PL184399B1 - Ciekła detergentowa kompozycja - Google Patents

Abstract

1 . Ciekla detergentowa kompozycja zawierajaca odmiane subtilazy, znamienna tym, ze obok typowych skladników zawiera subtilaze, w której jedna lub wiecej niz jedna reszta aminokwasu usytuowana w lub w sasiedztwie hydrofobowej domeny rodzicielskiej subtilazy zostala podstawiona przez reszte aminokwasu bardziej hydrofobowa niz oryginalna reszta, przy czym odmiana subtilazy jest R170L lub R170I. PL

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe ciekłe detergentowe kompozycje zawierające mutanty enzymów lub odmiany enzymów wykazujące zwiększoną trwałość przechowywania przy zachowaniu lub zwiększeniu ich działania piorącego.

Tło wynalazku

W przemyśle detergentów od ponad 30 lat wprowadzano enzymy do formulacji piorących. Enzymy używane w takich formulacjach to proteazy, lipazy, amylazy, celulazy, jak również inne enzymy albo ich mieszaniny. Z handlowego punktu widzenia najważniejsze są proteazy.

Chociaż proteazy są stosowane w przemyśle detergentów przez ponad 30 lat, nie zostało szczegółowo wyjaśnione jak enzymy oddziały\wyąz substratami i/innymi substancjami występującymi np. w kompozycjach detergentowych. Niektóre czynniki związane ze specyficznymi resztami i wpływanie na określone właściwości, takie jak stabilność tlenowa i termiczna ogólnie zostały wyjaśnione, ale wiele pozostało nieodkrytych. Również, nie jest jeszcze dokładnie wiadomo jakie fizyczne lub chemiczne właściwości odpowiadąjąza dobre działanie piorące lub zdolności proteazy w specyficznych kompozycjach detergentowych.

Obecnie stosowane proteazy zostały w większej części odkryte przez wyizolowanie proteaz istniejących w naturze i przebadanie ich w detergentowych formulacjach.

Proteazy

Enzymy rozszczepiające wiązania amidowe w proteinowych substratach sąklasyfikowane jako proteazy, lub (zamiennie) peptydazy (patrz Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms.

W.H. Freeman and Company, San Francisco, Rozdział 3). Bakterie z gatunku Bacillus wydzielaj ą dwa pozakomórkowe gatunki proteaz, neutralną, albo metaloproteazę, i proteazę zasadową, którajest funkcjonalnie endopeptydazząseryny a zazwyczaj określanajestjako subtilizyna. Wydzielanie tych proteaz zostało powiązane z cyklem wzrostu bakterii o zwiększonym wydzielaniu proteazy w fazie stacjonarnej, kiedy występuje również sporulacja. Joliffe i inni (1980) J. Bacteriol 1411199-1208, sugerowali, że funkcje proteaz Bacillus zmieniająsię w ścianie komórkowej.

Subtilazy

Proteaza serynowajest enzymem, który katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych, w którym zasadnicze znaczenie ma reszta serynowa w aktywnym centrum (White, Handler i Smith, 1973 „Principles of Biochemistty”, piąte wydanie, McGraw-Hill Book Company, NY, str 271-272).

Bakteryjne proteazy serynowe mają ciężar cząsteczkowy w zakresie 20 000 do 45 Οθ0. Sąone hamowane przez diizopropylofluorofosforan. Hydrol izująproste terminalne estry i sąpodobne w aktywności do eukariotycznej chymotrypsyny a również proteazy serynowej. W węższym znaczeniu, zasadowa proteaza, obejmująca podgrupę, odbija wysokim optimum pH, pH w zakresie 9,0 do 11,0, od innych proteaz serynowych, (dla porównania patrz Priest (1977) Bacteriological Rev 41 711-753).

Podgrupa proteaz serynowych podobnie nazywanych subtilazami została zaproponowana przez Siezena i in., Protein Engng. 4 (1991) 719-737. Zostały one określone przez analizę homologiczną sekwencji więcej niż 40 aminokwasów proteaz serynowych wcześniej opisywanych jako podobne do subtilizyny proteazy. Poprzednio subtilizyna była określana jako proteaza serynowa produkowana przez Gram-pozytywne bakterie lub grzyby, i zgodnie z Siezen i in., teraz stanowi podgrupę subtilaz. Zidentyfikowano wiele różnorodnych subtilizyn, określono sekwencje aminokwasów wielu subtilizyn. Obejmują one więcej niż sześć subtilizyn z łańcuchów z Bacillus, nazwane subtilizyna 168, subtilizyna BPN', subtilizyna Carlsberg, subtilizyna Y, subtilizyna amylosacharyticus i mesenterikopeptydaza (Kurihara i in. (1972) J. Biol. Chem. 247 5629-5631; Welle i in. (1983) Nucleic Acids Res. 117911 -7925; Stahl i Ferrari (1984) J. Bacterial. 159 811-819; Jacobs i in. (1985) Nucl. Acids Res. 13 8913-8926; Nedkov i in. (1985) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366 421-430; Svenseni in. (1986) FEBSLett. 196 228-232), jedna subtilizyna z promieniowców, termitaza z Thermoactinomyces vulgaris (Meloun i in. (1985) FEBS Lett. 198 195-200), i jedna subtilizyna grzybowa, proteinaza K z Tritirachium album (Jany i Mayer (1985) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366 584-492). Dalsze odnośniki literaturowe podano poniżej w tabeli I z Siezen i in.

Subtilizyny są dobrze scharakteryzowane fizycznie i chemicznie. W uzupełnieniu wiedzy o pierwszorzędowej strukturze (sekwencja aminokwasów) tych enzymów, określono ponad 50 struktur subtilizyny metodą promieniowania X o wysokiej rozdzielności, dla których wykreślono połączenia substratów, przemianę przejścia, produkty, co najmniej trzy różne inhibitory proteazy, i określono strukturalne konsekwencje naturalnej zmienności (Kraut (1977) Ann. Rev. Biochem. 46 331-358).

W kontekście niniejszego zgłoszenia substraty powinny być interpretowane w ich najszerszej postaci jako składające się ze związku zawierającego co najmniej jedno wiązanie peptydowe podatne na hydrolizę przez proteazę subtilizyny.

Również określenie „produkt” powinno być w kontekście niniejszego wynalazku interpretowane jako obejmujące produkty reakcji hydrolizy wywołanej proteazą subtilizyny. Produkt może być substratem następnej reakcji hydrolizy.

Jedna podgrupa subtilaz, I-S1, zawiera „klasyczne” subtilizyny, takie jak subtilizyna 168, subtilizyna BPN', subtilizyna Carlsberg (ALCALASE®, NOVO NORdIsK A/S) i subtilizyna DY.

Dalsza podgrupa subtilaz I-S2, została rozpoznana przez Siezen i in. (supra). Podgrupa I-S2 proteaz została opisana jako wysoko alkaliczne subtilizyny zawierające enzymy takie jak subtilizyna PB92 (MAXACAL®, Gist-Brocades NV), subtilizyna 309 (SAVINASE®, NOVO NORDISK A/S), subtilizyna 147 (ESPERASE®, NOVO NORDISK A/S) i alkaliczna elastaza YaB.

W kontekście niniejszego wynalazku odmiany subtilazy albo zmutowane subtilazy oznaczają subtilazę, która została wytworzona przez organizm, który ekspresjonuje mutant genu po184 399 chodzącego z macierzystego mikroorganizmu posiadającego pierwotny lub macierzysty gen i który wytwarza odpowiedni enzym macierzysty, ten gen macierzysty został zmutowany w celu wytworzenia mutanta genu, z którego wytwarzana jest zmutowana proteaza subtilizyny ekspresjonowana w odpowiednim gospodarzu.

Statystyczne i ukierunkowane mutacje genu subtilazy pojawiają się z wiedzy o fizycznych i chemicznych właściwościach enzymu i dostarczają informacji dotyczących katalitycznej aktywności subtilaz, specyficzności substratów, trzeciorzędowej struktury itp. (Wells i in. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84; 1219-1223; Wells i in. (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond A. 317 415-423; Hwang i Warshel (1987) Biochem. 262669-2673; Rao i in., (1987)Nature 328 551-554.

Późniejsze publikacje dotyczące tej tematyki to Carter i in. (1989) Proteins 6 240-248 odnosząca się do projektowania odmian rozszczepiających specyficzne miejsca sekwencji w substracie (pozycje 24 i 64); Graycar i in. (1992) Annals of the New York Academy of Science 672 72-79 dyskutują wcześniej publikowane wyniki; oraz Takagi (1993) Int. J. Biochem. 25 307-312 również podaje przegląd wcześniejszych rezultatów.

Zwłaszcza ukierunkowane mutacje genów subtilizyny przyciągały dużo uwagi i opisano różnorodne mutacje w następujących zgłoszeniach patentowych i patentach:

EP-A-130 756 (GENENTeCh) (odpowiada patentowi US Reissue Patent nr 34 606 (GENENCOR)) odnosi się do ukierunkowanych albo statystycznie generowanych mutacji w „karbonylowych hydrolazach” i następnego badania różnych właściwości zmutowanych enzymów, takich jak stosunek k_kat/K_m, profil aktywności pH i stabilność tlenowa. Ta publikacja ujawnia, że określona mutacja jest wykonalna oraz że mutacja subtilizyny BPN' w określonych specyficznych pozycjach tj. ’TYR, ³Asp, ¹⁵⁵ASN, ¹⁰⁴Tyr, ²²²Met, ¹⁶⁶Gly, 6*His, ¹⁶⁹Gly, ¹⁸⁹Phe, ³³Ser, ²²¹Ser, ²¹⁷Tyr, ¹⁵6Glu albo ^2 Ala, dostarcza enzymów wykazujących zmienione właściwości. Ponieważ wszystkie te pozycje z wyjątkiem pozycji -1 byty znane jako związane z funkcjono waniem enzymu przed złożeniem zgłoszenia, zatem są one ewidentne do wybrania, to zgłoszenie nie wnosi wiele do rozwiązania problemu zdecydowania gdzie wprowadzać mutacje w celu otrzymania enzymów o pożądanych właściwościach.

EP-A-214 435 (HENKEL) odnosi się do klonowania i ekspresji subtilizyny Carlsberg i jej dwóch mutantów. W tym zgłoszeniu nie ujawniono powodu do mutowania ¹⁵⁸Asp na ^8 Ser i *61 Ser na ^Asp.

W publikacji WO-A-87/04461 (AMGEN) proponuje się zmniejszenie liczby sekwencji Asn-Gly występujących w macierzystym enzymie w celu otrzymania zmutowanych enzymów wykazujących ulepszoną stabilność pH i ogrzewanie, w zgłoszeniu zwrócono uwagę na usuwanie, mutowanie albo modyfikowanie reszt 1⁰⁹ Asn i 2¹⁸Asn w subtilizynie BPN'. Brak przykładów delecji lub modyfikacji reszt Gly.

Publikacja WO-A-87/05050 (GENEX) ujawnia statystyczne mutacje i badania ogromnej liczby mutantów subtilizyny BPN' w celu ulepszenia właściwości. Opisano mutacje następujących pozycji 21⁸Asn, ⁿⁱGly, 254Thr, ^1<’⁶Gly, '^Ala, ¹⁸⁸Ser, ¹²6Leu i 53Ser.

W EP-A-251446 (GENENCOR) opisano jak homologiczne rozważania na poziomie struktury pierwszo- i trzeciorzędowej mogą być zastosowane do identyfikacji ekwiwalentnych reszt aminokwasów, czyje zachować czy nie. Te informacje razem z wiedząwynalazców o trzeciorzędowej strukturze subtilizyny BPN' doprowadziły wynalazców do wybrania pozycji odpowiednich do mutacji w oczekiwaniu otrzymania mutantów o zmienionych właściwościach. Tak zidentyfikowane pozycje to: ¹²⁴Met, ²²²Met, ^Tyr, *52Ala, ^Gly, ^Gly, ^Gly, ^Phe, ^Tyr. A rówmeż *55 Asn, 21Tyr, 22Tyr, 24Ser, 32 Asp, 33Ser, 36Asp, 4⁶Gly, 48 Ala, 49Ser, 5°Met, 77Asn, 8^?Ser, 94Lys, 94Val, 96Leu, ^l07Ile, ^ll0Gly, 17°Lys, ^Tyr, ¹⁷²Pro, '97 Asp, ¹99Met,20^łSer,21³Lys i221Ser, te pozycje zostały zidentyfikowane jako mające wpływ na różnorodne właściwości enzymu. Dla poparcia tych sugestii wiele mutacji zilustrowano przykładami. Ponadto do pojedynczych mutacji w tych pozycjach, wynalazcy przeprowadzili wiele wielokrotnych mutacji. Dalej wynalazcy zidentyfikowali 21⁵Gly, 6^?His, ¹²⁶Leu, ^B5Leu i reszty aminokwasów wewnątrz segmentów 97-103, 126-129,213-215 i 152-172jako interesuj ące, ale mutacj i w żadnej z tych pozycj i nie zilustrowano przykładem.

184 399

Szczególnie interesujące dla celów niniejszego wynalazkujest to, że wynalazcy EP-A-251446 sugerująpodstawienie 1⁷⁰Lys (w subtilizynie BPN', typ I-S1), zwłaszcza sugerują wprowadzenie Glu albo Arg zamiast pierwotnej Lys. Wydaje się, że odmiana Glu została wytworzona i stwierdzono, że jest wysoce odpowiednia do autolitycznej degradacji (por. strony 48,121,123 (tabela XXI podaje oczywisty błąd, ale wskazuje zmniejszenie połowicznego czasu autolizy z 86 do 13 minut) i fig. 32).

EP-A-260 105 (GENENCOR) opisuje modyfikacje określonych właściwości enzymów zawierających katalityczną triadę, przez wyselekcjonowanie reszt aminokwasów wewnątrz około 1 5a od katalitycznej triady, i zamianę wybranych reszt aminokwasów przez inne aminokwasy. Enzymy typu subtilazy opisane w niniejszym zgłoszeniu są specyficznie wymienionejako należące do klasy enzymów zawierających katalityczną triadę. Pozycje subtilizyny 222 i 217 są wskazane jako pozycje korzystne dla zamiany.

Thomas, Russell i Fersht (1985) Nature 318 375-376 ujawnili, że wymiana Asp na Ser w subtilizynie BPN* zmienia zależność enzymu od pH.

W następnym artykule (1987) J. Mol. Biol. 193 803-813, ci sami autorzy dyskutu)ązam.ianę ¹⁵⁶Serwmiejsce ¹⁵⁶Glu. Obie te mutacje występuj ąwewnątrz około 15A od aktywnej ⁶⁴His.

W Nature 328 496-500 (1987) Russel i Fersht dyskutują wyniki ich eksperymentów i przedstawiają zasady zmiany profilu aktywności pH spowodowane mutacją enzymu w celu otrzymania zmian na naładowanej powierzchni.

Publikacje WO-A-88/08028 (Genex) i WO-A-88/08033 (Amgen) odnoszą się do modyfikacji reszt aminokwasów w centrach wiążących wapń subtilizyny BPN'. Mówi się, o stabilizacji enzymu przez podstawienie bardziej negatywnie naładowanej reszty w miejsce oryginalnej.

wO-A-89/06279 (NOVO NORDISK A/S) wskazano pozycję 170 jako interesując ąi sugerowaną do zamiany występującej reszty przez Tyr. Jednak brak danych odnoszących się do takiej odmiany. W WO-A-91/00345 (NOVO NoRDISK A/S) zrobiono tę samą sugestię, i pokazano, że odmiana Tyr w pozycji, 170 subtilizyny 309 (typ I-S2) wykazuje ulepszone działanie piorące w detergentach przy pH około 8 (odmiana S003 w tabelach III, IV, V, VI, VIII, X). To samo podstawienie w kombinacji z innymi podstawieniami w innych pozycjach również wykazuje ulepszone działanie piorące (S004, S011-S014, S022-S024, S019, S020, S203, S225, S227 w tej samej tabeli i tabeli VII) wszystkie zgodnie z ogólną koncepcją tego zgłoszenia.

W EP-A-525 610 (SOLVAY) sugeruje się ulepszenie stabilizacji enzymu (subtilaza typu I-S2 blisko związana z subtilizynąPB92) w kierunku jonowych środków powierzchniowo czynnych przez zmniej szenie hydrofobowości w określonym regionie powierzchni. W konsekwencji, sugeruje się podstawienie Gln zamiast Arg w pozycji 164 (170jeżeli stosuje się numerację BPN'). W zgłoszeniu brak ujawnienia odmian zawierających takie podstawienie.

W WO-A-94/02618 (GIST-BROCADES N.V.) opisano wiele odmian pozycji 164 (170jeżeli stosuje się numerację BPN) subtilizyny PB92 typu I-S2. Przykłady ujawniają podstawienia Met, Val, Tyr, Ile w miejsce oryginalnej Arg. Testy działania piorącego w proszkach detergentowych tych odmian wykazują nieznaczne ulepszenie. Zwłaszcza wykazano w testach działania piorącego na kakao, dla odmiany Ile ulepszenie około 20-30%. Brak danych dotyczących stabilności.

Przemysłowe zastosowania subtilaz

Proteazy takie jak subtilizyny znalazły duże zastosowanie w przemyśle, zwłaszcza w kompozycjach detergentowych, z powodu ich użyteczności w usuwaniu białkowych plam.

Obecnie, co najmniej następujące proteazy są znane jako handlowo dostępne, a wiele z nich jest sprzedawanych w dużych ilościach w wielu krajach świata:

Subtilizyna BPN' lub Novo dostępna z np. SIGMA, St. Louis, USA.

Subtilizyna Carlsberg, sprzedawanaprzezNOVO NORDISK A/S (Dania)jako ALCALASE® i przez IBIS (Holandia) jako MAXATASE®; Obie z nich należądo podgrupy I-S1 subtilazy.

Spośród subtilaz podgrupy I-S2 znane i sprzedawane są następujące:

Subtilizyna Bacillus lentus, subtilizyna 309, sprzedawana przez NOVO NORDISK A/S (Dania) jako SAVINASE®. Białkowa odmiana wytworzona metodą inżynierii genetycznej tego enzymu sprzedawana jest jako DURAZYM®.

Enzymy bardzo podobne do SAVINASE®, takie jak subtilizyna PB92, MAXACAL® sprzedawana przez Gist-Brocades N.V. (białkowa odmiana wytworzona metodą inżynierii genetycznej tego enzymu sprzedawana jest jako MAXAPEM®), OPTICLEAN® sprzedawany przez SOLVAY et Cie. i PURAFECT® sprzedawany przez GEnEnCOR International.

Subtilizyna Bacillus lentus, subtilizyna 147, sprzedawana przez NOVO NORDISK A/S (Dania) jako ESPERASE®.

Jednak, aby być skutecznymi, takie enzymy musząnie tylko wykazywać aktywność w warunkach prania, ale muszą być również kompatybilne z innymi składnikami w czasie wytwarzania detergentu i przechowywania.

Na przykład subtilizyny mogą być stosowane w kombinacji z innymi enzymami aktywnymi przeciw innym substratom, a wybrana subtilizyna powinna być stabilna przeciw takim enzymom, a również wybrana subtilizyna korzystnie nie powinna katalizować degradacji innych enzymów. Wybrana subtilizyna powinna być odporna na działanie innych składników kompozycji detergentowej, takich środki bielące, środki utleniające itp. w szczególności enzymy do stosowania w kompozycjach detergentowych powinny być stabilne w odniesieniu do siły utleniającej, właściwości łączenia wapnia, i w warunkach pH wywoływanych przez nieenzymatyczne składniki detergentu, podczas przechowywania i w cieczy piorącej podczas prania.

Zdolność enzymu do katalizowania degradacji odmian naturalnie występujących substratów obecnych na przedmiotach czyszczonych podczas np. prania często odnosi się do ich zdolności mycia, zdolności zmywających, detergencyjności albo działania piorącego. W niniejszym zgłoszeniu będzie używane określenie działanie piorące, obejmujące te właściwości.

Zdolność enzymu do pozostawania aktywnym w obecności innych składników kompozycji detergentowej przed jej zastosowaniem (przeważnie przez dodanie wody w procesie prania) jest zazwyczaj odnoszona do stabilności przechowywania albo dopuszczalnego okresu magazynowania. Często jest mierzona jako okres pół-trwania, t_1/2. Dla przedstawienia tej właściwości w niniejszym zgłoszeniu będzie używane określenie stabilność przechowywania.

Stwierdzono, że naturalnie występujące subtilizyny mają właściwości, które są bardzo różnorodne w odniesieniu do mocy lub zdolności piorącej odmian w różnych parametrach takich jak pH. Kilka z wyżej wymienionych detergentów proteazowych, rzeczywiście ma lepsze działanie niż sprzedawane około 20 lat temu, ale dla optymalnego działania każdy enzym ma swoje specyficzne warunki w odniesieniu do formulacji i warunków prania, np. pH, temperatura, siła jonowa (=Γ), układ aktywny (tensydy, środki powierzchniowo czynne, środek bielący itp.), wypełniacze, itp.

W konsekwencji stwierdzono, że enzym mający odpowiednie właściwości przy niskiej wartości pH i niskiej wartości I, może być mniej atrakcyjny w bardziej zasadowych warunkach i wyższym I, albo enzym wykazujący dobre właściwości przy wyższym pH i wyższym I może być mniej atrakcyjny w warunkach niskiego pH i niskiego I. Stwierdzono również, że stabilność przechowywania różni się między enzymami, ale następnie stwierdzono, że specyficzne enzymy wykazują duże różnice stabilności przechowywania w zależności od różnych formulacji detergentu, w zależności od wielu parametrów, takichjak pH, pi, układu bielącego, tensydów itp., oraz w zależności od fizycznej postaci detergentowej kompozycji, która może być proszkiem, pyłem lub cieczą. Ponadto może występować w postaci stężonej lub rozcieńczonej.

Wykorzystanie i rozwój technik rekombinacji DNA miał głęboki wpływ na chemię protein.

Chociaż zastosowanie tych technologii jest obecnie możliwe do konstruowania enzymów mających pożądane sekwencje aminokwasów, alejak wcześniej wykazano niewielka ilość badań była poświęcona zaprojektowaniu subtilizyn o zmienionych właściwościach.

Wiele technik wytwarzania i badania dużej liczby zmutowanych enzymów opisano w publikacji EP-A-130 756 (GENENTECH) (US Reisue Patent nr 34 606 (GENENCOR), a publikacja WO-A-87/05050 (GENEX) odnosi się do znacznie rozszerzonych klasycznych metod izolacji prostych enzymów, poddawania ich klasycznym programom mutagennym (z użyciem promieniowania lub chemicznych mutagenów) i badanie ich właściwości. Różnice leżące w tych metodach sąbardziej skuteczne dla wiedzy o obecności dużej ilości odmian enzymów podstawionych w specyficznych pozycjach.

184 399

Enzym subtilizyny zazwyczaj zawiera około 275 reszt aminokwasów. Każda reszta może mieć od 1 do 20 możliwych, naturalnie występujących aminokwasów. Zatem jednąz bardzo poważnych trudności występujących w tej procedurze jest bardzo duża ilość generowanych mutacj i, które musząbyć brane pod uwagę we wstępnych badaniach określaj ących ich właściwości.

Procedura opisana w niniejszym zgłoszeniu będzie tylko niewiele lepsza od tradycyjnych metod statystycznych mutacji znanych od lat.

Inne znane techniki odnoszą się do zmiany specyficznych właściwości, takich jak stabilność tlenowa, stabilność termiczna, stabilność Ca, szybkość transestryfikacji i szybkość hydrolizy (EP-A-260 105 (GENENCOR)), profil aktywności pH (Thomas, Russell, i Fersht, supra) i specyficzność substratów (publikacja WO-A-88/07578 GENENTECH)). Żadna z tych publikacji nie odnosi się do zmian ani działania piorącego enzymu ani stabilności przechowywania.

W zgłoszeniu PCT/DK/88/00002 (NOVO NORDISK A/S) proponuje się zastosowanie koncepcji porównywania homologów do określania, które pozycje aminokwasów powinny być wybrane do mutacji i które aminokwasy powinny być podstawione w tych pozycjach, w celu otrzymania pożądanych zmian działania gorącego.

Stosując taką procedurę można drastycznie skrócić procedurę badań, ponieważ liczba generowanych mutantówjest dużo mniejsza, ale tą procedurą można jedynie przewidzieć, że będą otrzymane enzymy wykazujące połączone użyteczne cechy enzymu macierzystego i enzymu użytego w porównaniu.

Zatem jak wykazano wyżej jeszcze nie zidentyfikowano zależności między dobrze zdefiniowanymi właściwościami enzymu takimi jak określone powyżej a działaniem piorącym i stabilnością przechowywania enzymu w różnorodnych kompozycjach detergentowych.

Problemem jest to, że pomimo wielu badań skierowanych na określenie mechanizmu aktywności enzymu, ciągle jeszcze nie wiele wiadomo o czynnikach w strukturze i kombinacji reszt aminokwasów określających właściwości, takie jak stabilność przechowywania w detergentach, enzymów w zależności od większości ich właściwości, zwłaszcza gdy enzymy występująw mieszanym kompleksie.

W konsekwencji, istnieje ciągle potrzeba dalszych usprawnień i dostosowania enzymów do układów detergentowych, jak również lepszego zrozumienia mechanizmu działania proteazy i degradacji w praktycznym zastosowaniu w kompozycjach czyszczących lub piorących. Takie zrozumienie może skutkować zasadami stosowanymi do wyboru mutacji, które w rozsądnym stopniu pewności będą skutkowały tym, że enzym będzie wykazywał ulepszoną stabilność przechowywania i/lub ulepszone działanie w określonych warunkach w kompozycjach detergentowych.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że odmiana subtilazy o polepszonej trwałości przechowywania i/lub ulepszonym działaniu w detergentowych kompozycjach, może być otrzymana przez podstawienie jednej lub więcej niż jednej reszty aminokwasu usytuowanej w lub w sąsiedztwie hydrofobowej domeny macierzystej subtilazy przez resztę aminokwasu bardziej hydrofobową niż oryginalna reszta.

Przedmiotem wynalazku jest ciekła detergentowa kompozycja zawierająca odmianę subtilazy, która obok typowych składników zawiera subtilazę, w której jedna lub więcej niż jedna reszta aminokwasu usytuowana w lub w sąsiedztwie hydrofobowej domeny rodzicielskiej subtilazy została podstawiona przez resztę aminokwasu bardziej hydrofobową niż oryginalna reszta, przy czym odmianą subtilazy jest R170L lub R170I.

Korzystnie kompozycja zawiera subtilazę, której rodzicielska subtilaza jest wybrana z grupy zawierającej ABSS168, BASBPN, BSsDy i BLSCAR.

W korzystnym wykonaniu kompozycja zawiera subtilazę, której macierzysta subtilaza jest wybrana z podgrupy I-S2, a zwłaszcza z grupy zawierającej BLS147, BLS309, BAPB92 i BYSYAB, a szczególnie korzystnie zawiera subtilazę, której macierzystą subtilazą jest TVTHER.

184 399

W innym korzystnym wykonaniu korzystnie według wynalazku zawiera subtilazę, która jest odmianą połączoną z dalszymi substytucjami, delecjami i/lub insercjami w dowolnej jednej lub więcej, z pozycji: 36, 57, 76,218, 222 i 224.

W tym wykonaniu korzystnie zawiera subtilazę należącą do podgrupy I-S2 z dalszą zmianą wybraną z grupy obejmującej *36D, S57P, N76D, N218S, M222S, M222A i T224S.

Korzystne kompozycje według wynalazku zawierają odmianę subtilazy wybranąz grupy odmian obejmujących:

a) S57P + R170L a') S57P + R170I

b) R170L + N218S b') R170I+N218S

c) S57P + R170L + N218S c') S57P + R170I + N218S

c) S57P + V104Y + R170L + N218S c) S57P + V104Y + R170I + N218S

d) R170L + N218S + M222A d') R170I + N218S + M222S

e) S57P + R170L + S188P + A194P

e) S57P + R170I + S188P + A194P

f) Y167L + R170L

f) Y167L + R170I

g) Y167I + R170L g') Y167I + R170I

h) N76D + R170L + N218S h') N76D + R170I + N218S

i) S57P + N76D + R170L + N218S i') S57P + N76D + R170I + N218S

j) N66D + R170L + N21S S + M222A j') ^6DD+ :^7001+^HS S + M22SS j) N76D + NUDL + N^LS + MUSA j^w) N76D + RfZDL + N208S + M12SS

k) S57P + + S188P + A144P + NUSS

k) S57P + R170L + S188P + A194-P+ N218S

l) *36D + N76D + H120D + R170L + G195E + KK33L l') *36D + N76D + H120D + + G195E + K235L

m) N76D + H120D + R^L + G195E + K235L m') N76D + H^D + R170I + G195E + K235L

n) *36D D- G97N + V104Y + H120D D RHOL + A114P + G195E + K235L n') *36D + NNH + + + RHW + A194P + G195E + K235L

o) S57P + RUdL + o') S57P + R170I + Q306E

p) R170L + Q206E p') R1701 + Q206E

q) Y1167I + R170L + Q206E q') Y667I + RHOI + Q206E

r) Y^F + RHOL r') Y667F + RUOI

t) Y^I + RnOL + A^P t') Y667 I + R170I + A994P

u) Y167 I+ R170L+ N288S u') Y167I + R170I + R318S

v) Y167 I + RnOL + AWP + roUS

184 399

V) Y167I + R170I + A194P + N218S

x) R170L + P131V x') R170I + P131V

y) *36D + Y167I + R170L y') *36D + Y167I + R170I aa) Y167V + R170L aa') Y167V + R170I

W korzystnym wykonaniu kompozycja według wynalazku ponadto zawiera deflokujący polimer.

Szczególnie korzystna kompozycja jako odmianę subtilazy zawiera S57P + V104Y + R170L + N218S albo S57P + V104Y + R170I + N218S.

W powyższych oznaczeniach i w dalszej części opisu stosowane są następujące skróty. Skróty

Aminokwasy

A	Ala	Alanina
V	Val	Valina
L	Leu	Leucyna
I	Ile	Izoleucyna
P	Pro	Prolma
F	Phe	Fenyloalarntina
W	Trp	Tryptofan
M	Met	Metionina
G	Gly	Glicyna
S	Ser	Seryna
T	Thr	Threonina
C	Cys	Cysteina
Y	Tyr	Tyrozyna
N	Asn	Asparagina
Q	Gin	Glutamina
D	Asp	Kwas aspartowy
E	Glu	Kwas glutamowy
K	Lys	Lizyna
R	Arg	Arginina
H	His	Histydyna

Zasady kwasów nukleinowych

A = Adenina

G = Guanina

C = Cytozyna

T = Tymina (tylko w DNA)

U = Uracyl (tylko w RNA)

Odmiany

Do opisywania różnych odmian enzymu wytworzonych lub rozważanych według wynalazku, zastosowano następujące nazewnictwo: oryginalny(e) aminokwas(-y) - pozycja(-e) - podstawiony^) aminokwas(-y).

Według tego glicyna w pozycji 195 kwasu glutaminowego jest określona jako:

Gly 195 Glu albo G195E delecja glicyny w tej samej pozycji jest określona jako:

Gly 195 * albo G195* a insercja dodatkowej reszty aminokwasu takiej jak lizyna jest określona jako:

Gly 195 GlyLys albo G195GK

Przy czym delecje wskazane w tabeli I, lub obecność w subtilizynie niewskazana w tabeli I, insercje w takiej pozycji są określane jako:

18-4399 * 36 Asp albo *36D dla insercji kwasu aspartowego w pozycji 36.

Wielokrotne mutacje są oddzielone plusami, np:

Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu albo R170Y+G195E oznacza mutacje w pozycji 170 i 195 podstawione przez tyrozynę i kwas glutamowy zamiast, odpowiednio argininy i glikozyny.

Pozycje

Dla opisania odmian w niniejszym zgłoszeniu oraz w załączonych zastrzeżeniach stosuje się uszeregowanie odmian subtilazy jak w Siezen i in., Supra. W innych publikacjach odnoszących się do subtilazy stosowano inne uporządkowanie lub numerację specyficznych enzymów. Dla fachowcajest sprawąrutynową ustalenie pozycji ze specyficznąrcsztą w zastosowanej numeracji. Odnośniki do fig. 1, przedstawiają uszeregowanie reszt odpowiednich dla niniejszego wynalazku, z ogromnej liczby subtilaz. W tabeli I zrobiono odnośnik do publikacji WO-A-91/00345 pokazujący uporządkowanie reszt odpowiednich dla niniejszego wynalazku, z ogromnej liczby subtilaz.

Tabela I

Obecnie znane subtilazy (z Siezen i in., Supra).

Organizm	cDNA, gen	enzym	akronim
1	2	3	4
PROKARIOTYCZNE Bakterie: gram-dodatnie Bacillus subtilis 168	apr A	subtilizyna 1168, apr	ABSS168
Bacillus amyloliquefaciens	apr	subtilisin BPN' (NOVO)	BASPPN
Bacillus subtilis DY	-	subtilizyna DY	BSSDY
Bacillus licheniforms	+	subtilizyna Carlberg	BLSCAR
Bacillus lentus	+	subtilizyna 147	BLS147
Bacillus alcalophilus PB92	+	subtilizyna PB	BAPB92
Bacillus sp. DSM 4828	-	proteaza zasadowa	BDSM48
Bacillus YaB	ale	elastaza zasad. YaB	BYSYAB
Bacillus subtilis 168	epr	min. extracell.prot.	BSEPR
Bacillus subtilis	bpf	bacillopeptydaza F	BSBPF
Bacillus subtilis IFO3013	ispl	intracell.ser.	BSISP1
Bacillus subtilis A50	-	intracell.ser.prot.	BSIA50
Bacillus thuringiensis	-	extracell.ser.prot.	ETFINI
Bacillus cereus	-	extracell.ser.prot.	BCESPR
Nocardiopsis dassonvillei	-	zasadowa ser.prot.	NDAPII
Thermactinomyces vulgaris	-	termitaza	TVTHER
Enterococcus faecalis	cylA	cytolizyna skł. A	EFCYLA
Staphylococcus epidermidis	epiP	epidermin lead.prot.	SEEPIP
Streptococcus pyrogenes	scpA	C5a peptydaza	SPSCPA
Lactococcus lactis SK11	prtP	SK11 cell wall prot.	LLSK11
Bakterie gram-ujemne
Dichelobacter nodosus	+	zasadowa proteaza	DNEBPR
Xanthomonas campestris	+	extracellular prot.	XCEXPR
Serratia marcescens	+	Exrtacell. ser.prot.	SMEXSP
Thermus aquaticus YT-1	pstI	aqualizyna I	TAAQUA
Thermus rT41A	+	T41A proteaza	TRT41A
Vibrio alginolyticus	proA	proteaza A	VAPROA
Streptomyces rutgersensis	-	proteinaza D	SRESPD
Archaea halophilic strain 172P1	-	halophil extra.prot.	ARB172
CyjanobakteriE Anabaena variabilis	prcA	Ca-zależna proteaza	AVPRCA

184 399

Tabela 1 - ciąg dalszy

1	2	3	4
Niższe eukariotyczne Grzyby Tritirachium album Limber	+	proteinaza K	TAPROK
Tritirachium album	+	proteinaza R	TAPROR
TritreacCium album	proT	proteinaza T	TAPROT
Aspergillus oryzae	+	zasadowa proteaza	AOALPR
Malbranchea pulchella	-	termomykolina	MPTHMY
Acremonium chrysogenum	alp	zasadowa proteaza	ACALPR
Drożdże Klnyweromyces lactis	kex1	kex1 (tr.proteinaza	KLKEX^1
Sacharomyces ahehvrsrae	kex2	kex2 ser. proteinaza	SCKEX2
Sacharomyces ahrhvrsiae	prb1	proteaza B	SCPRB1
Yarrowia hpolytica	xpr2	zas. extrαctll.prot.	YLXPR2
Wyższe kariotyczne Robaki Cahnorhabditis elegans	bli4	cuticle proteaza	CEBLI4
Owady Drosophila (muszka owocowa)	furl	furin1	DMFUR1
Drosophila (muszka owocowa)	fur2	furin2	DMFUR2
Rośliny. Cucumis melo (melon)	«	cncnmi(in	CMCUCU
Ssaki Człowiek (tez szczur, mysz)	fur	furin	HSFURI
Człowiek (również mysz)	+	insulinoma PC2 prot.	HSIPC2
Mysz	+	pituitary PC3 prot.	MMPPC3
Człowiek	+	tripeptydyl peptid.II	HSTPP

Odnośniki stosowane w tabeli I

Odnośniki sekwencji aminokwasów (powiązania z danymi GenBank®/EMBL Data Bank podano w nawiasach):

ARB172 Kimiekura i Seno. (1990) Biochem. CeliBioL 68 352-359 (sekwencjonowane aminokwasy dojrzałej proteazy reszty 1-35; reszta 14 nie określona).

BSS168 Stahl)iFeraari. 11984) J. Bacteriol. 158411-418(K01988). Yoshimoto. Oyamai inni (1488) J Biochem. 103 1060-1065 (dojrzała subtilizyna z B. subtilis var. amylosacchariticus odróżniająca się posiadaniem T130S i T162S). Svendsen i inni (1986) FEBS Lett. 196 228-232 (PIR A23624; sekwencjonowane aminokwasy; dojrzała alkaliczna mesentericopeptydaza z B. meseμμμ odróżniająca się posiadaniem S85A, A88S, S89A, S183A i N259S).

BASBPN WeHsinm) 11983) Nuci Acids Res 11 7911-7925 XC00165.. Vasantha i irmi (1984) J. Bacteriol. 159 811-814 (K02496).

BSSDY Nedkov i inni (1983) Hoppe-Seylers Z. PhysioL Chem. 364 1537-1540 (PIR A00969; sekwencjonowane aminokwasy).

BLSCAR Jacobs i ΐηηΐ (1985) NucL AcidsRes 13 8913-9926 . Smith i ϊηηΐ (1968) J. Biol Chem. 243 2184-2191 (PIR A00968; sekwencjonowane aminokwasy; sekwencja dojrzałej proteazy odróżniająca się T103S, P129A, S158N, N161S i S212N).

BLS147 Hastnip i hmi (1989) zgooszenic patentowe PCT WO’) 89/06279 . publ . 13 iipca

1989 (Esperase® z B. lentus). Takami i inni (1990) Appl. Microbiol. Biotechnol. 33 519-523 ((ekwencConowane reszty aminokwasów alkalicznej proteazy reszty 1-20 z Bacillus sp. nr AH-101; ta sekwencja odróżnia się od BLS147 przez posiadanie N11S).

184 399

ΒΑΒΡ92

BDSM48

BYSYAB

BSEPR

BSBPF

BSISP1

BSIA50

BTFINI

BCESPR

NDAPII

TVTHER

EFCYLA

SEEPIP

SPSCPA

DNEBPR

LLSK11

XCEXPR

SMEXSP

TAAQUA

TRT41A

VAPROA

SRESPD

AYPRCA van der Laan i inni (1991) Appl. Erwiron. Microbiol. 57 901-909. (Maxacal®). Hastrp i inni (1989) zgłoszenie patentu PCT WO 89/06279, publ. 13 lipca 1989. (subtilizyna 309, Savinase® z B. lentus odróżnia się tylko posiadaniem N873). Godette i inni (1991) Abstracts 5-th Protein Society Symposium, 6 czerwca, Baltimore: skrót M8 (wysokoalkaliczna proteaza z B. lentus odróżnia się posiadaniem N87S, S99D, S101R, S103 A, V1041 i G159S). Rettenmaier i inni (1990) zgłoszenie patentu PCT WO 90/04022, publ. 19 kwietnia 1990.

Kaneko i inni (1989) J. Bacteriol. 171 5232-5236 (M28537).

Slomai inni (1988)7. Bacteriol. 1705557-5563 (M22407). Bruckner (1990) Mol. Gen. Genat. 221 486-490 (Χ53307).

Słoma i inni (1990) J. Bacteriol. 172 1470-1477 (M29035; skorygowany). Wu i inni (1990) J. Biol. Chem. 265 6845-6850 (J05400); ta sekwencja odróżnia się posiadaniem A169V i 586 mniej C-terminalne reszty odpowiednio do struktury).

Koide i inni (1986) J. Bacteriol. 167 110-116 (M13760).

Strongin i inni (1978)7. Bacteriol. 133 1401-1411 (sekwencj onowane aminokwasy dojrzałej proteazy reszt 1-54; reszt 3; 39; 40; 45; 46; 49 i 50 nie określono).

Chestukhina i inni (1985) Biokhimiya 50 1724-1730 (sekwencj ono wane aminokwasy dojrzałej proteazy reszty 1-14 z B. thurigiensis variety israeliensis, i reszty 1-16 i 223-243 z odmiany initimus). Kunitate i inni (1989) Agric. Biol. Chem. 53 3251-3256 (sekwencj ono wane aminokwasy dojrzałej proteazy reszty 6-20 z odmiany kurstaki. BTKURS).

Chestukhina i inni (1985) Biokhimiya 50 1724-1730 (sekwencj ono wane aminokwasy dojrzałe reszty 1-16 i 223-243).

Tsujibo i inni (1990) Agric. Biol. Chem. 54 2177-2179 (sekwencj ono wane aminokwasy dojrzałe reszty 1-26).

Meloun i inni (1985) FEBS Lett. 183 195-200 (PIR A00973; (sekwencjonowane aminokwasy dojrzałej proteazy reszty 1-274).

Segarra i inni (1991) Infect. Immun. 59 1239-1246.

Schnell i inni (1991) osobiste doniesienie (Siezen i inni (supray).

Chen i inni (1990) 7. Biol. Chem. 265 3161-3157 (J05224).

Kortt i inni (1991) Abstract %th Protein Society Symposium, 22-26 czerwca, Baltimore, skrót S76.

Vos i inni (1989) 7. Biol. Chem. 264 13579-13585 (J04962). Kok i inni (\9%$)Appl. Environ. Microbiol. 54231-238 (M24767); sekwencja z łańcucha Wg2 różniąca się pozycją44, obejmuje 18 różnic w domenach proteazy, i delecja reszt 1617-1676). Kiwaiki i inne (1989) Mol. Microbiol. 3 359-369 (X1413 0; sekwencj a z łańcucha N CD0763 różniąca siępozycją46, obejmuje 22 domenę proteazy i delecje reszt 1617-1676).

Liu i inni (1990) Mol. Gen. Genet. 220 433-440.

Yanagida i inni (1986) 7. Bacteriol. 166 937-994 (M13469).

Terada i inni (1990) 7 Biol. Chem. 265 6576-6581 (J054I4).

McHale i inni (1990) Abstracts 5-th Eur. Congr. Biotechn. Christiansen, Munck i Villadsen (eds), Munksgaard Int. Publishers, Copenhagen.

Deane i inni (1989) Gene 76 281-288 (M25499).

Lavrenova i inni (1984) Biochemistry USSR. 49 447-454 (sekwencjonowane aminokwasy reszty 1-23; reszt 13, 18 i 19 nie określono).

Maldener i inni (1991) Mol. Gen. Genet. 225 113-120 (publikowana sekwencja ma 28 nieokreślonych reszt w pobliżu pozycji 2000-210 odpowiednio do błędu odczytywania struktury).

184 399

TAPROK

TAPROR

TAPROT

AOALPR

MPTHMY

ACALPR

KLEX1

SCKEX2

SCPRB1

YLXYPR2

CEBL14

DMFUR1

DMFUR2

CMCUCU

HSFURI

HSIPC2

MMPPC3

HSTPP

Gunkel i Gassen (1989) Eur. J Biochem. 179 185-194 (X14688/XI4689). Jany i inni (1986) J. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367 87 (PIR A24541; sekwencjonowane aminokwasy; dojrzała proteaza różni się posiadaniem S745G, SILST204-208DSL i VNLL264-267FNL).

Samai i inni 11990) Mol. Mirrobiol. 4 17894792 ¢556116).

Samai i mni 0989) Gnni 85 329-333.

Tatsumi i inni (1989) Mol. Gen. Genet. 219 33-38. Cheevadhanarah i inni (1991) EMBL Data Library (X54726).

Gaucher i Stevenson 91976) Methods Enzymol. 45 415-433 (sekwencjonowane aminokwasy reszty 1 -28, i heksapeptyd LSGTSM z aktywnym centrum seryny).

Isogal 1 ńmi 11991) Agbic. ΒίοΙ. Chem. 55 471477 . Stepimov i inni (1986) Int. J. Biochem. 18 369-375 (sokwoncjonowano aminokwasy reszty L27; dojrzała proteaza różniąca się posiadaniem H13 [1] Q, R13 [2]N i S13 [6]A).

Wescdowkiii-Louel i Fukthaaaa 11988i FEBS lett. 234 464-470 (X07038).

Mizuno i inni 0988i Bucchem. Bóopyys. Rss. Commnn. 156 246-254 (M24201).

Moehle i ίηηί 0987i Mol. Clll. Βίοι 7 4390-4399 (Ml8097).

davidow i unii 11987IJ. ΒαΡ^Μ. 169 4627 4629 (M1774)) . Maooba i inni (1988) Mol. Cell. Biol. 8 4904-4916 (M23353).

Peter i Roee 099)i Des Noem BeeedrEs Gazette 1i 2..

Roebooek i mni 199)i FEBS Lett. 289 133437 0559384).

Roebooek i mni Ο992) 267 ^12^^1^255.

Kaneda i ΐηη i 19 984) J. Βϊαοίκτη. 95 825-829 IeekwencSonowane ammokwasy oktapeptydu NIISGTSM z aktywnym centrum seryny). vrni den ΟποιΙ^Ι ibrni 09901 NuoI. AiiSs Rss. 18 664 seelweencja mysiej furyny różniąca się w pozycji 51, obejmuje pięć katalitycznych domen: A15E, Y21F, S223F, A232V i N258[2]D0. MISUMII INNI (1990) Nucl. Acids Res. 18 6719(X55660: sekwoncja szczurzej furyny różniąca się w pozycji 49, obejmuje 3 katalityczne domeny: A15E, Y21f, H24R). Smokiem i Slemrr0990)7. ΒΐοΙ. Chem. 26i 29974ΟΟΙ (J05252) . Seddah i inni (1990) DNA Cell Biol. 9 415-854 (sekwencja proteazy mysiej przysadki PC2 różna w pozycji 23, obejmująca siedem domen proteazy: I4F, S42[2]Y, E45D, N76S, D133E, V134L i G239 [1]D).

Smeekens imni 0991) PPooc. Natl.Aadd Uci. USAi 88 340-344(58572) . Stidah i inni (1990) DNA Cell Biol. 9 415-424 (M55668/M55669; częściowa sekwencja)

Tonkemson i ennISon099)i Bóohhemietry 30 168474 (0^299^).

Krótki opis figur

Na rysunkach, figura 1 przedstawia uszeregowanie wymienionych w tabeli I;

Figura 2 jest trójwymiarowym przedstawieniem subtilizyny 309 pokazującym położenie hydrofobowych domen i niektóre podstawione reszty aminokwasów w ich sąsiedztwie.

Nieoczekiwanie okazało się, że trwałość przechowywania i/iub działanie w detergentowych kompozycjach jest polepszone jeżeli reszty aminokwasów usytuowane w sąsiedztwie hydrofobowych domen zawierają reszty P129, P131,1165, Y167, Y171 subtilizyny 309 podstawione przez bardziej hydrofobowe reszty. Zwłaszcza przez reszty R170.

Figura 2 przedstawia hydrofobowe domeny w subtilizynie 309 i numery reszt w ich sąsiedztwie podstawione w celu zwiększenia hydrofobowości domeny. Może to być osiągnięte przez podstawienie hydrofobowych reszt zamiast nie hydrofobowych reszt i/iub przez podstawienie reszt aby stały się bardziej hydrofobowe niż w macierzystym enzymie.

Te same zasady zastosowano do odpowiednich hydrofitowych domen innych subtilaz, których identyfikacja jest oczywista dla przeciętnego fachowca pracującego w tej dziedzinie techniki. Graficzne przedstawienia, jak na figurze 2, mogąbyć wykonane dla innych subtilaz dla określenia celowych reszt do podstawienia zgodnie z wynalazkiem.

Ich liczbę przedstawiono poniżej w tabeli II:

Tabela II

Reszty hydrofobowych domen i ich sąsiedztwa

Poz.\Enzym	BASBPN	BLSCAR	BLS309	BLS147	TVTHER
Domena
129	P	A	P	T	T
131	G	G	P	G	G
165	V	I	I	V	P
167	Y	Y	Y	Y	Y
171	Y	Y	Y	Y	Y
Sąsiedztwo
136	K	K	E	E	Q
159	S	S	G	G	T
164	T	T	S	G	A
170	K	K	R	R	Y
194	P	A	A	P	S
195	E	E	G	E	V

Tabelę II skonstruowano zgodnie z uszeregowaniem przedstawionym na figurze 2. Jest oczywiste, że podobne lub większe tabele obejmujące inne subtilazy mogą być łatwo stworzone przez fachowców.

W wynalazku stosuje się odmiany subtilazy, w których zmieniono sekwencje aminokwasów przez mutacje genu enzymu subtilizyny, który zaplanowano do modyfikacji (macierzysty enzym lub gen) w kodonie odpowiedzialnym za ekspresję reszt aminokwasów w pozycjach 129, 131,165,167,171,136,159,164,170,194 i 195, których reszty są bardziej hydrofobowe niż reszta(-y) w macierzystym enzymie, zwłaszcza takie hydrofobowe reszty, które zawierają względnie długi hydrofobowy łańcuch, takie jak Ile, Leu i Val, przy czym, jeżeli zmutowany gen jest ekspesjonowany, reszta aminokwasu jest podstawiana przez bardziej hydrofobową resztę, która zwiększa hydrofobowość domeny jako takiej.

Na ogół hydrofobowe reszty są następujące: Val (V), Ile (I), Leu (L), Met (M), Phe (F), Pro (P) i Trp (W). Między nimi korzystne są Val, Ile i Leu. Patrząc na tabelę II i stosując zasady według wynalazku można wskazać wiele kandydatur odpowiednich do podstawienia.

Dla obu BASBPN i BLSCAR wydają się odpowiednie do dokonania podstawienia pozycje 136, 159, 164, 167, 170 i 195. W BLS309 pozycje 136,164,167 i 170 byłyby w pierwszej kolejności do wybrania, a pozycje 159 i 195 byłyby w drugiej kolejności. W BLS147 pozycje 136, 167, 170 i 195 byłyby w pierwszej kolejności a pozycje 159 i 164 w drugiej kolejności. Na koniec w TVTHER pozycje 136, 167 i 194 są w pierwszej kolejności a pozycja 164 w drugiej.

Będzie to pociągało za sobą korzyści z podstawienia reszty Gly w hydrofobowej domenie na bardziej zabudowaną przestrzennie i bardziej hydrofobową resztę.

Takie rozważania stosuje się do hydrofitowych albo hydrofobowych reszt mogących zajmować dowolną z wymienionych pozycji, oznacza to, że każdy wzrost hydrofobowości wydaje się być korzystnym. To oznacza, że np. bardzo hydrofitowe reszty takie jak naładowane reszty Arg (A), Asp (D), Glu (E) lub Lys (K) mogą być podstawione przez dowolną resztę, która jest

184 399 mniej hydrofilową. Takie mniej hydrofilowe reszty obejmują reszty Gly (G), Cys (C), Ser (S) Ala (A), Thr (T), Tyr (Y), Gln (Q), His (H) lub Asn (N).

Podobne rozważania mogą być stosowane do innych subtilaz mających hydrofobowe domeny w tej części powierzchni enzymu.

W kontekście niniejszego wynalazku subtilaza jest określona według Siezen i in. powyżej. W węższym sensie, zastosowanym do wielu wykonań wynalazku, subtilazy odpowiednie to takie, które należądo podgrup I-S 1i I-S2. W bardziej specyficznym sensie wiele wykonań wynalazku odnosi się do proteazy serynowej gram-pozytywnych bakterii, które mogabyć podciągnięte w zasadniczo niedwuznacznej homologii w ich pierwszorzędowej strukturze, do subtilaz wymienionych w tabeli I powyżej.

Możliwe jest jedno lub więcej niż jedno, podstawienie w wyżej określonych pozycjach w kombinacji z innym podstawieniem, delecjąlub addycjądo sekwencji aminokwasów w macierzystym enzymie. Rozważane są zwłaszcza kombinacje z innymi podstawieniami znanymi z polepszania właściwości enzymu.

Takie kombinacje obejmują pozycje: 222 (polepszona stabilność tlenowa), 218 (polepszona stabilność termiczna), podstawienia w centrach wiążących Ca stabilizujące enzym, np. pozycja 76, i wiele innych odróżniających od stanu techniki. Co więcej, rozważane są również specyficzne kombinacje z odmianami wskazanymi w publikacji EP-A-405 901.

Odmiany

A: pojedyncze odmiany:

Subtilizyna BPN', Subtilizyna Carlsberg, Subtilizyna 168 i Subtilizyna DY odmiany:

K136V,	K13^I,	K136L, K136M, K136F,
S159V,	S1591,	S159L , S159M, S159F,
T164V,	T1641,	SKUL, SI UHM, S164F,
K170V,	K1701,	KI70L, K170M, K170F,
E195V, E1951, Odmiany termitazy:	E195L, E195M, E195F,
Q136V,		Q136L, ęiUM, Q136F,
T159V,	Tl 591,	T159L T159M, T159F,
A164V,	Al^^I,	A164L, A164M, A164F,
Y167V,	YH7I,	Y167L, Y167M, Y167F
Y170V,	Y110I,	Y170L, Y170M, Y170F,
S194V,		H44L, SH4M, S194F,
Odmiany Subtilizyny 309, Subtilizyny 147 i proteaza Bacillus PB92:
E136V,	E136I,	E134L, E136F,
G159V,	G1^^9,	G194L, G159M,
G164V,	G1^^^4,	dUL, GlUtM, <^1^^«,, (BLS147)
S164V,	S^L	^L, SHHM S164F, (BLS309 i BAPPB92)
Y167V,	Y^H,	YHLL, Y167M,
R170V,	RUM,	(oba wyłączone dla PAPB92)
R170L,	R170M,	(wyłączone dla PAPB92), RI00F,R170GIRI00C
A194V,	Aim,	A194L, A194F, (BLS309 ΐ BAPB99)
P194V,	P19U ,	P194L , PWM, P194F, (BLS147)
E195V,	E^,	E195L, EmM, E195F, (BLS447)
G195V, G195I, B: odmiany kombinacji:	Gl95L, G195M, G195F, ^^LS399 i BAPB92)

Każda z wymienionych wyżej odmian jest rozważana pod względem dawania korzyści po połączeniu z innąodmianąw dowolnej zpozycji: 27, 36, 57, 76, 101,104, 123, 218, 222, 224 i 274.

Zwłaszcza, następujące odmiany BLS309 uważa się za odpowiednie do kombinacji:

K27R, *36D, S57P, N76D, S101G, V104A, V104N, V104Y, N123S, A194P, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S i T274A.

184 399

Takie odmiany również zawierają dowolny jeden lub dwa podstawniki X167L, X167I, X170L i/lub X170I w kombinacji z dowolnie jednym lub więcej niż jednym, innymi podstawieniami, delecjami i/lub insercjami wskazanymi powyżej jako korzystne.

Co więcej, odmiany obejmują dowolne odmiany spośród V104N+S101G, K27R+V104Y+ +N123S+T27A lub N76D+V104A, w kombinacji z dowolnie jednym lub więcej niż jednym podstawieniem, deleejąi/lub insercją wskazaną wyżej jako zdającą się wykazywać ulepszone właściwości.

Specyficzne kombinacje wymieniono wcześniej.

Kompozycje czyszczące i detergentowe według wynalazku mają zasadniczo postać ciekłych kompozycji detergentowych, ale odmiany subtilazy mogąbyć włączane do kompozycji detergentowych w postaci kostek, tabletek, pałeczek i podobnych, do bezpośredniego stosowania, których wykazują polepszoną stabilność enzymu.

Korzystnie kompozycje według wynalazku są zwłaszcza wodnymi ciekłymi detergentami mającymi na przykład jednorodne fizyczne właściwości, np. mogą one zawierać micelarny roztwór środków powierzchniowo czynnych w ciągłej fazie wodnej, tak zwane ciecze izotropowe.

Alternatywnie i korzystnie, mogą one mieć heterogenną fizycznie fazę i mogąbyć strukturowane, na przykład mogą zawierać dyspersję lamelarnych kropelek w ciągłej fazie wodnej, na przykład zawierające polimer zapobiegający flokulacji mający hydrofilowy szkielet i co najmniej jeden hydrofobowy łańcuch boczny, jak opisane w publikacji EP-A-346 995 (Unilever) (włączonej jako odnośnik literaturowy do niniejszego zgłoszenia). Te ostatnie ciecze sąheterogenne i mogą zawierać zawiesinę cząstek stałych takich jak cząstki materiału wypełniacza np. z rodzaju opisanych poniżej.

Korzystnie, ciekłe kompozycje czyszczące i detergentowe według wynalazku powinny mieć wysokie stężenie elektrolitów, tak jak opisano w publikacjach patentowych EP-A-328177, EP-A-359308, EP-A-328176, EP-A-346995 (wszystkie Unilevera).

Takie kompozycje zawierają jedną lub więcej niż jedną odmianę enzymu subtilizyny w połączeniu z dowolnymi składnikami zazwyczaj włączanymi do takich kompozycji, dobrze znanymi fachowcom.

Takie składniki obejmują wypełniacze, takie jak fosforanowe lub zeolitowe wypełniacze, środki powierzchniowo czynne, takie jak anionowe, kationowe, niejonowe lub obojniaczojonowe środki powierzchniowo czynne, polimery, takie jak polimery akrylanowe lub ich ekwiwalenty, układy wybielające, takie jak nadboranowe lub zawierające aminy prekursory bielenia lub aktywatory, środki nadające strukturę, takie jak silikonowe strukturanty, zasadę lub kwas dla ustalenia pH, substancje pochłaniające wilgoć i/lub obojętne nieorganiczne sole.

Ponadto, wiele ewentualnych składników zazwyczaj występujących w kompozycjach według wynalazku, takich jak:

A. Ewentualne kosurfaktanty

B. Wypełniacz winianowo bursztynianowy

C. Układ neutralizujący

D. Środek eliminujący mydliny

E. Inne enzymy

F. Ewentualne inne składniki

Stosunek wagowy syntetycznego anionowego środka powierzchniowo czynnego do etoksylowanego niejonowego środka powierzchniowo czynnego wynosi od 1:1 do 5:1. Kompozycje mają w roztworze 10% wagowych w temperaturze 20°C, zakres pH od 7,0 do 9,0; a krytyczne stężenie micelalne (Critical Micelle Concentration) mniejsze lub równe 200 ppm, a napięcie międzyfazowe powietrze/woda przy krytycznym stężeniu micelalnym mniejsze lub równe 32 dyny/cm w 35°C w destylowanej wodzie. Korzystnie kompozycje są klarowne, homogenne i stabilne fazowo oraz mają dobre działanie czyszczące i dobrą stabilizację enzymu.

184 399

Różne składniki

1. Syntetyczne anionowe środki powierzchniowo czynne

Ciekłe detergentowe kompozycje według wynalazku zawierają od około 10% do około 50%, korzystnie od około 15% do około 50%, korzystniej od około 20% do 40%, a najkorzystniej od 20% do około 30% wagowych naturalnych lub syntetycznych środków powierzchniowo czynnych. Odpowiednie naturalne lub syntetyczne środki powierzchniowo czynne np. mydła i takie jak ujawnione w publikacjach US-A-4 285 841, i US-A-3 929 678.

Odpowiednie anionowe środki powierzchniowo czynne obejmują rozpuszczalne w wodzie sole, zwłaszcza metali alkalicznych, sole amonowe i alkiloamonowe (np. monoetanoloamina lub trietanoloamina), produkty reakcji sulfonowania związków organicznych mające w swojej strukturze cząsteczkowej grupę alkilową zawierającą od około 10 do około 20 atomów węgla i grupę kwasu sulfonowego lub ester kwasu siarkowego. (Określenie „alkilowa” obejmuje też alkilową część grupy arylowej). Przykładami tej grupy syntetycznych środków powierzchniowo czynnych są siarczany alkilu, zwłaszcza otrzymane przez sulfonowanie wyższych alkoholi (C₈-C]8 atomów węgla) takich jak wytworzone przez redukcję glicerydów oleju talowego lub kokosowego; siarczany alkilobenzenu, w których grupy alkilowe zawierają od około 9 do około 15 atomów węgla w prostym lub rozgałęzionym łańcuchu, np. takie jak opisane w patentach US 2 220 099 i US 2 477 383. Zwłaszcza cenne są siarczany alkilobenzenu o prostym łańcuchu alkilowym o średniej liczbie atomów węgla w grupie alkilowej od około 11 do 14.

Inne anionowe środki powierzchniowo czynne to rozpuszczalne w wodzie sole: siarczany parafin zawierające od 8 do około 24 (korzystnie około 12 do 18) atomów węgla; alkilogliceryloeterosiarczany, zwłaszcza etery alkoholi Cg-C^ (np. wytworzone z oleju talowego i kokosowego); alkilofenoloetoksylowane eterosiarczany zawierające od 1 do około 4 jednostek tlenku etylenu na cząsteczkę i od 8 do 12 atomów węgla w grupie alkilowej; oraz etoksylowane alkiloeterosiarczany zawierające 1 do 4 jednostek tlenku etylenu na cząsteczkę i od 10 do 20 atomów węgla w grupie alkilowej.

Inne odpowiednie anionowe środki powierzchniowo czynne obejmują rozpuszczalne w wodzie sole estrów α-sulfonowanych kwasów tłuszczowych zawierające od 6 do 20 atomów węgla w grupie kwasu tłuszczowego i od 1do 10 atomów węgla w grupie estrowej; rozpuszczalne w wodzie sole kwasów 2-acyloksyalkeno-1-sulfonowego zawierające od 2 do 9 atomów węgla w grupie acylowej i od 9 do 23 atomów węgla w ugrupowaniu alkanu; rozpuszczalne w wodzie sole siarczanów olefin zawierające od 12 do 24 atomów węgla; i siarczanów β-alkiloksy alkanów zawierające od 1do 3 atomów węgla w grupie alkilowej i od 8 do 20 atomów węgla w ugrupowaniu alkanu.

Korzystnymi anionowymi środkami powierzchniowo czynnymi są siarczany C^-C^ alkilu i etoksylowane alkilosiarczany zawierające średnio do 4 jednostek tlenku etylenu na mol siarczanu alkilu, liniowe C_n-C|3 alkilobenzenosiarczany, oraz ich mieszaniny.

2. Etoksylowane niejonowe środki powierzchniowo czynne

Drugim ewentualnym składnikiem jest etoksylowany niejonowy środek powierzchniowo czynny w ilości od 2% do 14%, korzystnie od 2% do 8%, korzystniej od 3% do 5% wagowych. Stosunek wagowy syntetycznego anionowego środka powierzchniowo czynnego (liczony na kwaśną zasadę) do niejonowego środka powierzchniowo czynnego wynosi od 1:1 do 5:1, korzystnie od 2:1 do 5:1, korzystniej od 3:1 do 4:1. Takie stosunki zapewniają tworzenie i adsorpcję wystarczająco twardych środków powierzchniowo czynnych na granicy powietrze/woda, aby zapewniały dobre usuwanie tłustych/olejowych plam.

Etoksylowane niejonowe środki powierzchniowo czynne mają wzór R'(OC2H4)_nOH, w którym R1 oznacza grupę alkilową C_I0-C₁₆, lub grupę Cg-C^ alkilofenylową, n ma wartość od 3 do 9, a niejonowy środek powierzchniowo czynny ma HLB (równowaga hydrofilowo-lipofilowa) od 6 do 14, korzystnie od 10 do 13. Takie środki powierzchniowo czynne zostały bliżej opisane w publikacjach US-A-4 285 841 i US-A-4 284 532. Szczególnie korzystne sąprodukty kondensacji alkoholi C₁₂-C„ z od 3 do 8 molami tlenku etylenu na mol alkoholu, np. alkohol C^-C^ skondensowany z około 6,5 molami tlenku etylenu na mol alkoholu. Inne niejonowe środki

184 399 powierzchniowo czynne, o których należy wspomnieć to APG, EGE i glukamidowe środki powierzchniowo czynne.

3. Detergentowe wypełniacze

Pomiędzy typowymi składnikami detergentowymi, które mogą występować w typowych ilościach w detergentowych kompozycjach według wynalazku są następujące: kompozycje mogą być osadzone na wypełniaczu albo nie osadzone na wypełniaczu, a mogą być typu zero-P (np. mogą nie zawierać żadnych wypełniaczy zawierających fosfor). Kompozycje mogą zawierać w agregatach na przykład od 1-50%, np. co najmniej około 5% a często aż do 35-40% wagowych jednego lub więcej niż jednego organicznego i/lub nieorganicznego wypełniacza. Typowe przykłady wypełniaczy obejmują wyżej wspomniane oraz, szerzej opisując orto-, piro- i tripolifosforany metali alkalicznych, węglany metali alkalicznych, zarówno same jak i w mieszaninie z kałcytem, cytryniany metali alkalicznych, nitrylotrioctany metali alkalicznych, karboksymetyloksybursztyniany, zeolity, poliacetalokarboksylany itp.

Dokładniej biorąc kompozycje według wynalazku zawierająod 5% do 20%, korzystniej od 10% do 15% wagowych wypełniacza detergentowego, który może być kwasem tłuszczowym zawierającym od 10 do 18 atomów węgla i/lub polikarboksylanem, zeolitem, polifosforanem i/lub wypełniaczem polifosfonianowym. Korzystnie, kompozycje z.awierająod 0 do 10% (korzystniej od 3% do 10%) wagowych nasyconych kwasów tłuszczowych zawierających od 12 do 14 atomów węgla, razem z od 0 do 10%, korzystniej od 2% do 8%, najkorzystniej od 2% do 5% wagowych polikarboksylowanego wypełniacza, najkorzystniej kwasu cytrynowego, w stosunku wagowym od 1:1 do 3:1.

Ponieważ proteolityczne enzymy według wynalazku mająkorzystną optymalną stabilność przechowywania w przeciwieństwie do innych enzymów, gdy stosunek wypełniacza do twardości wody jest bliski jedności, to kompozycje korzystnie zawierają wypełniacz skuteczny do sekwestracji od 2 do 10, korzystnie od 3 do 8, grainów na galon twardości.

Odpowiednie nasycone kwasy tłuszczowe można otrzymać ze źródeł naturalnych takich jak roślinne lub zwierzęce estry (np. olej z ziarn palmowych, olej palmowy i kokosowy) lub wytworzyć syntetycznie (np. przez utlenianie ropy naftowej lub uwadarnianie tlenku węgla w procesie Fishera-Tropscha). Przykładami nasyconych kwasów tłuszczowych odpowiednich do użycia w kompozycjach według wynalazku są kwasy kaprynowy, larynowy, mirystynowy, kwasy tłuszczowe z orzecha kokosowego i z ziarna palmowego. Korzystne sąnasycone kwasy tłuszczowe z orzecha kokosowego; w stosunku wagowym od 5:1 do 1:1 (korzystnie około 3:1) mieszaniny kwasu laurynowego i mirystynowego; mieszaniny wyżej wymienionych z mniejszymi ilościami (np. 1 %-30% sumarycznie kwasów tłuszczowych) kwasu oleinowego i kwasu tłuszczowego z ziarn palmowych.

Kompozycje według wynalazku korzystnie zawierają również polikarboksylanowe, polifosforanowe i polifosfonianowe wypełniacze opisane w publikacji US-A-4 284 532; korzystne są rozpuszczalne w wodzie wypełniacze polikarboksylanowe, szczególnie cytryniany. Odpowiednie polikarboksylanowe wypełniacze obejmują różne aminopolikarboksylany, cykloalkanopolikarboksylany, alkilopolikarboksylany, poksypolikarboksylany, tetrahydropolikarboksylany, benzenopolikarboksylany i poliacetylopolikarboksylany.

Przykładami takich polikarboksylanowych wypełniaczy są sodowy i potasowy etylenodiaminotetraoctan; sodowy i potasowy nitrylotrioctan; rozpuszczalne w wodzie sole kwasu fitynowego, np. sodowy i potasowy fitynian, ujawnione w publikacji US-A-1 739 942, polikarboksylanowe materiały opisane w publikacji US-A-3 364 103; oraz rozpuszczalne w wodzie sole polikarboksylanowych polimerów i kopolimerów opisane w publikacji US-A-3 308 067.

Inne odpowiednie detergentowe wypełniacze obejmują rozpuszczalne w wodzie sole polimerycznych alifatycznych polikarboksylowych kwasów mających następujące strukturalne i fizyczne właściwości: (a) minimalny ciężar cząsteczkowy około 350 obliczony na postać kwasową; (b) ekwiwalentny ciężar 50 do 80 liczony jako postać kwasową; (3) co najmniej 45% molowych monomerowych fragmentów ma co najmniej dwa rodniki karboksylowe oddzielone jeden od drugiego nie więcej niż dwoma atomami węgla; (d) miejsce przyłączenia polimerowego łań20

184 399 cucha dowolnego rodnika zawierającego karboksyl jest oddalone o nie więcej niż trzy atomy łańcucha polimerowego od miejsca przyłączenia następnego zawierającego karboksyl rodnika. Specyficznymi przykładami takich wypełniaczy są polimery i komonomery kwasu itakonowego, akonitowego, maleinowego, mezokoinowego, fumarowego, metylenomalonowego i kwasu cytrakonowego.

Inne odpowiednie wypełniacze polikarboksylanowe obejmują rozpuszczalne w wodzie sole, zwłaszcza sodowe i potasowe kwasu melitowego, kwasu cytrynowego, kwasu piromelitowego, kwasu benzenopentakarboksylowego, kwasu oksodioctowego, kwasu karboksymetyloksybursztynowego, kwasu karboksymetyloksymalonowego, kwasu cis-cykloheksanoheksakarboksylowego, kwasu cis-cyklopentanotetrakarboksylowego i kwasu oksydibursztynowego.

Inne polikarboksylany to poliacetylokarboksylany opisane w publikacji US-A-4 144 226 i US-A-4 146 495.

Inne wypełniacze detergentowe obejmują zeolity, takie jak glinokrzemianowe materiały jonowymienne opisane w publikacji US-A-4 405 483.

Inne korzystne wypełniacze mają wzór ogólny R-CH(COOH)CH₂(COOH), tj. pochodne kwasu bursztynowego, w których R oznacza C₁7-C37 alkil lub alken, korzystnie C^-Cn, lub w których R może być podstawiony przez podstawnik będący hydroksylem, grupą sulfonową, sulfoksy lub sulfonem. Takie wypełniacze bursztynianowe są korzystnie używane w postaci ich rozpuszczalnych w wodzie soli, obejmujących sodowe, potasowe lub alkanoloamoniowe sole. Specyficzne przykłady bursztynianowych wypełniaczy obejmują: bursztynian laurylowy, bursztynian mirystylowy, bursztynian palmitynowy, bursztynian dodecenylowy i podobne.

4. Proteolityczne enzymy

Enzymy według wynalazku mogą być używane w kompozycjach detergentowych w dobrze znanych standardowych ilościach. Te ilości mogą się mieścić w szerokich granicach np. około 0,0002-0,1, np. około 0,005-5, jednostek Anson'a na gram detergentowej kompozycji. Wyrażając w alternatywnychjednostkach, proteazy mogąbyć włączone w kompozycje w ilości, w zależności od formulacji kompozycji, od około 0,1 do 100 GU/mg (np. 1-50, zwłaszcza 5-20 GU/mg), albo dowolna ilość w szerokim zakresie centrującym się przy około 0,01-4, np. 0,1-0,4 KNPU na gram formulacji detergentu.

Na przykład, może być dogodne stosowanie enzymów w ilości około 0,25 mg proteinowego enzymu na litr płynu do prania, odpowiadające aktywności enzymu 0,08 KNPU na liti*. Odpowiednie formulacje detergentu mogą zawierać enzymy na przykład w ilości zapewniającej 0,1-0,4 KNPU/g.

Inaczej mówiąc, kompozycja według wynalazku zawiera od około 0,01 % do około 5%, korzystnie od około 0,1% do około 2% wagowych enzymów proteolitycznych według wynalazku.

Opisany proteolityczny enzym jest korzystnie włączany w ilości skutecznej do zapewnienia aktywności od 0,05 do około 1,0; korzystniej od około 0,1 do 0,75; najkorzystniej od około 0,125 do około 0,5 mg aktywnego enzymu na gram kompozycji.

5. Układ stabilizujący enzym

Ciekłe detergenty według wynalazku mogązawierać układ An stabilizujący enzym, zawierający jon wapnia, kwas bomy, glikol propylenowy i/lub krótkołańcuchowe kwasy karboksylowe. Układ stabilizujący enzym stanowi od około 0,5% do około 15% wagowych kompozycji.

Kompozycja korzystnie zawiera od około 0,01 do około 50, korzystnie od około 0,1 do około 30, korzystniej od około 1 do 20 milimoli jonu wapnia na litr. Poziomjonu wapnia powinien być dobrany tak, aby zawsze pozostawał pewien minimalny poziom dostępny dla enzymu, po skompleksowaniu z wypełniaczem w kompozycji. Dowolna rozpuszczalna w wodzie sól może być użyta jako źródło jonu wapnia, włączając chlorek wapnia, mrówczan wapnia i octan wapnia. Niewielkie ilości jonu wapnia, zazwyczaj od około 0,05 do 0,4 milimola na litr, często występują w kompozycji z powodu obecności wapnia w zawiesinie enzymu i wodzie. Korzystne jest od około 0,03% do około 0,6% mrówczanu wapnia.

184 399

Drugim korzystnym stabilizatorem enzymu sąpoliole zawierające tylko atomy węgla, wodoru i tlenu. Korzystnie zawierająone od 2 do 6 atomów węgla i od 2 do 6 grup hydroksylowych. Przykłady obejmują glikol propylenowy (zwłaszcza 1,2-propanediol, który jest korzystny), glikol etylenowy, glicerol, sorbitol, mannitol i glukoza. Poliole zazwyczaj występują w ilości od około 1,5% do około 8% wagowych kompozycji. Korzystnie stosunek wagowy polioli do dodanego kwasu bornego wynosi co najmniej 1, korzystniej co najmniej 1,3.

Ponadto kompozycje korzystnie zawierają rozpuszczalne w wodzie krótkołańcuchowe karboksylany opisane w publikacji US-A-4 318 818. Korzystne są mrówczany i mogą być stosowane w ilości od około 0,05% do około 5%, korzystnie od około 0,2% do około 2%, najkorzystniej od 0,4% do 1,5% wagowych kompozycji. Korzystny jest mrówczan sodowy.

Kompozycje według wynalazku korzystnie zawie ^^a^kwas borny w ilości od około 0,25% do około 5%, korzystniej od około 0,5% do około 3% wagowych. Kwas bomy może być, ale korzystnie nie jest, tworzony przez związki zdolne do wytworzenia kwasu bornego w kompozycji. Kwas bomy jest korzystny, jednak inne związki takie jak bezwodnik borowy, boraks i inne borany metali alkalicznych (np. sodowy orto-, meta- i piroboran, sodowy pentaboran) są odpowiednie. Podstawione kwasy borowe (np. kwas fenyloborowy, kwas butanoborowy i kwas p-bromofenyloborowy) mogą być również użyte zamiast kwasu bornego.

6. Woda

Ciekłe kompozycje detergentu według wynalazku mogą być cieczami wodnymi lub niewodnymi. Jeżeli są cieczami wodnymi to zawierają od około ł5% do około 60%, korzystnie od około 25% do około 45% wagowych wody.

Dalsze ewentualne składniki

A. Ewentualne kosurfaktanty

Ewentualne kosurfaktanty do stosowania z wymienionymi toksylowanymi niejonowymi środkami powierzchniowo czynnymi obejmują amidy o wzorze:

O R²

X !' 1 3 w którym R oznacza rodnik alkilowy, hydroksyalkilowy lub alkenylowy zawierający od 8 do 20 atomów węgla, a R2i R³ są wybrane spośród wodoru, metylu, etylu, propylu, izopropylu, 2-hydroksyetylu, 2-hydroksypropylu, 3-hydroksypropylu, a wymienione rodniki dodatkowo zawierają do 5 jednostek tlenku etylenu, z zastrzeżeniem, że co najmniej jeden z R2 i R3 zawiera grupę hydroksylową.

Korzystnymi amidami są amidy alkilooli C₈-C20 kwasów tłuszczowych, w których każda grupa alkiloolu zawiera od 1 do 3 atomów węgla, a dodatkowo mogą zawierać do 2 jednostek tlenku etylenu. Szczególnie korzystne są mono- i dietanole amidów kwasów tłuszczowych C,1-C,6.

Jeżeli są używane, amidy występują w kompozycjach w stosunku wagowym etoksylowanego niejonowego środka powierzchniowo czynnego do amidowego środka powierzchniowo czynnego od 4:1 do 1:4, korzystnie od 3:1 do 1:3.

Korzystnymi ewentualnymi kosurfaktantami stosowanymi w ilości od 0,15% do 1% są czwartorzędowe amoniowe, aminowe i aminotlenkowe środki powierzchniowo czynne opisane w publikacji US-A-4 507 219.

Z wyżej wymienionych korzystne są sole C₎₀-C_M alkilotrimetyloamoniowe, np. metylosiarczan decylotrimetyloamoniowy, chlorek laurylotrimetyloamoniowy, bromek mirystylotnmetyloamoniowy oraz chlorek i metylosiarczan kokotrimetyloamoniowy. Korzystne jest 0,2% do 0,8% chlorku monoalkilotrimetyloamoniowy.

B. Nośnik winianowo bursztynianowy

Korzystne kompozycje według wynalazku mogą zawierać od 0 do około 10%, korzystnie od 0 do około 6% wagowych liczonych na kwas, winianowo bursztynianowego materiału nośnikowego wybranego spośród grup składających się

184 399

i) HOCH - CH - O - CH - CH₂ i I i I coox coox coox coox w którym X oznacza kation tworzący sól;

ii) CH₂ - CH - O - CH lilii coox coox coox coox coox

CH - O - CH - CH₂

I coox w którym X oznacza kation tworzący sól; i iii) ich mieszanin.

Związki winianowo bursztynianowe do stosowania w niniejszym wynalazku są opisane w publikacji US-A-4 663 071.

C. Układ neutralizujący

Kompozycje według wynalazku mogą również ewentualnie zawierać od około 0 do około 0,04 mola, korzystnie od około 0,01 do 0,035 moli, najkorzystniej od około 0,015 do około 0,03 mola na 100 gramów kompozycji, alkanoloamin wybranych spośród: monoetanoloaminy, dietanoloaminy, trietanoloaminy i ich mieszanin. Niska zawartość alkanoloamin, zwłaszcza monoetanoloaminy jest korzystna dla wzmagania stabilności produktu, działania piorącego i zapachu. Jednak ilość alkanoloaminy powinna być minimalizowana ze względu na najlepszą kompatybilność bielących chlorków·'.

Dodatkowo, kompozycje zawierają jony sodowe i korzystnie jony potasowe, w ilości skutecznej do neutralizacji amonowych fragmentów i zapewniającej odpowiednie pH.

D. Środek eliminujący mydliny

Innym ewentualnym składnikiem do stosowania w ciekłych detergentowych kompozycjach według wynalazku w ilości od 0 do około 1,5%, korzystnie od około 0,5% do około 1,0% wagowego opartego na silikonie środka eliminującego mydliny.

Silikony są szeroko znanymi i stosowanymi środkami o wysokiej skuteczności eliminowania mydlin. Na przykład publikacja US-A-3 455 839 ujawnia kompozycje i sposoby odpieniania wodnych roztworów przez wprowadzenie do nich niewielkich ilości płynnego polidimetylosiloksanu.

Odpowiednie silikony regulujące mydliny są mieszaniną silikonu i silanowanej krzemionki, jak opisane w publikacji niemieckiego zgłoszenia patentowego DE-A-2 124 526.

Silikonowe środki odpieniające i regulujące mydliny były skutecznie włączane do granulowanych kompozycji detergentów dzięki zabezpieczeniu ich przed detergentowymi środkami powierzchniowo czynnymi, jak opisano w Patentach US 3 933 672 i US 4 652 392.

Korzystnie silikonowy środek eliminujący mydliny stosowany jest w wynalazku w ilości eliminującej mydliny, środek eliminujący mydliny składa się zasadniczo z:

(i) płynu polidimetylosiloksanu mającego lepkość od około 20 cs. do około 1500 cs. w 25°C;

(ii) od około 5 do około 50 części na 100 części wagowych (i) żywicy siloksanowej składającej się z jednostek (CH₃)₃SiO_I/2 i jednostek SiO₂ w stosunku jednostek (CH₃)₃SiO_1/2 do jednostek S1O2 od około 0,6:1 do około 1,2:1; i (iii) od około 1 do około 20 części na 100 części wagowych (i) stałego żelu krzemionkowego.

Określenie „ilość eliminująca mydliny” oznacza, że osoba formułująca kompozycje może wybrać ilość środka kontrolującego mydliny, tak aby kontrolował mydliny do pożądanego poziomu. Ilość mydlin zależy od wybranego środka powierzchniowo czynnego. Na przykład ze środkami powierzchniowo czynnymi wytwarzającymi dużo mydlin stosuje się względnie większą ilości środka kontrolującego mydliny aby osiągnąć pożądaną kontrolę mydlin, niż z nisko pieniącymi środkami powierzchniowo czynnymi.

184 399

E. Inne enzymy

Kompozycje detergentowe według wynalazku mogą zawierać dalsze enzymy.

Na przykład, można dodawać lipazę w postaci kompozycji granulatu (alternatywnie roztworu aibo zawiesiny lipsIityczeogs enzymu z materiałem nośnikowym (np. jak wEP-A-258 068 (Novo Nordisk A/S).

Dodawana ilość lipazy może mieścić się w szerokich granicach, na przykład 50 do 30 000 LU/g na gram układu środka powierzchniowo czynnego lub kompozycji detergentowej, np. często co najmniej 100 LU/g, korzystnie co najmniej 500 LU/g, czasami korzystnie powyżej 1 000, powyżej 2 000 LU/g lub powyżej 4 000 LU/g albo więcej, bardzo często w zakresie od 50 - 4 000 LU/g, a dopuszczalnie w granicach 200 - 1 000 LU/g. W niniejszym opisie jednostki lipazy są określane tak jak w EP-A-258 068.

Lipolityczny enzym może być wybrany spośród szerokiego zakresu lipaz w szczególności, lipazy opisane w, na przykład następujących opisach patentowych: EP-A-214 761 (Novo Nordisk A/S), EP-A-258 068, a zwłaszcza lipazy wykazujące immunologiczną krzyżową aktywność z surowicą odpornościową przeciw lipazie z Thermomyces lanuginosus ATCC 22070, EP-A-505 208 i EP-A-206 390, a zwłaszcza lipazy wykazujące immunologiczną aktywność krzyżową z surowicą odpornościową przeciw lipazie z ChromoOacter viscosum var Lipolyticum NRRL B-3673, albo przeciw lipazie z Alcaligenes PL.-679, ATCC 31371 i FERM-P 3783, również lipazy opisane w opisach WO 87/00859 (Gist-BrscedoI) i EP-A-504 284 (Sapporo Breweries). W szczególności, odpowiednie są na przykład następujące handlowo dostępne preparaty lipazy: LipsleIo® Novo Nordisk A/S, Amano lipazy CE, P, B, AP, M-AP, AML i CES, oraz Meito lipazy MY-30, OF i PL., również Esterne® MM, Lipozym, SP225, SP285 (wszystkie Novo Nordisk A/S), Saiken lipne, Enzeco lipazę, Toyo Jozo lipase i Dio^to lipne (znaki towarowe), Lumafast® (Genecor Inc.), Lipomax® (GiIt-BrocedoI

N. V.), i lipazy opisane w WOiA-98/03578 (Uni^yer).

Gdy są potrzebne, mogą być stosowane amylazy, w ilości w zakresie od około 1 do około 100 MU (jednostki maltozy) na gram kompozycji detergentowej (lub 0,014-1^ np.

O, 07-0,7 KNU/g (jednostki Noyo)). Przykładami odpowiednich amylaz są np. Termamyl® i BAN (Novo Nordisk A/S). Gdy są pożądane, mogą być na przykład stosowane celulazy, w ilości w zakresie od około 0,3 do około 35 jednostek CEVU na gram kompozycji detergentowej. Odpowiednimi coIuIazemi sąnp. CeH^yme® i Canz^e® (Novo Nordisk A/S).

Inne enzymy odpowiednie do użycia w niniejszym wynalazku to oksydazy i porsksydezy.

F. Inne ewentualne składniki

Innymi ewentualnymi składnikami do stosowania w ciekłych detergentach według wynalazku są środki usuwające plamy, polimery rozszczepiające plamy, środki przeciw osadzaniu takie jak tetraetyleeopente.minsetoksylan (od około 0,5% do 3%, korzystnie od około 1% do około 3% wagowych), regulatory mydlin, hydrotropy takie jak kumenssulfoniee sodu, zmęteiecze, entyutIoeiecze, środki bakteriobójcze, barwniki, perfumy i rozjeśnieczo znane ze stanu techniki. Takie ewentualne składniki na ogół stanowią mniej niż 15%, korzystnie od około 0,5% do około 10%, korzystniej od około 1% do około 10% wagowych kompozycji.

Kompozycja może zawierać od około 0% do około 8%, korzystnie od około 0% do około 5% wagowych kwasu Cu-Cm alkeeobursztynswego lub jego soii. Te materiały o ogólnym wzorze R-CH (COOX)CH₂(COOX), w którym R oznacza grupę Cu-Cn aikeeyIswą a każdy X jest wodorem albo odpowiednim kationem, takim jak sodowy, potasowy, amonowy lub eikenoIsemonowy (np. mono-, di- lub trieteeoIoemiea). Specyficznymi przykładami są 5-dsdeceeyIsbursztyeian (korzystny) i 2-tetredeceeyIsbursztyeiee.

Kompozycje według wynalazku ewentualnie zawierają od około 0,1% do około 1%, korzystnie od około 0,2% do około 0,6% wagowych rozpuszczalnych w wodzie soli kwasu etyleeotriemieotetrametyIonsfosfseswego, kwasu dietylenotrieminopentemetyleeofosfonowego, kwasu etyIensdiemiestetraoctswegs (korzystny) albo kwasu dietylenstrieminopenteoctowego (najkorzystniejszy) aby podwyższyć działanie czyszczące przy traktowaniu tkanin.

Ponadto kompozycje detergentowe mogą zawierać od 1-35% środka bielącego lub prekursora bielenia albo układu zawierającego środek bielący i/lub jego prekursor.

184 399

Dalszymi ewentualnymi składnikami są środki gaszące pianę, środki antykorozyjne, środki zawieszające brud, środki sekwesterujące, środki zapobiegające ponownemu osadzaniu brudu itp.

Kompozycje według wynalazku zawierają do około 10% etanolu.

G. Inne właściwości

Kompozycje do bezpośredniego stosowania zazwyczaj w rozcieńczeniu 10% wagowych w wodzie w 20°C, mająpH od około 7,0 do 9,0; korzystnie od około 8,0 do około 8,5.

Kompozycje do bezpośredniego użycia mają krytyczne stężenie micelli (Critical Micelle Concentration - CMC) mniejsze lub równe 200 części na milion (ppm), a napięcie powierzchniowe powietrze/woda powyżej CMC niniejsze lub równe 32, korzystnie mniejsze lub równe 30 dyn na centymetr w 35°C w wodzie destylowanej. Te pomiary są opisane w „Measurement of Interfacial Tension and Surface Tension - General Review for Practical Man” C. Weser, GIT Fachzeitschrift fur das Laboratorium, 24 (1980) 642-648 i 734-742, FIT Verlag Ernst Giebeler, Darmstadt i „Interfacial Phenomena - Equilibrium and Dynamic Effects”, C.A. Miller i P. Neogi, Chapter 1, pp. 29-36 (1985), Maecel Dekker, Inc. New York.

Kompozycje według wynalazku mogą być używane do prania materiałów tekstylnych, zwłaszcza ale bez ograniczania, bawełnianych i tekstyliów opartych na poliestrach, oraz ich mieszanin. Na przykład proces prania prowadzony w temperaturze około 60-65°C lub niższej, np. około 30-35°C lub niższej jest szczególnie odpowiedni. Może być bardzo odpowiedni do stosowania kompozycji z szybkością skuteczną do zapewnienia około np. 0,4-0,8g/l środka powierzchniowo czynnego w cieczy piorącej, jednak jest oczywiście możliwe stosowanie nizszych lub wyższych stężeń, jeśli są pożądane. Bez ograniczania może np. być utrzymywany tak aby szybkość użycia od około 1 do 10 g/l, np. od około 3-6 g/l, detergentowej formulacji jest odpowiednia do stosowania w przypadku gdy formulacje mają zasadniczo skład jak w przykładach.

W tym aspekcie wynalazek w szczególności odnosi się do:

a) detergentowej kompozycji w postaci wodnej cieczy detergentowej zawierającej anionowy środek powierzchniowo czynny, niejonowy środek powierzchniowo czynny, substancję pochłaniającą wilgoć, kwas organiczny, sodę kaustyczną, o pH ustawionym na wartość między 9 a 10.

b) detergentowej kompozycji w postaci niewodnej cieczy detergentowej zawierającej ciekły niejonowy środek powierzchniowo czynny składający się zasadniczo z liniowego alkoksylowanego pierwszorzędowego alkoholu, triacetyny, trój fosforanu sodu, sody kaustycznej, prekursora bielenia monohydratu nadboranu i aktywatora bielenia czwartorzędowej aminy, o pH ustawionym na wartość między 9 a 10.

c) enzymatycznej ciekłej kompozycji detergentowej dającej ciecz piorącą o pH 9 lub mniej przy użyciu z szybkością odpowiadającą 0,4-0,8 g/l środka powierzchniowo czynnego.

d) enzymatycznej ciekłej kompozycji detergentowej dającej ciecz piorącą o pH 8,5 lub więcej przy użyciu z szybkością odpowiadającą 0,4-0,8 g/l środka powierzchniowo czynnego.

e) enzymatycznej ciekłej kompozycji detergentowej dającej ciecz piorącą o sile jonowej 0,03 lub mniej np. 0,02 lub mniej, przy użyciu z szybkością odpowiadającą 0,4-0,8 g/l środka powierzchniowo czynnego.

f) enzymatycznej ciekłej kompozycji detergentowej dającej ciecz piorącą, o sile jonowej 0,01 lub więcej, np. 0,02 lub więcej, przy użyciu z szybkością odpowiadającą 0,4-0,8 g/l środka powierzchniowo czynnego.

Stwierdzono, że wyżej określone odmiany subtilazy mogą być korzystnie włączone do kompozycji detergentowej w postaci kostek, tabletek, pałeczek i podobnych do bezpośredniego stosowania do tkanin, twardych powierzchni lub innych powierzchni. W szczególności mogą być włączone w mydło lub kompozycje mydło/syntetyk w postaci kostek, w których wykazują wyjątkową stabilność enzymu.

Kompozycje detergentowe w postaci kostek, tabletek, pałeczek i podobnych do bezpośredniego stosowania są np. opisane w patencie Południowej Afryki 93/7274, włączonym do niniejszego zgłoszenia jako odnośnik. Korzystne takie kompozycje kostek zawierają, obok odmiany subtilazy:

184 399

i) 25 do 80%, najkorzystniej 25 do 70% wagowych aktywnego detergentu, którym jest mydło lub mieszanina mydła i syntetycznego aktywnego detergentu, liczonego jako bezwodny;

ii) 0 do 50%, a najkorzystniej 10 do 30% wagowych wody;

iii) 0 do 35% i najkorzystniej 0,1 do 30% wagowych wypełniacza.

Na ogół, ilość odmiany subtilazy do włączenia w takich kompozycjach jest taka, że odpowiada aktywności proteolitycznej 0,1 do 100 GU/mg liczone na kompozycję, korzystnie 0,5 do 20 GU/mg, najkorzystniej 1,0 do 10 GU/mg, gdzie GU/mg oznacza jednostki glicyny na miligram.

Sposoby wytwarzania mutacji w genach subtilazy

Znanych jest wiele sposobów wprowadzania mutacji w genach. Po krótkim omówieniu klonowania genów subtilazy, zostaną omówione sposoby wytwarzania mutacji zarówno statystycznych jak i specyficznych wewnątrz genu subtilazy.

Klonowanie genu subtilazy

Geny kodujące subtilazę mogą być klonowane z dowolnego organizmu wskazanego w tabeli I, zwłaszcza gram-dodatnich bakterii lub grzybów, różnymi metodami dobrze znanymi w stanie techniki. Po pierwsze genomy, i/lub biblioteka cDNA z DNA musi być konstruowana przy użyciu chromosomalnego DNA lub matrycowego RNA z organizmu produkującego subtilazę. Następnie, jeżeli sekwencja aminokwasów subtilazy jest znana, można syntetyzować homologii, znakowane oligonukleotydy próbne i używać ich do identyfikowania kodującego klony subtilizyny z biblioteki genomów bakteryjnego DNA, albo z biblioteki cDNA. Alternatywnie, próbki znakowanego oligonukleotydu zawierające sekwencje homologów subtilazy z innego łańcucha bakterii lub organizmu mogą być używane jako próbki do identyfikacji klonów kodujących subtilazę, przy użyciu hybrydyzacji i odmywania w warunkach niższej mocy.

Jeszcze inna metoda identyfikowania klonów produkujących subtilazę składa się z insercji fragmentów genomu DNA do wektora ekspresji, takiego jak plazmid, transformowania bakterii proteazoujemnych z otrzymanym genomem biblioteki DNA, i następnie umieszczania transformowanej bakterii na agar zawierający substrat dla subtilazy, taki jak odtłuszczone mleko. Te bakterie zawierające plazmid niosący subtilazę będą produkowały kolonie wokół aureoli czystego agaru, odpowiednio do zużywania odtłuszczonego mleka przez wydzielaną subtilazę.

Wytwarzanie statystycznych mutacii w genie subtilazy

Po sklonowaniu genu subtilazy odpowiednim wektorem, takim jak plazmid, może być stosowanych wiele metod do wprowadzania statystycznych mutacji w genie.

Jedną metodą będzie inkorporowanie sklonowanego genu subtilazy, jako części wyszukującego wektora, w łańcuchu mutującego Eschericia coli.

Inna metoda obejmuje generowanie pojedynczego łańcucha z genu subtilazy i następnie łączenie (annealing) fragmentu DNA zawierającego gen subtilazy z innym fragmentem DNA tak, że część genu subtilazy pozostaje pojedynczym łańcuchem. Ten oddzielony pojedynczy region łańcucha może być eksponowany dowolną liczbą czynników mutagenizujących, obejmujących, ale nie ograniczonych, wodorosiarczyn sodu, hydroksyaminy, kwas azotawy, kwas mrówkowy albo hydralazyny. Specyficzne przykłady tej metody tworzenia statystycznych mutacji opisał Shortle i Nathans (1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75 2170-2174). Według sposobu Shortle'a i Nathans'a plazmid niosący gen subtilazy będzie nitkowany przez restrykcję enzymu rozszczepiającego genu. Ta nitka będzie włączana w przerwę przy użyciu działania egzonukleazy DNA polimerazy I. Otrzymana pojedynczo łańcuchowa przerwa może być mutagenizowana przy użyciu dowolnego z wyżej podanych czynników mutagenizujących.

Alternatywnie, gen subtilizyny z kawałków szczepu Bacillus obejmujących naturalny promotor i inną kontrolną sekwencję może być klonowany na wektorze plazmidu zawierającego replikacje obu E. coli i B. subtilis, selektywny fenotypowy marker i Ml 3 macierzysty replikacji dla wytworzenia pojedynczego łańcucha plazmidu DNA podczas superinfekcji z pomagającym fagiem IR1. Pojedynczo łańcuchowy plazmid DNA zawierający sklonowany gen subtilizyny jest izolowany i łączony (annealing) z fragmentem DNA zawierającym wektor sekwencji ale nie region kodujący subtilizyny, wytwarzając przerywane podwójne czą26

184 399 steczki. Mutacje są wprowadzane do genu subtilizyny zarówno przez wodorosiarczyn sodu, kwas azotawy lub kwas mrówkowy albo przez replikację mutującego łańcucha E. coli jak opisano powyżej. Ponieważ wodorosiarczyn sodu reaguje wyłącznie z cytozyną w pojedynczym łańcuchu DNA, mutacja wytworzona z tym mutagenem jest ograniczona tylko do regionów kodujących. Czas reakcji i stężenie wodorosiarczynu sodu są różne w różnych eksperymentach tak, że średnio tworzy się od jednej do pięciu mutacji w genie subtilizyny. Inkubacja 10 |ig przerwanej podwójnej cząsteczki DNA w 4M dwusiarczynu sodu, pH 6,0 przez 9 minut w 37°C w objętości reakcji 400 μ1, dezaminuje około 1% cytozyny w regionie pojedynczego łańcucha. Region kodujący macierzystej subtilizyny zawiera około 200 cytozyn, w zależności od skrętu DNA. Korzystnie czas reakcji mieści się w zakresie od około 4 minut (do wytworzenia częstotliwości występowania mutacji jedna na 200) do około 20 minut (około 5 na 200).

Po mutagenezie przerwane cząsteczki są traktowane in vitro polimerazą I DNA (fragment Klevow) aby wytworzyć całkowicie podwójny łańcuch i zabezpieczyć mutacje. Następnie odpowiednie E. coli jest transformowane z zmutagenizowanym DNA z wytworzeniem rozszerzonej biblioteki mutantów subtilizyny. Rozszerzone biblioteki mutantów mogą być również wytwarzane przez wzrost plazmidu DNA w Mut D łańcuchu E. coli, który wzmaga zakres mutacji odpowiednio do błędu pron DNA polimerazy.

Mutagenny kwas azotawy i kwas mrówkowy mogą być również użyte do wytwarzania biblioteki mutantów. Ponieważ te odczynniki chemiczne nie są tak specyficzne dla pojedynczego łańcucha DNA jak dwusiarczyn sodu reakcje mutagenezy są prowadzone według następującej procedury. Część kodująca genu subtilizyny jest klonowana w fabu M13 standardowymi metodami i wytwarza się pojedynczy łańcuch faga DNA. Pojedynczołańcuchowy DNA następnie reaguje z IM kwasem azotawym pH 4,3 przez 15-60 minut w23°C, albo z 2,4M kwasem mrówkowym przez 1-5 minut w 23°C. Te zakresy czasu reakcji tworzą częstotliwość mutacji od 1 na 1 000 do 5 na 1 770. Po mutagenezie uniwersalny primer jest łączony z Ml 3 DNA, duplex DNA jest syntetyzowany przy użyciu zmutowanego pojedynczołańcuchowego łańcucha DNA jako matrycy tak, że kodująca część genu subtilizyny staje się całkowicie podwójnym łańcuchem. W tym punkcie z kodującego regionu może być odcięty wektor Ml3 za pomocą enzymu restrykcyjnego i ligatowany do wektora ekspresji niezmutagenizowanej, tak, że mutacje występują tylko w fragmencie restrykcji. (Myers i irtn., Science 229 242-257^1^^5)^^.

Tworzenie ukierunkowanych mutacji w genach subtilazy

Jeżeli sklonowany gen subtilazy i wybrane do identyfikowanej mutacji centrum oraz reszty do podstawienia w miejsce oryginalnych zostały określone, to takie mutacje można wprowadzać przy użyciu syntetycznego oligonukleotydu. Te oligonukleotydy zawierają boczne sekwencje nukleotydowe określonego centrum mutacji; mutant nukleozydu jest wstawiany podczas syntezy oligonukleotydu. W korzystnej metodzie pojedynczy przerwany łańcuch DNA niosący gen subtilazy jest tworzony w wektorze niosącym gen subtilazy. Następnie syntetyczny nukleotyd niosący pożądaną mutację jest łączony z homologiczną częścią pojedynczego łańcucha DNA. Pozostała przerwa jest następnie wypełniana przez polimerazę I DNA (fragment Klenow) akonstrukt jest ligatowany przy użyciu ligazy T4. Specyficzny przykład tej metody opisał Morinaga i inni, (1984, Biotechnology 2 646-639). Według Morinaga i in., fragment wewnątrz genu jest usuwany przy użyciu restrykcyjnej endonukleazy. Wektor/gen, teraz zawierający przerwę jest następnie denaturowany i hybrydyzowany do wektora/genu, który zamiast zawierać przerwę, został rozszczepiony inną restrykcyjną endonukleazą w miejscu poza obszarem związanym z przerwą. Region pojedynczołańcuchowego genu jest następnie poddawany hybrydyzacji z zmutowanym oligonukleotydem, pozostała przerwa jest wypełniana fragmentem Klenow polimerazy I DNA, insercje są ligatowane ligazą T4 DNA, a po cyklu replikacji, wytwarza się podwójnołańcuchowy plazmid niosący określoną mutację. Metoda Morinaga wymaga dodatkowych manipulacji konstruowania nowego restrykcyjnego miejsca, i przez to ułatwia generowanie mutacji wielokrotnych. U.S. Reissue Patent nr 34 606 (Estell i inni,) opublikowany 10 maja 1994, pozwala na wprowadzenie oligonukleotydów niosących wielokrotne mutacje przez wprowadzanie mniejszych zmian

184 399 w kasecie, jednak, nawet większa różnorodność mutacji może być wprowadzona w tym samym czasie metodą Morinaga, ponieważ może być wprowadzone wiele nukleotydów o różnych długościach.

Ekspresja mutantów subtilazy

Zmutowane geny subtilazy wytworzone metodami opisanymi powyżej, albo alternatywnymi znanymi w stanie techniki, mogą być wydzielane w postaci enzymu przy użyciu wektora ekspresji. Wektor ekspresji na ogół może być określony jako wektor klonowania, ponieważ wektor ekspresji zazwyczaj zawiera składniki typowego wektora klonowania, to znaczy element, który pozwala na autonomiczną replikację wektora w mikroorganizmie niezależnie od genomu mikroorganizmu, i jeden lub więcej markerów fenotypu dla wybranego celu. Wektor ekspresji zawiera kontrolną sekwencję kodującą promotor, operator, miejsce przyłączające rybosom, sygnał początkujący translacje i ewentualnie gen represyjny lub różne geny aktywujące. Aby pozwolić na wydzielenie ekspresjonowanej proteiny, nukleotydy kodujące „sekwencję sygnalną” mogąbyć włączane wcześniej do sekwencji kodującej genu. Dla ekspresji w kierunku kontrolnej sekwencji, odpowiedni gen do traktowania według wynalazku jest podłączany do kontrolnej sekwencji we właściwie odczytanej budowie. Promotor sekwencji może być inkorporowany do wektora plazmidu, i może podtrzymywać transkrypcję genu mutującego subtilazę, obejmując ale nie ograniczając do promotora prokariotycznej β - laktamazy. (yiHa-Kamaroff, i in. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75 3727-3731) i promotor tac (DeBoer, i in. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80 21-25). Dalsze odnośniki mogą być znalezione w,, Useful proteins from recombinant bacteria ’’ w Scieniific American (1980) 242 74-94.

Według jednego wykonania B. subtilis jest transformowany przez wektor ekspresji niosący zmutowane DNA. Jeżeli ekspresja ma miejsce w wydzielającym mikroorganizmie takim jak B. subtilis to sygnalna sekwencja może uzupełniać translacje inicjalnego sygnału i produkować odpowiednią sekwencję DNA. Sygnalna sekwencja działa w celu przeniesienij produktu ekspresji do ściany komórkowej, w której jest odczepiana od produktu w czasie sekrecji. Określenie „kontrolna sekwencja” jak zdefiniowano powyżej ma obejmować sygnalną sekwencję, jeżeli ona występuje.

Inne układy gospodarzy znane fachowcom są również odpowiednie do ekspresji i produkcji odmian proteazy według wynalazku. Taki układ grzyby, obejmując nitkowate grzyby, rośliny, ptasie i ssacze komórki, jak również inne.

Materiały i metody

Szczepy

B. subtilis309 i 347 są odmianami BamlIuc ic8^/^sι,zdeponewanymi w NCIB odpowiepnio pod numerami NCIB 10309 i 10147, a opisanymi wUS-A-3 723 250, włączonym do niniejszego opisu jako odnośnik.

E. coli MC 1000 1M.J. CaJabCaaa aS.N. Cohen OeSO^y. Mol. Biol. U38 179-2179, wytworzono r+ m+ konwencjonalnymi metodami i również opisano w US-A-039 298.

Aktywność protenhtyczwa

W kontekście niniejszego wynalazku aktywność proteolityczna jest wyrażana w jednostkach proteazy Kilo NOVO (Kilo NOVO Proteaze Units KNPU). Aktywność jest określana względem enzymu standardowego (SAWINASE) a określanie opiera się na trawieniu roztworu kazeiny (DMC) przez proteolityczny enzym w standardowych warunkach, np. 50°C, pH 8,3; czas reakcji 9 minut, czas pomiaru 3 minuty. Folder AF 220/1 jest dostępny z Novo Nordisk A/S, Dania, który to folder jest włączony do niniejszego zgłoszenia jako odwnśnik.

GU oznacza jednostkę glicyny określoną jako proteolityczną aktywność enzymu, w standardowych warunkach, podczas 15 minutowej inkubacji w40°C zN-acetylo kazeiną jako substratem, wytwarzającą ilość grup NH2 ekwiwalentnych 1 ąmolowi glicyny.

Enzymatyczna aktywność może być również mierzona przy użyciu testu PNA, według reakcji z roztworem substratu bursztynian-aljwinj-jljwina-prnlina-fenyl-aljwinα-paranitrnfennl, który został opisany w Journal of American Oil Chemists Society, Rothgeb, TM, Goodljwder, B.D. Garrison, P.H. i Smith L.A.(1988).

184 399

Przykłady

Dla określenia odmian enzymu stosowano takie same materiały i metody jak opisano między innymi w: WO-A-89/06279 (Novo Nordisk A/S), EP-A-130756 (Genentech), EP-A-479870 (Novo Nordisk A/S), EP-A-214435 (Henkel), WO-A-87/04461 (Amgen), WO-A-87/05050 (Genex), zgłoszenie EP-87/303761 (Genentech), EP-A-260105 (Genencor), WO-A-88/06624 (Gist-Brocades NV), WO-A-88/07578 (Genentech), WO-A-88/08028 (Genex), WO-A-88/08033 (Amgen), WO-A-88/08164 (Genex), Thomas i inni (1985) Nature 318 375-376; Thomas i inni (1987) J. Mol. Biol. 193 803-813; Russel i Fersht (1987) Nature 328 496-500. Inne sposoby dobrze znane w stanie techniki mogą być również stosowane.

Przykład 1

Konstrukcja i ekspresja odmian enzymu

Skonstruowano wektor nadający się do kodowania syntezy genu dla subtilazy 309 i jej mutantów. Jest to zasadniczo plazmid pUC19 [Yanish-Perron i Messing (1985) Gene 33 103-119], w którym wiele centr klonujących zostało zastąpionych przez połączenia zawierające centra restrykcyjne użyte do oddzielenia pięciu podfragmentów tworzących gen. Nowe połączenie zostało wprowadzone do EcoRI-HindIII przeciętym przez pUC19 co zniszczyło te centra. Szczegóły konstrukcji opisano w publikacji WO 92/19729 na stronach 25-26 i figurze 1 (arkusze 1/7-7/7), zawartość publikacji została włączona do niniejszego zgłoszenia jako odnośnik literaturowy.

Każdy podfragment zawierał od 6 do 12 oligonukleotydów-. Oligonukleotydy syntetyzowano na automatycznym syntezatorze DNA przy użyciu fosforoamidytyny na kontrolowanym szklanym podłożu [Beaucage i Carruthers (1981) Tetrahedron Letters 22 1859-1869].

Pięć podfragmentów było izolowanych na 2% żelu agarowym i insertowane do pSX191. Sekwencja była weryfikowana przez sekwencjonowanie dideoksynukleotydem. Fragmenty A-E izolowano i ligatowano razem z KpnI-BamHI ciętym pSX191. Mieszaniny ligatującej użyto do transformacji odpowiedniego E. coli MC 1000 r', m+wybranego dla oporności ampicyliny. Fragment 850 bp KpnI-BamHI składający się z części genu kodującego subtilizyny 309 dojrzałej części enzymu był użyty do zamiany dzikiego typu genu pSX212 dającego wzrost na pSX222, który następnie transformowano do odpowiedniego szczepu B. subtilisis. Po fermentacji transformowanego szczepu i oczyszczaniu enzymu okazało się, że był on nierozróżnialny od produktu dzikiego typu.

Odmiany proteazy pochodzące z syntetycznego genu wytworzono przy użyciu oligonukleotydów o zmienionej sekwencji w miejscu(-ach) w którym mutacjajest pożądana (np. w sekwencjach podanych poniżej) i zmieszaniu ich z resztą oligonukleotydów przeznaczonych dla syntetycznego genu. Złożenie odmiany genu jest prowadzone z materiałami odmian sposobem analogicznym do opisanego powyżej. Dalsze informacje dotyczące ogólnej syntezy genów są dostępne w publikacji Agarval i inni (1970) Nature 227 27-34.

Centrum KpnI wprowadzono do początkowego fragmentu syntetycznego genu subtilazy 309 kodującego dojrzałą część enzymu. Stosowano metodę zwanąoligonukleotydowe bezpośrednie rozerwanie podwójnej nitki naprawczej mutagenezy i opisanej przez Mandecki (1986) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 83 7177-7181. pSX172 jest otwierany przez NcoI na początku dojrzałej części genu subtilazy 309 i jest mieszany z oligonukleotydem NOR 789 (por. WO-A-92/19729), ogrzewany do 100°C, chłodzony do 0°C, i transformowany do E. coli. Po retransformacji, rekombinanty mogą być badane przez kolonie hybrydyzacji przy użyciu 32-P-labelled nOr 789. Rekombinanty zmieniono na pozytywne podczas badania wprowadzono centrum KpnI bezpośrednio na początek NcoI przez zmienienie dwóch zasad bez zmiany sekwencji aminokwasów. pSX172 jest opisany w EP 405 901. Tak wytworzone centrum KpnI jest insertowane do pSX120 we fragmencie 400-bp PvuI-NheI, dając początek pSX212. pSX120 jest również opisany w EP-A-405 901.

Syntetyczny gen jest insertowany miedzy KpnI a BamHI na pSX212, dając początek pSX222.

184 399

Przykłady mutacji i odpowiednich sekwencji oligonukloeotydów są następujące: Rm! (fragment D1)

5'- AATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCGCTCTAT -3

11111111111111 i 111111111111111 * Μ 11 5 ' - GTCCACGTCCGAGTTAGTCGATAGGCCX5CX3AGATACGCTTG - 3

RHH (fragment D1)

5'- AATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCX3ATCTAT - 3' lllll!llllllllll!llllllllllll**llll

5- GTCCACGTCCGAGTTAGTCGATAGGCCGCTAGATACGCTTG -3'

S57P (fragment B1)

5' - AGCTTTGTACCAGGGGAACCGCCGACTCAAGATGGG - 3' lllllllllllllllll*llllllllllllll

3' - AACATGGTCCCCTTGGCGGCTGAGTTCTACCCTTACCC - 5’

Te oligonukleotydy były łączone z resztą oligonukleotydów z syntetycznego genu, który nie był zmieniany.

Przykład 2

Oczyszczanie odmian enzymu:

Procedura odnosi się do oczyszczania w skali 10 litrów fermentacji enzymu Subtilizyny 147, enzymu Subtilizyny m lub ich mutantów.

Około 8 litrów roztworu fermentacyjnego odwirowywano przy szybkości 5000 obrotów na minutę w 1 litrowej zlewce. Przesącze ustawiano na pH 6,5 przy użyciu 10% kwasu octowego i filtrowano na płytkach filtracyjnych Seitz Supra S100.

Filtraty zatężono do około 400 ml przy użyciu jednostki Amicon CH2A UF wyposażonej w nabój Amicon S1Y10 UF. Zatężone UF odwirowywano i filtrowano przed absorpcją w temperaturze pokojowej na kolumnie chromatografii powinowactwa Bacitracin przy pH 7. Proteazę wymywano z kolumny Bacitracin w pokojowej temperaturze przy użyciu 25% 2-propanolu i 1 M chlorku sodu w roztworze buforowanym za pomocą 0,01 M kwasu dimetyloglutarowego, 0,1 M kwasu bornego i 3I332 M chlorku potasu ustawionym na pH 7.

Frakcje z aktywnąproteaząz etapu oczyszczania kolumnąBatricin połączono i podano na kolumnę 750 ml Sephadex G25 (5 cm średnicy) zrównoważoną buforem zawierającym 0,01 M kwasu dimetyloglutarowego, 0,2 M kwasu bornego i 0,002 M chlorku potasu ustawionym na pH 6,5.

Frakcje o aktywności proteazy z kolumny Sephadex G25 połączono i podano na kolumnę kationowymienną 150 ml CM Sepharose CL 6B (5 cm średnicy) zrównoważoną buforem zawierającym 0,01 M kwasu dimetyloglutarowego, 0,2 M kwasu bornego i 0I002 M chlorku potasu ustawionym na pH 6,5.

Proteazę eluowano liniowym gradientem 0-0,1 M chlorku sodu w 2 litrach tego samego buforu (3-3,2 M chlorku sodu w przypadku Subtilizyny 147).

W końcowym etapie oczyszczania frakcje zawierające proteazę z kolumny CM Sepharose połączono w komorze Amicon ultrafiltrującej wyposażonej w membranę GR81PP (z Danish Sugar Factories hic.)

Przy użyciu techniki z przykładu 1 do konstrukcji i wyżej opisanej procedury izolacji wytworzono i wyizolowano następujące odmiany Stibilizyny 309:

184 399

A G159I

B S164I

C Y167I

D R170I

E R170L

F R170M

G R170F

H G195F

I S57P + R170L

J S57P +N218S

K S57P + R170L + N218S

L R170L + N218S + M222A

M S57P + R170L + S188P + A994P

N Y167I + R170L

O S57P + R170L + Q206E P R170L + Q206E

Q Y167I + R170L +Q206E

R Y167I + R170L + A194P S Y167I + R170L + N288S

T Y167I + R170L + A194P + N228S

U Y167I + Y17II

V R170G W R170C Przykład 3

Kompozycje detergentowe zawierające odmiany enzymów

Przykład D1:

Wytworzono (izotropową) wodną detergentową ciecz według wykonania wynalazku, zawierającą:

Składnik	%
NaLAS	8,0
Neodol 25-9	8,0
AES 25-3S	14,0
Na cytrynian · 2H2O	5,0
Glikol propylenowy	5,0
Sorbitol	4,5
Barwnik F Tinopal UNPA-GX	0,15
Lytron 614 zmętniacz	0,03
Kathon konserwant	0,0003
Kwas błękitny 80	0,00117
Kwas fioletowy 48	0,0033
Savinaza 16L	0,25
Lipolaza 100L	0,70
Zapach	0,15
Woda	do 100,0

pH ustawiono na 7,1.

184 399

Tabela III

Aktywność resztkowa enzymu (w procentach początkowej aktywności) po przechowywaniu w 37°C dla przykładu D1 zawierającego BLS309 odmiana S57P+R170L+N218S

Czas przechowywania (w dniach)	Typ dziki	S57P+R170L+N218S
0	100	100
3	44	74
7	11	50
10	5	36
14	7	27

Z tabeli III ewidentnie widać, że odmiana S57P+R170L+N5I8S wykazuje znaczne ulepszenia stabilności tego rodzaju detergentu. Co więcej, odmiana S57P+R170L+N218S ma wspaniałą kompatybilność w stosunku do lipazy.

Tabela IV

Resztkowa aktywność lipazy (w procentach początkowej aktywności) po przechowywaniu w 37°C dla przykładu D1 zawierającego BLS309 odmianę S57P+R170L+N218S i Lipolazy™

Czas przechowywania (w dniach) Lipolaza plus:	Typ dziki	S57P+R170L+N218S
0	100	100
3	38	67
7	24	44
10	22	33
14	21	27

Z powyższej tabeli IV widać, że w dodatku do stabilności proteazy, kompatybilność proteazy względem Lipolazy jest również ulepszona.

Przykład d2:

Wytworzono niewodny ciekły detergent według wynalazku z 38,5% C^-C^ liniowego pierwszorzędswegs alkoholu alkoksylowanego 4,9 mol/mol tlenku etylenu i 2,7 mol/mol tlenku propylenu, 5% triacetyny, 30% trifosfsrenu sodowego, 4% popiołu sody, 15,5% jednowodnego nadboranu sodowego zawierającego niewielkie ilości 4% TAED, 0,25% EDTA, którego 0,1% jest kwasem fosforowym, Aerosil 0,6%, SCMC 1 % i 0,6% proteazy^. pH ustawiono na wartość między 9 a 10, np. około 9,8.

Przykład D3:

Strukturowany ciekły detergent może na przykład zawierać, obok tu opisanej proteazy, 2-15% niejonowego środka powierzchniowo czynnego, 5-40% całości środków powierzchniowo czynnych, zawierających niejonowe i ewentualnie anionowe środki powierzchniowo czynne, 5-35% wypełniacza zawierającego lub nie fosforany, 0,2-0,8% polimerycznego zagęszczacza, np. usieciowanogo polimeru akrylowego o masie cząsteczkowej powyżej 10⁶, co najmniej 10% krzemianu sodowego, np. jako obojętnego szkła wodnego, zasady (np. zasada zawieraj ąca potas) aby ustawić na odpowiednie pH, korzystnie w zakresie 9-10 lub powyżej, np. powyżej 11, ze stosunkiem kation sodowy : anion krzemionkowy (jako wolna krzemionka) (wagowo) mniejszym niż 0,7:1, i lepkości 0,3-30 Pas (w 20°C i 20I7/).

Próbki zawierały około 5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego C₁₃_₁₅ alkoholu eIksksyIowenego około 5 grupami EO na moi i około 2,7 grupami PO na moi, 15-23%

184 399 obojętnego szkła wodnego ze stosunkiem wagowym 3,5 między krzemionką a tlenkiem sodu, 13-19% KOH, 8-23% STPP, 0-11% węglanu sodu, 0,5% Carbopol 941™.

Proteaza może być włączona na przykład w ilości 0,5%.

Przykład D4: (ciekły deflokujący polimer)

Priolene 6907 4,5

KOH 10

Etoksylowany alkohol 7EO (Synperonic A7) 4,5

Etoksylowany alkohol 3EO (Synperonic A3) 4,5

Zeolit 4A 15

Fluorescer Tinopal CBS-X 0,08

Narlex DC1 1

Kwas cytrynowy 8,23

Silikonowy środek przeciwpienny DB100 0,3

Kwas LAS 11,5

Zapach 0,0

Woda do 110%

Tabela V

Resztkowa aktywność enzymów (w procentach początkowej aktywności) po przechowywaniu w 37°C dla przykładu D4 zawierającego odmianę R^L BLS309

Czas przechowywania (w dniach)	R170L	Typ dziki
0	100	100
2	98	73
4	96	66
10	94	46
33	87	8
81	78	2,1
101	71	0

Z tabeli V ewidentnie widać, że odmiana R^L wykazuje znaczne ulepszenie stabilności tego rodzaju detergentu.

Przykład D5: (ciekły deflokujący polimer)

Priolene 6907 4,5

KOH 10

Etoksylowany alkohol 7EO (Synperonic A7) 4,5

Etoksylowany alkohol 3EO (Synperonic A3) 4,5

Zeolit 4A 15

Fluorescer Tinopal CBS-X 0,08

NarlexDC1 1

Kwas cytrynowy 8,23

Silikonowy środek przeciwpienny DB100 0,3

Kwas LAS 11,5

Lipolaza 1000 0,6

Zapach 0,5

Woda do 100%

184 399

Tabela VI

Resztkowa aktywność enzymu (w procentach początkowej aktywności) po przechowywaniu w 37°C dla przykładu D5 zawierającego BLS309 odmiana S57P+R170L+N218S.

Czas przechowywania (dni)	Resztkowa aktywność Proteazy	Resztkowa aktywność Lipazy
S57P+R170L+N218S	typ dziki	typ dziki	S57P+R170L+N218S
0	100	100	100	100
2	-	75	41	94
5	97	50	15	76
8	87	30	7	71
12	91	20	12	78
28	100	18	12	70

Z tabeli VI ewidentnie widać, że odmiana S57P+R170L+N218S wykazuje znaczne ulepszenie stabilności tego rodzaju detergentu. Co więcej, odmiana S57P+R170L+N218S ma wspaniałą kompatybilność w stosunku do lipazy.

Przykład D6:

Wytworzono kostki mydła zawierające 49,7% wagowych 80/20 mydła olej talowy/kokosowy, 49,0% wody, 20% cytrynianu sodu, 1,0% kwasu cytrynowego i 0,031% proteazy. Po wytworzeniu, kostki mydła były przechowywane w temperaturze pokojowej i po określonym przedziale czasu pobrano próbki i mierzono aktywność proteazy. Dane określające stabilność podano poniżej w tabeli VII:

Tabela VII

Czas przechowywania (dni)	W.T.	R170L	R170L+N218S+S57P	R170L+Y167I
0	100	100	100	100
1	50	100	97	94
2	25	91	100	83
3		100	94	80
6		98	89	90
10	0	100	94	71
17		93	80	73
27		95	86	70

Z tabeli VII ewidentnie widać, że odmiana subtilazy R170L, S57P+R170L+N218S i R170L+Y167I wykazuje znaczne ulepszenie stabilności tego rodzaju detergentu.

Przykład D7:

Wytworzono kostki mydła zawierające 63,88% 80/20 mydła oleju talowy/kokosowy, 1% kwasu tłuszczowego z orzecha kokosowego, 25,1% wody, 10% cytrynianu sodu i 0,021% proteazy. Kostki mydła do prania przechowywano w temperaturze 37°C i po określonym przedziale czasu pobrano próbki i zmierzono aktywność proteazy.

184 399

Tabela VIII Dane obrazujące stabilność

Przechowywanie (dni)	W.T.	R170O+N218S+S57P
0	100	100
10		90,1
14		81,5
10	10
20	0	91,4
31		72,8
35		79
45		78

Z powyższej tabeli VIII ewidentnie widać, że odmiana subtilazy R1N0L+N318S+S57P wykazuje znaczne ulepszenie stabilności tego rodzaju detergentu.

Przykład 4

Działanie piorące detergentowych kompozycj i do prania zawieraj ących odmiany enzymu. Następuj ące przykłady ilustruj ą wyniki dla kilku testów prania przeprowadzonych w poniższych warunkach.

Tabela IX

Warunki prowadzenia badań nad odmianami Subtilizyny 309

Detergent	Proteazowy modelowy detergent '95
Dawka detergentu	3 g/l
pH	9,5
Czas prania	15 minut
Temperatura	15°C
Twardość wody	9°dH 1,61 mMCa3+/Mg3+
Enzymy	Subtylizyna 309 odmiany wymienione poniżej
Stężenie enzymu	0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 mg/l
Metoda badania	mini pranie *(SOP DEF-SM-OO3D.O1/01)*
Próbka tkaniny/objętość	5 próbek tkaniny (Φ 2,5 cm)/50 ml
Testowany materiał	trawa na bawełnie (spłukana w wodzie);*DF-4417N12*

Powyższy model detergentu jest prostą detergentową formulacją. Najbardziej charakterystyczne jest to, ze STP jest stosowany jako wypełniacz a zawartość anionowych środków powierzchniowo czynnych (LAS) jest całkiem wysoka. Ponadto pH jest ustawiane na 9,5 co jest niskim dla proszkowych detergentów.

Kompozycja modelowego detergentu była następująca:

184 399

Tabela X

25,0%	STP (Na5P3O10)
25,0%	Na2SO4
10,0%	Na2CO3
20,0%	LAS (Nansa 80S)
5,0%	niejonowy (Dobanol 25-7)
5,0%	Na2Si2O5
0,5%	karboksymetyloceluloza (CMC)
9,5%	woda
dawka	3 g/l
pH ustawione na	9,5

Pomiary remisji (R) testowanego materiału przeprowadzono przy 460 nm stosując fotometr Elrepho 2000 (bez UV). Wyniki pomiarów były wstawiane do następującego wyrażenia:

a AR,

AR_max + a c

Współczynnik ulepszenia (improvement factor) obliczano przy użyciu początkowego nachylenia krzywej IF=a/are·

Δ R - efekt prania enzymem w jednostkach reemisji, a - początkowe nachylenie krzywej (c — 0). a^ - początkowy slop=brudna woda dla ref enzymu c - stężenie enzymu w mg/1.

ΔΚ^,χ - eeoeetycrny maksymatoy ffek-pamiia eizymui weednoscce eecH^ - (L —> oo..

Tabela XI

Odmiany i współczynniki ulepszenia dla Subtilizyny 309

Wybór	Odmiana	IF
1	2	3
S003*	R170Y	2,8
S004*	R170Y + G195E	2,6
S012*	R170Y + G195E + K251E	1,6
G	R170F	3,3
E	R170L	3,8
F	R170M	2,4
D	R170I	4,1
I	S57P + R170L	3,9
J	S57P + N218S	1,6
K	S57P + R170L + N218S	2,3
n	Y167I + R170L	6,2
P	R170L + Q206E	2,6
V	R170G	2,0

184 399

Tabela XI - dalszy ciąg

1	2	3
w	R170C	3,4
o	S57P + R170L + Q206E	2,9
Q	Y167I + R170L + Q206E	2,4

* opisane w WO-A-91/00345

Jak widać z tabeli XI, wszystkie 25 odmian Suetilizyny 309 według wynalazku wykazują ulepszenia działania piorącego.

X V) ο ο > <

x	x	CU	X	CL	Ol	CL	Ol	Ol	x a.	CL	a-a
<	<	<	<	<	<	<			< <	O	P
X	X	>	>	VI	V)	>	<	5	Ul Ul	a-	X
£	>		a-a	I-I	U.	u	>	U	> a—	a-i	U
Ul	u	o	O	u	Ul	o	O	X	O Ul	Ul	o
u	u		U	w	>	a-i	>	>	a-l CL	>	a-a
1	1		1	1	1	1	1	<	1 X	1	U.
I	l	t	1	1	<	1	1	<	1 a-i	I	t
1	l		<	1	1	<	<	1	1 Ul	1	1
1	1	1	ł	1	1	1	1	1	• O	1	1
<	l		1	1	1	1	1	1	1 >·	1	<
1	1	f	I	1	1	I	1	t	1 CL	1	1
ω	ω	o	o	ω	Ul	(al	3	CC	O Ul	X	X
<	<	<	<	CL	o	x	Ul	<	P Ol	Ul	X
o	o	u o	o	o	2 o	O	O O	o	o
> •	>	>- «	>-	a- a	P 1	<	>	>- 1	u. 1 1	p 1

χ χ χ χ χ < < < ο <

Lu U. U. U< U.

> U J a-i *t o o o o o > J > -J »J o u o > >

Ul X 0 Ul Ul U o O <J o X a- a- >- a-

tn tn

tn tn

1 tn tn

1 tn tn

1 1 1 σ c/fui ui ui

< 1 I- X Ul Ul

1 1 P X Ul Ul

1 X Ul

1 u Ul

I X Ul

1 2 Ul

1 1 1 Ul Ul tUl p Ul

1 o CSI

1 td <

1 1 ω ω O Ul

1 1 Ul Ul Ul VI

Ul tn

1 1 1 XXX VI VI VI

1 X tn

1 X tn

U.

u

u.

Cl.

U. U. U.

X X

U. X

p

X

p

X

X X Ul

a-·

ρ

ρ a->

ρ p

>

XXX

U-

u.

1 1 1

1 1

1 1

1

1

1

1

1 1 1

1

1

1 1

1 1

1

1 1 1

1

o.

0.

o

o

< < Ul

Ul X

Ul 2

<

X

Ul

X

O X X

X

ρ

3 X

>-

< ρ <

Ou

tn

>

>

>-

>*

» p P

p p

a- u

o

p

u

u

< Ul U

u

a-i

£ *-·

a-i a-i

>-h

> > >

W

Ul

X

X

X

XXX

32

a-ι ui

X

X

u

X

< p >

ρ

Ul

Ul Ul

VI V)

tn

XXX

tn

tn

o

<

<

<

< < <

< Ul

<

<

o

<

< o o

U1

Q

Ul X

X X

X

< < <

<

<

Cu

0.

0.

Cu

XXX

X X

X X

X

X

X

X

XXX

<

P

< Ρ Ρ P

t-

XXX

Cl>

tu

>

>

>

>*

ρ u p

a- a-

a- 3

u

X

a-i

Ul

p VI X

a-

a-

p p

a- p

>·

VI VI VI

tn

tn

u

o

o

O

ui u z

X Ul

X p

Ul

<

X

o

o o <

O

o

o o

O O

o

ρ ρ ρ

>

>»

>

>

w H

w H

a-i > > Ul 2 o

> J X Ul

X X < Ul

o Ul

Φ-Ί Ul

X Ul

>

£££

O X

o u

o o u υ

O o a x

o >*

1 1 < t 1 1

1

1 1

1 1 1

t 1

I 1

1

1

1

X

O Ul 1

1

1

1 1

1 1

1

1 1 1

1

1

1 1 1

1 1

I 1

1

1

1

X

ρ 2 i

1

1

1 1

1 1

(

1 1 1

t

1

1 < <

1 1

( <

1

I

1

Ul

Q O 1

<

1

1 1

1 I

1

1 1 t

t

1

1 1 1

1 1

1 1

1

1

1

p

X O 1

1

<

1 1

1 1

1

1 1 I

1

1

1 1 1

1 1

1 1

1

1

1

X U 1

•

1

1 1

1 1

1

I 1 1

1

f

1 1 1

1 1

1 1

1

<

1

tsi

» O »

1

1

1 1

1 1

i

1 1 1

1

ł

1 1 1

1 1

1 I

I

1

I

• P 1

1

1

1 t

1 1

1

1 1 1

1

1

1 1 1

1 1

1 1

1

1

1

X

t P 1

1

1

1 1

1 1

1

1 1 1

1

1

1 1 1

1 1

1 I

1

1

1

X

o o <

1

<

1 1

1 1

i

I t 1

<

1

ł I ł

1 1

I <

<

<

<

X

< X u

t

1

< 1

< I

1

1 1 I

t

1

1

1

1 1 I

1 1

1 1

1

1

1

X

J x ui

1

1 1

< 1

1

1 I 1

1

•

«

I

1

1 1 I

1 1

1 1

1

1

1

a-i

X > X

<

1

1 1

1 t

1

1 1 1

1

1

1

1

t

1

1 1 1

1 1

1 1

1

o

1

ω

J o o

I

1

1 1

1 1

1

1 1 1

1

1

TAPROT ^GGPSS-------------SAVNRAAAEITSA-· EAT--DASS---------------SSPASEE- YSN-----FGSV------VOLLAP

ACALPR ^GGGYS.............SAFNNAVNTAYSR-· DNQ--NAAN------- YSPASAA- FSN.....YGSV-.....LDIFAP

AOALPR ^GGGYS....... KAFNDAVENAFEQ-· ENS--DACQ.............--TSPASAP- FSN-----FGKV-.....VDVFAP

SCPRB1 ^GGGKS-------------PALDLAVNAAVEV-· ENQ--DACN---------------TSPASAD- FSN-----WGKC------VDVFAP

YLXPR2 ^GGPKS-------------ASQDALWSRATQE-· DAV--DACN---------------DSPGNICG WSGGQGSNYGTC------VDVFAP

1	o	X	X	X	2	2	2	Ua	2	2	X
1	u	o	o	o	u	o	O	O	U	X	X
1	X	o	Ul	X	Ul	2	<	<	<	<	<
o	o	o	a	o	o	O	o	o	2	O	o
>	o	1	X	CS O	o	1	t	ł	1	1
Ul	o	>-	ω	X	X	X	1	t	1	1	1
Cd	X	Ul	X	X	X	f-	<	X	<	<	<
2	o	o	o	o	o	o	2	2	2	2	2
O	u	u	o	o	o	o	Ul	O	O	2	2
o	o	o	o	o	o	o	1	1	1	1	1
X	o	X	O X	Ul	u	Ul <		Ul	Ul

£££££ o o o u o o cc ui χ x P a-a -□

O O O —Ul p n CL X tn in

Ul p U1 Ul o —u o

IO Ul U) — P ui O o ω UJ

<	<	<	<	<	<
K	X	X	Ul	t-	2	Ul	ui
Ul	X	X	o	o	o	2	2
<	>	>		-J	_)	>	>
□	u		<	<	<	Ul	Ul
ω	t-	o	>	f-	t-	VI	VI

o	Ό	X	o	o	a	o	o	o	Ul	u
Ul	Ul	Ul	<	Ul	Ul	VI	>	V5	o	U)
X	X	X	U)	P	P	X	P	O	o	o
u	o	VI	Ul	Ul	P	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o	o	o	o	o	o

~t CC CC CC

<3

a

U

o

2

o

o

a

o

Ul Ul

V)

Ul

Ul

tn

X

O

o

a

o

o

o

o

o»<

>

>>

>·

X

<

X

2

p

Id

o

Ul

<

o o

O

o

o

tn

a-<

X

X

X

X

X

X

X

o o

O

o

o

o

O

o

O

o

o

o

o

o

a o

O

o

o

cd CC n <D r~

X

>·

<

V»

<

<r

X

X

(d

X

X

X

co

o

u

0

>

X

Ul

X

0

X

X

VI

VI

Ul

Ul

X

Ul

tn

ω

I-I

P

UJ

UJ

0

<

VI

VI

-J

<

>

u

Ul

Ul

i>

2

V»

VI

a>

o

®

m

0

a

eo

o

O

P

O

X

0

< X < —i O. < f η H ji-.o.Hin(juua >-ŁUliXaŁŁ3 UUlUlUlUlCUCCi-tU. PtdXUX>XV10 UJU1<S1U<S1<XXX

		CM	<	<	< X	X
X	X	X	o		=> o	o
o	UJ	-Ul	X	-r	cs a	£X
u.	X		X	p	< X	X
X	J o	<	(X	< <	<
o	X	tn	>	P	P P	P

184 399

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cona 6,00 zł.

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Ciekła detergentowa kompozycja zawierająca odmianę subtilazy, znamienna tym, że obok typowych składników zawiera subtilazę, w której jedna lub więcej niżjedna reszta aminokwasu usytuowana w lub w sąsiedztwie hydrofobowej domeny rodzicielskiej subtilazy została podstawiona przez resztę aminokwasu bardziej hydrofobową niż oryginalna reszta, przy czym odmianą subtilazy jest R170L lub R170I.
2. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera subtilazę, której rodzicielska subtilaza jest wybrana z grupy zawierającej ABSS168, BASBPN, BSSDY i BLSCAR.
3. 3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera subtilazę, której macierzysta subtilaza jest wybrana z podgrupy I-S2.
4. 4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera subtilazę, której macierzysta subtilaza jest wybrana z grupy zawierającej BLS147, BLS309, BAPB92 i BYSYAB.
5. 5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że zawiera subtilazę, której macierzystą subtilaząjest TVTHER.
6. 6. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera subtilazę, która jest odmianą połączoną z dalszymi substytucjami, delecjami i/lub insercjami w dowolnej jednej lub więcej, z pozycji: 36, 57, 76, 218, 222 i 224.
7. 7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że zawiera subtilazę należącą do podgrupy I-S2 z dalszą zmianą wybraną z grupy obejmującej *36D, S57P, N76D, N218S, M222S, M222A i T224S.
8. 8. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera odmianę subtilazy wybraną z grupy odmian obejmujących:

   a) S57P + R170L a') S57P + R170I

   b) R170L + N218S b') R170I+N218S

   c) S57P + R170L +N218S

   c) S57P + R170I + N218S

   c) S57P + V104Y + R170L + N218S c) S57P + V104Y + R17^I + N218S

   d) R170L + N218S + M222A d') R170I +N218S + M222S

   e) S57P + R170L + S188P + A194P e') S57P + R170I + S188P + A194P

   f) Y167L + R170L

   f) Y167L + R170I

   g) Y1671 + R170L g') Y1671 + R170I

   h) N76D + R170L + N218S h') N76D + R170I +N218S

   i) S57P + N76D + R170L + N218S i') S57P + N76D + R1701 + N218S

   j) N76D + R170L + N218S + M222A j') N76D + R170I + N218S + M222S j) N76D + R170L + N218S + M222A j) N76D + R170L + N218S + M222S

   k) S57P + R170I + S188P + A194P +N218S k') S57P + R170L + S188P + A194P + N218S

   184 399

   l) *36D + N76D + H120D + R170L + G195E + K235L l') *36D + N76D + H120D + R170I + G195E + K235L

   m) N76D + H120D + R170L + G195E + K235L m') N76D + H120D + R170I + G195E + K235L

   n) *36D + G97N + V104Y + H120D + R170L + A194P + G195E + K235L n') *36D + N97N + V104Y + H120D + R1701 + A194P + G195E + K235L

   o) S57P + R170L + Q206E o') S57P + R170I + Q206E

   p) R170L + Q206E p') R170I + Q206E

   q) Y167I + R170L + Q206E q') Y167I + R170I + Q206E

   r) Y167F + R170L r0 Y167F + R170I

   t) Y167I + R170L +A194P

   V) Y167I + R170I + A194P

   u) Y167I + R170L + N218S u') Y167I + R170I + N218S

   v) Y167I + R170L +A194P + N218S V) Y167I + R170I + A194P + N218S

   x) R170L + P131V x') R170I + P131V

   y) *33D + Y167I + R170L /) *36D +Y1677 + R170I aa) Y167V + R170L aa') Y167V + R170I
9. 9. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że ponadto zawiera deflokujący polimer.
10. 10. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że jako odmianę subtilazy zawiera S57P + V104Y + R170L + N218S albo S57P + V104Y + R170I + N218S.