PL183954B1 - Kompozycja do wywoływania swoistej reakcji odpornościowej limfocytów T cytotoksycznych przeciwko antygenowi - Google Patents

Abstract

1 . Kompozycja do wywolywania swoistej reakcji odpornosciowej limfocytów T cytotoksycznych przeciwko antygenowi po podaniu zwierzeciu wybranemu z grupy obejmujacej czlowieka, zwierzeta domowe i/lub hodowlane, znamienna tym, ze obejmuje antygen wybrany z grupy obejmujacej antyge- ny HIV, antygeny malarii, antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia watroby typu B, antygeny wirusa grypy, antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia watroby typu A, antygeny wirusów herpes, antygeny wirusa oddechowego oraz antygeny nowotworowe, zmieszany z mikrofluidyzowana formulacja dla antygenu obejmujaca: a) detergent stabilizujacy; b) czynnik tworzacy micelle; i c) ulegajacy rozkladowi biologicznemu i biokompatybilny olej, przy czym formulacja dla antygenu jest wytworzona jako stabilna emulsja olej w wodzie, jest za- sadniczo wolna od jakiegokolwiek immunostymulujacego czynnika peptydowego. 2. Kompozycja do wywolywania swoistej reakcji odpornosciowej limfocytów T cytotoksycz- nych przeciwko antygenowi po podaniu zwierzeciu wybranemu z grupy obejmujacej czlowieka, zwie- rzeta domowe i/lub hodowlane, znamienna tym, ze obejmuje antygen wybrany z grupy obejmujacej antygeny HIV, antygeny malarii, antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia watroby typu B, antygeny wirusa grypy, antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia watroby typu A, antygeny wirusów herpes, antygeny wirusa oddechowego oraz antygeny nowotworowe, zmieszany z mikrofluidyzowana formula- cja dla antygenu obejmujaca: a) detergent stabilizujacy; b) czynnik tworzacy micelle; i c) ulegajacy rozkladowi biologicznemu i biokompatybilny olej, przy czym formulacja dla antygenu jest wytworzona jako stabilna emulsja olej w wodzie, jest po- zbawiona jakiegokolwiek immunostymulujacego czynnika peptydowego. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja do wywoływania swoistej reakcji odpornościowej limfocytów T cytotoksycznych przeciwko antygenowi u ludzi oraz zwierząt domowych i gospodarczych.

Uważa się, że limfocyty T cytotoksyczne (CTL) są głównym mechanizmem obronnym w odpowiedzi na różne zakażenia bakteryjne oraz wzrost nowotworu albo raka. Komórki te eliminują komórki zakażone albo transformowane przez rozpoznawanie fragmentów antygenowych w połączeniu z różnymi cząsteczkami (określanymi jako cząsteczki MHC klasy I) na komórkach zakażonych albo transformowanych. CTL mogą być indukowane doświadczalnie przez wprowadzanie do cytoplazmy pewnych rozpuszczalnych antygenów do określonych komórek. Immunizacja samymi antygenami rozpuszczalnymi jest zasadniczo niewystarczająca do indukowania swoistych limfocytów T.

Jedna z metod, którą można indukować odpowiedź CTL obejmuje zastosowanie technik inżynierii rekombinacyjnej do wprowadzania kluczowych składników interesującego antygenu do genomu łagodnych czynników zakaźnych. Celem takiej strategii jest wywołanie swoistej antygenowo odpowiedzi limfocytów T cytotoksycznych na pożądany epitop, przez poddanie gospodarza łagodnej, samoograniczającej się infekcji. Opisano wektory chimeryczne wykorzystujące wirusy krowianki, polio, adeno- i retrowirusy, jak również bakterie takie jak Listeria i BCG. Przykładowo, Takahashi i in., 85 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 3105, 1988, opisuje zastosowanie rekombinowanego wirusa krowianki ekspresjonującego gen otoczkowy gp160 HIV jako potencjalne narzędzie do wywołania odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T.

Druga metoda, dzięki której można indukować odpowiedź komórkową obejmuje zastosowanie adiuwantów. Aczkolwiek stan techniki obfituje w dyskusje na temat zastosowania adiuwantów, nie jest jasne czy została wywołana odpowiedź komórkowa oraz czy odpowiedź

183 954 taka obejmuje odpowiedź limfocytów T cytotoksycznych. Poniżej przedstawione są najbardziej reprezentatywne różne publikacje w tej dziedzinie.

Stover i in., 351 Nature 456, 1991 (publikacja nie stanowi stanu techniki dla niniejszego wynalazku) opisuje odpowiedź CTL na β-galaktozydazę przy użyciu rekombinowanych BCG niosących gen β-galaktozydazy. Nie stwierdzono takiej odpowiedzi stosując niekompletny adiuwant Freunda i β-galaktozydazę.

Mitchell i in., 8 J. Clinical Oncology 856, 1990 (publikacja nie stanowi stanu techniki dla niniejszego wynalazku) opisuje leczenie pacjentów z przerzutami czerniaka adiuwantem określanym jak DETOX i lizatami allogenicznego czerniaka podawanymi pięciokrotnie w ciągu sześciu tygodni. U niewielkiej części pacjentów obserwowano podwyższenie liczby limfocytów T cytotoksycznych. Autorzy opisują potrzebę zwiększenia poziomu wytwarzania limfocytów T cytotoksycznych i sugerują skojarzone leczenie adiuwantem z IL-2, jak również wstępne leczenie cyklofosfamidem w celu zmniejszenia poziomu swoistych wobec nowotworu limfocytów T supresorowych, które mogą występować. DETOX zawiera detoksykowaną endotoksynę (monofosforylo-lipid A) z Salmonella minnesota, szkielety ściany komórkowej Mycobacterium phlei, olej Squalene i emulgator.

Allison i Gregoriadis, 11 Immunology Today 427, 1990 (publikacja nie stanowi stanu techniki dla niniejszego wynalazku) zauważyli, że jedynym adiuwantem dopuszczonym do stosowania w szczepionkach dla ludzi są sole glinu (alum), które nie wywołują w sposób powtarzalny odporności komórkowej Allison i Gregoriadis stwierdzają: istnieje potrzeba opracowania adiuwantów o skuteczności kompletnego adiuwantu Freunda, ale bez jego licznych efektów ubocznych takich jak ziarniniaki. Twierdzą oni, że istnieją trzy możliwe strategie: przykładowo, zastosowanie liposomów; zastosowanie adiuwantów określanych jako kompleksy immunostymulujące (ISCOM, które zawierają saponinę albo Quil A (triterpenoid z dwoma łańcuchami węglowodanowymi), cholesterol i fosfatydylocholinę) zatwierdzonych do stosowania w końskich szczepionkach przeciwko grypie (Morein i in., Immunological Adjuvants and Vaccines, Plenum Press, 153); oraz zastosowanie emulsji (SAF) Squalene albo Squalane (z lub bez czynników typu Pluronic) i muramylodipeptydu (MDP). Uważa się, że SAF wywołuje odporność komórkową u myszy, jakkolwiek długo uważano, że podjednostki antygenu nie mogą wywołać odpowiedzi limfocytów T cytotoksycznych (CTL).

Takahashi i in., 344 Nature 873, 1990, opisują wywołanie limfocytów T rozpoznających w kontekście klasy II, pomocniczych i cytotoksycznych, przez zastosowanie ISCOM-ów w pojedynczej immunizacji podskórnej u myszy. Twierdzą oni, że adiuwant Freunda, niekompletny adiuwant Freunda i roztwór soli buforowany fosforanem nie wywołuje aktywności cytotoksycznych limfocytów T przeciwko celom stanowiącym ich przedmiot zainteresowania. Twierdzą oni, że w przeciwieństwie do wyników z innymi postaciami egzogennych rozpuszczalnych antygenów białkowych, wykazali, że jest możliwe uczulenie rozpoznających w kontekście klasy II CTL CD8+ CD4- swoistych wobec antygenu, przez immunizację egzogennym kompletnym białkiem przez wykorzystanie ISCOM. Twierdzą również, że opisane doświadczenia wskazują na możliwość wywołania ludzkich CTL przez zastosowanie ISCOM zawierających białka HIV, oraz, że szczepionki oparte na ISCOM mogą osiągnąć długo poszukiwany cel wywołania zarówno CTL jak i przeciwciał przez oczyszczone białko.

Byars i Allison, 5 Vaccines 223, 1987, opisują zastosowanie SAF-1, zawierającego monooleinian polioksyetylenosorbitanu, PLURONIC L121 i squalene albo Squalane, z lub bez zastosowania dipeptydu muramylowego, i sugerują, że ich dane wskazują, że kompozycja z dipeptydem muramylowym powinna być przydatna do stosowania w szczepionkach ludzkich i weterynaryjnych. Dawki przypominające adiuwantu były podawane bez dipeptydu muramylowego. Opisuje się, że dipeptyd muramylowy zwiększa znacząco wytwarzanie przeciwciał w stosunku do zastosowania adiuwantu bez niego. Odporność komórkowa była mierzona jako testy skórne nadwrażliwości typu późnego, w celu określenia indukcji limfocytów T pomocniczych. Nadwrażliwość taka była silniejsza i bardziej trwała gdy w adiuwancie znajdował się dipeptyd muramylowy. Podobne adiuwanty opisał Allison i in., w patencie USA 4,770,874 (gdzie stwierdzono, że połączenie dipeptydu muramylowego i poliolu Pluronic stanowi istotę wywołania silnej komórkowej i humoralnej odpowiedzi na kurzą albuminę);

183 954

Allison i in., patent USA 4,772,466; Murphy-Corb i in., 246 Science 1293, 1989 (gdzie stwierdzono, że zastosowanie skojarzonych adiuwantów z dipeptydem muramylowym może wzmocnić indukcję ' gałęzi humoralnej jak i komórkowej odpowiedzi odpornościowej); Allison i Byars, 87 Vaccines 56, 1987 (gdzie stwierdzono, że odporność komórkowa wywoływana jest przez SAF (z dipeptydem muramylowym) co wykazano nadwrażliwością typu późnego, odpowiedzią proliferacyjną limfocytów T na antygen, wytwarzaniem interleukiny-2 oraz swoistą genetycznie rozpoznawaną lizą komórek docelowych niosących immunizujący antygen); Allison i Bryars, Immunopharmacology of Infectious Diseases: Vaccine Adjuvants and Modulators ot Non-Specific Resistance 191-201, 1987; Morgan i in., 29 J. Medical Virology 74, 1989; Kenney i in., 121 J. Immunological; Methods 157, 1989; Allison i Bryars, 95 J. Immunological Methods 157, 1986 (gdzie wykazano, że sole glinu i emulsje olejów mineralnych zwiększają wytwarzanie przeciwciał ale nie odporność komórkową; oraz wykazano, że preparaty dipeptydu muramylowego wywołują odporność komórkową); Byars i in., 8 Vaccine 49, 1990 (publikacja nie stanowi stanu techniki dla niniejszego wynalazku, gdzie stwierdzono, że kompozycje adiuwantów znacząco zwiększają odpowiedź humorałną oraz w mniejszym stopniu reakcję komórkową na antygen hemaglutyniny wirusa grypy); Allison i Bryars, 28 Molecular Immunology 279, 1991 (publikacja nie stanowi stanu techniki dla niniejszego wynalazku; gdzie stwierdzono, że funkcją dipeptydu muramylowego jest wywołanie ekspresji cytokin i zwiększenie ekspresji genów głównego układu zgodności tkankowej (MHC); oraz, że uzyskano lepszą odpowiedź przeciwciał i komórkową niż w przypadku innych adiuwantów, oraz wyrażono nadzieję, że podobna strategia będzie skuteczna u ludzi); Allison i Byars, Techno-logy Advances in Vaccine Development 401, 1988 (gdzie opisano odporność komórkową po zastosowaniu SAF); Epstein i in., 4 Advance Drug Delivery Reviews 223, 1990 (gdzie zamieszczono przegląd różnych adiuwantów stosowanych w preparatach szczepionek); Allison i Byars, 95 J. Immunological Methods 157, 1986 (gdzie stwierdzono, że dodanie dipeptydu muramylowego do adiuwantu znacząco wzmaga odpowiedź komórkową na różne antygeny, w tym na przeciwciała monoklonalne i antygeny wirusowe); i Morgan i in., 29 J. Medical Virology 74, 1989 (gdzie opisano zastosowanie SAF-1 do wytwarzania szczepionki przeciwko wirusowi Epsteina-Barr).

Kwak i in., Idiotype Networks in Biology and Medicine, Elsevier Science Publishers, str. 163, 1990 (publikacja nie stanowi stanu techniki dla niniejszego wynalazku) opisuje zastosowanie SAF bez dipeptydu muramylowego jako adiuwantu wobec idiotypowi chłoniaka z limfocytów B u ludzi. Konkretnie, emulsję Pluronic LI21, Squalane i 0,4% monooleinian polioksyetyleno-sorbitanu, w roztworze soli buforowanym fosforanem podawano wraz z idiotypem. Stwierdzili oni, że „dodanie adiuwantu powinno dalej wspomóc ... odpowiedź humoralną, oraz również może poprawić indukcję odpowiedzi komórkowej.

Inne preparaty immunologiczne zawierają liposomy (Allison i in., patent USA 4,053,585 oraz 4,117,113); peptydy cykliczne (Dreesman i in., patent USA 4,778,784); kompletny adiuwant Freunda (Asherson i in., 22 Immunology 465, 1972; Berman i in., 2 International J. Cancer 539, 1967; Allison, 18 Immunopotentiation 73, 1973; oraz Allison, NonSpecific Factors Influencing Host Resistance 247, 1973); ISCOM (Letvin i in., 87 Vaccines 209, 1987); adiuwanty zawierające niejonowe polimery blokowe, wytworzone z olejem mineralnym, czynnkiem aktywnym powierzchniowo i monooleinianem polioksyetyleno-sorbitanu, (Hunter i Bennett, 133 J. Immunqlogy 3167, 1984; oraz Hunter i in., 127 J. Immunology 1244, 1981); adiuwanty składające się z oleju mineralnego i czynnika emulgującego z lub bez zabitych mykobakterii (Sanches-Pescador i in., 141 J. Immunology 1720, 1988); oraz inne adiuwanty takie jak lipofilowe pochodne dipeptydu muramylowego, oraz dipeptyd muramylowy sprzęgnięty kowalencyjnie z białkiem rekombinowanym (id.).

Streszczenie wynalazku

Zgłaszający opracowali bezpieczne i korzystne kompozycje, dzięki którym można wywołać odpowiedź CTL u ludzi oraz zwierząt domowych i hodowlanych. Kompozycja zawiera antygen o małej lub żadnej toksyczności dla zwierząt, oraz pozbawiona jest peptydu immunostymulującego (np. dipeptydu muramylowego) którego obecność mogłaby zmniejszyć pożądaną odpowiedź komórkową. Oprócz tego, technologia wytwarzania kompozycji, jest prosta

183 954 do zastosowania i nie wymaga intensywnej pracy in vivo w celu zmiany istniejących komórek techniką rekombinacji DNA i uczynienia ich bardziej antygenowymi. Stwierdzenie to jest zaskakujące, ponieważ nie oczekiwano, że taka odpowiedź CTL może być wywołana przez zastosowanie takiej formulacji dla antygenu, pozbawionej peptydów immunostymulujących albo ich równoważników. Odkrycie Zgłaszających umożliwia zastosowanie takich formulacji dla antygenu w szeregu chorób albo jako czynników profilaktycznych. Przykładowo, podanie takiej kompozycji antygenu może być zastosowane w leczeniu chorób wirusowych w których istotna jest odpowiedź CTL, przykładowo, w leczeniu zakażenia HIV albo grypą; może również być rozciągnięte na zastosowanie w leczeniu zakażeń bakteryjnych, nowotworów, inwazji robaków itp. Jako czynnik profilaktyczny, kompozycja antygenu skojarzona z odpowiednim antygenem jest przydatna w zapobieganiu zakażeniom wirusami odpowiedzialnymi za wymienione wyżej choroby wirusowe, szczególnie profilaktyce zakażeń HIV jak również do profilaktyki u pacjentów narażonych na choroby nowotworowe, przykładowo po wycięciu guza pierwotnego.

Tak więc, w pierwszym aspekcie wynalazek dotyczy dostarczenia kompozycji antygenu, na który pożądana jest odpowiedź CTL, i dostarczenie jej w nie toksycznej kompozycji antygenu obejmującej, składającej się z, i zasadniczo składającej się z detergentu stabilizującego, czynnika tworzącego micele i ulegającego rozkładowi biologicznemu i biokompatybilnego oleju. Ta formulacja dla antygenu korzystnie pozbawiona jest jakiegokolwiek immunostymulującego składnika peptydowego albo zawiera wystarczająco niski poziom takiego składnika, tak że odpowiedź odpornościowa nie jest zmniejszona. Formulacja ta korzystnie jest dostarczona jako stabilna emulsja olej w wodzie. To znaczy, każdy z różnych składników wybrany jest tak, że emulsja pozostaje w postaci emulsji przez okres co najmniej miesiąca, zaś korzystnie przez ponad rok, bez rozdzielenia się faz. Według wynalazku, antygen i formulacja dla antygenu są mieszane ze sobą tworząc mieszaninę (korzystnie przez mikrofluidyzację), a mieszanina podawana jest zwierzęciu w ilości odpowiedniej do wywołania odpowiedzi CTL u zwierzęcia. Podawanie takie jest konieczne tylko raz.

Przez określenie „stabilizujący detergent rozumie się detergent, który umożliwia składnikom emulsji pozostawanie w stanie stabilnej emulsji. Detergenty takie obejmują monoolo-inian polioksyetyleno-sorbitanu (Sorbitano-mono-9-oktadecenian-poli(oksy 1,2-etanodiyl; wytwarzany przez ICI Americas, Wilmington, DE), monolaurynian polioksyetyleno-sorbitanu, monopalmitynian polioksyetyleno-sorbitanu, mono-stearynian polioksyetyleno-sorbitanu, Zwittergent 3-12, TEEPOL HB7 i trioleinian sorbitanu. Detergenty te zwykle stosuje się w ilości około 0,05 do 0,5%, korzystnie około 0,2%.

Przez określenie „czynnik tworzący micele rozumie się czynnik: który jest zdolny do stabilizacji emulsji utworzonej przez inne składniki tak, że tworzone są struktury micelarne. Czynniki takie korzystnie powodują pewne podrażnienie w miejscu wstrzyknięcia co powoduje rekrutację makrofagów i zwiększenie odpowiedzi odpornościowej. Przykłady takich czynników obejmują surfaktanty polimerowe opisane w publikacjach BASF Wyandotte, np. Schmolka, 54 J. Am. Oil. Chem. Soc. 110, 1977, i Hunter i in., 129 J. Immunol. 1244, 1981, załączone tu jako odnośniki, PLURONIC L62LF, L101 i L64, PEG1000 i TETRONIC 1501, 150R1, 701, 901, 1301 i 130R1. Budowa chemiczna takich środków jest dobrze znana. Korzystnie, wybiera się czynnik posiadający równowagę hydrofilowo-hydrofobową (HLB) od 0 do 2, jak to zdefiniowano w Hunter i Bennett, 133 J. Immunol. 3167, 1984. Środek korzystnie stosuje się w ilości od 0,5 do 10%, korzystniej w ilości pomiędzy 1,25 do 5%.

Olej dobiera się tak aby ułatwiał retencję antygenu w emulsji olej w wodzie, tj. aby stanowił nośnik dla pożądanego antygenu i korzystnie miał temperaturę topnienia poniżej 65°C, tak że emulsja tworzy się w temperaturze pokojowej (około 20-25°C) albo temperatura emulsji spadnie do temperatury pokojowej. Przykłady takich olejów obejmują Squalane, Squalene, EICOSANE, tetratetrakontan, glicerynę i olej arachidowy albo inne oleje roślinne. Olej korzystnie stosuje się w ilości pomiędzy 1 i 10%, najkorzystniej pomiędzy 2,5 i 5%. Istotne jest, aby olej ulegał degradacji biologicznej albo był biokompatybilny, tak by organizm mógł rozłożyć olej po pewnym czasie, oraz by nie powodował on niekorzystnych efektów takich jak ziarniniaki.

183 954

Istotne jest, aby w powyższej formulacji nie znajdował się składnik peptydowy, a zwłaszcza dipeptyd muramylowy (MDP). Peptyd taki będzie przeszkadzał w indukcji odpowiedzi CTL, jeżeli będzie dostarczony w ilości większej niż około 20 pg w normalnej ludzkiej dawce kompozycji. Korzystne jest, aby peptydy nie występowały zupełnie w formulacji dla antygenu, mimo ich wyraźnego pobudzania przedziału humoralnego układu odpornościowego. Zgłaszający stwierdzili, że jakkolwiek peptydy takie mogą pobudzać odpowiedź humoralną, są one niekorzystne gdy pożądana jest odpowiedź limfocytów T cytotoksycznych.

W innym pokrewnym aspekcie, formulacja dla antygenu wytworzona jest tylko z dwóch spośród powyższych trzech składników i zastosowana z dowolnym pożądanym antygenem (które to określenie obejmuje białka, polipeptydy i ich fragmenty, które są immunogenne), z wyjątkiem albuminy jaja (albo innych albumin, np. HSA, BSA albo owalbuminy) w celu wywołania odpowiedzi CTL u powyższych zwierząt albo ludzi.

Zgłaszający uważają, że powyższe formulacje są wyraźnie korzystniejsze w porównaniu z poprzednimi formulacjami (w tym ISCOM, DETOX i SAF) w zastosowaniu u ludzi. W przeciwieństwie do powyższych formulacji, niniejsze formulacje zarówno obejmują czynnik tworzący micele, jak i pozbawione są peptydów, szkieletów ścian komórkowych albo składników komórek bakteryjnych. Niniejsze formulacje wywołują również odpowiedź CTL, która nie występowała w przypadku poprzednich formulacji albo jest ona znacząco zwiększona w porównaniu z innymi formulacjami.

Przez „nietoksyczne rozumie się, że nie występują albo występują niewielkie objawy uboczne formulacji dla antygenu u leczonych zwierząt albo ludzi. Specjaliści w dziedzinie medycyny albo weterynarii zauważą, że określenie to ma szerokie znaczenie. Przykładowo, u zasadniczo zdrowego zwierzęcia albo człowieka tolerowana jest wyłącznie niewielka toksyczność, podczas gdy u człowieka cierpiącego na niebezpieczną chorobę dopuszczalna jest zasadniczo większa toksyczność.

W najkorzystniejszym wykonaniu, formulacja dla antygenu składa się zasadniczo z dwóch albo trzech spośród detergentu, czynnika i oleju; sposób zasadniczo obejmuje pojedyncze podanie mieszaniny (antygen z formulacją dla antygenu) człowiekowi albo zwierzęciu; człowiek albo zwierzę jest zakażone wirusem i cierpi na jeden lub wiele objawów (jak to jest ogólnie definiowane przez specjalistów z danej dziedziny medycyny) zakażenia przez wirusa; zaś formulacja dla antygenu nie jest toksyczna dla człowieka albo zwierzęcia.

W najkorzystniejszym wykonaniu, antygen wybrany jest spośród części antygenowych antygenów HIV: gp160, gag, pol, Nef, Tat i Rev; antygenów malarii: białka CS i białka 2 powierzchni sporozoitów; antygenów powierzchniowych wirusa zapalenia wątroby typu B: PreS1, Pre-32, Hbc Ag i HBe Ag; antygenów wirusa grypy: HA, NP i NA; antygenów powierzchniowych wirusa zapalenia wątroby typu A; antygenów wirusa Herpes: EBV gp340, EBV gp85, HSV gB, HSV gD, HSV gH, wczesnego produktu białkowego HSV, antygenów ludzkiego wirusa brodawczaków (np. antygenów HPV takich jak antygeny L1, E4, E6, E7, w szczególności antygenów E6 i E7 HPVl6 i 18, dwóch najbardziej powszechnych typów związanych z rakiem szyjki macicy, E4 i L1 pochodzącymi z HPV6 i HPV11, dwóch najbardziej powszechnych typów związanych z kłykcinami kończystymi; antygenu swoistego dla gruczołu krokowego (PSA), gB wirusa cytomegalii, gH wirusa cytomegalii i białka IE gP72; antygenów wirusa oddechowego: białka F, G i N; oraz antygenów raka CEA, mucyny związane z rakiem, antygenów rakowych P21, P53, antygenów czerniaka MPG, p97 i produktu onkogenu nowotworowego Neu, rakowego produktu genu p53, antygenu czerniaka MAGE, i zmutowanego białka ras p21 obecnego na różnych nowotworach złośliwych.

W pokrewnym aspekcie, wynalazek dotyczy kompozycji obejmującej, składającej się albo składającej się zasadniczo z antygenu zmieszanego z formulacją dla antygenu opisaną powyżej, przy czym antygen wybrany jest spośród części antygenowych wymienionych wyżej.

W innym pokrewnym aspekcie, wynalazek dotyczy sposobów leczenia pacjenta zarażonego wirusem HlV, cierpiącego na malarię, cierpiącego na grypę, cierpiącego na zapalenie wątroby, cierpiącego na raka, zarażonego wirusem herpes, cierpiącego na raka szyjki macicy, cierpiącego na kłykciny kończyste (kłykciny genitalne) albo zakażonego wirusem oddechowym, przez podanie kompozycji obejmującej odpowiedni antygen (np. wybrany spośród wy8

183 954 mienionych wyżej) zmieszany z odpowiednią formulacją dla antygenu wymienioną wyżej. Antygeny te i leczenie są jedynie przykładami antygenów, które można zastosować w niniejszych formulacjach antygenów.

Inne cechy i zalety wynalazku staną się jasne w oparciu o poniższy opis najkorzystniejszych wykonań oraz zastrzeżerua.

Opis najkorzystniejszych wykonań

Poniżej podano krótki opis rysunków

Rysunki

Figury od 1A do 1C i od 4A do 4C są graficzną prezentacją danych porównujących indukcję CTL przez różne kompozycje owalbuminy; na wszystkich Figurach E:T przedstawia stosunek efektorów do celów.

Figury 2A i 2B są graficzną prezentacją danych porównujących indukcję CTL przez różne formulacje β-galiddOzydazy;

Figura 3 jest graficzną prezentacją danych porównujących indukcję CTL przez owalbuminę w liposomach i w formulacji dla antygenu;

Figury 4 i 6 są graficzną prezentacją danych pokazujących wpływ usunięcia limfocytów CD4 i CD8 na indukcję CTL;

Figura 7 jest graficzną prezentacją danych przedstawiających indukcję CTL przez gp120;

Figura 8 jest graficzną prezentacją danych pokazujących indukcję CTL przez mieszaninę Pluronic i detergentu (TWEEN) oraz antygenu;

Figura 9 jest graficzną prezentacją danych pokazujących indukcję CTL mieszaniną Squalene, Pluronic i antygenu;

Figura 10 jest graficzną prezentacją danych pokazujących indukcję CTL przez mieszaninę Squalene, Pluronic i antygenu;

Figura 11 jest graficzną prezentacją wpływu OVA w różnych formulacjach dla antygenu na odpowiedź CTL;

Figura 12 jest graficzną prezentacją indukcji przeciwciał przeciwko gp120IIIb u małp, przez różne formulacje dla antygenu;

Figura 13 przedstawia aktywność przeciwnowotworową komórek HOPE2 dziesięć dni po pojedynczej immunizacji rozpuszczalnym białkiem E7 w adiuwancie; i

Figura 14 przedstawia aktywność przeciwnowotworową komórek HOPE2 w 10, 19 dni po dwukrotnej immunizacji rozpuszczalnym białkiem E7 w adiuwancie.

Formulacja dla antygenu

Formulacje dla antygenu przydatne w niniejszym wynalazku są ogólnie opisane powyżej. Specjaliści w tej dziedzinie wiedzy zauważą, że można łatwo wytworzyć równoważniki formulacji i należy oczekiwać podobnych właściwości indukcji odpowiedzi CTL. Formulacje takie można łatwo testować pod kątem ich właściwości stosując techniki równoważne do opisanych niżej w przykładach.

Poniżej przedstawiono przykłady wynalazku z zastosowaniem formulacji dla antygenu (AF) składającej się z około 2,5% Squalrnr, 5% kwasu Pluronic i monooleinianu polioksyety-lrnosorbitanu, w roztworze soli buforowanym fosforanem. Konkretnie, emulsja AF obejmowała: 15 mg Squalene, 37,5 mg poloksameru 401 (PLURONIC L121), 6 mg monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu, 0,184 mg chlorku potasu, 0,552 monozasadowego fosforanu sodu, 7,36 mg chlorku sodu, 3,3 mg dizasadowego fosforanu sodu (bezwodnego) na 1 ml wody, pH 7,4. Emulsję tą mikrofluidyzowano stosując standardową technikę (Microfluidics Model M110F) z modułem ciśnienia zwrotnego przy 11-14000 psi ze stopniowym powrotem do ciśnienia atmosferycznego, chłodzono i pakowano w lodzie.

W innych przykładach, antygen zmieszano z mikrofluidyzowaną mieszaniną Squalene (S), Pluronic (P) i monooleinianu polioksyrtyleno-sorbitanu (T) zachowując stężenia końcowe 0,2% monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu, 1,25% Pluronic i 5% Squalene. W celu określenia składników niezbędnych do indukcji swoistej antygenowe odpowiedzi odpornościowej wytworzono mieszaniny Squalane-monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu, Pluronic-monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu i Squalrne-Pluronic w tych samych stężeniach co w mieszaninie trzech

183 954 składników. Pluronic, Squalane albo monooleinian polioksyetyleno-sorbitanu były również preparowane osobno w celu określenia wpływu pojedynczych składników na indukcję CTL. Wykonano również zastąpienia monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu przez monolaurynian polioksyetyleno-sorbitanu, monopalmitynian polioksyetyleno-sorbitanu i Zwittergent w celu określenia wpływu różnych pochodnych TWEEN na indukcję CTL w układzie ova. Zastąpienie Squalene w formulacji trójskładnikowej wykonano przez zastosowanie Eicosone albo Triacontone zaś kopolimer Pluronic zastąpiono w tych samych trzech formulacjach PEG 1000, Pluronic L62LF i Tetronic 1501 i 150R1. W formulacjach dwuskładnikowych mieszano różne analogi w różnych kombinacjach i badano pod kątem indukcji CTL swoistej wobec ova. Były to mieszaniny cholesterolmonooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu, Squalene-monolaurynianu polioksyetyleno-sorbitanu, Pristane-mono-oleinianu polioksyetyleno-sorbitanu albo olej z oliwek-monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu. W badaniach nad stabilizacją mikrofluidyzowaną mieszaninę Squalenemonooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu mieszano z dekstrozą do stężenia końcowego 5%. We wszystkich przypadkach, kombinację wypełniacza mieszano w urządzeniu do mikrofluidyzacji tworząc stabilną emulsję. W niektórych doświadczeniach formulacje dwuskładnikowe mieszano z różnymi stężeniami MDP w celu indukcji odpowiedzi CTL i humoralnej. W tabeli 1 przedstawiono skróconą listę różnych formulacji stosowanych w tym badaniu.

Tabela 1

Wpływ różnych zastąpień w układach dwu- i trójskładnikowych

Zastąpienia w formulacji trój składnikowej

STP monopalmitynian polioksyetyleno-sorbitanu (T) monolaurynian polioksyetyleno-sorbitanu (T) T1501(P)

T150R1(P)

Pluronic L62LF(P)

Eicosane (S)

PEG 1000(P)

Triacontane (S)

Zwittergent (T)

Zastąpienia w formulacji dwuskładnikowej

ST

PT

SP

Cholesterol (S ) + monooleinian polioksy-etyleno-sorbitanu

Skwalen + monolaurynian polioksyetylenosorbitanu (T)

Pristane(S) + monooleinian polioksyetylenosorbitanu

Olej z oliwek (S) + monooleinian polioksy-etyleno-sorbitanu F ormulacj a j ednoskładnikowa Pluronic L121 Skwalen monooleinian polioksyetyleno-sorbitanu Skwalen + monooleinian polioksyetylenosorbitanu+ 5% dekstrozą * test CTL jest powtarzany

Procent niszczenia przy E:T równym 100:1 84

183 954

Formulację adiuwantu Syntex (mikrofluidyzowana; SAFm) zastosowano jako kontrolę adiuwantu i składała się ona z dwóch części. Część I składała się z roztworu soli buforowanego fosforanem zawierającego 5% Squalene, 1,,25% Pluronic i 0,2% monooleinian polioksyetyleno-sorbitanu (nośnik albo I-SAF). Część II składała się z N-acetylomuramylo-Ltreonylo-D-izoglutaminy (Thr-MDP), pochodnej składnika ściany komórkowej mykobakterii. W celu immunizacji, antygen miesza się z mikrofluidyzowanym nośnikiem (część I) w celu otrzymania homogennej emulsji. Do wytworzonego SAFm dodaje się MDP i krótko miesza. Stężenie MDP w mieszaninie było zmieniane w celu określenia, czy było ono optymalne dla indukcji CTL. Jako kontrola adiuwantu, myszy immunizowano również rozpuszczalnymi antygenami zmieszanymi z alumem według instrukcji producenta (Pierce Chemical, Rockford, IL) albo z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA).

Tę formulację dla antygenu stosowano do indukowania odpowiedzi limfocytów T cytotoksycznych u myszy. Specjaliści w tej dziedzinie wiedzy zauważą, że taki model mysi świadczy, że jest możliwe równoważne doświadczenie albo leczenie powinno podobnie wywołać odpowiedź limfocytów T cytotoksycznych u ludzi, zwierząt domowych albo hodowlanych. Ilość formulacji dla antygenu i antygenu przydatna w wywołaniu pożądanej odpowiedzi komórkowej może być określona doświadczalnie według standardowych procedur, dobrze znanych specjalistom, bez dodatkowych doświadczeń. Tak więc, jeżeli pożądane jest zmniejszenie efektów ubocznych leczenia taką mieszaniną, specjalista może określić minimalny poziom takiej mieszaniny do podawania człowiekowi, zwierzęciu domowemu albo hodowlanemu, w celu wywołania odpowiedzi CTL i w ten sposób wywołania odporności na pożądany antygen. W normalnym stosowaniu, mieszanina taka może być wstrzykiwana dowolną spośród licznych procedur, ale szczególnie korzystne jest wstrzyknięcie domięśniowe w miejsce umożliwiające emulsji pozostanie w postaci stabilnej przez okres kilku dni albo tygodni.

Metody

Poniższe materiały i metody zastosowano w Przykładach podanych niżej jeżeli nie zaznaczono inaczej:

Myszy

Samice myszy C57BL/6 (H-2^b) i BALB/c (H-2^d) zakupiono z Harlen Spraque (San Diego, Kalifornia).

Antygeny

Owalbuminę (ova, czystość VII; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) zastosowano w postaci natywnej. β-galaktozydazę (β-gal, czystość VIII; BRL) zastosowano w postaci natywnej i po gotowaniu z 1 M NaOH przez 2 min. co dało produkt trawienia alkalicznego. Rekombinowanągp120 zakupiono z American Biotechnology.

Komórki nowotworowe i transfektanty

Zastosowano komórki nowotworowe linii Ia- EL4 (C57BL/6, grasiczak H-2b) i P815 (DBA/2, mastocytoma H-2_d). Otrzymanie transfektantów EL4 wytwarzających ova, EG7-ova, opisano uprzednio przez Moore i in., 54 Cell 777, 1988. Transfektant wytwarzający β-gal, P13.1, uzyskano przez elektroporację 10⁷komórek P815 w 1 ml roztworu soli buforowanego fosforanem (PBS) z 10 mg pCH110 (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) linearyzowanego Psit I, i 1 mg pSV2 neo (Southern i in., 1 J. Mol. Appl. Gen. 327, 1982) linearyzowanego PvuI, a następnie selekcję w 400 pg/ml antybiotyku G418. Transfektant C3-4 uzyskano z hybrydomy BALB/c Igm 662 przez transfekcję plazmidem kodującym gen β-gal poddany fuzji z trzecim i czwartym egzonem łańcucha ciężkiego IgM (Rammensee i in., 30 Immunogenetics 296, 1989). Fibroblasty 3T3 ekspresjonujące gp160IIIb, 15-12, uzyskano od Dr Germain z NIH (Bethesda, MD). Linię komórek L transfekowanych Kb uzyskano od Dr Carbone, Monash University, Australia. Linie komórek L transfekowanych Dd i Ld uzyskano od Dr Teda Hansena, Washington University, St. Louis.

Immunizacja

Myszy immunizowano dożylnie stosując 200 pi zawiesiny 25x10⁶ splenocytów, po upakowywaniu cytoplazmy jak to opisano w Moore i in., wyżej, i Carbone i in., J. Exp. Med. 169:603, 1989. Do immiunizacji formulacją dla antygenu ova albo formulacją β-gal 30 pg każdego z antygenów białkowych na mysz wstrzyknięto w poduszkę łapy i podskórnie u na183 954 sady ogona. Każde ze wstrzyknięć zawierało 67 pl mikrofluidyzowanej formulacji dla antygenu (wytworzonej procedurą standardową) i 30 pg antygenu białkowego w objętości końcowej 200 pl. Objętość końcową dopełniono HBSS, patrz, podręcznik Whittakera (Walkersville, MD). MDP dostarczono w stężeniach pomiędzy 0 i 300 pg. Gdzie to zaznaczono, myszy immunizowano rozpuszczalnym antygenem w CFA, albo w alumie w objętości końcowej 200 pl.

Pobudzanie populacji efektorów in vitro

Splenocyty (30x10⁶) pochodzące z myszy normalnych albo immunizowanych, uczulonych przynajmniej 14 dni wcześniej, inkubowano z 1,5x10⁶ EG7-ova (napromieniowanych dawką 20000 radów) dla odpowiedzi na ova i 1,5x10⁶ komórek C3-4 (napromieniowanych dawką 20000 radów) dla odpowiedzi na β-gal w 24-studzienkowych płytkach w 37°C w 7% CO2/powietrze. Wszystkie hodowle komórkowe wykonano w kompletnej pożywce zawierającej pożywkę IMDM, patrz, podręcznik Whittakera (Walkersville, MD) z dodatkiem 10% surowicy płodowej cielęcej (FCS), 2 mM glutaminy, gentamycyny i 2x10'⁵ 2-merkaptoetanolu. Do doświadczeń z deplecją in vitro, splenocyty uczulane in vivo albo pobudzane in vitro traktowano przeciwciałami monoklonalnymi (mAbs) RL.172 (przeciwko CD4) albo mAbs 3.168 (przeciwko CD8) w celu usunięcia limfocytów CD4+ albo CD8+ (Sarimento i in., 125 J. Immunol. 2665, 1980; i Ceredig i in., 314 Nature 98, 1985). mAb RL.172 i mAb 3.168 uzyskano od Dr Jonathana Sprenta z Scripps Clinic and Research Fundation, La Jolla CA.

Splenocyty (30x106) od normalnych albo immunizowanych myszy, uczulonych przynajmniej 21 dni wcześniej inkubowano z 1,5x106 komórek 15-12 (traktowanych 200 pg mitomycyny C na 10⁸ komórek przez 45 minut) albo 500 pg peptydu 18IIIb zawierającego dominujący epitop CTL myszy BALB/c w kompletnej pożywce IMDM (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) zawierającej 10% uprzednio zbadanej FCS (ICN Flow; ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA), 2 mM glutaminę, gentamycynę i 2x10'5 2-merkaptoetanolu. Do stymulacji in vitro peptydami, splenocyty hodowano w kompletnej IMDM zawierającej 5% nadsącz ConA.

Do doświadczeń z deplecją, uczulane in vivo albo pobudzane in vitro splenocyty traktowano mAbs RL.172 (przeciwko CD4) albo mAbs 3.168 (przeciwko CD8) w obecności króliczego dopełniacza o niskiej toksyczności (Cederlane Laboratories, Ltd., Homby, Ontario, Kanada) w celu usunięcia limfocytów CD4+ albo CD8+ (22, 23). mAb RL.172 i mAb 3.168 były ofiarowane przez Dr Jonathana Sprenta z Scripps Clinic and Research Fundation, La Jolla, CA.

Test cytotoksyczności

Komórki docelowe (1x106) znakowano 100 pCi [5'Cr] chromianu sodu przez 60 minut. W celu uzyskania celów pulsowanych peptydem, 50 pl roztworu peptydu 1 mg/ml w HBSS dodano podczas znakowania celów 5'Cr. Po płukaniu, 10⁴ znakowanych celów i seryjne rozcieńczenia komórek efektorowych inkubowano w 200 pl RP10 przez 4 godziny w 37°C. Zebrano 100 pl nadsączu i określano lizę swoistą w następujący sposób:

% lizy swoistej=100 x {(uwalnianie w CTL - uwalnianie spontaniczne)/(uwalnianie maksymalne - uwalnianie spontaniczne)}.

Uwalnianie spontaniczne pod nieobecność limfocytów T cytotoksycznych (CTL) wynosiło <25% uwalniania maksymalnego pod wpływem detergentu we wszystkich doświadczeniach.

Określenie odpowiedzi przeciwciał u myszy i małp

Każdą ze studzienek płytki 96-studzienkowej o ukształtnych denkach (Costar, Cambridge, MA) opłaszczono 150 ng ova albo gp120 w 50 pl HBSS i inkubowano przez w 4°C. W celu określenia odpowiedzi przeciwciał przeciwko antygenom gp120 albo ova u myszy, płytki blokowano 1% BSA przez 1 godzinę. Seryjnie rozcieńczone surowice dodano w ilości 25 pl na studzienkę i inkubowano przez 2 godziny. Płytki płukano i dodawano po 50 pl rozcieńczenia 1:1000 kozich koniugatów z HRPO przeciwko mysim IgG (SBT, Alabama) w 1% BSA. Po 1 godzinie inkubacji, płytki płukano i dodawano po 100 pl substratu na studzienkę. OD4₀5 mierzono po 10 do 15 minutach. W celu określenia odpowiedzi przeciwciał przeciwko gp120 u małp, wszystkie etapy były takie same z wyjątkiem tego, że blokowanie płytek i rozcieńczenia surowic wykonano w 5% normalnej surowicy koziej w HBSS.

183 954

Synteza peptydów

Syntetyczne peptydy odpowiadające sekwencji aminokwasowej 253-276 (Identyfikator Sekw. Nr 1:

EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER; gdzie w celu przedstawienia aminokwasów zastosowano standardowy kod jednoliterowy) owalbuminy [ova 253-276), sekwencji amino-kwasowej 84-102 zasadowego białka mieliny (MBP 84-102) (Identyfikator Sekw. Nr 2:

DENPVVHFFKNIVTPRTPP) i syntetyczne peptydy odpowiadające sekwencji amino kwasowej 308-322 (sekwencja 18IIIb) gp120IIIb, wytworzono stosując syntezę peptydów na podłożu stałym z użyciem syntezatora Applied Biosystems 430A. Aminokwasy sprzęgano przez uprzednio wytworzone bezwodniki symetryczne z wyjątkiem asparaginy, glutaminy i argininy które wiązano jako estry hydroksybenzotriazolu. Efektywność sprzęgania monitorowano reakcją ninhydrynową w oparciu o metodę Kaisera i in., 34 Anal. Biochem. 595, 1970. Peptydy uwalniano z podłoża przy użyciu HF, w oparciu o procedurę określaną jako „low-high opisaną przez Tam i in., 21 J. Am. Chem. Soc. 6442, 1983 zaś peptydy ekstrahowano z żywicy 10% kwasem octowym. Po liofilizacji, peptydy wysalano na kolumnie Sephadex G-25, zaś próbki peptydów oczyszczano przez HpLc, metodą chromatografii z odwróconymi fazami na kolumnie preparatywnej Vydac C-18. Oczyszczone peptydy (98%) solubilizowano w HBSS w stężeniu końcowym 10 mg/ml i rozcieńczano do pożądanego stężenia w kompletnej pożywce.

Trawienie CNBr

Próbki białka (np. β-galaktozydazy) traktowano 100-krotnym nadmiarem molarnym bromku cyjanu w roztworze 100 mM kwasu trifluorooctowego. Reakcję prowadzono przez 18 godzin w temperaturze pokojowej (około 20°C) przy wirowaniu. Po przepisanym czasie, fragmenty peptydowe oddzielono od składników reakcji stosując aparat SEP-PAK C-18 (Waters), eluowano 95% acetonitrylem i liofilizowano.

Trawienie alkaliczne

Próbki białka (np. β-galaktozydazy) traktowano 1 N NaOH i gotowano przez 2 minuty, zaś powstałe fragmenty peptydowe oddzielono od składników reakcji stosując aparat SEPPAK C-18 (Waters), eluowano 95% acetonitrylem i liofilizowano.

Przykład 1: Wyzwalanie CTL w kontekście klasy I

Moore i in., 113 UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. 1989 i Carbone i Bevan, 171 J. Exp. Med. 377, 1990, wykazali, że myszy immunizowane splenocytami o cytoplazmach wypełnionych rozpuszczalną ova, były uczulone swoiście wobec ova odpowiedzią CTL w kontekście klasy I. Do pobudzania in vitro uczulonych in vivo limfocytów śledzionowych jak również jako cele do swoistego wobec ova niszczenia przez CTL zastosowano transfektanty EG7-ova, ekspresjonujące ova EL4. Badanie to pokazało również, że efektory CD8+ indukowane przez transfektanty ova albo splenocyty z cytoplazmą upakowaną ova, rozpoznaj ą determinantę mapowaną przez peptyd ova 258-276 w kontekście H-2K^b, niszczą EG7-ova jak również niszczą komórki EL4 opłaszczone przez ova 258-276. Tak więc, w celu określenia czy endogenny szlak limfocytów T CD8+ rozpoznających w kontekście klasy I może być indukowany antygenem rozpuszczalnym, powyższy układ zastosowano do określenia, czy pewne formulacje dla antygenu mogą być zastosowane do skierowania rozpuszczalnego antygenu na szlak rozpoznawania w kontekście klasy I.

a) ova

Myszy C57BL/6 immunizowano jeden raz różnymi ilościami ova (30 pg - 1 mg na mysz) z lub bez formulacji dla antygenu. Myszy nastrzykiwano podskórnie oraz u podstawy ogona. Splenocyty pobrano od immunizowanych myszy przynajmniej dwa tygodnie po immunizacji i pobudzano in vitro transfektantami EG7-ova. Stężenie ova równe 30 pg było równie skuteczne jak dawka 1 mg. Stąd, badania CTL były rutynowo wykonywane ze splenocytami od myszy uczulanych dawką 30 pg ova. Po pięciu dniach hodowli in vitro z EG7-ova, badano uczulenie przez obecność swoistych dla ova efektorów zdolnych do niszczenia EG7-ova.

Myszy nastrzyknięte rozpuszczalną ova w HBSS w dawce 1 mg nie wykazywały śladów uczulenia CTL (fig. 1A). Jednakże, myszy immunizowane 30 pg ova w formulacji dla

183 954 antygenu opisanej powyżej (pokazane na figurach jako AF) wykazywały znaczną odpowiedź CTL swoistą wobec transfektantów (fig. 1C). Ponadto, wielkość niszczenia EG7-ova przez swoiście immunizowane splenocyty była porównywalna z obecną u myszy immunizowanych splenocytami wypełnionymi ova (fig. 1B).

Swoistość antygenową uczulenia CTL in vivo wykazano przez brak u myszy immunizowanych β-galaktozydazą splenocytów wykazujących wtórną odpowiedź CTL in vitro podczas pobudzania EG7-ova. Nie obserwowano indukcji CTL swoistych wobec ova.

b) (egalaatooydaaa

Podobne wyniki uzyskano przy zastosowaniu innego rozpuszczalnego antygenu białkowego, β-gal. W celu zbadania odpowiedzi CTL swoistej wobec β-gal, zastosowano jako cel transfektanty C3-4 ekspresjonujące β-gal, uzyskane od BALB/c. Immunizacja myszy BALB/c rozpuszczalną β-gal dawała odpowiedź CtL na poziomie tła. Stąd, w celu oznaczenia swoistej odpowiedzi CTL zbieranie limfocytów śledzionowych odłożono o przynajmniej osiem tygodni po czym hodowano je przez 5 dni w obecności napromieniowanych transfektantów C3-4.

Figura 2B pokazuje, że 30 pg β-galaktozydazy w AF indukuje silną odpowiedź CTL swoistą wobec transfektantów. Przy stosunku efektorów do celów (E:T) równym 3:1, myszy immunizowane β-gal-AF wykazywały około 80% niszczenia swoistego wobec C3-4. Jednakże, tylko 20% niszczenia swoistego wobec tych samych celów uzyskano stosując komórki efektorowe izolowane od myszy immunizowanych β-gal w HBSS przy tym samym stosunku E:T (fig. 2A). Ponieważ ani EL4, ani P815 nie ekspresjonują produktu genu MHC klasy II zaś liza wykazuje restrykcję syngeniczną, te swoiste wobec ova i β-gal komórki efektorowe rozpoznają w kontekście MHC klasy I.

W celu wykazania przydatności formulacji dla antygenu, myszy immunizowano rozpuszczalną ova zamkniętą w dwóch rodzajach liposomów, z których jeden typ był wrażliwy na pH. Tydzień później, splenocyty pobudzano in vitro, jak to opisano wyżej, i badano wobec EG7-ova albo EL4 znakowanym ^5lCr. Figura 3 pokazuje reprezentatywne wyniki pokazujące, że ova w liposomach może nie uczulać myszy w kierunku wyraźnej odpowiedzi CTL. Podobne wyniki obserwowano gdy immunizowano myszy ova w alumie.

Przykład 2: Rozpoznawanie epitopu przez CTL

Carbone i Bevan, wyżej, wykazali, że CTL indukowane u myszy C57BL/6 przez transfektanty EG7-ova oraz przez splenocyty o cytoplazmach wypełnionych ova, rozpoznają komórki EL4 opłaszczone peptydem ova 258-276. W celu stwierdzenia, czy rozpuszczalna owalbumina w AF wywołuje podobną odpowiedź CTL, od immunizowanych myszy pobrano splenocyty i pobudzano in vivo EG7-ova. Efektory badano wobec komórek EL4 opłaszczonych peptydem ova 258-276 albo peptydem kontrolnym uzyskanym z zasadowego białka mieliny (MBP 84-102). Wyniki pokazują, że ova-AF uczulała CTL z podobną swoistością co wywołana przez transfektanty, albo komórki o cytoplazmie wypełnionej ova (fig. 1A, 1B i 1C). Komórki efektorowe uczulane ova-AF skutecznie niszczyły EG7-ova oraz nie transfekowane komórki EL4 opłaszczone ova w ilości 50 pg/10⁸ komórek, ale nie niszczyły komórek EL4 opłaszczonych peptydem MBP w ilości 50 gg/10⁶ komórek.

W układzie β-galaktozydazy, Carbone i Bevan, wyżej, wykazali, że transfektant ekspresjonujący β-gal i spenocyty wypełnione rozpuszczalną β-gal indukują CTL, które niszczą transfektanty ekspresjonujące β-gal i nietransfekowane komórki P815 opłaszczone produktem alkalicznego trawienia β-galaktozydazy. Rozpuszczalna β-galaktozydaza wywoływała CTL o podobnej swoistości gdy immunizowano niż w AF (fig. 2).

Przykład 3: efektory CTL są limfocytami T CD8+

Indukcję efektorowych limfocytów T CD8+ przez rozpuszczalny antygen w AF wykazano w poniższy sposób. Splenocyty od immunizowanych myszy hodowano in vitro przez 5 dni wraz z napromieniowanymi transfektantami. Następnie, komórki zebrano i pozbawiono limfocytów CD4+ albo CD8+ stosując odpowiednio, przeciwciała monoklonalne przeciwko CD4 albo przeciwko CD8 z dodatkiem dopełniacza. Populacje tak traktowane badano następnie w układzie ova wobec ^5ICr-EGY-ova albo układzie β-gal wobec ^5lCr-P13.1. Dane pokazane na fig. 4 wskazują, że w układzie ova usunięcie limfocytów T CD8+ usuwa aktywność

183 954 cytolityczną wykazywaną przez pełną populację efektorową. Jednakże, usunięcie populacji limfocytów T CD4+ nie wykazuje wpływu na niszczenie EG7-ova.

Podobnie, w układzie β-gal, usunięcie limfocytów T CD8+ zniosło aktywność cytolityczną splenocytów immunizowanych formulacjjądla antygenu z β-gal.

Przykład 4: Rozpuszczalna ova w AF uczula limfocyty T CD8+

W celu wykazania, że ova-AF uczula populacje limfocytów T CD8+ in vivo, i jest kluczowa dla wtórnej odpowiedzi in vitro, populacje CD4+ albo CD8+ usunięto ze śledzion myszy immunizowanych ova-AF oraz myszy naiwnych. Tak traktowane populacje były następnie pobudzane in vitro samą ova-AF, albo w kombinacji z limfocytami T CD4+ i CD8+ od myszy immunizowanych ova-AF, albo w różnych kombinacjach limfocytów CD4+ albo CD8+ od myszy immunizowanych ora-AF z limfocytami T CD4+ albo CD8+ od myszy naiwnych. figura 5 pokazuje, że uczulone limfocyty CD8+ są kluczowe dla wywołania wtórnej odpowiedzi CTL in vitro. Dane te wskazują również, że dla skutecznej wtórnej odpowiedzi CTL in vitro nie są konieczne limfocyty T CD4+. Limfocyty CD4+ nie są konieczne do uczulenia. Podobnie, limfocyty T CD8+ były konieczne do wywołania wtórnej odpowiedzi CTL in vitro swoistej wobec β-gal.

Powyższy przykład pokazuje wpływ formulacji dla antygenu na indukcję odpowiedzi CTL w kontekście klasy I przeciwko rozpuszczalnemu antygenowi białkowemu. Formulacja dla antygenu indukowała uczulenie CTL rozpuszczalnym antygenem o podobnej aktywności co indukowana przez transfektanty albo splenocyty o cytoplazmach wypełnionych rozpuszczalną ova albo β-gal. W układzie owalbuminy, EG7-ova, splenocyty wypełnione ova i ovaAF indukowały: (a) CD8+ CTL w kontekście klasy I; (b) CTL rozpoznające cele uwrażliwione syntetycznym peptydem ova 253-276; i (c) długotrwałe CTL po tylko jednej immunizacji. W układzie β-galaktozydazy, β-gal-AF indukowała CTL, które rozpoznawały transfektant C3-4 ekspresjonujący β-gal, jak również nietransfekowane komórki P815 uwrażliwione produktem trawienia alkalicznego β-gal. Jest to analogiczne do tego, co było obserwowane z CTL indukowanymi przez immunizację splenocytami o cytoplazmach wypełnionych β-galaktozydazą. Indukcja CTL swoistych wobec ova przez formulację dla antygenu jest unikalna, ponieważ ani ova zamknięta w liposomach wrażliwych na pH, ani w alumie nie potrafiła indukować uczulenia CTL in vivo.

Przykłady te wskazują że zastosowana wyżej formulacja dla antygenu i jej równoważniki są przydatne w terapii człowieka oraz w opracowywaniu szczepionek do wywoływania CTL przeciwko różnym chorobom wirusowym i nowotworowym.

Przykład 5:

Jest to konkretny przykład mający na celu pokazanie zastosowania powyższej AF do wywołania uczulenia CTL w kontekście klasy I przez rozpuszczalną gp120 HIV.

Linię komórkową ekspresjonującą gp160 IIIB (15-12) uzyskano w oparciu o linię komórek 3T3 uzyskaną z fibroblastów Balb/c. Otrzymano ją od Dr Rona Germaina i Jay'a Berzofsky'ego, National Institutes of Health, Bethesda, MD. Linię komórkową ekspresjonującą gp160 zastosowano do pobudzania in vitro uczulonych in vivo limfocytów śledzionowych, jak również zastosowano ją jako cel do indukcji CTL swoistych wobec gp160. Myszy Balb/c immunizowano jednokrotnie stosując 10 pg gp160 na mysz, z albo bez Af. Myszy nastrzykiwano w poduszeczkę łapy i podskórnie w nasadę ogona. Splenocyty pobrano od immunizowanych myszy po dwóch tygodniach po i pobudzano in vitro napromieniowanymi transfektantami gp160. Po 5 dniach hodowli in vitro uczulenie oceniano przez wykazanie obecności efektorów zdolnych do niszczenia transfektantów gp160, a nie nietransfekowanych kontroli. Wyniki pokazano na fig. 7, gdzie odpowiedź CTL jest wzmożona przez AF z gp120.

Poniższy przykład pokazuje zastosowanie formulacji dla antygenu według wynalazku przy zastosowaniu tylko jednego albo dwóch składników. Przykłady te pokazj że odpowiedź CTL może być indukowana przy użyciu tylko dwóch spośród trzech składników.

Przykład 6: Oznaczanie składników kluczowych, niezbędnych do indukcji CTL

W celu określenia czy wszystkie spośród zaznaczonych powyżej składników są niezbędne do indukcji CTL swoistych wobec antygenu, myszy immunizowano owalbuminą

183 954 w mikrofluidyzowanej formulacji różnych kombinacji dwóch albo trzech składników przedstawionych w powyższej AF. Zastosowano poniższe kombinacje dwuskładnikowe; Skwalan/TWEEN w PBS, Skwalan/Pluronic w PBS albo Pluronic/TWEEN w PBS. Włączono dodatkowy zestaw grup w których myszy immunizowano ova w postaci układu jednoskładnikowego, tj. Skwalanu w PBS, Pluronic w PBS albo TWEEN w PBS. Powyższe trójskładnikowe formulacje dla antygenu zostały zmodyfikowane w taki sposób, że jednocześnie były wyłączane pojedyncze składniki, z wprowadzeniem na ich miejsce PBS.

Powyższe formulacje dla antygenu składały się z: 0,300 g monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu (Aldrich, WI), 1,875 g Pluronic L121 (BASF, NJ) i 7,5 g Squalane (Aldrich, WI) w PBS do objętości 50 ml.

Dwuskładnikowe formulacje składały się z: Squalane/TWEEN: 0,300 g monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu, 7,5 g Squalane, w PBS do objętości 50 ml.

Pluronic/TWEEN: 1,875 g Pluronic L121, 0,300 g monooleinianu polioksyetylenosorbitanu, w PBS do objętości 50 ml.

Pluronic/Squalane: 1,875 g Pluronic L121, 7,5 g Squalane, w PBS do objętości 50 ml.

Próbki poddano obróbce w urządzeniu do mikrofluidyzacji, model 110T, Microfluidics Corp., butelkowano i przechowywano w 4°C do momentu zastosowania.

Owalbuminę (Sigma, MO) ważono i doprowadzono do stężenia 0,3 mg/ml w HBSS (Whittaker, wyżej). Roztwór wyjściowy 0,3 mg/ml połączono z dwuskładnikową formulacją w następujących ilościach: 5 części roztworu owalbuminy 0,3 mg/ml, 3,3 części formulacji dwuskładnikowej i 1,7 części HBSS.

Formulację zmieszano i trzymano na lodzie do momentu wstrzyknięcia. Wszystkie roztwory połączono tuż przed wstrzyknięciem.

Każda mysz otrzymała 200 μΐ jednej z formulacji zawierającej 30 μΐ OVA, we wstrzyknięciu w poduszeczki obu tylnych łap zaś resztę roztworu wstrzyknięto podskórnie w nasadę ogona. Myszy przed pobraniem śledzion pozostawiono na dwa do czterech tygodni.

Dwa tygodnie po immunizacji, wypreparowano splenocyty i pobudzano in vitro napromieniowanymi EG7-OVA. Po pięciu dniach hodowli obecność CTL swoistych wobec OVA mierzono wobec ⁵¹Cr-EGY-OVA albo ^5ICr-EL4 w 4-godzinnym teście uwalniania ⁵¹Cr. Dane pokazane na Fig. 8-10 pokazują, że owalbumina w postaci mikrofluidyzowanego układu dwuskładnikowego może uczulać CTL swoiste wobec OVA in vivo.

Badano dalej względny wpływ pojedynczych składników na ich zdolność do pobudzania CTL, w połączeniu z antygenami białkowymi. Dla celów immunizacji, rozpuszczalny antygen mieszano z mikrofluidyzowanym wypełniaczem w celu uzyskania stabilnej homogennej emulsji o wielkości cząsteczek zawierającej się od 250 do 300 nm. W celu dalszego określenia składników formulacji Squalane-monooleinian polioksyetyleno-sorbitanu -Pluronic (STP) odpowiedzialnych za indukcję CTL, immunizowano myszy ova w mieszaninie Squalan-monooleinian polioksyetyleno-sorbitanu (ST), Pluronic-monooleinian polioksyetylenosorbitanu (T) albo Squalane-Pluronic (SP) i jako kontrola w Squalane (S), monooleinianie polioksyetyleno-sorbitanu (T) albo w Pluronic (P). Myszy immunizowano również ovaSAFm (zawierającą 70 μg MDP) albo ova-alum jako kontrola adiuwantu. Jako kontrolę pozytywną myszy immunizowano splenocytami o cytoplazmach wypełnionych rozpuszczalną ova. Zastosowano również inne kombinacje i zastąpienia, zaś wyniki przedstawiono w tabeli 1.

W badaniach uczulania CTL myszy immunizowano jednokrotnie. Dwa tygodnie po immunizacji splenocyty zmieszano z napromieniowanymi EG7-ova (komórkami EL4 ekspresjonującymi ova) na pięć dni i badano wobec komórek ^5lCr-EG7-ova albo ⁵¹Cr-EL4. Wyniki (fig. 11) pokazują że 30 μg ova w połączeniu z STP albo ST, uczula odpowiedź CTL w kontekście klasy I u myszy. Uczulenie CTL swoistych wobec ova przez ova w STP albo w ST wydaje się być lepsze niż wywołane przez splenocyty o cytoplazmach wypełnionych rozpuszczalną. ova. Ova w PT albo w SP może wywołać odpowiedź CTL swoistą wobec ova u myszy, ale słabo i nie w powtarzalny sposób. W przeciwieństwie do SAFm, dodanie MDP do formulacji ST nie zakłóca odpowiedzi CTL swoistej wobec ova u myszy (tabela 2). Nie stwierdzono indukcji CTL swoistych wobec ova gdy myszy immunizowano ova zmieszaną z pojedynczymi składnikami S, T albo P, ani u myszy immunizowanych ova-SAFm albo ova16

183 954 alum. Myszy immunizowane 1 mg ova w (a) HBSS, (b) w SAFm albo (c) adsorbowane na alumie nie wywoływały CTL swoistych wobec ova.

Tabela 2

Indukcja odpowiedzi CTL swoistej wobec ova nie jest blokowana przez ST+MDP

	% cytotoksyczności u myszy immunizowanych
Stymulator	Cel	E:T	Ova-ST	Ova-ST	ova-ST- -MDP-300 pg/mysz	ova-ST- -MDP-72 pg/mysz
EG7-ova	EG7-ova	100:1	0	100	82	76
		33:1	0	86	67	62
		11:1	0	33	39	25
		3:1	0	6	13	3
		1:1	0	0	0	0
		3:1	0	0	0	0

* myszy immunizowano 30 pg ova w różnych formulacjach % cytotoksyczności obliczono przez odjęcie procentu niszczenia wobec linii komórkowych nie ekspresjonujących antygenu.

Przykład 7: Składniki niezbędne do wytwarzania przeciwciał swoistych wobec ova Myszy immunizowano trzykrotnie w odstępach 2-tygodniowych 30 pg ova w HBSS,

STP, ST, PT albo SP. Jako kontrolę pozytywną myszy immunizowano również ova-SAFm, ponieważ wiadomo, że SAFm wywołuje silną odpowiedź przeciwciał. Siedem dni po drugiej i trzeciej immunizacji, myszom pobierano krew i badano surowice pod kątem odpowiedzi przeciwciał swoistej wobec ova. Wyniki pokazano na tabeli 3. Wskazują one, że myszy immunizowane ova w STP, ST albo w SAFm wykazują podobne odpowiedzi przeciwko ova po dwóch immunizacjach.

Tabela 3.

Indukcja odpowiedzi przeciwciał przeciwko ova

30 pg formulacji ova/zwierzę	Liczba myszy odpowiadających/liczba myszy nastrzykniętych	ł/rozcieńczenie miano surowic
HBSS	0/3	< 1/20, < 1/20, < 1/20
STP	3/3	<1/4860, >1/4860,<1/4860
ST	3/3	>1/4860, >1/4860,>1/4860
PT	NA	NA, NA, NA
SP	NA	NA, NA, NA
SAFm	3/3	1/4860,1/4860,1/4860

* NA; dane nie dostępne

Przykład 8: Indukcja CTL swoistych wobec gp120 HIV gp120 IIIb HIV zastosowano jako drugi układ antygenowy w celu określenia indukcji CTL w STP, ST albo MP-T. Myszy immunizowano 1 pg gp120 IIIb w HBSS, STP, PT albo w ST. Jako kontrolę, myszy immunizowano 1 pg gp120 IIIb w SAFm albo cFa (kompletny adiuwant Freunda) albo w układzie adiuwantu RIBI zawierającym MPL (monofosforylo-lipid A) i TDM (dimykolan trehalozy). Trzy tygodnie po immunizacji, splenocyty wypreparowano i pobudzano in vitro traktowanymi mitomycyną transfektantami 15-12 albo peptydem 18IIIb. Po pięciu dniach hodowli, powstałe komórki efektorowe badano wobec komórek P815 zakażonych wirusem krowianki: gp160IIIb albo rodzicielskich komórek zakażonych wirusem krowianki, służących jako cel. Wyniki wskazują, że formulacja gp120-Squalanemonooleinian polioksyetyleno-sorbitanu, nie zaś formulacja gp120-Squalane-monooleinianu polioksyetyleno-sorbitanu albo gp120-HBSS wywołuje odpowiedź CTL swoistą wobec gp120 u myszy (tabela 4).

183 954

Tabela 4

	% cytotoksyczności u myszy immunizowanych*
Stymulator	Cel	E:T	gp120-HBSS	gp120-ST	gp120-STP
18IIIb/IL2	vac:gp120	100:1	23	42	NA***
		33:1	23	38	NA
		11:1	0	0	NA
		3:1	0	35	NA
18IIIb/IL2	15-12	100:1	0	50	0
		33:1	0	35	0
		11:1	0	27	0
		3:1	0	18	0
18IIIb/IL2	3T3+18IIIb	100:1	0	59	13
		33:1	0	59	2
		11:1	0	57	0
		3:1	0	29	0
15-12	vc:gp120	100:1	35	84	NA
		33:1	19	65	NA
		11:1	12	37	NA
		3:1	0	22	NA
		1:1	0	0	NA

* myszy immunizowano 1 ąg gp120III w różnych formulacjach ** % cytotoksyczności obliczono przez odjęcie procentu niszczenia linii komórkowych nie ekspresjonujących antygenu *** NA; dane nie dostępne

Przykład 9: Indukcja odpowiedzi humoralnej swoistej wobec gp120 u myszy W celu indukcji odpowiedzi humoralnej swoistej wobec gp120 myszy immunizowano pg gp120IIIb trzykrotnie w odstępach dwutygodniowych. Zwierzętom pobierano krew i badano na obecność przeciwciał IgG wykrywających gp120IIIb w teście ELISA na podłożu stałym. Wyniki pokazują, że gp120-ST jest lepszym immunogenem niż gp120-HBSS, gp120SAFm (tabela 5) albo gp120-STP.

Tabela 5

Indukcja odpowiedzi przeciwciał przeciwko gp120

1 ąg formulacji gp120/zwierzę	Liczba myszy odpowiadających/liczba nastrzykniętych	1/rozcieńczenie miano surowic
HBSS	0/3	<1/20, <1/20, <1/20
STP	1/3	<1/20,>1/4860,<1/20
ST	3/3	> 1/4860,> 1/4860,>1/4860
PT	3/3	>1/4860,>1/4860,>1/4860
SP	2/3	<1/20, 1/540, 1/540
SAFm	2/3	1/180,>1/4860, 1/540

Przykład 10: Odpowiedź przeciwciał swoista wobec gp120 u małp

Małpy (po dwie na grupę) immunizowano gp120-SAFm, gp120-SPT, gp120-ST albo gp120-HBSS. Jako kontrola, grupę małp immunizowano rekombinowanym wirusem krowianki zawierającym gp160IIIb. Małpy immunizowano w odstępach dwutygodniowych i pobierano im krew w dwa i trzy tygodnie po drugiej immunizacji. Surowice z przed immunizacji i po immunizacji od każdej z małp rozcieńczano seryjnie i badano pod kątem aktywności wobec gp120 w teście ELISA jak to opisano w Materiałach i Metodach. Dane (fig. 12) pokazują, że małpy immunizowane gp120-STP albo gp120-SAFm odpowiadały podobnie na immuniza18

183 954 cje. Jedna z małp immunizowana gp120-ST, odpowiedziała przeciwko gp120 podobnie jak grupa immunizowana gp120-SAFm albo gp120-SPT. Jedna z małp immunizowana gp120-ST nie odpowiedziała silnie na gp120 po dwóch immunizacjach.

Przykład 11: Aktywność in vivo AF w kombinacji z HPV 16 E7

1. Wytworzenie rekombinowanego białka HPV16 E7 do immunizacji

a) PCR i klonowanie genu E7

Gen HPV16 E7 klonowano z plazmidu uzyskanego od Dr Karen Vousden (Ludwig Institute) kodującego gen E7 uzyskany z linii komórkowej nowotworu CaSki. Region kodujący amplifikowano przez PCR stosując startery kodujące końce 5' i 3' genu flankowane przez miejsca klonowania BamHI i SalI. Produkt PCR E7 ligowano do wektora ekspresyjnego pGEX-4T-1 (Pharmacia Biotech) otrzymując plazmid ekspresyjny pGEX.E7. Szczep E. coli XL1-blue (Stratagene) transfekowano plazmidem ekspresyjnym pGEX.E7. Uzyskano sekwencję E7 z plazmidu z powstałych kolonii i była ona identyczna z sekwencją E7 uzyskaną z komórek CaSki.

b) Wytwarzanie i oczyszczanie E7 ekspresjonowanego w bakteriach

Plazmid ekspresyjny pGEX.E7 kodował białko fuzyjne transferazy S glutationu (GST) zbudowane z GST na końcu aminowym, miejsca cięcia trombiny i białka E7 na końcu karboksylowym. Białko E7 było wytwarzane i oczyszczane jak to opisano w literaturze dołączone przez producenta wektora pGEX-ET-1 (Pharmacia Biotech). Pokrótce, bakterie zawierające plazmid ekspresyjny pGEX.E7 indukowano do ekspresji białka fuzyjnego przez dodanie izopropylo-D-tiogalaktozydazy do pożywki hodowlanej. Komórki zebrano i poddano lizie przez delikatną sonikację. Lizat wprowadzono do kolumny Glutathione Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Po związaniu się białka z matrycą, żywicę płukano w celu usunięcia białka związanego nieswoiści. Związane białko trawiono trombiną w celu uwolnienia białka E7 z fuzji z GST.

Preparat białka E7 analizowano przez SDS-PAGE i oznaczano jego stężenie analizą Bradforda (BioRad). Z litra hodowli bakterii uzyskano 9 mg rozpuszczalnego białka E7.

2. Tworzenie transfektanta E7 X21

Sekwencję kodującą białko HPV16 E7 (patrz wyżej) wprowadzono do eukariotycznego plazmidu ekspresyjnego INPEP4, stanowiącego własność IDEC. W tym wektorze, ekspresja E7 kontrolowana jest przez element transkrypcyjny promotora/wzmacniacza wirusa cytomegalii. Oprócz tego, pierwsze trzy nukleotydy sekwencji kodującej E7 usunięto i zastąpiono sekwencją liderową łańcucha lekkiego immunoglobuliny, położona bezpośrednio powyżej i w jednej ramce z regionem kodującym E7. Po transfekcji do mysiej linii komórkowej X21 badano pojedyncze klony oporne na G418 analizą metodą northern blot, w kierunku obecności sygnału E7. Każdy z klonów wykazywał wykrywalny sygnał E7. Przeprowadzono analizę metodą western blot lizatów komórkowych z dwóch spośród tych klonów, 4E7 i 1C7 (odpowiednio, HOPE1 i HOPE2) i stwierdzono produkcję białka E7.

3. Aktywność in vivo immunizacji rozpuszczalnym antygenem E7/AF

Do doświadczeń użyto samic myszy podłoża C3H (H2^k/^f, Harlan Spraque Dawley). Zwierzęta trzymano według wytycznych „Guide fot the Care and Use of Laboratory Animals (publikacja DHHS nr NIH 86-23, Bethesda, MD:NIH, 1985) z pełnym dostępem do wody i pożywienia. Nowotworową linię komórkową utrzymywano w kolejnych pasażach in vitro.

Linia komórkowa utrzymywała ekspresję cytoplazmatyczną antygenu E7, co wykryto analizą western blot, po kolejnych pasażach in vitro. Wzrost nowotworu u syngenicznych myszy C3H zapoczątkowano przez wstrzyknięcie podskórne 150000 komórek pasażowanych in vitro.

Guzy mierzono w 2 kierunkach w odstępach dwutygodniowych. Objętość guzów (V) obliczano w oparciu o poniższy wzór:

V (mmj=(LxW) podzielone przez 2 gdzie:

L= najdłuższy wymiar podłużny w mm

W= wymiar w osi poprzecznej w mm

183 954

Dane na tabeli 6 przedstawiono jako liczba myszy z guzem (liczba zwierząt z guzem w stosunku do zwierząt nastrzykniętych). Dane na fig. 13 i 14 są przedstawione jako mediana wielkości guza (mm³) każdej z grup leczonych albo kontrolnych. Każdą z grup leczonych porównywano z kontrolą nie otrzymującą żadnego leczenia. Leczenie rozpoczęto 10 dni powszczepieniu komórek HOPE2, kiedy większość z guzów była wyczuwalna palpacyjnie (około 50-75 mm³). Leczenie zapoczątkowano przez immunizację myszy rozpuszczalnym białkiem E7 w adiuwancie AF albo alumie (podskórnie w objętości całkowitej 0,2 ml). Bezpośrednio przed immunizacją AF zmieszano przez 60 sekund z białkiem E7 w buforowanym roztworze soli Hank'a (HBSS) tak, że każda z myszy otrzymała 30 pg albo 90 pg białka E7 w 0,2 ml. Alum (Pierce Chemical Co.) zmieszano z białkiem E7, według instrukcji producenta, tak, że każde ze zwierząt otrzymało 90 pg białka E7 w 0,2 ml na mysz. Zwierzęta w drugiej grupie leczonej otrzymały drugą immunizację 9 dni później (19 dni po wszczepieniu komórek nowotworowych). Immunizację przypominającą przygotowano bezpośrednio przed szczepieniem, jak to opisano wyżej.

W tym przykładzie (tabela 6: Xp #233), 41 dni po wszczepieniu komórek nowotworowych tylko 4/8 i 5/8 myszy otrzymujących pojedyncze wstrzyknięcie rozpuszczalnego E7 w AF (odpowiednio, 30 pg albo 90 pg) wykazywało mierzalny guz. W przeciwieństwie, wszystkie spośród myszy immunizowanych białkiem E7 w alumie (8/8) miało aktywnie rosnące nowotwory. Oprócz tego, jak to pokazano na fig. 13, znaczące zahamowanie wzrostu guza obserwowano wyłącznie w grupach leczonych immunizowanych białkiem E7 w AF w porównaniu z kontrolą (nie leczoną) albo grupami otrzymującymi leczenie w alumie. Zahamowanie wzrostu guza (fig. 13) albo zwiększone tempo regresji (tabela 6) nie były obserwowane u myszy, otrzymały pojedyncze wstrzyknięcie E7 w alumie.

Podobne wyniki obserwowano w grupach otrzymujących dwie immunizację w dniach 10 i 19 po podaniu nowotworu (tabela 6 i fig. 14), jakkolwiek pewne opóźnienie wzrostu guza obserwowano u myszy otrzymujących dwa wstrzyknięcia AF w alumie.

Wyniki wskazują, że znaczną aktywność przeciwnowotworową, mierzoną zmniejszoną liczbą myszy z guzem oraz zahamowaniem wzrostu nowotworu, obserwowano po immunizacji rozpuszczalnym E7 w AF. W przeciwieństwie, wszystkie zwierzęta immunizowane pojedynczą albo podwójną immunizacją rozpuszczalnego białka E7 w alumie miały rosnący nowotwór. Podsumowując, immunizacja rozpuszczalnym białkiem E7 w AF powodowała znaczące zahamowanie wzrostu komórek nowotworowych czego nie obserwowano stosując immunizację rozpuszczalnym E7 w alumie.

Tabela 6.

Aktywność przeciwnowotworowa immunizacji rozpuszczalnym E7 w adiuwancie

Dośw. Nr	Leczenie	Dawka (pg/mysz)	Zwierzęta z guzem*. Dzień 41
223	Kontrola	-	7/8
223	E7 w AF	30 pg x1	4/8
223	E7 w AF	90 pg x1	5/8
223	E7w AF	90 pg x1	8/8
223	E7 w AF	30 pg x2c	3/8
223	E7 w AF	90 pg x2	1/4
223	E7 w alumie	90 pg x2	8/8

a. Liczba myszy z guzem/całkowita liczba nastrzykniętych

b. Wszystkie immunizacje rozpoczęto dnia 10 po wszczepieniu

Inne wykonania ujęto w poniższych zastrzeżeniach.

183 954 % Cytotoxicity % Cytotoksyczności

fig. 2g

183 954

FIG. 4α

Ονα in HBSS Immunized a _ tmniunizowane ova w HBSS % Cytotoxicity % Cytotoksyczności

100

33:! 11:1 3:1 1:1

FIG. 4c

FIG. 4b

o

1:1

183 954

Limfocyty T CD8+ są komórkami efektorowymi

CD8 + T cells ore the Effector cells

Effector to target ratio _ Stosunek efektorów do celów fig. 6

183 954

Idox nasila indukcję CTL wywołaną gp12O Idox potentiates gp120 induced CTL induction

Effector ; Target EfektorzCel

183 954

Wpływ skwalanu/TUEEN na uczulanie CTL Effect of Squalone/Tween on CTL Priming % Cytotoxicity * Cytotoksyczności

Wpływ skwalanu/pluronic na uczulanie CTL

Effector : Target Efektor:Cel

183 954

Porównanie 30 ug ova w znanych adiuwantach 2- albo 3-składnikowych

Comparison of 30 ug 0VA in Custom 3 or 2 Component Adjuvants

FIG.

Efektor:Cel

Indukcja przeciwciał przeciwko gp12CIIIb u małp

Induction of anti-gp120IUb antibodies in monkeys

1/sera dilution

1/rozcieńczenie surowicy

FIG. 12

-B—· 854/SPT/2d 220/SPT/2d <— 207/ST/2d Θ— 222/ST/2d A— 720/SAFm/2d A— 722/SAFm/2d -X—- 225/HBSS/2d H- 208/HBSS/2d

183 954

Aktywność przeciwnowotworowa komórek H0PE2 popojedyncjej immunizacji (Dzień 10) rozpuszczalnym białkiem E7 w adiuwancie

Antitumor activity of H0PE2 Cells after a Single Immunization (Day 10) of Soluble E7 Protein in Adjuvont

Tumor Size (mm3) Wielkość guza

3000 —i-j-
		- 30/ΑΡ/1Χ
	—	- 90/AF/1X
	—B—	- 9O/ALUM/1X
	Δ	Control
2000 -	Kontrola J
1000 -
o -	—i—		ι»ηΑί8ι

15

FIG. I3

25 30 35 40

Days Post Implant

Dni dc wszczepieniu

183 954

Aktywność przeciwnowotworowa komórek H0PE2 po dwukrotnej immunizacji (Dzień 10, 1S) rozpuszczalnym białkiem E7 w adiu νθηο iθ

Antitumor Actiwity of H0PE2 Cells ofter o Two Immunizotions (Day 10, 19) of Soluble E7 Protein in Adjuvant

Tumor Size (mm3) Wielkość guza

Doys Post Implant

Dni po wszczepieniu fig. 14

183 954 fig. ia % Cytotoxicity % cytotoksyczności

100

33:1 11:1 3:1 1:1 % Cytotoxicity % Cytotoksyczności

10080fig. ib fig. ic

Ονα in HBSS immunized Immunizowane ova w HBSS

EL4 and EG7—Ονα

0va cytoplasmically loaded wypełnione cytoplazmatycznie ova

EG7-0va

ET

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (20)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Kompozycja do wywoływania swoistej reakcji odpornościowej limfocytów T cytotoksycznych przeciwko antygenowi po podaniu zwierzęciu wybranemu z grupy obejmującej człowieka, zwierzęta domowe i/lub hodowlane, znamienna tym, że obejmuje antygen wybrany z grupy obejmującej antygeny HIV, antygeny malarii, antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia wątroby typu B, antygeny wirusa grypy, antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia wątroby typu A, antygeny wirusów herpes, antygeny wirusa oddechowego oraz antygeny nowotworowe, zmieszany z mikrofluidyzowaną formulacją dla antygenu obejmującą:

   a) detergent stabilizujący;

   b) czynnik tworzący micelle; i

   c) ulegający rozkładowi biologicznemu i biokompatybilny olej, przy czym formulacja dla antygenu jest wytworzona jako stabilna emulsja olej w wodzie, jest zasadniczo wolna od jakiegokolwiek immunostymulującego czynnika peptydowego.
2. 2. Kompozycja do wywoływania swoistej reakcji odpornościowej limfocytów T cytotoksycznych przeciwko antygenowi po podaniu zwierzęciu wybranemu z grupy obejmującej człowieka, zwierzęta domowe i/lub hodowlane, znamienna tym, że obejmuje antygen wybrany z grupy obejmującej antygeny HIV, antygeny malarii, antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia wątroby typu B, antygeny wirusa grypy, antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia wątroby typu A, antygeny wirusów herpes, antygeny wirusa oddechowego oraz antygeny nowotworowe, zmieszany z mikrofluidyzowaną formulacją dla antygenu obejmującą:

   a) detergent stabilizujący;

   b) czynnik tworzący micelle; i

   c) ulegający rozkładowi biologicznemu i biokompatybilny olej, przy czym formulacja dla antygenu jest wytworzona jako stabilna emulsja olej w wodzie, jest pozbawiona jakiegokolwiek immunostymulującego czynnika peptydowego.
3. 3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że antygen jest z grupy obejmującej antygeny HIV: gp160, gag, pol, Nef, Tat i Rev; antygeny malarii: białka CS i białka 2 powierzchni sporozoitów; antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia wątroby typu B: Pre-S1, Pre-S2, HbcAg i HbeAg; antygeny wirusa grypy: HA, NP i NA; antygeny powierzchniowe wirusa zapalenia wątroby typu A; antygeny wirusów herpes: EBV gp340, EBV gp85, HSV gD, HSV gH, wczesnego produktu białkowego HSV, gB wirusa cytomegalii, gH wirusa cytomegalii i białka IE gp72; antygeny wirusa oddechowego: białka F, G i N oraz antygeny nowotworowe: CEA, mucyny związanej z rakiem, antygeny P21, P53, antygeny czerniaka MPG, p97 i produktu onkogenu nowotworowego Neu, rakowego produktu genu p53 i zmutowanego białka Ras p21.
4. 4. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że formulacja dla antygenu jest nietoksyczna dla ludzi i zwierząt domowych albo hodowlanych.
5. 5. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że detergent stabilizujący wybrany jest z grupy obejmującej monooleinian polioksyetyleno-sorbitanu, monolaurynian polioksyetyleno-sorbitanu, monopalmitynian polioksyetyleno-sorbitanu, monostearynian polioksyetyleno-sorbitanu, Zwittergent 3-12, Teepol HB7 i trioleinian sorbitanu.
6. 6. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera detergent w ilości w zakresie od ok. 0,05% do 0,5%.
7. 7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że ilość detergentu wynosi ok. 0,2%.
8. 8. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera czynnik tworzący micelle charakteryzujący się równowagą hydrofilowo-lipofilową w zakresie od 0 do 2.
9. 9. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że czynnik tworzący micelle wybrany jest z grupy obejmującej polioksamer 401, Pluronic L62LF, Pluronic L101, Pluronic

   183 954

   L64, PEG 1000, Tetronic 1501, Tetronic 150R1, Tetronic 701, Tetronic 901, Tetronic 1301 i Tetronic 130R1.
10. 10. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera czynnik tworzący micelle w ilości od ok. 0,5% do ok. 10%.
11. 11. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że ilość czynnika tworzącego micelle wynosi od ok. 1,:25% do ok. 5%.
12. 12. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że olej wykazuje temperaturę topnienia niższą niż 60°C.
13. 13. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że olej jest wybrany z grupy obejmującej skwalen, skwalan, eikozan, tetratetrakontan, pristan, glicerynę i oleje roślinne.
14. 14. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera olej w ilości od ok. 1%dook. 10%.
15. 15. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że ilość oleju wynosi od ok. 1,5% do ok. 5%.
16. 16. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera mniej niż 20 pg dipeptydu muramylowego na dawkę.
17. 17. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że nie zawiera w ogóle dipeptydu muramylowego.
18. 18. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że jako detergent zawiera monooleinian polioksyetyleno-sorbitanu, zaś czynnikiem tworzącym micelle jest Polioksamer 401.
19. 19. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że jako olej zawiera skwalan.
20. 20. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że detergent wybrany jest z grupy obejmującej monolaurynian polioksyetyleno-sorbitanu, monopalmitynian polioksyetyleno-sorbitanu, monostearynian polioksyetyleno-sorbitanu; olej wybrany jest z grupy obejmującej skwalan, eikozan i pristan, zaś czynnik tworzący micelle wybrany jest z grupy obejmującej Pluronic L62LF i Polioksamer 401.