PL186518B1

PL186518B1 - Białko, kompozycja farmaceutyczna i sposób wytwarzania białka

Info

Publication number: PL186518B1
Application number: PL96322945A
Authority: PL
Inventors: Fusao Makishima; Hirouki Takamatsu; Hideo Miki; Shinji Kawai; Michio Kimura; Tomoaki Matsumoto; Mieko Katsuura; Koichi Enomoto; Yusuke Satoh
Original assignee: Bioph Biotech Entw Pharm Gmbh
Priority date: 1995-04-19
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 2004-01-30
Also published as: PL322945A1; EA199700329A1; US7816103B2; DE69636728T2; NO974812L; EP0955313A1; HU225424B1; DE69636728D1; NZ305472A; DE69636728T4; US20090325864A1; US7268114B2; CA2216741C; AU5347096A; NO321153B1; EP0955313B1; CA2216741A1; EA000582B1; HUP9801697A3; ES2258774T3

Abstract

1. Bialko o sekwencji aminokwasów przedstawionej w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji. 3. Kompozycja farmaceutyczna przeznaczona do leczenia chorób chrzastki i kosci, znamienna tym, ze zawiera, w ilosci terapeutycznie skutecznej, bialko zdefiniowane w zastrz. 2 oraz farmaceutyczny nosnik. 10. Sposób wytwarzania bialka o sekwencji aminokwasów przedstawionej w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji, znamienny tym, ze przeprowadza sie hodowle bakterii E, coli transformowanych plazmidem zawierajacym sekwencje DNA zdolna do wyrazania wspomnianego bialka. 12. Sposób wytwarzania homodimeru bialka o sekwencji aminokwasów przedsta- wionej w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji, znamienny tym, ze: konstruuje sie plazmid zawierajacy DNA kodujacy sekwencje aminokwasów uwi- doczniona w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji z metionina na N-koncu; wprowadza sie skonstruowany plazmid do komórek bakterii E. coli w celu dokona- nia ich transformacji; solubilizuje sie cialka wtretowe otrzymane w wyniku przeprowadzenia hodowli wspomnianych bakterii E. coli; wyodrebnia sie bialko monomeryczne z utworzonego roztworu; dokonuje sie refaldowania bialka monomerycznego z utworzeniem bialka dimerycz- nego i otrzymane bialko poddaje sie oczyszczaniu. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest białko, kompozycja farmaceutyczna i sposób wytwarzania białka.

W praktyce klinicznej, do zapobiegania i leczenia chorób kości używa się kompozycji farmaceutycznych zawierających witaminę D3, kalcytoninę, estrogen lub ich pochodne, jak również pochodne bisfosfonianowe. Ostatnio doniesiono, że morfogenetyczne w stosunku do

186 518 kości białko (określane w dalszej części opisu skrótem BMP), białka z superrodziny genu, TGF-β obejmującej BMP-2 do BMP-9 i białka pokrewne, posiadają aktywność morfogenetycznąw stosunku do kości.

Następnie, doniesiono także o morfogenetycznej, w stosunku do kości, aktywności jednego z tych białek, o nazwie MP52 (WO 93/16099 i WO 95/04819). Uważa się, że dojrzały region białka MP52 jest białkiem złożonym ze 120 reszt aminokwasowych zawierającym N-końcową alaninę i w publikacjach tych jest opisana sekwencja aminokwasów tego białka.

Opisano także białko o nazwie GDF-5, posiadające sekwencję aminokwasową analogiczną do sekwencji białka MP52 [Naturę, tom 368, str. 639 - 643 (1994) i WO 94/15949].

Jednakże, białek tych nie można w łatwy sposób otrzymać w postaci oczyszczonej w skali przemysłowej.

Posługując się technologią inżynierii genetycznej dokonywano prób produkowania MP52 z wykorzystaniem linii komórkowych ssaków, takich jak linia komórek L. Jednakże stwierdzono, że wytworzenie z udziałem systemów ekspresyjnych MP52 w postaci oczyszczonej i to z wysoką wydajnością nie jest rzeczą łatwą.

Twórcy niniejszego wynalazku podjęli próbę wytworzenia MP52 przy użyciu bakterii E. coli, z wykorzystaniem technologii inżynierii genetycznej. Próbowali oni wytworzyć MP52 przy użyciu bakterii E. coli za pomocą dodania kodonu kodującego metioninę do DNA kodującego dojrzały region MP52, który zaczyna się od alaniny. W wytworzonym tak produkcie znajdowało się nie tylko samo MP52, ale mieszanina MP52, białka o 121 resztach aminokwasowych, zawierającego N-końcową metioninę i białka o 119 resztach aminokwasowych, z odłączoną N-końcową alaniną i zaczynającego się od proliny. Nadzwyczaj trudne okazało się wyodrębnienie z mieszaniny czystego MP52, co najmniej z dojrzałym regionem.

Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że białko przedstawione w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji, zaczynające się od proliny na N-końcu można wytworzyć w sposób selektywny i to z nadzwyczaj wysoką wydajnością za pomocą skonstruowania plazmidu, w którym kodon kodujący metioninę był połączony z sekwencją DNA kodującą sekwencję aminokwasów uwidocznioną w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji złożoną ze 119 reszt aminokwasowych, z eliminacją N-końcowej alaniny białka MP52, a następnie zastosowania otrzymanych bakterii E. coli z wprowadzonym plazmidem do ekspresji białka. Ponadto potwierdzono, że homodimer białka przedstawionego w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji wykazuje aktywność morfogenetyczną w stosunku do chrząstki i kości i w ten sposób dokonano pełnego opracowania niniejszego wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest białko o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji. Białko według wynalazku składa się ze 119 reszt aminokwasowych i odpowiada białku, w którym z ludzkiego MP52, uważanego za dojrzały region złożony ze 120 reszt aminokwasowych, wyeliminowana jest N-końcowa alanina. Białko według wynalazku jest rozpuszczalne w wodzie. Oprócz tego, białko to, samo z siebie odznacza się niską toksycznością, ponieważ pochodzi od MP52 człowieka.

W szczególności białko według wynalazku jest w postaci homodimeru.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do leczenia chorób chrząstki i/lub kości, zawierająca, jako składnik aktywny, homodimer białka według wynalazku o sekwencji aminokwasów przedstawionej w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji. Bardziej szczegółowo, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest przeznaczona do leczenia chorób chrząstki i kości takich, jak zrzeszotnienie kości. Korzystnie kompozycja według wynalazku nadaje się do leczenia chorób chrząstki i kości takich, jak zapalenie kości i stawów lub zapalenie części kostnych stawu oraz złamanie kości i ubytek kości. Korzystnie kompozycja według wynalazku nadaje się do leczenia chorób chrząstki i kości takich, jak ubytki korzeniowe i zębodołowe oraz zaburzenia albo ubytki chrzęstne, na przykład ubytek chrząstki stawowej. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku nadaje się do leczenia wrodzonych chorób chrząstki i kości jak, na przykład chondrodysplazja, chondrohipoplazja, achondrogeneza, rozszczep podniebienia i osteodysplazja.

Przykładowo, kompozycja według wynalazku może być zastosowana do leczenia zniekształcającego zapalenia stawu kolanowego i zwyrodnienia stawu biodrowego, zmian choro4

186 518 bowych łękotki stawowej, jak również podczas odtwarzania brakujących fragmentów kości i chriząstki, które to ubytki spowodowane zostały urazem lub wycięciem nowotworu.

Białko według wynalazku w postaci homodimeru wykazuje aktywność morfogenetyczną w stosunku do chrząstki i kości i może być stosowane przy zabiegach takich jak przeszczepy kostne w chirurgii kosmetycznej. Do zabiegów terapeutycznych należą także zabiegi chirurgii weterynaryjnej.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białka według wynalazku, w którym przeprowadza się hodowlę bakterii E. coli transformowanych plazmidem zawierającym sekwencję DNA zdolną do ekspresji białka według wynalazku.

Korzystnie plazmid zawiera DNA kodujący sekwencję aminokwasów uwidocznioną w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji, z metioniną na N-końcu.

Tak więc wymagana jest konstrukcja plazmidu zawierającego sekwencję DNA kodującą sekwencję aminokwasową składającą się ze 119 reszt aminokwasowych przedstawioną w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji, z dodatkową metioniną na N-końcu. Tylko dojrzały region cDNA ludzkiego MP52 jest amplifikowany na drodze reakcji łańcuchowej polimerazy (metoda PCR) przy użyciu jako matrycy DNA wektora plazmidowego zawierającego cDNA, opisanego w WO 93/16099. Metoda pCr, w niniejszym ujęciu, oznacza ogólnie zwielokrotnianie bardzo małej ilości fragmentów DNA lub RnA w sposób opisany w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4683195.

W celu wytworzenia białka według wynalazku, niezbędne jest skonstruowanie odpowiednich wektorów ekspresyjnych zawierających DNA kodujący białko, które następnie wprowadza się do pożądanych szczepów-gospodarzy E. coli z wykorzystaniem technologii inżynierii genetycznej. Do wytwarzania białka na dużą skalę zastosowano następujące, polepszone sposoby postępowania:

1) Sposób zwiększania wydajności produkcyjnej procesu wytwarzania białek docelowych polegający na wzmożeniu wydajności translacji, jak o tym donieśli M. Nobuhara i in. (Agric. Biol. Chem., 52 (6), 1331 - 1338 (1988), a mianowicie sposób zwiększania zawartości AT wokół kodonu inicjacji ATG, oraz

2) Sposób zwiększania średniej liczby kopii plazmidów/komórkę, a mianowicie sposób zastępowania regionu ori dla początku replikacji wektora pBR regionem ori dla replikacji wektora pUC. Następnie, skonstruowano wektor ekspresyjny (pKOT245) za pomocą bezpośredniej ligacji regionu promotorowego do sekwencji DNA kodującej sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji, z dodatkową metioniną na jej N-końcu. Szczep E. coli zawierający wspomniany wektor zdeponowano w dniu 14 kwietnia 1995 pod numerem rejestracyjnym Bikoken-KI P-14895 w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, znajdującym się pod adresem 1-3, Higashi 1-chome, Yatake-cho, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan i przeniesiono do depozytu w dniu 10 kwietnia 1996 (nr rejestracyjny BIKOKEN-KI BP-5499) zgodnie z Układem Budapeszteńskim (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms)

Ponadto przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białka według wynalazku w postaci homodimeru obejmujący etapy:

- konstruowania plazmidu zawierającego DNA kodującego sekwencję aminokwasową uwidocznioną w SEK. Nr ID.: Iw Wykazie Sekwencji z metioniną na N-końcu;

- wprowadzania skonstruowanego plazmidu do komórek bakterii E. coli w celu dokonania ich transformacji;

- solubilizacji ciałek wtrętowych otrzymanych w wyniku przeprowadzenia hodowli bakterii E. coli;

- wyodrębnienia białka monomerycznego z utworzonego roztworu; oraz

- refałdowania białka monomerycznego z utworzeniem białka dimerycznego i oczyszczania otrzymanego białka.

Po solubilizacji ciałek wtrętowych E. coli otrzymany roztwór wprowadza się na kolumnę SP-Sepharose FF i kolumnę Sephacryl S-200, w celu otrzymania oczyszczonych, sulfonowanych monomerów MP52, które poddaje się refaldowaniu i wytrącaniu izoelektrycznemu,

186 518 a następnie nanosi na kolumnę RESOURCE RPC do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z odwróconym układem faz, w wyniku czego otrzymuje się oczyszczone dimeryczne frakcje białek. Właściwości fizykochemiczne białek według wynalazku analizowano na podstawie N-końcowej sekwencji aminokwasów i składu aminokwasowego oraz metodą elektroforezy.

Bakterie E. coli, z wprowadzonymi wektorami ekspresyjnymi hoduje się w następujących warunkach: podłoże hodowlane o temperaturze 28 - 34°C, pH 6 - 8, stężenie rozpuszczonego tlenu 20 - 50%.

Rozwiązania według wynalazku pozwalają na opracowanie sposobu leczenia chorób chrząstki i kości, polegającego na podawaniu osobie chorej kompozycji farmaceutycznej według wynalazku zawierającej, jako składnik aktywny białko w postaci homodimeru w skutecznej ilości.

Biologiczną aktywność białka według wynalazku w postaci homodimeru oznaczano przez analizę rentgenogramów otrzymanych z zastosowaniem miękkich promieni X, badania przy pomocy barwienia tkanek i badania ektopowego formowania się chrząstek/kości z upływem czasu. Następnie, na podstawie wyników oddziaływania na kostnienie na podłożu błoniastym, ustalono, że wpływ na regenerację chrząstki stawowej i wpływ na leczenie złamania kości i jej ubytków, wywierany przez białko według wynalazku w postaci homodimeru, jest dobroczynny w odniesieniu do leczenia chrząstki i/lub odtworzenia kości.

Białko homodimeryczne według wynalazku można podawać ogólnoustrojowo, za pomocą wstrzyknięć dożylnych, domięśniowych lub dootrzewnowych. W przypadku podawania drogą dożylną, oprócz typowych wstrzyknięć dożylnych można także zastosować dożylny wlew kroplowy.

Preparaty nadające się do wstrzykiwania można formułować, na przykład, w postaci proszków do wstrzykiwania. W takim przypadku, proszki można wytworzyć przez dodanie do składnika aktywnego jednego, lub większej liczby stosownych, rozpuszczalnych w wodzie zarobek, takich jak mannitol, sacharoza, laktoza, maltoza, glukoza, fruktoza itp., rozpuszczenie utworzonej tak mieszaniny w wodzie, rozdysponowanie otrzymanego roztworu do fiolek lub ampułek, a następnie liofilizację i hermetyczne zamknięcie.

W przypadku podawania miejscowego, białkiem według wynalazku w postaci homodimeru można powlec powierzchnię chrząstki, kości lub zęba, którą następnie można potraktować pastą kolagenową, klejem fibrynowym lub innymi substancjami przylegającymi. W przypadku przeszczepów kostnych, zastosować można zarówno kość naturalną, jak i typową kość sztuczną. Przez określenie „kość sztuczna” rozumie się kość wytworzoną z metalu, materiałów ceramicznych, szkła i innych nieorganicznych materiałów naturalnych lub sztucznych. Jako korzystna substancja sztuczna przytaczany jest hydroksyapatyt. I tak, na przykład, sztuczną kość można skonstruować ze stali, jako materiału spoistego, znajdującego się w części wewnętrznej i hydroksyapatytu jako materiału porowatego, obecnego w części zewnętrznej. Ponadto, białko według wynalazku w formie homodimeru można nanieść na tę część, z której usunięto rakowatą tkankę kostną, w celu przyspieszania odtworzenia kości. Białko według wynalazku można także zastosować w przypadku przeszczepiania chrząstki.

Stosowane dawki mogą zmieniać się w zależności od rozmaitych czynników wpływających na aktywność białka, takich jak masa kości i chrząstki, które poddaje się rekonstrukcji, rodzaj uszkodzonego miejsca w kości i chrząstce, a także objawy chorobowe oraz wiek i płeć pacjenta, ciężkość zakażenia, przerwy w podawaniu leku i inne czynniki kliniczne. Dawki mogą się zmieniać również w zależności od typu nośników zastosowanych do restrukturyzacji razem z białkiem według wynalazku w formie dimerycznej. Ogólnie, w przypadku podawania w postaci kompozycji zawierającej nośnik, dawka mieści się w zakresie około 10 - 10⁶ ng białka homodimerycznego/mokrą wagę pożądanej kości lub chrząstki. W przypadku podawania w postaci zastrzyku, czy to miejscowo czy ogólnoustrojowo, korzystnie stosuje się dawkę wynoszącą 0,1 - 10⁴ (ig, z częstotliwością mieszczącą się w zakresie od raz na tydzień do raz na dzień.

Przy odtwarzaniu kości i chrząstki można spodziewać się zaistnienia efektu synergistycznego w przypadku stosowania białka homodimerycznego według wynalazku jednocze6

186 518 śnie ze znanymi czynnikami wzrostowymi, takimi jak, na przykład, insulinopodobny czynnik wzrostu-1.

Dotychczas nigdy jeszcze nie donoszono o sposobie wytwarzania białka według wynalazku na skalę przemysłową i to w postaci oczyszczonej, jak powyżej opisano, jak również o tym, że białko według wynalazku w postaci homodimeru znajduje zastosowanie w kompozycji medycznej do leczenia chorób chrząstki i kości, ponieważ wykazuje aktywność morfogenetyczną w stosunku do chrząstki i kości. Ponadto, sposób wytwarzania białka według wynalazku może znaleźć zastosowanie przy wytwarzaniu innych białek, członków powyżej wspomnianej superrodziny TGF-β, zwłaszcza, że wytwarzanie ich wszystkich z zastosowaniem linii komórkowych ssaków wiązało się, jak dotychczas, z niewielkim tylko powodzeniem.

Wynalazek niniejszy jest poniżej objaśniony następującymi przykładami. Jednakże, nie należy tego interpretować w ten sposób, że zakres wynalazku ograniczony jest jedynie do tych konkretnych przykładów.

Przykład 1. Konstrukcja wektora ekspresyjnego (1) Wyodrębnianie dojrzałego regionu Mp52.

Dojrzały region cDNA ludzkiego MP52 amplifikowano metodą PCR stosując jako matrycę DNA wektor plazmidowy (pSK52s) zawierający cDNA opisany w WO 93/16099.

Zgodnie ze sposobem zwiększania wydajności produkcyjnej docelowych białek, podanym przez M. Nobuharę i in. [Agris. Biol. Chem., 52 (6), 1331 - 1338 (1988)], część DNA dojrzałego regionu genu MP52 zastąpiono, w celu zwiększenia zawartości AT wokół kodonu inicjacji ATG.

Mutagenezę przeprowadzono metodą PCR przy użyciu zaprojektowanego „w górę” startera PCR obejmującego mutację uwidocznioną w SEK ID Nr.: 2 w Wykazie Sekwencji. Jeśli chodzi o sekwencję DNA starterów PCR, użyto: DNA uwidocznionego w SEK. Nr ID.: 2 jako startera „w górę”, a DNA uwidocznionego w SEK. Nr DD.: 3 w Wykazie Sekwencji jako startera „w dół”.

PCR przeprowadzono za pomocą dodania 10 ng matrycy DNA, 50 pmoli każdego ze starterów PCR w kierunku celowym i w kierunku odwrotnym, 0,2 mmola dNTP i 1,5 mmola MgCl₂, w tej samej probówce, razem z 5 jednostkami polimerazy DNA Tag.

Wykonano 30 cykli PCR, przy zachowaniu następujących warunków przeprowadzania każdego cyklu : temperatura 94°C w ciągu minuty przy denaturacji, temperatura 55°C w ciągu minuty przy łączeniu startera i temperatura 72°C w ciągu 2 minut przy wydłużaniu startera.

Produkty otrzymane w wyniku PCR wyodrębniono metodą elektroforezy w 1,5% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (dostarczonej z firmy FMC) i wyizolowano fragmenty 0 około 360 pz (Fragment 1).

(2) Konstrukcja wektora ekspresyjnego E. coli dla białka według wynalazku.

W celu zwiększenia liczby kopii plazmidu w przeliczeniu na ilość bakterii, dokonano wymiany regionu ori dla początku replikacji wektora pBR na region ori dla początku replikacji wektora pUC. Wektor ekspresyjny E. coli pKK223-3, dostępny w handlu (dostarczony przez firmę Pharmacia Biotech) wykorzystano do wyodrębnienia regionu promotora tac za pomocą trawienia przy użyciu endonukleaz restrykcyjnych Sspl i EcoRl, a także do wyodrębnienia regionu terminatora rmBtit2 przy użyciu Sali i Sspl. Fragment DNA regionu promotora tac potraktowano preparatem nukleazy Mung Bean Nuclease (z firmy Takara Shuzo Co., Ltd.) i ligowano z udziałem ligazy DBA T4 do Fragmentu 1, otrzymanego sposobem powyżej opisanym. Otrzymany tak fragment DNA strawiono przez Sali i religowano do regionu rrnBt^. Następnie fragment DNA ligowano do miejsca Smal wektora pOC18 w celu skonstruowania wektora ekspresyjnego [pKOT245 (nr rejestracyjny BIKOKEN-KI P-14895), (fig. 1)], przeznaczonego do wytwarzania białka. Długość DNA pKOT245 wynosi 3,5 kz. Sekwencję nukleotydów wektora ekspresyjnego skonstruowanego z przeznaczeniem do wytwarzania omawianego białka analizowano z zastosowaniem analizatora sekwencji DNA (Pharmacia ALF).

(3) Transformacja.

Transformację przeprowadzono zgodnie z metodą transformacji przewidującą zastosowanie chlorku rubidu, podaną przez Kushnera i in. [Genetic Engineering, str. 17, Elsevier

186 518 (1978)]. Mówiąc krótko, użyto pKOT245 do transformacji komórek szczepu-gospodarza E. coli W3110M według metody powyżej wspomnianej, w wyniku czego wytworzono transformanty E. coli przeznaczone do produkowania białka.

Przykład 2. Hodowla (1) Hodowla.

Wstępną hodowlę bakterii E. coli, w których dochodzi do ekspresji białka według wynalazku, przeprowadzono w zmodyfikowanym podłożu SOC (Bacto tryptone 20 g/litr, ekstrakt drożdżowy Bacto 5 g/litr, NaCl 0,5 g/litr, MgCl₂'6 H₂O 2,03 g/litr, glukoza 3,6 g/litr). Następnie, 100 ml zawiesiny bakterii użyto do zaszczepienia 5 litrów podłoża produkcyjnego (Bacto tryptone 5 g/litr, kwas cytrynowy 4,3 g/litr, K₂HPO4 4,675 g/litr, KH₂PO4 1,275 g/litr, NaCl 0,865 g/litr, FeS04 7H₂O 100 mg/litr, CuSO4’5 H₂O 1 mg/litr, MnSO> nH₂O 0,5 mg/litr, CaCh 2H₂O 2 mg/ml, Na₂B4C>7 - 1OH₂O 0,225 mg/litr, (NH4)₆Mo70^₂4 · 4H₂O 0,1 mg/litr, ZnS04 7H₂O 2,25 mg/litr, C0Cl₂ · 6H₂O 6 mg/litr, MgSC4 · 7H₂O 2,2 g/litr, chlorowodorek tiaminy 5,0 mg/litr, glukoza 3 g/litr) i hodowlę prowadzono w 10-litrowym fermentowe z mieszaniem i napowietrzaniem. Po osiągnięciu wczesnego stopnia logarytmicznej fazy wzrostu [gęstość optyczna (OD55o) = 5,0], do fermentora wprowadzono izopropylo-β-Ο-tiogalaktopiranozyd w końcowym stężeniu 1 mM i hodowlę prowadzono, a^ do osiągnięcia OD550 = 150. Podczas prowadzenia hodowli utrzymywano temperaturę na poziomie 32°C, a wartość pH na poziomie 7,15 (za pomocą dodawania amoniaku). W celu zapobieżenia obniżaniu się stężenia rozpuszczonego tlenu, zwiększano szybkość mieszania w celu utrzymania stężenia rozpuszczonego tlenu na poziomie 50% nasycenia powietrza. Hodowla postępowała z dodawaniem 50% roztworu glukozy na poziomie 0,2% w celu uzyskania wysokiej gęstości komórek, przy wskazaniu nagłego wzrostu stężenia rozpuszczonego tlenu.

(2) Otrzymywanie ciałek wtrętowych E. coli.

Brzeczkę hodowlaną otrzymaną sposobem powyżej opisanym odwirowano w celu zebrania komórek, które następnie zawieszono w 25 mM buforze Tris, zawierającym 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (pH 7,3). Komórki rozerwano za pomocą przepuszczenia przez homogenizator (produkcji firmy APV Gaulin 1nc.) i ponownie odwirowano w celu zebrania osadu zawierającego ciałka wtrętowe.

Przykład 3. Oczyszczanie (1) Solubilizacja ciałek wtrętowych E. coli.

Po trzykrotnym przemyciu zużyciem 1% Triton Χ-100, ciałka wtrętowe E. coli wirowano przy 3000 x g w ciągu 30 minut, w temperaturze 4°C, po czym otrzymany osad poddano solubilizacji za pomocą nadźwiękawiania w środowisku, które stanowił 20 mM bufor Tris-HC1, pH 8,3, 8 M mocznik, 10 mM DTT i 1 mM EDTA.

(2) Otrzymywanie monomerów.

Otrzymany w wyniku solubilizacji roztwór wirowano przy 20000 x g w ciągu 30 minut, w temperaturze 4°C, i zebrano utworzony supematant. Zgromadzony tak supematant naniesiono na SP-Sepharose FF (Pharmacia Ab), zrównoważoną 20 mM buforem Tris-HCl, pH

8.3, 6 M mocznik, 1 mM EDTA, a następnie, po przemyciu również tym samym roztworem, przeprowadzono elucję takim samym roztworem, ale zawierającym 0,5 M NaCl. Białko zawarte w eluacie poddano sulfonowaniu za pomocą wprowadzania Na₂SO3 i Na₂S40ć, aż do uzyskania końcowego stężenia, odpowiednio, 111 mM i 13 mM, oraz inkubowania w temperaturze 4°C w ciągu 15 godzin. Roztwór po sulfonowaniu poddano chromatografii żelowej na Sephacryl S-200 (Pharmacia AB) (zrównoważony 20 mM buforem Tris-HCl, pH

8.3, 6 M mocznik, 0,2 M NaCl i 1 mM EDTA), w wyniku czego otrzymano oczyszczone sulfonowane monomery białka według wynalazku.

(3) Refałdowanie.

Roztwór sulfonowanych monomerów wprowadzono, przy mieszaniu, do dziewięć razy większej objętości 50 mM buforu z solą sodową glicyny, pH 9,8, 0,2 M NaCl, 16 mM CHAPS, 5 mM EDTA, 2 mM GSH (glutation w postaci zredukowanej) i 1 mM GSSG (glutation w postaci utlenionej), po czym całość inkubowano w ciągu 24 godzin w temperaturze 4°C w celu utlenienia i refałdowania białka według wynalazku.

(4) Wytwarzanie homodimerów.

186 518

Roztwór białka refałdowanego rozcieńczono taką samą objętością wody oczyszczonej, po czym doprowadzono do pH około 7,4 za pomocą dodania 6 N NaCl i umieszczono w urządzeniu do wytrącania izoelektrycznego. Strąty zebrane za pomocą wirowania przy 3000 x g w ciągu 20 minut solubilizowano w 30% roztworze acetonitiylu zawierającego 0,1% kwasu ^^i^<^i^(^(^(^(^(^’wego (TFA). Utworzony roztwór rozcieńczono taką samą objętością wody oczyszczonej i wprowadzono na kolumnę RESOURCE RPC (Pharmacia AB) do HPLC z odwróconymi fazami, wstępnie zrównoważoną 25% acetonitrylem zawierającym 0,05% TFA. Następnie przeprowadzono elucję w gradiencie liniowym 25 - 45% acetonitrylu zawierającego 0,05% TFA. Przebieg elucji kontrolowano przy absorbancji 280 nm. Frakcje zawierające oczyszczone białko homodimeryczne zgromadzono i /liofilizowano z zastosowaniem aparatu SpeedVac Concentrator (Servant Co.).

(5) Określenie właściwości fizykochemicznych oczyszczonego białka według wynalazku.

a) Analiza N-końcowej sekwencji aminokwasów.

Analizę N-końcowej sekwencji aminokwasów oczyszczonych białek przeprowadzono przy użyciu analizatora sekwencji aminokwasów (Model 476A, Applied Biosystems Inc.) w celu ustalenia sekwencji aminokwasów od N-końca do 30-ego aminokwasu, jak to przedstawiono w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji.

b) Analiza składu aminokwasowego.

Analizy składu aminokwasowego oczyszczonych białek otrzymanych sposobem powyżej opisanym, dokonano z zastosowaniem analizatora sekwencji aminokw^ów (PICO TAG Systems. Waters). Otrzymany wynik przedstawiono w tabeli 1. Liczba podana w tabeli 1 wskazuje ilość reszt aminokwasowych w monomerycznym białku.

Tabela 1

Aminokwas	Ilość stwierdzona	Ilość oczekiwana
Asx	11,5	12
Glx	10,9	11
Ser	8,4	9
Gly	4,3	4
His	4,0	4
Arg	7,7	7
Thr	5,4	6
Ala	7,3	7
Pro	10,2	10
Tyi-	2,9	3
Val	5,7	7
Met	5,1	4
1/2 Cys	2,6	7
Ile	4,9	6
Leu	10,0	10
Phe	4,0	4
Lys	5,9	6
Trp	-	2
Długość sekwencji		119

186 518

-: nieoznaczalne.

c) Badanie metodą elekfroforetyczną.

Masę cząsteczkową oczyszczonych białek otrzymanych sposobem powyżej opisanym ustalono na około 28 kDa metodą SDS-PAGE w warunkach nieredukujących.

Na podstawie wyników przedstawionych powyżej w punktach a), b) i c) można stwierdzić, że białko według wynalazku zawiera 119 reszt aminokwasowych, rozpoczynając się od N-końcowej Pro.

Przykład 4. Określenie aktywności biologicznych (1) Aktywność ektopowego tworzenia kości u myszy.

Około 500 pg białka homodimerycznego, otrzymanego sposobem opisanym w przykładzie 3, rozpuszczono i rozcieńczono w 50 |il 10 mM kwasu solnego, po czym sporządzono następujące rozcieńczenia utworzonego tak roztworu : 1 jg/10 pi, 10 pg/10 (ig i 100 pg/10 fil. Dziesięć mikrolitrów każdego roztworu zmieszano ze 150 mikrolitrami roztworu świńskiego ścięgnowego kolagenu typu I (Koken, 0,5%, pH 3, I-AC) i po zobojętnieniu zlioflizowano, po czym otrzymaną mieszaninę wszczepiono do kieszonek utworzonych w mięśniach uda

8-tygodniowych samców myszy ICR. Po upływie 21 dni od wszczepienia, zwierzęta uśmiercono i pobrano z nich uda. Po ściągnięciu z ud skóry, rozmiary utworzenia się zwapniałych tkanek oceniano metodą rentgenograficzną z zastosowaniem miękkich promieni X. Jak to przedstawiono w tabeli 2, wszczepienie białka dimerycznego w dawce wynoszącej 1 pg/jedno miejsce lub więcej miejsc, wywoływało utworzenie się zwapniałej tkanki w części grupy myszy, podczas gdy wszczepienie 10, lub więcej dawek wywoływało powstanie zwapniałej tkanki u wszystkich użytych do badania myszy.

Tabela 2

Dawka białka homodimerycznego	Powstanie zwapniałej tkanki
Kontrola (sam kolagen typu I)	0/4
1 pg/miejsce	3/4
10 pg/miejsce	4/4
100 pg/miejsce	4/4
Figura 2 przedstawia typowe przykłady rentgenogramów zwapniałej tkanki, wykonanych z zastosowaniem miękkich promieni X, które to zwapnienie wywołane jest podaniem dawek białka MP52. Fig. 2A, 2B i 2C przedstawiają przykłady wykonanych z zastosowaniem

miękkich promieni X rentgenogramów ud mysich z wszczepionym białkiem homodimerycznym, podanym w dawkach wynoszących, odpowiednio, 1 jig białka homodimerycznego/miejsce, 10 (rag białka homodimerycznego/miejsce i 100 pg białka homodimerycznego/miejsce. Rentgenogramy te pokazują, że białko homodimeryczne powodowało tworzenie się u myszy zwapniałej tkanki i zwiększało zakres tego zjawiska w stopniu zależnym od wielkości podanej dawki. W celu przekonania się, czy utworzone zwapniałe tkanki stanowiły chrząstkę czy kość, skrawki utrwalonych ud mysich, do których wszczepiono białko homodimeryczne w dawce wynoszącej 10 pagmiejsce, zabarwiono barwnikiem von Kossa, barwnikiem Alcian Blue lub hematoksyliną-eozyną.

Figura 3 pokazuje wykonane pod mikroskopem świetlnym fotografie skrawków zabarwionych zgodnie z odnośnym sposobem barwienia. Na fig. 3 (barwienie barwnikiem von Kossa) obszary wskazane przez ct i cc stanowią, odpowiednio, zwapniałą tkankę i zwapniałe komórki chrzęstne. Na fig. 3B (barwienie barwnikiem Alcian Blue), obszar wskazany przez rc stanowi pozostającą tkankę chrzęstną. Na fig. 3C (barwienie hematoksyliną-eozyną), elementy wskazane przez ad, bm, lb, ob i wb stanowią, odpowiednio, komórkę tłuszczową komórki szpiku kostnego, kość blaszkowatą, komórki kościotwórcze i kość utkaną. Toteż oczywiste jest, że wszczepienie białka homodimerycznego z kolagenem typu I do ud mysich wywołuje powstanie w tych miejscach zwapniałych komórek chrzęstnych, komórek kościotwórczych i komórek szpiku kostnego.

186 518

Tak więc, wykazano, że białko homodimeryczne wykazuje aktywność ektopowego tworzenia chrząstki i kości.

(2) Analiza przebiegu z upływem czasu ektopowego tworzenia kości u myszy.

Zmieszano 3 |ig białka dimerycznego, otrzymanego sposobem opisanym w przykładzie 3, z roztworem kolagenu typu I i utworzoną mieszaninę zobojętniono sposobem opisanym w przykładzie 4 (1). Po zliofilizowaniu, otrzymane substancje wszczepiono w uda samcom myszy ICR. W dniach 3, 7, 10, 14, 21 i 28 od wszczepienia, uda wycięto i utrwalono w 10% formalinie, po czym odcinki ud zabarwiono hematoksyliną-eozyną lub barwnikiem von Kossa. Figura 4 przedstawia wykonane pod mikroskopem świetlnym fotografie zabarwionych skrawków.

W dniu 3 (fig. 4A, barwienie hematoksyliną-eozyną), w przestrzeni pomiędzy włóknami wszczepionego kolagenu (co) a komórkami mięśniowymi (m) pojawiły się niezróżnicowane komórki mezenchymalne (mc) włącznie z morfologicznie włóknistymi komórkami tkanki łącznej. Między dniem 7 a 10 (fig. 4B i 4C, odpowiednio barwienie hematoksyliną-eozyną), przestrzeń tę wypełniły niezróżnicowane komórki mezenchymalne (mc) i te komórki uległy przerostowi i zróżnicowaniu w tkankę chrzęstną pierwotną. W dniu 14 (fig 4D, barwienie hematoksyliną-eozyną. i fig. 4E, barwienie barwnikiem von Kossa) zaobserwowano zwapnialą tkankę chrzęstną (cc) i tkankę kostną (b). W dniu 21 (fig 4D, barwienie hematoksyliną-eozyną oraz fig. 4E, barwienie barwnikiem von Kossa) wcale nie zaobserwowano zwapniałej tkanki chrzęstnej, przy czym wydawało się, że tkanka zaobserwowana w dniu 14 została zastąpiona przez kość (b) ze szpikiem kostnym (bm). W dniu 28 (fig. 4H, barwienie hematoksyliną-eozyną), stwierdzono obecność dużej ilości komórek szpiku kostnego, a uformowana kość wydawała się ulegać procesowi resoprcji.

Tak więc, jest rzeczą oczywistą, że białko homodimeryczne wywołuje kostnienie śródchrzęstne poprzez tworzenie chrząstki w miejscach ektopowych, jak o tym doniesiono w związku ze stosowaniem innych białek BMP.

(3) Wpływ na kostnienie na podłożu błoniastym.

Białko homodimeryczne otrzymane sposobem opisanym w przykładzie 3 rozpuszczono w roztworze chlorku sodowego buforowanym fosforanem (pH 3,4) zawierającym 0,01% albuminy surowicy ludzkiej, po czym sporządzono następujące stężenia utworzonych roztworów : 0,01 ng/20 pl, 0,1 f.g/20 jj1 i 1 ji.g/20 |al. Dwadzieścia mikrolitrowych porcji każdego z tych roztworów wstrzyknięto 12 razy, jeden raz dziennie, do okostnej kości ciemieniowej noworodków szczurzych, przy użyciu mikrostrzykawki, począwszy od pierwszego dnia po urodzeniu. Tę samą objętość vehiculum wstrzyknięto do kości ciemieniowej każdego szczura od strony przeciwnej. Taką samą objętość vehiculum wstrzyknięto także od obu stron kości ciemieniowej szczurów kontrolnych. W dniu 1 od ostatniego wstrzyknięcia, szczury uśmiercono i obie strony kości ciemieniowych wycięto i utrwalono, po czym spreparowano odwapnione skrawki zabarwione hematoksyliną-eozyną w celu zmierzenia, na fotografiach mikroskopowych, grubości kości ciemieniowej od strony dokonanego wstrzyknięcia. Dla każdego szczura obliczono wartość stosunku grubości strony kości ciemieniowej, od której dokonano wstrzyknięcia białka homodimerycznego, do grubości strony, od której dokonano wstrzyknięcia vehiculum. Jak to przedstawiono w tabeli 3, białko homodimeryczne powodowało zwiększenie grubości kości ciemieniowej w stopniu zależnym od wielkości podanej dawki. Typowy przykład fotografii mikroskopowych skrawka w przypadku strony, od której wstrzyknięto białko homodimeryczne w dawce 0,1 pg/miejsce przedstawiono na fig. 5B w porównaniu z miejscem strony przeciwnej, od której wstrzyknięto vehiculum (fig. 5A). Wstrzyknięcie białka homodimerycznego wywoływało aktywację i proliferację komórek okostnowych (p), przy czym w kości ciemieniowej i na niej (b) zaobserwowano obecność zaktywowanych komórek kościotwórczych (ob). Wyniki te uwidoczniają, że białko homodimeryczne, gdy zostało wstrzyknięte miejscowo, stymulowało kostnienie na podłożu błoniastym oraz, że białko homodimeryczne wywiera dobroczynne działanie w leczeniu zrzeszotnienia kości, złamania kości i ubytków zębodołowych i okołozębowych.

186 518

CCA

CTG

GCC

ACT

CGC

CAG

GGC

AAG

CGA

CCC

AGC

AAC

CTT

AAG

GCT

Pro

Leu

Ala

Thr

Arg

Gln

Gly

Lys

Arg

Pro

Ser

Ły s

Asn

Leu

Lys

Ala

5

10

15

CGC

TGC

AGT

CGG

AAG

GCA

CTb

CAT

GTC

AAC

TTC

AAG

GAC

ATG

GGC

TGG

Arg

Cys

Ser

Arg

Ly3

Ala

Leu

His

/al

Asn

Phe

Lys

Asp

Mat

Gly

Trp

20

25

30

GAC

TGG

ATC

ATC GCA CCC

CTT

GAG

TAC

GAG

C-CT TTC

CAC

TGC

GAG

144

Asp

Trc

Ile

I_e Ala Frc

Leu

Gin

Tyr

Glu

Ala Phe

His

Cy3

Glu

35

40

4 c

•GGG

CTG

TGC

GAG

TTC CCA TTG

CGC

TCC

CAC

s>mr·

GAG CCC

ACG

AAT

CAT

192

Gly

Leu

Cys

bili

Phe Pro Lću

Arg

Ser

His

Leu

Glu Pro

Thr

Asn

His

50

55

60

GCA

GTC

ATC

CAG

ACC CTG ATG

AAC

TCC

ATG

GAC

CCC GAG

TCC

ACA

CCA

240

Ala

Val

Ile

Gln

Thr Leu Met

Asn

Ser

Μβ t

Asp

Pro Glu

Ser

Thr

Pro

65

70

7 5

80

CCC

ACC

TGC

TGT

GTG CCC ACG

CGA

CTG

AGT

CCC

ATC AGC

ATC

CTC

TTC

288

Pro

Thr

Cys

Val Pro Thr

Arg

Leu

Ser

Prc

Ile Ser

Ile

Leu

Phe

85

90

95

ATT

GAC

TCT

GCC

AAC AAC GTG

GTG

TAT

AAG

CAG

TAT GAG

GAC

ATG

GTC

336

Ile

Asp

Ser

Ala

Asn Asn Val

Val

Tyr

Ly3

Gln

Tyr Glu

Asp

Met

Val

100

105

no

GTG

GAG

TCG

TGT

GGC TGC AGG

357

Val^£

Glu

Ser

Cys

Gly Cys Arg

115

186 518

Tabela 3

Dawka białka homodimerycznego ((ig/miej sce/dzień)	Grubość kości ciemieniowej (jam)	Stosunek (B/A)
	od strony wstrzyknięcia:
	vehiculum (A)	MP52 (B)
0 (vehiculum)	128 ±7	141 ±20	1,10 ± 0,16
0,01	134 ±9	167 ±30	1,27 ±0,33
0,1	119 ± 19	190 ±29	1,60 ±010*
1	132 ±9	225 ± 25	1,70 ±014**

Wartości oznaczają średnie ± SD (n = 4);

* p < 0,05;

** p < 0,01 w odniesieniu do grupy, w przypadku której vehiculum wstrzyknięto z obu stron (test Williamsa).

(4) Wpływ na regenerację chrząstki stawowej.

Do badania tego użyto sześciu 12-tygodniowych królików New Zealand White, samców. Skórę na prawym kolanie i torebkę stawową przecięto i utworzono ubytki kostno-chrzęstne, 5x5 mm całej grubości w bruździe rzepki przy użyciu wiertła dentystycznego, w taki sposób, aby nie uszkodzić otaczających ścięgien. Powstałe ubytki wypełniono albo gąbką ze zliofilizowanego kolagenu typu I, albo gąbką ze zliofilizowanego kolagenu typu I zawierającą 10 fig białka homodimerycznego, wytworzonego sposobem opisanym w przykładzie 4(1). Następnie przeciętą torebkę stawową, i skórę zaszyto. Po upływie trzech tygodni od tej operacji, króliki uśmiercono, wycięto głowy kości udowej i utrwalono je w 10% formalinie, po czym odwapnione skrawki zabarwiono barwnikiem Alcian Blue. Na fig. 6 przedstawiono typowe przykłady fotografii mikroskopowych tych skrawków. Ubytki potraktowane białkiem dimerycznym (fig. 6C i 6D) wykazały odtworzenie komórek chrzęstnych (ch) z pozakomórkowymi macierzami, które zabarwiły się intensywnie barwnikiem Alcian Blue, co widać przy porównaniu z ubytkami kontrolnymi z wszczepioną gąbką kolagenu typu I (fig 6A i 6B) wypełnionymi tkanką włóknistą (i). Tkanka chrzęstna indukowana przez białko dimeryczne wykazała strukturę strefową, włącznie z komórkami chrzęstnymi w spoczynku, komórkami chrzęstnymi wzrostowymi i komórkami chrzęstnymi przerostowymi, podobnie do sytuacji obserwowanej w przypadku normalnej chrząstki stawowej. Chondroindukcję przez białko MP52 zaobserwowano w przypadku ubytków u wszystkich królików (n = 3). Wyniki te unaoczniają, że białko dimeryczne jest skuteczne pod względem reperacji uszkodzonej tkanki chrzęstnej u osób choiych, na przykład, na zapalenie kości i stawów.

(5) Wpływ na gojenie się złamania i ubytków kości.

Do badania tego użyto 30 około 15-tygodniowych szczurów Sprague-Dawley, samców. Z wykorzystaniem bocznego dostępu do kości udowej, wybrano wszystkie mięśnie i tkankę z trzonu kości długiej. Następnie utworzono 5 mm-segmentowy ubytek kostny w środkowym regionie trzonu prawej kości udowej przy użyciu wiertła dentystycznego, po czym wzdłuż warstwy korowej kości udowej zamocowano specjalnie wykonaną płytkę polietylenową, przy użyciu śrub ze stali nierdzewnej. Sposobem opisanym w przykładzie 4(1) sporządzono gąbki z kolagenu typ I zawierające 0, 1, 10 i 100 pg białka homodimerycznego i wszczepiono je do segmentalnych ubytków kości, po czym ranę zaszyto. Tuż po zakończeniu operacji i po upływie 12 tygodni od jej przeprowadzenia, ubytki poddano ocenie metodą rentgenograficzną z zastosowaniem miękkich promieni X. Jak to uwidoczniono na fig. 7, dawki białka homodimerycznego wynoszące 10 i 100 pg/miejsce stymulowały tworzenie się w ubytkach kostniny (cs) i doprowadzały do tworzenia się zrostu kości. Jednakże, wpływ ten w przypadku dawki wynoszącej 1 pg/miejsce, przy porównaniu z kontrolnym ubytkiem z wszczepionym kolagenem, nie był wyraźny: zaobserwowano jedynie brzeżne śródkostne formowanie kości. Po

186 518 upływie 12 tygodni od przeprowadzenia operacji szczury uśmiercono i kość udową wraz z ubytkiem wycięto, po czym zmierzono zawartość substancji mineralnych w kości (zebrano jeden z trzech środkowych sk^ingów w ubytku) metodą absorpcjometrii rentgenowskiej z podwójną wiązką promieniowania (Aloka, Model DCS-600), stosując sposób z 1 mm szerokości skanowania po usunięciu płytki polietylenowej. Oba końce kości udowej z żywicą zamocowano, po czym zmierzono w badanych próbkach maksymalną wytrzymałość zrostu na skręcanie przy rozerwaniu, z użyciem rozciągacza kości systemu Malto (model MZ-500D), przy szybkości posuwu wynoszącej 180°/min.

Okazuje się, że białko homodimeryczne powoduje zarówno zwiększenie zawartości substancji mineralnych, jak i podwyższenie wytrzymałości kości w przypadku ubytku, w kości udowej szczura z wszczepionym białkiem. Wyniki wykazują skuteczność białka według wynalazku w gojeniu złamania kości i w odtwarzaniu kości w przypadku zaistnienia ubytku.

Tabela 4

Dawka białka homodunerycznego (ng/miejsce)	Zawartość substancji mineralnych kości w ubytku kości udowej szczura (mg)	Maksymalna wytrzymałość na skręcanie (kG cm)	Liczba
Sam kolagen	120,2 ± 24,5	2,92 ± 0,09	6
1	176,9 ±36,4	6,24 ± 1,00	8
10	277,4 ± 63,9	9,35 ±3,14	8
100	374,8 ±67,1*	40,34 ± 7,64*	8

Wartości oznaczają średnie ± SE;

* p < 0,05 w odniesieniu do grupy z samym kolagenem (test Studenta t).

Na podstawie wyników badań przeprowadzonych sposobem opisanym w przykładzie 4 stwierdzono, że białko homodimeryczne według wynalazku wykazuje aktywność morfogenetycznąw stosunku do chrząstki i do kości.

Białko złożone z homodimeru białka o sekwencji aminokwasów uwidocznionej w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji wykazuje aktywność morfogenetyczną w stosunku do chrząstki i kości i jest użyteczne, w postaci kompozycji farmaceutycznej, w leczeniu chorób chrząstki i kości. Następnie, białko według wynalazku można wytwarzać w skali przemysłowej i w postaci czystej z wykorzystaniem metod inżynierii genetycznej, obejmujących przeprowadzenie hodowli bakterii E. coli t^^^:foi^owanych wektorem zapewniającym ekspresję większej liczby kopii wspomnianego białka.

Wykaz Sekwencji

SEK. Nr ID.: 1

Długość sekwencji: 119

Typ sekwencji: aminokwasowa

Topologia: liniowa

Typ cząsteczkowy: peptyd

Typ fragmentu: fragment N-końcowy

Pierwotne źródło

Organizm: Homo sapiens

Nazwa tkanki: płód

Cechy znamienne:

Inna informacja: z sekwencji aminokwasów 383 do 501 sekwencji aminokwasów MP52.

Opis sekwenc^: SEK. Nr ID.: 1:

186 518

SEK. Nr 1D.: 2

Długość sekwencjj: 27

Typ sekwentcj: kwas nukleinowy

Struktura niciowa: pojedyncza

Topotogia: liniowa

Typ cząsteczkowy : inny kwas nukleinowy

Pierwotne źródło : nie ma

Organizm : nie ma

Szczep : nie ma

Cechy znamienne : starter PCR „ w górę” MP52 typu dojrzałego

Opis sekwenccj : SEK. Nr 1D. : 2:

ATAATGCCAC TAGCAACTCG TCAGGGC 27

SEK. Nr ID.: 3

Długość sekwenccj: 26

Typ sekwen^j: kwas nukleinowy

Struktura niciowa: pojedyncza

Topologa: liniowa

Typ cząsteczkowy: inny kwas nukleinowy

Źródło pierwotne : nie ma

Organizm : nie ma

Nazwa tkarni : nie ma

Cechy znamieruie:

Inne informacje : starter „ w dół” PCR MP52 typu dojrzałego.

Opis sekwe^cj: SEK. NR 1D.: 3 :

CGTCGACTAC CTGCAGCCAC ACGACT 26

Krótkie objaśnienie rysunków

Figura 1 przedstawia mapę plazmidową, wektora ekspresyjnego (pKOT245) dla białka według wynalazku, wytworzonego sposobem opisanym w przykładzie 1 (2).

Figura 2 przedstawia wykonany z zastosowaniem miękkich promieni X rentgenogram zwapniałej tkanki, której utworzenie się w mysim udzie wywołano sposobem opisanym w przykładzie 4(1).

Figura 3 przedstawia wykonaną pod mikroskopem świetlnym fotografię zwapniałej tkanki zabarwionej w mysim udzie sposobem opisanym w przykładzie 4(1),

Figura 4 przedstawia wykonaną pod mikroskopem świetlnym fotografię zwapniałej, w miarę upływu czasu, tkanki zabarwionej w mysim udzie sposobem opisanym w przykładzie 4 (2).

Figura 5 przedstawia wykonaną pod mikroskopem świetlnym fotografię szczurzej kości ciemieniowej zabarwionej sposobem opisanym w przykładzie 4 (3).

Figura 6 przedstawia wykonaną pod mikroskopem świetlnym, fotografię ubytków chrząstki stawowej zabarwionych w głowie kości udowej królika sposobem opisanym w przykładzie 4 (4).

Figura 7 przedstawia wykonany z zastosowaniem miękkich promieni X rentgenogram formowania kości w ubytkach kości udowych szczura sposobem opisanym w przykładzie 4 (5).

186 518

Fig. 2

186 518

Fig. 3

186 518

Fig. 4

186 518

Fig. 5

186 518

Fig. 6

186 518

CS

Fig. 7

186 518

Fig. 1

AatII(3627),

Gsul(2794)

Cfrl 01(2789) Ppal(2776)

HindM(400) Narl(235) Ndel(183)

Sspl(3511)> XmnI(3304), Scal(3187)

SphI(406)

Pstl(412)

SaU(418) Xbal(424) BamHI(430)

pKOT245

Pstl(895)

SalI(901)

AflIII(1816)

EcoRI(1461)i

Kpnl(1449) Sacl(1455)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Białko o sekwencji aminokwasów przedstawionej w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji.
2. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że jest w postaci homodimeru.
3. Kompozycja farmaceutyczna przeznaczona do leczenia chorób chrząstki i kości, znamienna tym, że zawiera, w ilości terapeutycznie skutecznej, białko zdefiniowane w zastrz. 2 oraz farmaceutyczny nośnik.
4. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 3, znamienna tym, że nadaje się do leczenia chorób chrząstki i kości takich, jak zrzeszotnienie kości.
5. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 3, znamienna tym, że nadaje się do leczenia chorób chrząstki i kości takich, jak zapalenie kości i stawów lub zapalenie części kostnych stawu.
6. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 3, znamienna tym, że nadaje się do leczenia chorób chrząstki i kości takich, jak złamanie kości i ubytek kości.
7. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 3, znamienna tym, że nadaje się do leczenia chorób chrząstki i kości takich, jak ubytki korzeniowe i zębodołowe.
8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 3, znamienna tym, że nadaje się do leczenia chorób chrząstki i kości takich jak, zaburzenia albo ubytki chrzęstne, przykładowo ubytek chrząstki stawowej.
9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 3, znamienna tym, że nadaje się do leczenia chorób chrząstki i kości, które są wrodzone, jak np. chondrodysplazja, chondrohipoplazja, achondrogeneza, rozszczep podniebienia i osteodysplazja.
10. Sposób wytwarzania białka o sekwencji aminokwasów przedstawionej w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji, znamienny tym, że przeprowadza się hodowlę bakterii E. coli transformowanych plazmidem zawierającym sekwencję DNA zdolną do wyrażania wspomnianego białka.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że plazmid zawiera DNA kodujący sekwencję aminokwasów uwidocznioną w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji, z metioniną na N-końcu.
12. Sposób wytwarzania homodimeru białka o sekwencji aminokwasów przedstawionej w SEK. Nr ID.: 1 w Wykazie Sekwencji, znamienny tym, że:

konstruuje się plazmid zawierający DNA kodujący sekwencję aminokwasów uwidocznioną w SEK. Nr iD.: 1 w Wykazie Sekwencji z metioniną na N-końcu;

wprowadza się skonstruowany plazmid do komórek bakterii E. coli w celu dokonania ich transformacji;

solubilizuje się ciałka wtrętowe otrzymane w wyniku przeprowadzenia hodowli wspomnianych bakterii E. coli;

wyodrębnia się białko monomeryczne z utworzonego roztworu;

dokonuje się refałdowania białka monomerycznego z utworzeniem białka dimerycznego i otrzymane białko poddaje się oczyszczaniu.