonowy nie zależy od syntezy białek komórkowych.
Przykład 6. Kwas linolowy indukuje aktywację transkrypcyjną promotora VCAM-1 poprzez wrażliwy na reakcje redox czynnik NF-kB - podobny
HAEC rozszczepiono w takim stosunku, aby uzyskać około 60% konfluencję na 100 mm płytkach do hodowli tkankowych. HAEC transfekowano 30 pg plazmidu VCAMCAT p288, VCAMCAT p85 lub pSV2CAT, stosując technikę koprecypitacji fosforanu wapniowego z użyciem standardowych metod. Po 24-godzinnym okresie regeneracji HAEC poddano obróbce wstępnej 50 pM PDTC i po 30 minutach ekspozycji na kwas linolowy (7,5 pM) lub TNF-α (100 U/ml), dodawane bezpośrednio do płytek. Po 18 godzinach wytworzono wyciągi komórkowe przez szybkie zamrażanie-rozmrażanie w 0,25 M Tris, pH 8,0. Białka z poszczególnych wyciągów komórkowych badano pod kątem aktywności acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT) (Ac, chloramfenikol acetylowany, N, nieacetylowany). Fig. 7 ukazuje wyniki tego doświadczenia. Kwas linolowy indukuje aktywację transkrypcyjną promotora VCAM-1 poprzez wrażliwy na reakcje redox czynnik NF-kB - podobny. Wyniki te sąpodobne do obserwowanych przy aktywacji promotora VCAM-1 przez cytokiny, takie jak TNF-α. Sugeruje to, że PUFA działająprzez utleniony związek pośredni, który stanowi jednocześnie mediator aktywacji cytokinowej V CAM-1.
Przykład 7. Wielonienasycone kwasy tłuszczowe aktywująNF-kB - podobną aktywność wiązania DNA, blokowaną przez przeciwutleniacz PDTC
Konfluentne HAEC w pożywce zawierającej 4% FBS (jak to opisano w przykładzie 1) poddano obróbce wstępnej PDTC (50 pM) przez trzydzieści minut, a następnie trzygodzinnej ekspozycji na kwas linolowy lub oleinowy (7,5 pM), lub TNF-α (100 U/ml). Pięć mikrogramów wyciągu jądrowego inkubowano z dwuniciowąwtVCAM-1, wyznakowaną 32p, frakcjonowano ze względu na wielkość na 4% natywnym żelu akrylamidowym, i poddano ekspozycji na kliszę autoradiograficznąw temperaturze -70°C przez 18 godzin. Oznaczono dwa pasma A i C, odpowiadające aktywności NF-kB - podobnej. W komórkach kontrolnych (nie poddanych obróbce) obserwowano słabe pasmo B. Na fig. 8 ukazano, że kwas linolowy indukuje NF-kB - podobną aktywność wiązania do promotora VCAM-1 w sposób wrażliwy na reakcje redox. Jest to analogiczne do cytokiny TNF-α i sugeruje podobny mechanizm działania. TNF-α prawdopodobnie indukuje VCAM-1 poprzez mechanizm, którego mediatorem jest ox-PUFA.
Przykład8. Utlenienie w bezkomórkowym, pozbawionym pożywki układzie przez nieutleniony i utleniony (15-HPETE) kwas arachidonowy
Figury 9A i 9B stanowią wykresy kolumnowe względnie reaktywnych na kwas tiabarbiturowy substancji (O. D. 532 nm) kwasu arachidonowego i 15-HPETE w obecności lub nieobecności PDTC. Próba reaktywności na kwas tiabarbiturowy (TBARS) pozwala zmierzyć zdolność utleniającą materiału w bezkomórkowym, nie zawierającym pożywki, środowisku. Jak to ukazano na figurach, zarówno kwas arachidonowy, jak i 15-HPFTE wykazują wyraźną aktywność TBARS, hamowaną przez PDTC.
180 874
III. Sposób loczeniazaburzee, których mediatorem jest OCAM-l
Odkrycie, że wielonienasycone kwasy tłuszczowe i ich utlenione metabolity stanowią selektywne, wrażliwe na reakcje redox immunomodulatory, zapewnia podstawę do leczenia zaburzeń, których mediatorem jest VCAM-1 lub geny wrażliwe na reakcje redox.
Zapewnia się sposób leczenia miażdżycy, restenozy po angioplastyce, chorób naczyń wieńcowych, dusznicy bolesnej i innych chorób sercowo-naczyniowych, jak również chorób zapalnych nie obejmujących układu sercowo-naczyniowego, których mediatorem jest VCA'M-1, przy czym sposób ten polega na usunięciu, zmniejszeniu stężenia lub zapobieganiu wytwarzania się utlenionych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, takich jak np. (lecz nie ograniczonych do nich) utleniony kwas linolowy, linolenowy i arachidonowy. W alternatywnym wykonaniu zapewnia się sposób leczenia tych chorób, polegający na zapobieganiu interakcji PUFA lub ox-PUFA z białkiem lub peptydem, stanowiącym mediator ekspresji VCAM-1.
Hamowanie ekspresji VCAM-1 można osiągnąć na różne sposoby, w tym przez podawanie przeciwutleniacza, zapobiegającego utlenianiu wielonienasyconego kwasu tłuszczowego, przez modyfikację ib vivo metabolizmu PUFA do ox-PUFA, jak to szczegółowo opisano poniżej. l.Podewebir przrciwutlóbiedzy
W tym sposobie leczenia można stosować dowolny związek redukujący ox-PUFA lub hamujący utlenianie PUFA, któryjest względnie nietoksyczny i biodostępny, lub który można zmodyfikować dla zapewnienia jego biodostępności. Specjalista łatwo ustali standardowymi sposobami, czy dany związek redukuje ox-PUFA lub hamuje utlenianie PUFA.
Pkzódiwutlóbiedzr eitiokekńokcylebowr
Stwierdzono, że ditiokarboksylany wykazują korzystne działanie w leczeniu miażdżycy i innych chorób sercowo-naczyniowych i zapalnych. Ditiokarboksylany, w tym ditiokarbaminiany, można stosować do blokowania zdolności komórek, w tym komórek śródbłonka, do ekspresji VCAM-1 lub do hamowania ekspresji genu wrażliwego na reakcje redox lub aktywacji genu hamowanego na szlaku wrażliwym na reakcje redox.
Co najmniej jeden z tych związków, ditiokarbaminian pirolidynowy (PDTC) hamuje ekspresję genu VCAM-1 w stężeniu mniejszym od 1,0-mikromolowego. Związki te wykazują również korzystną toksyczność wobec namnażających się lub nieprawidłowo dzielących komórek mięśniówki gładkiej naczyń. Inny ditiokarbaminian, N-metylo-N-karboksymetylo-N-karboditiolan sodowy, również hamuje ekspresję VCAM-1, lecz nie wykazuje korzystnej toksyczności wobec nieprawidłowo dzielących się komórek mięśniówki gładkiej naczyń.
Stwierdzono, że ditiokarbaminian pirolidynowy nie hamuje istotnie ekspresji ICAM-1 ani ELAM-1, tak więc leczenie tym związkiem nie wpływa niekorzystnie na aspekty odpowiedzi zapalnej, której mediatoremjest ELAM-1 lub ICAM-1. Tak więc unika się uogólnionej immunosupresji. W ten sposób unika się powikłań ogólnoustrojowych, wynikających z uogólnionego hamowania cząsteczek adhezyjnych w licznych innych komórkach, o których wiadomo, że wykazują ekspresję tych cząsteczek. Inne farmaceutycznie dopuszczalne sole PDTC również stanowią skuteczne środki do leczenia chorób sercowo-naczyniowych i zapalnych.
Ditiokarbaminiany stanowiąchelatory metali przejściowych stosowane w klinice w przypadkach zatrucia metalami ciężkimi. Baselt, R. C., F. W. J. Sunderman i wsp., (1977), “Comparisons od antidotal efficacy of sodium diethyldithiocarbamate, D-penicillamine and triethylenetetramine upon acute toxicity of nickel carbonyl in rats”. Res Commun Chem Pathol Pharmacol 18(4): 677-88; Menne, T. i K. Kaaber (1978), “Treatment of pompholyx due to nickel allergy with chelating agents”. Contact Dermatitis (4(5): 289-90; Sunderman, F. W. (1978), “Clinical response to therapeutic agents in poisoning from mercury vapor” Ann Clin Lab Sci 8(4): 259-69; Sunderman, F. W. (1979), “Efficacy of sodium diethylodithiocarbamate (dithiocarb) in acute nickel carbonyl poisoning”. Ann Clin Lab Sci 9(1): 1-10; Gale, G. R., A. B. Smith i wsp., (1981), “Diethylodithiocarbamate in treatment of acute cadmium poisoning”, Ann Clin Lab Sci 11(6): 476-83; Jones, M. M. i M. G. Cherian (1990), “The search for chelate antagonists for chronic cadmium intoxication”, Toxicology 62(1): 1-25; Jones S. G., M. A. Basinger i wsp., (1982), “A comparison of diethylodit180 874 hiocarbamate and EDTA as antidotes for acute cadmium intoxication”, Res Commun Chem Pathol Pharmacol 38(2): 271-8; Pages, A., J. S. Casas i wsp. (1985), “Dithiocarbamates in heavy metal poisoning: complexes of N,N-di(1-hydroxyethyl)dithiocarbamate with Zn(II), Cd. (Ii), Hg(II), CH3Hg(II) i C6H5I Ig(ll). : J. Inorg Biochem 25(1): 35-42; Tandon, S. K.,N. S. Hashmi i wsp., (1990), “The lead-chelating effects of substituted dithiocarbamates”. Biomed Environ Sei 3(3): 299-305.
Ditiokarbaminiany stosuje się również jako środek dodatkowy w chemioterapii cisplatyną w celu zapobiegania nefrotoksyczności. Hacker, M. P., W. B. Ershler i wsp (1982), “Effect of disulfiram (tetraethylthiuram disulfide) and diethyldithiocarbamate on the bladder toxicity and antitumor activity of cyclophosphamide in mice”, Cancer Res 42(11): 4490-4. Bodenner, 1986 #733; Saran, M. i Bors, W. (1990) “Radical reactions in vivo - an overview”.Radiat. Environ. Biophys. 29(4): 249-62.
Ditiokarbaminian stosowany obecnie w leczeniu nadużywania alkoholu stanowi disulfiram, dimer dwuetyloditiokarbaminianu. Disulfiram hamuje dehydrogenazę aldehydową w wątrobie. Inoue, K. i Fukunaga, i wsp., (1982) “Effect of disulfiram and its reduced metabolite, diethyldithiocarbamate on aldehyde dehydrogenase of human erythrocytes”, Life Sci 30(5): 419-24.
Istnieją doniesienia o tym, że ditiokarbaminiany hamują replikację wirusa HIV, jak również przyspieszają dojrzewanie swoistych subpopulacji komórek T. Odkrycie to dało początek badaniom klinicznym ditiokarbaminianu w populacji chorych na AIDS. Reisinger, E. i wsp., (1990), “Inhibition of HIV progression by dithiocarb.”, Lancet 335: 679.
Ditiokarboksylany stanowią związki o wzorze A-SC(S)-B, należące do ogólnej klasy związków znanych jako przeciwutleniacze tiolowe, i zwane są inaczej karboditiolami lub karboditiolanami. Wydaje się, że cząstka -SC(S) ma zasadnicze znaczenie dla aktywności terapeutycznej, i że A i B mogą stanowić dowolną grupę, która nie wpływa niekorzystnie na skuteczność lub toksyczność związku.
W alternatywnym wykonaniu, jeden lub oba atomy siarki ditiokarbaminian zastąpione są atomem selenu. Zastąpienie siarki selenem może zmniejszać toksyczność cząsteczki w niektórych przypadkach, przez co jest on lepiej tolerowany przez pacjenta. Doboru A i B specjalista dokona tak, aby uzyskać korzystną charakterystykę związku, włączając w to wielkość, ładunek, toksyczność, i stopień stabilności (w tym także stabilność w środowisku kwaśnym, takim jak żołądek, lub zasadowym, takim jak dalsze odcinki przewodu pokarmowego). Dobór A i B ma również istotny wpływ na dystrybucję w tkankach i farmakokinetykę związku. Ogólnie, w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych, korzystne jest, aby związek akumulował się, lub lokalizował, w warstwie błony wewnętrznej naczynia, w której znajdują się naczyniowe komórki śródbłonka. Korzystne są związki wydalane z moczem.
Korzystną cechą przy farmaceutycznym podawaniu ditiokarboksylanów jest to, że, jak się wydaje, nie ulegają one enzymatycznemu rozszczepieniu in vivo przez tioesterazy, mogą więc wykazywać długi okres półtrwania in vivo.
W korzystnym wykonaniu, A stanowi atom wodoru lub farmaceutycznie dopuszczalny kation, jak na przykład, lecz bez ograniczenia do nich, atom sodu, potasu, wapnia, magnezu, glinu, cynku, bizmutu, baru, miedzi, kobaltu, niklu, lub kadmu; tworzący sole kwas organiczny, typowo kwas karboksylowy, jak na przykład, lecz bez ograniczenia do nich, kwas octowy, kwas szczawiowy, kwas winowy, kwas bursztynowy, kwas jabłkowy, kwas askorbinowy, kwas benzoesowy, kwas garbnikowy, kwas pamoinowy, kwas alginowy, kwas poliglutaminowy, kwas naftalenosulfonowy, kwas naftalenodwusulfonowy, lub kwas poligalakturonowy; lub kation wytworzony z amoniaku lub innej zasady azotowej, jak na przykład, lecz bez ograniczenia do nich, azotowa grupa heterocykliczna, lub cząstka o wzorze NR4R5R6R7, w którym R4, R5, R6 i R7 stanowią, niezależnie od siebie, atom wodoru, grupa alkilowa C1- linearna, rozgałęziona, lub (w przypadku C4.6) cykliczna, hydroksy(C1.66 alkilowa (w której na dowolnym atomie węgla znajduje się jedna lub więcej grup hydroksylowych), lub arylowa, N,N-dwubenzyloetylenodwuamina, D-glukozamina, cholina, tetraetyloamoniak, lub etylenodwuamina.
W innym wykonaniu, A może stanowić fizjologicznie odszczepialną grupę opuszczającą, która może ulegać odszczepieniu in vivo z cząsteczki, do której jest przyłączona, jak na przykład,
180 874 lecz bez ograniczenia do nich, grupy acylowe (włączając w to grupę acetylową, propionylową i butyrylową), alkilowe, fosforanowa, siarczanowa lub sulfoniowa.
W jednym z wykonań, B stanowi grupa alkilowa, alkenylowa, alkinylowa, alkoarylowa, aroalkilowa, chlorowcoalkilowa, chlorowcoalkenylowa, chlorowcoalkinylowa, arylowa, alkoarylowa, atom wodoru, grupa Ci- a1koksy-Cl_l()alkiio\vaJ Ci^alkilot^o-Cnoalkilowa, NR2R3, -(CHOH)nCH2OH, w której wartość n wynosi 0,1,2, 3,4, 5 lub 6, -(CH2)nCO2Ri, w tym grupa alkiloacetylowa, alkilopropionylowa i alkilobutyrylowa, lub hydroksy(Ci-6) alkilo- (w której przy dowolnym z atomów węgla znajduje się jedna lub więcej grupa hydroksylowa).
W innym wykonaniu, B stanowi Nr2r3, w którym R2 i R3 stanowią niezależnie od siebie grupy alkilowe; -(CHOHjnC^OH, w której wartość n wynosi 0,2,2,3,4,5 lub 6, -(CH2)nCO2Ri, -(CH2)nCO2R4; hydroksy(Ci_6)alkilo-; alkenylowa (na przykład, lecz bez ograniczenia do nich, grupa winylowa, allilowa, i CH3CH=CH-CH2CH2); alkilo(CO2H), alkenylo(CO2H), alkinylo(CO2H), lub arylowa, w której grupa arylowa może zawierać podstawnik, jak to opisano powyżej, szczególnie, na przykład, NO2, CH3, grupę t-butylową, CO2H, atom chlorowca, lub grupę p-OH; lub R2 i R3 mogą razem tworzyć mostek taki jak -(CH2)m-, w którym wartość m wynosi 3, 4, 5 lub 6, i w którym R4 stanowi grupa alkilowa, arylowa, alkoarylowa lub aroalkilowa, na przykład, lecz bez ograniczenia do nich, grupa acetylowa, propionylową i butyrylową.
Wjeszcze innym wykonaniu, B może stanowić grupę heterocykliczną lub alkikloheterocykliczną. Grupa heterocykliczna może być ewentualnie częściowo lub całkowicie uwodorniona. Nieograniczające przykłady stanowiągrupy wymienione powyżej, włączając w to grupę fenazynową, fenotiazynową, pirydynową i dihydropirydynową.
W jeszcze innym wykonaniu, B stanowi pozostałość farmaceutycznie czynnego związku lub leku. Termin “lek”, w rozumieniu niniejszego opisu, oznacza dowolną substancję do użytku wewnętrznego lub zewnętrznego jako środek do leczenia lub zapobiegania choroby lub zaburzenia.
Nieograniczające przykłady stanowią leki do leczenia lub zapobiegania chorób sercowo-naczyniowych, takie jak przeciwutleniacze, np. probucol; kwas nikotynowy; środki zapobiegające zlepianiu się płytekkrwi, takie jak aspiryna; środki przeciwzakrzepowe, jak kumaryna; blokery kanału wapniowego, jak werapamil, diltiazem i nifedypina; inhibitory enzymu konwertazy angiotensyny (ACE), jakkaptopryl i enalapryl; β-blokery, jakpropanolol, terbutalol i labetalol; niesterydowe leki przeciwzapalne, jak ibuprofen, indometacyna, fenoprofen, kwas mefenamowy, kwas flufenamowy, sulindak, lub kortykosteroidy. Grupa - C(S)SA może być bezpośrednio połączona z lekiem, lub przyłączona poprzez dowolnąodpowiedniącząstkę łącząca.
W innym wykonaniu, ditiokarbaminian stanowi pochodna aminokwasu o wzorze AO2C-R9-NR1o-C(S)SA, w którym R9 stanowi dwuwartościowa cząstka B, cząstka łącząca, lub reszta wewnętrzna dowolnego z naturalnie występujących aminokwasów (np. CH3CH dla alaniny, CH2 dla glicyny, CH(CH2)4NH2 dla lizyny, itd.), a Rw stanowi atom wodoru lub niższa grupa alkilowa.
B może również stanowić polimer, do którego dołączona jest jedna lub więcej grup ditiokarbaminianowych, bezpośrednio lub poprzez dowolnąodpowiecdiiącząstkę łączącą. Ditiokarbaminian uwalnia się korzystnie z polimeru w warunkach in vivo w czasie odpowiednim dla zapewnienia korzystnego wpływu leczniczego. W korzystnym wykonaniu, sam polimer również ulega degradacji in vivo. Termin “ulegający biodegradacji”, w rozumieniu niniejszego opisu, oznacza polimer, który rozpuszcza się lub degraduje w okresie dopuszczalnym w pożądanym zastosowaniu (zwykle w terapii in vivo), wynoszącym zwykle poniżej pięciu lat, a korzystnie, mniej niż jeden rok, przy ekspozycji na roztwór fizjologiczny o pH 6-8 w temperaturze 25 a 37°C. W korzystnym wykonaniu, polimer degraduje się w czasie wynoszącym od 2 godziny do kilku tygodni, w zależności od zastosowania.
Znanych jest wiele polimerów ulegających degradacji. Nieograniczające przykłady stanowią peptydy, białka, nukleoproteiny, lipoproteiny, glikoproteiny, syntetyczne i naturalne polipeptydy i poliaminokwasy, na przykład, lecz bez ograniczenia do nich, polimery i kopolimery lizyny, argininy, asparaginy, kwasu aspartamowego, cysteiny, cystyny, kwasu glutaminowego, glutaminy, hydroksylizyny, seryny, treoniny, i tyrozyny; poliortoestry, takie jak poli(a-hydroksykwasy), na przykład, kwas polimlekowy, kwas poliglikolowy, poli(laktydo-ko180 874
-glikolid), wielobezwodniki, albumina lub kolagen, polisacharydy zawierające jednostki cukrowe, jak laktoza, i polikaprolakton. Polimer może stanowić kopolimer nieregularny lub blokowy.
B może również stanowić grupę zwiększającą rozpuszczalność ditiokarbaminianu w wodzie, na przykład, -niższy alkilo-O-R8, w którym R8 stanowi -PO2(OH)M+ LUB PO3(M+)2, w którym M+ stanowi farmaceutycznie dopuszczalny kation; -C(O) (CH2)2CO2-M+ lub -SO3- M+ -niższą alkilową alkilokarbonylo-niższą; -korboksylo-niższą alkilową; -niższą alkiloaminoniższą alkilową, N,N-dwupostawioną amino niższą alkilową, w której podstawniki stanowiąniezależnie od siebie grupę niższą alkilową; pirydylo-niższą alkilową, imidazolilo-niższą alkilową, imidazolilo-Y-niższą alkilową, w której Y stanowi grupę tiolową lub aminową; morfolinyloniższą alkilową, pirolidynylo-niższą alkilową; tiazolinylo-niższą alkilową, piperydynylo-niższą alkilową, morfolinylo-niższą hydroksyalkilową; N-pirylową; piperozynylo-niższą alkilową, N-podstawioną piperazynylo-niższą alkilową, w której podstawnik stanowi niższa grupa alkilowa; triazolilo-niższą alkilową; tetrazolilo-niższą alkilową, tetrazolilamino-niższą alkilową; lub tiazolilo-niższą alkilową.
W alternatywnym wykonaniu podawać można dimer toki jak B-C(S)S-SC(S)-B.
Nieograniczające przykłady ditiokarbaminianów stanowią związki o wzorze:
1) Substrat alifatyczny
HR
2)aminokwas
COOH •C
I
S·
COOH
IR'H
COOH ,R H
Lys- Lys ' I .
NR I c=s
I
I rn
I
C= S
I
S'
C=S
I s-
i
3’
O
B
Rpodstawniki
NOj
CH3 lub grupa t-butylowa
COOH p-OH
A-S-C-B
K* s S H* u a
B-C-S-S-C-B
R-C-S-C-R Na* Tioester
Ca**
NH/
Cholina* i aminy czwartorzędowe
Mg**
Al.+++
180 874 zmienionego. Związek nie powinien gromadzić się w przedziałach o niskim obrocie metabolicznym, takich jak tkanka tłuszczowa. W korzystnym wykonaniu do leczenia chorób sercowo-naczyniowych, farmakokinetyka związku nie powinna ulegać istotnym zmianom w przypadku zastoinowej niewydolności serca ani niewydolności nerek.
W celu podawania miejscowego, do leczenia chorób zapalnych skóry, wybrany związek należy wytwarzać w postaci preparatu wchłanianemu przez skórę w ilości wystarczającej dla uzyskania działania terapeutycznego w miejscu chorobowo zmienionym.
Ditiokarboksylan musi być fizjologicznie dopuszczalny. Ogólnie, dopuszczalne sązwiązki o indeksie teeapeutycznym ^noszącym co najimuee 2, a korrystnie, co najmniee 5 lub 10. Indeks terapeutyczny definiuje się jako EC50/ICs0, gdy EC50 stanowi stężenie związku hamującego ekspresję VCAM-1 o 50%, natomiast IC50 stanowi takie stężenie związku, które jest toksyczne dla 50% komórek docelowych. Toksyczność komórkową można mierzyć poprzez bezpośrednie zliczanie komórek, metodą wyłączenia błękitu trypanowego, lub różne badania nad aktywnością metaboliczną, np. metodą włączania 3H-tymidyny, jak jest to znane specjalistom. Indeks terapeutyczny PDTC w hodowli komórkowej w komórkach HUVE, mierzony jako iloraz toksyczności komórkowej i zdolności hamowania aktywowanej przez TNFa ekspresji VCAM-1, ma wartość powyżej 100. We wstępnych badaniach nad szybko dzielącymi się komórkami ludzkiego glejaka HT-18 wykazano brak toksyczności w stężeniach 100-krotnie wyższych od stężenia terapeutycznego. Disulfiram, stosowana doustnie postać dwuetyloditiokarbaminianu, stosowana w leczeniu nadużywania alkoholu, nie wykazuje zwykle istotnego klinicznie działania toksycznego przy właściwym stosowaniu.
Znanych jest kilka ditiokarbaminianów o działaniu uszkadzającym geny (genottoksycznym). Związki te nie są objęte zakresem niniejszego wynalazku, który ograniczony jest do podawania materiałów dopuszczalnych fizjologicznie. Przykład ditiokarbaminianu genotoksycznego stanowi środek grzybobójczy dwumetyloditiokarbaminian cynku. Ponadto, właściwości antycholinesterazowe niektórych ditirkarbaminianów mogą prowadzić do działania neurotoksycznego. Miller, D. (1982), “Neurrerxiciey of the pesticidal carbamates. Neurobehav. Toxicol. Tetratol. 4(6): 779-87.
Termin “ditiokarboksylan” w rozumieniu niniejszego opisu oznacza, lecz nie jest do niego ograniczony, ditiokarbaminiany o wzorach:
R1 SC(S)NR2R3 lub R2R3N(S)CS-SC(S)NR2R3, w których R1 stanowi atom wodoru lub kation dopuszczalny farmaceutycznie, jak na przykład, lecz bez ograniczenia do nich, jon sodowy, potasowy, lub nR4R5R6R7, w którym R4, R5, R6 i R7 stanowią, niezależnie od siebiem otom wodoru, grupę C1.6 alkilową o łańcuchu prostym, rozgałęzionym lub cyklicznym, grupę hydro ksylCalkalkilową Sw keórej przy donornym miGenie wagln znajduje sięjc^dmr lub weccej gruy hydroksylowych), lub grupę arylową, a
R2 i R3 stanowią, niezależnie od siebie, grupę CWo alkilową o łańcuchu prostym, rozgałęzionym lub cyklicznym; -(CHOH)n(CH2)nOH, w których n może wynosić 0, 12, 3, 4, 5 lub 6; -(CH2)nCO2R1, -(CH2)nCO2R4; grupę hydroksyl .^alkilową, lub R2 i R3 razem tworzą wiązanie, na przykład -(CH2)o-, w którym wartość m wynosi 3-6, i w którym R4 stanowi grupę alkilową, arylową, alkyarylową, lub aroalkilową, włączając w to grupę acetylową, propissnylowąl butyrylową.
Szczegółowe przykłady korzystnych ditiykarbaminianów, przedstawione na fig. 15, stanowią sól sodowa dieiokarbaminianu N-pirolidynowego, N-metylo-N-karbyktymetyly-Nkarbydieiylan sodowy, N,N-dwa(karboktymetylo)-N-karboditiolan trójsodowy, N-metylo-D-glukamino-N-karbyditiolan sodowy; N,N-dwuetylo-N-karboditiolan sodowy (dwadeyloZitiykarbaminian sodowy) i N,N-dwuizopropylo-N-karbyditiolan sodowy.
Aktywne Zitiykarboksylany, a w szczególności ditiokarbaminiany, są dostępne w handlu lub można je wytworzyć sposobami znanymi ze stanu techniki.
II. Aktywność biologiczna
Zdolność ditiykarbyktylanów do hamowania ekspresji VCAM-1 można mierzyć różnymi sposobami, na przykład sposobami opisanymi szczegółowo poniżej w przykładach 9-15. Dla
180 874 ułatwienia, w przykładach 9-11 i 14-15 opisano ocenę aktywności biologicznej soli sodowej karboditiolanu N-pirydynylowego (zwanej również PDTC). Celem tych przykładów nie jest ograniczenie zakresu wynalazku, który obejmuje zastosowanie dowolnego z wyżej opisanych związków do leczenia miażdżycy i innych rodzajów chorób zapalnych i sercowo-naczyniowych, których mediatorem jest VCAM-1. Zamiast PDTC można łatwo zastosować dowolny z wyżej opisanych związków i oceniać go w podobny sposób.
W przykładach 12 i 13 podano dane porównawcze dotyczące zdolności niektórych ditiokarbaminianów do hamowania ekspresji genu VCAM-1. W poniższych przykładach wykazano, że ditiokarbaminiany według niniejszego wynalazku swoiście blokują zdolność VCAM-1 do ekspresji w komórkach śródbłonka naczyniowego w odpowiedzi na wiele sygnałów, o których wiadomo, że wykazują aktywność w miażdżycy i w odpowiedzi zapalnej.
Procedury doświadczalne
Hodowle komórkowe
Dokonano izolacji z cewnikowanych ludzkich żył pępkowych komórek HUVE, przepłukano je roztworem Hanksa dla usunięcia krwi, a następnie inkubowano z 1% kolagenazą przez 15 minut w temperaturze 37°C. Po usunięciu kolagenazy komórki hodowano w pożywce M199 z dodatkiem 20% bydlęcej surowicy płodowej (HyClone), 16 pg/ml heparyny (ESI Pharmaceuticals, Cherry Hill, NJ), 50 (ig/ml dodatku wzrostowego dla komórek śródbłonka (Collaborative Reasearch Incorporates, Bedford MA), 25 mM Hepes Buffer, 2 mM L-glutaminy, 100 pg/ml penicyliny i 100 pg/ml streptomycyny, w temperaturze 37°C na płytkach do hodowli tkankowej, pokrytych 0,1% żelatyną. Dokonano pasażowania komórek w konfluencji poprzez rozszczepienie 1:4. Komórki stosowano w pierwszych 8 pasażach.
Inkubacja z cytokinami i innymi odczynnikami
Konfluentne komórki HUVE przepłukano solą fizjologiczną buforowaną fosforanem, po czym umieszczono w świeżej pożywce. 30 minut przed dodaniem cytokin dodano wskazane stężenia PDTC. Do pożywki bezpośrednio dodano cytokiny i inne induktory, w punktach czasowych i w stężeniu wskazanych dla każdego doświadczenia. Ludzka rekombinacyjna IL-1b stanowiła dar Upjohn Company (Kalamazoo, Michigan). TNFa uzyskano z firmy Boehringer Ingelheim. Lipopolisacharyd bakteryjny (LPS), kwas poliinozynowy : kwas policytydylowy (Poły I:C) i ditiokarbaminian pirolidynowy (PDTC) uzyskano z firmy Sigma Chemical (St. Louis, MO). Wszystkie inne odczynniki stosowano w stopniu odczynnika.
Izolacja RNA
Dokonano izolacji całkowitego RNA komórkowego poprzez pojedynczą ekstrakcję z zastosowaniem kwaśnej mieszaniny tiocyjanianu-fenolu-chloroformu. Komórki przepłukano solą fizjologiczną /buforowaną fosforanem, a następnie dokonano ich lizy 2 ml izotiocyjanianu guanidynowego. Roztwór zakwaszono 0,2 ml octanu sodowego (pH 4,0), a następnie ekstrahowano 2 ml fenolu i 0,4 ml mieszaniny chloroformu : alkoholu izoamylowego (24:1). Przeprowadzono dwukrotnie strącenia RNA etanolem przed zastosowaniem go do analizy metodąNorthem blot.
Analiza metodąNorthem blot
Wyizolowano RNA całkowite (20 pg) i dokonano podziału na frakcje zależnie od wielkości z zastosowaniem 1% żelu agarozowo-formaldehydowego w obecności 1 pg/ml bromku etydowego. RNA przeniesiono na filtr nitrocelulozowy i połączono kowalencyjnie promieniowaniem ultrafioletowym z zastosowaniem urządzenia do wiązania poprzecznego Stratlinker UV (Stratagene, La Jolla, CA). Hybrydyzację prowadzono w temperaturze 42°C przez 18 godzin w 5X SSC (1X=150 mM NaCl, 15 mM cytrynianu Na), 1% soli sodowej siarczanu dodecylowego, 5X roztworze Denhardta, 50% formamidzie, 10% siarczanie dekstranowym i 100 pg/ml pociętego zdenatuworanego DNA spermy łososiowej. Zastosowano około 1-2X 106 cpm/ml wyznakowanej sondy (aktywność swoista > 108 cpm/pg DNA) na hybrydyzację. Po hybrydyzacji filtry przepłukano na koniec 0,2X SSC w temperaturze 55°C. Przed rehybrydyzacjaz innymi sondami
180 874 nitrocelulozę usunięto przegotowaną wodą. Przeprowadzono autoradiografię z ekranem intensyfikującym w temperaturze -70°C.
32Sondy
Sondy DNA, wyznakowane 32p, wytworzono sposobem losowego doboru primera oligonukleotydu. Sondę ICAM-1 stanowił fragment EcoRI ludzkiego cDNA. Sondę ELAM-1 stanowił 1,85 kb fragment Hind III ludzkiego cDNA. Sondę VCAM-1 stanowił fragment Hind III - Xho I ludzkiego cDNA, utworzony z nukleotydów 132-1814.
Enzymatyczny Test Immunosorpcyjny (ELISA)
Komórki HUVE posiewano na 96-zagłębieniowe płytki 48-72 godzin przed przeprowadzeniem testu. Do każdego z zagłębień dodano przeciwciała pierwotne w M199 z 5% FBS i inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze 37°C. Komórki następnie przepłukano i inkubowano przez jedną godzinę ze znakowanymi peroksydaząlgG kozimi, skierowanymi przeciwko przeciwciałom mysim (Bio Rad), rozcieńczonymi 1/500 w M199 z 5% FBS. Następnie przepłukano zagłębienia i prowadzono wykrywanie wiązania przeciwciał, dodając 100 μΐ 10 mg/ml 3, 3, 5, 5'-tetrametylobenzydyny (Sigma) z dodatkiem 0,003% H2O2. Reakcję przerwano, dodając 25 μΐ 8N kwasu siarkowego. Płytki odczytano w urządzeniu do odczytu ELISA (Bio Rad) w OD 450 nm po zaślepieniu na rzędach zabarwionych tylko przeciwciałem drugiego etapu. Dane stanowią średnią z trzech powtórzeń.
Przeciwciała
Przeciwciało monoklonalne (MAb) 4B9, rozpoznające cząsteczkę adhezji komórkowej naczyń - 1 (VCAM-1) były darem Dr Johna Harlana (University of Washington). MAb rozpoznające cząsteczkę adhezji komórek śródbłonka (ELAM-1) były darem Dr Swerlick (Emory University). Hybrydoma wytwarzające MAb 84H10, rozpoznające wewnątrzkomórkową cząsteczkę adhezyjną(ICA.M-1) wyhodowano rutynowymi sposobami w naszym laboratorium i przeciwciało zastosowano jako supernatant hodowli komórkowej.
Przykład 9. PDTC blokuje indukcję akumulacji mRNA VCAM-1 HUVEC, której mediatorem jest IL-1B, lecz nie blokuje indukcji ICAM-1 ani ELAM-1
Dla określenia, czy stan oksydacyjny komórki śródbłonka może zmieniać podstawową lub indukowaną ekspresję genu cząsteczki adhezji komórkowej, dokonano ekspozycji ludzkich komórek śródbłonka naczyniowego na działanie cytokiny indukcyjnej, IL-1b (10 U/ml) w obecności lub w nieobecności tiolowanego przeciwutleniacza chelatującego metal, ditiokarbaminianu pirolidynowego (PDTC, 50 pM) przez czas do 24 godzin. Jak to ukazano na fig. 10, sama IL-1b (pasma 2, 4, 6, 8) indukuje oczekiwaną szybką i przejściową indukcję akumulacji mRNA VCAM-1 (Płytka A), E-selektyny (ELAM-1, Płytka B) i ICAM-1 (Płytka C), z których wszystkie osiągają wartości szczytowe po czterech godzinach. Jednakże, w obecności PDCT, indukcja akumulacji mRNA VCA.M-1 przez IL- 1b jest gwałtownie hamowana o ponad 90% (Płytka A, pasma 3,5,1 i 9). W przeciwieństwie do tego, jakkolwiek indukcja ELAM-1, której mediatorem jest IL- lb, ulega niewielkiemu hamowaniu po 2 i 24 godzinach (por. pasma 2 i 3), 8 i 9, Płytka B), PDCT nie hamuje indukcji po 4 i 8 godzinach (pasma 5 i 7, Płytka B). Indukcja akumulacji mRNA ICAM-1, której mediatorem jest IL-1b, nie jest zaburzona (Płytka B, pasma 3, 5, 7 i 9). Istotnie, spostrzega się niewielki wzrost indukcji przez IL-1b akumulacji mRNA ICAM-1 (-30%) (por. pasma 4 i 5, Płytka B). Jednakową ilość przeniesionego na nitrocelulozę RNA na pasmo potwierdzono poprzez barwienie bromkiem etydowym i uwidocznienie.
Przeprowadzono analizę zależności odpowiedzi od dawki dla określenia, czy PDTC hamuje indukcję ekspresji genu VCAM-1 przez IL-1b w sposób zależny od dawki. Jak to ukazano na fig. 11, PDTC hamuje indukcję ekspresji genu VCAM-1, której mediatorem jest IL-1b, stromą krzywą zależności odpowiedzi od dawki (fig. 11, Płytka A) z obliczonym EC5O wynoszącym około 10 pM, natomiast PDTC nie hamuje indukcji ekspresji ELAM-1, której mediatorem jest IL-1b, w tych stężeniach (fig. 11, Płytka B). Indukcja akumulacji mRNA ELAM-1, której media180 874 torem jest IL-1b, jest zwiększana przez PDTC w stężeniu powyżej 0,5 μM (fig. 2, por. pasmo 2 i pasma 4-7, Płytka C).
Dane te wykazują, że IL- 1b wykorzystuje etap wrażliwy na ditiokarboksylan, a w szczególności na ditiokarbaminian, jako część swego mechanizmu sygnalizacyjnego przy indukcji ekspresji genu VCAM-1. Dane wydają się również wskazywać, że ten etap wrażliwy na ditiokarbaminian nie odgrywa istotnej roli w indukcji ekspresji genu ELAM-1 ani ICAM-1, której mediatorem jest IL-1b.
Przykład 10. PDTC blokuje indukcję akumulacji mRNA VCAM-1HUVEC poprzez różnorodne dodźce
W celu stwierdzenia, czy inne znane z piśmiennictwa aktywatory ekspresji genu VCAM-1 również wykorzystują etap wrażliwy na PDTC, przebadano trzy odrębne klasy aktywatorów: inny klasyczny czynnik indukujący, którego mediatorem jest receptor (TNFa), induktor, którego mediatorem nie jest receptor (lipopolisacharyd - LPS), i opisany niedawno nowy induktor (dwuniciowy RNA, poli (I:C). We wszystkich trzech przypadkach, PDTC znacznie hamował indukcję akumulacji mRNA VCAM-1 HUVEC po czterech godzinach (fig. 12, mRNA VCAM-1 Płytka A). Jakkolwiek ekspresja genu ELAM-1, której mediatoremjest TNFa, ulega w pewnym stopniu zahamowaniu (fig. 12 pasmo 1 i 2, Płytka B), akumulacja mRNA ELAM-1, której mediatorem jest LPS i poli(I:C) nie ulega zmianie (fig. 12 pasma 3-6, Płytka B). Dane te wskazują, że strukturalnie różne czynniki indukujące, działające poprzez odrębne szlaki, mają wspólny etap regulacyjny swoisty dla indukcji ekspresji genu VCAM-1.
Przykład 11.
PDTC blokuje ekspresję VCAM-1 na powierzchni komórki HUVE, indukowaną przez różne bodźce
W celu określenia, czy indukcja ekspresji białka powierzchni komórek śródbłonka VCAiM-1, podobnie jak jego mRNA, ulega hamowaniu przez PDTC, przeprowadzono test ELISA z użyciem przeciwciał monoklonalnych dla ilościowej oceny indukcji VCAM-1 i ICAM-1 powierzchni komórki hodowli komórek HUVE. Jak to ukazano na fig. 13, wiele klas czynników aktywujących, w nieobecności PDTC (-PDTC), indukuje szybką i przejściową akumulację VCAM-1 (górna płytka po lewej stronie) w momencie szczytu na powierzchni komórki po sześciu godzinach. W obecności PDTC (+PDTC, górna płytka po prawej stronie), indukcja przez wszystkie badane czynniki ekspresji VCAM-1 na powierzchni komórki wyraźnie zmniejsza się (80-90%). W przeciwieństwie do tego, indukowana ekspresja ICAM-1 na powierzchni komórki w tych samych warunkach nie zmienia się (dolne płytki po lewej i prawej stronie).
Dane te wskazują, że ekspresja VCAM-1 na powierzchni komórki, podobnie jak akumulacja jej mRNA, ulega wybiórczemu hamowaniu przez ditiokarbaminiany i że wiele klas czynników aktywujących wykorzystuje podobny, wrażliwy na ditiokarbaminiany mechanizm w celu indukowania ekspresji genu VCAM-1.
Przykład 12. Porównanie skuteczności przeciwutleniaczy w blokowaniu indukcji VCAM-1 przez TNFa
W celu określenia, czy strukturalnie podobne, lub niepodobne, przeciwutleniacze mogą również hamować ekspresję genu VCAM-1, i z jakim natężeniem, komórki HUVE eksponowano na sześć godzin na TNFa w obecności lub w nieobecności czterech różnych przeciwutleniaczy w różnym stężeniu. Jak to ukazano na fig. 14, zarówno dwuetyloditiokarbaminian (DETC), jak i N-acetylocysteina (NAC) hamowały ekspresję VCAM-1 w stężeniu, odpowiednio, 5 μM i 30 μM. W przeciwieństwie do tego, PDTC (PDTC) wykazywał skuteczność w stężeniu od 5 do 50 μM. Chelator metali (żelaza), desferoksamina, nie wykazywał działania w badanych stężeniach.
Przykład 13. PDTC hamuje indukcję przez TNF adhezji, której mediatorem jest VCAM-1/VLA-4
Sposobami opisanymi w przykładzie 12 badano zdolność rozmaitych przeciwutleniaczy do hamowania indukcji TNF-α VCAM-1 w komórkach HUVE. Fig. 15 stanowi wykres względnej ekspresji VCAM-1 powierzchni komórkowej (O. D. 595 nm) w ludzkich komórkach
180 874 śródbłonka żyły pępkowej, aktywowanych TNFa, w zależności od stężenia PDTC (sól sodowa ditiokarbaminianu N-pirolidynowego), DIDTC (N,N-dwuetylo-N-karboditiolan sodowy), SarDTC (N-metylo-N-karboksymetylo-N-karboditiolan sodowy), IDADTC (N,N-dwu(karboksymetylo)-N-karboditiolan trójsodowy), MGDTC (N-metylo-D-glukamino-N-karboditiolan sodowy), MeOBGDTC (\-(4-metoksybenzylo)-D-glukamino-N-karboditiolan sodowy), DEDTC (N,N-dwuetylo-N-karboditiolan sodowy), Di-PDTC (N,N-dwuizopropylo-N-karboditiolan sodowy) i NAC (N-acetylocysteina).
Przykład 13. PDTC hamuje indukcję przez TNF adhezji, której mediatorem jest VCAM-1/VLA-4
W celu ustalenia, czy hamowanie przez PDTC regulacji VCAM-1 wiąże się z konsekwencjami czynnościowymi, badano przyłączanie się komórek Molt-4 do komórek HUVEC, stymulowanych, lub nie, TNFa (100 U/ml) przez sześć godzin w obecności lub nieobecności PDTC. Uprzednio wykazano, że komórki Molt-4 przyłączają się do aktywowanych komórek HUVEC poprzez mechanizm zależny od VCAM-1. Jak to ukazano na fig. 16, odsetek komórek Molt-4 przyłączających się do komórek HUVEC zmniejszał się przy obecności w pożywce PDTC.
Przykład 14.
PDTC hamuje wiązanie monocytów w aorcie piersiowej u królików, którym podawano cholesterol
Przeprowadzono doświadczenie w celu określenia, czy przeciwutleniacz tiolowy PDTC będzie skuteczny w blokowaniu pierwszej składowej miażdżycy, wiązania monocytów, w doświadczalnym modelu zwierzęcym. Jeden dojrzały biały królik szczepu New Zealand (3,5 kg) otrzymywał dożylnie PDTC (20 mg/kg, co odpowiada stężeniu 20 mg/ml w PBS) jeden raz dziennie przez 5 dni. Wstrzyknięcia podawano przez rurkę do żyły bocznej usznej, której drożność utrzymywano przez płukanie heparynizowanym roztworem soli fizjologicznej. PDTC roztwór wytwarzano codziennie lub do drugi dzień (przechowywano w ciemnym miejscu w temperaturze 4°C), i filtrowano (filtr o porach 0,45 mm) bezpośrednio przed użyciem. Po pierwszym wstrzyknięciu, po umieszczeniu rurki, lek podawano przytomnemu królikowi bez wyraźnego dyskomfortu ani innych działań niepożądanych. Drugiego dnia wstrzyknięć, królikowi podano karmę zawierającą 15 (wagowo) cholesterolu, którąpodawano następnie przez pozostały czas doświadczenia. W piątym dniu zwierzę uśmiercano, dokonywano wycięcia i utrwalenia aorty piersiowej. Po odpowiednim przygotowaniu próbkę oglądano na niższym etapie skaningowego mikroskopu elektronowego wyposażonego w emiter LaB. Stosując obrazowanie dwuekranowe i przezroczystą siatkę na ekranie CRT, oceniano 64 sąsiednie pola w powiększeniu 62ox, co odpowiada powierzchni ~1,3 mm2. W każdym polu zliczano liczbę przylegających leukocytów (WBC) i erytrocytów (RbC).
Dane z próbki łuku aorty były następujące: 5 WBC i ~25 RBC na pole o powierzchni
1,3 mm2. Ten poziom adhezji WBC jest podobny do obserwowanego u zwierząt kontrolnych, którym podawano zwykłą karmę (około 7 na pole obserwowano w próbkach z luku i odcinka piersiowego aorty w dwóch doświadczeniach “kontroli ujemnej”). U królików z “kontroli dodatniej”, otrzymujących przez 4 dni 1%o cholesterolu i nie otrzymujących przeciwutleniacza, stwierdzano około pięciokrotny wzrost adhezji, do wartości 38 WBC/1,3 mm2. Przy próbkach z łuku aorty obserwowano znaczną ilość szczątków o rozmiarach komórek. Nie jestjasne, czy materiał ten stanowi artefakt powstały przy wytwarzaniu preparatu, czy też 42X. Badania te sugerują, że wstrzyknięcia PDTC mogą skutecznie blokować początkową adhezję monocytów do śródbłonka aorty.
Przykład 15. Hamowanie związków addycyjnych BSA13-HPODE za pomocą PDTC
Figura 18 stanowi wykres kolumnowy wpływu PDTC na tworzenie się fluorescencyjnych związków addycyjnych bSa i 13-HPODE, według pomiaru w jednostkach fluorescencyjnych, w stosunku do mikromolowego stężenia PDTC. Jeden mikromol 13-HPODE inkubowano z 200 mikrogramami BSA w obecności PDTC przez sześć dni. Fluorescencję mierzono w 430-460 nm ze wzbudzeniem w 330-360 nm. Szczegóły testu, por. Freebis, J. Parthasarathy, S., Steinberg, D., Proceedings of the National Academy of Sciences 89, 10588-10592, 1992. W typowej reakcji
180 874
100 nmol LOOH (wytworzonego poprzez katalizowane przez lipooksygenazę utlenienie kwasu linolowego) inkubuje się ze 100 pg bydlęcej albuminy surowicy przez 48-72 godzin i po wytworzeniu się produktów fluorescencyjnych mierzy się spektrum fluorescencyjne ze wzbudzeniem w 360 nm i emisję pomiędzy 390 a 500 nm.
Jak to ukazano, PDTC zmniejsza stężenie fluorescencyjnych związków addycyjnych BSA i 13-HPODE.
Figura 19 stanowi wykres wpływu PDTC na tworzenie się fluorescencyjnych związków addycyjnych BSA i ox-PUFA w zależności od długości fali (nm) i stężenia PDTC. W miarę wzrostu PDTC zmniejsza się zawartość fluorescencyjnych związków addycyjnych.
Przykład 16. Wpływ PDTC na utlenianie LDL przez peroksydazę chrzanową
Figura 20 stanowi wykres wpływu PDTC na utlenienie LDL przez peroksydazę chrzanową (HRP), mierzony w zależności od czasu (minuty) dla zmiennego stężenia PDTC. Po utlenieniu LDL mierzono utlenienie składowych kwasów tłuszczowych LDL, określane poprzez wzrost gęstości optycznej w 234 nm. Gdy wielonienasycony kwas tłuszczowy utlenia się, zachodzi przemieszczenie wiązań podwójnych, w wyniku czego powstają sprzężone dieny absorbujące przy 234 nm. Uważa się, że odcinek krzywej rozpoczęcia i rozprzestrzeniania (okres latencji) jest miarą zdolności LDL do utlenienia. Typowo, 100 pg ludzkiego LDL inkubuje się z 5 pM H2O2 i obserwuje się następnie wzrost absorpcji w 234 nm. Stwierdzono, że po okresie inkubacji PDTC hamuje utlenianie LDL przez HRP w sposób zależny od stężenia.
Przykład 17. Wpływ PDTC na indukowane cytokinami wytwarzanie ox-PUFA
Figura 21 stanowi wykres wpływu PDTC na indukowane cytokinami tworzenie się ox-PUFA w ludzkich komórkach śródbłonka aorty. Jak to wskazano, zarówno TNF-α, jak i IL-1B powoduje utlenienie kwasu linolowego do kwasu oksylinolowego. PDTC wyraźnie zmniejsza utlenianie.
2.Modyfikacja syntezy i metabolizmu PUFA i ox-PUFA
Poprzez modyfikację przemiany PUFA do ox-PUFA można uzyskać hamowanie ekspresji VCAM-1. Na przykład, znanych jest wiele enzymów utleniających związki nienasycone, takich jakperoksydazy, lipoksygenazy, cyklooksygenazy lub cytochromP-450. Hamowanie tych enzymów może zapobiegać utlenianiu PUFA in vivo. PUFA mogą również ulegać utlenieniu przez zależne od metali substancje nieenzymatyczne.
IV Sposób modyfikacji ekspresji genu wrażliwego na reakcje redox
W alternatywnym wykonaniu zapewnia się sposób hamowania ekspresji genu wrażliwego na reakcje redox lub aktywacji genu hamowanego we wrażliwym na reakcje redox szlaku, polegający na podawaniu skutecznej ilości substancji zapobiegającej utlenianiu sygnału, a typowo, utlenianiu wielonienasyconego kwasu tłuszczowego. Przykładowe geny wrażliwe na reakcje redox, związane z prezentacją odpowiedzi immunologicznej, stanowią, lecz nie są do nich ograniczone, geny powodujące ekspresję cytokin biorących udział w inicjowaniu odpowiedzi immunologicznej (np. IL-1 β), chemiczne środki przyciągające, ułatwiające migrację komórek zapalnych do miejsca uszkodzenia (np. MCP-1), czynniki wzrostu (np. IL-6 i receptor trombiny) i cząsteczki adhezyjne (np. VCAM-1 i E-selektyna).
Uwzględniając powyższe, specjalista będzie mógł dokonać przesiewowego badania rozmaitych przeciwutleniaczy pod kątem ich zdolności do hamowania ekspresji genu wrażliwego na reakcje redox lub aktywacji genu hamowanego w szlaku wrażliwym na reakcje redox. Wszystkie takie wykonania są objęte zakresem niniejszego wynalazku.
Na podsatwie wyników takich badań przesiewowych można zidentyfikować cząsteczki kwasów nukleinowych zawierające 5'-końcowe sekwencje regulacyjne genów wrażliwych na reakcje redox, do regulacji lub hamowania ekspresji genów in vivo. Do ekspresji konkretnej rekombinacyjnej sekwencji genowej regionu bocznego 5' w komórkach można stosować wektory, włączając w to zarówno plazmidy, jak i eukariotyczne wektory wirusowe, w zależności od preferencji i oceny specjalisty (por. np. Sambrook i wsp., rozdział 16). Ponadto, trwają prace nad pewną liczbą wektorów wirusowych i niewirusowych, umożliwiających włączenie sekwencji
180 874 kwasów nukleinowych in vivo (por. np. Mulligan, 1993, Science, 260, 926-932; Patent Stanów Zjednoczonych nr 4 980 286; Patent Stanów Zjednoczonych nr 4 868 116, włączone do niniejszego opisu przez przywołanie). Ostatnio opracowano układ transportowy, w którym kwas nukleinowy zamyka się w liposomach kationowych, które można wstrzykiwać dożylnie do organizmu ssaka. Układ ten stosuje się do wprowadzania DNA do komórek różnych tkanek dorosłych myszy, w tym do śródbłonka i szpiku kostnego (por. np. Zhu i wsp., 1993 Science, 261, 209-211, włączone do niniejszego opisu przez przywołanie).
Sekwencje boczne 5' genu wrażliwego na reakcje redox można stosować w celu hamowania ekspresji genu wrażliwego na reakcje redox. Na przykład, antysensowny RNA całego lub części regionu bocznego 5' genu wrażliwego na reakcje redox można stosować do hamowania ekspresji genu in vivo. Są już znane ze stanu techniki wektory ekspresyjne (np. retrowirusowe wektory ekspresyjne), które można stosować do wytwarzania antysensownego RNA wybranej sekwencji DNA, ulegającej ekspresji w komórce (por. np. Patent Stanów Zjednoczonych nr 4 868 116, Patent Stanów Zjednoczonych nr 4 980 286).
Zgodnie z powyższym, możno dokonać wprowadzenia DNA zawierającego całość lub część sekwencji regionu bocznego 5' genu do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, tak że po przejściu do komórki w wyniku transkrypcji wprowadzonego DNA wytwarza się antysensowne RNA, komplementarne do produktu transkrypcji mRNA genu normalnie znajdującego się w komórce. Ten produkt transkrypcji antysensownego RNA wprowadzonego dNa może następnie dobrać się porami zasad z prawidłowym produktem transkrypcji mRNA znajdującym się w komórce i w ten sposób zapobiec translacji mRNA. Jest oczywiście niezbędne dobranie sekwencji regionu bocznego 5' w kierunku końca 3' od miej sc początku transkrypcji dla genu wrażliwego na reakcje redox dla zapewnienia, że antysensowne RNA zawiera sekwencje komplementarne obecne na mRNA. Antysensowne mRNA możno wytwarzać również in vitro, i następnie wprowadzać do komórek. Oligonukleotydy można wytwarzać w automatycznym urządzeniu do syntezy (np. automatyczne urządzenie do syntezy Model 8700 firmy Milligen-Biosearch, Burlington, MA, lub ABI, Model 380 B). Udowodniono również, że dezoksyoligonukleotydy antysensowne skutecznie hamują transkrypcję genu i replikację wirusową (por. np. Zamecnik i wsp., 1978, Proc. Notl. Acad. Sci USA 75, 280-284; Zamecnik i wsp., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 4143-4146; Wickstrom i wsp., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci USA 85,1028-1032; Crooke 1993 FASEB J. 7,533-539. Ponadto, w niedawnych badaniach wykazano, że możliwe jest ulepszenie hamowania ekspresji genu przez oligonukleotydy antysensowne, jeżeli oligonukleotydy antysensowne zawierają zmodyfikowane nukleotydy (por. np. Offensperger i wsp., 1993 EMBO J. 12,1257-1262 (hamowanie in vivo replikacji wirusa wiruoswego zapalenia wątroby typu B u kaczek i ekspresji jego genu przez antysensowne oligonukleotydy fosforotiolonowe); Rosenberg i wsp., PCT WO 93/01286 (wytwarzanie oligonukleotydów siarczanotiolowych); Agrawal i wsp., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083 (wytwarzanie antysensownych fosforoamidonów i fosforotiolanów oligonukleozydowych w celu hamowania replikacji ludzkiego wirusa braku odporności - 1); Sarin i wsp., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7794 (wytwarzanie antysensownych oligonukleotydów metylofosfonianowych); Shaw i wsp., 1991 Nucleic Acid Res. 19, 747-750 (wytwarzanie oligonukleotydów opornych na 3'-egzonukleozę, zawierających modyfikacje fosforoamidanu · 3'-końcowego); powyższe publikacje włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie.
Sekwencje regionu bocznego 5' genu wrażliwego na reakcje redox można stosować także w terapii potrójnej helisy (triplex). Udowodniono, że oligonukleotydy komplementarne do genowych sekwencji promotorowych na jednej z nici DNA wiążą się z promotorem i sekwencjami regulatorowymi, tworząc miejscowo potrójne helisy kwasu nukleinowego, blokujące transkrypcję genu (por. np. 1989 Maher i wsp., Science 245,725-730; Orson i wsp., 1991 Nucl. Acids Res. 19, 3435-3441; Postal i wsp., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8227-8231; Cooney i wsp., 1988 Science 241, 456-459; Young i wsp., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10023-10026; Dwal-Yolentin i wsp., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 504-508; 1992 Blume i wsp., Nucl. Acids Res. 20, 1777-1784; 1992 Grigoriev i wsp., J. Biol. Chem. 267, 3389-3395.
180 874
Ostatnio przedstawiano obliczenia teoretyczne i odkrycia empiryczne, ułatwiające zaprojektowanie oligonukleotydów do zastosowania w kierowanym oligonukleotydarni wytwarzaniu potrójnej helisy w celu hamowania ekspresji genu. Na przykład, oligonukleotydy powinny na ogół mieć długość powyżej 14 nukleotydów dla zapewnienia swoistości sekwencji docelowej (por. np. Maher i wsp., (1989); Grigoriev i wsp., (l992)). Ponadto, wiele komórek chciwie wychwytuje oligonukleotydy o długości poniżej 50 nukleotydów (por. np. Orson i wsp., (2991); Holt i wsp., 1988 Mol. Cell. Biol. 8,963-973; Wickstromiwsp., l988 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85,1028-1032). W celu zmniejszenia podatności na degradację wewnątrzkomórkową, np. przez 3'-egzonukleazy, do 3'-końcowej grupy hydroksylowej oligonukleotydów można wprowadzić wolną aminę, bez utraty swoistości wiązania sekwencji (Orson i wsp., 1991). Ponadto, stabilność tripleksów zwiększa się przy metylacji cytokin obecnych w oligonukleotydzie, jak również wtedy, gdy czynnik rozdzielający, jak np. pochodna akrydynowa, jest kowalencyjnie przyłączony do fosforanu 5'-końcowego (np. przez mostek pentametylenowy); znów, bez utraty swoistości wiązania sekwencji (Maher i wsp., (1989); Grigoriev i wsp., (1992).
Sposoby wytwarzania oligonukleotydów są dobrze znane specjalistom. Sposoby takie są rozmaite, od standardowego trawienia enzymatycznego i następnie izolowania fragmentu nukleotydu (por. Np. Sambrook i wsp., rozdziały 5 i 6) aż do sposobów czysto syntetycznych, np. poprzez metodę fosfoamidynu cyjanoetylowego z zastosowaniem urządzenia do syntezy DNA Milligen lub Beckman System iPlus (por. również Ikuta i wsp., Ann. Rev. Biochem., 2984 53, 323-356 (metoda fosfotrójestrowa i fosforynotrójestrowa); Narang i wsp., Methods Enzymol, 65,610-620 (1980) (metoda fosfotrój estrowa). W związku z powyższym, sekwencje DNA regionu bocznego 5' genu wrażliwego na reakcje redox, opisanego powyżej, można stosować do projektowania i wytwarzania oligonukleotydów zawierających sekwencje DNA utworzone w zasadzie z co najmniej 15 kolejnych nukleotydów·', z (lub bez) modyfikacji zasad, z (lub bez) rozdzielających pochodnych czynników, do zastosowania w wytwarzaniu potrójnych helis, szczególnie w regionie bocznym 5' genu wrażliwego na reakcje redox w celu hamowania ekspresji tego genu.
W niektórych przypadkach może być korzystne wprowadzenie do układu ekspresyjnego czynników wzmacniających lub wielokrotnych kopii sekwencji regulatorowych w celu ułatwienia przesiewowego badania sposobów i odczynników służących do manipulacji ekspresją.
V Modele i sposoby badania przesiewowego
Zapewnia się również sposoby badań przesiewowych do wykrywania zaburzeń, których mediatorem jest VCAM-1, lub gen wrażliwy na reakcje redox, polegające na ilościowym oznaczeniu zastępczych markerów choroby.
W jednym z wykonań ocenia się poziom utlenionego wielonienasyconego kwasu tłuszczowego lub innych odpowiednich markerów, w tkance lub we krwi, na przykład, gospodarza, jako środek oceny “środowiska oksydacyjnego” gospodarza i wrażliwości gospodarza na choroby, których mediatorem jest gen wrażliwy na reakcje redox lub VCAM-1.
W jeszcze innym wykonaniu ocenia się uwrażliwienie komórek śródbłonka naczyniowego gospodarza na wielonienasycone kwasy tłuszczowe lub ich utlenione odpowiedniki. Można to osiągnąć np. wystawiając gospodarza na działanie PUFA lub ox-PUFA i porównując otrzymane stężenie VCAM-1 na powierzchni komórki lub krążącego, lub innego markera zastępczego z normą populacyjną. W jeszcze innym wykonaniu zapewnia się modele in vivo miażdżycy lub innych chorób serca lub chorób zapalnych, których mediatoremjest VCAM-1, poprzez podawanie zwierzętom-gospodarzom nadmiernej ilości PUFA lub utlenionego wielonienasyconego kwasu tłuszczowego dla wywołania choroby. Zwierzęta te można stosować w badaniach klinicznych dla dalszego dokładniejszego poznania tych zaburzeń.
W jeszcze innym wykonaniu wynalazku związki ocenia się ze względu na ich zdolność do leczenia zaburzeń, których mediatorem jest V CAM-1, na podstawie ich zdolności do hamowania utleniania wielonienasyconego kwasu tłuszczowego, lub interakcji PUFA lub ox-PUFA z białkiem docelowym.
180 874
Można to osiągnąć poprzez narażenie gospodarza, na przykład człowieka lub zwierzęcia, np. myszy, na wysoki poziom PUFA lub ox-PUFA i następnie ocenę terapeutycznej skuteczności związku badanego w oparciu o jego zdolność do zmniejszania stężenia VCAM-1 krążących lub osadzonych na powierzchni komórek. Zamiast tego można stosować badanie przesiewowe in vitro, oparte na zdolności związku badanego do zapobiegania utlenianiu PUFA lub interakcji PUFA lub ox-PUFA z białkiem docelowym w obecności substancji utleniającej, takiej jak metal, np. miedź, lub enzymu, takiego jak peroksydaza, lipoksygenaza, cyklooksygenaza lub cytochrom P-450.
W innym wykonaniu, komórki śródbłonka naczyniowego wystawia się na działanie TNF-α lub innego materiału indukującego VCAM-1 przez odpowiedni czas, a następnie uszkadza się je odpowiednimi środkami, np. poprzez sonikację lub zamrażanie-rozmrażanie. Izoluje się przedziały cytozolowe i błonowe. Wyznakowane radioaktywnie PUFA dodaje się do określonych ilości przedziałów. Bada się zdolność płynu do przemiany PUFA w ox-PUFA w obecności lub w nieobecności związku badanego. Zamiast układu komórek uszkodzonych można stosować komórki nienaruszone.
III. Preparaty farmaceutyczne
Możliwe jest leczenie ludzi, koni, psów, bydła i innych zwierząt, w szczególności ssaków, cierpiących na choroby sercowo-naczyniowe, i inne choroby zapalne, których mediatorem jest VCAM-1 lub gen wrażliwy na reakcje redox, poprzez podawanie pacjentowi związku powodującego usunięcie, zmniejszenie stężenia lub zapobieganie wytwarzania się utlenionych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, takich jak np. (lecz nie ograniczonych do nich) utleniony kwas linolowy (C18 A9'2), linolenowy (C18 Α69Ί2), arachidonowy (C20 A5^>11J4) i eikozatrienowy (C20 A8,11’14); innych sygnałów oksydacyjnych; lub innego związku czynnego, lub ich farmaceutycznie dopuszczalnej pochodnej lub soli w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku lub rozpuszczalniku. Substancje czynne można podawać dowolną korzystną drogą, np. doustnie, pozajelitowo, dożylnie, śródskórnie, podskórnie lub miejscowo.
W rozumieniu niniejszego opisu, termin “farmaceutycznie dopuszczalne sole lub kompleksy” oznacza sole lub kompleksy zachowujące korzystną aktywność biologiczną wyżej wymienionych związków i wykazujące minimalne niepożądane działania toksyczne. Nieograniczające przykłady takich soli stanowią: (a) kwasowe sole addycyjne, wytworzone z kwasów nieorganicznych (np. kwas solny, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, kwas fosforowy, kwas azotowy, itp.), i sole wytworzone z kwasów organicznych takichjak kwas octowy, kwas szczawiowy, kwas winowy, kwas bursztynowy, kwas jabłkowy, kwas askorbinowy, kwas benzoesowy, kwas garbnikowy, kwas pamoinowy, kwas alginowy, kwas poliglutaminowy, kwas naftalenosulfonowy, kwas naftalenodwusulfonowy, lub kwas poligalakturonowy; (b) zasadowe sole addycyjne, wytworzone z wielowartościowego kationu metalu takiego, jak cynk, wapń, bizmut, bar, magnez, glin, miedź, kobalt, nikiel, kadm, sód, potas itp., lub z kationu organicznego, wytworzonego z N,N-dwubenzyloetylenodwuaminy, D-glukozaminy, amoniaku, tetraetyloamoniaku, lub etylenodwuaminy lub (c) kombinacje (a) i (b), np. taninian cynku itp.
Związek czynny lub mieszaninę związków podaje się w dowolny odpowiedni sposób, na przykład, lecz bez ograniczenia do tych sposobów, doustnie i dożylnie. Ogólny zakres dawkowania w wymienionych powyżej zaburzeniach będzie wynosił od 0,5 do 500 mg/kg masy ciała, podawanych z częstością od jeden raz na dwa dni do kilku razy dziennie. Korzystne są dawki dzienne od około 1 do 3000 mg/pacjenta/dzień, bardziej korzystne, od około 5 do 500 mg/pacjenta/dzień, i najkorzystniejsze, od około 25 do 500 mg/pacjenta/dzień.
Składnik czynny należy podawać w taki sposób, aby uzyskiwać szczytowe stężenie związku czynnego w osoczu wynoszące około 0,1 -100 μM, korzystnie, około 1-10 μM. Można to osiągnąć np. poprzez wstrzyknięcie dożylnie roztworu lub preparatu składnika czynnego, ewentualnie w soli fizjologicznej, lub w środowisku wodny, lub poprzez podanie bolusu składnika czynnego.
180 874
Związki podawać można również bezpośrednio do ściany naczyniowej, stosując cewniki perfuzyjne z balonikiem, po lub zamiast angioplastyki naczyń wieńcowych lub innych naczyń tętniczych. Na przykład, podaje się 2-5 ml fizjologicznie dopuszczalnego roztworu zawierającego około 1-500 pM związku lub mieszaniny związków, pod ciśnieniem 1-5 atmosfer. Następnie, w ciągu następnych sześciu miesięcy, w okresie największego ryzyka restenozy, związki czynne podaje się odpowiednimi drogami w odpowiednim schemacie dawkowania.
W celu spowodowania “obkurczania się” zmian chorobowych tętnic wieńcowych, których nie można leczyć angioplastykąani zabiegiem operacyjnym, stosuje się względnie krótkotrwałe leczenie związkiem czynnym. Nieograniczający przykład krótkotrwałego leczenia stanowi podawanie związku przez okres od dwóch do sześciu miesięcy w dawce od 0,5 do 500 mg/kg masy ciała, z częstością od raz na dwa dni do trzy razy dziennie.
W celu zapobiegania rozwojowi zmian zaawansowanych u pacjentów wysokiego ryzyka można stosować leczenie długoterminowe. Leczenie długoterminowe może trwać wiele lat, w dawkach od 0,5 do 500 mg/kg masy ciała, z częstościąod raz na dwa dni do trzy razy dziennie.
Związki czynne można również podawać w okresach bezpośrednio przed i po angioplastyce naczyń wieńcowych w celu zmniejszenia lub wyeliminowania nieprawidłowej odpowiedzi proliferacyjnej i zapalnej, która obecnie prowadzi do istotnej klinicznie restenozy.
Związki czynne można podawać wraz z innymi lekami stosowanymi w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych, włączając w to środki obniżające poziom lipidów, takie jak probucol i kwas nikotynowy; środki hamujące agregację płytek krwi, takie jak aspiryna; środki przeciwzakrzepowe, jak kumaryna; blokery kanału wapniowego, jak werapamil, diltiazem i nifedypina; inhibitory enzymu konwertazy angiotensyny (ACE), jak kaptopryl i enalapryl i β-blokery, jak propranolol, terbutalol i labetalol. Związki można również podawać wraz z niesterydowymi lekami przeciwzapalnymi, jak ibuprofen, indometacyna, fenoprofen, kwas mefenamowy, kwas flufenamowy, sulindak. Związek można również podawać wraz z kortykosteroidami.
Stężenie związku czynnego w preparacie będzie zależeć od stopnia wchłaniania, dystrybucji, inaktywacji i wydalania leku, jak również od innych czynników znanych specjalistom. Należy zaznaczyć, że dawkowanie będzie również zależało od ciężkości schorzenia. Należy rozumieć, że sposób dawkowania należy dobierać odpowiednio dla danego pacjenta w danym okresie, w zależności od indywidualnego zapotrzebowania i profesjonalnej oceny osoby podającej lub nadzorującej podawanie preparatów, oraz że zakres stężenia, podany w niniejszym opisie, majedynie charakter przykładowy i nie ogranicza zakresu niniejszego wynalazku. Składnik czynny można stosować w jednej dawce lub w dawkach podzielonych, podawanych w różnych odstępach czasowych. Preparaty doustne zawierać będą zwykle obojętny rozcieńczalnik lub jadalny nośnik. Mogą one być zamknięte w kapsułkach żelatynowych lub prasowane w tabletki. Związek czynny przeznaczony do leczniczego podawania doustnego można łączyć z zarobkami i stosować w postaci tabletek, kołaczyków lub kapsułek. W skład preparatu mogą także wchodzić farmaceutycznie odpowiednie środki wiążące, i/lub substancje dodatkowe.
Tabletki, pigułki, kapsułki, kołaczyki itp. mogą zawierać dowolny z następujących składników, lub związków o podobnej naturze: środek wiążący, jak celuloza mikrokrystaliczna, tragakanta lub żelatyna; zaróbka, jak skrobia lub laktoza, środek rozsadzający, jak kwas alginowy, Primogel lub skrobia kukurydziana; środek zwilżający, jak stearynian magnezowy lub Sterotes; środek poślizgowy, jak koloidalny dwutlenek krzemu; środek słodzący, jak sacharoza lub sacharyna; środek smakowy, jak mięta pieprzowa, salicylan metylowy, lub aromat pomarańczowy. W przypadku kapsułek, mogą one zawierać, oprócz substancji omówionych powyżej, ciekły nośnik, np. olej. Ponadto, poszczególne rodzaje preparatów mogą zawierać rozmaite inne substancje, modyfikujące fizyczną postać preparatu, np. powłoki cukrowe, szelakowe lub inne powłoki dojelitowe.
Związek czynny lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sol lub pochodną można podawać jako składnik eliksiru, zawiesiny, syropu, opłatka, gumy do żucia itp. Syrop może oprócz związków czynnych zawierać sacharozę, jako środek słodzący, i niektóre środki konserwujące, barwniki i środki smakowe.
180 874
Związek czynny lub jego farmaceutycznie dopuszczalne pochodne lub sole można również podawać z innymi substancjami czynnymi, nie zaburzającymi korzystnego działania, lub z substancjami uzupełniającymi korzystne działanie, takimi jak antybiotyki, środki przeciwgrzybicze, przeciwzapalne, lub przeciwwirusowe.
Roztwory lub zawiesiny do stosowania pozajelitowego, śródskómego, podskórnego lub miejscowego mogą zawierać następujące składniki: jałowy rozcieńczalnik, jak woda do wstrzyknięć, roztwór soli fizjologicznej, oleje roślinne, glikole polietylenowe, gliceryna, glikol propylenowy lub inne rozpuszczalniki syntetyczne; środki przeciwbakteryjne, jak alkohol benzylowy lub metyloparabeny; przeciwutleniacze, jak kwas askorbinowy lub bisiarczyn sodowy; środki chelatujące, takie jak kwas etylenodwuaminoczterooctowy; bufory, jak octany, cytryniany lub fosforany i środki izotonizujące, jak chlorek sodowy lub dekstroza. Preparat do podawania doustnego można wytwarzać w postaci ampułek, strzykawekj ednorazowych lub szklanych lub plastikowych fiolek wielodawkowych.
Znane są odpowiednie nośniki do zastosowań miejscowych, należą do nich płyny do zmywania (lotio), zawiesiny, maści, kremy, żele, nalewki, aerozole, pudry, pasty, plastry przezskóme o przedłużonym uwalnianiu, aerozole dooskrzelowe, i czopki do stosowania doodbytniczego, dopochwowego i na śluzówkę nosa lub jamy ustnej.
Do wytwarzania preparatów do podawania miejscowego można stosować środki zagęszczające, zmiękczające i stabilizujące. Przykłady środków zagęszczających stanowią wazelina, wosk pszczeli, żywica ksantanowa i glikol polietylenowy, środki pochłaniające wilgoć, jak sorbit, środki zmiękczające, jak oleje mineralne, lanolina i jej pochodne, lub skwalen. W handlu dostępne są liczne roztwory i maści.
W celu poprawienia smaku preparatów miejscowych do podawania na śluzówki można stosować naturalne lub syntetyczne środki smakowe lub słodzące. Można dodawać obojętne barwniki, w szczególności w przypadku preparatów przeznaczonych do stosowania na powierzchnię śluzówki jamy ustnej.
Związki czynne można łączyć z nośnikami, chroniącymi związek przed szybkim uwalnianiem się, np. w postaci preparatów o przedłużonym uwalnianiu, włączając w to wszczepy i mikrokapsułkowe układy uwalniania. Można stosować odpowiednie biologicznie i ulegające degradacji biologicznej polimery, takie jak octan etylenowo-winylowy, wielobezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry, i kwas polimlekowy. Opatentowano wiele sposobów wytwarzania takich preparatów, które są ogólnie znane specjalistom.
Przy podawaniu dożylnym, korzystne nośniki stanowią sól fizjologiczna lub sól fizjologiczna zbuforowana fosforanem (PBS).
Związek czynny można również podawać w plastrze przezskómym. Sposoby wytwarzania plastrów przezskómych sąznane specjalistom, Por, np. Brown, L. i Langer, R., “Transdermal Delivery ofDrugs, Annual Review ofMedicine, 39:221-229 (1988), które włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie.
W innym wykonaniu, składniki czynne łączy się z nośnikami zabezpieczającymi związek przed szybkim usunięciem z organizmu, w postaci np. preparatów o przedłużonym uwalnianiu, włączając w to wszczepy i mikrokapsułkowe układy uwalniania. Można stosować odpowiednie biologicznie i ulegające degradacji biologicznej polimery, takie jak octan etylenowo-winylowy, wielobezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry, i kwas polimlekowy.
Sposoby wytwarzania takich preparatów są oczywiste dla specjalistów. Materiały można również nabyć w Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc.
Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki mogą również stanowić zawiesiny liposomalne. Można je wytwarzać sposobami znanymi specjalistom, opisanymi np. w Patencie Stanów Zjednoczonych Nr 4 522 811 (który włącza się w całości do niniejszego opisu przez przywołanie). Na przykład, preparaty liposomowe można wytwarzać, rozpuszczając odpowiedni lipid (lipidy) (takie jak stearoilofosfatydyloetanolamina, stearoilofosfatydylocholina, arachidoilofosfatydylocholina i cholesterol) w rozpuszczalniku nieorganicznym, który następnie odparowuje się, pozostawiając cienką warstwę wysuszonego lipidu na powierzchni naczynia. Następnie do na180 874 czynią wprowadza się wodny roztwór związku czynnego lub jego pochodnej monofosforanowej, dwufosforanowej i/lub trój fosforanowej. Naczynie wiruje się następnie ręcznie dla uwolnienia substancji lipidowych z boków naczynia i dla rozproszenia płynnych agregatów, wytwarzając w ten sposób zawiesinę lipytymalną.
Dla specjalisty oczywiste będą modyfikacje i odmiany niniejszego wynalazku, wynikające z powyższego szczegółowego opisu. Takie modyfikacje i odmiany są objęte zakresem niniejszego wynalazku.
180 874
WPŁYW KWASU LINOLOWEGO I 13-HPODE NA KINETYKĘ EKSPRESJI GENU VCAM-1
ιΰ Godziny •o ω <u
Fig.i
180 874
Wpływ kwasu linolowego i 13-HPODE (zależność odpowiedzi nd dawki) na ekspresję genu VCAM-1
Fig. 2
180 874
Ekspresja na powierzchni komórki (O.D. 450nm)
a.i
Fig·. 3
180 874
VCAM-1
i.
A
2X2dH-S:
aaoaH-ετ
AAOuopTtpęju σ’ —<
&
Am.otouti;
SPMH
HąojąuoH
P4 o
(ΌΌ) -pfjęuio^ TuąozjojMod eu eCs9.ićIs}{3
180 874
Fig. 5
180 874
A. A. + CHX
A.A.
LA.
L.A. +CHX
CHX
CON
A. A. + CHX
A.A.
L.A.
L.A. + CHX
CHX
CON
A.A
L.A.
+ CHX
A.A.
L.A. + CHX
CHX
CON
A.A. 4- CHX
A.A.
L.A. L.A. +CHX
CHX
CON ig . 6
180 874 p85VCAMCAT p288VCAMCAT pSV,CAT
CON.
L.A.
‘ KONTROLA = KWAS LINOLOWY
CON L.A. TNF L.A. CON L.A. TNF L.A. ♦ » potc porc p85VCAMCAT p288VCAMCAT
CON L.A. TNF L.A.
♦
POIĆ pSV,CAT
CON L.A. TNF L.A.
*
POTC
CON L.A TNF L.A ♦
PDTC
CON L.A TNF L.A
PDTC
Fig .7
180 874
KWAS LINOLOWY (7.5 flM) Li KWAS LINOLOWY (7.5 jiM)
180 874
□xaa+3i3dH-si
OMd + Amou -opygosje nnffl-si
Amou
-opygoucre
SPAJJ epojąuo}!
0.80 η (mu ££S CTO)
S8Y81L o^ouMZyąe eupSybzM
Fig. 9a wartość różna (p<f0,05) od kontroli wartość różna (p<0,05) od wartości dla odpowiedniego kwasu tłuszczowego bez obróbki PDTC * =«=
180 874
3iad+3X3<IH-SI □X<M+
3X3dH-SI
Amou
-opTąoBj:^
SGM}J oro (nrozęs ’QO) o tn Φ S O N O N ω β rM +>
W to 5 14
O tn <U •H β
Ό
Φ •H
Awouop o
-Tąoeje sbmm 3 ra rd
SUY91 osourt/ąą-e eupSpbzM pjojcąuo^
•rl •H
i—4 o
o xn
μ O
+j -P
β
0 β
14
Ό Ό
0 0
in in
o o
..
o o
V V
cu CU
—' —'
β β
β β
•N •N
Ό Ό
O 0
Ό Ό
xo ΧΛ
O O
+J +J
O P
β β
I & I
1 * 1 =tt=
Λ
ΟΊ •
σ»
N obróbki PDTC
180 874
CZAS (GODZINY) 0 2 4 8 24
PDTC - - + - +· — -4- — +
IL-1 β - 4- * «► 4- 4- 4- $> +
28S-
Fig- 10a to MS'
18$ -
1 2 3 4 5 6 7 p 8 9
CZAS (GODZINY) 0 2 4 8 24
PDTC - - + — 4- ee Φ ” +
IL- IB «“ + 4· + 4»
VCAM“1
Fig.lOb
28S
Λ a*.
E
18S
CZAS (GODZINY)
Fig- .10c
PDTS
IL-1J9
28$·
2345678 9
2 4 8 24
-» ψ> - + - 4·
4» + + 4· + 4· 4- 4·
ICAM-1
18S
23456789
POTC (μΜ) O O 0.050.5 5 50 100
Fig.lla
VCAM~1
3 4 5 6 7
180 874
POTClpM) o O O.O5O.5 5 50 100 IL-1£ + + 7- +- +
28SH
Figr. . llb
18S
E- SELEKTYNA
2 3 4 5 6 7
PDTC (μΜ) O O 0.0005 5 50 100 -+ + + + + +
28SFig- .lic
18SICAM - 1
2 3 4 5 6 7
TNF LPS PIC
TNF LPS PIC PDTC „ * _ + _ +
TNF LPS PIC
28S
18S -4
Fig-.12c
ICAM- 1
180 874
Względna Względna akumulacja ICAM-1 akumulacja VCAM-
<$. $ U.
«J ω u. t ΐ
{— ο» t z
O □ j H 0,
Fig·. 13
180 874
Względna ekspresja VCAM-1 na powierzchni komórki
0.4
0.3-
Fig-. 14
180 874 % wiązanie MOLT-4 Względna ekspresja VCAM-
ω
5 Σ
□ 3 3
o o O
o o o
in in m
Fig. 15
CTL TNF POTC TNP * POTC
Fig. 16
180 874
Fig· -17 S c-SNa
Sól sodowa karboditiolanu N-pirolidynowego
CH3-N-CS,Na
I
CHjCOOH
N-metylo-N-karboksymetylo-Nkarboditiolan sodowy (zwany też sarkozynodwutiokarbaminianem sodowym)
NaOOCCH-j-N-CSjNa
CH2COONa
Ν,Ν-dwu(karboksymetylo)-N-karboditiolan trójsodowy (zwany też solą trój sodową ditiokarbaminianu kwasu.iminodwuoctowego)
Mo—N (CHCHl4Oyn
ĆSjNo
N-metylo-D-glukamino-N-karboditiolan sodowy
CH.CHj-N- CS,Na
I
CHjCHj
N-(4-metoksybenzylo)-D-glukamino-N-karboditiolan sodowy
N,N-dwuetylo-N-karboditiolan sodowy (zwany też dwuetyloditio karbaminianem sodowym) (CH3)2CH-N-CS2Na
CHICHĄ
N,N-dwuizopropylo-N-karboditiolan sodowy (zwany też dwuizopropylodwukarbaminianem sodowym)
180 874
33 •H C3 Ό CO N a) N SH CU o EH a CU
U >H -H
u
•-3 xn
>H 0 Ή
U £ £
>1 0
Q (U O
O Λ CO
< 0 n I
5 ? 1 o
O ri! m
W n
N ω
O ca 3
H -H
5 •H £
N ε <D
as N
33 ε T3
U 3 3
>H SH Λ
s Cn N
0 Z
>1 M
u 34 >)
Z •H N
w ε Sh
υ CU
cn o
w o ε
03 CM £
O o N O
i-3 co
0-t 0 sr
£ 1
W (0 o
H & n
W 0 'S'
W Λ £ S
H 34
Z £ 0
< •Γ-ί 3
03 0
03 w N
< o SH
£ o CD
Eh CU •H
>H 33 ε
£ 1
cn oz
f—ł •i—1
Z U
r4 £
U 0 Φ
Eh ε O
Q o ta
CU £ <D
34 Ch
S •H O
>H ε 3
p3 Γ—ł
CU 1“ł
S
irDNaosaHoma iaisoNaar
W o
S
O w
H s
u
H
Q
CU
Fig.18
180 874
Wpływ PDTC na wytwarzanie się fluorescencyjnych związków addycyjnych z BSA i LOOH
U
U U
Q
Q & Q
& § &
S 3 S
3 3
ei
ŚN eó •
© © © ©
© © © ©
w CS ?<
iroNaosanomj iaisoNaar
390 405 42© 435 45© 465 48© 495
180 874
WPŁYW PDTC NA UTLENIANIE LDL PRZEZ HRP
Czas (minuty)
GO M ISOHZM
180 874
Fig.21
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (1)

  1. Zastrzeżenie patentowe
    Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby, której mediatorem jest VCAM-1 zawierającej znany nośnik i/lub substancję pomocniczą oraz substancję czynną, znamienny tym, że (i) oznacza się czy substancja ta hamuje utlenianie wielonienasyconego kwasu tłuszczowego, a następnie ocenia się stopień utleniania wielonienasyconego kwasu tłuszczowego, a następnie (ii) łączy się substancję czynną, która hamuje utlenianie wielonienasyconego kwasu tłuszczowego w etapie (i) z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i/lub substancjąpomocmczą do podawania doustnego, pozajelitowego, podskórnego, doskórnego lub miejscowego, przy czym substancja czynna, która zapobiega lub minimalizuje utlenianie wielonienasyconego kwasu tłuszczowego jest zawarta w ilości 0,5-500 mg/kg ciężaru ciała.
    * * *
PL95317193A 1994-05-10 1995-05-10 Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby, której mediatorem jest VCAM-1 PL180874B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US24085894A 1994-05-10 1994-05-10
US08/317,399 US5807884A (en) 1992-10-30 1994-10-04 Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
PCT/US1995/005880 WO1995030415A1 (en) 1994-05-10 1995-05-10 Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL317193A1 PL317193A1 (en) 1997-03-17
PL180874B1 true PL180874B1 (pl) 2001-04-30

Family

ID=26933783

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL95317193A PL180874B1 (pl) 1994-05-10 1995-05-10 Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby, której mediatorem jest VCAM-1
PL95342067A PL184466B1 (pl) 1994-05-10 1995-05-10 Zastosowanie estru ditiokarbaminianowego

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL95342067A PL184466B1 (pl) 1994-05-10 1995-05-10 Zastosowanie estru ditiokarbaminianowego

Country Status (17)

Country Link
US (6) US5807884A (pl)
EP (1) EP0759752A4 (pl)
JP (1) JP3120091B2 (pl)
KR (1) KR100394157B1 (pl)
CN (1) CN1152869A (pl)
BG (1) BG101030A (pl)
BR (1) BR9507716A (pl)
CA (1) CA2189336A1 (pl)
CZ (1) CZ330896A3 (pl)
GE (1) GEP20012409B (pl)
HU (1) HUT76728A (pl)
MX (1) MX9605450A (pl)
NO (1) NO964742D0 (pl)
NZ (1) NZ287214A (pl)
PL (2) PL180874B1 (pl)
SK (1) SK136496A3 (pl)
WO (1) WO1995030415A1 (pl)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5380747A (en) * 1992-10-30 1995-01-10 Emory University Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
US5807884A (en) * 1992-10-30 1998-09-15 Emory University Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
US5821260A (en) * 1992-10-30 1998-10-13 Emory University Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
AUPM906594A0 (en) * 1994-10-26 1994-11-17 Peptide Technology Limited Synthetic polyunsaturated fatty acid analogues
US5571523A (en) * 1995-03-09 1996-11-05 President And Fellows Of Harvard College Antioxidant-induced apoptosis in vascular smooth muscle cells
US5741815A (en) * 1995-06-02 1998-04-21 Lai; Ching-San Methods for in vivo reduction of nitric oxide levels and compositions useful therefor
US5792787A (en) * 1995-06-07 1998-08-11 Emory University Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
KR19990071477A (ko) * 1996-09-20 1999-09-27 아테로제닉스, 인코포레이티드 염증성질환의진단방법및매개체
AU731937B2 (en) * 1996-12-10 2001-04-05 Hadasit Medical Research Services & Development Company Ltd Serum-derived factor inducing cell differentiation and medical uses thereof
GB2321455A (en) * 1997-01-24 1998-07-29 Norsk Hydro As Lipophilic derivatives of biologically active compounds
US6852878B2 (en) 1998-05-14 2005-02-08 Atherogenics, Inc. Thioketals and thioethers for inhibiting the expression of VCAM-1
CN1275596C (zh) * 1997-05-14 2006-09-20 阿特罗吉尼克斯公司 普罗布考单酯在制备用于治疗心血管疾病和炎性疾病的药物中的应用
US6670398B2 (en) * 1997-05-14 2003-12-30 Atherogenics, Inc. Compounds and methods for treating transplant rejection
EP1695959A1 (en) * 1997-05-14 2006-08-30 Atherogenics, Inc. Compouds and methods for the inhibition of the expression of VCAM-1
WO1999001118A2 (en) * 1997-07-01 1999-01-14 Atherogenics, Inc. Antioxidant enhancement of therapy for hyperproliferative conditions
US7067117B1 (en) 1997-09-11 2006-06-27 Cambridge University Technical Services, Ltd. Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response
US6989435B2 (en) 1997-09-11 2006-01-24 Cambridge University Technical Services Ltd. Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
IL122892A0 (en) * 1998-01-11 1998-08-16 Yeda Res & Dev Pharmaceutical compositions comprising a thiocarbamate
IL122891A0 (en) 1998-01-11 1998-08-16 Yeda Res & Dev Pharmaceutical compositions comprising a thiocarbamate
ES2251204T3 (es) * 1998-07-06 2006-04-16 Mgi Gp, Inc. Inhibidores de naaladasa utiles como compuestos y composiciones farmaceuticas.
CA2658200A1 (en) * 1998-07-06 2000-01-13 Mgi Gp, Inc. Naaladase inhibitors useful as pharmaceutical compounds and compositions
US6548540B2 (en) * 1998-09-08 2003-04-15 Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority Method of treating cancer using dithiocarbamate derivatives
US6706759B1 (en) 1998-09-08 2004-03-16 Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority Method of treating cancer using dithiocarbamate derivatives
US6589987B2 (en) 1998-09-08 2003-07-08 Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority Method of treating cancer using tetraethyl thiuram disulfide
US7816403B2 (en) 1998-09-08 2010-10-19 University Of Utah Research Foundation Method of inhibiting ATF/CREB and cancer cell growth and pharmaceutical compositions for same
US20050197283A1 (en) * 1998-10-04 2005-09-08 Vascular Biogenics Ltd. Compositions containing beta 2-glycoprotein I for the prevention and/or treatment of vascular disease
IL126447A (en) * 1998-10-04 2004-09-27 Vascular Biogenics Ltd An immune preparation that confers tolerance in oral administration and its use in the prevention and / or treatment of atherosclerosis
US6887712B1 (en) 1998-11-09 2005-05-03 Atherogenics, Inc. Methods and compositions to lower plasma cholesterol levels
US6372187B1 (en) 1998-12-07 2002-04-16 Mcdermott Technology, Inc. Alkaline sorbent injection for mercury control
US7238711B1 (en) 1999-03-17 2007-07-03 Cambridge University Technical Services Ltd. Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response
AU2985100A (en) 1999-02-08 2000-08-25 Checkpoint Genetics, Inc. (n)-substituted amino acids, antioxidant pharmaceutical compositions containing same and methods using same
US6855859B2 (en) * 1999-03-31 2005-02-15 The Babcock & Wilcox Company Method for controlling elemental mercury emissions
US6284199B1 (en) * 1999-03-31 2001-09-04 Mcdermott Technology, Inc. Apparatus for control of mercury
US6734192B1 (en) * 1999-08-23 2004-05-11 Mp-1 Inc. Treatment of viral infections
US6710086B1 (en) * 2000-02-25 2004-03-23 Medinox, Inc. Protected forms of pharmacologically active agents and uses therefor
EP1282445A2 (en) * 2000-03-21 2003-02-12 Atherogenics, Inc. N-substituted dithiocarbamates for the treatment of biological disorders
US6881860B2 (en) 2000-04-11 2005-04-19 Atherogenics, Inc. Compounds and methods to increase plasma HDL cholesterol levels and improve HDL functionality
JP2003531149A (ja) 2000-04-13 2003-10-21 ザ・ロツクフエラー・ユニバーシテイ 抗体由来の免疫応答の増強
CA2424246A1 (en) * 2000-10-02 2002-04-11 Shianlen Cahoon Methods and compositions for the treatment of inflammatory diseases
WO2002040021A2 (en) 2000-11-17 2002-05-23 Idenix (Cayman) Limited Methods for inhibiting the transmission of hiv using topically applied substituted 6-benzyl-4-oxopyrimidines
WO2002041827A2 (en) 2000-11-24 2002-05-30 Vascular Biogenics Ltd. Methods employing and compositions containing defined oxidized phospholipids for prevention and treatment of atherosclerosis
NO20006008L (no) * 2000-11-28 2002-05-29 Thia Medica As Fettsyreanaloger for behandling av inflammatoriske og autoimmune sykdommer
PL366250A1 (pl) * 2000-12-29 2005-01-24 Reddy Us Therapeutics, Inc. Sposoby i kompozycje do wykrywania związków modulujących odpowiedzi zapalne
WO2002062207A2 (en) 2001-01-02 2002-08-15 The Cleveland Clinic Foundation Myeloperoxidase, a risk indicator for cardiovascular disease
US6596708B1 (en) 2001-09-07 2003-07-22 Advanced Medical Instruments Composition for the treatment and prevention of endothelial dysfunction
US20050129680A1 (en) * 2001-09-17 2005-06-16 Paul Wentworth Antimicrobial activity of antibodies
US20040157280A1 (en) * 2001-09-17 2004-08-12 Paul Wentworth Antibody mediated ozone generation
US20040116350A1 (en) * 2001-09-17 2004-06-17 Paul Wentworth Jr Methods and compositions relating to hydrogen peroxide and superoxide production by antibodies
IL162533A0 (en) 2001-12-19 2005-11-20 Atherogenics Inc Chalcone derivatives and their use to treat diseases
US20030147958A1 (en) * 2002-01-29 2003-08-07 Cheol-Hee Ahn Biodegradable multi-block copolymers of poly(amino acid)s and poly(ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents
AU2003288058A1 (en) * 2002-11-14 2004-06-03 Novartis Ag Antibody- or neutrophil-mediated ozone generation
US8017651B2 (en) * 2002-11-22 2011-09-13 Bionexus, Ltd. Compositions and methods for the treatment of HIV-associated fat maldistribution and hyperlipidemia
WO2004056727A2 (en) * 2002-12-19 2004-07-08 Atherogenics, Inc. Process of making chalcone derivatives
WO2004104022A2 (en) * 2003-05-16 2004-12-02 The General Hospital Corporation Compositions comprising pathogen elicited epithelial chemoattractant (eicosanoid hepoxilin a3), inhibitors thereof and methods of use thereof
US7173129B2 (en) * 2003-06-06 2007-02-06 Athero Genics, Inc. Sulfonamide-substituted chalcone derivatives and their use to treat diseases
US20060025481A1 (en) * 2004-02-09 2006-02-02 Strange Matthew L Process for preparation of probucol derivatives and polymorphic forms thereof
US7294736B2 (en) * 2004-04-09 2007-11-13 Cambrex Charles City, Inc. Process for preparation of probucol derivatives
WO2005112914A2 (en) 2004-04-20 2005-12-01 Atherogenics, Inc. Phenolic antioxidants for the treatment of disorders including arthritis, asthma and coronary artery disease
US20060063828A1 (en) * 2004-06-28 2006-03-23 Weingarten M D 1,2-Bis-(substituted-phenyl)-2-propen-1-ones and pharmaceutical compositions thereof
EP1812793A4 (en) * 2004-11-15 2008-04-16 Quantomix Ltd DEVICE AND METHOD FOR ANALYZING A METAL CHANGING
US7345191B2 (en) * 2005-02-26 2008-03-18 Cambrex Charles City, Inc. Process for preparation of probucol derivatives
US8071545B2 (en) * 2005-03-15 2011-12-06 Lewis S. Coleman, Md, Inc. Therapies and compositions for controlling the stress mechanism and for stabilizing hemostasis in an organism
US7767710B2 (en) 2005-05-25 2010-08-03 Calosyn Pharma, Inc. Method for treating osteoarthritis
US20060269579A1 (en) * 2005-05-25 2006-11-30 Musculoskeletal Research Llc Compositions for treating osteoarthritis
KR100823533B1 (ko) 2007-02-27 2008-04-30 바이오스펙트럼 주식회사 알파 비사볼올을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용조성물
EP2139320A4 (en) * 2007-03-26 2010-09-08 Salutria Pharmaceuticals Llc METHODS AND COMPOSITIONS OF PROBUCOL DERIVATIVES FOR THE TREATMENT OF DIABETES
WO2008118946A1 (en) * 2007-03-27 2008-10-02 Atherogenics, Inc. Methods and compositions using certain phenolic derivatives for the treatment of diabetes
US20090163440A1 (en) * 2007-09-26 2009-06-25 Waddell David D Ion-Channel Regulator Compositions and Methods of Using Same
EP2381940A4 (en) * 2008-11-26 2012-12-05 Univ Texas NOVEL FAMILY OF PAIN PRODUCING SUBSTANCES AND METHODS OF PRODUCING NEW ANALGESIC MEDICINES
CN102250045A (zh) * 2010-05-21 2011-11-23 复旦大学附属华山医院 抗结核分支杆菌的化合物及其应用
WO2012040656A2 (en) * 2010-09-24 2012-03-29 Sciclone Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers to track response to scv-07
US9029342B2 (en) 2012-09-17 2015-05-12 Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions of matter that reduce pain, shock, and inflammation by blocking linoleic acid metabolites and uses thereof
SI3011345T1 (sl) 2013-08-07 2017-12-29 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Biomarkerski proteini za atipični hemolitični uremični sindrom (ahus)
JP2016538288A (ja) * 2013-11-15 2016-12-08 ディグニティ サイエンシス リミテッド 多価不飽和ヒドロキシ脂肪酸の薬学的に許容される塩
US10905062B2 (en) * 2015-10-19 2021-02-02 General Mills, Inc. High protein oat species
RU2662316C1 (ru) * 2017-08-31 2018-07-25 Сергей Владимирович Кунгурцев Жидкофазная композиция с повышенным содержанием природных устойчивых к окислению омега-3 полинепредельных жирных кислот
US20210315851A1 (en) 2020-04-03 2021-10-14 Afimmune Limited Compositions comprising 15-hepe and methods of treating or preventing hematologic disorders, and/or related diseases

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3875170A (en) * 1971-05-25 1975-04-01 Banyu Pharma Co Ltd Pyridine bis (dithiocarbamate) derivatives
US4025527A (en) * 1973-07-13 1977-05-24 Smith Kline & French Laboratories Limited Certain thiazoles and oxazoles
GB1542840A (en) * 1975-02-03 1979-03-28 Smith Kline French Lab Heterocyclic dithiocarbamates and isothioureas
US4670471A (en) * 1981-11-03 1987-06-02 Clark Lealand L Treatment for inflammatory skin disease
US4522811A (en) * 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
GB8421039D0 (en) * 1984-08-17 1984-09-19 Wyeth John & Brother Ltd Heterocyclic compounds
IL79289A (en) * 1985-07-05 1992-01-15 Whitehead Biomedical Inst Introduction and expression of foreign genetic material into keratinocytes using a recombinant retrovirus
US4980286A (en) * 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
EP0284879A3 (en) * 1987-03-17 1990-10-17 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Method of inhibiting interleukin-1 release
US4870101A (en) * 1987-03-17 1989-09-26 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Method of inhibiting interleukin-1 release
US5035878A (en) * 1988-09-12 1991-07-30 University Of Rochester Use of dithiocarbamates to counteract myelosuppression
US5166133A (en) * 1991-04-17 1992-11-24 Cetus Corporation Method for inhibing adhesion of white blood cells to endothelial cells
AU659482B2 (en) * 1991-06-28 1995-05-18 Massachusetts Institute Of Technology Localized oligonucleotide therapy
FR2679452B1 (fr) * 1991-07-22 1993-11-12 Cis Bio International Produit radiopharmaceutique ayant notamment un tropisme cerebral, comportant un complexe nitruro d'un metal de transition, et son procede de preparation.
US5206264A (en) * 1991-11-04 1993-04-27 Cypros Pharmaceutical Corporation Use of disulfiram to prevent cardiovascular damage
US5306724A (en) * 1992-08-17 1994-04-26 Clintec Nutrition Company Method for preventing and treating atherosclerosis
US5380747A (en) * 1992-10-30 1995-01-10 Emory University Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
US5807884A (en) * 1992-10-30 1998-09-15 Emory University Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
US5792787A (en) * 1995-06-07 1998-08-11 Emory University Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases

Also Published As

Publication number Publication date
US5773209A (en) 1998-06-30
CA2189336A1 (en) 1995-11-16
US5773231A (en) 1998-06-30
CN1152869A (zh) 1997-06-25
US5750351A (en) 1998-05-12
EP0759752A4 (en) 2001-08-08
NO964742L (no) 1996-11-08
GEP20012409B (en) 2001-04-25
US5846959A (en) 1998-12-08
EP0759752A1 (en) 1997-03-05
CZ330896A3 (cs) 1998-07-15
BG101030A (en) 1997-09-30
BR9507716A (pt) 1997-09-23
PL317193A1 (en) 1997-03-17
WO1995030415A1 (en) 1995-11-16
NO964742D0 (no) 1996-11-08
SK136496A3 (en) 1999-01-11
HU9603041D0 (en) 1997-01-28
JP3120091B2 (ja) 2000-12-25
KR100394157B1 (ko) 2004-02-11
US5807884A (en) 1998-09-15
JPH10500111A (ja) 1998-01-06
HUT76728A (en) 1997-11-28
PL184466B1 (pl) 2002-11-29
US5811449A (en) 1998-09-22
NZ287214A (en) 2001-05-25
MX9605450A (es) 1997-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL180874B1 (pl) Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby, której mediatorem jest VCAM-1
US5783596A (en) Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
CZ111595A3 (cs) Dithiokarbamáty pro ošetřování aterosklerózy a jiných kardiovaskulátních a zánětlivých chorob
EP2581451A1 (en) Compounds for inhibiting mammalian s-nitrosoglutathione reductase
US20010049349A1 (en) Antioxidant enhancement of therapy for hyperproliferative conditions
AU2019338896B2 (en) Composition for treating fibrotic diseases, comprising benzhydryl thioacetamide compound as active ingredient
KR20020015382A (ko) 포스페이트 수송 억제제
US20120121554A1 (en) Hmg-coa secondary metabolites and uses thereof
US20130157986A1 (en) Novel methylenedioxy phenolic compounds and their use to treat disease
RU2235541C2 (ru) Лечение атеросклероза и других сердечно-сосудистых и воспалительных заболеваний
US20220401420A1 (en) Combination therapy having antioxydant properties
AU709939B2 (en) Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
AU733198B2 (en) Treatment for atherosclerosis and other cardiovascular and inflammatory diseases
AU2020376223B2 (en) Combination therapy having antioxydant properties
JP2007509054A (ja) 血管健康を促進するシリルフェノール

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20110510