PL184642B1

PL184642B1 - Izolowana czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca ligand TIE-2, wektor zawierajacy izolowana czasteczke kwasu nukleinowego, izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, uklad gospodarz-wektor, sposób wytwarzania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, przeciwcialo, cialo ligandu, koniugat, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie przeciwciala, zastosowanie izolowanego i oczyszczonego ligandu, sposób in vitro podtrzymywania w hodowli ekspresji receptora TIE-2, sposób identyfikacji antagonisty receptora TIE-2, cialo receptora, izolowana czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca cialo receptora, wektor zawierajacy izolowana czasteczke kwasu nukleinowego kodujaca cialo receptora, kompozycja farmaceutyczna zawierajaca cialo receptora PL

Info

Publication number: PL184642B1
Application number: PL95319586A
Authority: PL
Inventors: Samuel Davis; Joanne Bruno; Mitchell Goldfarb; Thomas H Aldrich; Peter C Maisonpierre; Czeslaw Radziejewski; Pamela F Jones; George D Yancopoulos
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1995-10-06
Publication date: 2002-11-29
Also published as: IL140138A0; DE69520149D1; US5814464A; FI120313B; IL140138A; DK0784683T3; CN1230536C; EP0784683B1; JP4054375B2; NO971557L; HU221422B1; CA2202028A1; DE69520149T2; US6433143B1; NZ296638A; EP0784683A1; ES2154354T3; CA2202028C; NO322643B1; US6166185A

Abstract

1. Izolowana czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca ligand TIE-2, w której to czasteczce, sekwencje kwasu n ukleinowego stanowi: (a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierajaca region kodujacy ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie scislych z sekwencja kwa- su nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiazacy receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzowac z sekwencja kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiazacy receptor TIE-2. 7. Wektor zawierajacy izolowana czasteczke kwasu nukleinowego, kodujaca ligand TIE-2, w której to czastecz-- ce, sekwencje kwasu nukleinowego stanowi: (a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierajaca region kodujacy ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie scislych z sekwencja kwa- su nukleinowego (a), i która koduje ligand TIE-2 wiazacy receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzowac z sekwencja kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiazacy receptor TIE-2. 15. Izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez czasteczke kwasu nukleinowego, w której to cza- steczce, sekwencje kwasu nukleinowego stanowi: (a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierajaca region kodujacy ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie scislych z sekwencja kwa- su nukleinowego (a), i która koduje ligand TIE-2 wiazacy receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzowac z se- kwencja kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiazacy receptor TIE-2, albo czasteczk kwasu nukleinowego charakteryzujaca sie tym, ze kodowany przez nia ligand TIE-2 stanowi agoniste TIE-2. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2.

Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego charakteryzuje się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2, przy czym wspomniany ligand TIE-2 posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5.

Przedmiotem wynalazku jest także izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, i w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2.

184 642

Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego charakteryzuje się tym, że kodowany przez tą cząsteczkę ligand TIE-2 stanowi antagonistę TIE-2, przy czym wspomniany ligand TIE-2 posiada sekwencję aminikwasową przedstawioną na fig. 6.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor zawierający izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

Korzystnie wektor charakteryzuje się tym, że zawarta w nim cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie związana z sekwencją kontrolującą ekspresję, zdolną do kierowania ekspresją w komórce gospodarza. Bardziej korzystnie wspomniany wektor może być plazmidem.

W korzystniejszym rozwiązaniu plazmid stanowi plazmid oznaczony symbolem pJFE14, kodujący ligand TIE-2 (numer akcesyjny ATCC 75910), a najkorzystniej, plazmid oznaczony symbolem pBluescript KS, kodujący ludzki TIE-2 ligand 2 (numer akcesyjny ATCC 75963). .

W korzystnej postaci wynalazku wektor może stanowić wektor oznaczony symbolem ZgtlO, kodujący hTIE-2 ligand 1 (numer akcesyjny ATCC 75928).

Przedmiotem wynalazku jest także izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2.

Przedmiotem wynalazku jest także izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2.

Kolejnym przedmiotem wynalazkujest izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2.

Przedmiotem wynalazku jest także izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2.

184 642

Przedmiotem wynalazku jest także układ: gospodarz-wektor do wytwarzania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, posiadającego sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodna, który wiąże się z receptorem TIE-2 zawierającym wektor obejmujący izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2 w komórce gospodarza.

Korzystnie układ: gospodarz-wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawarta w tym wektorze cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie związana z sekwencją kontrolującą ekspresję, zdolną do kierowania ekspresją w komórce gospodarza.

W układzie: gospodarz-wektor korzystnie wektorem jest plazmid. Bardziej korzystnie plazmidem jest plazmid oznaczony symbolem pJPE14, kodujący ligand TIE-2 (numer akcesyjny ATCC 75910), a jeszcze bardziej korzystnie plazmidem jest plazmid oznaczony symbolem pBluescript KS, kodujący ludzki TIE-2 ligand 2 (numer akcesyjny ATCC 75963).

W układzie: gospodarz-wektor korzystnym wektorem jest wektor oznaczony symbolem kgtlO, kodujący hTIE-2 ligand 1 (numer akcesyjny ATCC 75928).

W układzie: gospodarz-wektor według wynalazku, korzystnie komórkę gospodarza stanowi komórka bakteryjna, drożdżowa, owadzia albo ssacza.

W układzie: gospodarz-wektor, korzystnie może znajdować się ponadto kwas nukleinowy kodujący receptor TEE-2.

Przedmiotem wynalazku jest także układ: gospodarz-wektor do wytwarzania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2 zawierającym wektor obejmujący izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

W korzystnej postaci wynalazku układ: gospodarz-wektor charakteryzuje się tym, że zawarta w tym wektorze cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie związana z sekwencją kontrolującą ekspresję, zdolną do kierowania ekspresją w komórce gospodarza.

W układzie według wynalazku korzystnie wektorem jest plazmid, a bardziej korzystnie plazmid oznaczony symbolem pJFE14, kodujący ligand TIE-2 (numer akcesyjny ATCC 75910).

Jeszcze bardziej korzystnie w układzie: gospodarz-wektor według wynalazku plazmidem jest plazmid oznaczony symbolem pBluescript KS, kodujący ludzki TIE-2 ligand 2 (numer akcesyjny ATCC 75963).

Najkorzystniej, w układzie: gospodarz-wektor według wynalazku wektorem jest wektor oznaczony symbolem kgtlO, kodujący hTIE-2 ligand 1 (numer akcesyjny ATCC 75928).

Komórkę gospodarza może stanowić komórka bakteryjną drożdżową owadzia albo ssacza. Układ: gospodarz-wektor, wynalazku korzystnie zawiera ponadto kwas nukleinowy kodujący receptor TIE-2.

184 642

Przedmiotem wynalazku jest także układ: gospodarz-wektor do wytwarzania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, kodowanego przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2 zawierający wektor obejmujący izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2 w komórce gospodarza.

W układzie gospodarz-wektor według wynalazku, zawarta w tym wektorze cząsteczka kwasu nukleinowego korzystnie jest operacyjnie związana z sekwencją kontrolującą ekspresję, zdolną do kierowania ekspresją w komórce gospodarza.

Korzystnie wektorem może być plazmid, a bardziej korzystnie plazmidem jest plazmid oznaczony symbolem pJFE14, kodujący ligand TIE-2 (numer akcesyjny ATCC 75910). Plazmidem może być natomiast korzystnie plazmid oznaczony symbolem pBluescript KS, kodujący ludzki TIE-2 ligand 2 (numer akcesyjny ATCC 75963).

W układzie według wynalazku korzystnie wektorem jest wektor oznaczony symbolem Xgt10, kodujący hTIE-2 ligand 1 (numer akcesyjny ATCC 75928), a komórką gospodarza może być komórka bakteryjną, drożdżowa, owadzia albo ssacza.

Dodatkowo układ: gospodarz-wektor, może zawierać kwas nukleinowy kodujący receptor TIE-2.

Przedmiotem wynalazku jest także układ: gospodarz-wektor do wytwarzania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, kodowanego przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2, zawierający wektor obejmujący izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo

184 642 (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2 w komórce gospodarza.

W układzie: gospodarz-wektor według wynalazku zawarta w tym wektorze cząsteczka kwasu nukleinowego korzystnie jest operacyjnie związana z sekwencją kontrolującą ekspresję, zdolną do kierowania ekspresją w komórce gospodarza.

Korzystnie w układzie gospodarz-wektor wektorem jest plazmid, a bardziej korzystnie plazmidem ten jest oznaczony symbolem pJFE14, kodujący ligand TIE-2 (numer akcesyjny ATCC 75910). Jeszcze bardziej korzystnie plazmidem jest plazmid oznaczony symbolem pBluescript KS, kodujący ludzki TIE-2 ligand 2 (numer akcesyjny ATCC 75963).

W układzie gospodarz-wektor według wynalazku wektorem wektor oznaczony symbolem kgtlO, kodujący hTIE-2 ligand 1 (numer akcesyjny ATCC 75928), a komórkę gospodarza może stanowić komórka bakteryjna, drożdżowa, owadzia albo ssacza Ponadto układ ten może zawierać kwas nukleinowy kodujący receptor TIE-2.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, polegający na tym, że prowadzi się hodowlę komórek w układzie: gospodarzwektor w warunkach pozwalających na wytwarzanie tego ligandu i odzyskuje się wytworzony ligand, przy czym ligand ten, posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment łub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2, a wektor w układzie gospodarz-wektor obejmuje izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodującą ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencją kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2 w komórce gospodarza.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało swoiście wiążące izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2. Korzystnie przeciwciałem może być przeciwciało monoklonalne.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało swoiście wiążące izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2. Korzystnie przeciwciałem może być przeciwciało monoklonalne.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało swoiście wiążące izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TEK-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2. Korzystnie przeciwciałem może być przeciwciało monoklonalne.

Przedmiotem wynalazkujest także przeciwciało swoiście wiążące izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2 w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

184 642 (a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2. Korzystnie przeciwciałem może być przeciwciało monoklonalne.

Przedmiotem wynalazku jest także ciało ligandu, które zawiera izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2.

Korzystnie ciało ligandu według wynalazku ma sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4, 5 lub 6 i stały region immunoglobulinowy jest częścią Fc ludzkiej IgGl.

Przedmiotem wynalazku jest także koniugat zawierający ligand skoniugowany z środkiem cytotoksycznym, charakteryzujący się tym, że ligand stanowi izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig.4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2.

Korzystnie, w takim koniugacie środkiem cytotoksycznym jest radioizotop albo toksyna.

Przedmiotem wynalazku jest także koniugat zawierający ligand skoniugowany z środkiem cytotoksycznym, charakteryzujący się tym, że ligand stanowi izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig.6 łub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2.

Korzystnie w takim koniugacje środkiem cytotoksycznym jest radioizotop albo toksyna.

Przedmiotem wynalazku jest także koniugat zawierający ligand skoniugowany z środkiem cytotoksycznym, charakteryzujący się tym, że ligand stanowi izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2. W koniugacie korzystnie środkiem cytotoksycznym jest radioizotop albo toksyna.

Przedmiotem wynalazku jest także koniugat zawierający ligand skoniugowany z środkiem cytotoksycznym, charakteryzujący się tym, że ligand stanowi izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2 w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2. Korzystnie, środkiem cytotoksycznym jest radioizotop albo toksyna.

184 642

Przedmiotem wynalazkujest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig.4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierającą izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

Przedmiotem wynalazkujest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2 w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo, (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera przeciwciało, korzystnie przeciwciało monoklonalne, swoiście wiążące izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną, który wiąże się z receptorem TIE-2 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, zawierająca przeciwciało, korzystnie przeciwciało monoklonalne, swoiście wiążące izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, zawierająca przeciwciało, korzystnie przeciwciało monoklonalne, swoiście wiążące izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego

184 642 charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2, i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, zawierająca przeciwciało, korzystnie przeciwciało monoklonalne, swoiście wiążące izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2 w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TEE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2, i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca ciało ligandu obejmującego izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, który ma sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną i który wiąże się z receptorem TIE-2, oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

Korzystnie kompozycja zawiera ligand TIE-2, który ma sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4, 5 lub 6 i stały region immunoglobulinowy jest częścią Fc ludzkiej IgGl.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja zawierająca koniugat obejmujący ligand skoniugowany z środkiem cytotoksycznym, przy czym ligand stanowi izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną, który wiąże się z receptorem TIE-2 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie wspomnianym środkiem cytotoksycznym może być radioizotop albo toksyna.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja zawierająca koniugat obejmujący ligand skoniugowany z środkiem cytotoksycznym przy czym ligand stanowi izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2, i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie, wspomnianym środkiem cytotoksycznym jest radioizotop albo toksyna.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja zawierająca koniugat obejmujący ligand skoniugowany z środkiem cytotoksycznym przy czym ligand stanowi izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie wspomnianym środkiem cytotoksycznym jest radioizotop albo toksyna.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja zawierająca koniugat obejmujący ligand skoniugowany z środkiem cytotoksycznym przy czym ligand stanowi izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2 w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6,

184 642 (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligano, TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie wspomnianym środkiem cytotoksycznym jest radioizotop albo toksyna.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie przeciwciała, korzystnie przeciwciała monoklonalnego, specyficznie wiążącego izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2 do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie blokowania wzrostu naczyń krwionośnych u ssaków. Korzystnie, ssakiem jest człowiek.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie izolowanego i oczyszczonego ligand TIE-2, posiadającego sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną, który wiąże się z receptorem TIE-2 do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie wspomagania neounaczynienia u ssaków. Korzystnie, do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie wspomagania leczenia zranień lub do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie leczenia ischemii.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2 kodowanego przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2, do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie wspomagania neounaczynienia u ssaków. Korzystnie, do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie wspomagania leczenia zranień oraz do, wytwarzania leku do zastosowania w metodzie leczenia ischemii.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie przeciwciała, korzystnie przeciwciała monoklonalnego, zdolnego do specyficznego wiązania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, posiadającego sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2 do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie hamowania aktywności ligandu TIE-2 u ssaków.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie przeciwciała zdolnego do specyficznego wiązania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, posiadającego sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem

184 642

TIE-2 do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie hamowania aktywności ligandu TIE2 u ssaków.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie przeciwciała zdolnego do specyficznego wiązania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2 kodowanego przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2, do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie hamowania aktywności ligandu TIE-2 u ssaków.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie przeciwciała zdolnego do specyficznego wiązania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2 kodowanego przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2, do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie hamowania aktywności ligandu TIE-2 u ssaków. Korzystnie, do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie hamowania aktywności ligandu TIE-2 u ssaków. Korzystnie ssakiem jest człowiek. Bardziej korzystnie do wytwarzania leku do zmniejszania lub zapobiegania wzrostowi guza u człowieka.

Również korzystnie zastosowanie do wytwarzania leku w metodzie hamowania aktywności ligandu TIE-2 u ssaków, przy czym korzystnie ssakiem jest człowiek.

Bardziej korzystnie zastosowanie według wynalazku stosuje się do wytwarzania leku do zmniejszania lub zapobiegania wzrostowi guza u człowieka.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób in vitro podtrzymywania w hodowli ekspresji receptora TIE-2 w komórce, polegający na tym, że dostarcza się do komórki z ekspresją receptora TIE-2 skuteczną ilość izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, posiadającego sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną wiążący się z receptorem TIE-2. Korzystnie, jako komórkę z ekspresją receptora TIE-2 stosuje się komórkę śródbłonka.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób in vitro podtrzymywania w hodowli ekspresji receptora TIE-2 w komórce, polegający na tym, że dostarcza się do komórki z ekspresją receptora TIE-2 skuteczną ilość izolowanego i oczyszczonego liganda TIE-2 kodowanego przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo

184 642 (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2. Korzystnie w sposobie według wynalazku jako komórkę z ekspresją receptora TIE-2 stosuje się komórkę śródbłonka.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób identyfikacji antagonisty receptora TIE-2 polegający na tym, że kontaktuje się komórki, w których przebiega ekspresja receptora TIE-2 z:

a) badanym związkiem, i

b) izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig.4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2, w warunkach pozwalających na wiązanie tego ligandu z receptorem i oznacza się, czy badany związek ma zdolność zaburzania wiązania ligandu z receptorem poprzez oznaczenie czy testowany związek obniża przeżycie komórki lub proliferację, transformację komórkową, zmienia wczesną indukcję genu lub fosforylację TIE-2.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób identyfikacji 'antagonisty receptora TIE-2 polegający na tym, że kontaktuje się komórki, w których przebiega ekspresja receptora TIE-2 z:

a) badanym związkiem, i

b) izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig.6 lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2, w warunkach pozwalających na wiązanie tego ligandu z receptorem i oznacza się, czy badany związek ma zdolność zaburzania wiązania ligandu z receptorem poprzez oznaczenie czy testowany związek obniża przeżycie komórki lub proliferację, transformację komórkową, zmienia wczesną indukcję genu lub fosforylację TIE-2.

a) badanym związkiem, i

b) izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje, w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2, w warunkach pozwalających na wiązanie tego ligandu z receptorem i oznacza się czy badany związek ma zdolność zaburzania wiązania ligandu z receptorem poprzez oznaczenie czy testowany związek obniża przeżycie komórki lub proliferację, transformację komórkową, zmienia wczesną indukcję genu lub fosforylację TIE-2.

a) badanym związkiem, i

b) izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2 w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

184 642 (a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand ΤΙΕ2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2, w warunkach pozwalających na wiązanie tego ligandu z receptorem i oznacza się, czy badany związek ma zdolność zaburzania wiązania ligandu z receptorem poprzez oznaczenie czy testowany związek obniża przeżycie komórki lub proliferację, transformację komórkową, zmienia wczesną indukcję genu lub fosforylację TIE-2.

Przedmiotem wynalazku jest także ciało receptora, które wiąże się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2.

Przedmiotem wynalazkujest także izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ciało receptora wiążącego się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną wiążący się z receptorem TIE-2.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor zawierający izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ciało receptora wiążące się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2. Korzystnie wektorem jest plazmid.

Przedmiotem wynalazku jest także ciało receptorą które wiąże się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną.

Przedmiotem wynalazku jest także izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ciało receptora wiążącego się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną

Przedmiotem wynalazku jest także wektor zawierający izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ciało receptora wiążącego się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-246. Korzystnie wektor jest plazmidem.

Przedmiotem wynalazku jest także ciało receptorą które wiąże się specyficznie z izolowanym o oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand ΤΊΕ-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2.

Przedmiotem wynalazku jest także izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ciało receptora wiążącego się specyficznie z izolowanym o oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5,

184 642 (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor zawierający izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ciało receptora wiążącego się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i którą koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2. Korzystnie wektorem jest plazmid.

Przedmiotem wynalazku jest także ciało receptora, które wiąże się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2.

Przedmiotem wynalazkujest także izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ciało receptora wiążącego się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nuklemowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor zawierający izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ciało receptora wiążącego się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6.

184 642 (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TEE-2. Korzystnie wektor jest plazmidem.

Jeszcze bardziej korzystnie plazmid ten oznaczony jest jako ciało receptora vTIE-2 (depozyt ATTC oznaczony jako VR 2484).

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera ciało receptora wiążącego się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, charakteryzującą tym, że zawiera ciało receptora, wiążącego się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera ciało receptora, wiążącego się specyficznie z izolowanym o oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-23 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera ciało receptora wiążącego się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TEE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Wynalazek został zilustrowany na rysunkach na których odpowiednie figury przedstawiają odpowiednio:

Figury 1A i 1B przedstawiąją proces hamowania rozwoju naczyń krwionośnych w błonie kosmówki omoczniowej (CAM) embrionów kurzych przez ciało receptora TIE-2 (TIE-2 RB). Jeden skrawek resorbowalnej pianki żelatynowej (Gelfoam) nasączony ilością 6 pg RB umieszczano bezpośrednio pod błoną CAM z jednodniowych embrionach 'kurzych. Po trzech następnych dniach inkubacji usunięto i zbadano 4-dniowe embriony i otaczające je błony CAM. fig. 1A: embriony traktowane ciałem receptora EHK-1 RB (rEHK-1 ecto/h IgGl Fc) pozostają żywe i posiadają normalnie rozwinięte naczynia krwionośne w otaczającej je błonie CAM. fig. 1B: wszystkie embriony traktowane przez TIE-2 RB (rTIE-2 ecto/h IgGl Fc)

184 642 obumarły, mają zmniejszoną wielkość i są prawie całkowicie pozbawione otaczających naczyń krwionośnych.

Figura 2 przedstawia wektor pJFE14.

Figura 3 przedstawia mapę restrykcyjną Xgt 10.

Figura 4 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego i wyprowadzoną z niej sekwencję ąminokwasową (kod jednoliterowy) ludzkiego ligandu TIE-2 z klonu ZgtlO kodującego htie2 ligand 1.

Figura 5 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego i wyprowadzoną z niej sekwencję aminokwasową (kod jednoliterowy) ludzkiego ligandu TIE-2 z klonu T98G.

Figura 6 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego i wyprowadzoną z niej sekwencję aminokwasową (kod jednoliterowy) ludzkiego ligandu TIE-2 z klonu pBluescript KS, kodującą ludzki TIE-2 ligand 2.

Figura 7 obrazuje blotting Westema wykazujący aktywację receptora TIE-2 przez TIE-2 ligand 1 (pasmo Ll) ale nie przez TIE-2 ligand 2 (pasmo L2) lub kontrolę (Mock).

Figura 8 przedstawia biotting Westema uwidaczniający, że uprzednie traktowanie komórek HAEC nadmiarem TIE-2 ligandu 2 (pasmo 2) antagonizuje następną zdolność rozcieńczonego TIE-2 ligandu 1 do aktywowania receptora TIE-2 (TIE2-R) w porównaniu z uprzednim traktowaniem komórek HAEC pożywką MOCK (pasmo 1).

Figura 9 przedstawia histogram obrazujący częstotliwość wiązania ze szczurzą TIE2 IgG immobilizowaną na powierzchni przez ligand TIE2 w zatężonych (10x), kondycjonowanych mediach po hodowli komórek C2C12 ras, Rat2 ras, SHEP i T98G. Swoiste wiązanie TIE2 szczura (rTIE2) jest wykazane przez znaczne obniżenie aktywności wiązania w obecności rozpuszczalnego TIE2 RB szczura w stężeniu 25 pg/ml, w porównaniu z nieznacznym obniżeniem tej aktywności obserwowanym w obecności rozpuszczalnego trkB RB.

Figura 10 przedstawia wiązanie rekombinacyjnego, ludzkiego TIE-2 ligandu 1 (hTLl) i ludzkiego TIE-2 ligandu 2 (hTL2) w supematantach z hodowli komórek cos do powierzchni z immobilizowanymi ludzkimi TIE-2 RB. Swoiste wiązanie ludzkiego TIE-2 oznaczano przez inkubowanie próbek w pożywce zawierającej 25 pg/ml albo rozpuszczalnych ludzkich TIE-2 RB albo trkB RB. Znaczące obniżenie aktywności wiązania obserwowano jedynie w próbkach inkubowanych z ludzkimi TIE2 RB.

Figura 11 przedstawia blotting typu Western uwidaczniający, że ciała receptora TIE-2 (oznaczone symbolem TIE-2 RB albo jak na tej figurze, TIE2-Fc) blokują aktywację receptorów TIE-2 przez TIE-2 ligand 1 (TLI) w komórkach HUVEC, podczas gdy niespokrewnione ciało receptora (TRKB-Fc) nie blokuje tej aktywacji.

Jak opisano bardziej szczegółowo poniżej, zgłaszający wyizolowali techniką klonowania ekspresyjnego nowy ligand, który wiąże receptor TIE-2. Przedmiotem wynalazku jest ligand TIE-2 i jego sekwencja aminokwasowa a także równoważne funkcyjnie cząsteczki, w których reszty aminokwasowe są podstawione przez inne reszty występujące w tej sekwencji, dając zmianę cichą. Przykładowo, jedna lub większa ilość reszt aminokwasowych w tej sekwencji może być podstawiona przez inny aminokwas lub inne aminokwasy o zbliżonej polamości działające jako równoważniki funkcyjne, w wyniku czego powstaje cicha zmiana. Podstawienia aminokwasowe w tej sekwencji mogą być wybrane spośród innych przedstawicieli klasy, do której należy dany aminokwas. Np., klasa niepolamych (hydrofobowych) aminokwasów obejmuje alaninę, leucynę, izoleucynę, walinę, prolinę, fenyloalaninę, tryptofan i metioninę. Polarne, obojętne aminokwasy obejmują glicynę, serynę, treoninę, cysteinę, tyrozynę, asparaginę i glutaminę. Do aminokwasów z ładunkiem dodatnim (zasadowych) należą arginina, lizyna i histydyna. Do aminokwasów z ładunkiem ujemnym (kwaśnych) należą kwas asparaginowy i kwas glutaminowy. Przedmiotem wynalazku są również białka, ich fragmenty lub pochodne, wykazujące tę samą lub podobną aktywność biologiczną oraz pochodne, które zostały w inny sposób zmodyfikowane podczas albo po translacji, np. glikozylacji, rozszczepieniu proteolitycznym, związaniu z cząsteczką przeciwciała albo z innym ligandem komórkowym lub w podobnym procesie.

Przedmiotem wynalazkujest ponadto sekwencja nukleotydowa kodująca białko opisane jako TIE-2 ligand 1 oraz komórki, które zostały genetycznie zmienione technikami inżynierii

184 642 genetycznej tak, aby wytwarzały to białko, np. techniką transfekcji, transdukcji, infekcji, elektroporacji lub mikroiniekcji kwasu nukleinowego kodującego opisany powyżej TIE-2 ligand 1 w odpowiednim wektorze ekspresyjnym.

Wynalazek obejmuje również sekwencję nukleotydową kodującą białko opisane jako TIE-2 ligand 2 oraz komórki, które zostały genetycznie zmienione technikami inżynierii genetycznej tak, aby wytwarzały to białko, np. techniką transfekcji, transdukcji, infekcji, elektroporacji lub mikro iniekcji kwasu nukleinowego kodującego opisany powyżej TIE-2 ligand 2 w odpowiednim wektorze ekspresyjnym.

Dla specjalistów jest zrozumiałe, że wynalazek obejmuje ponadto sekwencje DNA i RNA hybrydyzujące z wyprowadzoną sekwencją kodującą ligand TIE-2 w warunkach umiarkowanych, określonych np. w podręczniku Sambrook’a i wsp., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Π wyd., tom 1, str. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Tak więc, cząsteczką kwasu nukleinowego objętą wynalazkiem jest cząsteczka posiadająca sekwencję wyprowadzoną z sekwencji aminokwas owe j ligandu TIE-2 otrzymana opisanym sposobem a także cząsteczka posiadająca sekwencję kwasów nukleinowych hybrydyzującą z taką sekwencją kwasu nukleinowego a także sekwencja kwasu nukleinowego, która nie zawiera powyższych sekwencji jako wynik kodu genetycznego, ale która koduje ligand wiążący receptor TIE-2.

Do skonstruowania wektorów ekspresyjnych kodujących ligand TIE-2 można użyć dowolne znane sposoby insercji fragmentów DNA do wektora i odpowiednie sygnały kontroli transkrypcji i translacji oraz sekwencje kodujące to białko. Do sposobów tych należą rekombinacja DNA in vitro i techniki syntetyczne oraz rekombinacje in vivo (rekombinacja genetyczna). Ekspresja sekwencji kwasu nukleinowego kodującej ligand TIE-2 lub jego fragmenty peptydowe może być regulowana przez drugą sekwencję kwasu nukleinowego, dzięki czemu to białko lub peptyd będzie wytwarzane w gospodarzu transformowanym tą rekombinantową cząsteczką DNA. Przykładowo, ekspresja opisanego tu ligandu TIE-2 może być kontrolowana przez dowolny, znany element promotora/wzmacniacza. Do promotorów, które mogą być użyte do kontroli ekspresji tego ligandu należą (nie ograniczając się do nich) długa powtarzalna jednostka końcowa opisana przez Squinto i wsp. (Celi 65, 1-20, 1991), region wczesnego promotora SV40 (Bemoist i Chambon, Naturę, 290, 304-310), promotor CMV, powtarzalna jednostka końcowa M-MulV 5', promotor zawarty w 3' długiej, powtarzalnej jednostce końcowej wirusa mięsaka Rousa (Yamamoto i wsp.. Celi, 22, 787-797, 1980), promotor kinazy tymidynowej wirusa Herpes (Wagner i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. US.A. 78, 144-145, 1981), promotor adenowirusa, sekwencje regulacyjne genu metalotioeiny (Brinster i wsp.. Nature 296, 39-42, 1982), prokariotyczne wektory ekspresyjne, takie jak promotor β-laktamazy (Villa-Kamaroff i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. US.A., 75, 3727-3731, 1978) albo promotor tac ęDeBoer i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. US.A., 80, 21-25, 1983; patrz również: „Useful proteins from recombinant bacteria w Scientific American, 242, 74-94, 1980), elementy promotora z drożdży lub innych grzybów, takie jak promotor Gal 4, promotor ADH (dehydrogenazy alkoholowej), promotor PGK (kinazy fosfoglicerolowej), promotor alkalicznej fosfatazy oraz następujące zwierzęce regiony kontroli transkrypcji, które wykazują swoistość tkankową i są stosowane w zwierzętach transgenicznych: region kontroli genu elestazy I, aktywny w komórkach graniastych trzustki (Swift i wsp.. Celi 38, 639-646, 1984); Omitz i wsp., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50, 399-409, 1986; MacDonald, Hepatology 7, 425-515, 1987), region kontroli genu insuliny, który jest aktywny w trzustkowych komórkach beta (Hanahan, Nature 315, 115-122, 1985), region kontroli genu immunoglobuliny, aktywny w komórkach limfoidalnych (Grosschedl i wsp., Celi, 38, 647-658, 1984; Adames i wsp., Nature 318, 533-538, 1985; Alexander i wsp., Mol. Celi. Biol. 7, 1436-1444, 1987), region kontrolny mysiego wirusa raka sutka, który jest aktywny w komórkach jąder, sutka, komórkach limfoidalnych i tucznych (Leder i wsp. Celi 45, 485-495, 1986), region kontrolny genu albuminy, aktywny w wątrobie (Pinkert i wsp., Genes and Devel. 1, 268-276, 1987), region kontrolny genu a-fetoproteiny, aktywny w wątrobie (Krumlauf i wsp.. Mol. Celi. Biol. 5, 1639-1648, 1985; Hammer i wsp., Science 235, 53-58, 1987), region kontrolny genu a-l antytrypsyny aktywny w wątrobie (Kelsey i wsp., Genes and Devel., 1, 161-171, 1987), re34

184 642 gion kontrolny genu beta-globiny aktywny w komórkach szpiku (Mogram i wsp.. Naturę 315, 338-340, 1985; Kollias i wsp.. Cell 46, 89-94, 1986), region kontrolny genu zasadowego białka mieliny, aktywny w oligodendrocytach w mózgu (Readhead i wsp.. Cell 48, 703-712, 1987), region kontrolny genu lekkiego łańcucha-2 miozyny, aktywny w mięśniach szkieletowych (Shani, Naturę 314, 283-286, 1985) i region kontrolny genu hormonu uwalniającego gonadotropinę, aktywny w podwzgórzu (Mason i wsp., Science 234, 1372-1378, 1986).

Przedmiotem wynalazku jest również wytwarzanie związków antysensownych, które mają zdolność swoistej hybrydyzacji z sekwencją RNA kodującą ligand TIE-2 w celu modulowania jej ekspresji (Ecker, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5.166.195 wydany 24 listopada 1992 r.).

Tak więc, według wynalazku, wektory ekspresyjne zdolne do replikacji w gospodarzu bakteryjnym lub eukariotycznym, zawierające kwas nukleinowy kodujący opisany ligand TIE-2 stosuje się do transfekcji gospodarza i przez to kieruje się ekspresję tego kwasu nukleinowego na wytwarzanie ligandu TIE-2, który następnie odzyskuje się w formie biologicznie aktywnej. Użyty tu termin „forma biologicznie aktywna” oznacza formę zdolną do wiązania receptora TIE-2 i wywoływania odpowiedzi biologicznej takiej jak funkcja różnicowania albo wpływania na fenotyp komórki, w której zachodzi ekspresja receptora. Takie formy aktywne biologicznie mogłyby przykładowo indukować fosforylację domeny kinazy tyrozynowej w receptorze TIE-2.

Wektory ekspresyjne zawierające inserty tego genu można identyfikować wykorzystując cztery podstawowe podejścia: (a) hybrydyzację DNA-DNA, (b) obserwację występowania lub niewystępowania funkcji genu „markerowego”, (c) ekspresję wbudowanych sekwencji i (d) wykrywanie w łańcuchowej reakcji amplifikacji z udziałem polimerazy (PCR). W pierwszym podejściu, obecność obcego genu wbudowanego do wektora ekspresyjnego można wykryć przez hybrydyzację DNA-DNA, stosując sondy zawierające sekwencje homologiczne z wbudowanym genem kodującym ligand TIE-2. W drugim podejściu, rekombinantowy układ: wektor/gospodarz można zidentyfikować i wyselekcjonować w oparciu o występowanie lub niewystępowanie pewnych funkcji genu markerowego (np. aktywności kinazy tymidynowej, oporności na antybiotyk, fenotypu transformacji, tworzenia ciałka okluzyjnego w baculowirusie lub podobnej) wywołanych insercją obcych genów w tym wektorze. Jeśli np. kwas nukleinowy kodujący ligand TIE-2 wbuduje się do sekwencji genu markerowego tego wektora, wówczas rekombinanty zawierające ten insert można będzie zidentyfikować w oparciu o brak funkcji tego genu markerowego. W trzecim podejściu, rekombinantowe wektory ekspresyjne można zidentyfikować analizując produkt obcego genu, którego ekspresja zachodzi w organizmie rekombinacyjnym. Takie analizy mogą być przykładowo oparte na fizycznych lub funkcyjnych właściwościach produktu genu dla ligandu TIE-2, np. na wiązaniu tego ligandu do receptora TEE-2 lub jego części, co można śledzić za pomocą np. wykrywalnego przeciwciała lub jego części lub przez wiązanie z przeciwciałami wzbudzonymi przeciw białku ligandu TEE-2 lub jego części. Komórki według wynalazku mogą przejściowo albo korzystnie, konstytutywnie i trwale wytwarzać ligandy TEE-2 opisane powyżej. W czwartym podejściu, można przygotować primery nukleotydowe DNA korespondujące z sekwencją DNA tie-2 specyficzną. Primery te można następnie użyć do amplifikacji w reakcji PCR fragmentu genu tie-2 (sposób wykonania reakcji PCR jest opisany w publikacji: PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications, wyd.: Michael A. Innis i wsp., Academic Press, 1990).

Rekombinacyjny ligand można oczyszczać dowolną techniką pozwalającą na następne wytworzenie trwałego, aktywnego biologicznie białka. Przykładowo (lecz nieograniczająco) ten ligand można wyodrębnić z komórek albo w postaci rozpuszczalnych białek albo w formie ciał inkluzyjnych, z których mogą być ilościowo ekstrahowane za pomocą 8M roztworu chlorowodorku guanidyniowego i następnie poddawane dializie. W celu dalszego oczyszczenia ligandu można zastosować konwencjonalne techniki chromatografii jonowymiennej, chromatografii interakcji hydrofobowej, chromatografii z odwróconymi fazami lub filtracji żelowej.

184 642

W dodatkowych rozwiązaniach według wynalazku można użyć rekombinacyjny gen kodujący ligand TIE-2 do inaktywacji lub wyeliminowania genu endogennego przez rekombinację homologiczną i przez to utworzyć komórkę, tkankę lub zwierzę z deficytem ligandu TIE-2. Przykładowo (lecz nieograniczająco) można modyfikować technikami inżynierii rekombinantowy gen kodujący ligand TIE-2 w taki sposób aby zawierał mutację insercyjną, np. gen neo, który mógłby inaktywować natywny gen kodujący ligand TIE-2. Taką konstrukcję pod kontrolą odpowiedniego promotora można wprowadzić do komórki, takiej jak embrionalna komórka pnia, techniką taką jak transfekcja, transdukcja lub iniekcja. Komórki zawierające tę konstrukcję można następnie selekcjonować w oparciu o oporność na G418. Następnie można identyfikować komórki nie zawierające pierwotnego, własnego genu kodującego ligand TIE-2 metodą blottingu typu Southern, wykrywania w reakcji PCR, blottingu typu Northern albo próby ekspresji. Komórki, w których nie występuje własny, nienaruszony gen kodujący ligand TIE-2 można następnie łączyć przez fuzję z komórkami wczesnego embrionu, generując transgeniczne zwierzęta z brakiem tego ligandu. Takie zwierzęta można stosować do badania specyficznych procesów przebiegających in vivo, normalnie zależnych od tego ligandu.

Przedmiotem wynalazku są ponadto przeciwciała przeciw opisanym ligandom TIE-2, które to przeciwciała są użyteczne do identyfikacji tych ligandów, przykładowo w zastosowaniach diagnostycznych. Do wytworzenia przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko ligandowi TIE-2 można użyć dowolną technikę umożliwiającą produkcję cząsteczek przeciwciał w ciągłych hodowlach linii komórkowych. Przykładowo, w zakres wynalazku wchodzi technika tworzenia hybrydoma opracowana przez Kohler'a i Milstein'a (Nature 256, 495-497, 1975) oraz technika trioma, technika hybrydoma ludzkich limfocytów B (Kozbor i wsp., Immunology Today 4, 72, 1983) oraz technika hybrydoma EBV wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych (Cole i wsp., „Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”, 1985, Alan R. Liss Inc., str. 77-96) i podobne.

Takimi przeciwciałami monoklonalnymi mogą być ludzkie przeciwciała monoklonalne albo przeciwciała monoklonalne chimerowe, ludzko-mysie (lub z innego gatunku). Ludzkie przeciwciała monoklonalne można wytwarzać wieloma znanymi technikami (np. Teng i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sei. US.A. 80, 7308-7312, 1983; Kozbor i wsp., Immunology Today 4, 72, 1983; Olsson i wsp., Meth. Enzymol. 92, 3-16, 1982). Można otrzymywać chimerowe cząsteczki przeciwciał zawierające mysią domenę wiąż.ąca_t antygen z ludzkimi regionami stałymi (Morrison i wsp. Proc. Natl. Acad. Sei. US.A., 816851,1984; Takeda i wsp.. Nature 314,452).

Do wytwarzania poliklonalnych przeciwciał przeciw epitopom na opisanych Ugandach TIE-2 można użyć różne procedury znane w technice. W celu wytworzenia takiego przeciwciała można immunizować różnych gospodarzy zwierzęcych, np. króliki, myszy lub szczury, przez iniekcję ligandu TIE-2 albo jego fragmentu bądź pochodnej.

Dla wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej można stosować różne adiuwanty, zależnie od gatunku gospodarza. Do takich adiuwantów należą np. kompletny i niekompletny adiuwant Freunda, żele nieorganiczne, takie jak wodorotlenek glinu, substancje powierzchniowo aktywne, takie jak lizolecytyna, poliole serii Pluronic, polianiony, peptydy, emulsje olejowe, hemocyjaniny pijawki, dinitrofenol i potencjalnie użyteczne adiuwanty ludzkie, takie jak szczepionka BCG (pałeczka Calmette-Guerin'a) i Corynebacterium parvum.

Klon molekularny przeciwciała przeciw wybranemu epitopowi ligandu TIE-2 można przygotować stosując znane techniki. Do konstruowania sekwencji kwasu nukleinowego kodujących cząsteczkę przeciwciała monoklonalnego albo jego regionu wiążącego antygen można zastosować metodologię rekombinacji DNA opisaną np. przez Mianiatisa i wsp. (Maniatis i wsp., Molecuar Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor New York /1982/).

Przedmiotem wynalazku są cząsteczki przeciwciała oraz fragmenty tych cząsteczek przeciwciała. Fragmenty przeciwciała, które zawierają idiotyp tej cząsteczki można wytwarzać wykorzystując znane techniki. Przykładowo, do takich fragmentów nieograniczająco należą: fragment F(ab')₂, który można otrzymać przez trawienie pepsyną cząsteczki przeciwciała; fragmenty Fab', które można generować przez redukcję mostków dwusiarczkowych we

184 642 fragmencie F(ab')₂ i fragmenty Fab, które można generować przez traktowanie cząsteczki przeciwciała papainą i środkiem redukującym. Cząsteczki przeciwciał można oczyszczać znanymi technikami, np. immunoabsorpcji albo chromatografii immunopowinowactwa, metodami chromatograficznymi, takimi jak HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa) albo stosując kombinacje tych metod.

Przedmiotem wynalazku jest również metoda immunologiczna oznaczania ilości ligandu TIE-2 w próbce biologicznej polegająca na:

a) kontaktowaniu tej próbki biologicznej z co najmniej jednym przeciwciałem, które swoiście wiąże ligand TIE-2, przez co przeciwciało tworzy kompleks z ligandem TIE-2 obecnym w tej próbce i

b) pomiarze ilości powstałego kompleksu a przez to pomiarze ilości ligandu TIE-2 w próbce biologicznej.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto metoda oznaczania ilości receptora TIE-2 w próbce biologicznej polegająca na:

a) kontaktowaniu tej próbki biologicznej z co najmniej jednym ligandem według wynalazku, przez co ligand ten tworzy kompleks z receptorem TIE-2 i

b) pomiarze ilości powstałego kompleksu a przez to pomiarze ilości receptora TIE-2 w tej próbce biologicznej.

Wynalazek dotyczy również zastosowania ligandu TIE-2 do wspomagania, utrzymywania przy życiu i/lub wzrostu i/lub różnicowania się komórek, w których zachodzi ekspresja receptora ΤΓΕ-2. Ligand ten może być zatem użyty jako dodatek do wspomagania np. komórek śródbłonka w hodowli. Ponadto, wykrycie przez zgłaszających pokrewnego ligandu dla receptora TIE-2 umożliwia zastosowanie systemów analitycznych użytecznych do identyfikacji agonistów i antagonistów tego receptora TIE-2. Takie systemy analityczne mogłyby być stosowane do identyfikacji cząsteczek zdolnych do wzmagania bądź hamowania angiogenezy. Przykładowo, wjednym z rozwiązań, można identyfikować antagonistów receptora TIE-2 jako cząsteczki badane, zdolne do zaburzania interakcji receptora TIE-2 z aktywnym biologicznie ligandem TIE-2. Takich antagonistów identyfikuje się na podstawie ich zdolności do 1) blokowania wiązania biologicznie aktywnego ligandu TIE-2 z receptorem, co oznacza się wykorzystując np. technologię czujników biologicznych BIAcore (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, Nowy Jork) albo 2) blokowania zdolności biologicznie aktywnego ligandu TIE-2 do wywoływania odpowiedzi biologicznej. Do takich odpowiedzi biologicznych należą np. fosforylacja receptora TIE-2 albo komponentów niższej części szlaku przenoszenia sygnału TIE-2 albo przeżywanie, wzrost lub różnicowanie się komórek posiadających receptor TIE-2.

W jednym z rozwiązań, wzrost komórek zmienionych genetycznie tak, aby zachodziła w nich ekspresja receptora TIE-2 może być zależny od dodania ligandu TIE-2. Takie komórki dostarczają użytecznych układów analitycznych do identyfikacji dodatkowych agonistów receptora TIE-2 albo antagonistów zdolnych do zaburzania aktywności ligandu TIE-2 na tych komórkach. Alternatywnie, w skład takich układów analitycznych, do oznaczania zarówno potencjalnych agonistów jak i antagonistów wchodzą komórki autowydzielnicze, tak zmodyfikowane, że majązdolność koekspresji zarówno ligandu jak i receptora TIE-2.

Tak więc, wynalazek daje możliwość wprowadzania receptora ΤΊΕ-2 do komórek, w których normalnie nie zachodzi ekspresja tego receptora, co sprawia, że komórki te nabywają zdolności wykazywania głębokich i wyraźnie zaznaczonych odpowiedzi na ligand wiążący ten receptor. Typ wywoływanej odpowiedzi zależy od użytej komórki a nie od swoistego receptora wprowadzonego do tej komórki. Można wybrać właściwe linie komórkowe aby uzyskać odpowiedź o największej użyteczności do celów analitycznych a także do celów wykrywania cząsteczek, które mogą działać na receptory kinazy tyrozynowej. Mogą to być cząsteczki dowolnego typu, włączając w nie niewyłącznie cząsteczki peptydowe i niepeptydowe, które to cząsteczki będą działać w układach niżej opisanych w sposób specyficzny dla receptora. W jednym z bardziej użytecznych układów, który można wykorzystać, wprowadza się receptor TIE-2 do linii komórek fibroblastów (np. komórek NIH3T3), co sprawia, że taki receptor, który normalnie nie wpływa na odpowiedzi proliferacyjne może po wprowadzeniu do fibroblastów być oznaczany wieloma dobrze znanymi metodami, umożliwiając ilościowe

184 642 pomiary wpływów czynników wzrostu fibroblastów (np. wprowadzenie tymidyny lub inne typy prób proliferacji, patrz: van Zoelen, „The Use of Biological Assays For Detection Of Połypeptide Growth factors” w publikacji: Progress Factor Research, tom 2, str. 131-152, 1990; Zhan i M. Goldfarb, Mol. Cell. Biol., tom 6, str. 3541-3544, 1986). Te próby majątę dodatkową zaletę, że każdy preparat może być oznaczany zarówno na linii komórkowej posiadającej wprowadzony receptor jak i na rodzicielskiej linii komórkowej, nie zawierającej tego receptora. Tylko te swoiste efekty, które występują w linii komórkowej z receptorem mogą być uznane jako wywołane przez wprowadzony receptor. Takie komórki można dalej modyfikować technikami inżynierii genetycznej w kierunku ekspresji ligandu TEE-2, stwarzając układ autowydzielniczy użyteczny do oznaczania cząsteczek działających w tej interakcji jako antagoniści/agoniści. Tak więc, przedmiotem wynalazku są komórki gospodarza zawierające kwas nukleinowy kodujący Ugand TIE-2 i kwas nukleinowy kodujący receptor TIE-2.

Interakcja receptor TIE-2 / ligand TIE-2 stanowi również podstawę użytecznego systemu do identyfikacji małych cząsteczek agonistów i antagonistów receptora TIE-2. Przykładowo, można identyfikować fragmenty, mutanty albo pochodne ligandu TIE-2, które wiążą receptor TIE-2 ale nie wzbudzają aktywności biologicznej. Alternatywnie, scharakteryzowanie ligandu TIE-2 umożliwia oznaczenie aktywnych części tej cząsteczki. Identyfikacja ligandu umożliwia ponadto oznaczenie rentgenowskiej struktury krystalograficznej kompleksu receptor/ligand, co umożliwia identyfikację miejsca wiązania na receptorze.

Wiedza o miejscu wiązania dostarczy cennych wskazówek do racjonalnego projektowania nowych agonistów i antagonistów.

Swoiste wiązanie badanej cząsteczki z receptorem TIE-2 można oznaczać wieloma drogami. Przykładowo, rzeczywiste wiązanie badanej cząsteczki z komórkami, w których zachodzi ekspresja genu tie-2 można wykrywać lub mierzyć przez detekcję lub pomiar (i) badanej cząsteczki związanej z powierzchnią niemodyfikowanych komórek, (ii) badanej cząsteczki sieciowanej z białkiem TIE-2 w lizatach komórkowych albo (iii) badanej cząsteczki związanej z TIE-2 in vitro. Swoistą interakcję zachodzącą między badaną cząsteczką a TIE-2 można oceniać stosując reagenty uwidaczniające unikalne właściwości tej interakcji.

W specyficznym, nieograniczającym przykładzie, sposoby według wynalazku można stosować następująco: rozważmy przypadek, w którym ma być oznaczany ligand TIE-2 w próbce. Różne rozcieńczenia tej próbki (badanej cząsteczki) równolegle z kontrolą negatywną (NC) nie zawierającą aktywności ligandu TIE-2 i kontrolą pozytywną (PC) zawierającą znaną ilość ligandu TIE-2 można kontaktować z komórkami, w których zachodzi ekspresja genu tie-2 w obecności znakowanego w celu detekcji ligandu TIE-2 (w tej próbce - ligand znakowany jodem radioaktywnym). Ilość ligandu TIE-2 w badanej próbce można ocenić przez oznaczenie ilości znaczonego '²⁵J ligandu TIE-2, który wiąże się z kontrolami i z każdym z rozcieńczeń i przez następne porównanie wartości uzyskanych dla próbek z krzywą standardową. Im więcej ligandu TIE-2 w próbce, tym mniej ¹²⁵J ligandu wiążącego się z TIE-2.

Ilość związanego ¹²⁵J-ligandu można oznaczać przez pomiar ilości radioaktywności na komórkę albo przez sieciowanie ligandu TIE-2 do białek powierzchni komórki z użyciem DSS, co jest opisane przez Meakin'a i Shootefa (Neuron 6, 153-163, 1991) i oznaczenie ilości znakowanego białka w ekstraktach komórkowych stosując np. elektroforezę w żelu poliakryloamidowym SDS, w której można ujawnić znakowane białko o wielkości odpowiadającej kompleksowi ligand ΤΙΕ-2/receptor TIE-2. Swoista interakcja badanej cząsteczki z TIE-2 może być dalej śledzona przez dodanie do próbek zmiennych rozcieńczeń nieznakowanego ligandu kontrolnego, który nie wiąże receptora TIE-2, a zatem, nie powinien wywierać znaczącego wpływu na współzawodnictwo między znakowanym ligandem TIE-2 a badaną cząsteczką w wiązaniu TIE-2. Alternatywnie można oczekiwać, że cząsteczka, o której wiadomo, że ma zdolność rozrywania wiązania ligand TIE-2/TIE-2, taka jak np. przeciwciało anty-TIE2 albo ciało receptora TIE-2 opisane w niniejszym opisie będzie zaburzać współzawodnictwo między ligandem ¹²⁵J-TIE-2 a badaną cząsteczką na wiązanie z receptorem TIE-2.

Do ligandów TIE-2 znakowanych w celu wykrycia należą nie ograniczając się do nich; ligand TIE-2 związany kowalencyjnie lub niekowalencyjnie z substancją radioaktywną substancją fluorescencyjną substancją wykazującą aktywność enzymatyczną substancją która

184 642 może służyć jako substrat dla enzymu (korzystne są enzymy i substraty związane z reakcjami wykrywanymi kolorymetrycznie) albo z substancją, którą można rozpoznać za pomocą cząsteczki przeciwciała, którą korzystnie stanowi cząsteczka przeciwciała znaczona w celu jej wykrycia.

Alternatywnie, swoiste wiązanie badanej cząsteczki z TIE-2 można oznaczać przez ocenę wtórnych efektów biologicznych wiązania: ligand ΤΙΕ-2/receptor TIE-2, włączając w to nieograniczająco wzrost i/lub różnicowanie się komórek albo natychmiastową, wczesną ekspresję genu bądź fosforylację TIE-2. Przykładowo, zdolność badanej cząsteczki do indukowania różnicowania można oznaczać w komórkach, w których brak genu tie-2 i w komórkach porównawczych, w których przebiega ekspresja tego genu. Różnicowanie w komórkach, w których zachodzi ekspresja genu tie-2 ale nie w komórkach porównawczych z brakiem genu tie-2 wskazuje na swoistą interakcję badanej cząsteczki z TIE-2. Podobną analizę można przeprowadzić wykrywając natychmiastową indukcję wczesnego genu (np. fos i jun) w komórkach tie-2 minus i komórkach tie-2 plus albo poprzez wykrycie fosforylacji TIE-2 z użyciem znanych, standardowych prób na oznaczanie fosforylacji. Taka analiza może być użyteczna do identyfikowania agonistów albo antagonistów nie wiążących się kompetycyjnie z TIE-2.

Podobnie, przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji cząsteczki wykazującej aktywność biologiczną ligandu TIE-2 polegający na (i) eksponowaniu komórki, w której zachodzi ekspresja tie-2 na cząsteczkę badaną i (ii) wykryciu swoistego wiązania tej badanej cząsteczki z receptorem TIE-2, w którym to sposobie swoiste wiązanie z TIE-2 dodatnio koreluje z aktywnością TIE-2 podobną. Swoiste wiązanie można wykryć przez oznaczenie albo wiązania bezpośredniego albo wtórnych efektów biologicznych tego wiązania, o czym wspomniano powyżej. Taki sposób może być szczególnie użyteczny do identyfikowania nowych przedstawicieli rodziny ligandów TIE albo w przemyśle farmaceutycznym, do skriningu dużych serii cząsteczek peptydowych i niepeptydowych (tak zwanych peptydomimetyków) na związaną z TIE aktywność biologiczną W korzystnym, specyficznym, nieograniczającym wykonaniu wynalazku można sporządzić wielką siatkę dołków hodowlanych zawierających w naprzemiennych rzędach komórki PC 12 (albo fibroblasty, patrz poniżej) tie-2 minus albo zmienione technikami inżynierii genetycznej na tie-2 plus. W ten sposób można załadować wiele badanych cząsteczek, tak, aby każda kolumna w tej siatce albo część tej kolumny zawierała inną badaną cząsteczkę. Każdy dołek można następnie badać na występowanie lub niewystępowanie wzrostu i/lub różnicowania. W ten sposób można oznaczyć wyjątkowo dużą ilość badanych cząsteczek na taką aktywność.

W dodatkowych rozwiązaniach, przedmiotem wynalazku są sposoby detekcji lub pomiaru aktywności TIE-podobnej bądź identyfikacji cząsteczki posiadającej tę aktywność, w których to sposobach (i) eksponuje się badaną cząsteczkę na białko receptora TIE-2 in vitro w warunkach umożliwiających wiązanie i (ii) wykrywa się wiązanie tej badanej cząsteczki z białkiem TIE-2, przy czym wiązanie badanej cząsteczki z TIE-2 koreluje z aktywnością TIE-podobną. W powyższych sposobach TIE-2 może albo nie musi być zasadniczo oczyszczone, może być przytwierdzone do stałego podłoża (np. w formie kolumny powinowactwa albo próby ELISA) albo może być wprowadzone do sztucznej błony. Wiązanie badanej cząsteczki do TIE-2 można oceniać dowolną znaną metodą. W korzystnych rozwiązaniach, wiązanie badanej cząsteczki można wykrywać lub mierzyć przez ocenę jej zdolności do współzawodnictwa pod względem wiązania receptora TIE-2 ze znakowanymi w celach detekcji, znanymi Ugandami TIE-2.

Wynalazek dotyczy również sposobu wykrywania zdolności badanej cząsteczki do działania jako antagonista aktywności TIE-podobnej, który to sposób polega na wykryciu zdolności tej cząsteczki do hamowania wpływu wiązania ligandu TIE-2 z TIE-2 na komórkę, w której zachodzi ekspresja tie-2. Taki antagonista może ale nie musi zaburzać wiązania ligandu TIE-2 z receptorem TIE-2. Efektami wiązania ligandu TIE-2 z receptorem TIE-2 są korzystnie efekty biologiczne lub biochemiczne, włącznie z przeżywaniem lub proliferacją komórki, transformacją komórki, natychmiastową indukcją wczesnego genu lub fosforylacją TIE-2.

Następnie, przedmiotem wynalazku jest zarówno sposób identyfikacji przeciwciał lub innych cząsteczek zdolnych do neutralizacji ligandu lub blokowania wiązania z receptorem

184 642 jak i cząsteczki zidentyfikowane tym sposobem. W nieograniczającym przykładzie wykonania, można ten proces prowadzić jako próbę biologiczną, koncepcyjnie podobną do próby ELISA. Przykładowo, można związać ciało receptora TIE ze stałym podłożem, takim jak plastikowa płytka wielodołkowa. Jako kontrolę, do dołka można wprowadzić znaną ilość ligandu TIE znaczonego Myc i następnie identyfikować każdy znaczony ligand TIE, który wiąże ciało receptora za pomocą przeciwciała raportującego skierowanego przeciw znacznikowi Myc. Ten system oznaczania może być dalej użyty do skriningu próbek badanych na obecność cząsteczek, które wykazują zdolność: i) wiązania ze znakowanym ligandem albo ii) wiązania z ciałem receptora i przez to blokowania przez ten znakowany ligand wiązania z tym ciałem receptora. Przykładowo, do dołka można wprowadzić badaną próbkę zawierającą przypuszczalną cząsteczkę razem ze znaną ilością znaczonego ligandu i oznaczać ilość znakowanego ligandu wiążącą się z ciałem receptora. Przez porównanie ilości związanego znakowanego ligandu w badanej próbce z ilością w próbce kontrolnej można zidentyfikować próbki zawierające cząsteczki o zdolności blokowania wiązania ligandu z receptorem. Tak zidentyfikowane pożądane cząsteczki można izolować wykorzystując znane sposoby.

Po wykryciu blokera wiązania ligandu, specjalista powinien potrafić przeprowadzić następne próby w celu określenia, czy bloker ten wiąże się z receptorem czy z ligandem a także próby wyjaśniające, czy cząsteczka blokera może neutralizować aktywność biologiczną tego ligandu. Przykładowo, przez wykonanie próby wiązania wykorzystującej technologię czujników biologicznych BIAcore (lub równoważnej), w której albo ciało receptora TIE albo ligand TIE jest kowalencyjnie związany ze stałym podłożem (np. Z karboksymetylodekstranem na powierzchni złota), specjalista będzie mógł oznaczyć, czy cząsteczka blokera wiąże się swoiście z ligandem czy z ciałem receptora. W celu określenia, czy cząsteczka blokera może neutralizować aktywność biologiczną ligandu, specjalista powinien przeprowadzić próbę fosforylacji (przykład V) albo alternatywnie, biologiczną próbę funkcyjną, takąjak próba przeżycia, stosując hodowle pierwszorzędowe, np. hodowlę komórek śródbłonka. Alternatywnie, cząsteczka blokera wiążąca się z ciałem receptora może być agonistą i specjalista powinien wiedzieć, jak to oznaczyć, prowadząc odpowiednią próbę identyfikacji dodatkowych agonistów receptora TIE-2.

Ponieważ receptor TIE-2 został zidentyfikowany w związku z komórkami śródbłonka i jak wykazano w opisie, blokowanie tego ligandu wydaje się zapobiegać unaczynieniu, zgłaszający wykazali, że ligand TIE-2 będzie użyteczny do pobudzania unaczynienia w chorobach lub w zaburzeniach, gdzie to unaczynienie jest wskazane. Do takich chorób i zaburzeń można zaliczyć gojenie się ran, niedotlenienie i cukrzycę. Z drugiej strony, antagoniści receptora TIE-2, tacy jak ciała receptora opisane w przykładach II i III oraz TIE-2 ligand 2 opisany w przykładzie IX mogąbyć użyteczni do zapobiegania lub łagodzenia unaczyniania, zapobiegając lub hamując przez to przykładowo wzrost nowotworu.

Komórki zawierające receptor TIE-2 wydają się być regulowane w kierunku wzmożonego unaczynienia, a więc, ciała ligandu TIE-2 mogą być również przydatne do zapobiegania lub hamowania np. wzrostu nowotworu. Ciała ligandu TIE-2 mogą służyć do dostarczania toksyn do komórek zawierających receptor. Alternatywnie, posiłkując się ciałami ligandu TIE-2, do komórek zawierających receptor TIE-2 można dostarczać inne cząsteczki, takie jak czynniki wzrostu, cytokiny albo substancje odżywcze. Ciała ligandu TIE-2 można również stosować jako odczynnik diagnostyczny dla receptora TIE-2, do celów wykrywania tego receptora in vivo albo in vitro. Tam, gdzie receptor TIE-2 jest związany ze stanem chorobowym, ciała ligandu TIE-2 mogą być użyteczne jako odczynniki diagnostyczne do wykrywania choroby, drogą np. barwienia tkanki albo obrazowania całego ciała.

Przedmiotem wynalazku są również kompozycje farmaceutyczne zawierające ligandy TIE-2 albo opisane ciała ligandów, ich fragmenty peptydowe lub pochodne w nośniku dopuszczalnym farmakologicznie. Te białka ligandu TIE-2, fragmenty peptydowe lub pochodne można podawać wewnętrznie lub miejscowo. Można zastosować dowolną odpowiednią drogę podawania, w tym np. dożylną dooponową dotętniczą donosową doustną podskórną dootrzewnową lub dowolną miejscową iniekcję lub implant chirurgiczny. Przedmiotem wynalazku są również formy o przedłużonym uwalnianiu.

184 642

Przedmiotem wynalazku jest następnie wyizolowana i oczyszczona cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ludzki ligand TIE-2, przy czym ta cząsteczka kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy składającej się z:

(a) sekwencji kwasu nukleinowego zawierającej region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4, fig. 5 albo fig. 6, (b) sekwencji kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2 albo (c) sekwencji kwasu nukleinowego, która została zdegenerowana jako wynik kodu genetycznego do sekwencji (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4, fig. 5 albo fig. 6 (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2 albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2.

Przedmiotem wynalazkujest następnie wyizolowany i oczyszczony ludzki ligand TIE-2 kodowany przez wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest też wektor, który zawiera wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ludzki ligand TIE-2. W jednym z rozwiązań, wektorem tym jest pBluescript KS kodujący ludzki TIE-2 ligand 2.

Przedmiotem wynalazku jest następnie wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę DNA kodującą ludzki ligand TIE-2, która to cząsteczka DNA jest operacyjnie związana z sekwencją kontroli ekspresji. Wynalazek dostarcza również układ: gospodarz/wektor do produkcji polipeptydu posiadającego aktywność biologiczną ludzkiego ligandu TIE-2, który to układ składa się z wektora ekspresyjnego według wynalazku w odpowiedniej komórce gospodarza. W jednym z rozwiązań, odpowiednią komórką gospodarza może być komórka bakteryjna, drożdżowa, owadzia albo ssacza. Wynalazek rozwiązuje również sposób wytwarzania polipeptydu posiadającego aktywność biologicznie aktywnego ligandu TIE-2, w którym to sposobie prowadzi się wzrost komórek układu: gospodarz/wektor według wynalazku w warunkach zapewniających wytwarzanie tego polipeptydu i odzyskuje się wytworzony polipeptyd.

Opisany tu wynalazek dotyczący izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej ligand TIE-2 obejmuje również opracowanie postaci tego ligandu, jego fragmentu lub pochodnej bądź innej cząsteczki będącej agonistą albo antagonistą receptora jako środka terapeutycznego, nadającej się do leczenia pacjentów cierpiących na schorzenia angażujące komórki, tkanki albo narządy, w których przebiega ekspresja receptora TIE. Nieograniczającym przykładem rozwiązania według wynalazku jest ciało ligandu, które swoiście wiąże się z receptorem TIE-2 albo z TIE-2. W rozwiązaniu alternatywnym, przedmiotem wynalazku jest ciało ligandu zawierające ligand TIE-2 związany przez fuzję ze stałym regionem immunoglobuliny. W jednym z rozwiązań, to ciało ligandu zawiera TIE-2 ligand 1 albo TIE-2 ligand 2 i część Fc ludzkiej IgGl. Takie ciało ligandu można użyć w sposobie leczenia człowieka lub zwierzęcia albo w metodzie diagnozy.

Przedmiotem wynalazku jest poza tym przeciwciało, które swoiście wiąże się z taką cząsteczką leczniczą. Przeciwciało to może być monoklonalne lub poliklonalne. Sposób użycia takiego monoklonalnego lub poliklonalnego przeciwciała do oznaczania ilości tej cząsteczki leczniczej w próbce pobranej od pacjenta do celów monitorowania przebiegu leczenia jest następnym przedmiotem wynalazku.

184 642

Przedmiotem wynalazku jest następnie kompozycja terapeutyczna zawierająca ludzki ligand TIE-2 albo ciało ligandu i skoniugowany z nim środek cytotoksyczny. W jednym z rozwiązań środkiem cytotoksycznym może być radioizotop albo toksyna.

Następnym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało swoiście wiążące się z ludzkim ligandem TIE-2. To przeciwciało może być monoklonalne lub poliklonalne.

Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania ludzkiego ligandu TIE-2 polegający na:

a) sprzężeniu co najmniej jednego substratu wiążącego TIE-2 ze stałą matrycą,

b) inkubowaniu substratu a) z lizatem komórkowym, w wyniku czego substrat ten tworzy kompleks z każdym ludzkim ligandem TIE-2 w tym lizacie komórkowym,

c) przemyciu tej stałej matrycy i

d) eluowaniu ludzkiego ligandu TIE-2 ze sprzężenia z substratem. Substratem może być dowolna substancja, która swoiście wiąże ludzki ligand TIE-2. W jednym z rozwiązań, substrat jest wybrany z grupy składającej się z przeciwciała przeciw ligandowi TIE-2, receptora ΊΊΕ-2 i ciała receptora TIE-2. Przedmiotem wynalazku jest następnie ciało receptora, które swoiście wiąże się z ludzkim ligandem TIE-2, kompozycja terapeutyczna zawierająca to ciało receptora w nośniku dopuszczalnym farmaceutycznie oraz sposób blokowania rozrostu naczyń krwionośnych u człowieka polegający na podaniu skutecznej ilości tej kompozycji terapeutycznej.

Przedmiotem wynalazku jest następnie kompozycja terapeutyczna zawierająca ludzki ligand TIE-2 albo ciało ligandu w nośniku dopuszczalnym farmaceutycznie oraz sposób wzmagania unaczyniania u pacjenta polegający na podaniu temu pacjentowi skutecznej ilości tej kompozycji terapeutycznej.

Ponadto, następnym przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikowania komórki, w której przebiega ekspresja receptora TIE-2, polegający na kontaktowaniu tej komórki ze znakowanym w celu detekcji ligandem TIE-2 albo z ciałem ligandu w warunkach pozwalających na wiązanie tego znakowanego w celach detekcji ligandu z receptorem TIE-2 i oznaczeniu, czy ten znakowany w celach detekcji ligand jest związany z receptorem TIE-2 i przez to na zidentyfikowaniu komórki jako tej, w której zachodzi ekspresja receptora TIE-2.

Następnym przedmiotem wynalazkujest kompozycja terapeutyczna zawierająca ligand TIE-2 albo ciało ligandu i skoniugowany z nim środek cytotoksyczny. Takim środkiem cytotoksycznym może być radioizotop albo toksyna.

Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania ekspresji ligandu TIE-2 w komórce, w którym to sposobie z komórki uzyskuje się mRNA, kontaktuje się otrzymany mRNA ze znakowaną cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą ligand TIE-2 w warunkach hybrydyzacji, oznacza się obecność mRNA hybrydyzującego ze znakowaną cząsteczką i przez to wykrywa się ekspresję ligandu TIE-2 w komórce.

Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania ekspresji ligandu TIE-2 w skrawkach tkanki, w którym to sposobie kontaktuje się te skrawki tkanki ze znakowaną cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą ligand TIE-2 w warunkach hybrydyzacji, oznacza się obecność mRNA hybrydyzującego ze znakowaną cząsteczką i przez to wykrywa się ekspresję ligandu TIE-2 w skrawkach tkanki.

Przykład I. Identyfikacja linii komórkowej AB AE jako komórek reporterowych dla receptora TIE-2.

Dorosłe komórki BAE są zarejestrowane w Europejskim Muzeum Hodowli Komórkowych (European Cell Culture Repository) pod numerem ECACC#92010601 (PNAS 75, 2621, 1978). Analizy typu Northern (RNA) ujawniły średnie poziomy transkryptów tie-2 w linii komórkowej ABAE (Adult Bovine Arterial Endothelial; dorosłych bydlęcych komórek śródbłonka tętnic), co było zgodne z wynikami prób hybrydyzacji in situ, które wykazały prawie wyłączne usytuowanie tie-2 RNA w komórkach śródbłonka naczyń. Analizowano zatem lizaty komórek ABAE na obecność białka TIE-2 i na stopień fosforylacji reszty tyrozynowej w białku TIE-2 w warunkach normalnych w porównaniu do warunków wzrostu bez surowicy. Lizaty komórek ABAE zbierano i poddawano próbom immunoprecypitacji i następnie analizom metodą blottingu Westema strąconych w próbach immunologicznych białek z antysurowicami

184 642

TIE-2 swoistymi i fosfotyrozyno-swoistymi. Pominięcie albo włączenie peptydów TIE-2 jako swoistych cząsteczek blokujących podczas immunoprecypitacji TIE-2 pozwoliło na jednoznaczną identyfikację TIE-2 jako umiarkowanie wykrywalnego białka o masie cząsteczkowej około 150 kD, którego poziomy fosfotyrozyny w stanie ustalonym spadały do poziomów prawie niewykrywalnych po utrzymywaniu komórek w warunkach braku, surowicy.

Hodowlę komórek ABAE i odzysk lizatów komórkowych prowadzono następująco: komórki ABAE o małej ilości pasaży posiewano na płytki jako monowarstwę, z gęstością 2 χ 10⁶komórek na plastikową płytkę petriego o średnicy 150 mm (Falcon) i prowadzono hodowlę w pożywce Eagle modyfikowanej Dulbecco (DMEM) zawierającej 10% surowicy cielęcej (10% BCS), 2 mM L-glutaminy (Q) i po 1% penicyliny i streptomycyny (P-S), w atmosferze o zawartości 5% CO₂. Przed zebraniem lizatów komórkowych, komórki utrzymywano bez surowicy w czasie 24 godzin w pożywce DMEM/Q/P-S, następnie zasysano pożywkę i płytki przemywano oziębionym lodem roztworem fizjologicznym buforowanym fosforanem (PBS) wzbogaconym ortowanadanem sodu, fluorkiem sodu i solą sodową benzamidyny. Lizę komórek prowadzono w małej ilości tego samego buforu do przemywania z dodatkiem 1% NP40 jako detergentu i inhibitorów proteazy: PMSF i aprotyniny. Nierozpuszczalne debris usuwano z lizatów komórkowych przez odwirowanie przy 14.000 x G w czasie 10 minut, w temperaturze 4°C. Supematanty poddawano immunoprecypitacji z antysurowicami swoistymi dla receptora TIE-2, w obecności lub w nieobecności peptydów blokujących dodanych w ilości do około 20 pg/ml lizatu. Strącone w procesie immunoprecypitacji białka rozpuszczano w PAGE (7,5% żel Laemmli'ego) i następnie umieszczano metodą elektroprzeniesienia na membranie PVDF i inkubowano z różnymi TIE-2 albo z antysurowicami swoistymi przeciw fosfotyrozynie. Białko TIE-2 wizualizowano przez inkubację membrany ze związanymi z HRP wtórnymi antysurowicami i następne działanie odczynnikiem ECL (Amersham).

Przykład II. Klonowanie i ekspresja ciała receptora TIE-2 do opartych na powinowactwie badań interakcji ligandu TIE-2.

Przygotowano konstrukcję ekspresyjną, która powinna dawać wydzielane białko składające się z całkowitej pozakomórkowej części receptora TIE-2 szczura połączonej przez fuzję ze stałym regionem ludzkiej immunoglobuliny gamma-1 (IgGl Fc). To białko fuzyjne nazwano „ciałem receptora” (RB) TIE-2. W zasadzie, opierając się na tworzeniu się wiązań dwusiarczkowych pomiędzy poszczególnymi ogonami IgGl Fc, można byłoby oczekiwać, że występuje ono w roztworze w postaci dimeru. Część Fc tego TIE-2 RB sporządzono następująco. Fragment DNA kodujący część Fc ludzkiej IgGl rozciągający się od regionu zawiasowego do końca karboksylowego tego białka amplifikowano z ludzkiego cDNA łożyska w reakcji PCR wykorzystując oligonukleotydy odpowiadające opublikowanej sekwencji ludzkiej IgGl. Otrzymany fragment DNA sklonowano w wektorze plazmidowym. Odpowiednie fragmenty restrykcyjne DNA z plazmidu kodującego receptor TIE-2 o pełnej długości i z plazmidu zawierającego ludzkie IgGl Fc ligowano z każdą stroną krótkiego fragmentu pochodzącego z reakcji PCR, skonstruowanego tak, aby sprzęgał w zgodnej fazie sekwencje kodujące białka TIE-2 i ludzkiej IgGl Fc. Tak więc, otrzymane białko fuzyjne TIE-2ektodomena Fc dokładnie zastępowało IgGl Fc w miejscu regionu obejmującego domeny TIE-2 transbłonową i cytoplazmatyczną. Alternatywny sposób otrzymywania RB jest opisany przez Goodwin'a i wsp. (Celi 73, 447-456, 1993).

Miligramowe ilości TIE-2 RB otrzymano przez klonowanie fragmentu DNA TIE-2 RB do wektora pVL1393 baculowirusa i następne zakażenie owadziej linii komórkowej Spodoptera frugiperda SF-21AE. Alternatywnie można użyć linię komórkową SF-9 (ATCC nr CRL1711) albo linię komórkową BTI-TN-5bl-4. DNA kodujący TIE-2 RB klonowano jako fragment EcoRI-Notl do transferowego plazmidu baculowirusa, pVL1393. Plazmidowy DNA oczyszczony przez wirowanie w gradiencie chlorku cezu wprowadzono do wirusowego DNA przez zmieszanie 3 pg plazmidowego DNA z 0,5 pg Baculo-Gold DNA (Pharminigen) i następne wprowadzenie do liposomów z użyciem 30 pg produktu o nazwie handlowej Lipofectin (GIBCO-BRL). Mieszaniny DNA-liposomy dodano do komórek SF-21 AE (2 χ 10⁶ komórek na płytkę o średnicy 60 mm) w pożywce TMN-FH (modyfikowana pożywka do komórek owadzich Grace'a; GIBCO-BRL) i utrzymywano przez 5 godzin w temperaturze 27°C, po

184 642 czym prowadzono inkubację w temperaturze 27°C przez 5 dni w pożywce TMN-FH wzbogaconej dodatkiem 5% płodowej surowicy cielęcej. Medium hodowli tkankowej zebrano do oczyszczania rekombinantowych wirusów metodą łysinek, wykorzystując metody opisane uprzednio (O'Reilly D.R., L.K. Miller i V.A. Luckov, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual, 1992, Nowy Jork, W.H. Freeman) z tym, że wierzchnia warstwa agarozy zawierała 125 pg/ml odczynnika X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-P-D-galaktopiranozyd; GIBCO-BRL). Po 5 dniach inkubacji w temperaturze 27°C zebrano nierekombinowane łysinki w dodatniej reakcji barwnej z substratem X-gal i oznaczono ich pozycje. Rekombinantowe łysinki wizualizowano przez dodanie drugiej wierzchniej warstwy zawierającej 100 pg/ml MTT [bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy; Sigma). Łysinki przypuszczalnych wirusów rekombinowanych zbierano przez zassanie tłoczkiem i oczyszczano prowadząc wiele cykli izolacji łysinek dla zapewnienia homogenności. Zapasy wirusa wytwarzano przez seryjne pasażowanie z niską krotnością wirusów oczyszczonych metodą łysinek. Wytworzono pasażowane z niską krotnością zapasy jednego klonu wirusowego (vTIE-2 ciało receptora).

Prowadzono hodowlę komórek SF-21AE w pożywce bez surowicy (SF-900 II, GIBCOBRL) z dodatkiem roztworu 1 x antybiotyk/środek p-grzybiczy (GIBCO-BRL) i 25 mg/litr gentamycyny (GIBCO-BRL). Jako środek powierzchniowo czynny dodano Pluronic-F-68 do końcowego stężenia 1 g/litr. Przed zakażeniem, hodowle (4 litry) wzrastały w bioreaktorze (Artisan Cell Station System) przez co najmniej 3 dni. Komórki rosły w temperaturze 27°C w atmosferze gazu zawierającego 50% rozpuszczonego tlenu, przepuszczanego z szybkością 80 ml/minutę (napowietrzanie przez pierścień rozpryskujący). Mieszano mieszadłem kotwicowym z szybkością 100 obrotów/minutę. Komórki zbierano w średniologarytmicznej fazie wzrostu (około 2 x łO⁶ komórek/ml), zatężano przez wirowanie i zakażano 5 jednostkami tworzącymi łysinki vTIE-2 ciała receptora na jedną komórkę. Komórki i inokulum rozcieńczano do 400 ml świeżą pożywką i absorbowano wirusa przez 2 godziny w temperaturze 27°C w kolbie obrotowej. Następnie hodowlę powtórnie zawieszano w świeżej pożywce bez surowicy do końcowej objętości 8 litrów i inkubowano komórki w bioreaktorze w warunkach podanych powyżej.

Medium po hodowli komórek SF21AE zakażonych vTIE-2 -ciało receptora zebrano w czasie 72 godzin od zakażenia przez wirowanie (500 x g przez 10 minut). W supematantach doprowadzono wartość pH do 8 za pomocą NaOH, dodano EDTA do końcowego stężenia 10 mM i powtórnie ustawiono pH supernatantu na wartość 8. Supernatanty przefiltrowano przez filtr o średnicy porów 0,45 pm (Millipore) i wprowadzono na kolumnę z białkiem A (kolumna białko A sepharose 4 z szybkim przepływem albo HiTrap - białko A, obydwie z firmy Pharmacia). Kolumnę przemywano PBS zawierającym 0,5 M NaCl do czasu spadku absorbancji przy 280 nm do wartości wyjściowej. Następnie kolumnę przemyto w PBS i eluowano 0,5 M roztworem kwasu octowego. Frakcje wypływające z kolumny natychmiast zobojętniano przez eluowanie do probówek zawierających 1 M Tris (pH=9). Frakcje pików zawierające Tie-2 RB zebrano i dializowano względem PBS.

Przykład ΠΙ. Wykazanie, że TIE-2 odgrywa kluczową rolę w rozwoju układu naczyniowego.

Biorąc pod uwagę nieobecność znanego ligandu dla receptora TIE-2, uznano, że istnieje możliwość zbadania funkcji TIE-2 przez wprowadzenie „nadmiaru” rozpuszczalnego ciała receptora TIE-2 (TIE-2 RB) do rozwijającego się układu. Potencjalna zdolność TIE-2 RB do wiązania a przez to do neutralizacji dostępnego ligandu TIE-2 mogłaby powodować rozpoznawalne przerwanie normalnego rozwoju układu naczyniowego i umożliwić charakteryzację ligandu. W celu sprawdzenia, czy TIE-2 RB może być użyte do przerwania rozwoju układu naczyniowego we wczesnych embrionach kurzych, nasączano małe skrawki resorbowalnej biologicznie pianki w TIE-2 RB i natychmiast umieszczano pod błoną kosmówkowoomoczniową w pozycjach bezpośrednio bocznych w stosunku do pierwotnego embrionu.

Wczesne zarodki kurze rozwijały się na żółtku z małego krążka komórek pokrytego błoną kosmówkowo-omoczniową (CAM). Komórki śródbłonka, które będą tworzyć układ naczyniowy w embrionie wyrastają ze źródeł komórek poza- i wewnątrzzarodkowych. Ko44

184 642 morki śródbłonka pochodzenia pozazarodkowego, stanowiące główne źródło komórek śródbłonka w zarodku pochodzą z przyrostów mezenchymy usytuowanych bocznie wokół zarodka właściwego, tuż pod CAM. Dojrzewające komórki mezenchymalne stanowią wspólną podstawę dla potomnych linii komórek śródbłonkowych oraz hematopoetycznych, zwanych hemangioblastami. Z hemangioblastów powstaje z kolei mieszana populacja angioblastów (komórek macierzystych dla komórek śródbłonka) i hematoblastów (prekursorów wielokierunkowo różnicujących się komórek hematopoetycznych). Tworzenie się zaczątków układu naczyniowego rozpoczyna się wówczas, gdy potomne komórki śródbłonka rozdzielają się tworząc naczynie o grubości jednej komórki, otaczające krwinki pierwotne. Proliferacja i migracja tych komponentów komórkowych daje w końcu rozległą siatkę napełnionych krwią mikronaczyń pod powłoczką CAM, która ostatecznie wchodzi do embrionu łącząc się z ograniczonymi elementami naczyniowymi pochodzenia wewnątrzembrionalnego.

Nowo zapłodnione jaja kurze otrzymane z firmy Spafas Inc. (Boston, MA) inkubowano w temperaturze 99,5°F przy wilgotności względnej 55%. W około 24 godzinie rozwoju skorupkę jaja przecierano 70% etanolem i borem dentystycznym wywiercano otwór o średnicy 1,5 cm na bardziej płaskim stożku każdego jaja. Usuwano błonę skorupki uwidaczniając przestrzeń powietrzną bezpośrednio nad embrionem. Małe, prostokątne kawałki sterylnej pianki o nazwie Gelfoam (Upjohn) wycinano skalpelem i nasączano równymi stężeniami albo ciała receptora TIE-2 albo ciała receptora EHK-1. Ciało receptora EEIK-1 wytworzono takjak w przykładzie Π, stosując domenę pozakomórkową EHK-1 zamiast domeny pozakomórkowej TIE-2 (Maisonpierre i wsp., Oncogene 8, 3277-3288, 1993). Każdy kawałek pianki Gelfoam absorbował około 6 pg białka w 30 pm. Do wykonania małego otworku w błonie CAM w pozycji kilka milimetrów w bok od zarodka pierwotnego, użyto sterylne szczypczyki zegarmistrzowskie. Większą część kawałka nasączonej RB pianki Gelfoam umieszczono pod błoną CAM i szczelnie zakryto skorupkę jaja kawałkiem taśmy klejącej. Inne jaja w podobnej fazie rozwoju równolegle traktowano ciałem receptora z niespokrewnionej, wytwarzanej w neuronach kinazy tyrozynowej, EHK-1 (Maisonpierre i wsp., Oncogene 8, 3277-3288, 1993). Prowadzono rozwój przez 4 dni po czym badano embriony wizualnie. Wyjmowano je przez ostrożne rozbicie skorupek na płytkach z ogrzanym PBS i delikatne wycięcie embrionów wraz z otaczającą błoną CAM. Z 12 jaj traktowanych każdym z RB, ponad stan obserwowany na początku doświadczenia rozwinęło się 6 jaj traktowanych TIE-2 RB i 5 jaj traktowanych EHK-1 RB. Zaobserwowano ogromną różnicę między rozwijającymi się embrionami, co jest przedstawione na fig. IA i IB. Embriony traiktowane przez EHK-1 RB rozwijały się względnie normalnie. Cztery spośród 5 embrionów EHK-1 było żywe, co oceniano przez bicie serca. Ponadto, pozaembrionałny układ naczyniowy, widoczny gołym okiem dzięki obecności czerwonych krwinek był obfity i rozciągał się kilka centymetrów w bok pod błoną CAM. Odwrotnie, embriony traktowane przez TIE-2 RB były poważnie zahamowane w rozwoju, miały średnicę od 2 do 5 mm, w porównaniu z ponad 10 mm średnicą embrionów traktowanych EHK-1 RB. Wszystkie embriony traktowane przez TIE-2 RB były martwe a ich błony CAM były pozbawione naczyń krwionośnych. Zdolność TIE-2 RB do blokowania rozwoju układu naczyniowego u kurcząt dowodzi, że ligand TIE-2 jest potrzebny do rozwoju układu naczyniowego.

Przykład IV. Identyfikacja aktywności swoistego wiązania TIE-2 w kondycjonowanym medium z hodowli transformowanej onkogenem ras linii mioblastów mysich C2C12.

Skrining 10-krotnie zatężonych, kondycjonowanych komórkami mediów (10 x CCM) z różnych linii komórkowych na obecność w roztworze aktywności wiązania TIE-2 swoistego (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) ujawnił aktywność wiązania w mediach po hodowli bez surowicy onkogennych, transformowanych ras komórek C2C12 (C2C12-ras), komórek RAT 2-ras (linia komórek fibroblastowych transformowana ras), linii ludzkich komórek glejaka T98G i linii ludzkich komórek nerwiaka niedojrzałego, znanej jako SHEP-1.

C2C12-ras 10 x CCM pochodziła z trwale transfekowanej linii mioblastów C2C12, która została transformowana onkogennie przez transfekcję mutantem T-24 H-ras standardową techniką opartą na użyciu fosforanu wapnia. W celu umożliwienia selekcji transfekowanych klonów wiązano fizycznie oparty na SV40 plazmid ekspresyjny z genem oporności na neo184 642 mycynę z plazmidem ekspresyjnym ras. Otrzymane G-418-opome komórki ras-C2C12 rutynowo utrzymywano jako monowarstwę na płytkach plastikowych na pożywce: DMEM/glutamina/penicylina-streptomycyna z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS). Wolne od surowicy C2C12-ras 10 x CCM otrzymano przez posianie tych komórek z 60% zlania w określonej powyżej pożywce bez surowicy i ich hodowlę przez 12 godzin (Zhan i Goldfarb, Mol. Cell. Biol. 6, 3541-3544, 1986; Zhan i wsp., Oncogene 1, 369-376, 1987). Pożywkę odrzucono, zastąpiono ją świeżą DMEM/Q/P-S i utrzymywano przez 24 godziny. Zebrano medium hodowlane a komórki umieszczono w świeżej pożywce DMEM/Q/P-S, którą również zebrano po 24 godzinach. Te CCM uzupełniano inhibitorami proteazy, PMSF (1 mM) i aprotyniną(10 μg/ml) i zatężano 10-krotnie na sterylnych membranach o określonej wielkości porów (Amicon). Aktywność wiązania TIE-2 można było zneutralizować przed analizą w aparaturze BIAcore przez inkubację medium z nadmiarem TIE-2 RB ale nie przez inkubację z EHK-1 RB.

Aktywność wiązania w mediach 10 x CCM oznaczano stosując technologię czujników biologicznych (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), w której monitorowano interakcje biomolekulame w rzeczywistym czasie na drodze powierzchniowego resonansu plazmonowego. Oczyszczone TIE-2 RB sprzęgano kowalencyjnie poprzez pierwszorzędowe aminy z warstwą karboksymetylodekstranu w pastylce czujnika aparatu laboratoryjnego CM5 (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Powierzchnię pastylki czujnika aktywowano stosując mieszaninę N-hydroksysukcynimidu (NHS) i N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC), następnie immobilizowano TIE-2 RB (25 pg/ml, pH 4,5) i dezaktywowano miejsca nieprzereagowane 1,0 M roztworem etanoloaminy (pH 8,5). W podobny sposób przygotowano powierzchnię kontroli negatywnej z ciałem receptora EHK-1.

Buforem roboczym stosowanym w tym systemie był bufor HBS (10 mM Hepes, 3,4 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,005% surfaktantu P20 (pH 7,4). Próbki 10 x CCM wirowano przez 15 minut w temperaturze 4°C i następnie klarowano na sterylnym filtrze o niskim wiązaniu białka, o średnicy porów 0,45 pm (Millipore; Bedford, MA). Do każdej próbki CCM dodano dekstran (2 mg/ml) i surfaktant P20 (0,005%). Próbki po 40 pl wstrzykiwano przez immobilizowaną powierzchnię (TIE-2 albo EHK-1) z szybkością przepływu 5 pl/minutę i monitorowano wiązanie receptora przez 8 minut. Aktywność wiązania (w jednostkach rezonansowych, RU) mierzono jako różnicę między wartością wyjściową oznaczoną na 30 sekund przed iniekcją próbki a pomiarem wykonanym w 30 sekundzie po iniekcji. Powierzchnię regenerowano jednym wstrzyknięciem 12 pl 3 M MgCl₂.

Poziom zakłóceń aparatu wynosi 20 RU, a zatem, każda aktywność wiązania o sygnale wyższym od 20 RU może być uznana jako rzeczywista interakcja z receptorem. Dla kondycjonowanych C2C12-ras mediów, aktywności wiązania wynosiły od 60 do 90 RU dla powierzchni immobilizowanej TIE-2 RB. Dla tych samych próbek analizowanych na powierzchni immobilizowanej przez EHK-1 RB, aktywności te były niższe od 35 RU. Swoiste wiązanie z ciałem receptora TIE-2 oznaczano przez inkubację próbek z nadmiarem rozpuszczalnego TIE-2 RB albo EHK-1 RB przed pomiarem aktywności wiązania. Dodanie rozpuszczalnego EHK-1 RB nie miało wpływu na aktywność wiązania TIE-2 w żadnej z próbek, podczas gdy w obecności rozpuszczalnego TIE-2 związanego z powierzchnią było o dwie trzecie mniejsze od mierzonego w nieobecności TIE-2. Analiza powtórzona z użyciem ponad 50 x stężonego C2C12-ras CCM wykazała 4-krotne wzmocnienie ponad tło sygnału swoistego wiązania TIE-2.

Przykład V. C2C12-ras CCM wykazuje aktywność indukującą fosforylację tyrozyny w receptorze TIE-2.

C2Cl2-ras 10 x CCM badano na zdolność indukowania fosforylacji tyrozyny w TIE-2 w komórkach ABAE. Hodowane bez surowicy komórki ABAE krótko inkubowano z C2C12ras CCM, przeprowadzono ich lizę i poddano immunoprecypitacji i analizie Westema, co opisano powyżej. Stymulację hodowanych bez surowicy komórek ABAE przez wolne od surowicy medium C2C12-ras 10 x CCM prowadzono następująco:

Pożywkę komórek ABAE głodzonych jak opisano powyżej usuwano i zastępowano albo określoną pożywką albo 10 x CCM, uprzednio ogrzanymi do temperatury 37°C. Po 10

184 642 minutach, pożywki usuwano a komórki dwa razy przemywano na lodzie nadmiarem oziębionego PBS wzbogaconego ortowanadanem, NaF i benzamidyną. Lizę komórek i immunoprecypitację ΤΙΕ-2-swoistąprzeprowadzono w sposób opisany powyżej.

Komórki ABAE inkubowane przez 10 minut w określonej pożywce nie wykazywały wzbudzenia fosforylacji TIE-2 tyrozyny, podczas gdy inkubacja z C2C12-ras CCM powodowała co najmniej 100-krotny wzrost fosforylacji TIE-2. Ta aktywność była prawie całkowicie znoszona przez preinkubację C2C12-ras 10 x CCM przez 90 minut w temperaturze pokojowej z 13 pg TIE-2 RB sprzęgniętymi z białkiem G na perełkach sefarozy (białko G-sefaroza). Medium inkubowane z samą białko G-sefarozą nie zostało pozbawione aktywności fosforylacji.

Przykład VI. Klonowanie ekspresyjne ligandu TIE-2

Komórki COS-7 hodowano w pożywce Eagle modyfikowanej Dulbecco (DMEM) zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej (FBS), po 1% penicyliny i streptomycyny (P/S) i 2 mM glutaminy, w atmosferze o zawartości 5% CO₂. Linię mioblastów mysich Eagle'a C2C12-ras hodowano w minimalnej pożywce podstawowej (EMEM) z dodatkiem 10% FBS, (P/S) i 2 mM glutaminy. Klony cDNA dla mysiego ligandu TIE-2 o pełnej długości otrzymano przez skrining biblioteki C2C12-ras cDNA w wektorze pJFE14, którego ekspresja zachodzi w komórkach COS. Ten wektor jest przedstawiony na fig. 2. Jest to modyfikowana wersja wektora pSRa (Takebe i wsp., Mol. Cell. Biol. 8, 466-472, 1988). Bibliotekę utworzono wykorzystując dwa miejsca restrykcyjne BSTX1 w wektorze pJFE14.

Komórki COS-7 przejściowo transfekowano albo bankiem pJFE14 albo wektorem kontrolnym metodą transfekcji w DEAE-dekstranie. Pokrótce, komórki COS-7 posiewano z gęstością 1,0 χ 10⁶ komórek na płytki o średnicy 100 mm na 24 godziny przed transfekcją. Do transfekcji, komórki hodowano przez 3-4 godziny w temperaturze 37°C, w atmosferze o zawartości 5% CO₂, w pożywce DMEM bez surowicy, która to pożywka zawierała 400 pg/ml DEAE-dekstranu, 1 μΜ chlorochiny i 2 mM glutaminy oraz 1 pg odpowiedniego DNA. Media transfekcyjne zasysano i zastępowano na 2 - 3 minuty buforowanym fosforanem roztworem fizjologicznym z dodatkiem 10% DMSO. Po tym szoku DMSO, komórki COS-7 umieszczano w pożywce DMEM z dodatkiem 10% FBS, po 1% penicyliny i streptomycyny i 2 mM glutaminy na 48 godzin.

Ponieważ ligand TIE-2 jest wydzielany, zachodziła potrzeba zwiększenia przenikalności komórek w celu wykrycia wiązania sondy ciała receptora z ligandem. Po dwu dniach od transfekcji komórki przemywano roztworem PBS i następnie inkubowano z PBS zawierającym 1,8% formaldehydu w czasie 15-30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie komórki przemywano PBS i inkubowano przez 15 minut w PBS z dodatkiem 0,1% Tritonu Χ-100 i 10% surowicy cielęcej w celu permebilizacji komórek i zablokowania nieswoistych miejsc wiązania. Skrining prowadzono przez bezpośrednią lokalizację barwienia z użyciem ciała receptora TIE-2, które składało się z pozakomórkowej domeny TIE-2 połączonej przez fuzję ze stałym regionem IgGl. To ciało receptora przygotowano w sposób opisany w przykładzie II. Płytkę o średnicy 100 mm z transfekowanymi, utrwalonymi i permebilizowanymi komórkami COS sondowano przez inkubację w czasie 30 minut z TIE-2 RB. Następnie komórki przemyto dwukrotnie roztworem PBS i inkubowano przez dodatkowe 30 minut w PBS z dodatkiem 10% koniugatu: surowica cielęca/alkaliczna fosfataza antyludzkiej IgGl. Po trzech przemyciach roztworem PBS komórki inkubowano w substracie alkalicznej fosfatazy w czasie 30-60 minut. Płytkę analizowano mikroskopowo na obecność barwionych komórek. Dla każdej zabarwionej komórki zeskrobywano z płytki małą powierzchnię komórek włącznie z komórką zabarwioną używając końcówki plastikowej pipety, po czym odzyskiwano plazmidowy DNA i stosowano go do elektroporaćji komórek bakteryjnych. Pojedyncze kolonie bakteryjne otrzymane po elektroporaćji zebrano i plazmidowy DNA wypreparowany z tych kolonii użyto do transfekcji komórek COS-7, które sondowano na ekspresję ligandu TIE-2 wykrywanego przez wiązanie z ciałami receptora TIE-2. Pozwoliło to na identyfikację pojedynczych klonów kodujących ligand TIE-2. Ekspresję ligandu TIE-2 potwierdzono przez fosforylację receptora TIE-2 wykorzystując metodę opisaną w przykładzie V. Klon plazmidowy kodujący ligand TIE-2 zdeponowano w muzeum ATCC w dniu 7 października 1994 r pod nazwą „pJFE 14 kodujący ligand TIE-2” pod numerem akcesyjnym ATCC nr 75910.

184 642

Przykład VII. Izolowanie i sekwencjonowanie klonu cDNA o pełnej długości, kodującego ludzki ligand TIE-2.

Bank cDNA płuc płodu ludzkiego w lambda gt-10 (patrz fig. 3) otrzymano z Clontech Laboratories, Inc. (Pało Alto, CA). Łysinki posiewano z gęstością 1,25 χ 10⁶ na płytkę 20x20 cm i uzyskano filtry-repliki po wykonaniu standardowych procedur (Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, II wyd., str. 846, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor, Nowy Jork).

Izolację klonów ludzkiego ligandu tie-2 prowadzono następująco: fragment Xhol o wielkości 2,2 kb ze zdeponowanego klonu dla ligandu tie-2 (ATCC nr 75910 - patrz przykład VI, powyżej) znakowano przez losowe napiętnowanie do aktywności właściwej około 5 x 10⁸ cpm/ng. Hybrydyzację prowadzono w temperaturze 65°C w roztworze hybrydyzacyjnym zawierającym 0,5 mg/ml DNA ze spermy łososia. Filtry przemywano w temperaturze 65°C w 2 x SSC, 0,1% SDS i eksponowano na film Kodak XAR-5 przez dobę w temperaturze -70°C. Fagi pozytywne oczyszczano metodą łysinek. Lizaty o wysokim mianie czystego faga użyto do izolacji DNA na kolumnie Qiagen, wykorzystując standardowe techniki (Qiagen Inc. Chatsworth, CA, katalog 1995 r, str. 36). Fagowy DNA trawiono za pomocą EcoRI dla uwolnienia klonowanego fragmentu cDNA do następnego subklonowania. Wektor faga lambda zawierający DNA ludzkiego ligandu tie-2 zdeponowano w muzeum ATCC w dniu 26 października 1994 r. pod nazwą ,AgtlO kodujący htie-2 ligand 1” (ATCC, nr akcesyjny 75928). Fagowy DNA można bezpośrednio poddać analizie sekwencji DNA metodą zakańczania łańcucha didezoksy (Sanger i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. US.A., 74, 5463-5467, 1977).

Subklonowanie ludzkiego ligandu TIE-2 do ssaczego wektora ekspresyjnego.

Klon ZgtlO kodujący htie ligand 1 zawiera miejsce EcoRI zlokalizowane o 490 par zasad w dół od początku sekwencji kodującej ludzki ligand tie-2. Region kodujący można wyciąć wykorzystując unikalne miejsca restrykcyjne odpowiednio w górę i w dół od kodonów inicjacji i stopu. Przykładowo, miejsce Spel zlokalizowane o 70 par zasad w kierunku 5' od kodonu inicjacji i miejsce Bpul 102i (znane również jako BIpI) zlokalizowane w miejscu odległym o 265 par zasad od kodonu stopu można użyć do wycięcia całkowitego regionu kodującego. Ten region można następnie subklonować do wektora klonującego pJFE14, stosując Xbal (miejsce zgodne z nawisem Spel) oraz miejsca PstI (miejsca PstI i Bpul 1021 uzupełniano, tworzą; tępe końce).

Sekwencjonowanie ludzkiego ligandu TIE-2

Region kodujący z klonu ZgtlO, kodujący htie ligand 1 sekwencjonowano stosując aparat do sekwencjonowania DNA ABI 373A i zestaw „Taq Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit” (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA). Nukleotyd i wyprowadzona sekwencja aminokwasowa ludzkiego ligandu TIE-2 z klonu ZgtlO kodującego htie-2 ligand 1 są przedstawione na fig. 4.

Ponadto, otrzymano klony cDNA ludzkiego ligandu TIE-2 o pełnej długości przez skrining banku cDNA ludzkiego glejaka T98G w wektorze pJFE14. Klony kodujące ludzki ligand tie-2 identyfikowano przez hybrydyzację DNA, stosując fragment Xhol o wielkości

2,2 kb ze zdeponowanego klonu ligandu tie-2 (ATCC nr 75910) jako sondę (patrz przykład VI, powyżej). Region kodujący sekwencjonowano stosując aparat do sekwencjonowania DNA, ABI 373A i zestaw „Taq Dyedeoxy Terminator Cycle Seąuencing Kit” (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA). Ta sekwencja była prawie identyczna z sekwencją występującą w klonie ZgtlO kodującym htie-2 ligand 1. Jak widać na fig. 4, klon ZgtlO kodujący htie-2 ligand 1 zawiera dodatkową resztę glicyny, kodowaną przez nukleotydy 1114-1116. Sekwencja kodująca klonu T98G nie zawiera tej reszty glicyno wej ale poza tym jest identyczna z sekwencją kodującą klonu LgtlO kodującego htie-2 ligand 1. Na fig. 5 jest podana sekwencja nukleotydowa i wyprowadzona sekwencja aminokwasowa ludzkiego ligandu TIE-2 z klonu T98G.

Przykład VIII. Izolowanie i sekwencjonowanie drugiego klonu A cDNA o pełnej długości, kodującego ludzki ligand TIE-2.

Bank cDNA z płuc płodu ludzkiego w lambda gt-10 (patrz fig. 3) otrzymano z Clontech Laboratories, Inc. (Pało Alto, CA). Łysinki posiewano z gęstością 1,25 χ 10⁶ na płytkę 20 x 20 cm

184 642 i uzyskano filtry-repliki po wykonaniu standardowych procedur (Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, II wyd., str. 846, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor, Nowy Jork). Skrining filtrów-duplikatów wykonywano w warunkach luźnych (2 x SSC, 55°C) z sondami wykonanymi dla ludzkiej sekwencji tie-2 L-1. Jeden z filtrówduplikatów sondowano sondą 5', kodującą aminokwasy 25-265 ludzkiej sekwencji tie 2L-1, przedstawionej na fig. 4. Drugi filtr-duplikat sondowano sondą 3' kodującą aminokwasy 282498 z ludzkiej sekwencji tie 2 L-1 (fig. 4). Obydwie sondy hybrydyzowano w temperaturze 55°C w roztworze hybrydyzacyjnym zawierającym 0,5 mg/ml DNA ze spermy łososia. Filtry przemyto w temperaturze 55°C w 2 x SSC i eksponowano na film rentgenowski. Poza tym filtry-duplikaty hybrydyzowano w warunkach normalnych (2 x SSC, 65°C) z sondą mysiego tie2L o pełnej długości (F3-15, insert Xhol). Zebrano trzy klony dodatnie spełniające następujące kryteria: i. nie jest widoczna hybrydyzacja z sondą mysią o pełnej długości w warunkach normalnych i ii. jest widoczna hybrydyzacja w warunkach luźnych z obydwiema sondami 5' i 3'. Trawienie enzymem EcoRI fagowego DNA otrzymanego z tych klonów wykazało dwa niezależne klony o rozmiarach insercji około 2,2 kb i około 1,8 kb. Insert EcoRI o wielkości 2,2 kb subklonowano do miejsc EcoRI w wektorach pBluescript KS (Stratagene) i w ekspresyjnym wektorze ssaczym odpowiednim do użycia w komórkach COS. Dla ekspresyjnego wektora ssaczego zidentyfikowano dwie orientacje. Insert o wielkości 2,2 kb w pBluescript KS zdeponowano w muzeum ATCC w dniu 9 grudnia 1994 r. pod nazwą pBluescript KS kodujący ludzki TIE 2 ligand 2. Miejsce startu sekwencji kodującej TIE 2 ligand 2 znajduje się w odległości około 355 par zasad w dół od miejsca EcoRI w pBluescript.

Komórki COS-7 przejściowo transfekowano albo wektorem ekspresyjnym albo wektorem kontrolnym metodą transfekcj i w DEAE-dekstranie. Pokrótce, komórki COS-7 posiewano z gęstością 1,0 χ 10⁶ komórek na płytki o średnicy 100 mm na 24 godziny przed transfekcją Do transfekcji, komórki hodowano przez 3-4 godziny w temperaturze 37°C, w atmosferze o zawartości 5% CO₂, w pożywce DMEM bez surowicy, która to pożywka zawierała 400 pg/ml DEAE-dekstranu, 1 μΜ chlorochiny i 2 mM glutaminy oraz 1 pg odpowiedniego DNA. Media transfekcyjne zasysano i zastępowano buforowanym fosforanem roztworem fizjologicznym z dodatkiem 10% DMSO na 2 - 3 minuty. Po tym szoku DMSO, komórki COS-7 umieszczano w pożywce DMEM z dodatkiem 10% FBS, po 1% penicyliny i streptomycyny i 2 mM glutaminy na 48 godzin.

Ponieważ ligand TIE-2 jest wydzielany, zachodziła potrzeba zwiększenia przenikalności komórek w celu wykrycia wiązania sondy ciała receptora z ligandem. Transfekowane komórki COS-7 posiewano z gęstością 1,0 x łO⁶ komórek/płytkę 100 mm. Komórki przemywano roztworem PBS i następnie inkubowano z PBS zawierającym 1,8% formaldehydu w czasie 15-30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie komórki przemywano PBS i inkubowano przez 15 minut w PBS z dodatkiem 0,1% Tritonu Χ-100 i 10% surowicy cielęcej w celu permebilizacji komórek i zablokowania nieswoistych miejsc wiązania. Skrining prowadzono przez bezpośrednią lokalizację barwienia z użyciem ciała receptora TIE-2, które składało się z pozakomórkowej domeny TIE-2 połączonej przez fuzję ze stałym regionem IgGl. To ciało receptora przygotowano w sposób opisany w przykładzie II. Transfekowane komórki COS sondowano przez inkubację w czasie 30 minut z TIE-2 RB. Następnie komórki przemywano dwukrotnie roztworem PBS, utrwalano metanolem i inkubowano przez dodatkowe 30 minut w PBS z dodatkiem 10% koniugatu: surowica cielęca/alkaliczna fosfataza anty-ludzkiej IgG. Po trzech przemyciach roztworem PBS komórki inkubowano w substracie alkalicznej fosfatazy w czasie 30-60 minut. Płytkę analizowano mikroskopowo na obecność barwionych komórek. Komórki wykazujące jedną orientację klonu ale nie drugą orientację wiązały ciało receptora TIE-2.

Specjaliści łatwo zauważą, że opisane sposoby można wykorzystać do dalszej identyfikacji innych spokrewnionych przedstawicieli rodziny ligandów TIE.

Sekwencjonowanie drugiego ludzkiego ligandu TIE-2.

Region kodujący z klonu pBluescript KS, kodujący ludzki TIE-2 ligand 2 sekwencjonowano stosując aparat do sekwencjonowania DNA, ABI 373A i zestaw „Taq Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit” (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA). Nukleotyd

184 642 i wyprowadzona sekwencja aminokwasowa ludzkiego ligandu TIE-2 z klonu pBluecript KS kodującego ludzki TIE-2 ligand 2 są przedstawione na fig. 6.

Przykład IX. TIE-2 ligand 2 jest antagonistą receptora.

Kondycjonowane media z komórek COS wytwarzających albo TIE-2 ligand 2 (TL2) albo TIE-2 ligand 1 (TLI) porównano pod względem ich zdolności do aktywowania receptorów TIE-2 obecnych w stanie naturalnym w ludzkiej linii komórek śródbłonka.

Stosując odczynnik lipofektaminę (GIBCO-BRL, Inc.) i zalecane sposoby postępowania przeprowadzono transfekcję komórek COS-7 samym wektorem ekspresyjnym pJFE14 albo wektorem pJFE14 zawierającym cDNA ludzkiego TIE-2 ligandu 1 albo wektorem ekspresyjnym pMT21 (Kaufman R.J. Proc. Natl. Acad. Sci. US.A. 82, 689-693, 1985) zawierającym cDNA ludzkiego TIE-2 ligandu 2. Po trzech dniach zebrano media z hodowli komórek COS zawierające wydzielone ligandy i zatężono je 20-krotnie przez diafiltrację (membrany ultrafiltracyjne DIAFLO, Amicon, Inc.). Ilości aktywnego TIE-2 ligandu 1 i TIE-2 ligandu 2 obecne w tych mediach oznaczano i wyrażano w ilości jednostek rezonansowych (R.U.) aktywności swoistego wiązania receptora TIE-2 oznaczanych w próbie wiązania BIAcore.

Analizy typu Northern (hybrydyzacja RNA) ujawniły znaczące poziomy transkryptów TIE-2 w ludzkich pierwotnych komórkach śródbłonka HAEC (ludzka komórka śródbłonka aorty; Clonetics Inc.). Komórki te użyto zatem do zbadania, czy receptor TIE-2 jest sfosforylowany przy tyrozynie podczas ekspozycji na media hodowlane komórek COS zawierające ligandy TIE-2. Komórki HAEC utrzymywano w pełnej pożywce wzrostowej dla komórek śródbłonka (Clonetics Inc.), zawierającej 5% płodowej surowicy cielęcej, rozpuszczalny wyciąg z mózgów wołowych, 10 ng/ml ludzkiego EGF, 1 mg/ml hydrokortizonu, 50 mg/ml gentamycyny i 50 ng/ml amfoterycyny B. Oceny, czy TLI i TL2 mogą aktywować receptor TIE-2 w komórkach HAEC dokonano następująco: półpłynące komórki HAEC utrzymywano bez surowicy przez 2 godziny w pożywce Dulbecco MEM o wysokiej zawartości glukozy z dodatkiem L-glutaminy, penicyliny i streptomycyny, w temperaturze 37°C, po czym zastępowano pożywkę bez surowicy pożywką kondycjonowaną COS zawierającą ligand na 7 minut, w inkubatorze o temperaturze 37°C, w atmosferze o zawartości 5% CO₂. Komórki poddawano bzie i odzyskiwano białko receptora TIE-2 przez immunoprecypitację lizatów z antysurowicą dla peptydu TIE-2, po czym prowadzono blotting Westema z antysurowicą przeciw fosfotyrozynie, dokładnie jak w przykładzie I. Wyniki są przedstawione na fig. 7. Poziomy fosfotyrozyny na receptorze TIE-2 (TIE-2-R) indukowano przez traktowanie komórek HEAC kondycjonowanymi TIE-2 ligandem 1 (pasmo Ll) ale nie TIE-2 ligandem 2 (pasmo L2) mediami COS. MOCK jest kondycjonowanym medium z komórek COS transfekowanych pustym wektorem JFE14.

Dowód, że TLI i TL2 swoiście wiążą się z receptorem TIE-2 uzyskano przez wykonanie próby BIAcore, śledząc aktywności swoistego wiązania receptora TIE-2 w mediach z hodowli transfekowanych komórek COS i przez barwienie immunologiczne komórek COS wytwarzających TLI i TL2 z ciałami receptora TIE-2.

Ponieważ TL2 nie aktywuje receptora TIE-2, zgłaszający postanowili zbadać, czy TL2 może służyć jako antagonista aktywności TLI. Przeprowadzono próby fosforylacji HAEC, w których to próbach komórki najpierw inkubowano z nadmiarem TL2 a potem dodawano rozcieńczony TLI. Uznano, że uprzednie zajęcie receptora TIE-2 w wynikli wysokiego poziomu TL2 może zapobiec następnej stymulacji tego receptora po ekspozycji na TLI obecny w ograniczonym stężeniu.

Półpłynące komórki HAEC utrzymywano bez surowicy jak opisano powyżej i następnie inkubowano przez 3 minuty w temperaturze 37°C z dodatkiem 1-2 ml medium kondycjonowanego 20 x COS/JFE14-TL2. Płytki kontrolne traktowano tylko medium MOCK (20 X COS/JEE14). Płytki wyjmowano z inkubatora, dodawano różne rozcieńczenia medium COS/JFE14-TL1 i dalej inkubowano płytki przez 5-7 minut w temperaturze 37°C. Komórki przemywano, poddawano lizie i w lizatach oznaczano TIE-2 swoistą fosforylację tyrozyny przez immunoprecypitację receptora i blotting Westema, jak opisano powyżej. Wykonano rozcieńczenia TLI stosując medium 20 x COS/JFE14-TL1 rozcieńczone do 2X, 0,5X, 0,lX i 0,02X przez dodanie samego medium 20 x COS/JFE14. Oznaczenia początkowych mediów

184 642 x TLI i 20 x TL2 COS z zastosowaniem technologii czujników biologicznych BIAcore wykazały, że zawierają one podobne ilości TIE-2 swoistych aktywności wiązania, to znaczy 445 R.U. i 511 R.U. odpowiednio dla TLI i TL2. Wyniki blottingu Westema antyfosfotyrozyny przedstawione na fig. 8 wskazują, że w porównaniu do wstępnego traktowania komórek HAEC przez medium MOCK (pasmo 1), wstępne traktowanie komórek HAEC nadmiarem TIE-2 ligandu 2 (pasmo 2) antagonizuje następną zdolność rozcieńczonego TIE-2 ligandu 1 do aktywowania receptora TIE-2 (TIE2-R).

Powyższe dane wskazują, że w odróżnieniu od TLI, TL2 nie wykazywało zdolności stymulowania aktywności kinazy receptora TIE-2 w komórkach HAEC. Ponadto, preinkubacja komórek śródbłonka z wysokimi stężeniami TL2 i następne dodanie TLI blokowało zdolność TLI do stymulowania receptora TIE-2, co wskazuje, że TL2 jest antagonistą receptora TIE-2.

Przyk ład X. Identyfikacja aktywności swoistego wiązania TIE-2 w kondycjonowanym medium i w supematantach komórek COS.

Aktywność wiązania medium 10 x CCM z hodowli linii komórkowych C2C12 ras, Rat2 ras, SHEP i T98G albo supematantów komórek cos po transfekcji ludzkim TIE-2 ligandem 1 (hTLl) albo ludzkim TIE-2 ligandem 2 (hTL2) oznaczano z zastosowaniem technologii czujników biologicznych BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) monitorującej interakcje biomolekulame w rzeczywistym czasie na drodze powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR). Oczyszczone szczurze albo ludzkie TIE-2 RB sprzęgano kowalencyjnie poprzez aminy pierwszorzędowe z warstwą karboksymetylodekstranu pastylki czujnika laboratoryjnego CM5 (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Powierzchnię pastylki czujnika aktywowano stosując mieszaninę N-hydroksysukcynamidu (NHS) i N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo) karbodiimidu (EDC), następnie immobilizowano TIE-2 RB (25 μg/ml, pH 4,5) i dezaktywowano nieprzereagowane miejsca 1,0 M etanoloaminą (pH 8,5). Na ogół, z pastylką czujnika sprzęgano 9000-10000 jednostek RU każdego ciała receptora.

Buforem roboczym stosowanym w systemie był HBS [(10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,005% surfaktantu P20 (pH 7,4)]. Próbki wirowano przez 15 minut w temperaturze 4°C i następnie klarowano na sterylnym filtrze o niskim wiązaniu białek, o średnicy porów 0,45 pm (Millipore, Bedford, MA). Do każdej próbki dodawano dekstran (2 mg/ml) i surfaktant P20 (0,005%). Próbki po 40 pl wstrzykiwano poprzez immobilizowaną powierzchnię (szczurze albo ludzkie TIE2) z szybkością przepływu 5 pl/minutę i monitorowano wiązanie receptora przez 8 minut. Aktywność wiązania (jednostki rezonansowe, RU) mierzono jako różnicę między wartością wyjściową oznaczaną na 30 sekund przed wstrzyknięciem próbki a wartością zmierzoną w 30 sekundzie po iniekcji. Powierzchnię regenerowano jednym wstrzyknięciem 15 pl 3 M roztworu MgCl₂.

Próbki CCM (C2C12 ras, Rat2 ras, SHEP i T98G) testowano na powierzchni immobilizowanej przez TIE2 RB szczura a rekombinacyjne hTLl i hTL2 testowano na powierzchni immobilizowanej przez ludzkie TIE2 RB. W każdym przypadku, przed oznaczaniem aktywności wiązania, specyficzne wiązanie z ciałem receptora TIE-2 oceniano przez inkubację próbek z 25 pl/ml rozpuszczalnego TIE-2 RB (szczurzego albo ludzkiego) albo trkB RB. Jak widać na fig. 9 i fig. 10, dodanie rozpuszczalnego trkB RB powoduje lekki spadek aktywności wiązania TIE-2, podczas gdy dodanie rozpuszczalnego TIE-2 RB znacząco zmniejsza aktywność wiązania w porównaniu z aktywnością zmierzoną w nieobecności TIE-2 RB.

Przykład XI. TIE-2 RB swoiście blokuje aktywację receptora TIE-2 przez TIE-2 ligand 1

Zgłaszający postanowili zbadać, czy rozpuszczalne TIE-2-RB może służyć jako kompetencyjny inhibitor do blokowania aktywacji receptora TIE-2 przez TIE-2 ligand 1 (TLI). W tym celu media COS zawierające TLI wstępnie inkubowano albo z TIE-2-RB albo z TrkB-RB i następnie porównywano na zdolność aktywowania receptorów TIE-2 obecnych w stanie naturalnym w linii ludzkich komórek śródbłonka.

Kondycjonowane media COS generowano z hodowli komórek COS-7 transfekowanych albo samym wektorem ekspresyjnym pJFE14 (MOCK) albo wektorem pJFE14 zawierającym cDNA ludzkiego TIE-2 ligandu 1 (TLI) i zbierano jak opisano w przykładzie IX powyżej, z tym, że media były sterylnie filtrowane ale nie zatężane. Ilość TLI oznaczano i wyrażano

184 642 w ilości jednostek rezonansowych (R.U.) aktywności swoistego wiązania receptora TIE-2 oznaczanych w próbie wiązania BIAcore.

Analizy typu Northern (RNA) ujawniły znaczące poziomy transkryptów TIE-2 w ludzkich pierwotnych komórkach śródbłonka HUVEC (Humań Umbilical Vein Endothelial Cell; Clonetics, Inc.). Komórki te użyto zatem do sprawdzenia, czy receptor TIE-2 może być fosforylowany przy reszcie tyrozynowej przy ekspozycji na media COS zawierające TLI w obecności TIE-2-RB albo TrkB-RB. Komórki HUVEC utrzymywano w temperaturze 37°C, w atmosferze o zawartości 5% CO₂, w kompletnym medium wzrostowym dla komórek śródbłonka (Clonetics, Inc.) zawierającym 5% płodowej surowicy cielęcej, rozpuszczalny wyciąg z mózgu bydlęcego z 10 pg/ml heparyny, 10 ng/ml ludzkiego EGF, 1 pg/ml hydrokortizonu, 50 pg/ml gentamycyny i 50 ng/ml amfoterycyny B. Oceny, czy TLI mogą aktywować receptor TIE-2 w komórkach HUVEC dokonano następująco: Płytki z współpłynącymi komórkami HUVEC utrzymywano bez surowicy przez 2 do 4 godzin w pożywce Dulbecco MEM o niskiej zawartości glukozy, w temperaturze 37°C, w atmosferze o zawartości 5% CO₂, następnie prowadzono 10 minutową inkubację w pożywce bez surowicy, zawierającej 0,1 mM ortowanadanu sodu - silnego inhibitora fosfataz fosfotyrozynowych. W międzyczasie preinkubowano kondycjonowane media COS w czasie 30 minut w temperaturze pokojowej z TIE-2-RB albo z TrkB-RB, dodanymi w ilości 50 pg/ml. Z płytek HUVEC usuwano następnie pożywkę bez surowicy i prowadzono inkubację z mediami COS zawierającymi ciała receptora (RB) w czasie 7 minut, w temperaturze 37°C. Komórki HUVEC poddawano następnie lizie odzyskiwano białko receptora TIE-2 przez immunoprecypitację z antysurowicą dla peptydu TIE-2. Analizę Westema wykonywano z przeciwciałem przeciw fosfotyrozynie, jak opisano w przykładzie I. Wyniki są przedstawione na fig. 11. Poziomy fosfotyrozyny na receptorze TIE-2 były zwiększone w stosunku do poziomów dla medium kontrolnego (MOCK) przez traktowanie komórek HUVEC ΊΤΕ-2 ligandem 1 (TLI) i indukcja ta była swoiście blokowana przez uprzednią inkubację z TIE-2-RB (TIE2-Fc) ale nie przez inkubację z TrkB-RB (TrkB-Fc). Dane te wskazują, że rozpuszczalne TIE-2-RB może służyć jako selektywny inhibitor, do blokowania aktywacji receptora TIE-2 przez TIE-2 ligand 1.

Przykład XII. Konstruowanie ciał ligandu TIE-2

Utworzono konstrukcję ekspresyjną, która może wytwarzać białko wydzielane, składające się z całkowitej sekwencji kodującej ludzkiego TIE-2 ligandu 1 (TLI) albo TIE-2 ligandu (TL2) połączonych przez fuzję z regionem stałym ludzkiej immunoglobuliny gamma-1 (IgGl Fc). Takie białka fuzyjne nazwano TIE-2 „ciałami ligandu” (TLl-Fc albo TL2-Fc). Część Fc z TLl-Fc i TL2-Fc przygotowano następująco: Fragment DNA kodujący część Fc ludzkiej IgGl rozciągający się od regionu zawiasowego do końca karboksylowego tego białka amplifikowano z cDNA ludzkiego łożyska w reakcji PCR, stosując oligonukleotydy odpowiadające opublikowanej sekwencji ludzkiej IgGl. Powstały fragment DNA klonowano w wektorze plazmidowym. Poddano ligacji odpowiednie fragmenty restrykcyjne z plazmidu kodującego TLI albo TL2 o pełnej długości i z plazmidu dla ludzkiego IgGl Fc do każdej strony krótkiego fragmentu pochodzącego z reakcji PCR, który to fragment tak zaprojektowano, aby łączył w zgodnej fazie TLI albo TL2 z sekwencjami kodującymi ludzkie białko IgGl Fc.

Otrzymano miligramowe ilości TL2-Fc przez klonowanie fragmentu DNA TL2-Fc do wektora baculowirusa pVL1393 i następne zakażenie owadziej linii komórek Spodoptera ffugiperda SF-21AE. Alternatywnie można użyć linię komórkową SF-9 (numer akcesyjny ATCC: CRL-1711) albo linię komórkową BTI-TN-5bl-4. DNA kodujący TL2-Fc klonowano jako fragment EcoRI-Notl do transferowego plazmidu baculowirusa, pVL1393. Plazmidowy DNA wprowadzano do wirusowego DNA przez zmieszanie 3 mg plazmidowego DNA z 0,5 mg Baculo-Gold DNA dostarczonego przez firmę Pharminigen i następnie wprowadzano do liposomów z użyciem 30 mg odczynnika Lipofectin (GIBCO-BRL). Mieszaniny DNA-liposomy dodawano do komórek SF-21AE (2 χ 10⁶ komórek/płytkę 60 mm) w pożywce TMN-FH (modyfikowana pożywka Grace'a do komórek owadzich; GIBCO-BRL) i utrzymywano przez 5 godzin w temperaturze 27°C, następnie inkubowano w temperaturze 27°C przez 5 dni w pożywce TMN-FN z dodatkiem 5% płodowej surowicy cielęcej. Medium z hodowli tkań52

184 642 kowej zebrano do oczyszczania techniką łysinek rekombinowanych wirusów, korzystając z metod opisanych poprzednio (O'Reilly D., R., Miller L.K. i Luckov V.A., Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual Nowy Jork, 1992, W.H. Freeman), z tym, że wierzchnia warstwa agarozy zawierała 125 mg/ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-P-Dgalaktopiranozydu; GIBCO-BRL). Po 5 dniach inkubacji w temperaturze 27°C zliczono nierekombinantowe łysinki w dodatniej reakcji barwnej z substratem X-gal i oznaczono ich pozycje. Łysinki rekombinantowe wizualizowano następnie przez dodanie drugiej warstwy wierzchniej zawierającej 100 mg/ml MTT [bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowego; Sigma). Łysinki przypuszczalnych wirusów rekombinowanych zbierano przez zassanie tłoczkiem i oczyszczano prowadząc wiele cykli izolacji łysinek dla zapewnienia homogenności. Zapasy wirusa wytwarzano przez seryjne pasażowanie z niską krotnością wirusów oczyszczonych metodą łysinek. Wytworzono pasażowane z niską krotnością zapasy jednego klonu wirusowego (vTL2-Fc Clone #7).

Prowadzono hodowlę komórek SF-21AE w pożywce bez surowicy (SF-900 II, GIBCOBRL) z dodatkiem roztworu 1 x antybiotyk/środek p-grzybiczy (GIBCO-BRL) i 25 mg/litr gentamycyny (GIBCO-BRL). Jako środek powierzchniowo czynny dodano Pluronic F-68 do końcowego stężenia 1 g/litr. Przed zakażeniem, hodowle (4 litry) wzrastały w bioreaktorze (Artisan Cell Station System) przez co najmniej 3 dni. Komórki rosły w temperaturze 27°C w atmosferze gazu zawierającego 50% rozpuszczonego tlenu, przepuszczanego z szybkością 80 ml/minutę (napowietrzanie przez pierścień rozpryskujący). Mieszano mieszadłem kotwicowym z szybkością 100 obrotów/minutę. Komórki zbierano w średnio-logarytmicznej fazie wzrostu (około 2 χ 10⁶ komórek/ml), zatężano przez wirowanie i zakażano 5 jednostkami tworzącymi łysinki νΤΙΕ-2-Fc na jedną komórkę. Komórki i inokulum rozcieńczano do 400 ml świeżą pożywką i absorbowano wirusa przez 2 godziny w temperaturze 27°C w kolbie obrotowej. Następnie hodowlę powtórnie zawieszono w świeżej pożywce bez surowicy do końcowej objętości 8 litrów i inkubowano komórki w bioreaktorze w warunkach podanych powyżej.

Miedium po hodowli komórek SF21AE zakażonych νΤΙΕ-2-Fc zebrano po 72 godzinach od zakażenia przez wirowanie (500 x g przez 10 minut). W supematantach doprowadzono wartość pH do 8 za pomocą NaOH, dodano EDTA do końcowego stężenia 10 mM i powtórnie ustawiono pH supernatantu na wartość 8. Supernatanty przefiltrowano przez filtr o średnicy porów 0,45 pm (Millipore) i wprowadzono na kolumnę z białkiem A (kolumna białko A sepharose 4 z szybkim przepływem albo HiTrap - białko A, obydwie z firmy Pharmacia). Kolumnę przemywano PBS zawierającym 0,5 M NaCl do czasu spadku absorbancji przy 280 nm do wartości wyjściowej. Następnie kolumnę przemyto w PBS i eluowano 0,5 M roztworem kwasu octowego. Frakcje spływające z kolumny natychmiast zobojętniano przez eluowanie do probówek zawierających 1 M Tris (pH 9). Frakcje pików zawierające TL2-Fc zebrano i dializowano względem PBS.

Depozyty

Zgodnie z układem budapeszteńskim, w „American Type Culture Collection”, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, zdeponowano następujące klony: klon plazmidowy kodujący ligand TIE-2, opisany jako „pJEE14 kodujący ligand TIE-2”, zdeponowano w dniu 7 października 1994 r pod numerem ATCC nr 75910. Rekombinantowy baculowirus Autographa califomica kodujący ciało receptora TIE-2, opisany jako „vTIE-2 ciało receptora zdeponowano 7 października 1994 r pod numerem akcesyjnym VR2484. Wektor faga lambda zawierający DNA ludzkiego ligandu tie-2, opisany jako „kgtlO kodujący htie-2 ligand 1” zdeponowano 26 października 1994 r pod numerem ATCC nr 75928. Klon plazmidowy kodujący drugi ligand TIE-2, opisany jako „pBluescript KS kodujący ludzki TIE-2 ligand 2” zdeponowano 9 grudnia 1994 r pod numerem akcesyjnym ATCC nr 75963.

Niniejszy wynalazek nie jest ograniczony w swym zakresie opisanymi powyżej konkretnymi rozwiązaniami. Istotnie, różne modyfikacje wynalazku poza opisanymi powyżej staną się oczywiste dla specjalisty po zapoznaniu się z niniejszym opisem i załączonymi figurami. Modyfikacje takie są objęte zakresem załączonych zastrzeżeń.

184 642

FIG. 2

Xho1 a1 -Xhol - BstX1

BstX1- Xho1 PstI xNott -Sili

PJFE14 3833 bp

184 642

FIG. 3

184 642

FIG. 4

20

40 SO

70 80

CAG<TCACTC>GGCACGCTCCATCCTCAACCGTCACACACAGAGGAAACAATAAATCTCAGCTACTATCCAATAAATATC

100 110 120 130 140 150 160 ···«·*··

TCAAGTTTTAACGAAGAAAAACATCATTCCAGTGAAATAAAAAATTTTAAAATTTTACAACAAAGCTAACAAATCGCTAG

170 180 190 200 210 220 230 240

250 260 270 280 290 300 310 *··»·« ·

CTAGTTTTAGACCTCAGAAGAAAGGAGCAAGTrTTCCGAGAGGCACGGAAGGAGTGTGCTCGCAGTACA ATG AGA M T>

320 330 340 350 360 370 • · · · » ·

GTT TTC CTT TCC TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT CTC ACT CAC ATA GOC TCC ACC AAT CAC

V

F

L

s

F

A

F

L A

A

I

L

T

H

i

c

S N

Q>

380 CGC CCA

390 . ACT CCA GAA

AAC

400 ’ AGT GGG AGA

, AGA

410 TAT AAC

CGC

420 : ATT CAA

CAT GGC

430 CAA TCT GCC

R

S

P

E

N

S

G R

R

Y

N

R

I

0

H

c

0 c

A>

440 TAC ACT

TTC

ATT

450 ' CTT

CCA

. CAA

460 . CAC GAT

GGC

470 AAC TCT

CGT

GAG

480 ; AGT

ACG

ACA

490 GAC CAC

TAC

Y

T

F

I

L

P

E

H D

G

N

C

R

E

s

T

D Q

Y>

500 AAC ACA

AAC

GCT

510 CTC

CAG

AGA

520 GAT GCT

ęcA

530 CAC GTC

GAA

CCG

540 GAT

TTC

TCT

5S0 TCC CAG

AAA

N

T

N

A

L

Q

R

D λ

P

H

V

E

P

D

F

S

S 0

K>

560 CTT CAA

CAT

CTC

570 GAA

CAT

GTC

S80 ATC GAA

AAT

590 TAT ACT

CAG

TCC

600 CTG

CAA

AAA

610 CTT GAG

AAT

L

0

H

L

E

H

V

Μ E

H

Y

T

0

W

L

0

K

L E

N>

620 TAC ATT

CTG

GAA

630 AAC

ATC

AAG

640 TCG GAG

ATC

650 GĆC CAG

ATA

CAC

660 CAG

AAT

GCA

670 CTT CAG

AAC

Y

I

V

E

N

M

X

5 E

H

A

0

I

Q

0

N

A

V Q

N>

680 CAC ACC

GCT

ACC

690 « ATC

CTG

GAG

700 * ATA OGA

ACC

710 AGC CTC

CTC

TCT

720 CAC

ACT

GCA

730 GAC CAG

ACC

H

T

A

T

M

L

E

I G

T

S

L

s

0

T

A

E Q

T>

740 AGA AAG

CTC

ACA

750 GAT

CTT

GAG

760 • ACC CAC

GTA

770 • CTA AAT

CAA

ACT

780 TCT

CGA

CTT

790 GAG ATA

CAG

R

X

L

T

D

V

E

T o

V

L

N

0

T

S

R

L

E I

Q>

800 CTG CTC

GAC

AAT

810 • TCA

TTA

TCC

820 • ACC TAC

AAC

830 CTA GAG

AAG

CAA

<40 CTT

CTT

CAA

850 CAG ACA

AAT

L

E

N

s

L

S

T Y

K

L

£

X

Q

L

0

Q T

N>

860 GAA ATC

TTG

AAG

870 ATC

CAT

GAA

880 AAA AAC

AGT

890 TTA TTA

GAA

CAT

900 AAA

ATC

TTA

910 GAA ATC

GAA

£

I

L

X

I

H

E

X N

S

L

E

H

K

I

L

£ M

E>

920 GGA AAA

CAC

AAG

930 GAA

GAG

TTG

940 GAC ACC

TTA

950 AAG GAA

GAG

AAA

960 9 GAG

AAC

CTT

970 CAA GGC

TTC

G

X

H

K

E

L

D T

L

X

E

£

X

£

N

L

0 G

L>

980 CTT ACT

CCT

CAA

990 ACA

TAT

ATA

1000 ATC CAG

GAG

1010 CTG GAA

AAG

1020 CAA TTA

AAC

AGA

1030 GCT ACC

ACC

V

T

R

Q

T

Y

I

I Q

E

L

£

X

Q

L

N

R

A T

T>

1040 • AAG AAG

AGT

10S0 • GTC CTT i

CAG

AAG

1060 • CAG CAA

CTC

1070 • GAG CTC

ATC

1080 • GAC AGA '

CTC

CAC

1090 AAC CTT

GTC

N

w

S

V

L

0

X

Q 0

L

E

L

H

D

T

V

H

N L

V>

184 642

FIG,

4

(ciąg d}

1100

1110

1120

1130

1140

1150

AAT CTT

TGC

ACT

ΑΛΑ

GAA

CCT

GTT TTA

CTA

AAG GGA

GGA

AAA

. ACA

GAC

GAA

GAC AAA

CCA

N L

C

T

K

E

G

V L

I.

K G

G

K

R

e

ε

E X

P>

1160

1170

1180

1190

1200

1210

TTT AGA

GAC

TCT

GCA

GAT

GTA

TAT CAA

GCT

GCT TTT

AAT

AAA

ACT

GGA

ATC

TAC ACT

ATT

F R

0

c

A

D

V

Y 0

A

G F

X

s

G

I

Y T

I>

1220

1230

1240

1250

1260

1270

TAT ATT

AAT

ATG

CCA

GAA

CCC AAA

AAG

GTC TTT

TCC

AAT

ATC

GAT

CTC

AAT GGG

GGA

Y I

H

X

P

E

P X

X

V F

C

X

M

O

V

X C

G>

1280

1290

1100

1310

1320

1330

•

*

•

♦

«

CCT TCC ACT CTA ATA CAA CAT CCT GAA GAT GGA ACT CTA GAT TTC CAA AGA GCC TCG AAG

G

w

T

V

1

Q

H

R

E

D

G

S

L

D

F

Q

R

G

W

X>

1340 GAA TAT

AAA

1350 ATC GCT

TTT

GGA

1360 • AAT CCC

TCC

1370 • GGT GAA

TAT

1380 TCC CTC

GCC

AAT

1390 GAC TTT

ATT

E

Y

X

M

G

F

C

X

P

s

G

E

Y

W

L

G

N

E

F

1400 TTT GCC

ATT

1410 ACC AGT

CAG

AGG

1420 CAC TAC

ATC

1430 CTA AGA

ATT

1440 GAG TTA

ATC

GAC

1450 TCG GAA

GGG

F

A

I

T

S

0

R

0

Y

H

L

R

I

ε

L

M

D

W

E

G>

1460 AAC CGA

CCC

1470 TAT TCA

CAG

TAT

1480 GAC AGA

TTC

1490 CAC ATA

GGA

1500 AAT GAA

AAG

CAA

1510 AAC TAT

AGG

X

R

A

Y

5

G

Y

D

R

•F

K

I

G

X

£

K

0

X

Y

R>

1520 TTC TAT

TTA

1530 AAA GCT

CAC

ACT

1540 CCC ACA

GCA

1550 CGA AAA

CAC

1560 ACC AGC

CTC

ATC

1570 TTA CAC

CCT

L Y

L

X

G

H

T

G

T

A

G

’K

0

S

5

L

I

L

H

G>

1580 GCr GAT

TTC

1590 AGC ACT

AAA

GAT

1600 GCT GAT

AAT

1610 GAC AAC

TCT

1620 « ATC TCC

AAA

TCT

1630 GCC CTC

ATC

A

0

F

S

T

X

0

A

D

N

D

N

C

M

C

K

c

A

L

1640 TTA ACA

GGA

1650 GGA TOG

TCG

TTT

1660 GAT GCT

TCT

1670 GGC CCC

TCC

1680 AAT CTA

AAT

GGA

1690 ATC TTC

TAT

L

T

C

W

F

0

A

C

G

P

5

X

L

X

G

H

F

Y>

1700 ACT GCC

GCA

1710 CAA AAC

CAT

GGA

1720 AAA CTC

AAT

1730 GGG ATA

AAC

1740 TCC CAC

TAC

TTC

1750 AAA GOC

ccc

T

A

C

Q

H

C

X

L

N

G

I

X

W

H

Y

F

K

G

P>

1760 1770 1780 1730 1800 1810

ACT TAC TCC TTA CCT TCC ACA ACT ATC ATG ATT CGA CCT TTA GAT TTT TGA AAG CCCAATCT

S Y	S L	R $ T	T M	KIR	P L	D F
1820	1830	1840	1850	1860	1870	1880	1890
•	•	•	•	•	•	•	•
CAGAAGCGATTATGAAAGCAACAAAGAAATCCGGAGaAGCTGCCADGTCAGAAACTCTTTCAAAACTTCAGAAGCAAACA
1900	1910 •	1920 «	1930 •	1940 «	1950	1960	1970 «
ATATTCTCTCCCTTCCAGCaATAAGTCGTACTTaTC* UAAGTCAuCAAWJrn. *	I\^CCGT\AAl\TrUGAuCCUTTT\Au
1980	1990 »	2000	2010	2020 •	2030	2040	2050
TTCACAGCTCTCTACTTCOOGTCACAŁ,TV-l\-AUk» i i a i auaaaal i i ual i u i \-\AjUA_ i TTAAAA
2060	2070	2080	2090	2100	2110	2120	2130

Aa^y^^GAAACTGCTGAGCTIGCTCTGCTTCAAACTACTACTGGACCTTATTrTCGAACTATGGTAGCCAGATCATAAAT

2140

ATOCTTAAITTC

184 642

	FIG.	5
10	20	30	40	50	60	70	80
•	»	•	•	•	•	•	.·
CAGCTGACTCACGCACCCTTC?.TCCTCAACQCnX>CACAGAGAGGAAACAATAAATCTCAGCTACTATCCKATAAATATC
90	100	110	120	110	140 •	ISO «	160

TCAAZTTTTTAACCiAAGAAAAACATCATTGCACTGAAATAAAAAATTTrAAAATTTT^JSAJdCAAAGCTAACAAATGOCTAG

170	180	190	200	210	220	230	240
*	•	*	*	*	*	•	•
1 ΙΊ JL1ATCA1 ILI ILI ILAAALbLi I1LI HL»AGGGGGAAAGW»rCAAACAAAŁ_AAGUAbmTACCTGAAATAAAGAA
2S0	260	270	280	290	300 •	310

CTAL· 1' i 11AGAOTTCMIAAGAAAOCACCAAL· Γ11' IbOGAGAGCO^DSAASCACl^IlKriOCCWTrACA ATC ACA H T>

320

330

340

350

360

370

•

CTT TTC CTT TCC nr

GCT TTC CTC GCT GCC

. ATT CTC

; ACT CAC ATA

GGG

; tcc

AGC AAT CAG

V F

L

$

F

A

F

L A

A

I L

T

H

1

G

c

S H

Q>

380

390

400

410

420

430

•

-

•

*

CCC CCA

. ACT CCA

, CAA

AAC

' ACT

‘ GGG ACA

. AGA

TAT AAC

: ccc

ATT CAA

CAT

GOC

CAA TCT GCC

R R

S

P

E

N

S

G R

R

Y N

R

I

c

H

c

0 c

A>

440

450

460

470

480

490

•

*

TAC ACT

TTC

ATT

CTT

CCA

GAA

CAC GAT

GGC

AAC TCT

CGT

GAG

ACT

ACG

ACA

GAC CAG

TAC

Y T

F

I

L

P

ε

H D

G

N C

R

E

S

T

D 0

Y>

500

510

520

530

540

550

•

♦

•

AAC ACA

AAC

GCT

CTG

CAG

AGA

GAT GCT

CCA

CAC GTC

GAA

CCG

GAT

TTC

TCT

TCC CAG

AAA

N T

N

A

L

o

R

D A

P

Η V

E

P

D

F

S

S 0

K>

560

570

580

590

600

610

CTT CAA

CAT

CTG

GAA

CAT

GTG

ATG GAA

AAT

TAT ACT

CAG

TCG

CTC

CAA

AAA

CTT GAG

AAT

L 0

H

L

£

H

V

Μ E

N

Y T

o

W

L

0

X

L E

N>

62C

630

640

650

660

670

•

♦

•

ta: att

CTC

GAA

AAC

ATC

AAG

TCG GAC

ATC

CCC CAG

ATA

CAG

AAT

CCA

CTT CAG

AAC

γ i

V

E

W

H

K

5 £

M

A Q

I

0

N

A

v 0

N>

68C

690

700

710

720

730

•

*

CAC ACC

GCT

ACC

ATC

CTG

GAG

ATA GGA

ACC

AGC CTC

CTC

TCT

CAG

ACT

GCA

GAC CAG

ACC

Μ T

A

T

M

L

ε

1 G

T

S L

L

S

Q

T

A

ε Q

T>

740

750

760

770

780

790

•

AGA AAG

CTC

ACA

GAT

CTT

GAG

ACC CAG

CTA

CTA AAT

CAA

ACT

TCT

CGA

CTT

GAG ATA

CAG

R K

L

T

0

V

E

T Q

V

L K

Q

T

S

R

L

Ε I

G>

803

SIO

820

830

840

850

ctc ctc

GAG

AAT

TCA

TTA

TCC

ACC TAC

AAG

CTA GAC

AAG

CAA

CTT

CAA

CAC ACA

AAT

L L

ε

N

s

L

S

T Y

X

L £

X

0

L

Q

G τ

N>

960

870

880

890

900

910

GAA ATC

TTC

AAG

ATC

CAT

CAA

AAA AAC

ACT

TTA TTA

GAA

CAT

AAA

ATC

TTA

GAA ATC

GAA

ε i

L

X

H

E

X N

S

t L

£

H

K

I

t

£ H

E>

920

930

940

950

960

970

GGA AAA

CAC

AAG

GAA i

GAG

TTC

GAC ACC

TTA

AAG GAA

GAG

AAA

CAG

AAC

CTT

CAA GCC

TTG

C X

H

K

E

ε

L

D T

L

K E

E

K

ε

N

L

G C

L>

980

990

1000

1010

1020

1030

Al i

CCT

CAA

ACA TAT

ATA

ATC CAG

GAG

CTG GAA

AAG

CAA

TTA

AAC

AGA

GCT ACC

ACC

V T

R

0

T

Y

I

I G

ε

L Ξ

X

Q

L

W

R

A T

T>

1040

1050

1060

1070

1080

1090

AAC AAC

ACT

CTC

CTT CAC

AAG

CAG CAA

CTG i

GAG CTC

ATC

GAC

ACA 1

CTC

CAC

AAC CTT

GTC

N N

s

V

L

0

X

Q Q

L

E U

K

D

T

V

H

W Ł

v>

184 642 fig, 5 (ciąga)

1100

1110

1120

1130

1140

1150

AAT CTT

TGC

ACT AAA

GAA

CTT

TTA CTA

AAG

CGA CCA

AAA

AGA GAG

GAA GAC

AAA CCA

, TTT

K L

c

T K

E

V

L L

K

G C

X

R E

ε

K P

F>

1160

1170

1180

1190

1200

1210

ACA GAC

TCT

GCA GAT

GTA

TAT

CAA GCT

GGT

TTT AAT

AAA

ACT CGA

ATC

TAC

ACT ATT

TAT

R 0

c

A D

V

Y

Q A

G

F N

K

S G

1

Y

T I

Y>

1220

1230

1240

1250

1260

1270

ATT AAT

AAT

ATC CCA

GAA

ccc

AAA AAG

CTG

TTT TCC

AAT

ATC GAT

GTC

AAT

GGG GGA

GCT

1 N

N

Μ P

E

P

K K

V

F C

N

M 0

V

N

G G

c>

1280

1290

1300

1310

1320

1330

TOG ACT

CTA

ATA CAA

CAT

CCT

GAA CAT

CCA

AGT CTA

GAT

TTC CAA

AGA

CCC

TGG AAG

GAA

W T

V

I 0

H

R

E 0

G

5 L

0

F 0

R

c

W X

ε>

1340

1350

1360

L370

1380

1390

TAT AAA

ATC

GCT TTT

GCA

AAT

CCC TCC

CCT

GAA TAT

TCC

CTC GGC

AAT

GAC

TTT ATT

TTT

Y X

H

C F

G

N

P s

G

E Y

W

U G

N

ε

F I

F>

1400

1410

1420

1430

1440

1450

•

«

•

GCC ATT

ACC

ACT CAC

AGC

CAC

TAC ATC

CTA

AGA ATT

GAG

TTA ATC

GAC

TOG

GAA CGC

AAC

A I

T

s 0

R

0

Y M

L

R 1

E

L K

D

w

ε g

N>

1460

1470

1480

1490

1S00

1510

•

«

CCA CCC

TAT

TCA CAG

TAT

CAC

ACA TTC

CAC

ATA CGA

AAT

GAA AAC

CAA

AAC

TAT AGG

TTC

R A

Y

s o

Y

D

R F

K

I G

H

ε X

0

W

Y R

1520

1530

1540

1550

1560

1570

TAT TTA

AAA

CCT CAC

ACT

CCC

ACA CCA

CGA

AAA CAG

AGC

ACC CTC

ATC

TTA

CAC GCT

CCT

Y L

X

C H

T

c

T A

C

κ 0

S

S L

I

L

H G

A>

1580

1590

1600

1610

1620

1630

CAT TTC

ACC

ACT AAA

CAT

GCT

CAT AAT

GAC

AAC TCT

ATC

TCC AAA

TCT

CCC

CTC ATC

TTA

0 F

s

T K

0

A

D N

D

N C

H

C X

C

A

L K

L>

1640

1650

1660

1670

1680

1690

ACA CCA

CGA

TCC TCC

TTT

GAT

CCT TCT

GGC

CCC TCC

AAT

CTA AAT CCA

ATC

TTC TAT

ACT

T C

C

w w

r

0

A C

G

P s

N

L N

G

M

F Y

T>

1700

1710

1720

1730

1740

Π50

CCC CGA

CAA

AAC CAT

CCA

AAA

CTC AAT

GGG

ATA AAG

TCC

CAC TAC TTC

AAA CCC CCC

ter

A c

0 .

, N H

c

X

L N

C

I κ

W

Η Y

F

X

C P

s>

1760

1770

1780

Π90

1800

18)0

TAC TCC

TTA

CCT TCC

ACA

ACT

ATC ATC

ATT

CCA CCT

TTA

GAT TTT TCA

AACOCCAATCTCAGAA

Y s

L

R S

T

Μ H

I

R P

L

0 F

• >

1820 1830 1840 18S0 1860 18)0 1880 1890

CCCATTATCAAACCA3CAAACAAATTOXACAACCItX:CACCTC*CAAACTGTITCAAAACrrcX>ACCAAACAATATT

1900 1910 1920 1930 1940 19S0 1960 1990 .·»····· CTCTCCCTTCCACCAATAACTCCTACTTATCTCAACTCACCAACCTTCTTCIACCCTCAATCTCCACCCCTTTCACTTCAC

1980 1990 2000 2010 2020 20)0 2040 2050 .\ACACTTlVTACTTOXXnX>C*CTlXTCACCTCOCTCCACTATACAAAACirCACTC*CTCTCCCCCTTrAAAA«CCC*

2060 2090 2080 2090 2100 2110 2120 21)0

2140

TAATTTC

184 642

FIG.. 6

20 30 40 50 60 70 80 ·»····« ·

GAATTCCTCGGriGGTGTTTATCTCCTCCCAGCCTTCAGGGAGGGAACAACACTCTAGGATCTGCGGACAGAGCAACAAA

100 110 120 130 140 150 160 «···«·«· ggaccctgaaacctgctctgtaaaagctgacacagccctcccaagtcagcaggactcttcttcccactgcaatctcacag

170 180 190 200 210 220 230 240 ··«··«··

TTTACTGCATCCCTGGAGAGAACACAGCAGTAAAAACCAGGTTTGCTACTGGAAAAAGAGGAAAGAGAAGACTTTCATTG

2S0 260 270 280 290 300 310 320 ··«·«··»

ACGGACCCAGCCATGGCAGCGTAGCAGCCCTGCCTTTCAGACGGCAGCAGCTCGGGACTCTCGACGTCTCTTTCCCCTCA

330 340 350 360 370 380 • · · · · ·

AGTTTCCTAAGCTCCTCGTTTATTACTGAAGAAAGA ATG TGG CAG ATT GTT TTC TTT ACT CTG AGC TGT MWQIVFFTbSC>

390

400

410

420

430

440

GAT CTT GTC TTG GCC GCA GCC TAT AAC AAC TTT CGG AAG AGC ATG GAC AGC ATA GGA AAG DbVbAA AYNNFRKS M DS I G K>

450

460

470

480

490

500

AAG CAA TAT CAG GTC CAG CAT GGG TCC TGC AGC TAC ACT TTC CTC CTC CCA GAC ATG GAC KQYQVQHGSCSYTFbLP£MD>

510

520

530

540

550

560

AAC TGC CGC TCT TCC TCC AGC CCC TAC GTG TCC AAT GCT GTG CAG AGC GAC CCG CCG CTC NCRSSSSPYVSNAVQRDAPL>

580

590

600

610

620

GAA TAC GAT GAC TCG GTG CAG AGG CTG CAA CTC CTC GAG AAC ATC ATC GAA AAC AAC ACT EYDDSVQRLQVLENI MENNT>

630

640

650

660

670

680

CAG TGC CTA ATC AAG CTT GAG AAT TAT ATC CAG GAC AAC ATC AAG AAA GAA ATC GTA GAG QWLHXLEN¥IQDNMXXEHVE>

690

700

710

720

730

740

ATA CAG CAG AAT GCA GTA CAG AAC CAG ACG GCT GTG ATG ATA GAA ATA GGG ACA AAC CTG IQQNAVQNQTAVMIEIGTNL>

'50

760

770

780

790

800

TTG AAC CAA ACA GCT GAG CAA ACG CGG AAG TTA ACT GAT GTG GAA GCC CAA GTA TTA AAT LNQTAEQTRKLTDVEAQVLN>

810

820

830

840

850

860

CAG ACC ACG AGA CTT GAA CTT CAG CTC TTG GAA CAC TCC CTC TCG ACA AAC AAA TTC GAA QTTRLELQLL£HSLSTNKLE>

870

880

890

900

910

920

AAA CAG ATT TTG GAC CAG ACC AGT GAA ATA AAC AAA TTG CAA GAT AAG AAC AGT TTC CTA KQI bDQTSEINXbQDKNSFL>

930

940

950

960

970

980

GAA AAG AAG GTG CTA GCT ATG GAA GAC AAG CAC ATC ATC CAA CTA CAG TCA ATA AAA GAA EKKVbAHEDKHIIQLQSIKE>

990

1000

1010

1020

1030

1040

CAG AAA CAT CAC CTA CAC CTC TTA GTA TCC AAC CAA AAT TCC ATC ATT CAA CAA CTA CAA ekdqlqvlvskqnsi I EELE>

1060

1070

1080

1090

1100

AAA AAA ATA CTC ACT CCC ACG CTC AAT AAT TCA CTT CTT CAA AAG CAG CAA CAT GAT CTC KKIVTATVNNSVLQXQOHDL>

1050

184 642

PIG, 6 (ciąg d)

1110 ATG K

GAC E

1120 ACA GTT T V

AAT N

1130 AAC TTA N L

CTG L

ACT T

1140 ATC ATC Μ H

TCC s

1150 ACA TCA T S

AAC N

1160 TCA CCT S A

AAG CAC

ccc P>

X

D

1170

1180

1190

1200

1210

1220

ACT

GTT

GCT AAA

CAA

CAA CAA

ATC

ACC

TTC AGA

CAC

TCT GCT

GAA

GTA TTC

AAA

TCA

GGA.

T

V

A K

E

E 0

T

s

F R

D

C A

E

V F

K

S

G>

1230

1240

1250

1260

127C

1280

CAC

ACC

ACA AAT

GGC

ATC TAC

ACG

TTA

ACA TTC

CCT

AAT TCT

ACA

GAA GAG

ATC

AAG

GCC

H

T

T N

G

1 Y

T

T F

P

N S

T

E E

I

K

A>

1290

1300

1310

1320

1330

1340

TAC

TCT

GAC ATG

GAA

GCT GGA

GGA

GGC

GGG TGG

ACA

ATT ATT

CAG

CGA CGT

GAG

GAT

GGC

Y

C

D M

E

A G

C

G

G W

T

I I

Q

R R

E

D

G>

1350

1360

1370

1380

1390

1400

*

AGC

GTT

GAT TTT

CAG

AGG ACT

TCG

AAA

GAA TAT

AAA

GTG GGA

TTT

GGT AAC

CCT

TCA

GGA

S

V

D F

0

R T

W

K

E Y

X

V G

F

G N

P

S

G>

1410

1420

1430

1440

1450

1460

GAA

TAT

TGG CTG

GGA

AAT GAG

TTT

GTT

TCG CAA

CTG

ACT AAT

CAG

CAA CGC

TAT

GTC

CTT

E

Y

w t

G

N E

F

V

S 0

L

T N

0

Q R

Y

V

L>

1470

1480

1490

1500

1510

1520

AAA

ATA

CAC CTT

AAA

GAC TGG

GAA

GGG

AAT CAG

GCT

TAC TCA

TTC

TAT GAA

CAT

TTC

TAT

K

I

H L

K

D W

E

G

N E

A

Y s

L

Y E

H

F

Y>

1530

1540

1SS0

1560

1570

1580

CTC

TCA

AGT GAA

GAA

CTC AAT

TAT

AGG

ATT CAC

CTT

AAA GGA

CTT

ACA GGG

ACA

GCC

GGC

L

s

S E

E

L N

Y

R

I H

L

K G

L

T G

T

A

G>

1590

1600

1610

1620

1630

1640

AAA

ATA

AGC AGC

ATC

AGC CAA

CCA

GGA

AAT GAT

TTT

AGC ACA

AAG

GAT GGA

GAC

AAC

GAC

K

I

Ξ S

1

S 0

P

G

N D

F

S T

K

D G

D

N

D>

1650

1660

1670

1680

1690

1700

AAA

TGT

ATT TGC

AAA

TGT TCA

CAA

ATC

CTA ACA

GGA

GGC TGG

TGG

TTT GAT

GCA

TGT

GCT

K

C

I C

K

C S

Q

M

L T

G

G W

W

F D

A

C

G>

1710

1720

1730

1740

1750

1760

•

CCT

TCC

AAC TTG

AAC

GGA ATG

TAC

TAT

CCA CAG

AGG

CAG AAC

ACA

AAT AAG

TTT

AAC

GGC

P

s

N L

N

G M

Y

P Q

R

0 N

T

N K

F

N

G>

1770

1780

Π90

1800

1810

1820

•

«

•

ATT

AAA

TGG TAC

TAC

TGG AAA

GGC

TCA

GGC TAT

TCG

CTC AAG

GCC

ACA ACC

ATG

ATG ,

ATC

I

X

W Y

Y

W K

G

s

G Y

S

L K

A

T T

M

I>

1830

1840

1850

1860

1870

1880

1890

1900

»

•

«

•

CGA

CCA

GCA GAT

TTC

TAAACATCCCAGTCCACCTGAGGAACTGTCTCGAACTATTTTCAAAGACTTAACCCCAGT

R

P

A D

F>

1910

1920

1930

1940

1950

1960

1970

1980

•

MGG

1990

2000

2010

2020

2030

204 0

2050

«

•

CCAGATTAGAGCCTCTAAACTTTATCACTTAAACTTGCATCACTTAACGGACCAAAGCAAGACCCTAAACATCCATAATT

2070	2080	2090	2100	2110	2120	2130	2140
•	•	•	•	•	•	•	4

gtgattagacagaacacctatccaaagatgaacccgaggctcacaatcagactgacagtttacagaccctgctgtcacaa

2150 2160 2170 2100 2190 2200 2210 2220 • ···««· ccaagaatcttatgtccaactttatcagtaaataactggaaaacagaacacttatcttatacaatacagatcatcttgga

2230 2240 2250 2260 2270 2280 • · * · · · actgcattcttctcagcactctttatacactgtgtaaatacccatatgtcctgaattc

184 642

FIG. 7 receptor

-TIE2-R >

Medium

Mock L1

L2

FIG. 6

Medium

20x Mock 20x L 2 + +

0.1 xL1 0.1 xL1 receptorTIE2-R >

A,-rJ > ' ·?.

ΑΜΑ £8.

184 642

SHEP nj

Ή

CJ

Π3

N •60 ^ΰ.5Ο rv* ^40

-C3 0 o

Ό nj2° ΧΛΑΐ,ο O +>

G ca o 5 O >i C 4J Ό Ai ω < -n

SKP

1-1

SHEP SWP

1-1 » 1-1 » rTIE2 tfkB

184 642

FIG. 10

a;

184 642

Fig. 1A ,

ciało receptora - Γ EHK-1 ecto/h lgG1 Fc pianka żelatynowa Gelfoam (θ *jg)

Fig. 1B

<

ciało receptora - r TIE-2 ecto / h IgG1 Fc pianka żelatynowa Celtami 6 pg)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2.
2. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2.
3. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2 o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na fig. 4 lub 5.
4. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2, i w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2.
5. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 4, znamienna tym, że kodująca antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2.
6. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2 posiadający sekwencję aminokwasową przedstawiona na fig. 6.
7. Wektor zawierający izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodującą ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo

184 642 (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2.
8. Wektor według zastrz. 7, znamienny tym, że zawarta w nim cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie związana z sekwencją kontrolującą ekspresję, zdolną do kierowania ekspresją w komórce gospodarza.
9. Wektor według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że stanowi go plazmid.
10. Plazmid według zastrz. 9, oznaczony symbolem pJFE14, kodujący ligand TIE-2 (numer akcesyjny ATCC 75910).
11. Plazmid według zastrz. 9, oznaczony symbolem pBluescript KS, kodujący ludzki ΊΊΕ-2 ligand 2 (numer akcesyjny ATCC 75963).
12. Wektor według zastrz. 1 albo 8, oznaczony symbolem kgtlO, kodujący hTIE-2 ligand 1 (numer akcesyjny ATCC 75928).
13. Izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig.4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną, który wiąże się z receptorem TIE-2.
14. Izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig.6 lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2.
15. Izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand ΊΊΕ-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzuj ącą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2.
16. Izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2.
17. Układ gospodarz-wektor do wytwarzania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, posiadającego sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig.4 lub 5, lub jej fragmentu lub pochodnej, który wiąże się z receptorem TIE-2 zawierający wektor obejmujący izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodującą ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2 w komórce gospodarza.

184 642
18. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 17, znamienny tym, że zawarta w tym wektorze cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie związana z sekwencją kontrolującą ekspresję, zdolną do kierowania ekspresją w komórce gospodarza.
19. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 17, znamienny tym, że wektorem jest plazmid.
20. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 19, znamienny tym, że plazmidem jest plazmid oznaczony symbolem pJFE14, kodujący ligand ΊΊΕ-2 (numer akcesyjny ATCC 75910).
21. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 19, znamienny tym, że plazmidem jest plazmid oznaczony symbolem pBluescript KS, kodujący ludzki TIE-2 ligand 2 (numer akcesyjny ATCC 75963).
22. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 17 albo 18, znamienny tym, że wektorem jest wektor oznaczony symbolem ZgtłO, kodujący h'flE-2 ligand 1 (numer akcesyjny ATCC 75928).
23. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 17, znamienny tym, że w układzie tym komórkę gospodarza stanowi komórka bakteryjna, drożdżową, owadzia albo ssacza.
24. Układ: gospodarz-wektor, według zastrz. 17 albo 18, albo 19, albo 20, albo 21, albo 23, znamienny tym, że w układ ten zawiera ponadto kwas nukleinowy kodujący receptor TIE-2.
25. Układ: gospodarz-wektor do wytwarzania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2, zawierający wektor obejmujący izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierającą region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2 w komórce gospodarza.
26. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 25, znamienny tym, że zawarta w tym wektorze cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie związana z sekwencją kontrolującą ekspresję, zdolną do kierowania ekspresją w komórce gospodarza.
27. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 25, znamienny tym, że wektorem jest plazmid.
28. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 27, znamienny tym, że plazmidem jest plazmid oznaczony symbolem pJFE14, kodujący ligand TIE-2 (numer akcesyjny ATCC 75910).
29. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 27, znamienny tym, że plazmidem jest plazmid oznaczony symbolem pBluescript KS, kodujący ludzki TIE-2 ligand 2 (numer akcesyjny ATCC 75963).
30. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 27, znamienny tym, że wektorem jest wektor oznaczony symbolem XgtlO, kodujący hTIE-2 ligand 1 (numer akcesyjny ATCC 75928).
31. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 25, znamienny tym, że w układzie tym komórkę gospodarza stanowi komórka bakteryjną drożdżową, owadzia albo ssacza.
32. Układ: gospodarz-wektor, według zastrz. 25 albo 26, albo 27, albo 28, albo 29, albo 30, znamienny tym, że układ ten zawiera ponadto kwas nukleinowy kodujący receptor TIE-2.
33. Układ: gospodarz-wektor do wytwarzania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, kodowanego przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo

184 642 (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TLE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2 zawierający wektor obejmujący izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand ΤΊΕ2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand ΤΊΕ-2 wiążący receptor TIE-2 w komórce gospodarza.
34. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 33, znamienny tym, że zawarta w tym wektorze cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie związana z sekwencją kontrolującą ekspresję, zdolną do kierowania ekspresją w komórce gospodarza.
35. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 33, znamienny tym, że wektorem jest plazmid.
36. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 35, znamienny tym, że plazmidem jest plazmid oznaczony symbolem pJFE14, kodujący ligand TIE-2 (numer akcesyjny ATCC 75910).
37. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 35, znamienny tym, że plazmidem jest plazmid oznaczony symbolem pBluescript KS, kodujący ludzki TIE-2 ligand 2 (numer akcesyjny ATCC 75963).
38. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 33 albo 34, znamienny tym, że wektorem jest wektor oznaczony symbolem XgtlO, kodujący hTIE-2 ligand 1 (numer akcesyjny ATCC 75928).
39. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 33, znamienny tym, że w układzie tym komórkę gospodarza stanowi komórka bakteryjna, drożdżowa, owadzia albo ssacza.
40. Układ: gospodarz-wektor, według zastrz. 33 albo 34, albo 35, albo 36, albo 37, albo 39, znamienny tym, że w układ ten zawiera ponadto kwas nukleinowy kodujący receptor TIE-2.
41. Układ: gospodarz-wektor do wytwarzania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, kodowanego przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2 zawierający wektor obejmujący izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand ΤΙΕ2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2 w komórce gospodarza.

184 642
42. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 41, znamienny tym, że zawarta w tym wektorze cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie związana z sekwencją kontrolującą ekspresję, zdolną do kierowania ekspresją w komórce gospodarza.
43. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 41, znamienny tym, że wektorem jest plazmid.
44. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 43, znamienny tym, że plazmidem jest plazmid oznaczony symbolem pJFE14, kodujący ligand TIE-2 (numer akcesyjny ATCC 75910).
45. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 43, znamienny tym, że plazmidem jest plazmid oznaczony symbolem pBluescript KS, kodujący ludzki TIE-2 ligand 2 (numer akcesyjny ATCC 75963).
46. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 41 albo 42, znamienny tym, że wektorem jest wektor oznaczony symbolem ZgtlO, kodujący hTIE-2 ligand 1 (numer akcesyjny ATCC 75928).
47. Układ: gospodarz-wektor według zastrz. 41, znamienny tym, że w układzie tym komórkę gospodarza stanowi komórka bakteryjna, drożdżowa, owadzia albo ssacza.
48. Układ: gospodarz-wektor, według zastrz. 41 albo 42, albo 43, albo 44, albo 45, albo 47, znamienny tym, że w układ ten zawiera ponadto kwas nukleinowy kodujący receptor ΊΊΕ-2.
49. Sposób wytwarzania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórek w układzie: gospodarz-wektor w warunkach pozwalających na wytwarzanie tego ligandu i odzyskuje się wytworzony ligand, przy czym ligand ten, posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2, a wektor w układzie gospodarz-wektor obejmuje izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodującą ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2 w komórce gospodarza.
50. Przeciwciało swoiście wiążące izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną wiążącą się z receptorem TIE-2.
51. Przeciwciało według zastrz. 50, znamienne tym, że stanowi go przeciwciało monoklonalne.
52. Przeciwciało swoiście wiążące izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną wiążącą się z receptorem TIE-2.
53. Przeciwciało według zastrz. 52, znamienne tym, że stanowi go przeciwciało monoklonalne.
54. Przeciwciało swoiście wiążące izolowany i o oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand ΊΊΕ-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2.

184 642
55. Przeciwciało według zastrz. 54, znamienne tym, że stanowi go przeciwciało monoklonalne.
56. Przeciwciało swoiście wiążące izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2.
57. Przeciwciało według zastrz. 56, znamienne tym, że stanowi go przeciwciało monoklonalne.
58. Ciało ligandu, które zawiera izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2.
59. Ciało ligandu według zastrz. 58, znamienne tym, że ligand TIE-2 ma sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4, 5 lub 6 i stały region immunoglobulinowy jest częścią Fc ludzkiej IgGl.
60. Koniugat zawierający ligand skoniugowany z środkiem cytotoksycznym, znamienny tym, że ligand stanowi izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2.
61. Koniugat według zastrz. 60, znamienny tym, że środkiem cytotoksycznym jest radioizotop albo toksyna.
62. Koniugat zawierający ligand skoniugowany z środkiem cytotoksycznym, znamienny tym, że ligand stanowi izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2.
63. Koniugat według zastrz. 62, znamienny tym, że środkiem cytotoksycznym jest radioizotop albo toksyna.
64. Koniugat zawierający ligand skoniugowany z środkiem cytotoksycznym, znamienny tym, że ligand stanowi izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2.
65. Koniugat według zastrz. 64, znamienny tym, że środkiem cytotoksycznym jest radioizotop albo toksyna.
66. Koniugat zawierający ligand skoniugowany z środkiem cytotoksycznym, znamienny tym, źe ligand stanowi izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

184 642 (a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand ΤΊΕ-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2.
67. Koniugat według zastrz. 66, znamienny tym, że środkiem cytotoksycznym jest radioizotop albo toksyna.
68. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną, który wiąże się z receptorem TIE-2 oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
69. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną, który wiąże się z receptorem TIE-2 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
70. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
71. Kompozycja farmaceutyczną znamienna tym, że zawiera izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2 w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
72. Kompozycja farmaceutyczną znamienna tym, że zawiera przeciwciało, korzystnie przeciwciało monoklonalne, swoiście wiążące izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
73. Kompozycja farmaceutyczną znamienna tym, że zawiera przeciwciało, korzystnie przeciwciało monoklonalne, swoiście wiążące izolowany i oczyszczony ligand TIE-2,.posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 łub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
74. Kompozycja farmaceutyczną znamienna tym, że zawiera przeciwciało, korzystnie przeciwciało monoklonalne, swoiście wiążące izolowany i o oczyszczony ligand TIE-2

184 642 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi (a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2, i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
75. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera przeciwciało, korzystnie przeciwciało monoklonalne, swoiście wiążące izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2, w której to cząsteczce sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor ΊΤΕ-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
76. Kompozycja farmaceutyczna znamienna tym, że zawiera ciało ligandu zawierające izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2, i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
77. Kompozycja według zastrz. 76, znamienna tym, że ligand TIE-2 ma sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4, 5 lub 6 i stały region immunoglobulinowy jest częścią Fe ludzkiej IgGl.
78. Kompozycja farmaceutyczna znamienna tym, że zawiera koniugat zawierający ligand skoniugowany z środkiem cytotoksycznym przy czym ligand stanowi izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną, który wiąże się z receptorem TIE-2, i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
79. Kompozycja według zastrz. 78, znamienna tym, że środkiem cytotoksycznym jest radioizotop albo toksyna.
80. Kompozycja farmaceutyczna znamienna tym, że zawiera koniugat zawierający ligand skoniugowany z środkiem cytotoksycznym przy czym ligand stanowi izolowany i oczyszczony ligand TIE-2, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną, który wiąże się z receptorem TIE-2 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
81. Kompozycja według zastrz. 80, znamienna tym, że środkiem cytotoksycznym jest radioizotop albo toksyna.
82. Kompozycja farmaceutyczna znamienna tym, że zawiera koniugat zawierający ligand skoniugowany z środkiem cytotoksycznym przy czym ligand stanowi izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5,

184 642 (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
83. Kompozycja według zastrz. 82, znamienna tym, że środkiem cytotoksycznym jest radioizotop albo toksyna.
84. Kompozycja farmaceutyczna znamienna tym, że zawiera koniugat zawierający ligand skoniugowany z środkiem cytotoksycznym przy czym ligand stanowi izolowany i oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2 w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
85. Kompozycja według zastrz. 84, znamienna tym, że środkiem cytotoksycznym jest radioizotop albo toksyna.
86. Zastosowanie przeciwciała, korzystnie przeciwciała monoklonalnego, specyficznie wiążącego izolowany o oczyszczony ligand TIE-2 kodowany przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2 do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie blokowania wzrostu naczyń krwionośnych u ssaków.
87. Zastosowanie według zastrz. 86, znamienne tym, że ssakiem jest człowiek.
88. Zastosowanie izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, posiadającego sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną, który wiąże się z receptorem TIE-2 do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie wspomagania neounaczynienia u ssaków.
89. Zastosowanie według zastrz. 88, do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie wspomagania leczenia zranień.
90. Zastosowanie według zastrz. 88, do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie leczenia ischemii.
91. Zastosowanie izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2 kodowanego przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5,

184 642 (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand ΉΕ-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2, do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie wspomagania neounaczynienia u ssaków.
92. Zastosowanie według zastrz. 91, do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie leczenia zranień.
93. Zastosowanie według zastrz. 91, do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie leczenia ischemii.
94. Zastosowanie przeciwciała, korzystnie przeciwciała monoklonalnego, zdolnego do specyficznego wiązania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, posiadającego sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2 do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie hamowania aktywności ligandu TIE-2 u ssaków.
95. Zastosowanie przeciwciała zdolnego do specyficznego wiązania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, posiadającego sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig.6 lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2 do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie hamowania aktywności ligandu TIE-2 u ssaków.
96. Zastosowanie przeciwciała zdolnego do specyficznego wiązania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2 kodowanego przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2, do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie hamowania aktywności ligandu TIE-2 u ssaków.
97. Zastosowanie przeciwciała zdolnego do specyficznego wiązania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2 kodowanego przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2 w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2, do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie hamowania aktywności ligandu TIE-2 u ssaków.
98. Zastosowanie według zastrz. 95, do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie hamowania aktywności ligandu TIE-2 u ssaków.
99. Zastosowanie według zastrz. 96, znamienne tym, że ssakiem jest człowiek.
100. Zastosowanie według zastrz. 99, do wytwarzania leku do zmniejszania lub zapobiegania wzrostowi guza u człowieka

184 642
101. Zastosowanie według zastrz. 97, do wytwarzania leku do hamowania aktywności ligandu TIE-2 u ssaków.
102. Zastosowanie według zastrz. 101, znamienne tym, że ssakiem jest człowiek.
103. Zastosowanie według zastrz. 102, do wytwarzania leku do zmniejszania lub zapobiegania wzrostowi guza u człowieka.
104. Sposób in vitro podtrzymywania w hodowli ekspresji receptora TIE-2 w komórce, znamienny tym, że dostarcza się do komórki z ekspresją receptora TIE-2 skuteczną ilość izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, posiadającego sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2.
105. Sposób według zastrz. 104, znamienny tym, że komórkę z ekspresją receptora TIE-2 stanowi komórka śródbłonka.
106. Sposób in vitro podtrzymywania w hodowli ekspresji receptora TIE-2 w komórce, znamienny tym, że dostarcza się do komórki z ekspresją receptora TIE-2 skuteczną ilość izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2 kodowanego przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteiyzującąsię tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2.
107. Sposób według zastrz. 106, znamienny tym, żejako komórkę z ekspresją receptora TIE-2 stosuje się komórkę śródbłonka.
108. Sposób identyfikacji antagonisty receptora TIE-2 znamienny tym, że kontaktuje się komórki, w których przebiega ekspresja receptora TIE-2 z:

a) badanym związkiem i

b) izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig.4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2, w warunkach pozwalających na wiązanie tego ligandu z receptorem i oznacza się, czy badany związek ma zdolność zaburzania wiązania ligandu z receptorem poprzez oznaczenie czy testowany związek obniża przeżycie komórki lub proliferację, transformację komórkową, zmienia wczesną indukcję genu lub fosforylację TIE-2.
109. Sposób identyfikacji antagonisty receptora TIE-2 znamienny tym, że kontaktuje się komórki, w których przebiega ekspresja receptora TIE-2 z:

a) badanym związkiem i;

b) izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2, w warunkach pozwalających na wiązanie tego ligandu z receptorem i oznacza się, czy badany związek ma zdolność zaburzania wiązania ligandu z receptorem poprzez oznaczenie czy testowany związek obniża przeżycie komórki lub proliferację, transformację komórkową, zmienia wczesną indukcję genu lub fosfory lację TIE-2.
110. Sposób identyfikacji antagonisty receptora TIE-2 znamienny tym, że kontaktuje się komórki, w których przebiega ekspresja receptora TIE-2 z:

a) badanym związkiem i;

b) izolowanym o oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

184 642 (a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje, w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2, w warunkach pozwalających na wiązanie tego ligandu z receptorem i oznacza się czy badany związek ma zdolność zaburzania wiązania ligandu z receptorem poprzez oznaczenie czy testowany związek obniża przeżycie komórki lub proliferację, transformację komórkową, zmienia wczesną indukcję genu lub fosforylację TIE-2.
111. Sposób identyfikacji antagonisty receptora TIE-2 znamienny tym, że kontaktuje się komórki, w których przebiega ekspresja receptora TIE-2 z:

a) badanym związkiem i;

b) izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2 w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2, w warunkach pozwalających na wiązanie tego ligandu z receptorem i oznacza się, czy badany związek ma zdolność zaburzania wiązania ligandu z receptorem poprzez oznaczenie czy testowany związek obniża przeżycie komórki lub proliferację, transformację komórkową, zmienia wczesną indukcję genu lub fosforylację TIE-2.
112. Ciało receptora, które wiąże się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2.
113. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ciało receptora wiążącego się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2.
114. Wektor zawierający izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ciało receptora wiążące się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig.4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-2.
115. Wektor według zastrz. 114, znamienny tym, że stanowi go plazmid.
116. Ciało receptora które wiąże się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną.
117. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ciało receptora wiążącego się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną.
118. Wektor zawierający izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ciało receptora wiążącego się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiada14

184 642 jącym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną który wiąże się z receptorem TIE-246.
119. Wektor według zastrz. 118, znamienny tym, że jest plazmidem.
120. Ciało receptora które wiąże się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym 'ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2.
121. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ciało receptora wiążącego się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2.
122. Wektor zawierający izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ciało receptora wiążącego się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ligand TIE-2, w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-2.
123. Wektor według zastrz. 122, znamienny tym, że stanowi go plazmid.
124. Ciało receptora które wiąże się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2 w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która

184 642 koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2.
125. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ciało receptora wiążącego się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2 w której to cząsteczce, sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2.
126. Wektor zawierający izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ciało receptora wiążącego się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2, w której to cząsteczce sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6.

(b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b), i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2.
127. Wektor według zastrz. 126, znamienny tym, że stanowi go plazmid.
128. Plazmid według zastrz. 127, oznaczony jako ciało receptora vTIE-2 (depozyt ATTC oznaczony jako VR 2484).
129. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera ciało receptora które wiąże się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 4 lub 5, lub jej fragment lub pochodną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
130. Kompozycja farmaceutyczną znamienna tym, że zawiera ciało receptora, które wiąże się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2, posiadającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 6 lub jej fragment lub pochodną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
131. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera ciało receptora, które wiąże się specyficznie z izolowanym o oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ligand TIE-2, w której to cząsteczce sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 4 albo na fig. 5, (b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego charakteryzującą się tym, że kodowany przez nią ligand TIE-2 stanowi agonistę TIE-23 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

184 642
132. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera ciało receptora które wiąże się specyficznie z izolowanym i oczyszczonym ligandem TIE-2 kodowanym przez izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje ligand TIE-2, w której to cząsteczce sekwencję kwasu nukleinowego stanowi:

(a) sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca region kodujący ludzki ligand TIE-2 przedstawiony na fig. 6.

(b) sekwencja kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w warunkach umiarkowanie ścisłych z sekwencją kwasu nukleinowego (a) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo (c) sekwencja kwasu nukleinowego, która w wyniku degeneracji kodu genetycznego powinna hybrydyzować z sekwencją kwasu nukleinowego (a) albo (b) i która koduje ligand TIE-2 wiążący receptor TIE-2, albo przez cząsteczkę kodującą antagonistę TIE-2 jako ligand TIE-2 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Ogólnie wynalazek należy do dziedziny inżynierii genetycznej a konkretnie do dziedziny genów dla receptorowych kinaz tyrozyno wy ch i pokrewnych z nimi ligandów, ich insercji do wektorów rekombinacyjnego DNA i do wytwarzania zakodowanych białek w szczepach mikroorganizmów biorcy i w eukariotycznych komórkach biorcy.

Szczegółowo niniejszy wynalazek dotyczy izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej ligand TIE-2, wektora zawierającego izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, układu gospodarz-wektor, sposobu wytwarzania izolowanego i oczyszczonego ligandu TIE-2, przeciwciała, ciała ligandu, koniugatu, kompozycji farmaceutycznej, zastosowania przeciwciała, zastosowania izolowanego i oczyszczonego ligandu, sposobu in vitro podtrzymywania w hodowli ekspresji receptora TIE-2, sposobu identyfikacji antagonisty receptora TIE-2, ciała receptora, izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej ciało receptora, wektora zawierającego izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą ciało receptora i kompozycji farmaceutycznej zawierającej ciało receptora

Ligandy TIE-2 oraz kodujące je kwasy nukleinowe mogą być użyteczne do diagnozowania i leczenia niektórych chorób, w których zaangażowane są komórki śródbłonkowe i związane z nimi receptoiy TIE, takich jak choroby na podłożu nowotworowym, obejmujące angiogenezę nowotworową gojenie się ran, choroby zakrzepowo-zatorowe, miażdżycowe stwardnienie naczyń i choroby zapalne. Ogólnie biorąc, biologicznie aktywne ligandy TIE-2 można stosować do pobudzania wzrostu, przeżywalności i/lub różnicowania się komórek, w których zachodzi ekspresja receptora TIE-2. Biologicznie aktywny ligand TIE-2 może być użyty do utrzymywania przy życiu komórek wytwarzających receptor TIE-2 w hodowli in vitro. Do komórek i tkanek, w których zachodzi ekspresja receptora TIE-2 należą przykładowo: komórki śródbłonkowe mięśnia sercowego i naczyń krwionośnych, śródbłonek soczewki oka i śródbłonek nasierdzia. Alternatywnie, taki ligand można użyć do wspomagania komórek modyfikowanych metodami inżynierii genetycznej tak, aby przebiegała w nich ekspresja receptora TIE-2. Ponadto, ligandy TIE-2 i spokrewniony z nimi receptor można stosować w układach analitycznych, do identyfikacji agonistów lub antagonistów receptora TIE-2.

Funkcje komórek odpowiedzialne za rozwój, utrzymywanie i reperacje zróżnicowanych komórek i tkanek są regulowane w ogromnej mierze przez sygnały międzykomórkowe przenoszone poprzez czynniki wzrostu i podobne ligandy i ich receptory. Receptory są zlokalizowane na powierzchni komórek odpowiadających. Wiążą one peptydy lub polipeptydy znane jako czynniki wzrostu oraz ligandy hormono-podobne. W wyniku tej interakcji następują szybkie zmiany biochemiczne w komórkach odpowiadających, a także, szybkie i długotrwałe regulowanie ekspresji komórkowego genu. Wiele receptorów związanych z różnymi powierzchniami komórkowymi może wiązać swoiste czynniki wzrostu.

184 642

Fosforylacja reszt tyrozynowych na białkach przez kinazy tyrozynowe jest jedną z kluczowych dróg przenoszenia sygnałów w poprzek błony plazmatycznej. Wiele znanych obecnie genów dla białka kinaz tyrozynowych koduje receptory transbłonowe dla polipeptydowych czynników wzrostu i hormonów, takichjak naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), insulina, insulino-podobny czynnik wzrostu-I (IGF-I), płytkowe czynniki wzrostu (PDGF-A i PDGF-B) i fibroblastowe czynniki wzrostu (FGF) opisane przez Heldin'a i wsp. (Celi Regulation, 1, 555-566, 1990) i Ullrich'a i wsp. (Celi 61, 243-54, 1990). W każdym przypadku, te czynniki wzrostu wywierają działanie poprzez wiązanie się z zewnątrzkomórkową częścią pokrewnych im receptorów, co prowadzi do aktywacji własnej kinazy tyrozynowej, występującej na cytoplazmatycznej części tego receptora. Przedmiotem szczególnego zainteresowania są receptory czynników wzrostu komórek śródbłonka z powodu możliwego udziału czynników wzrostu w wielu procesach ważnych z punktu widzenia fizjologicznego i patologicznego, takich jak rozwój układu naczyniowego, angiogeneza, miażdżycowe stwardnienie naczyń i choroby zapalne. (Folkman i wsp., Science, 235, 442-447, 1987). Kinazami tyrozynowymi są również receptory wielu krwiotwórczych czynników wzrostu. Należą do nich c-fins, który jest receptorem czynnika stymulującego kolonie 1 (Sherr i wsp.. Celi, 41, 665-676, 1985) i c-kit, receptor pierwotnego krwiotwórczego czynnika wzrostu opisanego przez Huang’a i wsp. (Celi 63, 225-33,1990).

Receptorowe kinazy tyrozynowe podzielono ewolucyjnie na podrodziny w oparciu o charakterystyczną strukturę ich domen zewnętrznych (Ulirich i wsp., Celi, 61, 243-54, 1990). Do tych podrodzin należą: receptor kinazy EGF-podobnej (podklasa I) i receptor kinazy insulino-podobnej (podklasa II), wszystkie zawierające powtarzające się homologiczne sekwencje bogate w cysteinę w domenach pozakomórkowych. Pojedynczy region bogaty w cysteinę znaleziono również w pozakomórkowych domenach kinaz eph-podobnych (Hirai i wsp., Science 238, 1717-1720, 1987; Linberg i wsp.. Mol. Celi. Biol. 10, 6316-24, 1990; Lhotak i wsp., Mol. Celi Biol. 11, 2496-2502, 1991). Receptory PDGF oraz receptorowe kinazy tyrozynowe c-fins i c-kit można zgrupować w podklasę III a receptory FGF w podklasę

IV. Typowe dla przedstawicieli tych dwóch ostatnich podklas są pozakomórkowe jednostki fałdujące, stabilizowane przez wewnątrzłańcuchowe wiązania dwusiarczkowe. Te, tak zwane fałdy immunoglobulino-podobne (Ig-podobne) znajdują się w białkach nadrodziny immunoglobin, w której występuje wiele różnych innych receptorów na powierzchniach komórkowych posiadających Ugandy albo związane z komórką albo rozpuszczalne (Williams i wsp., Ann. Rev. Immunol., 6, 381-405, 1988).

Receptorowe kinazy tyrozynowe różnią się pod względem swoistości i powinowactwa. W zasadzie, receptorowe kinazy tyrozynowe są glikoproteinami składającymi się z (1) domeny pozakomórkowej zdolnej do wiązania określonych czynników wzrostu, (2) domeny transbłonowej, która zwykle stanowi alfa-helikalną część tej proteiny, (3) domeny okołobłonowej, gdzie receptor może być regulowany przez np. fosforylację białka, (4) domeny kinazy tyrozynowej będącej składnikiem enzymatycznym receptora i (5) ogona karboksyterminalnego, który w wielu receptorach jest zaangażowany w rozpoznawanie i wiązanie substratów dla kinazy tyrozynowej.

Zostały opisane procesy takie jak alternatywne składanie egzonu i alternatywny dobór promotora genu albo miejsc poliadenylacji, dzięki czemu można wytwarzać wiele odrębnych polipeptydów z tego samego genu. Takie polipeptydy mogą zawierać albo nie zawierać tych różnych, wymienionych powyżej domen. W konsekwencji, pewne pozakomórkowe domeny mogąbyć wytwarzane jako odrębne białka wydzielane a niektóre formy receptorów mogą nie zawierać domeny kinazy tyrozynowej a posiadać jedynie domenę pozakomórkową wbudowaną w błonę plazmatyczną poprzez domenę transbłonową i krótki ogon C-terminalny.

Gen kodujący transbłonową kinazę tyrozynową komórek śródbłonka, po raz pierwszy zidentyfikowany w reakcji RT-PCR jako nieznany fragment cDNA homologiczny z kinazą tyrozynową z ludzkich komórek białaczkowych został opisany przez Partanen'a i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8913-8917, 1990). Ten gen i kodowane przez niego białko nazwano symbolem „tie, będącym skrótem określenia „kinaza tyrozynową z domenami homologii

184 642 z Ig i EOF (tyrosine kinase with Ig and EGF homology domains; Partanen i wsp. Mol. Cell Biol. 12,1698-1707, 1992).

Opisano, że tie mRNA występuje we wszystkich tkankach płodu ludzkiego i embrionu mysiego. W wyniku badań zlokalizowano informację tie do komórek śródbłonka serca i naczyń krwionośnych. Wykryto tie mRNA w śródbłonku naczyń krwionośnych i wsierdziu 9,5 - 18,5-dniowych embrionów mysich. Zwiększoną ekspresję tie zaobserwowano podczas unaczyniania związanego z rozwojem gruczołu jajnikowego i ziaminowania tkanki w skaleczeniach skóry (Korhonen i wsp., Blood 80, 2548-2555, 1992). Tak więc, uważa się, że tie odgrywa rolę w angiogenezie, co jest istotne dla opracowywania sposobów leczenia guzów nowotworowych oraz szeregu innych chorób zależnych od angiogenezy, takich jak retynopatia cukrzycowa, łuszczyca, miażdżycowe stwardnienie naczyń i zapalenie stawów.

Opisano dwa pokrewne strukturalnie białka receptora TIE szczura, kodowane przez odrębne geny o zbliżonych profilach ekspresji. Jeden z tych genów, określony terminem tie-1, jest szczurzym homologiem ludzkiego genu tie (Maisonpierre i wsp., Oncogene 8, 16311637, 1993). Drugi gen, tie-2, może być szczurzym homologiem genu tek gryzoni, który to gen, jak opisano, podobnie jak gen tie, podlega ekspresji w organizmie myszy wyłącznie w komórkach śródbłonka i w ich przypuszczalnych komórkach macierzystych (Dumont i wsp., Oncogene 8, 1293-1301, 1993). Wykazano, że obydwa te geny podlegają szerokiej ekspresji w komórkach śródbłonka tkanek embrionalnych i pourodzeniowych. Znaczne poziomy transkryptów tie-2 występują również w innych populacjach komórek embrionalnych, w tym w nabłonku soczewki oka, w nasierdziu i w regionach mezenchymy (Maisonpierre i wsp., Oncogene 8, 1631-1637, 1993).

Dominująca ekspresja receptora TIE w śródbłonku naczyń wskazuje na to, że TIE odgrywa rolę w rozwoju i utrzymaniu układu naczyniowego. Rola ta powinna dotyczyć determinacji, proliferacji i różnicowania się komórek śródbłonka a także ich migracji i modelowania elementów naczyniowych. Opublikowano prace, w których na podstawie badań embrionów mysich z niedoborem TIE-2 wykazano, że ma on znaczenie w rozwoju naczyń, zwłaszcza w powstawaniu sieci naczyniowej w komórkach śródbłonka (Sato T. N. I wsp., Naturę 376, 70-74, 1994). W dojrzałym układzie naczyniowym TIE może odgrywać rolę w utrzymywaniu przy życiu, prawidłowym funkcjonowaniu i odpowiadaniu na wpływy patogenów komórek śródbłonka.