PL185647B1 - Nowy inhibitor proteazy HIV i kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Nowy inhibitor proteazy HIV i kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number
PL185647B1
PL185647B1 PL94313871A PL31387194A PL185647B1 PL 185647 B1 PL185647 B1 PL 185647B1 PL 94313871 A PL94313871 A PL 94313871A PL 31387194 A PL31387194 A PL 31387194A PL 185647 B1 PL185647 B1 PL 185647B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
reaction
compound
acid
solution
cells
Prior art date
Application number
PL94313871A
Other languages
English (en)
Other versions
PL313871A1 (en
Inventor
Bruce A. Dressman
James E. Fritz
Marlys Hammond
William J. Hornback
Stephen W. Kaldor
Vincent J. Kalish
John E. Munroe
Siegfried Heinz Reich
John H. Tatlock
Timothy A. Shepherd
Michael J. Rodriguez
Louis N. Jungheim
Original Assignee
Agouron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agouron Pharma filed Critical Agouron Pharma
Publication of PL313871A1 publication Critical patent/PL313871A1/xx
Publication of PL185647B1 publication Critical patent/PL185647B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/28—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a non-condensed six-membered aromatic ring of the carbon skeleton
    • C07C237/42—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a non-condensed six-membered aromatic ring of the carbon skeleton having nitrogen atoms of amino groups bound to the carbon skeleton of the acid part, further acylated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/51—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C323/60—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton with the carbon atom of at least one of the carboxyl groups bound to nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/16—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/08—Indoles; Hydrogenated indoles with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
    • C07D211/04—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D211/06—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D211/36—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D211/60—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D213/36—Radicals substituted by singly-bound nitrogen atoms
    • C07D213/40—Acylated substituent nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/48—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/48—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C07D215/50—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen attached in position 4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
    • C07D217/02—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with only hydrogen atoms or radicals containing only carbon and hydrogen atoms, directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring; Alkylene-bis-isoquinolines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
    • C07D217/02—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with only hydrogen atoms or radicals containing only carbon and hydrogen atoms, directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring; Alkylene-bis-isoquinolines
    • C07D217/06—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with only hydrogen atoms or radicals containing only carbon and hydrogen atoms, directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring; Alkylene-bis-isoquinolines with the ring nitrogen atom acylated by carboxylic or carbonic acids, or with sulfur or nitrogen analogues thereof, e.g. carbamates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
    • C07D217/22—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring
    • C07D217/26—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/576—Six-membered rings
    • C07F9/62—Isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Other In-Based Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Hydrogenated Pyridines (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)
  • Optical Couplings Of Light Guides (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

1. Nowy inhibitor proteazy HTV, 2-[2'-hydroksy-3'-fenylotiometylo-4'-aza-5'-okso-5'- -(2"-metylo-3"-hydroksyfenylo)pentylo]dekahydroizochmolino-3-N-t-butylokarboksa- mid o wzorze 1 i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy inhibitor proteazy HIV odpowiedni do stosowania jako środek przeciwwirusowy oraz zawierająca go kompozycja farmaceutyczna.
Zespół nabytego upośledzenia odporności (AIDS) jest stosunkowo niedawno rozpoznaną chorobą. AIDS powoduje stopniowe załamanie układu odpornościowego oraz postępujące uszkodzenie ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Od momentu pierwszego rozpoznania choroby we wczesnych latach 1980-tych AIDS rozprzestrzenia się gwałtownie i obecnie osiąga rozmiary epidemii w obrębie stosunkowo ograniczonej części populacji. Intensywne badania doprowadziły do odkrycia czynnika odpowiedzialnego - ludzkiego retrowirusa T-limfotropowego (HTLV-III), teraz powszechnie określanego jako ludzki wirus upośledzenia odporności lub HTV.
HIV należy do klasy wirusów znanych jako retro wirusy. Genom retro wirusowy jest złożony z RNA, który przekształcany jest w DNA przez odwrotną transkrypcję. Następnie retrowirusowy DNA trwale integruje się w chromosomie komórki gospodarza i, wykorzystując procesy replikacyjne komórek gospodarza, produkuje nowe cząstki retrowirusa i infekcja przechodzi na inne komórki. Wydaje się, iż HIV ma szczególne powinowactwo do ludzkich komórek limfocytów T-4, które odgiywają życiową rolę w układzie odpornościowym. Zakażenie HIV tych białych krwinek niszczy tę populację białych krwinek i ewentualnie powoduje, że układ odpornościowy jest nieczynny i nieefektywny wobec różnych chorób oportunistycznych takich jak, miedzy innymi, pneumocystozowe zapalenie płuc, mięsak Kaposiego, nowotwór układu limfatycznego.
Aczkolwiek dokładny mechanizm powstawania i działania wirusa HIV nie jest zrozumiały, identyfikacja wirusa doprowadziła do pewnego postępu w zwalczaniu choroby. Na przykład znaleziono lek - azydo tymi dynę (AZT), skutecznie hamujący odwrotną transkrypcję genomu retro wirusowego wirusa HIV, co daje możliwość kontrolowania choroby, ale nie daje wyleczenia pacjentów dotkniętych AIDS. Trwają poszukiwania leków, które mogłyby leczyć lub przynajmniej poprawić stopień zwalczenia śmiertelnego wirusa HIV.
Replikację retrowirusową rutynowo cechuje potranslacyjna obróbka poliprotein, którą prowadzi kodowany przez wirusa enzym - proteaza HIV. W wyniku tej obróbki otrzymuje się dojrzałe polipeptydy, które następnie pomagają w tworzeniu się i funkcjonowaniu zakaźnego wirusa. Jeśli zatrzyma się ten proces obróbki molekularnej, wówczas nie zachodzi normalna produkcja HIV. Zatem inhibitory proteazy HIV mogą działać jako środki przeciw ΗΓν.
Proteaza HIV jest jednym z produktów translacji genu poi białka strukturalnego HIV. Ta retrowirusową proteaza rozszczepia specyficznie inne strukturalne poiipeptydy w oddzielnych miejscach uwalniając te świeżo aktywowane białka strukturalne i enzymy, czyniąc w ten sposób wirion zdolnym do replikacji. Hamowanie proteazy HIV przez skuteczne związki może zapobiegać prowirusowej integracji zakażonych limfocytów T podczas wczesnej fazy cyklu życiowego HIV-1 oraz hamować wirusową obróbkę proteolityczną w późniejszym stadium. Ponadto
185 647 inhibitory proteazy mają tę zaletę, że są łatwiej dostępne, są dłużej trwałe w wirusach i są mniej toksyczne niż dostępne obecnie leki, prawdopodobnie dzięki swoistości wobec proteazy retrowirusowej.
Nowy inhibitor według wynalazku może hamować i/lub blokować aktywność proteazy HIV i zatrzymuje proliferację wirusa HIV.
Związek według wynalazku i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole hamują proteazę kodowaną przez ludzki wirus upośledzenia odporności (HTV) typ 1 (HTV-1) lub typ 2 (HTV-2). Związki te są użyteczne w leczeniu zakażenia HIV i leczeniu nabytego zespołu upośledzenia odporności (AIDS). Związek, jego farmaceutycznie dopuszczalne sole i zawierające je kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być stosowane same lub w kombinacji z innymi środkami przeciwwirusowymi, immunomodulatorami, antybiotykami lub szczepionkami.
Nowy Inhibitor proteazy HIV według wynalazku stanowi 2-[2'-hydroksy-3'-fenylotiometylo-4'-aza-5'-okso-5'-(2-metylo-3-hydroksyfenyło)pentylo]dekahydroizochinolino-3-N-t-butylokarboksamid o wzorze 1
VI2-Λ i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole, zwłaszcza sól kwasu metanosulfonowego.
Wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznej zawierającej jako substancję czynną skuteczną ilość związku o wzorze (1) lub jego farmaceutycznie dopuszczalnych soli, w kombinacji z farmacuetycznie dopuszczalnym nośnikiem, takim jak rozcieńczalnik lub zaróbka.
Nowe inhibitory proteazy HIV oraz zawierające je kompozycje farmaceutyczne według wynalazku są użyteczne do hamowania proteazy HIV, który jest enzymem związanym z produkcją i składaniem składnika wirusowego oraz do leczenia AIDS.
Sposób leczenia polega na podawaniu gospodarzowi lub pacjentowi skutecznej ilości związku o wzorze (1) lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, ewentualnie w postaci kompozycji farmaceutycznej.
Określenie „skuteczna ilość” oznacza ilość związku o wzorze (1) lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, która jest skuteczna w hamowaniu produkcji i składania składnika wirusowego, w których bierze udział proteaza HIV. Konkretna dawka związku według wynalazku podawana w celu uzyskania efektów terapeutycznych lub hamujących, będzie oczywiście zależeć od konkretnych okoliczności związanych z danym przypadkiem, na przykład od podawanego związku, sposobu podawania, stanu, który ma być leczony i stanu zdrowia leczonego gospodarza lub pacjenta. Przykładowa dawka dzienna (podawana w dawce pojedynczej lub w dawkach podzielonych) kształtuje się na poziomie od około 0,01 mg/kg do około 50 mg/kg wagi ciała związku według wynalazku. Korzystnie dawka dzienna zazwyczaj wynosi od 0,05 mg/kg do około 20 mg/kg, a bardziej korzystnie od około 0,1 mg/kg do około 10 mg/kg.
Związki według wynalazku podawać można w różny sposób, łącznie z podawaniem doustnym, doodbytniczym, przezskómymi, podskórnym, dożylnym, domięśniowym lub donosowym. Korzystnie związki według wynalazku przed podawaniem formułuje się w postać kompozycji farmaceutycznych. Tak więc, następnym aspektem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna lub preparat zawierający skuteczną ilość związku o wzorze (1) lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, takim jak rozcieńczalnik lub zaróbka.
185 647
Korzystnie składnik aktywny stanowi od 0,1% do 99,9% wagowych kompozycji. Przez określenie „farmaceutycznie dopuszczalny” należy rozumieć, że nośnik, taki jak rozcieńczalnik lub zaróbka, jest kompatybilny z innymi składnikami kompozycji i nieszkodliwy dla gospodarza lub pacjenta.
Ze związków według wynalazku kompozycje farmaceutyczne wytwarzać można znanymi sposobami i stosując łatwo dostępne składniki. Zazwyczaj, wytwarzając kompozycje według niniejszego wynalazku, składnik aktywny miesza się z nośnikiem, lub rozcieńcza za pomocą nośnika, lub zamyka się w nośniku, który może być w postaci kapsułki, saszetki, bibułki lub innego odpowiedniego pojemnika. Gdy nośnik służy jako rozcieńczalnik, może nim być stały, półstały lub ciekły materiał, który pełni rolę nośnika, zarobki lub ośrodka dla składnika aktywnego. Tak więc, kompozycje mogąbyć w postaci tabletek, pigułek, proszków, pastylek do ssania, saszetek, opłatków, eliksirów, zawiesin, emulsji, roztworów, syropów, aerozoli (w postaci stałej lub w ciekłym ośrodku), maści (zawierających, na przykład do 10% wagowych składnika aktywnego), miękkich i twardych kapsułek żelatynowych, czopków, sterylnych roztworów do wstrzyknięć, sterylnie pakowanych proszków i tym podobnych.
Przykłady kompozycji podano w dalszej części opisu jedynie w celu ilustracyjnym i bez zamiaru ograniczania zakresu wynalazku.
Związek według wynalazku zawiera centra asymetryczne oznaczone kropkami we wzorze 1.
W związku z tymi asymetrycznymi centrami związek według wynalazku może występować w jednej z możliwych postaci stereoizomerycznych i może być stosowany w mieszaninach stereoizomerów, które mogąbyć optycznie czynne lub racemiczne lub mogąbyć stosowane pojedynczo jako zasadniczo czyste stereoizomery, tj. o czystości co najmniej 95%. Wszystkie postaci asymetryczne, pojedyncze stereoizomery i ich kombinacje, wchodzą w zakres wynalazku.
Pojedyncze stereoizomery można wytwarzać z ich odpowiednich prekursorów, stosując procedury' opisane poniżej, przeprowadzając rozszczepienie mieszanin racemicznych lub rozdzielenie diastereoizomerów. Rozszczepienie można przeprowadzić w obecności czynnika rozszczepiającego, metodą chromatografii lub przez wielokrotną krystalizację bądź stosując pewne znane kombinacje tych technik. Dalsze szczegóły dotyczące rozszczepienia można znaleźć w Jacgues i in., Enantiomers, Racemates, and Resolutions, John Wiley & Sons 1981.
Korzystnie, związek według wynalazku jest zasadniczo czysty, tj. ma czystość powyżej 50%. Bardziej korzystnie, stopień czystości związku wynosi co najmniej 75%, szczególnie korzystnie więcej niż 90%. Szczególnie korzystnie związek ma czystość co najmniej 95%, korzystnie co najmniej 97%, a najkorzystniej co najmniej 99%.
Jak wspomniano powyżej, wynalazek obejmuje farmaceutycznie dopuszczalne sole związku o wzorze 1. Związek według wynalazku może być wystarczająco kwasowy, wystarczająco zasadowy lub może mieć obie grupy funkcyjne i może odpowiednio reagować z nieorganicznymi lub organicznymi zasadami i kwasami, tworząc farmaceutycznie dopuszczalną sól.
Stosowany tu termin „sól farmaceutycznie dopuszczalna” dotyczy soli związków o powyższym wzorze 1, które są zasadniczo nietoksyczne wobec żywych organizmów. Przykładowe sole farmaceutycznie dopuszczalne obejmują sole wytworzone przez reakcje związku według wynalazku z kwasem nieorganicznym lub organicznym lub z zasadą nieorganiczną. Reagenty zwykle łączy się we wspólnym rozpuszczalniku, takim jak eter dietylowy lub benzen, gdy wytwarza się sole addycyjne z kwasem, albo woda lub alkohole, gdy wytwarza się sole addycyjne z zasadami. Sole zwykle wytrącają się z roztworu w czasie od około 1 godziny do około 10 dni i można je wydzielić przez filtrację lub innymi konwencjonalnymi metodami. Takie sole są znane jako sole addycyjne z kwasem i sole addycyjne z zasadą.
Kwasami, które można stosować do wytworzenia soli addycyjnych, są kwasy nieorganiczne, takie jak kwas solny, kwas bromowodorowy, kwas jodowodorowy, kwas siarkowy, kwas fosforowy, i tym podobne, oraz kwasy organiczne, takie jak p-toluenosulfonowy, metanosulfonowy, szczawiowy, p-bromofenylosulfonowy, węglowy, bursztynowy, cytrynowy, benzoesowy, octowy, i tym podobne.
Przykładami farmaceutycznie dopuszczalnych soli są siarczan, pirosiarczan, wodorosiarczan, siarczyn, wodorosiarczyn, fosforan, monowodorofosforan, diwodorofosforan, metafosforan, pirofosforan, chlorek, bromek, jodek, octan, propionian, dekanian, kaprylan, akrylan,
185 647 mrówczan, izomaślan, kapronian, heptanian, propiolan, szczawian, malonian, bursztynian, suberynian, sebacynian, fumaran, maleinian, butyno-l,4-dioanian, heksyno-l,6-dioanian, benzoesan, chlorobenzoesan, metylobenzoesan, dinitrobenzoesan, hydroksybenzoesan, metoksybenzoesan, ftalan, sulfonian, ksylenosulfonian, fenylooctan, fenylopropionian, fenylomaślan, cytrynian, mleczan, g-hydroksymaślan, glikolan, winian, metanosulfonian, propanosulfonian, naftaleno-1-sulfonian, naftałeno-2-sulfonian, migdalan, i tym podobne.
Korzystnymi farmaceutycznie dopuszczalnymi solami z kwasami są sole utworzone z kwasami mineralnymi, takimi jak kwas solny i bromowodorowy, i sole utworzone z kwasami organicznymi, takimi jak kwas maleinowy i metanosulfonowy.
Sole addycyjne z zasadami obejmują sole utworzone z zasadami nieorganicznymi i organicznymi, takie jak wodorotlenki, węglany i wodorowęglany amonowe, metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych, i tym podobne. Zasady, które nadają się do wytwarzania soli według wynalazku, obejmują wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek amonu, węglan potasu, węglan sodu, wodorowęglan sodu, wodorowęglan potasu, wodorotlenek wapnia, węglan wapnia i tym podobne. Szczególnie korzystne są sole potasowe i sodowe.
Charakter przeciwjonu tworzącego część soli według wynalazku nie jest krytyczny o ile sól jako całość jest farmakologicznie dopuszczalna i o ile przeciwjon nie nadaje soli jako całości niepożądanych cech.
Korzystnym związkiem według wynalazku jest 2-[2’hydroksy-3’ -fenylotiometylo-4'-aza-5'-okso-5'-(2-metylo-3-hydroksyfenylo)pentylo]dekahydroizochmolino-3-N-t-butylokarboksamid w postaci soli kwasu metanosulfonowego o wzorze 3:
Każdy z powyższych wzorów ma pięć centrów asymetrycznym, określa zatem związek wybrany z grupy pojedynczych stereoizomerów i mieszaniny dwu lub więcej stereoizomerów.
Korzystnymi stereoizomerami tych związków są:
[3S-(3R*, 4aR*, 8aR*, 2'S*, 3'S*)]-2-[2'-hydroksy-3'-fenylotiometylo-4'-aza-5'-okso-5'-(2-metylo-3-hydroksyfenylo)pentylo]dekahydroizochinolino-3-N-t-butylokarboksamid:
[3S-(3R*,4aR*,8aR*,2'S*,3'S*)]-2-[2'-hydroksy-3'-fenylo-tiometylo-4'-aza-5'-okso-5'-(2-metylo-3-hydroksyfenylo)pentylo]dekahydroizochinolino-3-N-t-butylokarboksamid jako sól kwasu metanosulfonowego:
185 647
Związek według wynalazku wytworzyć można zgodnie z następującą Reakcją I. Ręąkcjąl
(IB) (IA)
Wzór 1
Reakcja I jest standardową reakcją sprzęgania powszechnie stosowaną w syntezie amidów lub peptydów, którą przeprowadza się przez poddanie reakcji odpowiednio podstawionej aminy o wzorze IA z odpowiednio podstawionym kwasem karboksylowym o wzorze IB, w aprotonowym rozpuszczalniku lub w mieszaninie rozpuszczalników. Reakcję typowo prowadzi się w obecności bądź w nieobecności, korzystnie w obecności, środka promującego i reagentu sprzęgającego. Typowym aprotonowym rozpuszczalnikiem w tej reakcji jest tetrahydrofuran lub dimetyloformamid lub ich mieszanina. Reakcję typowo prowadzi się w temperaturze od około 30°C do około 25°C. Reagent aminowy zwykle stosuje się w równomolowych ilościach w sto,,, ------:>>.· ----__;--ouiiAu u-u icagciiia Kwaouwvgu, w vucvnuoti iuwlimaiiuiuwcj ιινουι uu iucwicimc^u iiauuuaiu reagentu sprzęgającego. Typowe reagenty sprzęgające obejmują karbodiimidy, takie jak dicykloheksylokarbodiimid (DCC) i Ν,Ν'-dietylokarbodimid, imidazole, takie jak karbonylodiimidazol oraz reagenty takie jak chlorek bis(2-okso-3-oksazolidynylo)fosfinowy (BOP-Cl) lub N-etoksykarbonylo-2-etoksy-l,2-dihydrochinolina (EEDQ). Korzystnym reagentem sprzęgającym w tej reakcji jest DCC. W reakcji tej korzystnie stosuje się czynnik promujący; korzystnym czynnikiem promującym jest hydrat hydroksybenzotriazolu (HOBT-H2O).
185 647
Po zakończeniu reakcji związek można wydzielić, w razie potrzeby, sposobami znanymi w technice, np. związek można wykrystalizować i następnie zebrać przez filtrację, bądź można usunąć stosowany w reakcji rozpuszczalnik przez ekstrakcję, odparowanie lub dekantację. Związek można jeszcze dalej oczyszczać, w razie potrzeby, zwykłymi metodami, takimi jak krystalizacja lub chromatografia na stałych podłożach, takich jak żel krzemionkowy lub tlenek glinu.
Związki wyjściowe o wzorze IA można wytwarzać zgodnie z procedurą przedstawioną na Schemacie Reakcji A.
SCHEMAT REAKCJI A A Δ.. ^5.0 A0 1. Aktywacja kwasu _______
Wytwarzani
UH 3. H-27. Rediikcja 5 mocna zasada Γ M J H 6 0 J© (ciepło) 7 _odblokowanie 0 n X^ zz Η 1 1 OH c0i < 1 Λ X<j ^SPh o OH ^SPh 0^^ (IA)
185 647
Na powyższym Schemacie VA oznacza grupę ochronną grupy aminowej; Q3 oznacza grupę SPh, a ZZ oznacza chlorowiec.
Powyższy Schemat Reakcji A obejmuje 1-7 reakcji przeprowadzonych w określonym porządku. Po zakończeniu każdej reakcji, związek przejściowy można wydzielić, w razie potrzby, sposobami znanymi w technice, np. związek można wykrystalizować i następnie zebrać przez filtrację, bądź można usunąć stosowany w reakcji rozpuszczalnik przez ekstrakcję, odparowanie lub dekantację. Związek można jeszcze dalej oczyszczać, w razie potrzeby, zwykłymi metodami, takimi jak krystalizacja lub chromatografia na stałych podłożach, taki jak żel krzemionkowy lub tlenek glinu, przed prowadzeniem następnego etapu według schematu reakcji.
Reakcję A.I przeprowadza się przez przekształcenie kwasu karboksylowego z chronioną grupą aminową o strukturze:
OH w odpowiedni mieszany bezwodnik w warunkach znanych w technice. Przykładowo, kwas karboksylowy z chronioną grupą aminową można poddać reakcji z chloromrówczanem C|-Cfi alkilu, takim jak chloromrówczan izobutylu, korzystnie w obecności zmiatacza kwasu. Korzystnymi zmiataczami kwasu są trialkiloaminy, korzystnie trietyloamina. Reakcję typowo prowadzi się w aprotnowym rozpuszczalniku, takim jak octan etylu. Wybór rozpuszczalnika nie jest krytyczny, dopóki stosowany rozpuszczalnik jest obojętny w stosunku do zachodzących reakcji, a reagenty są wystarczająco rozpuszczalne aby zaszła żądana reakcja. Wytworzony mieszany bezwodnik korzystnie stosuje się w reakcji A.2 bez wydzielania lub dalszego oczyszczania.
Reakcję A.2 przeprowadza się w dwóch etapach. W pierwszym etapie roztwór wodorotlenku sodu, pokryty warstwą rozpuszczalnika eterowego, korzystnie eteru dietylowego, poddaje się reakcji z dużym nadmiarem N-metylo-N-nitro-N-nitrozoguanidyny i wytwarza się reagent diazometanowy. Wodorotlenek sodu korzystnie stosuje się jako wodny roztwór o stężeniu 4-6 moli/1. Gdy reakcja jest zasadniczo zakończona, warstwę organiczną suszy się nad środkiem suszącym, takim jak wodorotlenek potasu. Roztwór następnie poddaje się reakcji zmieszanym bezwodnikiem z reakcji A.I, jak powyżej, i wytwarza się odpowiedni związek α-diazokarbonylowy. Reagent diazometanowy korzystnie stosuje się w tej reakcji bez wydzielenia lub oczyszczania. Reakcję typowo prowadzi się w temperaturze od około -50°C do około -10°C, korzystnie około -20°C.
W reakcji A.3 związek α-diazokarbonylowy wytworzony w reakcji, A.2 poddaje się reakcji z kwasem o wzorze H-ZZ, w którym ZZ oznacza chlorowiec, typowo w aprotonowym rozpuszczalniku, takim jak eter dietylowy, i wytwarza się związek a-chlorowcokarbonylowy. Korzystnym reagentem kwasowym jest kwas solny, który umożliwia wytwarzanie odpowiedniego związku α-chlorokarbonylowego. Reakcję typowo prowadzi się w temperaturze od około -30°C do około 0°C. Wybór rozpuszczalnika nie jest krytyczny, dopóki stosowany rozpuszczalnik jest obojętny w stosunku do zachodzących reakcji, a reagenty są wystarczająco rozpuszczalne aby zaszła żądana reakcja.
Reagent kwasowy typowo dodaje się w postaci bezwodnego gazu małymi porcjami aż reakcja zasadniczo zajdzie całkowicie. Reakcję można śledzić metodą chromatografii cienkowarstwowej .
W reakcji A.4 resztę karbonylową w związku wytworzonym w reakcji A.3 redukuje się w standardowych warunkach znanych w technice i wytwarza się odpowiedni a-chlorohydroksyzwiązek. Na przykład, związek wytworzony w reakcji A.3 łączy się ze środkiem redukującym w mieszaninie rozpuszczalników. Typowe środki redukujące obejmują borowodorek
185 647 sodu, borowodorek litu, borowodorek cynku, wodorek diizobutyloglinu i wodorek sodowo-bis(2-metoksy-etoksy)glinowy. Korzystnym środkiem redukującym jest borowodorek sodu. Typowe mieszaniny rozpuszczalników obejmują mieszaniny rozpuszczalników protonowych i aprotonowych, takie jak tetrahydrofuran/woda. Wybór rozpuszczalnika nie jest krytyczny, dopóki stosowany rozpuszczalnik jest obojętny w stosunku do zachodzących reakcji, a reagenty są wystarczająco rozpuszczalne aby zaszła żądana reakcja. Reakcję typowo prowadzi się w temperaturze od około -10°C, korzystnie około 0°C.
W reakcji A. 5 na α-chlorohydroksyzwiązek wytworzony w reakcji A.4 działa się mocną zasadą i otrzymuje się odpowiedni związek epoksydowy w standardowych warunkach znanych w technice. Na przykład α-chlorohydroksyzwiązek można poddać reakcji z mieszaniną wodorotlenku potasu i etanolu w alkoholowym rozpuszczalniku, takim jak etanol. Reakcję typowo prowadzi się w temperaturze od około 0°C do temperatury zbliżonej do temperatury wrzenia rozpuszczalnika. Korzystnie reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej.
W reakcji A. 6 związek epoksydowy wytworzony w reakcji A.5 poddaje się reakcji z reagentem heterocyklicznym:
typowo w rozpuszczalniku alkoholowym, w temperaturze typowo od około 20°C do 100°C. Wybór rozpuszczalnika nie jest krystaliczny, dopóki stosowany rozpuszczalnik jest obojętny w stosunku do zachodzących reakcji, a reagenty są wystarczająco rozpuszczalne aby zaszła żądana reakcja. Typowe rozpuszczalniki dla tej reakcji obejmują alkohole, korzystnie izopropanol lub etanol. Reakcję korzystnie prowadzi się w temperaturze około 80°C.
Reakcja A.7 jest standardową reakcją usuwania grupy chroniącej grupę aminową z użyciem procedur i metod znanych w technice, w której otrzymuje się odpowiednią aminę, stosowaną w powyższej Reakcji I. Aminę tę można poddać reakcji bez oczyszczania ale korzystnie najpierw się ją oczyszcza.
Związki o wzorze IA typowo wytwarza się przez przeprowadzenie najpierw reakcji seryny z chronioną grupą aminową z trifenylofbsfiną i dietyloazodikarboksylanem (DEAD) w aprotonowym rozpuszczalniku w temperaturze od około -80°C do 0°C, w której wytwarza się odpowiedni β-lakton. Reakcję typowo prowadzi się w eterze, takim jak tetrahydrofuran, w temperaturze od około -80°C do -50°C. Następnie otwiera się pierścień laktonowy i powstaje związek o strukturze:
przez typową reakcję laktonu z odpowiednio podstawionym tioanionem o wzorze -S-aryl. Związek tioanionowy korzystnie wytrwarza się przez reakcję odpowiedniego tiolu z mocną zasadą, taką jak wodorek sodu lub wodorek potasu. Tę reakcję typowo prowadzi się w aprotonowym rozpuszczalniku w temperaturze od około 0°C do około 40°C, w obojętnej atmosferze, takiej jak azot. Typowe rozpuszczalniki dla tej reakcji obejmują etery, korzystnie tetrahydrofuran.
185 647
Alternatywnie, związki o wzorze IA można wytwarzać według procedur opisanych w Photaki, JACS, 85,1123 (1963) 1 N.A. Sauaki i in., Tetrahedron Letters, 28,6069 (1987). Na przykład, związki można wytwarzać przez reakcję podwójnie chronionej seryny (z chronioną grupą karboksylową i aminową) z chlorkiem toluenosulfonylu w obecności dimetyloaminopirydyny (DMAP) i zmiatacza kwasu, takiego jak pirydyna w aprotonowym rozpuszczalniku, takim jak chlorek metylenu, z wytworzeniem toluenosulfonianu, który następnie można poddać reakcji z odpowiednio podstawionym tioanionem o struktrze -S-aryl. Tioanionowy związek korzystnie wytwarza się przez reakcję odpowiedniego tiolu z mocną zasadą, jak opisano powyżej. Grupę ochronną grupy karboksylowej można usunąć z wytworzonej arylotioalaniny z podwójną ochroną, stosując warunki znane w technice.
Heterocykliczny reagent o wzorze
stosowany w reakcji A.6, można wytworzyć stosując procedury i metody znane w technice. Przykładowo, reagenty heterocykliczne wytworzono z odpowiednich aminokwasów z chronioną grupą aminową przez aktywację kwasu i następnie działanie alkiloaminą, Reakcję tę typowo prowadzi się w obecności zmiatacza kwasu, takiego jak N-metylomorfolina. Następnie, po usunięciu grupy ochronnej dla grupy aminowej standardowymi metodami usuwania grup ochronnych, otrzymuje się żądane reagenty heterocykliczne. Konkretnie [3S-(3R*,4aR*,8aR*)]-dekahydroizochinolino-3-N-t-butylokarboksamid wytworzono stosując kwas 2S-l,2,3,4-tetrahydro-3-izochinolinokarboksylowy zgodnie z następującą procedurą:
1) ochrona grupy aminowej (t-Boc);
2) aktywacja kwasu/reakcja z t-butyloaminą;
3) katalityczne uwodornienie;
4) usunięcie ochrony grupy aminowej.
Kwas karboksylowy o wzorze (IB)
OH
O (IB) stosowany w reakcji według Reakcji I, jeśli nie jest dostępny w handlu, może być wytworzony znanymi metodami. Reagent ten można wytworzyć przez dalsze podstawienie i/lub utlenienie dostępnego w handlu związku karbocyklicznego. Na przykład związki karbocykliczne o wzorze
OH || ó
O
185 647 można utlenić stosując procedury znane w technice. Związek ten można poddać reakcji ze środkiem utleniającym, takim jak ditlenek selenu lub nadmanganian potasu, w temperaturze od około 0°C do 200°C, w obojętnym rozpuszczalniku takim jak woda lub eter difenylowy.
Druga metoda wytwarzania związków o wzorze (IB) obejmuje wprowadzenie grupy ochronnej dla grupy karboksylowej w odpowiednio podstawionej karboksylowanej karbocyklicznej grupie i następnie dalsze wprowadzenie podstawników w grupie karbocyklicznej sposobami znanymi w technice. Grupę ochronną dla grupy karboksylowej można następnie usunąć stosując znane sposoby i otrzymuje się żądany kwas karboksylowy o wzorze (IB).
Stosowany tu termin „grupa ochronna dla grupy karboksylowej” odnosi się do podstawników grupy karboksylowej zwykle stosowanych do zablokowania lub ochrony funkcji karboksylowej podczas reakcji innych grup funkcyjnych w związku. Przykłady takich grup ochronnych dla grupy karboksylowej obejmują metyl, p-nitrobenzyl, p-metylobenzyl, p-metoksybenzyl, 3,4-dimetoksybenzyl, 2,4-dimetoksybenzyl, 2,4,6-trimetoksybenzyl, 2,4,6-t-rimetylobenzyl, pentametylobenzyl, 3,4-metylenodioksybenzyl, benzhydryl, 4,4'-dimetoksybenzhydryl, 2,2',4,4'-tetrametoksybenzhydryl, t-butyl, t-amył, trityl, 4-metoksytrityl, 4,4'-dimetoksytrityl, 4,4',4-trimeto-ksytrityl, 2-fenyloprop-2-yl, trimetylosilil, t-butylodimetylosilil, fenacyl, 2,2,2-trichloroetyl, b-(di(n-butylo)metylosililo)etyl, p-toluenosulfonyloetył, 4-nitrobenzylosulfonyletyl, allil, cynamyl, l-(trimetylosililometylo)prop-l-en-3-yl, i tym podobne grupy.
Korzystny sposób ochrony grupy karboksylowej obejmuje przeprowadzenie reszty karboksylowej w amidową i potem hydrolizę amidu w celu uzyskania żądanego podstawniku karboksylowego. Inne przykłady takich grup można znaleźć w książkach E: Haslarn, „Protective Groups in Organie Chemistry”, wyd. J.G.W. McOmie, Plenum Press, Nowy Jork, N.Y., 1973, rozdział 5 i T.W. Greene,,,Protective Groups in Organie synthesis” John Wiley and Sons, Nowy Jork, N. Y., 1981, rozdział 5. ' ' ' '
Korzystna procedura wprowadzenia ochrony reszty karboksylowej obejmuje aktywację kwasu i utworzenie następnie amidu. Przykładowo, ugrupowanie karboksylowe można przekształcić w halogenek acylowy, bezwodnik acylowy, acyloimidazol itp., korzystnie w obecności zmiatacza kwasu i uzyskuje się wówczas aktywowaną resztę karboksylową. Typowo stosuje się dostępny w handlu chlorek kwasowy obchodząc w ten sposób potrzebę dalszej aktywacji kwasu. Korzystnymi zmiataczami kwasu są trialkiloaminy, korzystnie trietyloaminy. Reakcję typowo prowadzi się w apro tonowym rozpuszczalniku, takim jak eter diety Iowy, chlorek metylenu lub podobne. Korzystnym rozpuszczalnikiem jest chlorek metylenu. Wybór rozpuszczalnika nie jest krytyczny, dopóki stosowany rozpuszczalnik jest obojętny w sto-sunku do zachodzących reakcji, a reagenty są wystarczająco rozpuszczalne aby zaszła żądana reakcja. Aktywowane ugrupowanie karboksylowe poddaje się następnie reakcji z aminą, R-NH2, np. z aniliną, w aprotonowym rozpuszczalniku, i otrzymuje się reagent amidowy
OH
CjC-NH-ιτ1 o który może być dalej podstawiony znanymi sposobami.
Reagent amidowy może być jeszcze dalej podstawiony przez orto-deprotonowanie grupy
OH
185 647 z wytworzeniem odpowiedniego anionu i dalej reakcję z różnymi reagentami, takimi jak halogenki alkilu lub środki chlorowcujące takie jak brom. Reagent amidowy zwykle jest deprotonowany dwukrotnie z użyciem dwóch równoważników mocnej zasady takiej jak n-butylolit lub sec-butylolit, w stosunku do tego reagenta, ewentualnie w obecności środka koordynującego metal, takiego jak tetrametyloetylenodiamina (TMEDA). Reakcję zwykle prowadzi się w aprotonowym rozpuszczalniku, korzystnie w eterze, takim jak dietyloeter, tetrahydrofuran itp., w temperaturze od około -78°C do około 25°C.
Wytworzony związek można następnie poddać hydrolizie znanymi w technice metodami, w wyniku czego otrzymuje się żądany podstawiony kwas karboksylowy o wzorze (IB). Przykładowo, odpowiednia hydroliza obejmuje działanie na reagent amidowy mocnym kwasem nieorganicznym, kwasem organicznym lub mieszaniną kwasu nieorganicznego i organicznego, w temperaturze od około 100°C do około 160°C. Typowe kwasy, które można stosować w tej reakcji obejmują kwas bromowodorowy, kwas octowy, kwas solny itp. W celu zwiększenia szybkości reakcji można ewentualnie stosować zamkniętą probówkę.
Trzeci sposób wytwarzania podstawionego kwasu karboksylowego o wzorze (IB) obejmuje diazowanie aniliny i reakcję typu „quenching” wytworzonej soli diazoniowej. Konkretnie, resztę aminową reagenta anilinowego przekształca się w sól diazoniową przez reakcję z kwasem azotawym. Kwas azotawy można wytworzyć in situ przez działanie azotynem sodu z wodnym roztworem mocnego kwasu, takiego jak kwas solny lub siarkowy. Reakcję typowo przeprowadza się w temperaturze 5°C lub niższej. Sól diazoniową poddaje się reakcji z odpowiednim reagentem („quenching”) aby uzyskać żądany podstawiony układ aromatyczny. Reprezentatywne reagenty stosowane w tym celu („quenching reagent”) obejmują wodę, cyjanek, halogenek, wodny roztwór kwasu siarkowego, itp. Typowo, mieszaninę reakcyjną ogrzewa się aby ułatwić przebieg żądanej reakcji.
W stanie techniki znane są różne reakcje, które można wykorzystać aby uzyskać żądane podstawienia w pierścieniach karbocyklicznych. Na przykład, różne reakcje aromatycznej elektrofilowej i nukleofilowej substytucji są przedstawione w rozdziałach U i 13 książki J. March „Advanced Organie Chemistry” wyd. 3, Wiley, 1985.
Ponadto, związki o wzorze (IB) można wytwarzać przez karboksylowanie odpowiednio podstawionego związku karbocyklicznego. Karboksylowanie można prowadzić stosując kilka różnych reagentów. Na przykład reagent karbocykliczny lub heterocykliczny można poddać reakcji z fosgenem, chlorkiem oksalilu, chlorowodorkiem mocznika lub chlorkiem N,N-dietylokarbamoilu, w obecności katalizatorów Friedel-Craftsa. Odmiana tej metody obejmuje reakcję reagenta karbocyklicznego lub heterocyklicznego z tiolochloromrówczanem alkilu (RSCÓC1) lub z chlorkiem karbamoilu (H2NCOC1), w której wytwarza się amid lub tioloester, odpowiednio. Amid i tioloester można następnie hydrolizować aby otrzymać żądaną grupę karboksylową, March, str. 491.
Przykłady katalizatorów Friedel-Craftsa obejmują kwasy Lewisa, takie jak bromek glinu (AlBr3), chlorek glinu (A1C13), chlorek żelaza (III) (FeCl3), trichlorek boru (BC13), trifluorek boru (BF3) itp. Patrz także J. March, „Advanced Organie Chemistry” wyd. 3, Wiley, 1985; Olah, „Friedel- Crafts and Related Reactions”, Interscience, Nowy Jork, 1963-1965; i Olah „Friedel-Crafts Chemistry”, Wiley, Nowy Jork, 1973.
Kwas chinolinokarboksylowy, można wytwarzać przez reakcję odpowiednio podstawionej aniliny z gliceryną, zgodnie z reakcją Skraupa, opisaną w publikacji L. Bradford i in., J. Chem. Soc., 1947, 437. Przykładowo, kwas 3-aminobenzoesowy można poddać reakcji z gliceryną w obecności środka utleniającego takiego jak kwas m-nitrobenzenosulfonowy lub m-nitrobenzenosulfonian sodu w 60-75% wodnym roztworze kwasu siarkowego, w wyniku czego uzyskuje się żądaną chinolinę podstawioną grupą karboksylową. Reakcję typowo prowadzi się w temperaturze od około 35°C do temperatury wrzenia przez 1 do 6 godzin, korzystnie w temperaturze od około 50°C do temperatury wrzenia przez 2 do 4 godzin.
Wytworzone reagenty można następnie redukować lub uwodornić stosując znane w technice procedury, patrz np. J. March, str. 700. Korzystna procedura polega na katalitycznym uwodornieniu, np. przez połączenie kwasu chinolinokarboksylowego z gazowym wodorem w obecności katalizatora. Korzystnym katalizatorem jest pallad na węglu. Typowe rozpuszczalniki odpowiednie
185 647 do stosowania w tej reakcji obejmują dowolny organiczny rozpuszczalnik taki jak octan etylu. Wybór rozpuszczalnika nie jest krytyczny, dopóki stosowany rozpuszczalnik jest obojętny w stosunku do zachodzącej reakcji. Reakcja jest zasadniczo cąłkowita po około 1 do 24 godzinach, gdy przebiega w temperaturze w zakresie od około 25°C do około 100°C.
Następujące przykłady ilustrują wynalazek. Przykłady 1 i 2 przedstawiają sposoby wytwarzania związków wyjściowych do syntezy związku według wynalazku.
Dla oznaczenia terminów: temperatura topnienia, widma jądrowego rezonansu magnetycznego, widma masowe uzyskane z zastosowaniem jonizacji elektronami, widma masowe uzyskane z jonizacją w polu elektrycznym połączoną z desorpcją, widma masowe uzyskane z jonizacją przez bombardowanie szybkimi atomami, widma w podczerwieni, widma w nadfiolecie, analiza elementarna, wysokosprawna chromatografia cieczowe i chromatografia cienkowarstwowa, stosowane są odpowiednio następujące skróty: temp, topn., NMR, EIMS, MS(FD), MS(FAB), IR, UV, Analiza, HPLC i TLC. Ponadto, dla widm IR wymienione są tylko interesujące widma absorpcji, a nie wszystkie obserwowane.
W odniesieniu do widm NMR stosowano następujące skróty: singlet, (s), dublet (d), dublet dubletów (dd), triplet (t), kwartet, (q), multiplet (m), dublet multipletów (dm), szeroki singlet (br.s), szeroki dublet (br.d), szeroki triplet (br.t) i. szerokr multiplet (br.m). J oznacza stałą sprzęgania w Hertzach (Hz). Jeśli nie zaznaczono inaczej, dane NMR odnoszą się do wolnej zasady przedmiotowego związku.
Widma NMR otrzymano na aparacie Bruker Corp. 270 MHz Lub urządzeniu General Electric QE-300 300 MHz. Przesunięcia chemiczne wyrażono w wartościach delta (ppm poniżej tetrametylosilanu). Widma MS(FD) wyznaczano na spektrometrze Varian-MAT 731, stosując emitery węglowo-dendrytowe. Widma EIMS uzyskano stosując urządzenie CEC 21-110 z firmy Consolidated Electrodynamics Corporation. Widma MS(FAB) otrzymano stosując spektrometr WG ZAB-2. Widma IR mierzono stosując urządzenie Perkin-Elmer 281. Widma UV otrzymano stosując urządzenie Cary 118. TLC prowadzono stosując płytki z żelu krzemionkowego z firmy E. Merck. Temperatury topnienia nie były korygowane.
Przykład 1
A. Kwas 2R-2-N(benzyloksykarbonylo)amino-3-fenylotio-propanowy
Do 13,1 ml (127 mmoli) tiofenolu, dodano powoli pod azotem 4,6 g (117 mmoli) 60% roztworu wodorku sodu. Mieszaninę mieszano przez około 15 minut, a następnie powoli dodano roztworu i 25,6 g (116 mmoli) β-laktonu L-N(benzyloksy-karbonylo)seryny w 450 ml tetrahydrofuranu. Mieszaninę pozostawiono do przereagowania w temperaturze pokojowej na około 1 godzinę, następnie zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano pozostałość. Pozostałość tę rozpuszczono w octanie etylu i przemyto kolejno 0,5N wodorosiarczanem sodu i nasyconym roztworem solanki. Oddzielono wytworzone warstwy, warstwę organiczną wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując pozostałość. Pozostałość oczyszczono metodą szybkiej chromatografii (gradient eluentów 0-2% kwas octowy w mieszaninie 4:1 chlorku metylenu i octanu etylu) i otrzymano 27,9 g białej substancji stałej.
Wydajność: 72%.
'HNMR (CDC13): δ 7,55-7,18 (m, 10H), 5.55 (d, J - 7 Hz, 1H), 5,08 (s, 2H), 4,73-4,60 (m, 1H), 3,55-3,30 (m ,2H).
IR(KBr): 3304, 3035, 1687, 1532, 736 cm-'.
MS (FD): m/e 332, 288, 271, 181.
Analiza dla: CI7H]7NO4S:
Obliczono: C, 61,61; H, 5,17; N, 4,23;
Znaleziono: C, 61,69; H, 5,22; N, 4,47.
B. 3S~l-diazo-2-okso-3-N-(benzyloksykarbonylo)amino-4-fenylotiobutan
Do zimnego (-30°C) roztworu 12,1 g (37 nunoli) związku tytułowego z przykładu 1A w octanie etylu pod azotem powoli dodano za pomocą strzykawki 5,09 ml (37 mmoli) trietyloaminy Następnie do wytworzonego roztworu za pomocą strzykawki 5,09 ml (37 mmoli) trietyloaminy. Następnie do 'wytworzonego roztworu za pomocą strzykawki dodano 7,13 ml (55 moli) chloromrówczanu izobutylu i 146 mmoli roztworu diazometanu. Roztwór diazometanu
185 647 wytworzono stosując 100 ml eteru dietylowego, 150 ml 5 N roztworu wodorotlenku sodu i 21 g (146 mmoli) N(metylo)-N(nitro)-N(nitrozo)-guanidyny. Mieszaninę bezwodnika i diazometanu pozostawiono do przereagowania w temperaturze -30°C na około 20 minut. Gdy reakcja zasadniczo zakończyła się, jak wykazano metodą TLC, za pomocą wypalanej w płomieniu pipety Pasteura przez roztwór barbotowano azot, aby usunąć nadmiar diazometanu. Następnie roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano pozostałość. Pozostałość tę oczyszczono stosując szybką chromatografię (gradient eluentów 0-5% octanu etylu w chlorku metylenu) i otrzymano żółty olej.
Wydajność: 73%.
Ή NMR (CDC13): δ 7,50-7,10 (m, 10H), 5,62 (d, J = 7 Hz, 1H), 5,47 (szer. s, 1H), 5,11 (s, 2H), 4,50-4,32 (m ,1H), 3,33 (d, J = 6 Hz, 1H).
IR (KBr): 3012, 2115, 1720,1501, 1367,1228 cm’1.
MS (FD): m/e 356, 328,242.
C. 3R-l-chloro-2-okso-3-N-(benzyloksykarbonylo)amino-4-fenylotiobutan
Przez zimny (-20°C) roztwór 22,3 g (63 mmole) związku tytułowego z przykładu IB w 400 ml eteru dietylowego przepuszczono krótkim wtryśnięciem (około 2 sekundy) bezwodny kwas chlorowodorowy (w postaci gazu), co spowodowało wydzielenie się gazu. Powtórzono tę procedurę, uważając, aby nie dodać nadmiaru gazu. Gdy reakcja w zasadzie zakończyła się, jak wykazano za pomocą TLC, roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano 21 g białej substancji stałej.
Substancję te stosowano bez dalszego oczyszczania.
Ή NMR (CDC13): δ 7,50-7,15 (m, 10H) , 5,56 (dd, J = 2, 6,7 Hz, 1H), 5,11 (s, 2H), 4,78-4,67 (m, 1H), 4,20 (d, J = 15,9 Hz, 1H), 4,12 (d, J = 15,9 Hz, 1H), 3,48-3,23 im, 2H),
IR (KBr): 3349, 1732,1684,1515,1266 cm·'.
MS (FD): m/e 363 (M+).
Analiza dla: C)8H18NO3SC1:
Obliczono: C, 59,42; H, 4,99; N, 3,85;
Znaleziono: C, 59,57; H, 5,09; N, 4,13.
D. [2S-(2R*,3S*)]-l-chloro-2-hydroksy-3-N-(benzyloksykarbonylo)amino-4-fenylotiobutan
Do zimnego (Ó°C) roztworu 21 g (58 mmoli) związku tytułowego z przykładu 1C w 30 ml tetrahydrofuranu dodano 2,4 g (63 mmole) borowodorku sodu. Gdy reakcja prawie zakończyła się, co wykazano za pomocą TLC, pH roztworu doprowadzono do wartości 3, stosując 10 ml wodnego nasyconego roztworu chlorku amonu i 500 μΐ 5N roztworu kwasu solnego. Wytworzony roztwór ekstrahowano dwa razy chlorkiem metylenu, a połączone warstwy organiczne przemyto wodą, wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, po czym zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano pozostałość. Pozostałość tę oczyszczono stosując szybką chromatografię (gradient eluentów 0-2% metanol w chlorku metylenu), a następnie znowu metodą szybkiej chromatografii (gradient eluentów 0-2% octan etylu w chloroformie), po czym rekrystalizowano z chlorku metylenu w -78°C, uzyskując 8,3 g związku tytułowego.
Wydajność: 39%.
’H NMR (CDC13): δ 7,47-7,19 (m, 10H), 5,22-5,03 (m, 1H), 5,09 (s, 2H), 4,01-3,89 (m, 2H), 3,75-3,58 (m, 2H), 3,32 (d, J = 4 Hz, 2H).
IR (KBr): 3321, 2951, 1688,1542, 1246, 738 cm·1.
MS (FD): m/e 366 (M+), 119.
Analiza dla: C,8H20NO3SCl:
Obliczono: C, 59,09; H, 5,51; N, 3,83;
znaleziono: C, 59,03; H, 5,50; N, 3,96.
E. [1 R-(1'R*,1S*)]-!-[1 '-N-(benzyloksykarbonylo)amino-2'-fenylotio)etylooksiran
Do roztworu 8,3 g (23 mmole) związku tytułowego z przykładu ID w 400 ml etanolu dodano roztworu 1,4 g (25 mmoli) wodorotlenku potasu w 400 ml etanolu. Gdy reakcja zasadniczo zakończyła się, jak wykazała TLC, mieszaninę reakcyjną przelano do mieszaniny wody i chlorku metylenu. Rozdzielono wytworzone warstwy, a warstwę organiczną przemyto wodą, wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, po czym zatężono pod zmniejszonym
185 647 ciśnieniem, uzyskując pozostałość. Pozostałość tę oczyszczono stosując szybką chromatografię (gradient eluentów 0-2% octan etylu w chlorku metylenu) i uzyskano 6,4 g białej substancji stałej.
Wydajność: 85%.
Ή NMR (CDC13): δ 7,45-7,15 (m, 10H), 5,12 (s, 1H), 5,08 (s, 2H), 3,77-3,62 (m, 1H), 3,21 (d, J = 6 Hz, 2H), 2,99 (m, 1H), 2,77 (m, 2H).
IR (KBr): 3303, 3067, 1694, 1538, 1257, 741 cm’’.
MS (FD): m/e 329.
Analiza dla: CrH45N3O4S:
Obliczono: C, 65,63; H, 5,81; N, 4,25.
Znaleziono: C, 65,48; H, 5,82; N, 4,29.
F. [3S-(3R*,4aR*,8aR*,2'S*,3'S*)]-2-[3'-N-(benzyloksykarbonylo)amino-2'-hydroksy-4'-fenylo)tio]butylodekahydroizochinolino-3-Ń-t~butylokarboksamid
Roztwór 6,3 g (10 mmoli) związku z tytułowego przykładu 1E i 5 g (21 mmola) [3S-(3R*,4aR*,8aR*)]-dekahydroizochinolino-3-N-t-butylokarboksamidu w 300 ml etanolu ogrzewano do 55°C przez około 48 godzin. Następnie wytworzoną mieszaninę reakcyjną oziębiono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując pozostałość. Pozostałość tę oczyszczono metodą szybkiej chromatografii (gradient eluentów 0-20% octan etylu w chlorku metylenu) i uzyskano 4,3 gbiałej substancji stałej.
Wydajność: 40%.
1H NMR (CDC13): δ 7,41-7,11 (m, 10H), 5,90 (d, J - 5 Hz, 1H), 5,64 (s, 1H), 5,05 (d, J = 4 Hz, 2H), 4,08-3,90 (m, 2H), 3,40 (d, J - 6, 2H), 3,05 (s, 1H), 2,95-2,85 (m, 1H), 2,62-2,45 (m, 2H), 2,28-2,15 (m, 2H), 2,05-1,88 (m, 2H), 1,78-1,10 (m, 7H), 1,29 (s, 9H).
IR (KBr): 3330, 2925, 2862,1706, 1661,1520, 1454,1246, 738, 694 cm’'.
MS (FD): m/e 568 (Mł), 467.
Analiza dla: C3,H45O4S:
Obliczono: C, 67,69; H, 7,99; N, 7,40.
Znaleziono: C, 67,64; H, 8,20; N, 7,45.
G. [3S-(3R *,4aR *, 8aR * 2'S*,3’S*)]-2-[3 '-amino-2'-hydroksy-4’-(fenylo)tio]butylodekahydroizochinolino-3-N-t-butylokarboksamid
Roztwór zawierający 1 g (1,8 mmola) związku tytułowego z przykładu 1F w 40 ml 30% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym poddawano reakcji przez około 1 godzinę. Surowy produkt rozpuszczono w 30 ml metanolu. Do wytworzonego roztworu dodano 2 ml dietyloaminy i 2 ml stężonego wodorotlenku amonu, a następnie mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano pozostałość. Pozostałość tę rozpuszczono w wodzie i octanie etylu. Rozdzielono wytworzone warstwy i warstwę organiczną przemyto kolejno wodnym roztworem wodorowęglanu sodu i solanką, wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, a następnie zatężono do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskano pozostałość. Pozostałość tę oczyszczono metodą szybkiej chromatografii (gradient eluentów 0-10% metanolu w chloroformie, zawierającym 3 krople wodorotlenku amonu na 1000 ml chloroformu) i otrzymano 0,54 g białej piany.
Wydajność: 71% oddzielnie
Ή NMR (CDC13): δ 7,41-7,16 (m, 5H), 6,07 (s, 1H), 3,78-3,70 (m, 1H), 3,45-3,38 (m, 1H), 3,03-2,84 (m, 3H), 2,38-2, 20 (m, 3H), 2,00-1,05 (m, 12H), 1,33 (s, 9H).
IR (KBr): 2924, 2862, 1660, 1517, 1454, 1439, 737, 691 cm’1.
MS (FD): m/e 434 (M+), 293.
Przykład 2
A. 3-metoksy-N-fenylobenzaraid
Do roztworu zawierającego 25,1 g (147 mmoli) chlorKU j-met vKsybdiz.uiiU w <.hłOhcu metylenu powoli dodano roztworu 13,4 ml (147 mmoli) aniliny w 30,7 ml trietyloaminy. Wytworzoną mieszaninę reakcyjną pozostawiono do przereagowania na około trzydzieści minut, a następnie rozcieńczono 1 N wodorowęglanem sodu. Rozdzielono wytworzone warstwy, a warstwę organiczną przemyto kolejno wodą 1 M wodorotlenkiem sodu, a następnie solanką wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono, po czym zatężono do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskano 31,6 g białawej substancji stałej. Wydajność: 95%.
185 647
B. 3-metoksy-2-metylo-N-fenylobenzamid
Do zimnego (-70°Ć) roztworu 4,54 g (20 mmoli) związku tytułowego, otrzymanego jak powyżej w punkcie A i 5,11 g (44 mmoli) TMEDA w 70 ml bezwodnego tetrahydrofurami dodano 26,9 ml 1,56 M roztworu n-butylolitu w heksanie. Wytworzoną mieszaninę reakcyjną ogrzano do -15 °C przez około 45 minut i otrzymano zabarwioną na żółto zawiesinę. Zawiesinę tę ponownie oziębiono do -70°C i dodano 2,89 g (20 mmoli) jodku metylu, co spowodowało wytworzenie białego osadu. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej i reakcję przerwano dodatkiem nasyconego roztworu chlorku amonu i rozcieńczono eterem dietylowym. Rozdzielono wytworzone warstwy i fazę organiczną przemyło kolejno nasyconym roztworem chlorku amonu, wodą i nasyconymi roztworami wodorowęglanu sodu i solanki. Następnie ekstrakty organiczne wysuszono nad siarczanem sodu i zatężono, uzyskując białą substancję stała, którą oczyszczono, rekrystalizując z roztworu octanu etylu i heksanu 2:1 i otrzymano 4,0 g igieł.
Wydajność: 99%.
Ή NMR (CDC13): δ 2,36 (s, 3H), 3,88 (s, 3H), 3,89 (s, 1H), 6,90-7,70 (m, 8H).
IR (CHC13): 3424, 3013, 2963, 2943, 2840, 1678, 1597, 1585, 1519, 1463, 1438, 1383, 1321, 1264, 1240, 1178, 1083, 1069 cm·’.
MS (FD): m/e 241 (M+, 100).
Analiza dla: C15H15NO2:
Obliczono: C, 74,67; H, 6,27; N, 5,80;
Znaleziono: C, 74,65; H, 6,29; N, 5,82.
C. Kwas 3-hydroksy-2-metylobenzoesowy
Mieszaninę 1,21 g (5,00 mmoli) związku tytułowego z przykładu 2B powyżej, 35 ml 5 N kwasu solnego i 20 mi 30% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 24 godziny. Po oziębieniu, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 100 ml octanu etylu i 100 ml wody. Rozdzielono wytworzone warstwy i warstwę organiczną przemyto raz wodą, a następnie zalkalizowano do pH 11 za pomocą 0,5 N roztworu wodorotlenku sodu. Oddzielono wytworzone warstwy i warstwę wodą zakwaszono do pH 1, stosując 5 N kwas solny. Następnie żądany związek ekstrahowano z warstwy wodnej za pomocą octanu etylu. Ekstrakty z octanu etylu przemyto następnie solanką, wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono, otrzymując pozostałość, z której po dwóch zatężeniach z heksanu uzyskano 750 mg białej substancji stałej.
Wydajność: 98%.
Ή NMR (CDCI3): δ 2,26 (s, 3H), 6,98 (d, J = 8,03 Hz, 1H), 7,02 (t, J = 7,69 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 7,37 Hz, 1H), 9,55 (szer. s, 1H).
IR (CHCI3): 3600-2100 (szer.), 3602, 2983, 1696, 1588, 1462, 1406, 1338, 1279, 1174, 1154, 1075, 1038, 920, 854, 816 cmt
MS (FD): m/e 152 (M+, 100).
Analiza dla: C8H8O3:
Obliczono: C, 63,15; H, 5,30;
Znaleziono: C, 63,18; H, 5,21.
Alternatywnie, żądany związek tytułowy wytworzono dodając w niewielkich porcjach do oziębionego (-10°C) roztworu 45 g (0,30 mola) kwasu 3-amino-2-metylobenzoesowego i 106 mg (58 ml, 1,08 mola) stężonego kwasu siarkowego w wodzie 22,6 g (0,33 mola) azotynu sodu, przy jednoczesnym utrzymywaniu temperatury poniżej 7°C. Wytworzoną mieszaninę reakcyjną mieszano przez około 30 minut w -10°C, przelano do roztworu 240 ml stężonego kwasu siarkowego w 1,2 1 wody, a następnie powoli ogrzano do 80°C (przy temperaturze pomiędzy 40-60°C pojawiło się silne wydzielanie gazu). Gdy przestał wydzielać się gaz, mieszaninę oziębiono do temperatury pokojowej i ekstrahowano żądany związek pięć razy octanem etylu (600 ml). Połączone fazy organiczne połączono z 500 ml wodnego nasyconego roztworu węglanu sodu. Rozdzielono wytworzone warstwy i warstwę wodną zakwaszono do pH 2 stężonym kwasem solnym. Następnie ekstrahowano tytułowy związek, stosując octan etylu (500 ml), a połączone fazy organiczne przemyto solanką, wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując surowy materiał.
185 647
Materiał ten oczyszczono, rekrystalizując dwukrotnie z mieszaniny octanu etylu i chloroformu i otrzymano 23,2 g jasno-pomarańczowego proszku. Wydajność: 52%.
Przykład 3
[3S-(3R *, 4aR *,8aR *,2'S*,3 'R *)]-2-[2 ’-hydroksy-3 '-fenylotiometylo-4 '-aza-5 '-okso-5 '-(2-metylo-3-hydroksyfenylo)pentylo]dekahydroizochinolino-3-N-t-butylokarboksamid
Do zimnego (-10°C) roztworu zawierającego 70 mg (0,16 mmola) związku tytułowego z przykładu IG, 24,6 mg (0,16 mmola) związku tytułowego z przykład 2C i 22 mg (0,16 mmola) hydratu 1-hydroksybenzotriazolu (HOBT.H2O) w 4 ml bezwodnego tetrahydrofuranu dodano 33 mg (0,16 mmola) 1,3-dicykloheksylokarbodiimidu (DCC). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 36 godzin w temperaturze pokojowej, po czym zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Wytworzoną pozostałość rozpuszczono w octanie etylu, przesączono przez celit, przemyto kolejno nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu i solanką wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Uzyskany surowy materiał oczyszczono metodą chromatografii krążkowej (płytka 1 mm; eluent 3% metanol w chlorku metylenu) i otrzymano 54 mg białej piany.
Wydajność: 60%.
[ct]D -119,23 (c = 0,26, MeOH).
Ή NMR (CDC13): δ 1,09 (s, 9H), 1,12-1,79 (m, 12H), 1,93-2,02 (m, 2H), 2,17-2,30 (m, 2H), 2,31 (s, 3H), 2,43-2,61 (m, 2H), 2,91 (m, 1H), 3,42 (m, 1H), 3,78 (m, 1H), 4,07 (m, 1H), 4,47 (m, 1H), 5,37 (m, 1H), 5,51 (szer.s, Ih), 6,84 (m, 1H), 7,06 (m, 2H), 7,17-7,32 (m, 4H), 7,45 (m, 2H).
IR (KBr): 3297, 2925, 2862, 1627, 1586, 1530, 1482, 1466, 1439, 1366, 1287, 1221, 1156, 1119, 1026, 801,735,689 cm1.
MS (FD): 568 (Nf. 100).
HR MS(FAB): m/e dla Ć32H46N3O4S:
Obliczono: 568,3209;
Znaleziono: 568,3182.
Przykład 4
[3S-(3R*, 4aR*, 8aR*, 2'S*,3'S*)]-2-[2-hydroksy-3'-fenylotiometylo-4'-aza-5'-oAso-5'-(2-metylo-3-hydroksyfenylo)pentylo]-dekahydroizochinolino-3-N-t-butylokarboksamid, sól kwasu metanosulfonowego
Związek ten wytworzono jak w przykładzie 3, z tą różnicą, że etapy 1A i ID z przykładu 1 zmieniono, jak podano poniżej w etapie (1), i dodano etap wytworzenia soli (2).
(1)
Do 2 1 kolby dodano Ph3P (109,6 g) w 500 ml CH2C12 i mieszaninę oziębiono do -70°C. Do mieszaniny w ciągu 25 minut wkroplono roztwór azydodikarboksylanu dietylu (66 ml) w 60 ml THF. Po 25 minutach w ciągu 45 minut wkroplono roztwór N-karbobenzyloksy-Lseryny (100 g) w 400 ml THF i pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej w łaźni wodnej na ponad około dwie godziny. Do mieszaniny dodano 150 ml THF. W innej kolbie w łaźni lodowej oziębiono do 0°C roztwór tiotenolu (46 g) w 1 1 THF i w porcjach dodawano zawiesinę NaH (10 g), uzyskując gęsty roztwór. Po jednej godzinie do roztworu tiolanu wkroplono za pomocą wkraplacza w ciągu 30 minut roztwór surowego laktonu. Po 12 godzinach biały osad odsączono, a placek filtracyjny przemyto THF. Substancję stałą pochłonięto w 0,4 N roztworze NaHSO4 i EtOAc, rozdzielono i warstwę organiczną przemyto solanką, wysuszono i odparowano, otrzymując 85 g kwasu 2R-2-N-(benzyloksykarbonylo)amino3-fenylotiopropanowego w postaci lepkiego oleju.
Jak się przypuszcza, otrzymana na początku substancja stała jest solą sodową żądanego produktu. Tak więc, wydajność i łatwość oddzielenia można poprawić przez bezpośrednie wydzielenie soli sodowej.
Do 1 1 absolutnego EtOH i 200 ml THF dodano surowego chloroketonu 3R-l-chloro-2-okso-3-N-(benzyloksykarbonylo)amino-4-fenylotiobutanu (16,87 g, 46,4 mmola) i roztwór oziębiono w łaźni CO2-aceton (-78°Tint) i w ciągu 1 godziny wkroplono NaBH4 (2,63 g, 69,5 mmola) w 200 ml absolutnego EtOH (T,„t < -75°C). Po dodaniu analiza metodą TLC wykazała, że reakcja zakończyła się. Mieszaninę rozcieńczono 300 ml eteru i reakcję przerwano podczas mieszania powoli dodając 0,4 N roztworu NaHSO3, co spowodowało wydzielenie się gazu.
185 647
Mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, aby usunąć większość EtOH i dodano jeszcze wody. Mieszaninę ekstrahowano eterem, połączone warstwy organiczne przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 i solanką wysuszono (Na^OJ i zatężono, otrzymując 15,7 g białawej substancji stałej. Materiał ten roztarto z wrzącym heksanem (300 ml) i gorący heksan ostrożnie zdekantowano. Czynność tę powtórzono 10 razy (300 ml za każdym razem) i otrzymano 10,35 g białawej substancji stałej (jeden czysty izomer, co wykazano TLC). Przesącz heksanowy zatężono i otrzymano dodatkowo 6 g białej substancji stałej, którą odłożono. Substancję roztartą ogrzewano z 50 ml CH2C12 i około 6 ml heksanu i gorącą przesączono. Przezroczysty roztwór pozostawiono, aby oziębił się do 25°C i następnie umieszczono w zamrażarce. Wytworzoną stałą substancję przesączono i prżemyto heksanami i otrzymano 7,157 g białej substancji stałej. Przesącz połączono z powyższym przesączem heksanowym i z surowym produktem reakcji z dwóch doświadczeń w małej skali (500 mg wyjściowego ketonu w każdym) i połączony materiał poddano chromatografii na SiO2 (2:1 heksany-eter—» 1:1 heksany-eter, załadowano z CH2C12) i uzyskano jeszcze 2,62 g produktu. Łącznie otrzymano 10,31 g czystego izomeru, [2S-(2R*,3S*)]-l-chloro-2-hydroksy-3-N-(benzyloksykarbonylo)amino-4-fenylotiobutanu (50% wydajności z kwasu).
alfaD = -63,6°C (c = 1, MeOH).
(2)
Wytwarzanie soli
[3S-(3R*,4aR*,8aR*,2'S*,3'S*)]-2-[2'-hydroksy-3'-fenylotiometylo-4'-aza-5'-okso-5'-(2-metylo-3-hydroksyfenylo)pentylo]-dekahydroizochinolino-3-N-t-butylokarboksamid (3,34 g) rozpuszczono w 30 ml MeOH i 30 ml CH2C12 i wkroplono roztwór kwasu metanosulfonowego (596 mg) w 10 ml CH,CL. Po 10 minutach mieszaninę zatężono do piany. Surową sól pochłonięto w 5 ml THF i powoli dodano do mieszaniny 175 ml eteru etylowego i 25 ml heksanów, mieszając, aż do wytworzenia się subtelnej zawiesiny. Zawiesinę tę oziębiono w zamrażarce, i zimną przesączono i przemyto kilka razy eterem etylowym, a następnie wysuszono w piecu próżniowym uzyskując 3,75 g (96%) soli kwasu metanosulfonowego [3S-(3R*,4aR*,8aR*,2'S*,3'S*)]-2-[2'-hydroksy-3,-fenylotiometylo-4'-aza-5'-okso-5'-(2-metylo-3-hydroksyfenylo)pentylo]-dekahydroizochinolino-3-N-t-butylokarboksamidu w postaci białego proszku.
Przykłady kompozycji
Określenie „składnik aktywny” oznacza związek o wzorze (1) lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.
Przykład 5
Kompozycja 1
Twarde kapsułki żelatynowe wytworzono stosując następujące składniki:
Składnik aktywny Skrobia, sucha Stearynian magnezu Całość
Ilość (mg/kapsułkę)
250
200
460 mg
Przykład 6
Kompozycja 2
Tabletkę wytworzono stosując poniższe składniki:
Składnik aktvwnv — ----------J
Celuloza, mikrokrystaliczna
Dwutlenek krzemu, Kwas sterarynowy Całość
Ilość (mg/tabletkę)
250
400
665 mg
Składniki miesza się i sprasowuje do postaci tabletek, każda o wadze 665 mg.
185 647
Przykład 7
Kompozycja 3
Wytworzono roztwór aerozolu zawierający następujące składniki:
Waga
Składnik aktywny 0,25
Metanol 25,75
Propelent 22
(Chlorodifluorometan) 74,00
Całość 100,00
Składnik aktywny miesza się z etanolem i mieszaninę dodaje się do porcji propelenta 22, oziębia się do -30°C i przenosi do urządzenia napełniającego. Wymaganą ilością napełnia się pojemnik ze stali nierdzewnej i rozcieńcza pozostałą ilością propelenta. Następnie pojemnik wyposaża się w zawór.
Przykład 8
Kompozycja 4
Tabletki, każda zawierająca 60 mg składnika aktywnego, sporządza się w następujący sposób:
Ilość (mg/tabletkę)
Składnik aktywny 60,0
Skrobia 45,0
Mikrokrystaliczna celuloza 35,0
Poliwmylopirolidon (jako 10% roztwór w wodzie) 4,0
Sól sodowa karboksymetyloskrobi 4,5
Stearynian magnezu 0,5
Talk 1,0
Całość 150,0
Składnik aktywny, skrobię i celulozę przepuszcza się przez sito Nr 45 mesh U.S
i dokładnie miele. Z wytworzonym proszkiem miesza się wodny roztwór zawierający poliwinylopirolidon i mieszaninę następnie przepuszcza się przez sito Nr 14 mesh U.S. Tak wytworzone granulki suszy się w 50°C i przepuszcza przez sito Nr 18 mesh U.S. Sól sodową karboksymetyloskrobię, stearynian magnezu i talk, uprzednio przepuszczone przez sito Nr 60 mesh U.S., dodaje się do granulek, i po zmieszaniu sprasowuje się w tabletkarce, uzyskując tabletki o wadze 150 mg każda.
Przykład 9
Kompozycja 5
Kapsułki, każda o zawartości 80 mg składnika aktywnego, sporządza się, jak następuje:
Ilość (mg/kapsułkę)
Składnik aktywny 80mg
Skrobia 59mg
Mikrokrystaliczna celuloza 59mg
Stearynian magnezu2
Całość 200mg
Składnik aktywny, celulozę, skrobię i stearynian magnezu miesza się, przepuszcza przez sito Nr 45 mesh U.S. i ilością 200 mg napełnia się twarde żelatynowe kapsułki.
Π i χ X. j xx x tx w i v
Kompozycja 6
Czopki, każdy o zawartości 225 mg składnika aktywnego, sporządzono, jak następuje:
Składnik aktywny 225 mg
Glicerydy nasyconych kwasów tłuszczowych 2,000 mg
Całość 2,225 mg
185 647
Składnik aktywny przepuszcza się przez sito Nr 60 mesh U.S. i zawiesza się w glicerydach nasyconych kwasów tłuszczowych, uprzednio stopionych, przy użyciu minimalnej ilości potrzebnego ciepła. Następnie mieszaninę wlewa się do formy czopkowej o nominalnej pojemności 2 g i pozostawia do oziębienia.
Przykład 11
Kompozycja 7
Zawiesiny, każda zawierająca 50 mg składnika aktywnego na 5 ml dawkę, sporządzono, jak następuje:
Składnik aktywny 50 mg
Sól sodowa karboksymetylocelulozy 50 mg
Syrop 1,25 ml
Roztwór kwasu benzoesowego 0,10 ml
Substancja zapachowa q.v.
Substancja barwiąca q.v.
Oczyszczona woda do uzupełnienia 5 ml
Składnik aktywny przepuszcza się przez sito Nr 45 mesh U.S. i miesza z solą sodową karboksymetylocelulozy i syropem, wytwarzając gładką pastę. Roztwór kwasu benzoesowego, substancję zapachową i barwiącą rozcieńcza się porcją wody i podczas mieszania dodaje do wytworzonej pasty. Następnie dodaje się wystarczającą ilość wody do uzyskania żądanej objętości.
Przykład 12
Kompozycja 8
Kompozycję do wstrzyknięć dożylnych wytwarza się, jak następuje:
Składnik aktywny 100 mg
Izotoniczna sól fizjologiczna 1,000 ml
Roztwór powyższych składników zazwyczaj podaje się pacjentowi dożylnie z szybkością 1 ml na minutę.
SKRINING AKTYWNOŚCI
Do badania biologicznej aktywności związków hamujących protoazę HIV stosowano kilka testów. Na przykład, stosowano testy do analizy szybkości hamowania i działania przeciwwirusowego na linie komórkowe zakażone przez HIV. Procedury stosowane w tych doświadczeniach są opisane poniżej. Wyniki z tych prób są zestawione w tabeli 1 poniżej lub w przykładach powyżej.
I. Podstawowy skrining związków przeciw HIV w Southern Research Institute (SRI) (Wyniki podane w tabeli 1 są oznaczone jako „SRI CEM (ng/ml)” lub „SRI MT2 (ng/ml)”.
A. Zasada próby MTT:
SRI ma ustalony program na podstawową analizę związków na własności przeciwwirusowe w próbach z mikromianowaniem, w których mierzy się zdolność wybranego związku do hamowania niszczenia komórek przez HIV. Próba ta obejmuje konwersję barwnika tetrazoliowego MTT w barwny produkt formazanowy przez mitochondrialne enzymy w metabolicznie aktywnych komórkach. Taki system stosowany jest przez SRI do skriningu ponad 30 000 związków rocznie. Krótko mówiąc, próba obejmuje zakażenie komórek CEM lub MT2 w okrągłodennych 96-dołkowych płytkach. Badany związek dodaje się tuż przed zakażeniem. Po 6 dniach inkubacji w 37°C płytki wybarwia się za pomocą MTT. Wyniki próby ocenia się ilościowo spektrofotometrycznie w czytniku płytkowym Molecular Devices Vmax. Dane analizuje się za pomocą analizy liniowej regresji wykorzystując własny program do obliczenia aktywności przeciwwirusowej (IC25, IC50, IC95) i toksyczności (TC25, TC50, TC95) oraz innych wartości.
Podstawowe próby przeciwwirusowe rutynowo przeprowadza się w komórkach CEM lub MT-2. SRI stwierdził, że wszystkie aktywne związki zostały zidentyfikowane w komórkach CEM, natomiast doświadczenia prowadzone w linii komórkowej MT-2 wykazały tylko małą ilość aktywnych związków.
185 647
B. Standardowe próby skriningowe w komórkach CEM i MT-2
1. Rozcieńczanie związku i dostarczanie do płytek
Leki rozpuszcza się w odpowiednim podłożu, takim jak woda destylowana lub DMSO, jeśli jest to konieczne. Podczas wszystkich etapów procesu stosuje się lateksowe rękawiczki, fartuchy laboratoryjne i maski, aby zabezpieczyć się przed potencjalnie szkodliwymi czynnikami. Lek przygotowuje się w odpowiednim stężeniu i przechowuje się w -20°C aż do użycia go przez laboratorium skriningu. Pierwsze rozcieńczenie każdego związku sporządza się w probówce do rozcieńczeń zużyciem środka rozcieńczającego do stężenia, które jest podwojeniem najwyższego badanego stężenia. Następnie używa się sterylnych probówek do oznaczania miana do sporządzenia szeregu półlogarytmicznych rozcieńczeń każdego związku. Rozcieńczony związek dodaj e się do odpowiedniego dołka w 96-dołkowej płytce do mianowania. Na jednej płytce można ocenić do 12 rozcieńczeń, każde w trzech powtórzeniach, wraz ze wszystkimi odpowiednimi próbami kontrolnymi obejmującymi kontrolę komórek, kontrolę wirusa, kontrolę toksyczności, kontrolę zabarwienia leku, kontrolę środka rozcieńczającego i kontrolną próbę na tworzywo (podłoże). Gdy badanie obejmuje tylko 6 rozcieńczeń na jednej płytce można ocenić 2 leki. Leki nanosi się na płytkę w końcowej objętości 100 μΐ.
2. Komórki i wirus
Podczas sporządzania rozcieńczeń komórki przemywa się i liczy. Żywotność śledzi się przez ekskluzję zużyciem barwnika - błękitu trypanu i jeśli żywotność spada poniżej 90% próby nie przeprowadza się. Komórki utrzymuje się w fazie logarytmicznego wzrostu i rozdziela się je 1:2 na dzień przód próbą, aby zapewnić logarytmiczną szybkość wzrostu.
Do podstawowego skriningu 'wykorzystuje się linie komórkowe CEM i MT-2. Jeśli nie wskazano inaczej, stosowanym podłożem jest RPMI 1640 z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą (FBS), glutaminą i antybiotykami.
Komórki propagują w 37°C w atmosferze 5% CO2 w powietrzu. Wirusem stosowanym w tej pracy sąizolaty IIIB i/lub RF HIV-1, które uzyskuje się w procesie ostrego zakażenia.
Krótko mówiąc, komórki zakażone wirusem zbiera się codziennie zaczynając trzeciego dnia po zakażeniu, dopóki wirus nie zabije wszystkich komórek w hodowli. Do zidentyfikowania puli z największą ilością wirusa stosuje się aktywność odwrotnej transkryptazy i p24 ELISA.
Komórki zebrane po 24 godzinach sączy się i zamraża w -90°C. Przed użyciem ich w próbie, infekcyjną pulę wirusa mianuje się na wszystkich dostępnych liniach komórkowych w celu określenia ilości wirusa potrzebnej w próbie przeciwwirusowej.
Zwykle, pule wyprodukowane w metodzie z ostrym zakażeniem wymagają dodawania 1 μΐ zakaźnego wirusa na dołek, co daje skrining leków przy wielokrotności zakażenia 0,01. W ten sposób przygotowuje się i zamraża wystarczającą ilość wirusa dla ponad tysiąca płytek, co pozwala na testowanie do 2 000 związków z pojedynczego zbioru zakaźnego wirusa. Używanie jednego zbioru wirusa przez długi okres badania ma bardzo korzystny wpływ na powtarzalność w takich układach.
Zakażenie komórek CEM i MT-2 wirusem w próbie przeciwwirusowej prowadzi się w procesie zakażenia w masie. Odpowiednią liczbę komórek, potrzebną do przeprowadzenia próby, miesza się z zakaźnym wirusem w stożkowej probówce do wirówki w małej całkowitej objętości -1-2 ml.
Po 4 godzinach inkubacji zakażone komórki doprowadza się do odpowiedniego stężenia końcowego 5 χ 104 komórek na ml ze świeżym podłożem do hodowli tkankowej i 100 μΐ dodaje się do odpowiednich dołków, eksperymentalnego i kontrolnego na wirus. Niezakażone komórld w tym samym stężeniu umieszcza się na płytce w dołkach kontrolnych dla toksyczności i kontrolnych dla komórek. Próby można także prowadzić stosując metodę zakażenia w dołkach. W tym przypadku lek, komórki i wirus dodąie się do dołka pojedynczo. W każdym przypadku MOI ustawia się tak, aby uzyskać całkowite zniszczenie w dołkach kontrolnych dla wirusa przez 6 dni.
3. Ocena hamowania CPE
Po umieszczeniu na płytce komórek i leków płytkę inkubuje się przez 6 dni w 37°C. Doświadczenie wykazało, że inkubacja przez dłuższy czas (7-8 dni) lub użycie wyższej liczby komórek na wyjściu (1 χ 104) daje znaczny spadek żywotności komórek kontrolnych i zmniejszenie różnicy gęstości optycznej między kontrolą komórek i wirusa po wybarwieniu MTT.
185 647
Metoda oceny próby przeciwwirusowej obejmuje dodawanie do każdego dołka płytki 20 μΐ soli tetrazoliowej MTT o stężeniu 5 mg/ml przez 4-8 godzin. Po tym okresie inkubacji komórki rozrywa się za pomocą dodatku 50 μΐ 20% SDS w 0,01 N HC1.
MetaboEczna aktywność żywych komórek w hodowh daje barwny produkt reakcji, który mierzy się spektrofotometrycznie w czytniku płytkowym Molecular Devices Vmax przy 570 nm. Wartość gęstości optycznej (O.D.) jest funkcją ilości formazanu, która jest proporcjonalna do liczby żywych komórek.
Czytnik płytkowy jest połączony szeregowo z mikrokomputerem w laboratorium skriningowym, który ocenia dane z płytek i oblicza dane dla płytek. Raport dotyczący płytek daje sprawozdanie o wszystkich odpowiednich informacjach włącznie z surowymi wartościami O.D., obliczonymi średnimi O.D. i procentowym zmniejszeniem wirusowego CPE oraz obliczonymi wartościami T50, IC50 i wskaźnika przeciwwirusowego i wskaźnika specyficzności. Wreszcie wyniki obejmują też wykres, który wizualnie przedstawia wpływ związku na niezakażone komórki (toksyczność) i działanie ochronne lub brak działania ochronnego związku na komórki zakażone.
II. Skrining związków przeciw HIV z użyciem całych komórek w firmie Eli Lilly (wyniki w tabeli 1 są oznaczone jako „Cała komórka IC50 nM” lub „Cała komórka IC90 nM”.
A. Cel i materiały
Cel: Określenie IC50 i CC50 dla związków:
Odczynniki i materiały
Podłoże A
Podłoże A [1% DMSO] (100 μΐ DMSO + 9,9 ml podłoża A)
SN 123 stosowany do zakażenia komórek (15 ml na 6 płytek) (10 ml na 4 płytki)
Komórki CEM [1 x 104] komórek/ml (4 płytka = 40 ml) (6 płytka = 60 ml)
DMSO (potrzeba 5 ml)
35B o stężeniu [10 mM] (potrzeba 70 μΐ każdego)
A-D o stężeniu [10 mM] w 100% DMSO łub 6 96-dołkowych płytek z dnem w kształcie „u” płytki 96-dołkowe z dnem płaskim do rozcieńczeń
8-10 pudełek z jałowymi końcówkami do wspólnej pipety
Około 10 tac do reagentów
Mikropipeta z 12 dozownikami
Odnośne informacje:
1000 komórek/dołek = 1 χ 104 komórek/ml = 1000 komórek/100 μΐ
200 μΐ = całkowita pojemność dołka
Końcowe stężenie DMSO = 0,25%
Końcowe rozcieńczenie Snl23 = 1:64
Kolejno rozcieńczane związki 35B, A-D, 1:3
B. Procedura
1. Przygotowanie komórek i umieszczenie ich na płytkach, podłoże A i podłoże A (1% DMSO)
a. Numer płytki do hodowli tkankowej z 96 dołkami dla każdego badanego związku, jedna płytka jako kontrolna i jedna dla związku kontrolnego.
Płytka # Opis
1 Kontrola ujemna i dodatnia
2 35B
3 A
4 B
5 C
6 D
185 647
b. Liczenie komórek na hemacytometrze i zawieszenie ich w 40 ml lub 80 ml podłoża A w stężeniu [1 x 104] komórek/ml.
Liczenie komórek na hemacytometrze:
Oznaczyć dwie 1,8-mililitrowe probówki Nunc'a jako 1 i 2
W probówce 1 umieścić 0,5 ml dobrze wymieszanych komórek CEM (w fazie wzrostu).
W probówce 2 umieścić 50 μΐ PBS i 40 μΐ błękitu trypanu.
Zmieszać komórki w probówce 1, po czym pobrać 10 μΐ komórek i umieścić je w probówce 2.
Wymieszać dobrze zawartość probówki 2, po czym pobrać 10 μΐ wybarwionych komórek i umieścić je w hemacytometrze.
Policzyć komórki w środkowym kwadracie hemacytometru nastawiając mikroskop na 10-krotne powiększenie.
Stężenie w zbiorze CEM podane jako komórki/ml określone jest następująco:
Zliczone komórki x 1 χ 105 = stężenie CEM w [komórki/ml].
c. Dodać 200 μΐ podłoża A do:
Al płytek 2-6.
Są to ślepe próby („Blanks”)
A4-H4 płytki 1.
Są to ślepe próby (Blanks)
d. Dodać 5 μΐ podłoża A do wszystkich dołków w rzędach A-D na płytkach 2-6 z wyjątkiem Al (góma połowa każdej płytki).
e. Dodać 50 μΐ podłoża A do dołków A1-D3 płytki 1 (góma połowa płytki).
f. Dodać 50 μΐ podłoża A [1% DMSO] do wszystkich dołków w kolumnach 1-3 płytki 1.
g. Dodać 100 μΐ [1 χ 104] komórek/ml do wszystkich dołków w kolumnach 1-3 płytki 1 i do wszystkich dołków (z wyjątkiem Al, który jest pusty) innych płytek. Daje to 1000 komórek/dołek.
h. Włożyć płytki do inkubatora na czas przygotowania rozcieńczeń leku.
2. Preparaty kontrolne i badane leki (a) Przygotowanie szeregu rozcieńczeń 1:3 (35B, A-D) na płytce z 100% DMSO.
(1) Wprowadzić 60 μΐ DMSO do wszystkich dołków w kolumnach 2-12, rzędy A-E.
(2) Wprowadzić 70 μΐ 35B [10 mM] w 100% DMSO do dołka Al.
(3) Wprowadzić 70 μΐ A [10 mM] w 100% DMSO do dołka BI.
(4) Wprowadzić 70 μΐ B [10 mM] w 100% DMSO do dołka Cl.
(5) Wprowadzić 70 μΐ C [10 mM] w 100% DMSO do dołka Dl.
(6) Wprowadzić 70 μΐ D [10 mM] w 100% DMSO do dołka El.
(7) Kolejno rozcieńczać (35B, A-D) 1:3 w kierunku ku dołowi kolumny 12 przenosząc 30 μΐ z kolumny 1 do kolumny 2, następnie z kolumny 2 do kolumny 3 itd. Przed każdym rozcieńczeniem zmienić końcówkę.
(b) Wytwarzanie rozcieńczeń 1:10 na płytce w podłożu A:
(1) W rzędach A-E innej płytki zrobić rząd dla pierwszego rozcieńczenia 1:10, odpowiadający każdemu związkowi w rzędzie ze 100% DMSO
35B rzędu A dla pierwszego rozcieńczenia 1:10
A do rzędu B dla pierwszego rozcieńczenia 1:10
C do rzędu D dla pierwszego rozcieńczenia 1:10
D do rzędu E dla pierwszego rozcieńczenia 1:10 (2) Wprowadzić 180 μΐ podłoża A do wszystkich dołków w rzędach A-E odpowiadających rzędom ze 100% DMSO. Na rząd potrzebne jest 2,5 ml.
(3) Pobrać 20 μ 1 ze wszystkich dołków w każdym rzędzie ze 100% DMSO i przenieść do odpowiedniego rzędu 1:10
C. Wytwarzanie rozcieńczeń 1:100 na płytce w podłożu A:
(1) Przygotować płytkę dla każdych 3 związków, które mają być badane.
(2) Wprowadzić 225 μΐ podłoża A do wszystkich dołków w rzędach A, B, D, E, G i H, zostawiając puste rzędy C i F. Użyć 20 ml podłoża A na płytkę.
185 647 (3) Przenieść 25 μΐ każdego związku z rzędu z rozcieńczeniem 1:10 do odpowiadających mu dwóch rzędów na płytce z rozcieńczeniem 1:100, zmieniając końcówkę przed każdym przeniesieniem.
Nr kolumny Lek Stężenie (nM) Lek Stężenie (μΐ)
1 25000,00 25,00000
2 8333,00 8,33333
3 2778,00 2,77780
4 926,00 0,92593
5 309,00 0,30864
6 103,00 0,10288
7 34,00 0,34290
8 11,00 0,01143
9 3,81 0,00381
10 1,27 0,00127
11 0,42 0,00042
12 0,14 0,00014
3. Dodawanie wirusowego Snl23 na płytki
a. Rozmrozić Snl23 w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez około 10 minut.
b. Rozcieńczyć Snl23 1:16 dodając 1 ml Snl23 do 15 ml podłoża A.
c. Dodać 50 μΐ Sn 123 [1:16] do dołków El-HI 2 na płytkach 2-6 i do dołków E1-H3 na płytce 1.
4. Dodawanie leków na płytki
a. Dodać 50 μΐ leku kontrolnego i badanego z rzędów na płytkach z rozcieńczeniami 1:100 do odpowiednich rzędów na ostatnich płytkach (zmieniając końcówki przed każdym przeniesieniem). Jeden rząd na płytce 1:100 da 4 rzędy na ostatniej płytce. Al pozostawić niewypełniony.
b. Inkubować wszystkie płytki przez 7 dni w 37°C 5% CO2.
c. 7-go dnia sporządzić protokół Xtt następująco:
d. Przygotowanie roztworu Xtt/PMS: (4 płytka - 20 ml) (6 płytka = 30 ml) (1) Receptura na 2 mM PMS:
15,3 mg PMS + 0,5 ml PBS = PMS o stężeniu [100 mM]
100 μΐ [100 mM] PMS + 4,9 ml PBS = PMS o stężeniu [2 mM] (2) Ogrzać 500 ml H,0 przez 5 minut w kuchence mikrofalowej nastawionej na wysoką temperaturę.
(3) W 50 ml probówce do wirowania umieścić 20 lub 30 ml czerwieni fenolowej RPMI.
(4) Wstawić RPMI do zlewki z gorącą wodą.
(5) Do ogrzanej RPMI dodać 20 łub 30 mg ΧΤΤ. Końcowe stężenie ΧΤΤ = [1 mg/ml], (63 Czekać aż ΧΤΤ rozmiśc-i się, no czvm dodać 200 nl 12 mMl PMS na 10 ml roztworu ΧΤΈ Γ J r L .
(e). Dodawanie Xtt/PMS na płytkę:
(1) Dodać 50 μΐ roztworu ΧΤΤ/PMS do wszystkich dołków na wszystkich płytkach.
(2) Przykryć płytki i inkubować przez 4 godziny w 37°C w atmosferze 5% CO2.
(3) Wyjąć płytki z inkubatora i pokrywki zastąpić plastikowymi płytkami zgrzewanymi.
(4) Wymieszać zawartość dołków w płytkach (5) Odczytać płytki przy testowej długości fali 450 nM i długości odniesienia 650 nM
185 647
III. Próba fluorescencyjna na inhibitor proteazy HIV-1 przeprowadzona w ramach skriningu na hamowanie proteazy HIV (Wyniki przedstawione w tabeli 1 są oznaczone jako „Pandex” (ng/ml))
W teście stosuje się następujące skróty:
BSA albumina z surowicy wołowej
BOC t-butoksykarbonyl
BrZ 2-bromobenzyloksykarbonyl
2-Clz 2-chlorobenzyloksykarbonyl
DCC dicykloheksylokarbodiimid
DIEA diizopropyloetyloamina
DTT ditiotreitol
EDTA kwas etylenodiaminotetraoctowy
FITC fluoresceinoizotiokarbamyl
HEPES kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1 -piperazynoetanosulfonowy
MES kwas 4-morfolinoetanosulfonowy
PAM fenyloacetimidometyl
TAPS kwas 3-[tris(hydroksymetylo)metylo]amino-l -sulfonowy
TRIS tris(hydroksymetylo)aminometan
TOS p-toluenosulfonyl (tosyl)
A. Przygotowanie proteazy i frakcji Gag
1. Hodowla E. coli KI 2 L507/pHP10D
Liofilizaty E. coli K12 L507/pHP10D uzyskano z Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604, zdeponowane pod nr NRRL B-18560 14 listopada 1989 r. Liofilizaty zdekantowano do probówek zawierających 10 ml pożywki LB (10 g Bacto-tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego Bacto i 10 g/1 wodnego roztworu chlorku sodu; pH doprowadzono do 7,5 i inkubowano przez noc w 32°C).
Małą porcję z prowadzonej przez noc hodowli umieszczono na płytkach na podłożu LBagar (podłoże LB z 15 g/1 Bacto-agaru) zawierającym 12,5 pg tetracykliny/ml w taki sposób, aby uzyskać pojedynczy izolat z kolonii E. coli K12 L507/pHP10D. Otrzymaną pojedynczą kolonią inokulowano 10 ml podłoża LB zawierającego 12,5 pg tetracykliny/ml i inkubowano przez noc w 32°C z energicznym wytrząsaniem. 10-miłilitrami prowadzonej przez noc hodowli inokulowano podłożem LB zawierającą 12,5 pg tetracykliny/ml i inkubowano w 32 °C z energicznym wytrząsaniem aż hodowla osiągnęła środek fazy logarytmicznej (mid-log).
2. Hodowla E. coli KI2 L507/pHGAG
Liofilizaty E. coli KI 2 L5O7/pHGAG otrzymano z NRRL, gdzie zostały zdeponowane 14 listopada 1989 pod numerem NRRL B-18561. Oczyszczoną kolonię E. coli K12 L507/pHGAG wyizolowano i użyto jako inokulum do hodowli, którą prowadzono do fazy wzrostu mid-log, zasadniczo według wskazówek w etapie A powyżej dla E. coli KI2 L507/pHP10D.
3. Wytwarzanie frakcji proteazy
Hodowlę E. coli K12 L507/pHP10D prowadzono do fazy wzrostu mid-log w 32°C w podłożu LB zawierającym 12,5 pg tetracykliny/ml. Temperaturę hodowli szybko podniesiono do 40°C aby wywołać ekspresję genu i w tej temperaturze hodowano komórki przez 2,5 godziny, po czym szybko oziębiono hodowlę za pomocą lodu. Komórki odwirowano, a osad komórek ponownie zawieszono w 20 ml 50 mmol buforu MES (pH 6,0) zawierającego 1 mmol EDTA, 1 mmol DTT, 1 mmol PMSF i 10% gliceryny (Bufor A). Komórki poddano lizie za pomocą ultradźwięków stosując aparat Fisher Model 300 Dismembrator i sondę z mikrokońcówką. Po wirowaniu przy 27 000 x g supematant rozcieńczono do całkowitej objętości 60 mi Buforem A i załadowano do kolumny QAE-Sepharose 2,0 x 19 cm (1 ml/min., 4°Ć), zrównoważonej Buforem A. Kolumnę przemyto w warunkach izokratycznych przez 180 min., po czym eluowano gradientem 0-1,0 M wodnego chlorku sodu w Buforze A przez 120 minut. Zmierzono aktywność enzymatyczną metodą HPLC stosując syntetyczny peptyd Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val opisany w publikacji Margolin i in., Biochem. Biophys. Res. Commun., 167, 554-560 (1990); zmierzono produkcję peptydu pl (Ser-Glu-Asn-Tyr).
185 647
Aktywne frakcje połączono, pH doprowadzono do 1,2 M w siarczanie amonu i naniesiono na kolumnę z heksyloagarozą 2,0 x 18 cm, zrównoważoną Buforem A zawierającym 1,2M siarczanu amonu. Próbkę wprowadzono z szybkością przepływu 1 mł/min, w 4°C, przemyło w ciągu 240 min. buforem stosowanym do zrównoważenia (1 ml/min.), po czym eluowano stosując odwrotny liniowy gradient 1,2-0 M siarczanu amonu w Buforze A, przez 120 min. przy takiej samej szybkości przepływu. Kolumnę przemyto Buforem A w warunkach izokratycznych przez 120 min.
Aktywne frakcje połączono, zatężono do 10 ml stosując komórkę z mieszaniem Amicon zaopatrzoną w membranę YM-10, po czym wprowadzono na kolumnę kationowymienną MOnos (1,0 x 10 cm), zrównoważoną Buforem A. Próbkę wprowadzono przy szybkości przepływu 1 ml/min w 25°C. Po przemywaniu w warunkach izokratycznych w ciągu 30 minut wyeluowano proteazę stosując liniowy gradient 0-0,45 M wodnego roztworu chlorku sodu w Buforze A w ciągu 40 minut. Kolumnę przemyto izokratycznie Buforem A zawierającym 0,45 M wodny roztwór chlorku sodu przez 30 minut.
Aktywne frakcje połączono i zatężono do 200 μΐ stosując komórkę z mieszaniem Amicon zaopatrzoną w membranę YM-10, po czym proteazę wprowadzono do kolumny do chromatografii ekskluzywnej Superose 6, zrównoważonej Buforem A zawierającym 0,1 M wodny roztwór chlorku sodu. Kolumnę przemyło izokratycznie tym buforem z szybkością przepływu 0,5 ml/min., po czym wyeluowano proteazę HIV jako pojedynczy pik.
QAE.-Sepharose i heksyloagarozę zakupiono z firmy Sigma Chemical Company. Superose 6 i Monos zakupiono z firmy Pharmacia, bufory i reagenty z firmy Sigma.
4. Wytwarzanie frakcji Gag
W analogiczny sposób prowadzono hodowlę E. coli KI2 507/pHGAG do fazy wzrostu midlog w 32°C, po czym przez około 4 do 5 godzin podniesiono temperaturę do 40°C. Hodowlę ochłodzono w lodzie i odwirowano, po czym osad komórek zawieszono ponownie w 8 ml buforu do łizy zawierającego 5 mg lizozymu/ml. Bufor do lizy zawierał 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 1 pg/mł E64 i 2 pg aprotyniny/mi. Hodowlę inkubowano około 30 do 60 minut w 4°C, po czym krotko poddano sonrkacji w aparacie Bronson® Celi Disrupter przy 60% mocy stosując trzy 20-sekundowe impulsy z chłodzeniem pomiędzy impulsami. Następnie hodowlę odwirowano przy 15 000 x g. Supematant, który zawiera białko gag nieobrobione, oczyszczono częściowo metodą chromatografii ekskluzyjnej w kolumnie Sephadex G-50 i przechowywano w -20°C w 50% glicerynie i buforze do lizy.
B. Wytwarzanie substratu: Na-Biotyna-Gly-Ser-Gin-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gly-Lys (NeFITC)-OH (a = alfa, e = epsilon)
1. Wytwarzanie biotynylowanego peptydu z aminową grupą końcową
Zsyntetyzowano chroniony peptyd na żywicy FT-Boc-Gly-Ser-GIn-Asn-Tyr (BrZ)-ProIle-Val-Gly-Lys (2-C1Z) -OCH2-PAM-żywica w syntezerze peptydów Advanced Chemtech Model 200 w skal 1,5 mmola według standardowego protokołu „double couple”. Grupę t-Boc przy końcowej grupie aminowej usunięto stosując 50% kwas trifluorooctowy w chlorku metylenu i uzyskaną żywicę zobojętniono 5% diizopropyloetyloaminą (DIEA) w chlorku metylenu. Następnie do peptydu na żywicy dodano 1,1 g (4,5 mmoli) biotyny w 20 ml sulfotlenku dimetylu, następnie 4,5 mmola dicykloheksylokarbodiimidu (DCC) w 9 ml chlorku metylenu. Wytworzoną mieszaninę reakcyjną rozcieńczono do całkowitej objętości 40 ml stosując 11 ml chlorku metylenu, po czym pozostawiono do przereagowania na około 5 godzin. Roztwór reakcyjny zatężono, żywicę przemyto kolejno sulfotlenkiem dimetylu, dimetyloformamidem i chlorkiem metylenu i następnie zobojętniono 5% DIEA w chlorku metylenu. Tę reakcję powtóizono dwukrotnie, przedłużając czas reakcji do 12 godzin na reakcję. Analiza żywicy z udziałem ninhydryny wykazała, że reakcja biotyny z grupą, aminową glicyny zaszła całkowicie. Wytworzony peptyd z żywicą przemyto intensywnie dimetyloformamidem i chlorkiem metylenu i wysuszono i otrzymano 4,3 g produktu (98% wydajność).
2. Usunięcie grup ochronnych
Z peptydu usunięto grupy ochronne i odszczepiono od żywicy, stosując 50 ml roztworu kwasu fluorowodorowy/m-krezol, 0°C, 1 godzina. Po usunięciu kwasu fluorowodorowego
185 647 przez destylację próżniową z mieszaniny reakcyjnej wyekstrahowano m-krezol stosując 100 ml eteru dietylowego. Następnie peptyd rozpuszczono w 50% wodnym roztworze kwasu octowego, zamrożono i liofilizowano i otrzymano 2,14 g produktu.
3. Oczyszczanie
Surowy peptyd, biotynylowany przy aminowym końcu, rozpuszczono w 200 ml 5% roztworu acetonitrylu w wodzie zawierającego 0,1% kwas trifluorooctowy i następnie przefiltrowano przez 0,22 μ filtr. Wytworzony roztwór naniesiono na kolumnę z odwróconymi fazami oktadecylkrzemionka 2,2 x 25 cm (Vydac C-18), zrównoważoną takim samym buforem. Peptyd eluowano stosując 855 min. liniowy gradient 7,5-25% acetonitrylu, przy szybkości 2 ml/min, i zebrano frakcje. Frakcje te analizowano metodą analitycznej HPLC na kolumnie Vydac C-18 4,6 x 250 mm z użyciem podobnych warunków buforowania. Frakcje zawierające żądany materiał połączono, zamrożono i liofilizowano i otrzymano 1,206 g (62% wydajność) produktu.
Analiza aminokwasowa wydzielonego biotynylowanego peptydu wykazała następujące stosunki, zgodne z teoretycznymi: Asn 1,1; Ser 0,96; Gin 1,1; Pro 1,1; Gly 2,1; Val 0,80; Ile 0,78; Tyr 1,1; Lys 1,1. W spektrometrii mas zbombardowaniem szybkimi atomami uzyskano pik masowy dla jonu cząsteczkowego 1288, zgodny z teoretyczną wartością.
4. Znakowanie
Następnie oczyszczony biotynylowany peptyd znakowano fluorescencyjnym markerem przy C-końcu i stosowano go w próbie Pandex. Najpierw biotynylowany peptyd (1,206 g, 0,936 mmola) rozpuszczono w 100 ml 0,1 M boranu sodu, pH 9,5. Następnie, roztwór 3 g (7,7 mmoli) izotiocyjanianu fluoresceiny w 15 ml sulfotlenku dimetylu dodano do mieszaniny reakcyjnej w 10 równych porcjach w ciągu 2 godzin. Po ostatniej porcji wytworzoną mieszaninę pozostawiono do przereagowania na 1 godzinę. pH roztworu doprowadzono do 3 stosując 5 N kwas solny, co spowodowało wytrącenie się osadu, który usunięto przez odwirowanie.
Następnie pH roztworu peptydu doprowadzono do wartości 7,8 za pomocą 5 N wodorotlenku sodu, po czym rozcieńczono do 200 ml dodając 0,1 M octan amonu, pH 7,5. Następnie wytworzony roztwór przesączono przez filtr 0,22 μ i wprowadzono na kolumnę Vydac C-18 2,2 x 25 cm, zrównoważoną 5% roztworem acetonitrylu w 0,1 M octanie amonu (pH 7,5). Peptyd wyeluowano z kolumny stosując 855 min. liniowy gradient 5-25% acetonitrylu przy szybkości 2 ml/min, i zebrano frakcje. Do analizowania frakcji stosowano analityczną HPLC. Frakcje zawierające żądany produkt połączono, zamrożono i liofilizowano i otrzymano 190,2 mg (12%) produktu.
Analiza aminokwasowa oczyszczonego peptydu wykazała zgodność z teorią: Asn 1,1; Ser 1,0; Gin 1,1; Pro 1,1; Gly 2,1; Val 0,8; Ile 0,8; Tyr 1,1; Lys 1,0. W spektrometrii masz bombardowaniem szybkimi atomami uzyskano pik masowy dla jonu molekularnego 1678, zgodny z teorią,
S. Fluorescencyjna próba na inhibitor proteazy HIV-1 W próbie tej stosowano następujące bufory i roztwory:
Bufor MES-ALB:
Bufor TBSA:
Roztwór kuleczek pokrytych awidyną
0,05 M 4-morfolinoetan kwas sulfonowy, pH 5,5
0,02 M NaCl
0,002 M EDTA
0,001 M DTT
1,0 mg/mlBSA
0,02 M TRIS
0,15 M NaCl
1,0 mg/ml BSA
0,1 % roztwór cząstek Fluoricon do próby 7. awidwia iąwidvna snrzeżona ze stałvmi kuleczkami polistyrenowymi o średnicy 0,6-0,8 μ w buforze TBSA
Roztwór enzymu:
lU/ml oczyszczonej proteazy HIV-1 w buforze MES-ALV (1IU równa jest ilości enzymu potrzebnej do zhydrolizowania 1 pmola substratu na minutę w 37°C)
185 647
Do każdego dołka w okrągłodennej płytce z 96 dołkami dodaje się 20 μΐ roztworu enzymu, następnie 10 μΐ związku, który ma być badany, w 20% wodnym roztworze sulfotlenku di-metylu. Otrzymano oczyszczoną proteazę HIV-1 jak opisano powyżej. Wytworzony roztwór inkub uje się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, po czym do każdego dołka dodaje się 20 μΐ roztworu zawierającego substrat, przygotowany jak powyżej, w buforze MES-AL V (1,5 μΐ/ml). Następnie roztwór inkubuje się przez 16 godzin w temperaturze pokojowej i zawartość każdego dołka rozcieńcza się 150 μΐ buforu MES-ALB.
Do każdego z 96 dołków drugiej okrągłodennej płytki Pandex dodaje się 25 μΐ roztworu kuleczek pokrytych awidyną. Następnie do każdego dołka dodaje się 25 μΐ rozcieńczonych roztworów do inkubacji, przygotowanych jak powyżej. Roztwory miesza się dokładnie i płytki umieszcza się w urządzeniu Pandex, przemywa się, odpowietrza i odczytuje. Badanie próbki przeprowadzono przez wzbudzenie przy 485 nm odczytując uzyskaną epifluorescencję przy 535 nm.
Wyniki IC50 uzyskane w próbie fluoroscencyjnej dla związków według wynalazku są zestawione poniżej w tabelach 1 i 2. Wszystkie wartości są odniesione do dodatniej próby kontrolnej, którą stanowi [lS-(lR*,4R*,5S*)]-N-(l-(2-amino-2-oksoetylo)-2-okso-3-aza-4-fenylometylo-5-hydroksy-6-(2-( 1 -t-butyloamino-1 -oksometylo)fenylo)heksylo)-2-chinolinylokarboksamid.
Dane dotyczące aktywności dla związku według wynalazku są przedstawione w tabelach 1 i 2 poniżej i w poprzedzających przykładach. Wyniki w nawiasach dotyczą przykładu 1 w opublikowanym europejskim zgłoszeniu patentowym 0 526 009 Al = 35B w takiej samej próbie.
Tabela 1
Wyniki w nawiasach dotyczą przykładu 1 opublikowanego zgłoszenia patentowego 0 526 009 Al = 35B w tych samych testach
Przykład Cała komórka IC50nM Cała komórka ICjo nM SRICEM ng/ml SRIMT2 ng/ml Pandex ng/ml
3 2,39 (9,93) 19,0 (53,5) 8,62 6,27 0,2a 0,16b
3 2,39 (9,93) 19,0 (53,5) 8,62 6,27 0,2c 0,16b
4 14,5 56,1
a) 35B 9,3 ng/ml; b) 35B 0,63 ng/ml; c) 35B 2,7 ng/ml
Tabela 2
Aktywność hamowania
Przykład Nr Próba Fluorescencyjna IC50 w ąg/ml
Kontrola 1,0
3 0,25
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (11)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Nowy inhibitor proteazy HIV, 2-[2'-hydroksy-3'-fenylotiometylo-4'-aza-5'-okso-5'-(2-metylo-3-hydroksyfenylo)pentylo]dekahydroizochinolino-3-N-t-butylokarboksamid o wzorze 1
    i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole.
  2. 2. Inhibitor według zastrz. 1, w postaci stereoizomeru o wzorze 2
    i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole.
  3. 3. Inhibitor według zastrz. 2. w postaci zasadniczo czystej soli,
  4. 4. Inhibitor według zastrz. 2 w postaci zasadniczo czystego steroizomeru.
  5. 5. Inhibitor według zastrz. 1 w postaci soli o wzorze 3
    185 647
  6. 6. Inhibitor według zastrz. 5 w postaci stereoizomeru o wzorze 4
  7. 7. Inhibitor według zastrz. 6 w postaci zasadniczo czystego stereoizomeru.
  8. 8. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera skuteczną ilość związku o wzorze 1
    lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.
  9. 9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera stereoizomer związku określonego w zastrz. 8, przedstawiony wzorem 2
    lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.
  10. 10. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość związku o wzorze 3
    185 647 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
  11. 11. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera stereoizomer związku określonego w zastrz. 10, przedstawiony wzorem 4
    * * *
PL94313871A 1993-10-07 1994-10-07 Nowy inhibitor proteazy HIV i kompozycja farmaceutyczna PL185647B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13354393A 1993-10-07 1993-10-07
US13369693A 1993-10-07 1993-10-07
US08/190,764 US5484926A (en) 1993-10-07 1994-02-02 HIV protease inhibitors
PCT/US1994/011307 WO1995009843A1 (en) 1993-10-07 1994-10-07 Hiv protease inhibitors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL313871A1 PL313871A1 (en) 1996-07-22
PL185647B1 true PL185647B1 (pl) 2003-06-30

Family

ID=27384442

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL94313871A PL185647B1 (pl) 1993-10-07 1994-10-07 Nowy inhibitor proteazy HIV i kompozycja farmaceutyczna

Country Status (35)

Country Link
US (14) US5484926A (pl)
EP (3) EP0889036B1 (pl)
JP (2) JP2951724B2 (pl)
KR (1) KR100190517B1 (pl)
CN (2) CN1046269C (pl)
AP (1) AP600A (pl)
AT (3) ATE222240T1 (pl)
AU (1) AU694746B2 (pl)
BG (1) BG62567B1 (pl)
BR (1) BR9407782A (pl)
CA (2) CA2268709C (pl)
CZ (1) CZ290417B6 (pl)
DE (3) DE69431193T2 (pl)
DK (2) DK0722439T3 (pl)
EE (1) EE05399B1 (pl)
ES (3) ES2236849T3 (pl)
FI (1) FI114794B (pl)
GE (2) GEP20002209B (pl)
HU (2) HU226814B1 (pl)
MD (1) MD1507G2 (pl)
MY (1) MY138860A (pl)
NO (1) NO307050B1 (pl)
NZ (2) NZ329626A (pl)
OA (1) OA10718A (pl)
PL (1) PL185647B1 (pl)
PT (2) PT889036E (pl)
RO (1) RO119363B1 (pl)
RU (1) RU2139280C1 (pl)
SI (2) SI0722439T1 (pl)
SK (2) SK284115B6 (pl)
TJ (1) TJ339B (pl)
TW (1) TW432049B (pl)
UA (1) UA56984C2 (pl)
UY (1) UY23840A1 (pl)
WO (1) WO1995009843A1 (pl)

Families Citing this family (148)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040122000A1 (en) 1981-01-07 2004-06-24 Vertex Pharmaceuticals Incorporated. Inhibitors of aspartyl protease
US6878728B1 (en) 1999-06-11 2005-04-12 Vertex Pharmaceutical Incorporated Inhibitors of aspartyl protease
USH1649H (en) * 1987-07-31 1997-05-06 Barrish; Joel C. HIV protease inhibitor combinations
US7141609B2 (en) 1992-08-25 2006-11-28 G.D. Searle & Co. α- and β-amino acid hydroxyethylamino sulfonamides useful as retroviral protease inhibitors
PT810209E (pt) 1992-08-25 2002-09-30 Searle & Co Hidroxietilamino-sulfonamidas de alfa- e beta-aminoacidos uteis como inibidores de protease retroviral
US5484926A (en) 1993-10-07 1996-01-16 Agouron Pharmaceuticals, Inc. HIV protease inhibitors
US5514801A (en) 1992-12-29 1996-05-07 Monsanto Company Cyclic sulfone containing retroviral protease inhibitors
IL110255A (en) * 1993-07-16 1998-12-06 Merck & Co Inc Formation and resolution of 2-tert-butylcarboxamido-piperazine
CA2182090A1 (en) * 1994-02-02 1995-08-10 William Joseph Hornback Hiv protease inhibitors and intermediates
US5480887A (en) * 1994-02-02 1996-01-02 Eli Lilly And Company Protease inhibitors
US5461154A (en) * 1994-02-02 1995-10-24 Eli Lilly And Company Intermediate and process for making
UA49803C2 (uk) * 1994-06-03 2002-10-15 Дж.Д. Сьорль Енд Ко Спосіб лікування ретровірусних інфекцій
US20030207813A1 (en) * 1996-12-09 2003-11-06 G.D. Searle Retroviral protease inhibitor combinations
US5831117A (en) * 1995-01-20 1998-11-03 G. D. Searle & Co. Method of preparing retroviral protease inhibitor intermediates
US6037157A (en) 1995-06-29 2000-03-14 Abbott Laboratories Method for improving pharmacokinetics
WO1997011938A1 (en) * 1995-09-26 1997-04-03 Japan Tobacco Inc. Process for producing amide derivatives and intermediate compounds
US6133461A (en) 1995-09-26 2000-10-17 Japan Tobacco Inc. Process for producing amide derivatives and intermediates therefor
US5914332A (en) 1995-12-13 1999-06-22 Abbott Laboratories Retroviral protease inhibiting compounds
MY126358A (en) * 1996-03-22 2006-09-29 Glaxo Group Ltd Compositions comprising vx478 and a water soluble tocopherol derivative such as vitamin e-tpgs
TW346612B (en) * 1996-06-05 1998-12-01 Sega Enterprises Kk Image processor, image processing method, game machine and recording medium
US5925759A (en) 1996-09-05 1999-07-20 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making HIV-protease inhibitors and intermediates for making HIV-protease inhibitors
US5705647A (en) * 1996-09-05 1998-01-06 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Intermediates for making HIV-protease inhibitors
US5962725A (en) 1996-09-05 1999-10-05 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Intermediate compounds useful for making HIV protease inhibitors such as nelfinavir
UA67727C2 (uk) * 1996-09-05 2004-07-15 Агурон Фармасевтікелс, Інк. Проміжні сполуки для одержання інгібіторів віл-протеази і способи одержання інгібіторів віл-протеази
US6232333B1 (en) 1996-11-21 2001-05-15 Abbott Laboratories Pharmaceutical composition
DE19704885C1 (de) * 1997-02-11 1998-06-10 Clariant Gmbh Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxy-2-methylbenzoesäure und 3-Acetoxy-2-methylbenzoesäure
HRP980112A2 (en) * 1997-03-13 1998-12-31 Agouron Pharma Hiv protease inhibitors
US6001851A (en) * 1997-03-13 1999-12-14 Agouron Pharmaceuticals, Inc. HIV protease inhibitors
CA2286013C (en) * 1997-04-10 2003-07-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for making a butylthio-isoquinoline and intermediates therefor
US6130348A (en) 1997-04-10 2000-10-10 Hoffmann-La Roche Inc. Process for a phenylthiobutyl-isoquinoline and intermediates therefor
US6123694A (en) * 1997-05-09 2000-09-26 Paragon Trade Brands Disposable absorbent article with unitary leg gathers
DE19730602A1 (de) * 1997-07-17 1999-01-21 Clariant Gmbh 3-Acetoxy-2-methylbenzoesäurechlorid und ein Verfahren zu seiner Herstellung
US6084107A (en) * 1997-09-05 2000-07-04 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Intermediates for making HIV-protease inhibitors
US6436989B1 (en) 1997-12-24 2002-08-20 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Prodrugs of aspartyl protease inhibitors
IN188157B (pl) 1998-01-16 2002-08-24 Japan Tobacco Inc
US6124500A (en) * 1998-03-09 2000-09-26 Rohm And Haas Company Process for synthesizing benzoic acids
FR2776292B1 (fr) * 1998-03-20 2004-09-10 Oncopharm Cephalotaxanes porteurs de chaine laterale et leur procede de synthese
AU6852998A (en) * 1998-04-16 1999-11-08 Nagase & Company, Ltd. Process for preparing chloro alcohol derivatives and intermediates
DK1086076T3 (da) 1998-06-19 2005-03-29 Vertex Pharma Sulfonamidinhibitorer af aspartylprotease
US6538006B1 (en) 1998-07-08 2003-03-25 Pharmacia Corporation Retroviral protease inhibitors
US6107511A (en) * 1998-07-29 2000-08-22 Kaneka Corporation Process for the purification or isolation of (2S,3R)-1-halo-2-hydroxy-3-(protected amino)4-phenylthiobutanes or optical antipodes thereof
US7635690B2 (en) * 1999-01-22 2009-12-22 Emory University HIV-1 mutations selected for by β-2′,3′-didehydro-2′,3′-dideoxy-5-fluorocytidine
US7115584B2 (en) * 1999-01-22 2006-10-03 Emory University HIV-1 mutations selected for by β-2′,3′-didehydro-2′,3′-dideoxy-5-fluorocytidine
TWI260322B (en) 1999-02-12 2006-08-21 Vertex Pharma Inhibitors of aspartyl protease
BR0009200A (pt) 1999-03-22 2001-12-26 Immugen Pharmaceuticals Inc Compostos e composições para o tratamento dedoenças associada com disfunção imune
US6566560B2 (en) 1999-03-22 2003-05-20 Immugen Pharmaceuticals, Inc. Resorcinolic compounds
EP1202626A4 (en) * 1999-07-20 2002-10-30 Merck & Co Inc ALPHA HYDROXY GAMMA (CARBOZYCLIC OR HETEROCYCLICALLY SUBSTITUTED) AMINOCARBONYLALKANAMIDE DERIVATIVES AND THEIR USE
US6589962B1 (en) 1999-07-20 2003-07-08 Merck & Co., Inc. Alpha-hydroxy-gamma-[[(carbocyclic-or heterocyclic-substituted)amino]carbonyl]alkanamide derivatives and uses thereof
KR100339831B1 (ko) 1999-08-18 2002-06-07 김태성 신규의 에틸 아지리딘 유도체 및 그 제조방법
US6403799B1 (en) 1999-10-21 2002-06-11 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Methods for the preparation of intermediates in the synthesis of HIV-protease inhibitors
JP2003514910A (ja) 1999-11-24 2003-04-22 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド Ｈｉｖプロテアーゼ阻害剤としてのガンマ−ヒドロキシ−２−（フルオロアルキルアミノカルボニル）−１−ピペラジンペンタンアミド類
EP1248600B1 (en) 2000-01-19 2008-05-14 Abbott Laboratories Improved hiv protease inhibitors pharmaceutical formulations
US6992081B2 (en) 2000-03-23 2006-01-31 Elan Pharmaceuticals, Inc. Compounds to treat Alzheimer's disease
WO2001070672A2 (en) * 2000-03-23 2001-09-27 Elan Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods to treat alzheimer's disease
AU2001259817A1 (en) 2000-05-04 2001-11-12 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The National Institutes Of Health Methods of and compounds for inhibiting calpains
US20020198207A1 (en) * 2000-05-18 2002-12-26 Kath John Charles Novel Hexanoic acid derivatives
EP1666452A2 (en) 2000-06-30 2006-06-07 Elan Pharmaceuticals, Inc. Compounds to treat Alzheimer's disease
US20030096864A1 (en) * 2000-06-30 2003-05-22 Fang Lawrence Y. Compounds to treat alzheimer's disease
AU2001271686A1 (en) * 2000-06-30 2002-01-14 Elan Pharmaceuticals, Inc. Compounds to treat alzheimer's disease
US6846813B2 (en) * 2000-06-30 2005-01-25 Pharmacia & Upjohn Company Compounds to treat alzheimer's disease
PE20020276A1 (es) 2000-06-30 2002-04-06 Elan Pharm Inc COMPUESTOS DE AMINA SUSTITUIDA COMO INHIBIDORES DE ß-SECRETASA PARA EL TRATAMIENTO DE ALZHEIMER
US7425537B2 (en) * 2000-08-22 2008-09-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services SH2 domain binding inhibitors
US20020137802A1 (en) * 2000-09-28 2002-09-26 Travis Craig R. Methods and compounds for inhibiting eicosanoid metabolism and platelet aggregation
AU2002213429A1 (en) * 2000-09-28 2002-04-08 Immugen Pharmaceuticals, Inc. Antiviral methods and compounds
IT1318986B1 (it) * 2000-10-09 2003-09-19 Archimica S P A Ora Clariant L Procedimento per la preparazione di (s)-n-terbutil-1,2,3,4-tetraidroisochinolin-3-carbossiammide.
EP1358458B1 (en) * 2000-10-19 2012-04-04 Target Discovery, Inc. Mass defect labeling for the determination of oligomer sequences
GB0028483D0 (en) * 2000-11-22 2001-01-10 Hoffmann La Roche Hydroxyethylamine HIV protease inhibitors
WO2002064553A1 (en) * 2001-02-14 2002-08-22 Kureha Chemical Industry Company, Limited Process for preparation of halogenoalcohol derivatives
HN2002000136A (es) 2001-06-11 2003-07-31 Basf Ag Inhibidores de la proteasa del virus hiv, compuestos que contienen a los mismos, sus usos farmaceuticos y los materiales para su sintesis
CA2452039A1 (en) * 2001-06-27 2003-01-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Beta-hydroxyamine derivatives useful in treatment of alzheimer's disease
US20070213407A1 (en) * 2001-06-29 2007-09-13 Elan Pharmaceuticals And Pharmacia & Upjohn Company Llc Compounds to treat Alzheimer's disease
US20030191121A1 (en) * 2001-08-09 2003-10-09 Miller Ross A. Piperazine carboxamide intermediates of HIV protease inhibitors and processes for their preparation
US20030068655A1 (en) * 2001-09-12 2003-04-10 Protiveris, Inc. Microcantilever apparatus and methods for detection of enzymes
US6696494B2 (en) 2001-10-22 2004-02-24 Enanta Pharmaceuticals, Inc. α-hydroxyarylbutanamine inhibitors of aspartyl protease
EP2316468A1 (en) 2002-02-22 2011-05-04 Shire LLC Delivery system and methods for protecting and administering dextroamphetamine
US20040067216A1 (en) * 2002-02-22 2004-04-08 Karki Shyam B. Hiv protease inhibitors supported on cation exchange resins for oral administration
US7157489B2 (en) * 2002-03-12 2007-01-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois HIV protease inhibitors
WO2003080043A1 (en) * 2002-03-18 2003-10-02 Immugen Pharmaceuticals, Inc. Topical formulations of resorcinols and cannibinoids and methods of use
DE10212885A1 (de) * 2002-03-22 2003-10-02 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxy-2-methylbenzoesäure
EP1371626A3 (de) * 2002-06-13 2004-07-21 Bayer Chemicals AG Verfahren zur Herstellung von 3-Alkoxy-2-methylbenzoesäuren
DE10226219A1 (de) * 2002-06-13 2004-01-08 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von 3-Acyloxy-2-methylbenzoesäuren
CA2393720C (en) 2002-07-12 2010-09-14 Eli Lilly And Company Crystalline 2,5-dione-3-(1-methyl-1h-indol-3-yl)-4-[1-(pyridin-2-ylmethyl)piperidin-4-yl]-1h-indol-3-yl]-1h-pyrrole mono-hydrochloride
ATE321059T1 (de) 2002-08-21 2006-04-15 Chirale diphosphorverbindungen und deren übergangsmetallkomplexe
PL377712A1 (pl) 2003-02-13 2006-02-06 Wellstat Therapeutics Corporation Związki do leczenia zaburzeń metabolicznych
BRPI0410125A (pt) * 2003-05-08 2006-05-09 Pfizer intermediários úteis para a sìntese de inibidores de protease de hiv, e métodos para os preparar
CN100475209C (zh) * 2003-07-15 2009-04-08 阿利健制药有限公司 抗冠状病毒剂
US7211588B2 (en) * 2003-07-25 2007-05-01 Zentaris Gmbh N-substituted indolyl-3-glyoxylamides, their use as medicaments and process for their preparation
US8025899B2 (en) * 2003-08-28 2011-09-27 Abbott Laboratories Solid pharmaceutical dosage form
US8377952B2 (en) * 2003-08-28 2013-02-19 Abbott Laboratories Solid pharmaceutical dosage formulation
DE602005027466D1 (de) 2004-07-27 2011-05-26 Gilead Sciences Inc Nukleosid phosphonat konjugate als anti hiv mittel
DK1814858T3 (en) * 2004-08-23 2015-05-26 Mylan Lab Ltd NOVEL crystalline forms of nelfinavir mesylate
CA2602854C (en) 2005-04-01 2013-05-14 Wellstat Therapeutics Corporation Compounds for the treatment of metabolic disorders
WO2007015805A1 (en) 2005-07-20 2007-02-08 Eli Lilly And Company 1-amino linked compounds
WO2007015807A1 (en) 2005-07-20 2007-02-08 Eli Lilly And Company Phenyl compounds
EP1976377A4 (en) 2006-01-25 2010-06-23 Wellstat Therapeutics Corp COMPOUNDS FOR THE TREATMENT OF METABOLIC DISORDERS
JP2009524686A (ja) 2006-01-25 2009-07-02 ウェルスタット セラピューティクス コーポレイション 代謝障害を処置するための化合物
CA2639939A1 (en) 2006-02-02 2007-08-16 Wellstat Therapeutics Corporation Compounds for the treatment of metabolic disorders
JP4788958B2 (ja) * 2006-02-28 2011-10-05 東亞合成株式会社 抗ウイルス性ペプチドおよびその利用
JP4831410B2 (ja) * 2006-02-28 2011-12-07 東亞合成株式会社 抗ウイルス性ペプチドおよび抗ウイルス剤
ES2596532T3 (es) * 2006-03-16 2017-01-10 Second Genome, Inc. Compuestos de bicicloheteroarilo como moduladores de P2X7 y usos de los mismos
WO2008033466A2 (en) * 2006-09-14 2008-03-20 Combinatorx (Singapore) Pre. Ltd. Compositions and methods for treatment of viral diseases
WO2008041087A1 (en) * 2006-10-06 2008-04-10 Aurobindo Pharma Limited An improved process for preparation of amorphous nelfinavir mesylate
US8598364B2 (en) 2007-03-12 2013-12-03 Nektar Therapeutics Oligomer-protease inhibitor conjugates
WO2009006203A1 (en) * 2007-06-29 2009-01-08 Gilead Sciences, Inc. Therapeutic compositions and the use thereof
TW200914011A (en) * 2007-06-29 2009-04-01 Gilead Sciences Inc Therapeutic compositions and methods
WO2009036341A2 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to hiv protease inhibition
JP2010540517A (ja) * 2007-09-25 2010-12-24 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション Ｈｉｖプロテアーゼ阻害剤
WO2009114151A1 (en) * 2008-03-12 2009-09-17 Nektar Therapeutics Oligomer-amino acid and olgomer-atazanavir conjugates
BRPI0924547B1 (pt) 2008-03-13 2021-08-17 Wellstat Therapeutics Corporation Composto ácido 2-(3-(2,6-dimetilbenzilóxi)-4-metilfenil)acético, sua composição, bem como seu uso
US8173621B2 (en) 2008-06-11 2012-05-08 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside cyclicphosphates
DK2364314T3 (da) 2008-12-09 2014-05-12 Gilead Sciences Inc Modulatorer af toll-lignende receptorer
EP3210603A1 (en) * 2008-12-11 2017-08-30 Shionogi & Co., Ltd Synthesis of carbamoylpyridone hiv integrase inhibitors and intermediates
WO2010075554A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Pharmasset, Inc. Synthesis of purine nucleosides
AR074897A1 (es) * 2008-12-23 2011-02-23 Pharmasset Inc Fosforamidatos de nucleosidos
WO2010075517A2 (en) * 2008-12-23 2010-07-01 Pharmasset, Inc. Nucleoside analogs
EP2435037B1 (en) 2009-05-27 2014-11-12 Merck Sharp & Dohme Corp. Hiv protease inhibitors
JP2012530069A (ja) 2009-06-12 2012-11-29 ネクター セラピューティックス プロテアーゼ阻害剤、水溶性非ペプチドオリゴマーおよび親油性部分を含む共有結合体
EP3632901B1 (en) * 2009-12-10 2022-02-02 The Trustees of Columbia University in the City of New York Histone acetyltransferase activators and uses thereof
US10640457B2 (en) 2009-12-10 2020-05-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Histone acetyltransferase activators and uses thereof
DE102010004957A1 (de) 2010-01-14 2011-07-21 Universitätsklinikum Jena, 07743 Biologisch wirksame Moleküle zur Beeinflussung von Virus-, Bakterien-, Parasiten-infizierten Zellen und/oder Tumorzellen und Verfahren zu deren Anwendung
US20110223131A1 (en) 2010-02-24 2011-09-15 Gilead Sciences, Inc. Antiviral compounds
US8247436B2 (en) 2010-03-19 2012-08-21 Novartis Ag Pyridine and pyrazine derivative for the treatment of CF
RS54368B1 (sr) 2010-03-31 2016-04-28 Gilead Pharmasset Llc Kristalni (s)-izopropil 2-(((s)-(((2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-diokso-3,4-dihidropirimidin-1-(2h)-il)-4-fluoro-3-hidroksi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoksi)(fenoksi)fosforil)amino)propanoat
TWI577377B (zh) 2010-09-16 2017-04-11 Ｖｉｉｖ醫療保健公司 醫藥組合物
WO2012055031A1 (en) 2010-10-28 2012-05-03 Merck Canada Inc. Hiv protease inhibitors
US9133157B2 (en) 2011-10-26 2015-09-15 Merck Canada Inc. HIV protease inhibitors
AU2013315833A1 (en) 2012-09-11 2015-03-05 Merck Canada Inc. HIV protease inhibitors
CA2889903C (en) 2012-10-29 2021-03-09 Manjinder Singh Phull Antiviral phosphonate analogues and process for preparation thereof
RU2505286C1 (ru) * 2012-12-29 2014-01-27 Открытое Акционерное Общество "Фармасинтез" Фармацевтическая композиция для лечения вич-инфекции, способ ее получения и способ лечения
WO2015013835A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Piperazine derivatives as hiv protease inhibitors
RU2543322C1 (ru) * 2013-09-19 2015-02-27 Открытое Акционерное Общество "Фармасинтез" Фармацевтическая композиция для лечения вич-инфекции, способ ее получения и способ лечения
WO2015095276A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Hiv protease inhibitors
EP3083609B1 (en) 2013-12-19 2018-08-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Hiv protease inhibitors
EP3113780B1 (en) 2014-03-06 2019-08-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Hiv protease inhibitors
US10138255B2 (en) 2014-03-10 2018-11-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Piperazine derivatives as HIV protease inhibitors
WO2016001907A1 (en) 2014-07-02 2016-01-07 Prendergast Patrick T Mogroside iv and mogroside v as agonist/stimulator/un-blocking agent for toll-like receptor 4 and adjuvant for use in human/animal vaccine and to stimulate immunity against disease agents.
TWI733652B (zh) 2014-07-11 2021-07-21 美商基利科學股份有限公司 用於治療ＨＩＶ之ｔｏｌｌ樣受體調節劑
US9738664B2 (en) 2014-10-29 2017-08-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Boronic acid inhibitors of HIV protease
WO2017048727A1 (en) 2015-09-15 2017-03-23 Gilead Sciences, Inc. Modulators of toll-like recptors for the treatment of hiv
US10539397B2 (en) 2017-04-12 2020-01-21 Wilcox Industries Corp. Modular underwater torpedo system
EP3684767B1 (en) 2017-09-22 2024-04-24 Jubilant Epipad LLC Heterocyclic compounds as pad inhibitors
WO2019077631A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Jubilant Biosys Limited IMIDAZO-PYRIDINE COMPOUNDS FOR USE AS PAD INHIBITORS
BR112020008851A2 (pt) 2017-11-06 2020-10-20 Jubilant Prodel LLC composto da fórmula i, processo de preparação de compostos da fórmula i, composição farmacêutica, método para o tratamento e/ou prevenção de várias doenças, uso, método para o tratamento de câncer, método de tratamento de câncer e método para o tratamento e/ou prevenção de câncer e doenças infecciosas
SG11202004537UA (en) 2017-11-24 2020-06-29 Jubilant Episcribe Llc Heterocyclic compounds as prmt5 inhibitors
BR112020018610A2 (pt) 2018-03-13 2020-12-29 Jubilant Prodel LLC Compostos de fórmula i, fórmula ii, fórmula iii, fórmula iv, fórmula v, fórmula vi, ou seus polimorfos, estereoisômeros, tautômeros, profármacos, solvatos e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos e uso dos mesmos; processo de preparação; composição farmacêutica; e método para o tratamento e/ou prevenção de várias doenças, que incluem câncer e doenças infecciosas
WO2021176369A1 (en) 2020-03-06 2021-09-10 Pfizer Inc. Methods of inhibiting sars-cov-2 replication and treating coronavirus disease 2019
WO2021209563A1 (en) 2020-04-16 2021-10-21 Som Innovation Biotech, S.A. Compounds for use in the treatment of viral infections by respiratory syndrome-related coronavirus
WO2025085662A1 (en) 2023-10-17 2025-04-24 Vanderbilt University Compounds for tocolytic use

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2448392A1 (fr) * 1979-02-12 1980-09-05 Vilbiss Toussaint De Dispositif automatique pour la projection de produits de revetement
US5142056A (en) * 1989-05-23 1992-08-25 Abbott Laboratories Retroviral protease inhibiting compounds
SU1676454A3 (ru) * 1984-11-30 1991-09-07 Санкио Компани Лимитед (Фирма) Способ получени пептидов или их фармацевтически приемлемых солей
IL89900A0 (en) * 1988-04-12 1989-12-15 Merck & Co Inc Hiv protease inhibitors useful for the treatment of aids and pharmaceutical compositions containing them
CA1340588C (en) * 1988-06-13 1999-06-08 Balraj Krishan Handa Amino acid derivatives
IL91307A0 (en) * 1988-08-24 1990-03-19 Merck & Co Inc Hiv protease inhibitors and pharmaceutical compositions for the treatment of aids containing them
EP0361341A3 (en) * 1988-09-28 1991-07-03 Miles Inc. Therapeutics for aids based on inhibitors of hiv protease
US5063208A (en) * 1989-07-26 1991-11-05 Abbott Laboratories Peptidyl aminodiol renin inhibitors
WO1991008221A1 (en) * 1989-12-04 1991-06-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Peptide inhibitors of hiv protease
GB8927915D0 (en) * 1989-12-11 1990-02-14 Hoffmann La Roche Novel alcohols
GB8927913D0 (en) * 1989-12-11 1990-02-14 Hoffmann La Roche Amino acid derivatives
CA2032259A1 (en) * 1989-12-18 1991-06-19 Wayne J. Thompson Hiv protease inhibitors useful for the treatment of aids
CA2056911C (en) * 1990-12-11 1998-09-22 Yuuichi Nagano Hiv protease inhibitors
HUT60282A (en) * 1991-02-08 1992-08-28 Sankyo Co Process for producing new beta-amino-alpha-hydroxycarboxylic acid derivatives and pharmaceutical compositions comprising such compounds
US5235039A (en) * 1991-06-10 1993-08-10 Eli Lilly And Company Substrates for hiv protease
CN1071930A (zh) 1991-07-10 1993-05-12 伊莱利利公司 用作治疗艾滋病的人免疫缺陷病毒蛋白酶的抑制剂
US5508407A (en) * 1991-07-10 1996-04-16 Eli Lilly And Company Retroviral protease inhibitors
US5220796A (en) 1991-07-15 1993-06-22 The Boc Group, Inc. Adsorption condensation solvent recovery system
DE4126482A1 (de) * 1991-08-10 1993-02-11 Bayer Ag (alpha)-trifluormethyl-substituierte, gesaettigt-bicyclische amine und verfahren zu deren herstellung
US5516784A (en) * 1991-08-13 1996-05-14 Schering Corporation Anti-HIV (AIDS) agents
EP0534511A1 (en) * 1991-08-16 1993-03-31 Merck & Co. Inc. HIV protease inhibitors useful for the treatment of aids
US5256783A (en) * 1991-09-18 1993-10-26 Hoffmann-La Roche Inc. Method for producing 2-isoquinoline compounds
WO1993008184A1 (en) * 1991-10-23 1993-04-29 Merck & Co., Inc. Hiv protease inhibitors
ZA929869B (en) * 1991-12-20 1994-06-20 Syntex Inc Hiv protease inhibitors
DE69300043T2 (de) * 1992-03-13 1995-05-24 Bio Mega Boehringer Ingelheim Substituierte Pipecoline-Säurederivate als HIV-Protease-Hemmer.
ATE199545T1 (de) * 1992-05-21 2001-03-15 Monsanto Co Inhibitoren retroviraler proteasen
PT810209E (pt) * 1992-08-25 2002-09-30 Searle & Co Hidroxietilamino-sulfonamidas de alfa- e beta-aminoacidos uteis como inibidores de protease retroviral
IS2334B (is) * 1992-09-08 2008-02-15 Vertex Pharmaceuticals Inc., (A Massachusetts Corporation) Aspartyl próteasi hemjari af nýjum flokki súlfonamíða
EP0604182B1 (en) 1992-12-22 2000-10-11 Eli Lilly And Company Inhibitors of HIV protease useful for the treatment of Aids
US5491166A (en) * 1992-12-22 1996-02-13 Eli Lilly And Company Inhibitors of HIV protease useful for the treatment of AIDS
US5475136A (en) * 1992-12-22 1995-12-12 Eli Lilly And Company Inhibitors of HIV protease useful for the treatment of AIDS
US5484926A (en) * 1993-10-07 1996-01-16 Agouron Pharmaceuticals, Inc. HIV protease inhibitors
US5554653A (en) * 1992-12-22 1996-09-10 Eli Lilly And Company Inhibitors of HIV protease useful for the treatment of AIDS
MX9308025A (es) * 1992-12-22 1994-08-31 Lilly Co Eli Compuestos inhibidores de la proteasa del virus dela inmunodeficiencia humana, procedimiento para supreparacion y formulacion farmaceutica que los contiene.
US5733906A (en) * 1993-10-12 1998-03-31 Eli Lilly And Company Inhibitors of HIV Protease useful for the treatment of Aids
MX9308016A (es) 1992-12-22 1994-08-31 Lilly Co Eli Compuestos inhibidores de la proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana, procedimiento para su preparacion y formulacion farmaceutica que los contiene.
US5846993A (en) * 1992-12-22 1998-12-08 Agouron Pharmaceuticals, Inc. HIV protease inhibitors
US5434265A (en) * 1992-12-22 1995-07-18 Eli Lilly And Company Inhibitors of HIV protease
US5480887A (en) * 1994-02-02 1996-01-02 Eli Lilly And Company Protease inhibitors
US5527829A (en) * 1994-05-23 1996-06-18 Agouron Pharmaceuticals, Inc. HIV protease inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
TW432049B (en) 2001-05-01
SK43996A3 (en) 1997-01-08
GEP20002209B (en) 2000-08-25
US5827858A (en) 1998-10-27
GEP20084497B (en) 2008-09-25
FI961449A0 (fi) 1996-03-29
HK1013650A1 (en) 1999-09-03
ES2287387T3 (es) 2007-12-16
US20020077338A1 (en) 2002-06-20
HU9600908D0 (en) 1996-05-28
CN1262272A (zh) 2000-08-09
PT722439E (pt) 2002-12-31
PL313871A1 (en) 1996-07-22
JPH11310573A (ja) 1999-11-09
MY138860A (en) 2009-08-28
DE69434977T2 (de) 2008-03-13
EP0889036A1 (en) 1999-01-07
US5859002A (en) 1999-01-12
EP1340744A2 (en) 2003-09-03
EP0722439B1 (en) 2002-08-14
JPH09501443A (ja) 1997-02-10
NZ329626A (en) 1999-08-30
CZ100496A3 (en) 1996-09-11
US6271235B1 (en) 2001-08-07
EE05399B1 (et) 2011-04-15
EP1340744A3 (en) 2003-12-03
EP0722439A1 (en) 1996-07-24
FI961449L (fi) 1996-05-29
US6525215B2 (en) 2003-02-25
HK1014950A1 (en) 1999-10-08
WO1995009843A1 (en) 1995-04-13
US5827859A (en) 1998-10-27
US5952343A (en) 1999-09-14
US5852043A (en) 1998-12-22
NO961382D0 (no) 1996-04-03
UY23840A1 (es) 1994-10-21
US5824688A (en) 1998-10-20
DE69434214D1 (de) 2005-02-03
ATE362918T1 (de) 2007-06-15
EP1340744B1 (en) 2007-05-23
CA2173328A1 (en) 1995-04-13
BG100455A (en) 1997-09-30
CA2268709C (en) 2008-03-25
HK1056172A1 (en) 2004-02-06
NO961382L (no) 1996-04-09
OA10718A (en) 2001-11-02
EE9600091A (et) 1996-12-16
CN1195737C (zh) 2005-04-06
SK284115B6 (sk) 2004-09-08
CA2173328C (en) 1999-08-31
KR100190517B1 (en) 1999-06-01
US20030216569A1 (en) 2003-11-20
US5834467A (en) 1998-11-10
AU7967494A (en) 1995-05-01
EP0889036B1 (en) 2004-12-29
RO119363B1 (ro) 2004-08-30
JP2951724B2 (ja) 1999-09-20
US5837710A (en) 1998-11-17
CN1046269C (zh) 1999-11-10
DE69431193D1 (en) 2002-09-19
US6162812A (en) 2000-12-19
AP9600844A0 (en) 1996-07-31
CZ290417B6 (cs) 2002-07-17
UA56984C2 (uk) 2003-06-16
US5827891A (en) 1998-10-27
HU227885B1 (en) 2012-05-29
DK0889036T3 (da) 2005-02-28
AP600A (en) 1997-07-23
HU0900219D0 (en) 2009-06-29
NZ275633A (en) 1998-03-25
BR9407782A (pt) 1997-03-18
SI0722439T1 (en) 2002-10-31
DE69434214T2 (de) 2005-06-02
ATE222240T1 (de) 2002-08-15
JP3703647B2 (ja) 2005-10-05
US5484926A (en) 1996-01-16
MD1507F2 (en) 2000-07-31
FI114794B (fi) 2004-12-31
NO307050B1 (no) 2000-01-31
SI0889036T1 (en) 2005-04-30
CA2268709A1 (en) 1995-04-13
DE69434977D1 (de) 2007-07-05
DK0722439T3 (da) 2002-12-16
PT889036E (pt) 2005-05-31
MD1507G2 (ro) 2001-04-30
BG62567B1 (bg) 2000-02-29
HUT75652A (en) 1997-05-28
ES2236849T3 (es) 2005-07-16
ES2181725T3 (es) 2003-03-01
US6693199B2 (en) 2004-02-17
DE69431193T2 (de) 2002-12-12
ATE286025T1 (de) 2005-01-15
RU2139280C1 (ru) 1999-10-10
HU226814B1 (en) 2009-11-30
CN1131942A (zh) 1996-09-25
SK284116B6 (sk) 2004-09-08
AU694746B2 (en) 1998-07-30
TJ339B (en) 2002-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL185647B1 (pl) Nowy inhibitor proteazy HIV i kompozycja farmaceutyczna
AU700417B2 (en) Protease inhibitors
US5719287A (en) Intermediates for inhibitors of HIV protease and method of preparation thereof
US5502061A (en) Peptidyl substituted benzamides and naphthamies
US5434265A (en) Inhibitors of HIV protease
US5578608A (en) Symmetrical diaryl and diheteroanyl cis epoxy alkanes antiviral compounds
US5508407A (en) Retroviral protease inhibitors
JPH06234728A (ja) Ａｉｄｓの処置のために有用なｈｉｖ−プロテアーゼ阻害剤
HUT76285A (en) N-substituted piperazine derivatives and process for producing them
JPH06234716A (ja) Ａｉｄｓの処置に有用なｈｉｖ−プロテアーゼ阻害剤
HK1013650B (en) Hiv protease inhibitors
SA95160061B1 (ar) مثبطات بروتياز hiv (protease inhibitors)
HK1014950B (en) Hiv protease inhibitors
HK1056172B (en) Hiv protease inhibitors