PL185678B1 - Nowe zastosowanie dimeru lizozymu - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie dimeni Iizozymu do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do ha- mowania lub zapobiegania proliferacji komórek tkanek nowotworowych innych niz miesak Kaposi'ego. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowe zastosowanie dimeru Iizozymu do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania lub zapobiegania proliferacji komórek tkanek nowotworowych innych niż mięsak Kaposiego. Nowe zastosowanie jest związane z nieswoistą stymulacją systemu immunologicznego i jest szczególnie użyteczne w zapobieganiu i/lub leczeniu objawów lub chorób związanych z osłabioną funkcją naturalnych układów obronnych i regeneracyjnych w organizmie ludzkim i zwierzęcym.

W późnych latach osiemdziesiątych odkryto, że zdimeryzowane formy pewnych enzymów, zachowując w znacznym stopniu dobroczynne właściwości odpowiednich monomerów wykazują daleko mniejszą toksyczność niż monomery, a nawet w niektórych przypadkach nie wywołują w ogóle negatywnych skutków ubocznych, gdy stosuje się je w dawkach terapeu185 678 tycznych. Antywirusowe i antybakteryjne kompozycje zawierające jako składnik aktywny dimer lizozymu lub inne zdimeryzowane enzymy opisano w publikacji WO 89/11294. Stwierdza się tam, że dimer lizozymu jest zdolny do hamowania proliferacji szeregu szczepów bakteryjnych wyhodowanych z próbek pobranych od pacjentów, gdy zastosowano go w stężeniach 1,25 - 20 mg/ml takich hodowli. Doniesiono również, że dimer jest skuteczny w leczeniu infekcji wywołanych parvowirusem psim (CPV), przy podawaniu doustnym dwa razy dziennie, w dawce 1-2 mg/kg masy ciała.

Później stwierdzono dalsze korzystne cechy dimerów lizozymu i opracowano dodatkowe terapeutyczne zastosowania leku, zwłaszcza do leczenia infekcji bakteryjnych i wirusowych, jak to ujawniono przykładowo w publikacji WO 94/01127.

W publikacji WO 94/01127 przedstawiono teorię modelową, pomocną w zrozumieniu różnych obserwowanych skutków działania dimeru lizozymu. Chociaż kompleksowy sposób działania dimeru lizozymu nie jest w pełni zrozumiały, wydaje się, że dimer ten posiada dodatkowe możliwości lecznicze, których nie można wyjaśnić aktywnością bakteriolityczną odpowiedniego monomeru. Zaobserwowano pewne immunostymulacyjne działania zdimeryzowanego lizozymu, szczególnie odnośnie modulowania poziomu cytokin. Ponadto, skonkludowano na podstawie przeprowadzonych eksperymentów, że dimer lizozymu wydaje się zapobiegać penetrowaniu komórek bakteryjnych przez wirusy, przypuszczalnie przez blokowanie pewnych regionów zewnętrznej powierzchni komórki, prawdopodobnie zawierających receptory białkowe wirusów.

Stan techniki ujawnia dalsze efekty otrzymane in vitro z dimerem lizozymu. W szczególności, Bartholeyns i Zenebergh (Europ. J. Cancer, Tom 15, 1979, 85-91) badali zdimeryzowany lizozym pod kątem aktywności cytostatycznej przeciw komórkom nowotworowym wątroby (HTC) in vitro. Obserwowali oni 73% ± 15% hamowanie multiplikacji komórek nowotworowych w hodowli komórkowej (ibid., str. 89, tabela 2).

Niespodziewanie, za wyjątkiem publikacji WO 94/01127, brak jest doniesień o eksperymentach in vivo z dimerem lizozymu. Jest to bardzo dziwne i zaskakujące i dotychczas niewyjaśnione, dlaczego ani Bartholeyns i Zenebergh, ani inni badacze nie podjęli tego tematu w celu dalszego rozwinięcia tego obiecującego odkrycia do walki z rakiem. Porównawcze przedstawienie (fig. 1) czystości dimeru lizozymu wytwarzanego metodą Sorrentino i in., Eur. J. Biochem. 124, 183-189 (1982) oraz dimeru lizozymu korzystnie stosowanego w obecnym wynalazku ujawnia co najmniej jedną możliwą przyczynę: wysokie stężenia produktów ubocznych takich jak monomer, trimer i tetramer lizozymu znaleziono w preparacie wytwarzanym metodą Sorrentino i in., podczas gdy produkt korzystnie stosowany w obecnym wynalazku jest wysoce oczyszczony, to znaczy zawiera pożądany dimer lizozymu w ilości do 90% wagowych w przeliczeniu na całkowitą masę frakcji lizozymowej w stosowanym preparacie. Sposób wytwarzania tak wysoce oczyszczonego dimeru lizozymu opisano w publikacji WO 91/10731. Wspiera to silnie założenie, że czystość znanych form dimeru lizozymu była po prostu niedostatecznie dobra dla eksperymentów i zastosowań in vivo, ponieważ wiadomo było powszechnie od 15 lat, że monomeryczna forma lizozymu, pomimo swej dobroczynnej antybakteryjnej aktywności, jest raczej toksyczna i może powodować stany zapalne oraz alergie, a nawet symptomy wstrząsu toksycznego.

W świetle tych okoliczności wydaje się bardziej zrozumiałe dlaczego kompetentni badacze, włączając Barholeynsa i Zenebergha, pomimo rekomendowania dimeru lizozymu jako obiecującego obiektu do dalszych badań, nie prowadzili dalszych eksperymentów wciągu ostatnich dziesięciu do piętnastu lat, w kierunku rozwinięcia zastosowań dimeru lizozymu in vivo.

Pomimo takiego braku aktywności badawczej w świecie naukowym, prawdopodobnie ze względu na uprzedzenia nauki przeciw wykorzystaniu dimeru lizozymu in vivo, prowadzone były dalsze badania i prace rozwojowe w celu udoskonalenia metody wytwarzania i oczyszczania zdimeryzowanego lizozymu oraz znalezienia zastosowań produktu in vivo, u ludzi i zwierząt, co doprowadziło - przykładowo, do wynalezienia zastosowań antywirusowych i antybakteryjnych ujawnionych w publikacji WO 94/01127.

185 678

Ponadto, w oparciu o swą dotychczasową wiedzę o niskiej toksyczności zdimeryzowanego lizozymu w porównaniu z monomerem oraz o dostępności nowego wysoce oczyszczonego preparatu dimeru lizozymu, podjęte zostały badania i rozpoczęte antynowotworowe próby in vivo z preparatami zawierającymi dimer lizozymu, chociaż stan techniki nie sugerował użycia go do leczenia chorób innych niż infekcje bakteryjne i wirusowe. Celem tych badań oraz celem obecnego wynalazku było opracowanie zastosowania wysoko oczyszczonego dimeru lizozymu do wytwarzania kompozycji stanowiących uzupełnienie lub zamiennik dla skrajnie toksycznych leków antynowotworowych stosowanych zwykle w konwencjonalnej chemioterapii.

Cele te osiągnięto dzięki opracowaniu rozwiązania według obecnego wynalazku.

Nowe wykorzystanie dimeru lizozymu według obecnego wynalazku obejmuje zastosowanie dimeru lizozymu do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania lub przeciwdziałania proliferacji komórek tkanek nowotworowych, innych niż mięsak Kaposi'ego.

Wynalazek obejmuje zastosowanie dimeru lizozymu do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do profilaktycznego i/lub terapeutycznego leczenia chorób nowotworowych indukowanych przez wirusy lub chorób nowotworowych, na które wirusy mają wpływ.

W szczególności, w zastosowaniu według wynalazku choroba nowotworowa wywoływana jest lub indukowana przez działanie wirusa wybranego z grupy obejmującej ludzki wirus papiloma (brodawczaka), wirus Epsteina-Barr, wirus zapalenia wątroby typu B, HTLV-I (wirus białaczki zakażającej komórki T u dorosłych), HTLV-II (wirus chłoniaka) oraz HIV-1 (ludzki wirus upośledzenia odpornościowego).

W zastosowaniu według wynalazku choroba nowotworowa wybrana jest z grupy obejmującej raka szyjki macicy, nowotwory układu moczopłciowego, pierwotnego raka komórek wątroby, chłoniaka (limfoma) komórek T, białaczkę, zwłaszcza białaczkę limfatyczną.

Zgodnie z wynalazkiem, zastosowanie dimeru lizozymu obejmuje zastosowanie tego dimeru do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej, przeznaczonej do leczenia obejmującego inhibitowanie procesów wolnorodnikowych w surowicy.

W zastosowaniu według wynalazku dimer lizozymu zawiera około 10% wagowych, lub mniej niż 10%o wagowych niepożądanych produktów ubocznych i jest zasadniczo wolny od monomerycznej postaci lizozymu.

W zastosowaniu według wynalazku kompozycja farmaceutyczna przystosowana jest do podawania w jednorazowej lub powtarzalnej dawce 0,005 - 0,5 mg/kg masy ciała, korzystnie 0,01 - 0,1 mg/kg masy ciała człowieka lub zwierzęcia.

W zastosowaniu według wynalazku kompozycja farmaceutyczna ma postać żelu, maści lub kompozycji płynnej i zawiera dimer lizozymu w ilości 0,01 - 10 mg/ml, korzystnie 0,01 1 mg/ml, albo postać stałą, przystosowaną do podawania doustnego i zawiera dimer lizozymu w ilości 0,01 -10 mg/g, korzystnie 0,01-1 mg/g.

Wynalazek bliżej objaśnia załączony rysunek, na którym fig. 1 ilustruje porównawczo czystość preparatów dimeru lizozymu wytwarzanego dwoma różnymi sposobami znanymi ze stanu techniki.

Wysoko oczyszczony dimer lizozymu, o którym wspomina się przy omawianiu obecnego wynalazku, może być stosowany do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych nadających się do bezpośredniego stosowania w leczeniu ludzi i zwierząt dzięki niskie) zawartości toksycznego monomeru.

Jak wskazano wyżej, tak oczyszczony dimer lizozymu zawiera około 10% wagowych, lub mniej, niepożądanych produktów ubocznych i może być otrzymany drogą dimeryzacji monomerów lizozymu różnego pochodzenia, przykładowo monomerów lizozymu pochodzących od ludzi, zwierząt, z jaj, roślin, mikroorganizmów, a więc monomerów wyizolowanych w postaci naturalnej albo otrzymywanych na drodze chemicznej lub metodami inżynierii genetycznej pozwalających na wytworzenie monomerów lizozymu o takiej samej lub zasadniczo takiej samej naturze chemicznej i biologicznej, jak monomery tego enzymu występujące w przyrodzie.

W testach na hodowlach komórkowych in vitro oraz modelach badawczych in vivo, korzystnie modelach badawczych na myszach i szczurach, zostało obecnie pomyślnie zademon185 678 strowane, że stosowane kompozycje dimeru lizozymu wykazują znaczną zdolność hamowania lub nawet całkowitego powstrzymania proliferacji komórek tkanek nowotworowych in vitro i in vivo. Takie lecznicze działanie zostało potwierdzone dla różnych rodzajów nowotworów, włączając, lecz nie ograniczając się do tych, o których wiadomo, że są indukowane przez wirusy, lub na które wirusy mają wpływ. Wirusami tymi są w szczególności: ludzki wirus papiloma (brodawczaka), wirus Epsteina-Barr, wirus zapalenia wątroby B oraz retrowirusy takie jak HTLV-I (wirus białaczki zakażający komórki T u dorosłych), HTLV-II (wirus limformy) oraz HIV-1 (ludzki wirus obniżonej odporności) oraz ich podtypy.

Do nowotworów indukowanych przez te wirusy, lub na które wirusy te mają wpływ, należą przykładowo: rak szyjki macicy, nowotwory układu moczopłciowego, mięsak Kaposi'ego, pierwotny rak komórek wątroby, białaczka, limfoma komórek T. AIDS oraz ich podtypy. Celem obecnego wynalazku jest dostarczenie kompozycji farmaceutycznej przydatnej w zapobieganiu i/lub leczeniu nowotworów u ludzi i zwierząt.

W toku prowadzonych badań klinicznych zaobserwowano, że podawanie wysoko oczyszczonego dimeru lizozymu powoduje również inne, nieoczekiwane, dobroczynne skutki, kiedy kompozycje zawierające ten składnik aktywny były podawane pacjentom z mniej lub bardziej zakażonymi ranami pooperacyjnymi przykładowo, po amputacji kończyny dolnej. Okazało się, że lokalne stosowanie dimeru nie tylko pomyślnie zlikwidowało zakażenie rany, ale także pobudziło porost włosów i odnowę owłosienia w obrębie leczonego obszaru. To zaskakujące odkrycie zostało potwierdzone w dalszych badaniach, które potwierdziły możliwość wytwarzania kompozycji farmaceutycznych nadających się do stosowania w przypadkach zaburzeń porostu włosów, w szczególności zaburzeń porostu włosów związanych z niedomogami lub dysfunkcjami immunologicznymi, takich jak przykładowo, przy łysieniu plackowatym, przez pobudzanie i usprawnienie flinkcji immunologicznych mechanizmów obronnych, poprawę obiegu krwi w powierzchniowych warstwach tkanek i skóry, ogólne niespecyficzne usprawnienie funkcji immunologicznych oraz prawdopodobnie dalsze wciąż niezidentyfikowane efekty.

Dimer lizozymu, o wysokim stopniu oczyszczenia może być podawany bezpośrednio pacjentom, którym jest potrzebny lub stosowany do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do stosowania w zwykłych postaciach galenowych. Kompozycje w postaci żelu, maści lub płynu zawierają dimer lizozymu korzystnie w stężeniu około 0,01 - 10 mg/ml, a często w stężeniu około 0,1 - 1,0 mg/ml. Zwykle są one wytwarzane jako sterylne i apyrogenne mieszanki, ewentualnie zawierające co najmniej jeden fizjologicznie akceptowalny rozpuszczalnik i/lub nośnik i/lub co najmniej jeden dogodny środek konserwujący.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające dimer lizozymu są użyteczńe i przeznaczone głównie do podawania miejscowego i/lub pozajelitowego, obejmującego miejscowe iniekcje przykładowo w sąsiedztwie stałego guza, albo do podawania zewnętrznego na powierzchni ciała, w tym przez iniekcje podskórne. Zastrzyki dożylne mogą zastąpić lub dodatkowo wspomagać miejscowe zastosowania podczas przebiegu leczenia. Okazało się także, że bardzo skuteczne jest podawanie kompozycji zawierających dimer lizozymu przez błony śluzowe, korzystnie przez inhalacje (błony śluzowe nosa, jamy ustnej, gardła) ciekłymi kompozycjami lub przez stosowanie miejscowe (błony śluzowe pochwy, szyjki macicy) kompozycji ciekłych lub kremów lub tamponów impregnowanych preparatem zawierającym dimer lizozymu.

W niektórych przypadkach korzystne jest podawanie dimeru lizozymu doustnie, korzystnie w zwykłej postaci galenowej, takiej jak przykładowo: tabletki, kapsułki lub drażetki lub w postaci płatków, granulek, kłaczków i pudru. Takie stałe kompozycje często zawierają aktywną substancję leczniczą w ilości około 0,01 - 10 mg, korzystnie około 0,01 - 1,0 mg/g całej kompozycji. Korzystnie zawierają one dodatkowo co najmniej jeden odpowiedni nośnik i/lub środek konserwujący i/lub inne zwykłe dodatki takie jak przykładowo środek smakowy lub barwiący.

Mieszanka dla stosowania doustnego może także mieć postać układu osmotycznego. W pewnych przypadkach, takich jak przykładowo profilaktyka i/lub leczenie nowotworu układu moczopłciowego, lokalne stosowanie antyseptycznych opatrunków lub tamponów

185 678 impregnowanych skuteczną dawką wysoko oczyszczonego dimeru lizozymu, może być użyteczne i korzystne.

Różne rodzaje wyżej wymienionych kompozycji zawierających dimer lizozymu korzystnie podaje się w pojedynczej lub powtarzalnej dawce około 0,005 do 0,5 mg/kg masy ciała, zwłaszcza w dawce 0,01 do 0,1 mg/kg masy ciała. Rozumie się samo przez się, że wymagane stężenie dimeru lizozymu w końcowej kompozycji farmaceutycznej zależy przede wszystkim od wielkości ludzkiego lub zwierzęcego pacjenta i od rodzaju terapii leczniczej lub profilaktycznej zaplanowanej dla odnośnego pacjenta. W większości przypadków, wyżej wspomniane zakresy stężeń są dostateczne dla właściwego leczenia. Nie mniej, może okazać się niezbędne, szczególnie w medycynie weterynaryjnej, zwiększenie faktycznych stężeń dimeru lizozymu w kompozycji do wartości ponad 10 mg/ml i poniżej rozpuszczalności dimeru w odpowiednim rozpuszczalniku, to jest do około 20 mg/ml kompozycji ciekłej lub w postaci maści. Działanie takie pozwala utrzymać objętość kompozycji przewidzianej do podania na sensownie minimalnym poziomie, dla łatwiejszego stosowania.

Jeśli to możliwe, łączny sposób podawania wyżej wspomnianych kompozycji jest korzystniejszy od terapii opartej na podawaniu jedną drogą: doustnie, pozajelitowe albo miejscowo.

Ze względu na zasadniczo nietoksyczny charakter wysoko oczyszczonego dimeru lizozymu kompozycje zawierające ten dimer mogą być podawane przez długi okres czasu, to jest przez całe miesiące lub nawet lata bez wywołania szkodliwych skutków. Interwały czasowe przy profilaktycznym lub terapeutycznym podawaniu leku mogą typowo wynosić od jednego do kilku razy dziennie, tygodniowo lub miesięcznie, a także obejmować nawet dłuższe okresy czasu w zależności od leczonego pacjenta oraz pilności leczenia, jak też skuteczności immunostymulacji dimerem lizozymu.

Jak wskazano wyżej, obecny wynalazek stał się - co najmniej częściowo, możliwy dzięki dostępności dimeru lizozymu o wysokiej czystości. Uderzająca różnica jakości produktu, a w szczególności, udział niepożądanego monomeru lizozymu, są zilustrowane rysunkiem fig. 1:

kolumna 1 przedstawia standartowe białka o niskim ciężarze cząsteczkowym (LMW): fosforylaza B - 142000 daltonów, BSA - 97000, owoalbumina -50000. anhydraza węglowa 35000, sojowy inhibitor trypsyny - 29700, lizozym 21900 (Biorad, Stany Zjednoczone Ameryki);

kolumny 2 i 3 przedstawiają oczyszczony dimer lizozymu dostępny jako LYDIUM KLP® 602 (KLP-602) seria 506449, po kontroli laboratoryjnej; kolumna 2 porcja 6,6 gg, kolumna 3 - 19,8 pg;

kolumny 4 i 5 przedstawiają inny rzut produkcyjny KLP-602, kolumna 4 porcja 6,6 pg, kolumna 5-19,8 pg;

kolumny 6 i 7 przedstawiają dimer lizozymu (KIW-607) wytworzony metodą Sorrentino i in., Eur. J. Biochem. 124, 183-189 (1982); kolumna 6 porcja 6,6 pg, kolumna 7-19,8 pg.

KLP-602 preparat oczyszczonego dimeru lizozymu zawiera cztery razy więcej dimeru w porównaniu z produktem KIW-607, natomiast porównywany produkt KlW-607 zawiera sześć razy więcej monomeru niż KLP-602.

Aby opisany tu wynalazek mógł .być pełniej zrozumiały, zamieszcza się poniższe przykłady. Należy rozumieć, że przykłady są jedynie do celów ilustracyjnych i nie należy ich interpretować jako ograniczenia obecnego wynalazku pod żadnym względem.

Przykład 1. Dimer lizozymu (KLP-602) w leczeniu białaczki limfatycznej u myszy AKR.

Materiały i metody

Do badań użyto myszy szczepu wysokobiałaczkowego AKR z wszczepionym wirusem Graffiego, w wieku 7 miesięcy, obojga płci, pochodzących z Ośrodka Hodowli Zwierząt Wsobnych przy Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu. U myszy AKR zachodzi wczesna aktywacja endogennego wirusa białaczkotwórczego, prowadząca między siódmym a dziewiątym miesiącem życia do klinicznej manifestacji choroby. Myszy podzielono na trzy grupy po 30 zwierząt w każdej:

185 678

Grupa I (doświadczalna)

- zwierzęta, którym podano KLP-602 podskórnie jednorazowo, w dawce 20 pg/kg w 0,3 cm FBS.

Grupa II (doświadczalna)

- zwierzęta, którym podano KLP-602 dwukrotnie, w takiej samej dawce jak wyżej,

Grupa III (kontrolna)

- zwierzęta, którym podano dwukrotnie 0,3 cm³ PBS.

Myszy zabijano przez skrwawienie po trzech i sześciu tygodniach po podaniu ostatniej injekcji KLP-602 (10 myszy w każdej grupie). Dziesięć myszy w każdej grupie pozostawiono na przeżycie.

Wykonano następujące badania:

1. Kontrola masy ciała oraz masy narządów wewnętrznych takich jak wątroba, śledziona, grasica i węzły chłonne szyjne zewnętrzne, oceniając stosunek masy każdego organu do masy całego ciała. Efektywność terapeutyczną wyliczano stosując wzór L/K x 100%, gdzie L oznacza średni czas przeżycia myszy otrzymujących KLP-602, zaś K oznacza średni czas przeżycia myszy kontrolnych.

2. Badania histopatologiczne wycinków wątroby, śledziony, grasicy i węzłów chłonnych. Preparaty barwiono rutynowo H + L oraz metodą Gomoriego na włókna retikułinowe.

3. Poziom wolnych rodników w surowicy krwi określano stosując metodę chemiluminescencyjną (Chl), która pozwala na detekcję bardzo słabych świeceń fotonowych w surowicy krwi.

4. Aktywność fagocytarną komórek polimorfonuklearnych (PMN) określano stosując test NTB i test chemiluminescencyjny (Chl).

Wyniki:

Jednorazowe (Grupa I) i dwukrotne (Grupa II) podskórne podanie KLP-602 myszom szczepu wysokobiałaczkowego AKR, w dawce 20 pg/kg prowadziło do statystycznie nieistotnego wzrostu masy ciała oraz spadku masy narządów wewnętrznych takich jak śledziona, grasica i węzły chłonne i wątroba (ów ostatni był statystycznie nieistotny) w porównaniu z grupą zwierząt kontrolnych (grupa III), po trzech tygodniach doświadczenia (tabela 1).

Po sześciu tygodniach doświadczenia wystąpił wzrost całkowitej masy ciała w obu grupach doświadczalnych, spadek masy śledziony, grasicy i węzłów chłonnych w Grupie I oraz wzrost masy wątroby i grasicy w Grupie II w porównaniu z Grupą kontrolną III (tabela 1).

Tabela 2 ilustruje stosunek masy narządów wewnętrznych do całkowitej masy ciała. Po trzech tygodniach obserwowano wzrost masy grasicy u zwierząt Grupy III (kontrola) w porównaniu z obu grupami doświadczalnymi (Grupy I i II). Po sześciu tygodniach stwierdzono wzrost masy śledziony, grasicy i węzłów chłonnych w Grupach II i' III w porównaniu z Grupą I.

Badania histopatologiczne przeprowadzone po trzech i sześciu tygodniach ujawniły mierną (w grupach doświadczalnych) i nasiloną (w grupie kontrolnej) kolonizację węzłów chłonnych szyjnych, grasicy i śledziony przez komórki limfoidalne. Jednakże nacieki komórek białaczkowych w wątrobie stwierdzono jedynie u zwierząt kontrolnych. Komórki limfoidalne miały owalne lub okrągłe hiperchromatyczne jądro z licznymi jąderkami oraz atypowymi figurami mitotycznymi. Komórkom tym towarzyszyły pojedyncze, słabo zróżnicowane komórki centroblastyczne, komórki siateczki, a ponadto ogniskowe namnożone megakariocyty w obrębie śledziony. Podścielisko narządów limfatycznych takich jak śledziona, węzły chłonne i grasica zawierało nieliczne cienkie włókienka retikulinowe.

Badania chemiluminescencyjne: Aktywność wolnych rodników w surowicy krwi u myszy kontrolnych wynosiła K = 18 x 10'3 po trzech tygodniach doświadczenia. W Grupie II aktywność wolnych rodników była niższa (K =10 x 103). Po sześciu tygodniach poziom wolnych rodników wynosił K = 10 x 10’3 u zwierząt kontrolnych, był niższy w Grupie II (K = 16 x 10’3) i nieznacznie wyższy w grupie I (K = 1,5 x 10*3).

Wyraźny wzrost fagocytamej aktywności PMN odnotowano w obu grupach doświadczalnych w porównaniu z grupą kontrolną po trzech tygodniach: 4688 Chl (Grupa I), 3485 Chl (Grupa II) i tylko 2052 Chl w grupie kontrolnej. Po sześciu tygodniach aktywność fagocytarna w Grupie II była równie wysoka (3264 Chl), zaś w Grupie I uległa obniżeniu (2477 Chl).

185 678

Istotny wzrost aktywności fagocytamej, mierzonej w teście NBT zaobserwowano po trzech tygodniach w obu grupach doświadczalnych: 0,27 i 0,26 odpowiednio w Grupach I i II. Po sześciu tygodniach aktywność fagocytarna była niższa i występowała jedynie w Grupie Π. Aktywność fagocytarna w grupie kontrolnej była na poziomie 0, 22.

Współczynnik efektywności terapeutycznej preparatu KLP-602 wynosił 128% oraz 150% odpowiednio w Grupach I i II a więc przekraczał wymagane minimum 125%. Wskazuje to na znaczną aktywność immunostymulacyjną KLP-602 i kwalifikuje ten preparat do dalszych badań.

Nacieki białaczkowe były wyraźnie słabsze w obu grupach doświadczalnych niż w grupie kontrolnej, a u niektórych myszy w ogóle nie wystąpiły. Nacieki białaczkowe stwierdzono w grasicy, śledzionie i węzłach chłonnych. Dodatkowo u zwierząt kontrolnych zaobserwowano nacieki białaczkowe dodatkowo w wątrobie. Wyniki badań wskazują, że KLP-602 może częściowo hamować lub opóźniać rozwój białaczki u myszy AKR. Przeciwnie natomiast, szybki wzrost narządów limfatycznych, z jednoczesnymi zmianami morfologicznymi, typowymi dla białaczki limfatycznej wyraźnie zróżnicowanej nastąpił u zwierząt, którym podawano placebo.

Ponadto KLP-602 hamuje wzrost ilości wolnych rodników w surowicy krwi myszy. Hamuje on procesy wolnorodnikowe podobnie jak działanie antyoksydantów takich jak witamina Π, C lub selen. Nie jest wykluczone, że zahamowanie proliferacji komórek białaczkowych u myszy AKR pod wpływem KLP-602 zależne jest od wygaszania procesów indukowanych przez wolne rodniki. U myszy kontrolnych (bez KLP-602) poziom wolnych rodników był wyzszy i skorelowany z nasileniem choroby.

KLP-602 stymuluje także aktywność fagocytarną układu jednojądrowych fagocytów (MPS) mierzoną dwoma niezależnymi metodami, NBT i Chl, a zatem wzmaga odporność komórkową. Może również modulować syntezę TNF (czynnika nekrozy nowotworów). Ponadto, antygeny odrzucania nowotworów obecne na powierzchni komórek białaczkowych mogą być rozpoznawane przez limfocyty T współpracujące z komórkami MPS. Są wśród nich limfocyty TIL antynaciekowe raka o 50-100% hardziej skuteczne niż komórki LAK (kilery aktywowane limfokinami). Mogą one mieć fenotyp CD4 lub CDs, lub fenotyp mieszany i wykazują ekspresję receptora dla IL-2 na swej powierzchni. Dlaczego są one paraliżowane przez komórki nowotworowe jeszcze niewiadome.

• Stymulacja układu RSE (reticulo-endothelial system) z komórkami MPS jest podstawowym mechanizmem immunologicznymi i przeciwwirusowym. Stymulacja tych komórek powoduje produkcję interferonu i pośrednio aktywuje specyficznie nieswoiste procesy immunologiczne kontrolowane przez limfocyty B, T oraz NK (naturalne kilery).

Komórki MPS uczestniczą w procesach immunologicznych za pośrednictwem swych receptorów takich jak receptory Fc, receptor dopełniacza C 3 oraz receptory antygenów zgodności tkankowej klasy Π, a także receptory lektynowe, transferyny, urokinazy insuliny i około pięćdziesiąt innych słabiej poznanych receptorów. Zmiany ich ekspresji i powinowactwa powierzchniowego są wykładnikiem aktywacji komórek. Komórki MPS mogą fagocytować komórki wrażliwe na NO (tlenek azotu) ponieważ mogą one syntezować tę substancję. Aktywowane fagocyty nazywane są komórkami „gniewnymi” lub „krwiożerczymi”. Komórki MPS mogą niszczyć także wirusy dzięki swym właściwościom cytotoksycznym i cytolitycznym, na zasadzie produkcji defektowych wirionów i syntezy interferonu.

Korzystne wyniki wstępnych badań na myszach AKR wskazują, że KLP-602 można skutecznie wykorzystać w leczeniu białaczki u myszy AKR.

185 678

Tabela 1.

Całkowita masa ciała (g) oraz masa organów wewnętrznych (mg) u myszy doświadczalnych i kontrolnych (x ± S; wyższe wartości oznaczają S, a niższe - x)

	Wyniki po 3 tygodniach	Wyniki po 6 tygodniach
Grupa	I	II	III	I	II	III
Całkowita masa	25,27	26,20	23,96	26,77	27,30	25,57
ciała	2,22	1,67	1,23	1,10	2,34	1,68
Śledziona	0,07	0,08	0,09	0,07	0,23	0,22
	0,00	0,02	0,01	0,00	0,01	0,00
Grasica	0,06	0,07	0,08	0,08	0,21	0,15
	0,01	0,02	0,02	0,01	0,03	0,07
Węzły chłonne	0,04	0,04	0,05	0,04	0,07	0,08
	0,00	0,00	0,01	0,00	0,04	0,04
Wątroba	1,38	1,36	1,43	1,61	1,89	1,67
	0,15	0,38	0,05	0,18	0,42	0,15

Tabela 2.

Stosunek masy organów wewnętrznych do całkowitej masy ciała u myszy doświadczalnych i kontrolnych (%)

	Wyniki po 3 tygodniach	Wyniki po 6 tygodniach
Grupa	I	II	III	I	II	III
Śledziona	0,30	0,31	0,37	0,29	0,84	0,87
Grasica	0,23	0,26	0,33	0,33	1,06	0,61
Węzły chłonne	0,18	0,18	0,21	0,15	0,26.	0,26
Wątroba	5,49	5,25	5,81	6,02	6,35	6,40

185 678

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie dimeru lizozymu do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania lub zapobiegania proliferacji komórek tkanek nowotworowych innych niż mięsak Kaposi'ego.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do profilaktycznego i/lub terapeutycznego leczenia chorób nowotworowych indukowanych przez wirusy lub chorób nowotworowych, na które wirusy mają wpływ.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 2, gdzie choroba nowotworowa wywoływana jest lub indukowana przez działanie wirusa wybranego z grupy obejmującej ludzki wirus papiloma (brodawczaka), wirus Epsteina-Barr, wirus zapalenia wątroby typu B, HTLV-I (wirus białaczki zakażającej komórki T u dorosłych), HTLV-II (wirus chłoniaka) oraz HIV-1 (ludzki wirus upośledzenia odpornościowego).
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, gdzie choroba nowotworowa wybrana jest z grupy obejmującej raka szyjki macicy, nowotwory układu moczopłciowego, pierwotnego raka komórek wątroby, białaczkę, chłoniaka (limfoma) komórek T.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 4, gdzie białaczka jest białaczką limfatyczną.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 4, w którym kompozycja przeznaczona jest do leczenia obejmującego inhibitowanie procesów wolnorodnikowych w surowicy.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 4, w którym dimer lizozymu zawiera około 10% wagowych, lub mniej niż 10% wagowych niepożądanych produktów ubocznych i jest zasadniczo wolny od monomerycznej postaci Iizozymu.
8. 8. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, w którym kompozycja przeznaczona jest do leczenia obejmującego inhibitowanie procesów wolnorodnikowych w surowicy.
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, w którym dimer Iizozymu zawiera około
10. 10% wagowych, lub mniej niż 10% wagowych niepożądanych produktów ubocznych i jest zasadniczo wolny od monomerycznej postaci Iizozymu.

    . 10. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym kompozycja farmaceutycznc przprtosowana jest do podawania w jednorazowej lub powtarzalnej dawce 0,005-0,5 mg/kg masy ciała, korzystnie 0,01-0,1 mg/kg masy ciała człowieka lub zwierzęcia.
11. 11. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym kompozycja farmaceutyczna ma postać żelu, maści lub kompozycji płynnej i zawiera dimer lizozymu w ilości 0,01-10 mg/ml, korzystnie 0,01-1 mg/ml.
12. 12. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym kompozycja farmaceutyczna ma postać stalą przystosowaną do podawania doustnego i zawiera dimer Iizozymu w ilości 0,01-10 mg/g, korzystnie 0,01-1 mg/g.