TW487575B

TW487575B - Pharmaceutical composition for induction of cytotoxic T-lymphocyte responses

Info

Publication number: TW487575B
Application number: TW84113021A
Authority: TW
Inventors: Syamal Raychaudhuri; William H Rastetter
Original assignee: Idec Pharma Corp
Priority date: 1994-12-07
Filing date: 1995-12-07
Publication date: 2002-05-21
Also published as: SI9520148A; CN1515319A; TJ384B; LV11866B; MX9704097A; HUP9800946A2; PL320612A1; RU2201253C2; BR9509872A; UA49814C2; EP0801656A4; NO972521L; AP9701056A0; AP661A; FI972431A7; EE03569B1; FI972431L; EP0801656A1; GEP20012556B; JPH10510264A

Description

487575 A7 B7 五、發明説明（1 ) 發明背景本發明係雷喬亨里（Syamal Raychaudhuri)與羅茲德（ William H. Rastetter )所著之標題”具細胞毒性之τ-淋巴細胞反應之謗發”；於1991年7月25日申請之美國系列編號 07/73 5,069的部份接績案，本發明係有關於對謗發人體或者馴養的或農耕的動物之細胞毒性τ_細胞調介反應上有用的方法與組合物。細跑毒性Τ-細胞(CTLs)係被認爲是反應多樣的病毒感染與腫瘤的或癌的成長之主要宿主防禦機制。此等細胞利用辨認與在感染的或轉形的細胞上之不同的分子（稱作類別 I MHC分子）相聯的抗原片段，以去除受感染或轉形的细胞。利用在特定的細胞之内細胞質裝載某些可溶的抗原可實驗上地謗發CTLs。對於特定的具細胞毒性τ-淋巴細胞謗發作用而言，僅以可溶的抗原免疫通常地係不足的。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 可謗發CTL反應之一種方法係包含使用重組的工程技術，以將有問題之抗原的重要成份嵌入一種良性的傳染物之染色體組中。此項策略之目的係藉由將該宿主蒙受一種溫和的，自我限制的感染以產生對該需要的表位（epitope) 之抗原特定的細胞毒性T-淋巴細胞反應。使用牛痘，脊髓灰質炎、腺性一與逆轉綠-病毒，以及例如Listeria與BCG 等之〃田囷之飲合載體已經有欽述。舉例而言，Takahashi 等人 85Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3105, 1988記述使用表現HIV gp 160外鞘基因之重組型牛痘病毒，作爲一種謗發具細胞毒性T -淋巴細胞之有潛力工具。 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __B7_五、發明説明（2 ) 可謗發一種細胞居間的反應之第二種方法包括佐劑 (adjuvant)之使用。當此技藝似乎充滿該佐劑用途之議論時，是否謗發細胞居間的免疫性以及是否該細胞居間的免疫性包括一種具細胞毒性T-淋巴細胞反應，對該技藝而言仍不明白。然而，下列係本領域中之不同發表文獻的代表。斯托維（Stover)等人；35 1, Nature 456，1991 (不公認係本申請案之先前技藝）記述使用含有卢-半乳糖苷酶基因之重組BCG之抗半乳糖甞酶的一種CTL反應。使用不完全的弗洛伊德氏佐劑（Freud、adjuvants)和-半乳糖替酶無法偵測該樣反應。米歇爾（Mitchell)等，8 J. Clinical Oncology 856? 1990 (其不公認係本發明之先前技藝）記述轉移黑色瘤 (metastastic melanoma)病患之治療；其係以一種稱作"丹投 (DETOX)"的佐劑和異基因的（allogeneic)黑瘤溶解物投藥五次長達六週之久，於該等病患之一小部份之中，發現溶細胞的T細胞之增加。該等作者記述增強細胞毒性T -淋巴細胞生產程度之必要性，以及建議含白血球介質素-2 (Interleukin-2)之佐劑之一種混合治療，以及以環磷醯胺之前治療以降低可能存在之腫瘤特定的T -抑制因子（T-suppressor)細胞之程度。丹投係包含來自Salmonella minnesota之去毒性的内毒素（單嶙醯基脂質A (monophosphoryl lipid A)) ? Mycobacterium phlei之細胞壁骨幹，角鯊缔油（squalene oil)和乳化劑。艾利森（Allison)和葛哥弟斯（Gregoriadis)， 11 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1· ，項再填· 裝· 訂 ΙΦ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（3 )

Immunology Today 427，1990 (其不認爲係本發明之先前的技藝）加註”授權可使用"於人體疫苗之唯一佐劑係鋁鹽（明蓉），其係不會一貫地謗出細胞居間的免疫性。艾利斯和葛哥弟斯陳述π因此發展具有弗洛伊德氏之完全佐劑之效力，但不具有其不同的副作用（例如肉芽瘤）之佐劑係有需要的。”他們且繼續言及三種可能策略存在；舉例而言 :脂質體（liposome)之使用；佐劑之使用，稱作免疫刺激複合物（ISCOMs，其係包含皀苷（saponin)或奎爾A (Quil A)(—種含二碳水化合物鏈之三萜系化合物），膽固醇和磷脂醯膽鹼）；其係授權可使用於馬類之一種流行性感冒疫苗（莫林（Morein)等人 ’ Immunological Adjuvants and Vaccines, Plenum Press，153);以及含魚鯊烯或魚鯊烷（有或沒有一種普洛尼克（pluronic agent)和胞壁醯基雙肽 (muramyl dipeptide (MDP))之乳劑（SAF)之使用。SAF 係被認爲可於老鼠中謗出細胞居間的免疫性；即使”長久認爲次單元抗原不能謗出細胞毒性T-細胞（CTL)反應。，’ 田卡哈許（Takahashi)等人，344 Nature 873，1990，記述藉由使用以單劑皮下的免疫法之ISCOMs，於老鼠中得第二類限制的助手型和細胞毒性的T -淋巴細胞謗發反應，他們陳述弗洛伊德氏佐劑、不完全的弗洛伊氏佐劑、和磷酸鹽缓衝的食鹽水不能謗發對抗所關心標的之具細胞毒性τ -淋巴細胞活性。與外源的可溶蛋白質抗原之其他形式之結果相反的，他們已顯示利用ISCOMs之外源的完整蛋白質免疫法未引發抗原特定的MHC第一類限制的CD8+ CD4- -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） --------^批衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) CTL係可能的，他們也述及所記載的實驗建議，藉由使用含HIV蛋白質tISC〇Ms以謗出人體CTL係可能的，並且基於ISCOM的疫苗可完成利用一純的蛋白質以謗發CTL 與抗體等二者之長久追尋的目的。拜聯(Byars)與艾利森，5 Vaccines, 223, 1987 記述 SAF-1之用途；其係包含吐溫80，普洛尼克L121 (PLURONIC L121)和角鯊缔或角鯊烷，有或沒有胞壁醯基雙肽，並且建議’他們的數據顯示含胞壁醯基雙肽之調配物將有益於人體與獸醫疫苗。該佐劑之激發劑注射（Booster shots)係不含該胞壁醯基雙肽，該胞壁醯基雙肽係認爲較使用不含胞壁醯基雙肽之佐劑顯著增加抗體之產生。利用皮膚測驗以遲缓型超過敏性測量細胞居間的免疫性，以測定T _助手型細胞謗發作用。當於該佐劑中含有胞壁醯基雙肽時，該超高敏性係較強且較持續的。類似的佐劑可見於艾利森等人，美國專利4,770,874 (其陳述胞壁醯基雙肽和複合的多元醇（pluronic polyol)之組合，對謗出抗卵白蛋白之一種強力的細胞居間的和體液的反應上係必須的）；艾利森等，美國專利4,772,466 :曼飛-可伯（Murphy-C〇rb)等， 246, Science 1293，1989 (其陳述含胞壁醯基雙肽之組合型佐劑之使用，可增強該免疫反應之體液的與細胞的裝備等二者之謗發作用。）；艾利森和拜耳茲87 Vaccines 56, 1987 (其陳述以SAF (含胞壁醯基雙肽）誘出間的免疫性；其係利用遲緩型超過敏性，利用對抗原之丁_細胞增殖反應，利用白血介素-2之產生，以及利用產生該 ^ 批衣------1T------ ^ J > (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -7- 487575 A7 B7 五、發明説明（5 ) 經濟部中央檩準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 免疫抗原之標的細胞之特定的生殖地限制溶解等方式表現 );艾利森和拜耳茲，感染性疾病之免疫藥理學：非專一性抗性之免疫佐劑與調節劑(Immunopharmacology of Infectious Diseases · Vaccine Adjuvants and Modulators of Non-specific Resistance) 19 1-20 1，1987莫根（Morgan)等，29 J. Medical Virology 74, 1989 ;肯尼（Kenney)等，121 L Immunological Methods 1 57，1989 艾利森和拜耳茲 95 J. Immunological Methods 157, 1986 (其中顯示銘鹽和礦物油乳劑可增加抗體形成，但非細胞間的免疫性；以及顯示胞壁醯基雙肽調配物可謗出細胞居間的免疫性）；拜耳茲等，8 Vaccine49? 1990 (不公認係本發明之先前的技藝，其陳述他們的佐劑調配物顯著地增加體液的反應，以及以較小的程度增強對流行性感冒血球凝集素（haemagglutinin) 抗原之細胞居間的反應）；艾利森和拜耳茲，28Molecular Immmunology 279，1991 (不公認係本發明之先前的技藝 ;其陳述該胞壁酿基雙肽的功能係謗發細胞激素（cytokines) 的表現與增加主要組織相容性（major histocompatibility; MHC)基因之表現；以及可獲得較其它佐劑爲佳的抗體和細胞反應；並且可望確定類似的策略對人體是否具有效力 ) » 艾利森和拜耳兹，Technology Advanced in Vaccine

Development 401, 1988 (其記述使用SAF之細胞居間的免疫性）；伊披斯坦（Epstein)等人，4 Advance Drug Delivery Reviews 223，1990 (其提供使用於疫苗製劑之不同佐劑的一篇綜論）；艾利森和拜耳茲，95[ -8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210、乂29?公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 487575 A7 B7 五、發明説明（6 )

Immunological Methods 157, 1986(其陳述將該胞壁醯基雙肽加入該佐劑，可顯著地增加對不同抗原之細胞居間的反應；包括單株免疫球蛋白和病毒抗原）；以及莫根等人， 29 J. Medical Virology 74, 1989 (其記述 SAF-1 用以製備伊披斯坦一巴爾（Epstein-Barr)病毒疫苗之用途）。跨可（Kwak)等人，Idiotype Networks in Biology and Medicine，Elsevier Science Publishers，163 頁，1990 (不公認係本發明之先前技藝）記述使用不含胞壁醯基雙肽的 SAF作爲於人體中之一種B -細胞淋巴瘤遺傳型之佐劑。特定而地，含普洛尼克L121，角鯊烷以及於磷酸鹽缓衝食鹽水之0.4%吐溫80的乳液係與該遺傳型共同投藥，他們陳述佐劑之添加應可進一步增大體液的反應，並且也可促進細胞反應之謗發。其他免疫製劑包括脂質體（艾利森等，美國專利 4,053,585 和 4,117，113 );環肽類（君斯曼（Dreesman)等，美國專利4,778,784 );弗洛伊德氏完全的佐劑（阿舍森 (Asherson)等；22Immunology 465, 1972 ;伯曼（Berman)等， 2 International J. Cancer5 39,1967;艾利森， 18Immunopotentiation 73, 1973;和艾利森 Non-Specific Factors Influencing Host Resistance 247? 1973 ) ;ISCOMs ( 拉的維（Letvin)等，87Vaccines 209，1987 ) •，含有由礦物油、一種介面活性劑和吐溫80形成的非離子性阻斷聚合物試劑之佐劑（罕德（Hunter)和班尼的（Bennett)，133 JL Immunology 3167，1984;和罕德等，127J. Immunology -9- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ^^裝訂 » X > (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（7 ) 1244，198 1);由礦物油和乳化劑（含或不含滅死的分支查桿菌）組成的佐劑（山崔茲一彭斯可朵（Sanchez-Pescador)等，141 J. Immunology 1720，1988);以及其它的佐劑；例如胞壁醯基三肽之一種親脂性的衍生物，及與重組蛋白質共價結合之一種胞壁醯基雙肚。發明摘述本發明已發現一種安全且有利的方法和組合物；藉其可謗發人體與經馴養或農業上重要的動物中之CTL反應。該方法包括使用一種抗原調配物（其對動物具有少些或無毒性）以及缺乏一種免疫刺激肽（例如胞壁醯基雙肽），其之存在可減低該需要的細胞反應。此外，該方法係簡易使用，並且藉由重組基因技術使現存的細胞免疫，而不須廣泛的活體内工作以改變該等現存的細胞。本發明係驚人的 •，因爲藉由缺乏免疫刺激肽或類似物之該一種抗原調配物之使用，可謗發該一種CTL反應係不可預期的，本發明者之發現使得該樣抗原調配物可用於廣泛範圍的疾病狀態，或者當作一種預防劑。舉例而言；可使用該樣抗原調配物投藥於病毒疾病之治療（其中一 CTL反應爲重要）；例如 HI V感染或流行性感冒之治療方面；其也可擴大的用於細菌感染，癌症、寄生性感染及其類似等方面之治療。作爲一種預防劑，含一適當抗原之該抗原調配物係有用於相當前述的病毒疾病之病毒感染之預防；特別地係HIV感染之預防法，而且也於有癌症危險之病患之預防法；舉例如於初期腫瘤之切除後。 -10- -----------^^裝------訂------ * X * 、 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度（CNS ) A4規格（210χ^^ 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（8 ) 因此，本發明之第一特色係一種用以謗發於人體或經馴養（例如貓或狗）或農耕上重要的動物（例如馬、牛或豬 )之對抗除B -細胞淋巴瘤抗原或蛋白蛋白以外之抗原的一種CTL反應之方法。該方法包括供給該ctl反應需要的抗原’以及供給包含、由、或本質地由安定用的清潔劑、膠微粒形成劑和生物可分解的且生物相容的油脂組成之一種無毒性抗原調配物等步驟。本抗原調配物較佳地缺乏任何免疫刺激肽成份，或者有相當低程度之該一種成份使該需要的細胞反應不會減低。此調配物較佳地呈一種安定的油水乳劑形式提供。即選擇每一該等不同的成份使得該乳劑將維持於一種乳劑狀態至少一個月期間，且較佳地超過一年，而沒有相之分離。於本方法，將該抗原與抗原調配物混合一起以形成一種混合物（較佳地利用微流體化作用 )，而且以一用量足夠謗發該動物之CTL反應將混合物投藥予該動物，該投藥僅須一次。 π安定用的清潔劑”係意謂一種清潔劑其可使該乳劑之成份維持呈一種安定的乳劑。該等清潔劑包括聚山梨酸酯， 80(吐溫）（山梨糖醇-單-9-十八烯酸酯·聚（氧-1，2 -乙二烷基（ethanediyl);由 ICI Americas，Wilmington，DE 製造）’ 吐溫 40，吐溫 20，吐溫60，士德劑 3-12(Zwittergent3-12) 提波HB7 (TEEPOL HB7)，和斯班85(Span 85)。經常地以一用量約0.05至0.5%，較佳地係約0.2%提供這些清潔劑〇 ”膠微粒形成劑”係意謂一種試劑其能夠安定含其它成份 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 487575 A7 B7 五、發明説明（9 ) 的該乳液以使形成一種膠微粒樣的結構。該等試劑較佳地引起在注射部位之一些刺激作用，以便添新巨噬細胞以增加該細胞反應，該等試劑之實例包括聚合物介面活性劑（吞己述於BASF Wyandotte publications，如斯摩卡（Schmolka)， 54 J- Am. Oil. Chem. Soc. 110, 1977，和罕德等，129】. Immunoj 1244, 1981 ;該二者在此納入本文爲參考文獻），複合劑 L62LF，L101 和 L64，L121，PEG1000，以及 TETRONIC 1501，150R1，701，901，1301 與 130R1。該等試劑之化學結構爲此藝所熟知的。較佳地選擇具有一親水性 —親脂性平衡値（hydrophile-lipophile balance，HLB)介於 0與2之間之試劑’其如罕德—班尼的，133 Journal of Immunology 3167, 1984所定義的。較佳地以一用量介於〇·5與10%間，最佳地一用量介於丨.25與5 %間提供該試劑。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 選擇該油脂係促進在油水乳劑中之該抗原的滯留，即，提供該需要的抗原一種媒劑（vehicle)，而且較佳地具有溶點低於65°C以使乳液在室溫（約20°C至256C )下，或者一旦該乳劑溫度被降至室溫時形成，該等油脂之實例包括角黨缔、角黨燒’二十碳燒，四十四碳燒，甘油、和花生油或其它植物油。該油脂係較佳地以一用量介於1與10%之間，最較佳地以一用量介於2.5與5 %之間供應。該油脂爲生物可分解的且生物可相容的係重要的，以使該生物體過時能分解該油脂，並且以使無不利的作用（例如肉芽瘤）係因使用該油脂而顯著的。 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（i〇 ) 在上述的調配物中缺乏一種肽成份，特別地一種胞壁醯基雙肽（MDP)是重要的。假如提供大於每一正常人體調配物投藥約20微克之用量則該一種肽將干擾CTL反應謗發作用。不管他們對免疫系統之體液部份之顯然的刺激作用，該抗原調配物完全缺乏該等肽係較佳的。即雖然該等肽可增強該體液反應，本發明已發現當希望。具細胞毒性T ·淋巴細胞反應時，他們係不利的。於其他相關的特色方面，該抗原調配物係自該等上述三種成份之其中僅二種而形成，並且與除了蛋白蛋白（或其它白蛋白，如HSA，BSA和卵白蛋白）之任一需要的抗原（其包括蛋白質，多肽、與它的具有免疫性的片段）一起使用以謗發於上述動物或人體之CTL反應。本發明相信上述調配物在使用於人體方面較先前的調配物（包括ISCOMS，DETOX，與S AF)顯著有利。不像該等調配物，本調配物包括一膠微粒形成劑以及不具有肽，細胞壁骨幹或細菌細胞成份。本調配物也誘發一種CTL反應；其不發生於該等先前的調配物或者與該等調配物比較係顯著地增強的。 ”無毒的”係意謂於受治療的動物或人體中些許或沒有發現該抗原調配物之副作用。習於醫學或獸醫技藝中之人士將認爲此名稱具有廣泛的意義。舉例而言，實質地健康動物或人體能忍受僅僅微小的毒性，但是遭受末期疾病之人體（具有預期壽命少於約三年者）實質地可忍受較多的毒性 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!〇><297公釐） — .1:------φ 裝----II ^------· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 487575 A7 B7 五、發明説明（U ) 於較隹的具體實施例中該抗原調配物基本上由該清潔劑、試劑和油脂之其中二者或三者所組成；該方法基本上由一種單獨投藥該混合物（抗原加上抗原調配物）予該人體或該動物所組成；該人體或動物係感染一種病毒，並且遭受該病毒感染之一個或以上的徵狀（如相關領域之醫生所普通定義者）之苦；而且該抗原調配物對該人體或動物係無毒的。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 於其它較佳的具體實施例中，該抗原係選自HIV抗原之具抗原性片段：gpl60, gag, pol, Nef，Tat，與Rev ;瘧疾抗原·· C,S蛋白質與鐮刀狀體（Sporozoite )表面蛋白質2 ; B 型肝炎表面抗原：Pre-Sl，Pre_S2, HBc Ag與HBe Ag ;流行性感冒抗原·· HA，HP與ΝΑ ; A型肝炎表面抗原；疱疹 (Herpes)病毒抗原；EBV gp340, EBV gp85, HSV gB，HSV gD，HSV gH, HSV早期蛋白質產物，巨噬細胞病毒 (cytomegalovirus) gB，巨嗤細胞病毒gH，與IE蛋白質gp72; 呼吸合胞體（syncytial)病毒抗原：F蛋白質，G蛋白質，與N蛋白質；以及腫瘤抗原；癌CEA，癌相關之黏液素，癌p21，癌p53，黑色瘤MPG，黑色瘤p97，與癌Neii腫瘤基因產物，癌p53基因產物，稱爲MAGE之黑瘤抗原，輿存在於多樣惡性腫瘤中之突變ρ2 1 ras蛋白質。於相關的特色中，本發明包括一種組合物；其包含’由或本質地由與上述之一種抗原調配物混合的一種抗原組合，並且該抗原係選自上列的抗原部份。於其它相關的特色色中，本發明包括利用投藥包含與一 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12 ) 種上述抗原調配物混合的一種適宜的抗原（如選自上列那些抗原）之組合物以治療病患之方法；該病患感染ΗI v病母’遭受癌疾之苦’遭受流行性感冒之苦，遭受肝炎之苦，遭受一種癌症之苦，感染疱疹病毒或者感染呼吸合胞體病毒。以下列之本發明較佳具體實施例説明和申請專利範園，將使本發明之其它特色與優點表現。發明説明首先簡單説明圖式：圖式第1A-1C及4A-4C圖爲比較以不同卵蛋白調配物誘發 CTL數據之圖示。於所有圖式中之Ε:Τ代表效應元對標的之比例。弟2Α和2Β圖爲比較以不同々-半乳糖菩酶調配物謗發 CTL數據之圖式；第3圖爲比較以存於脂質體中和存於抗原調配物中之卵蛋白謗發CTL數據之圖式；第5和6圖爲表示CD4和CD8細胞用盡對CTL謗發作用之數據圖式；第7圖爲表示gpl20謗發CTL數據之圖式，第8圖爲表示以含普洛尼克（Pluronic)和吐溫與抗原之漏合物謗發CTL數據之圖式；第9圖爲表示以含角鯊烷和普洛尼克與抗原之混合物謗發CTL數據之圖式； -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 琴 -訂· 487575 A7 B7 五、發明説明（13 ) 第1 0圖爲表示以含角鯊烷和普洛尼克與抗原之混合物謗發CTL數據之圖式； (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第1 1圖爲表示有不同抗原調配物〇 VA作用在CTL反應之圖式；第1 2圖爲以不同抗原調配物誘發猴子抗gp 120111b抗體之圖TF ; 第13圖爲經可溶E7蛋白質於佐劑的單一免疫1〇天後HOPE2細胞之抗癌活性，及第14圖爲經可溶E7蛋白質於佐劑的二次免疫1〇及19天後 HOPE2細胞之抗癌活性。抗原調配物可使用於本發明之抗原調配物係大概地如前述。一般熟於此藝者將認爲相當的調配物係容易製備的而且預期具有誘發CTL反應之相當的特徵，使用相當於下述實例中之技術可容易地測試該等調配物之特性。經濟部中央標準局員工消費合作社印製接著爲本發明之實例；其係使用由存於磷酸鹽緩衝的食鹽水（111^(18丁？）中之約2.5%角鯊烷、5%普洛尼克酸及吐溫8 0組成的一種抗原調配物（AF)。特定言之，該AF乳劑包含1 50毫克鯊坡，37_5毫克普羅沙美（poloxamer) 401 ( 普洛尼克Lm ) ，6毫克聚山梨酸酯80 (吐溫8〇 )， 0.184毫克氣化鉀，0·552毫克單鹼磷酸鉀，7.36毫克氣化鈉，3.3毫克二驗磷酸鈉（無水），每一毫升水，ρΗ7· 4 。利用標準技術（Microfluidics Model Ml 10F)-回壓（backpressure) 模數在 ll-14,000psi並逐漸恢復至大氣壓，冷卻並 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 487575 A7 B7 五、發明説明（14 ) 裝於濕冰中微液化本乳劑。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於其它實例中，將抗原與微液化的角鯊烷（S )，普洛尼克劑（P)和吐溫80(T)混合物混合以達到最終濃度分別爲0.2 %吐溫80，1.25 %普洛尼克與5 %角鯊烷複合劑。爲了測定一種抗原特定免疫反應謗發作用所須之次成份，以與該三種成份之混合物相同的濃度製備角鯊烷-吐溫80，普洛尼克-吐溫80或甲鯊烷-普洛尼克。也個別製備普洛尼克、角鯊烷或吐溫80以測定個別成份對該CTL謗發作用之影響。也製備取代吐溫80之吐溫20，吐溫40或士德劑之取代物以測定於該^系統中之不同吐溫衍生物對CTL謗發作用之影響。於該三種成份調配物中之角鯊烷取代物係利用 Eicosone或Triacontone，並且於該相同的三種成份調配物中之共聚物普洛尼克之取代物係利用PEG1000，Pleuronic 複合劑L62LF和Tetronics 1501與150R1製成。作爲二種成份調配物，將於不同組合中之不同類似物混合，並且測試 ova特定的CTL謗發作用。他們係膽固醇-吐溫80，角鯊烷-吐溫20，Pristane-吐溫80或橄欖油·吐溫80之混合物。爲一項安定性研究，將該角鯊烷-吐80之微液化混合物與葡萄糖混合以成爲最終濃度5 %。於所有實例中該等賦形劑之組合係於一微液化器中混合以形成一種安定的乳劑。於一些實驗中，將二種成份的調配物與不同濃度之MDP 混合，以謗發CTL與體液反應。表1記述使用於本研究之不同調配物的範圍廣泛列表。 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 487575 A7 B7 五、發明説明（15 ) 表 k種或二種成份系統中之不同取代物效應經濟部中央標準局員工消費合作社印製三種成份調配物之取代物吐溫40(Τ) 吐溫20(Τ) Τ1501(Ρ) T150R1(P) 普洛尼克L62LF(P) 二十碳烷（S) PEGIOOO(P) Triacontane(S) 士德劑（T) 二種成份調配物之取代物 _ ΡΤ SP 膽固醇（S)+吐溫80 角鯊烷+吐溫29(T) Pristane(S) +吐溫 80 橄欖油（S) +吐溫80 一種成分調配物普洛尼克L121 角鯊烷吐溫80 在 Ε:Τ 100:1時致死百分比 84 66 48 0 0 47 氺氺本 * 7645260654269ooo 角鯊烷+吐溫80 + 5%葡萄糖 86 *CTL試驗會重覆辛代斯（Syntex)佐劑調配物（微液化的；S AFm)係使用作-18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 487575 A7 B7 五、發明説明（16 ) 一種佐劑對照組並且由二部份組成，第一部份由含有最終濃度5%角鯊坑，1.25%普洛尼克和0.2%吐溫之；^酸鹽緩衝的食鹽水組成（賦形劑或I-SAF)，第二部份由釀胞壁釀基-L _蘇胺酿基-D-異越釀胺酸（Thr-MDP，分支桿菌屬細胞壁成份之一種衍生物）組成。爲了免疫之目的，將抗原與微流液賦形劑（第一部份）混合以獲得一均質的乳劑。將MDP加入以形成S AFm，並且概略地迴旋攪動。於該混合物中之MDP濃度係不同的，以測定對CTL誘發作用之最適濃度。當作一種佐劑對照組，亦以根據該製造商手册（Pierce Chemical，Rockford，IL )與明蓉混合之可溶性抗原，或以完全的弗溶伊德氏佐劑（CFA)來免疫老藏經濟部中央標準局員工消費合作社印製 IM.--··----•裝丨， (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

I 該抗原調配物係用以謗發老鼠之細胞毒性τ —淋巴細胞反應。習於該項技藝之人士將認爲此一老鼠模式顯示相當的實驗或治療將類似地謗發於人體，經馴養的或農耕的動物中之細胞毒性Τ -淋巴細胞反應。不需過分的實驗，以對於習於該項技藝之人士所熟悉的標準方法，可經驗地測定有利產生該需要的細胞反應之抗原調配物與抗原之用量。因此’如果需要將此類混合物治療之副作用減到最小，則習於該項技藝者可測定該混合物之最小用量以適合投藥予人體、馴養的或農耕的動物以謗發CTL反應，因而謗發抗一需要的抗原之免疫性。於正常使用下，以許多標準方法之任一種注射該混合物，但是特佳的係在一部位（其將使該乳劑維持一種安定形式長達數日或數週之久）之肌内注 -19 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 487575 A7 __B7_ 五、發明説明（17 ) 射。· 方法除非有另外的加註，下文之該等實例中係使用下列之材料和方法。老鼠雌性 C57BL/6 (H-2b)和 BALB/c (H-2b)老鼠係購自 Harlen Sprague (San Diego, California) 0 抗原卵白蛋白(ova，級數 VII，Sigma Chemical Co.，St.Louis， MO)係以天然的形式使用。0 -半乳糖甞酶（0 -gal，級數 VIII; BRL)係以天然的形式與在1 M NaOH煮沸2分鐘以產生一種強驗代謝物方式使用。重組gp 120係購自American Biotechnology 〇腫瘤細胞和轉感染物使用的腫瘤細胞係la·系線EL4 (C57BL/6, H-2b胸腺瘤）和 p815 (DBA/2，H-2d 肥大細胞瘤（mastocytoma))。由 ova_ 產生的EL4轉感染物（transfectant)，EG7-ova，先前地係由沐耳（Moore)等人，54Cell 777, 1988敘述。利用含10毫克經 PstI線性化的 pCHl 10 (Pharmacia LKB Biotechnology Inc·， Piscataway，NJ)和1毫克經pVuI線形化的pSV2 neo，將存於1毫升磷酸鹽緩衝的食鹽水（PBS)中之107 P815細胞進行電穿孔作用（帚升（Southern)等人，1 J. Mol. Appl. Genet. 327, I982)，接著利用400微升/毫升抗生素〇418篩選以衍生得A -gal-產生的轉感染物。藉由以編碼-gal基因（ -20- 本紙張尺度適用中國國家檩準（CNS ) M規格（210x297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) >裝_ 訂經濟部中央檩準局員工消費合作杜印製 487575 A7 B7 五、發明説明（18 ) 融入IgM重鏈之第三和第四表現序列（exon)之質體轉感染 BALB/C融合瘤Igm 662，而衍生得C3-4轉感染物（拉米希 (Rammensee)等，30 Immunogenetics 296, 1989)。表現 8?1601111)之3丁3纖維母細胞（15-12)係來自犯11之德曼博士（Dr. Germain) (Bethesda，MD)。經 Kb轉感染的 L 細胞系係來自卡棒博士（Dr. Carbone)，MonashUniversity，Australia 。經Dd與Ld轉感染的L細胞系係來自泰得漢森博士（Dr. Ted Hensen)，WashingtonUniversity，St. Louis 0 免疫作用如沐耳等人（同上）和卡棒（Carbone)等人，J. Exp.Med. 169 _·603, 1989所述，在細胞質的裝填之後，以200微升25 X 1〇6脾細胞懸浮液靜脈内免疫老鼠。爲抗原調配物或# -gal·抗原調配物之免疫，將每隻老鼠於足趾和尾端皮下地注射30微克每一種蛋白質抗原，每一劑注射於終體積 200微升中，含有67微升微流體化的抗原調配物（以下列標準方法製作）和30微克蛋白質抗原。該終體積係以HBSS 凑成（參見懷德克（Whittaker)手册（Welkersville，MD))。 MDP係於濃度介於0與300微克之間供給，視情況，以存於CFA或於明礬中總體積爲200微升之可溶的抗原免疫老鼠。效應元群之活體外刺激作用將來自正常的或經免疫老鼠（至少14日前己引發的）之脾細胞（30χ 106)在37。(：，7%C02/空氣下，於24槽培養盟中，以 1·5 X 106 EG7-ova(以 20,000rad 照射）（爲—反應）或 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Ϊ·

、1T 487575 A7 ____B7 _ 五、發明説明（19 ) 與 1·5χ 106 C3-4 細胞（以 20,000rad 照射）（爲 0 -gal反應）培養。於添加10%胎中血清（FCS)，2mM麩醯胺酸，慶大黴素（gentamycin)和2 X l〇-5M 2 —氫硫基乙醇之由IMDM 培養基組成的完全培養基中完成所有組織培養，參見懷德克手册（Welkersville，MD)。爲活體外細胞用盡實驗，將於活體内準備的或者於活體外刺激的脾細胞以單株抗體 (111八68)111^172(抗-€04)或〇1八68 3.168(抗-€08)處理以去除 CD4+ 或 CD8+T細胞（沙米朵（Sarmiento)等，125 L Immunol. 2665，1980與希里弟各（Ceredig)等，3 14 Nature 98, 1985)。該 mAb RL 172和 mAb 3.168 係獲自在 Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla，CA 之斯班的博士 (Dr. Jonathan Sprent) 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將來自正常的或經免疫老鼠之脾細胞（30 x 106)(其至少 21日前已引發的）與1·5χ 106 15-12細胞（每10s細胞以200 微克絲裂黴素C處理45分鐘）培養，或者與存於含有10% 前篩選的 FCS (ICN Flow ; ICN Biochemicals，Inc·，Costa Mesa, CA), 2mM麩醯胺酸，慶大黴素和2χ10·5Μ 2 —氫硫基乙醇之完全 IMDM培養基（Irvine Scientific, Santa Ana, CA)中之500微克18111b肽（包含Balb/c老鼠之主要CTL表位（epitope))培養。爲活體外之肽刺激作用，將脾細胞培養於含有5%ConA上層液之完全IMDM中。爲細胞用盡實驗，將活體内準備的或活體外刺激的脾細胞在低毒性的兔子補體（Cederlane Laboratories，Ltd·， Hornby Ontario，Canada)存在下，以 mAbs RL。172 (抗 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 487575 A7 B7 五、發明説明（2〇 ) 0〇4)或111八匕8 3.168(抗-€〇8)處理，以去除€〇 +或€〇8+丁細胞（22, 23)。該mAb RL 172和mAb 3.168係來自斯班的博士（前述者）。細胞毒性分析以100微居里[51Cr]酪酸鈉標記標的細胞（IX 106)60分鐘，對於肽脈衝的標的物，在標的標記51Cr期間，將50微升之1毫克/毫升肽溶液（存於HBSS)加入，清洗之後，將1〇4 經標記的標的和效應元細胞之系列稀釋液在37°C下培養於 200微升RP10中4小時。收集100微升上層液並且測定該比溶解（specific lysis)表示成：比溶解百分比二100 X {CTL 之釋放-自然發生的釋放）/(最大的釋放-自然發生的釋放）} 。於所有實驗中，於缺少細胞毒性T -淋巴細胞（CTL)之自然發生的釋放係小於以清潔劑引起的最大釋放之2 5 %。測定老鼠和猴子之抗體反應將96 —槽U底培養皿（Costar，Cambridge，Μ A)之每一槽塗覆存於50微升HBSS中之150微微克ova或gp 120，且在 4 “C過夜培養。爲測定老鼠抗-gp 120與抗-ova之抗體反應，培養皿以1 % BS A封塞（blocked) 1小時，將系列稀釋的血清以每槽25微升體積加入且培養2小時。清洗培養皿且將50微升存於1 % BSA中之與HRPO(SBT，Alabama)共軛之山羊抗老鼠IgG之1 : 1000稀釋液加入每槽。培養1小時之後，清洗培養m且將100微升受質加入每槽。在10至 15分鐘之後讀取該〇d4G5。爲測定猴子抗gpl20之抗體反應，所有步驟係相同的，惟該封塞培養皿和血清稀釋等二 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) a4規格（210X Μ公釐） I ^--------------IT------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 487575 A7 B7 五、發明説明（21 ) 步驟係於5 %正常的山羊血清（於漢克氏（Hank，s)平衡的鹽溶液）中完成。肽合成經濟部中央檩準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 利用Applied Biosystems 430A合成儀藉固相法胜肽合成技術裝配合成肽；其係相對於卵白蛋白胺基酸序列253-276 253-276)(序列表第 1 號：EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER ;其中該標準單字母符號係表示每一胺基酸），髓磷脂鹼性蛋白質（myelin basicprotein)之胺基酸序列84-102(序列表第2 號：DENPVVHFFKNIVTPRTPP)與 gpl20IIIb之胺基酸序列 301-322 (18111b序列）之合成肽。藉預先形成的對稱酐偶合胺基酸，但除天冬醯胺酸、麩醯胺酸和精胺酸係偶合爲羥基苯並三唑酯類。以接著凱塞（Kaiser)等人之方法（34 Biochem, 595, 1970)之茚滿三酮（ninhydrin)反應偵測偶合效率（Coupling efficiency)。利用接著湯姆（Tam)等人 21 J. Am. Chem. Soc· 6442,1983記述之”低一高”方法之HF，將該等肽自該支撑物釋出，而且以10%乙酸自樹脂萃取出該等泰。在冷凍乾燥之後·以Sephadex G-25管柱將肽去蘭，具以Vydac製備型〇 18管柱之逆相層析法HPLC純化該等肽之樣本。將純化的肽（98% )以終濃度10毫克/毫升溶解於 HBSS，並且於完全培養基中稀釋至所希望濃度。 CNBr 降解於100mM三氟乙酸溶液中以100倍莫耳過量之溴化氰處理蛋白質樣本（如々-半乳糖甞酶）。令反應於室溫（約20°C ) 下攪動反應18小時。接著該前述的反應時間，將該肽片段 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 487575 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 A7 B7 五、發明説明（22 ) 利用SEP-PAK C-18裝置（Waters)自該反應物分離，以95% 乙腈溶析，以及冷凍乾燥。驗性降解以1 N NaOH處理蛋白質樣本（如0 -半乳糖甞酶）且煮沸 2分鐘，而且利用一種C-18 SEP-PAK裝置（Water)將該產生的肽片段與反應物分離，以及用95 %乙腈溶析並且冷凍乾燥。實例1 :第I類限制的CTL引發沐耳等人，113 UCLA Symp. Mol· Cell· Biol. 1989卡棒和班維（Bevan)，171 J. Exp. Medicine 377, 1990 證明以細胞質地裝載可溶的^之脾細胞免疫的老鼠，係爲引發ova特定第I類限制的CTL反應。該表現的EL4轉感染物 EG7-〇va係使用於活體内準備的脾淋巴細胞之活體外刺激作用，而且也用作爲ova特定的CTL居間的致死作用之標的。本研究也證明藉由EG7-^_轉感染物或細胞質地裝載^之脾細胞謗發的CD8+效應元，辨認H-2Kb内由肽^1 258_276所吻合之決定基，溶解EG7-^i，並且也致死塗覆有^ 258-276之 EL4細胞。因此爲了評估是否可利用可溶的抗原謗發内原性第 I類限制的CD8+T細胞途徑，則使用上述系統以測定是否可使用某些抗原調配物，以產生可溶的抗原進入第I類限制的途輕。 a)ova 利用含或不含抗原調配物之不同用量的^(30微克-1毫克/老鼠）將C57BL/6老鼠免疫一次。其係於尾端皮下地注射|鼠。在該免疫之後至少兩週將脾細胞自該免疫老鼠中取出，龙真以 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） I I 裝 II 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 487575 A7 B7 五、發明説明（23 ) EG7-ova轉感染物進行活體外刺激。ova濃度在低如30微克係與 1毫克劑量具相同效力。因此，以來自30微克ova-引發的老鼠之脾細胞例行地完成CTL研究。在以EG7_^活體外培養5日之後，以能夠溶解EG7-ova之ova特定的效應元之存在下評估所謗發者" 以存於HBSS之可溶^ (1毫克）注射之老鼠，顯示不具 CTL謗發事實（第1A圖）。然而以存於如上述之抗原調配物 (於該等圖示中表示作AF )中之30微克ova免疫的老鼠顯示顯著的轉感染物特定的CTL反應（第1C圖）。況且，由經 ova-AF免疫的脾細胞所致死的EG7-5^之程度，與ova-裝載的脾細胞免疫的老鼠之程度係可比較的（第1B圖）。藉由/?-半乳糖甞酶免疫的老鼠之脾細胞，當以EG7-ova 刺激時缺乏出現活體外次級的CTL反應，可表示活體内謗發的CTL特定性係抗原特定的。沒有觀察到〇va#定的 CTL謗發。 b)· β —半乳糖甞酶經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用其它可溶的蛋白質抗原，#-gal，可獲得類似的結果。爲分析>5 -gal特定的CTL反應，使用的標的係baLB/C衍生的卢-gal-表現的C3-4轉感染物。以可溶的々_gai免疫BALB/C老鼠產生背景CTL反應。因此，爲了特定CTL反應之測定，將收獲延遲於收獲脾淋巴細胞之前至少八週，並且於該等放射的C3-4轉感染物存在之下培養5日。第2 B圖證明存於A F之3 0微克半乳糖甞酶謗發強烈的特定抗轉感染物之CTL反應。在效應元對標的（E : T)之比例爲3:1時， -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210χ297公董） 487575 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製五、發明説明（24 ) 經-gal-AF免疫之老鼠表現約80%之特定C3-4致死。然而，利用分離自A-gal(於HBSS)之效應元免疫的老鼠，在以相同的 E:T比例時，僅達到20。/〇致死該相同的標的（第2A圖）。因爲EL4 或P815皆未表現第Η類MHC基因產物，且溶解物皆沒有表現同系的限制作用，因此這些^和A-gal特定的效應元係第I類 MHC限制的。爲證明該抗原調配物之用途，以包囊於兩種形式的脂質體（其中一種係一種pH敏感的脂質體）中的可溶^^來免疫老鼠。一週之後，如上述地將脾細胞活體外刺激並且測試抗51Cr—標記的 EG7-ova或EL4。第3圖表示一種代表性的結果；其證明於脂質體中的ova不能引發老鼠之本質的CTL謗發作用，當〇va於明礬中免疫時，發現類似的結果。實例2 : CTL之表位辨認卡棒和班維（同前述）證明，利用EG7-ova轉感染物和利用細胞質地ova裝載的脾細胞等所謗發的CTL，辨認塗覆有肽ova 258-276之EL4細胞。爲了證明存於AF之可溶卵白蛋白是否謗發類似的CTL反應，將脾細胞製備自免疫老鼠，且以EG7-ova 活體外刺激。測試該等效應元之抗EL4細胞；該等細胞塗覆有肽ova 253-276或者有衍生自髓磷脂鹼性蛋白質之一種肽對照組 (ΜΒΡ 84·102)。該等結果證明^-AF謗發的CTL具有與那些爲轉感染物或爲細胞質地装載^所謗發者類似的特定性（第1A ，1B與1C圖）。^-AF引發的效應元細胞有效地溶解Ε<37·〇va ，以及塗覆有50微克/108細胞之^1肽的未轉感染的EL4細胞，但是不會溶解覆有50微克/108細胞之MBP肽之EL4細胞。 -27- (請先閱讀背面之注意事今 ▼項再填· 裝—— :寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) M規格（21〇X 297公釐） 487575 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（25 於半乳糖甞酶系統，卡棒和班維（同前述）顯示表現々义“的轉感染物和細胞質地裝載可溶半乳糖苷酶之脾細胞，謗發 CTL ;其溶解表現/j-gai的轉感染物和覆有經鹼降解的半乳糖甞酶之未轉感染的P815細胞。可溶的半乳糖甞酶當於AF* 免疫時，謗發類似的特定性之CTL。實例3 : CTL效應元俾細胞下述顯示存於AF之可溶的蛋白質抗原謗發CD8+效應元τ細胞。活體外以放射的轉感染物，培養來自經免疫老鼠之脾細胞5日 ’之後，採收細胞且利用單株抗CD4或抗CD8之抗體加上補體，以用盡CD4+或CD8+T細胞。然後測試已用盡族群於ova系統之抗51Cr_EG7-^，或者於A-gal系統之抗51Cr-Pl3.l。該等數據表示於第四圖，且顯示於ova系統，C〇8 + T細胞之去除作用廢除了具細胞溶解的活性，該活性係該全部效應元細胞群所賦與的。然而，CD4+T細胞群之去除作用對該EG7·^的溶解不具任何影響。類似地，於卢-gal系統，CD8 + T細胞之去除作用廢除点-ga!· 抗原調配物免疫的脾細胞之細胞溶解活性（數據未顯示）。實例4 :存於AF之可溶ova引發CD8+T細胞爲了證明ova-AF活體内引發CD8+T細胞群，且對活體外的次級反應係重要的，將CD4+或CD8+細胞群自ova-AF免疫的老藏和自天然的老鼠等之脾臟中去除。之後於活體外利用單獨的 EG7-ova ’或者於來自ova-AF免疫老鼠之CD4+和CD8+T細胞組合物中，或者於各種來自ova-AF免疫老鼠之CD4+或CD8 + T 細胞與來自天然老鼠之CD4+或CD8+細胞之組合物中刺激這些處 -28 - 木紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（26 ) 理過的細胞群。第5圖顯示對活體外顯現次級的CTL反應而言，引發的CD8+細胞係必要的。這些數據也指示對活體外之有效次級CTL反應而言需要CD4+T細胞。就引發作用而言，CD4+細胞係不需要的。相似地，CD8+T細胞須要活體外- gal特定次級C T L反應之表現。上述實例證明抗原調配物對謗發抗可溶蛋白質抗原之第I類限制的CTL反應之影響。該抗原調配物調節可溶抗原謗發的CTL 引發作用’且活性方面係類似於被轉感染物所謗發者和被脾細胞 (細胞質地裝載可溶0Va或点-gal)所謗發者。於卵白蛋白系統中 ’ EG7-ova ’細胞質地裝載〇va之脾細胞，和ova-AF绣發:〇) 第I類限制的CD8+CTL ; (b) CTL，其辨認以^ 253-276合成肽敏感化之標的物；以及僅一免疫作用之後的長效CTL。於半乳糖甞酶系統中，該々-gai-AF謗發CTL ;其辨認β _ gal表現的轉感染物C3-4，以及以經鹼性降解的A -gal敏感化之未轉感染的P815細胞。其類似於利用細胞質地裝載A -半乳糖甞酶之脾細胞免疫所謗發的CTL。由抗原調配物謗發ova特定的 CTL係獨一的，因爲包囊於pH敏感的脂質體中的或者於明礬中之^ (沒有顯示數據）皆沒有謗發活體内CTL反應。這些實例顯示在人類醫療方面，與不同癌症和病毒疾病之謗發 CTL的疫苗發展方面，上述抗原調配物及其相等物係有用的。實例5 本項係一種特別的實例，以顯示上述AF在由HI V之可溶 gpl20產生第I類限制的ctl引發作用方面上之用途。於由Balb/c纖維母細胞衍生的3T3細胞系中產生表現gpl6〇 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNsJ^4規格（2i〇x297公釐） " (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) r裝· 訂 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（27 ) IIIB的細胞系（15-12)。其係獲自德曼博士（Dr· Ron Germain) 和伯左夫斯基博士（Dr. JayBerzofsky)，National Institute of Health，Bethesda，M.D.該gpl6〇的細胞系係用於活體内引發的脾淋巴細胞之活體外刺激作用’而且也作爲SP160特定CTL锈發反應之標的物。以每一老鼠10微克SP160(含或不含AF)免疫 Balb/e老鼠一次。於尾端皮下地注射老氣。免疫後二週’將脾細胞自該免疫老鼠中取出並且利用經照射的gp160轉感染物活體外刺激。活體外培養5曰之後，藉由能夠溶解gpl60轉感染物（而非未轉感染的細胞系）之特定效應元之存在評估引發作用。該等結果係表示於表7，其中以AF與gpl20賦與CTL反應。下列實例證明含僅一種或二種成份之本發明抗原調配物之用途，這些實例證明以該等上述三種成份之中的僅僅二種可謗發 CTL-反應。 β : CTL謗發作用所須之重要成份之測定爲了測定是否所有上述的成份對抗原特定C.TL謗發作用係必須的，以存在於上述AF之該等三種成份其中的二種（以PBS取代該第三種成份）之不同組合物之微液化的調配物中的即蛋白免疫老鼠，使用的二種成份組合物係如下：存於PBS之角鯊烷/吐溫，存於PBS之角鯊烷/普洛尼克或者存於PBS之普洛尼克/吐溫。包括另一組實驗；其中利用調配於一種成份系統即，僅僅負繁烷於PBS，普洛尼克於PBS或吐溫於PBS而已）中之〇va免疫老鼠。改良上面三個成分抗原調配物以同時排除一成份組成於PBS 中〇上述抗原調配物包含：0·300公克吐溫80(AldHeh，WI)> -30 -

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝·

、1T

Lp 487575 A7 B7 五、發明説明（28 ) 1.875公克普洛尼克[121(8八8?，旧)和7.5公克角鯊燒 (Aldrich，WI)，添加PBS 至50毫升。二種成份調配物係：角鯊燒/吐溫：0·300公克吐溫80與7.5 公克角鯊烷，添加PBS至50毫升’普洛尼克/吐溫：i·875公克普洛尼克L121與〇·3〇〇公克吐溫80 ’添加PBS至5〇毫升’普洛尼克/角鯊坑：I·875公克普洛尼克L121與7·5公克角鯊坡’添加PBS至50毫升。之後，將該等樣本經過微液化器（model 110Τ， Micorofluidics Corp·)處理，以及裝瓶且於4°C下儲存直到使用稱重卵蛋白(〇va, Sigma，MO)並且製作存於HBSS(懷德肯，如前）中之〇·3毫克/毫升溶液。將該0.3毫克/毫升的原料溶液與下列用量之該等二種成份調配物組合：5份卵白蛋白〇.3毫克/毫升溶液，3.3份2成份調配物和1·7份HBSS。攪動該調配物並且放置於冰上直到注射，剛妤注射之前才組合所有溶液。以尾基部皮下地注射方式，使每一隻老鼠接受2〇〇微升之一種調配物（含有30微升0Va)。在脾臟採收之前，讓老鼠休息至少二至四週。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -------；---^裝— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在免疫之後二週，製備脾細胞並且以經照射的EG7-ova作活體外的刺激。在培養5日之後，以一種4小時MCr釋出分析法測試抗 WCr-EG?·^^或WCr_EL4，以測定ova特定的CTL之存在。表示於第6至8圖的數據證明調配物於微流體化的二種成份系統中的卵白蛋白能活體内引發ova特定的CTLs。 -31 -

經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製我們更進一步地評估該等個別的成份，在與蛋白質抗原組合時 ’其謗發CTL能力之貢獻。爲了免疫作用之目的，將可溶抗原與微流體化賦形劑混合，以獲得一種安定的均質乳劑（其粒子大小介於250-300毫微米之範園）。爲了進一步定義角鯊烷·吐溫普洛尼克（STP)調配物中之負責CTL謗發作用的該等成份，我們以存於角鯊烷-吐溫8〇(ST)普洛尼克，普洛尼克-吐溫80(PT) 混合物或角鯊烷-普洛尼克（SP)混合物中的^或者作爲一種對照組之存於角鯊烷（S)，吐溫80(Τ)或複合劑（Ρ)中的ova免疫老鼠。作爲佐劑對照組；也以ova-S AFm (含70微克MDP )或ova-明礬免疫老鼠。爲了作爲陽性對照組，利用細胞質地装載可溶的脾細胞免疫老鼠。也使用其它的組合物與取代物，且結果表示於表1。爲了 CTL引發研究之偵測，免疫老鼠一次。免疫兩週後，脾細胞與經照射EG7-ova (ova表現EL4細胞天且對51Cr_EG7-ova 或51Ct-EL4細胞測試。該等結果（圖11)證明與STP或ST組合的30微克ova於老鼠中引發第I類限制的CTL反應。利用存於 STP之ova或者利用存於ST之ova之ova特定CTL引發作用，似乎較利用細胞質地裝載可溶之脾細胞所謗發者爲佳。存於 PT或存於SP之^可謗發老鼠^特定的CTL反應，但卻係不一致的和不佳的。不似SAFm，將MDP加入ST調配物不能危害老鼠之該^特定的CTL謗發作用（表2)。當老鼠係以與個別的成份（S，P或T)混合之^所免疫時，和當老鼠係以^-SAFm 或明礬所免疫時等二者皆沒有發生^L特定的CTL謗發作用。利用存於（a)HBSS，（b)SAFm或（c)吸附於明蓉之1耄克之 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐）裝訂 * (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 487575 A7 _____B7_ 五、發明説明（3〇 ) 多的^所免疫的老鼠，不能謗出^特定的CTL。秦_2 以ST+MDP不會阻斷ova特定的CTL反應之謗發作用 _免疫老鼠之細胞毒性％# ova-ST-MDP ova-ST-MDP 刺激元標的物** ova-ST ova-ST 300微克老鼠72微克老鼠 BG7-ova EG7-ova 100:1 0 100 82 76 33:1 0 86 67 62 11:1 0 33 39 25 3:1 0 6 13 3 1:1 0 0 0 0 3:1 0 0 0 0 ---------裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 *老鼠係以存於不同調配物中之30微克^：免疫 **利用減去未表現抗原的細胞系之致死百分比計算％細胞毒性實例7 :爲ova特定的抗體生產所必須的成份利用存於HBSS，STP，ST，PT或SP中的30微克ova將老鼠在二週間隔下受免疫三次。當作一種陽性對照組，也以_-SAFm免疫老鼠，因爲已知SAFm能誘發強烈的抗體反應。在第二次和第三次免疫之後七日，將老鼠取血且測試血清之ova特定的抗體反應。結果列示於表3。他們顯示以存於STP，ST或於SAFm中之 ova免疫的老鼠，在三次免疫之後，表現類似的抗ova反應。訂 -33- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 487575 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（31 ) 表 3 30微克0va/動物調配物抗-ova抗體反應之謗發反應的老鼠數量/ 注射的老鼠總數量fl/競錄杳效僧、 HESS 0/3 <1/20, <1/20, <1/20 STP 3/3 <1/4860, >1/4860, <1/4860 ST 3/3 >1/4860, >1/4860, >1/4860 PT NA ΝΑ, ΝΑ, NA SP NA ΝΑ, ΝΑ, NA SAF-M 3/3 1/4860, 1/4860, 1/4860 *N/A ;不合適 f例8 : HIV gpl20特定的CTL後爹作用使用HIV gpl20 IIIB作爲第二種抗原系統，以測定其於STP ，ST或於MP-T中之CTL诱發作用。利用存於jjBSS，STP， PT或於ST中之1微克gp 120 Illb免疫老鼠。作爲一種對照組；利用存於SAFm或CFA (完全的弗洛伊德氏佐劑）或含MPL(單磷醯基脂質A)及TDM(海藻糖二黴菌物）<RIBI佐劑系統中i微克gpl20 Illb使老鼠免疫。在該免疫後3週，製備脾細胞並以經絲狀黴素處理的轉感染物細胞15_12或者以18111b肽進行活體外刺激，在培養5日之後，測試產生的效應元細胞之抗牛痘： gpl60 IIIB，或者以經母系牛痘感染的P815細胞作爲標的物。該等結果證明gpl20-角鯊烷-吐溫80調配物非gpl20-角鯊烷-吐溫80普洛尼克調配物謗發老鼠之gp 120特定的CTL反應（表4 ) -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(210X297^7 I 裝訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 487575 A7 B7 五、發明説明（32 ) 表 4 謗發老鼠之gpl 20特定的CTL反應用*免疫的老鼠之細胞毒性％刺激物標的物# 18IIIb/IL2 vac:^120 Ε-Τ gpl20-HESS gpl20-ST gpl20-STP 100:1 23 42 jsjA1 2 3 33:1 23 38 ΝΑ 11:1 0 0 ΝΑ 3:1 0 35 ΝΑ 18IIIb/IL2 15-12 100:1 33:1 11:1 3:1 ο ο ο ο 0 5 7 8 5 3 2 1 ο ο ο ο ---------^-裝— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 18IIIb/IL2 3T3+18IIIb 100:1 33:1 11:1 3:1 ο 59595729 -訂 100:1 35 84 ΝΑ 33:1 19 65 ΝΑ 11:1 12 37 ΝΑ 3:1 0 22 ΝΑ 1:1 0 0 ΝΑ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 15-12 1 利用存於不同調配物之1微克gpl20lll免疫老鼠 2 利用減去未表現抗原的細胞系之致死百分比計算％細胞毒性 3 不適合簠誘發老鼠之gpi2〇特定的體液反應

爲了謗發gpl20特定的體液反應，利用1微克gp 120111b以二週間隔期將老鼠免疫三次。取該等動物之血以及測試IgG抗體之存在（利用固相ELISA分析法偵測gpl20IIIb)。結果證明 gpl20-ST比 gpi2〇-HBSS，gpl20-SAFm(表 5)或 gpl20-STP -35- 代張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 487575 A7 B7 反應的老鼠數量/ 1微克gpl20/動物調配生注射的老鼠總數量(1/稀釋血清效價） 0/3 <1/20, <1/20, <1/20 1/3 <1/20, >1/4860, <1/20 3/3 >1/4860, >1/4860, >1/4860 3/3 >1/4860, >1/4860, >1/4860 2/3 <1/20, 1/540, 1/540 2/3 1/180, >1/4860, 1/540 五、發明説明（33 ) 更佳表_5^ 謗發抗_gpl20抗體反應

HESS STP ST PT SP

SAF-M 宜則L0」..爸土 2 0特定的抗體反應利用 gpl20-SAFm，gpl20-STP，gpl20-ST或者 gpl20-HBSS使猴子（每組二隻）免疫。作爲一種對照組，藉由含即16〇 Illb之重組牛痘免疫一組猴子。猴子係以二週間隔期免疫並且在第二次免疫之後二週和三週採血。系列地稀釋每一隻猴子之免疫前和免疫的血清，並且如上述於材料與方法中之ELISa方法分析抗gpl20活性。該等數據（第12圖）顯示以gpl2〇-STP或 gpl20-SAFm免疫的猴子誘發猴子類似反應。以gpi2〇__sT免疫的一隻猴子謗發的抗gpl2〇反應，類似於該gpl20-SAFm或 gpl20-SPT免疫組。以gpl2〇_ST免疫的一隻猴子在二次免疫之後並不能誘發強烈的抗-gpl2〇反應。實例16 E7之活體内活性 1.供免疫用之重組HPV 16 Ε7蛋白質之產·生 a)PCR及Ε7基因之選殖 I. II — — 裝 II 訂 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部 t 央準局員工消費合社印製經濟部中央標準局員工消費合作社印製 487575 A7 B7 五、發明説明（34 ) 由Dr· Karen Vousden (Ludwig研究所）編碼衍生自癌細胞系Caski之E7基因所獲質體選殖HPV 16 E7基因。以PCR及使用編碼Bam HI及Sal I選殖位址侧邊所接51及3·基因之引子放編碼區。將E7 PCR產物接入pGEX-4T-l表現載體 (Pharmacia Biotech)產生pGEX.E7表現質體。用 pGEX.E7表現質體轉移感染大腸桿菌XL1-藍（層聚基因（stratagene))。由所獲純種系質體所得E7序列與CaSki細胞所得E7序列相同〇 b)細胞表現E7之純化的產生 pGEX.E7細菌表現質體編碼麩胱甘肽-S-轉移酶（GST)融含蛋白質，其係在胺端GST，凝血酶蛋白酶裂解位址及羧端E7蛋白質所組成。產生及純化E7蛋白質係如pGEX-4T_l 載體（Pharmacia Biotech)廠商之產品資料文件所述。簡言之，藉加入異丙基b-D-硫代半乳糖甞酶至培養皿謗使含 pGEX.E7表現質體之細菌表現融合蛋白質。收成細胞並藉輕微音波振盪加以融解細胞。將溶菌產物用於麩胱甘肽瓊脂醣4B(Pharmacia Biotech)。融合蛋白連接至基質後，沖洗樹脂以移除非特異性結合蛋白質。用凝血酶消化已結合融合蛋白質以從GST融合伴體釋出E7蛋白質。以SDS-PAGE分析E7蛋白質製劑且以Bradford分析法 (BioRad)鑑定E7蛋白質濃度。每毫升細菌培養物得到9毫克可溶E7蛋白質。 2.X21 E7轉染物之產生 HPV16 E7蛋白質之編碼序列（見上述）業已插入IDEC所擁 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ♦ 項再填· 裝· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 487575 A7 B7 五、發明説明（35 ) 有的眞核表現質體INPEP4。於此載體中，以巨噬細胞病毒啓動子/增強子之轉錄元件控制E7表現。此外，E7編碼序列前三個核甞酸已移去並用免疫球蛋白輕鏈引導子序列替換，該序列直接置於上游及E7編碼區域之框。内轉染至老鼠細胞X21個別G418抗性純系後以E7訊息產生之RNA印跡分析來檢。查每一純系展現可測E7訊息。然後由彼等純系中二個4E7及1C7(分別爲HOPE1及HOPE2)進行細胞融解物之蛋白質印跡分析並證實E7蛋白質產生。 3.E7/AF可溶抗原免疫之活體内活性 C3H背景之雌鼠(H]1^，Harlan Sprague Dawley)用於此等研究。依”看護及使用實驗室動物之指南"（DHHS出版NIH 86-23, Bethesda，MD:NIH，1985)維護動物且任意接食物及水。E7轉染細胞系HOPE 於這些研究中。以活體外連續代維持腫瘤細胞系。此細胞系業已顯示維持E7胞漿抗原表現，如同以蛋白質印跡分析，接著重複活體外數代來偵測。以皮下注射 150,000活體外歷經數代細胞引發腫瘤於協同性€311老鼠中〇二星期時以2個垂直方向測量腫瘤。依下式計算腫瘤體積（V): V(毫米3) = (LxW2)除以2 其中： L =最長軸，以毫米測量 W二垂直軸（毫米） -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 487575 A7 B7 五、發明説明（36 經濟部中央標準局員工消費合作社印製表6數據係如腫瘤老鼠（帶腫瘤老鼠數/注射動物之總數）。圖13及14之數據如各治療組或控制組之正中腫瘤大小（亳米3)。各治療組與未接受治療之控制組相較。治療開始於HOPE2細胞接種1〇天後，此時大多數腫瘤係可觸知的（約50至75毫米3)。用溶解E7蛋白質於AF或明礬佐劑對老鼠免疫（皮下注射0 · 2爱升總量）引發治療。免疫前，直接將af 與溶於Hanks平衡鹽水溶液之E7蛋白質（HBSS)混合60秒使各老鼠接受30微克或90微克E7蛋白質於〇·2毫升。依製造商指示將明礬(Pierce化學公司）與Ε7蛋白質混合使各老鼠接受90微克E7蛋白質於〇.2毫升。第二治療組動物9天後接受第二次免疫作用（腫瘤細胞接種19天後）。如上述接種前立刻製備Booster免疫作用。此實驗中（表6 : Xp # 2 3 3 )，腫瘤細胞接種4 1天後，僅 4/8及5/8老鼠（接受可溶E7於aF(分別爲30微克或90微克） <單一注射已有可測得腫瘤。相反地，已用E 7蛋白質於明蓉（8/8)免疫之所有老鼠已積極生長腫瘤。另外，如圖所示’和控制組（未治療）或明礬治療組相較僅在用E 7蛋白質於aF免疫之治療組觀察到有顯著腫瘤生長受到抑制。腫瘤生長抑制（圖13)或增加腫瘤退化率（表6)未在接受E7於明礬單一注射之老鼠身上察覺出。雖然接受E7於明礬二次注射之老鼠察覺有一些腫瘤生長減緩，但在腫瘤被激起10及19天後（表6及圖14)接受二次免疫作用之治療組亦察覺有相似結果。結果指出帶腫瘤老鼠數目減少而測出顯著抗腫瘤活性及 -39- 尽、，氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公釐 ------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 訂 487575 A7 _ B7五、發明説明（37 ) 接著可溶E 7於AF之免疫作用察筧腫瘤生長抑制。相反地，用單一或雙重注射可溶E 7蛋白質於明礬免疫的所有動物均長腫瘤。總而言之，用可溶E 7蛋白質於AF之免疫作用導致腫瘤細胞生長受到顯著抑制而未察筧於使用可溶E 7於明礬免疫作用。表6 :可溶於E7於佐劑免疫作用之抗腫瘤活性實驗抵號治療劑量(微克/老鼠）腫瘤動物& 4 1天 223 控制組 7/8 223 E7 於AF 30微克X lb 4/8 223 E7 於 AF 90微克X 1 5/8 223 E7於明礬 90微克xl 8/8 223 E7 於 AF 30微克x2c 3/8 223 E7 於AF 90微克X 2 1/4 223 E7於明礬 90微克X 2 8/8 a .帶有腫瘤之老鼠數/受接種總數 b .所有免疫作用開始於植入1 0天後 c.第二次免疫作用（x2)於植入10天後其它具體實施例係於下列申請專利範圍内。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Jf •項再填. 裝· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims

六、申請專利範圍 1 ··一種包含人類乳頭狀瘤病毒（HP V)抗原之組合物，其包含於一種微液化抗原調配物中，包含： (a) —種安定用的清潔劑， (b ) —種膠微粒形成劑，和 (c ) 一種生物可分解與生物可相容的油脂，其中該Hp v 抗原係選自HPV16 E6抗原、HPV 18 E7抗原、HPV 6 E4 抗原、HPV 6 L1抗原、HPV11 E4抗原及HPV11 L1抗原’以及其被調配成一種安定的油水型乳劑且實質上缺少一種免疫刺激的肽且其中該組合物投與至選自人體、馬養動物及農耕動物能誘發對抗乳頭狀瘤病毒抗原之特定細胞毒性τ -淋巴細胞反應。 2 ·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物係選用供性病濕疣之治療。 3 ·根據申凊專利範圍第1項之組合物，其中該組合物適合前列腺癌之治療。 4 ·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該抗原調配物對該人或馴養的動物或農耕或的動物係無毒的。 5 ·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該微液化抗原 1周配物基本上包括該清潔劑，形成劑及油脂。 6 ·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中安定用的清潔劑選自聚山梨酸酯80，吐溫（TWEEN)20、吐溫40，吐溫 60 ’ 士德劑（Zwittergent)3-12，提波（TEEPOL)HB7，和斯斑（SPAN)85。 7 ·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中所提供清潔劑 A4^(21〇X 297/1¾) ； %/575

.量約為Ο · Ο 5至0.5 %。 8 ·根據申請專利範圍第9項之組合物，其中該清潔劑之量約 0.2%。 9 ·根據申凊專利範圍第1項之組合物，其中膠微粒形成劑包括介於0至2間親水性一親脂性平衡值。 10·根據申請專利範圍第1項之組合物’其中膠微粒形成劑選自普沙美（Poloxamer)401 、普洛克尼 (Pluronic)L62LF、普洛尼克 L101、普洛尼克 L64、 PEG1000、特聰尼克（Tetronic)1501、特聰尼克 150R1、特聰尼克70 1、特聰尼克90 1、特聰尼克13〇 1及特聰尼克 130R1 。 11.根據申請專利範固第1項之組合物，其中膠微粒形成劑量範固介於0.5至10%間。 12·根據申請專利範圍第11項之組合物，其中膠微粒形成劑量範圍介於1.25至5%間。 13·根據申凊專利範圍第1項之組合物，其中油脂呈現溶解溫度少於60°C。 14·根據申請專利範圍第13項之組合物，其中油脂選自角黨晞、角鯊烷、二十碳烷、四十四碳烷、姥鮫烷 (pristane)、甘油及蔬菜油。- 15.根據申請專利範圍第1項之組合物、其中油脂量範圍介於1至10%間。 16·根據申請專利範圍第1 5項之組合物，其中油脂量範圍介於2.5至5%間。 ___^__一本紙張尺度t國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公董) ' '— 圍申請專利範 17夫艮據申請專利範圍.第1項之組合物，包括少於2〇微克胞壁醯基二肽。 18·根據申請專利範圍第17項之組合物，不包括任何胞壁醯 ~*月太。 19·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中清潔劑係聚山梨酸醋80且微粒形成劑係普羅沙美40 i。 2〇·根據申請專利範圍第19項，其中油脂係角鯊烷。 1 ·根據申凊專利範圍第1項之組合物，其中清潔劑選自吐溫20、吐溫4〇及吐溫8〇 ;油脂選自角鯊烷、二十碳烷及姥起燒且膠微粒形成劑選自普洛尼克L62LF及普羅沙美 401 〇 22·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中組合物顆粒大小範圍為250至300毫微米。 L ___-3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)