PL188497B1 - Kompozycja lipidowa do wytwarzania liposomów - Google Patents

Abstract

1. Kompozycja lipidowa do wytwarzania liposomów, zawierająca znane składniki lipidowe, korzystnie fosfolipidy pochodzenia naturalnego i/lub fosfolipidy syntetyczne, znamienna tym, że zawiera modyfikator, korzystnie w ilości od 15% wagowych do 50% wagowych, w postaci 1,3-dihydroksy-5-ałkilobenzenu albo O-acylo-alkilobenzeno-O-siarczanu.

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja lipidowa do wytwarzania liposomów, znajdujących zastosowanie zwłaszcza do produkcji leczniczych preparatów liposomowych.

Z polskiego zgłoszenia wynalazku nr P.317273 znana jest kompozycja lipidowa do wytwarzania liposomów składająca się z lecytyny jajecznej, dimirystylofosfatydyloglicerolu i dimirystylofosfatydylocholiny, w stosunku molowym 3:3:4.

Wynalazek dotyczy kompozycji lipidowej do wytwarzania liposomów, zawierającej znane składniki lipidowe, korzystnie fosfolipidy pochodzenia naturalnego i/lub fosfolipidy syntetyczne. Istota wynalazku polega na tym, że kompozycja zawiera modyfikator, korzystnie w ilości od 15% wagowych do 50% wagowych, w postaci 1,3-dihydroksy-5-alkilobenzenu albo O-acylo-alkilobenzeno-O-siarczanu, korzystnie 1 -mirystyloksy-5-pentadecylobenzeno-3-siarczanu.

Obecność modyfikatorów w kompozycji według wynalazku powoduje, że w najprostszych warunkach (przez wytrząsanie składników lipidowych z wodnym roztworem chlorowodorku substancji czynnej oraz poprzez zamrażanie i rozmrażanie) stopień enkapsulacja tak związków markerowych, jak i modelowych leków antracyklinowych ulega kilkukrotnemu zwiększeniu, w porównaniu ze stopniem enkapsulacji liposomów wytwarzanych ze znanych kompozycji lipidowych, przy równoczesnym zmniejszeniu warstwowości i wielkości liposomów. Dodatkowo, zastosowanie acylowych pochodnych monosulfonowych lipidów rezorcynolowych umożliwiło zwiększenie enkapsulacji modelowego leku antracyklinowego do ponad 95%, podczas gdy przy stosowaniu kompozycji lipidowej zawierającej dimirytylofosfatydyloglicerol, wartość ta nie przekracza 55%. Korzystny wpływ obecności lipidów rezorcynolowych i ich pochodnych w składzie lipidowym liposomów wyrażany jest również w stosunku do kompozycji zawierających w swoim składzie cholesterol. Dzięki właściwościom antyoksydacyjnym lipidów rezorcynolowych oraz inhibitorowych w stosunku do fosfolipaz ich obecność w składzie lipidowym zapewnia dodatkowo ochronę składników lipidowych przed procesami ich oksydatywnej degradacji a także powodującej destrukcję struktury liposomowej hydrolizie przez fosfolipazy. Porównanie objętości zamkniętej roztworu wodnego związku markerowego w liposomach utworzonych z kompozycji lipidowych zawierających lipidy rezorcynolowe z objętością zamkniętą liposomów fosfolipidowych, przedstawia poniższa tabela. Objętość liposomów przygotowanych z kompozycji kontrolnych przyjęto za 100.

188 497

Tabela

Kompozycja (fosfolipidy)	Względna objętość zamknięta przy udziale wagowym w kompozycji lipidu rezorcynolowego
	0	10% w/w	20% w/w	30% w/w
PC	100	180	300	520
PC/PE (7:3)	100	230	440	480
PC/CHOL (7:3)	100	270	370	650

W tabeli PC oznacza lecytynę jajeczną, PE - fosfatydyloetanoloaminę, CHOL - cholesterol, w/w - stosunek wagowy składników kompozycji.

Przedmiot wynalazku jest objaśniony w przykładach wykonania, które ilustrują skład ilościowo-jakościowy kompozycji lipidowych o różnych składnikach oraz sposób wytwarzania liposomów z tych kompozycji.

Przykład 1. Kompozycja lipidowa składa się z 85% wagowych lecytyny jajecznej i 15% wagowych alkilorezorcynoli izolowanych z materiału zbożowego. Sposób wytwarzania liposomów z przykładowej kompozycji lipidowej jest następujący. W kolbie okrągłodennej, o pojemności 250 ml, umieszcza się 85 mg lecytyny jajecznej, firmy Lipid Products, Wielka Brytania, i 15 mg alkilorezorcynoli izolowanych z materiału zbożowego w postaci rozpuszczonej w chloroformie, a następnie odparowuje rozpuszczalnik na wyparce obrotowej, pod zmniejszonym ciśnieniem. Do kolby z pozostałością po odparowaniu, umieszczonej w termostatowanej łaźni wodnej o temperaturze 40°C, dodaje się wodny roztwór związku markerowego (Patent Blue Violet) ( 20 mg w 10 ml) o tej samej temperaturze, a następnie zawartość kolby wytrząsa energicznie przez 5 minut oraz poddaje procesowi zamrażania i rozmrazania. Po tych operacjach substancja markerowa jest w większości zawarta w rozproszonej warstwie lipidowej. Badanie zawartości kolby po wytrząsaniu, przeprowadzone przy użyciu mikroskopu optycznego z głowicą kontrastowo-fazową, przy powiększeniu 2250 razy pozwala obserwować struktury liposomowe, wypełnione barwną zawartością. Sączenie molekularne zawiesiny liposomów przez kolumnę z wypełnieniem Sephadex G 50 Fine (Sigma, St. Louis, MO, USA) prowadzi do oddzielenia niezamkniętej w liposomach substancji. Ilość zamkniętej w liposomach substancji określona jest we frakcjach wycieku z kolumny sefadeksowej, po rozbiciu struktur liposomowych przez użycie detergentu (np. Triton X-100), przez zmierzenie ekstynkcji roztworu przy długości fali odpowiadającej zamkniętej w liposomach substancji. Niezależny pomiar zawartości fosforu (metoda z kwasem nadchlorowym, molibdenianem amonu i kwasem askorbinowym z pomiarem ekstynkcji przy 812 nm), pozwolił oznaczyć stopień enkapsulacji badanych próbek na poziomie trzykrotnie wyższym od oznaczanego dla liposomów niezawierających lipidów rezorcynolowych i/lub ich pochodnych. Uzyskane liposomy, w odróżnieniu od liposomów niezawierających modyfikatorów będących przedmiotem wynalazku, wykazują wielkość około 180 nm, stabilną w szerokim zakresie temperatur. Stwierdzono, że dodanie substancji zwiększających trwałość liposomów in vivo nie obniża efektywności enkapsulacji.

Przykład 2. Kompozycja lipidowa składa się z 75% wagowych lecytyny jajecznej i 25% wagowych alkilorezorcynoli izolowanych z materiału zbożowego. Sposób wytwarzania liposomów z przykładowej kompozycji lipidowej jest następujący. W kolbie okrągłodennej, o pojemności 250 ml, umieszczono 75 mg lecytyny jajecznej, firmy Lipid Products, Wielka Brytania, i 25 mg alkilorezorcynoli izolowanych z materiału zbożowego w postaci rozpuszczonej w chloroformie, a następnie odparowano rozpuszczalnik na wyparce obrotowej, pod zmniejszonym ciśnieniem. Do kolby z pozostałością po odparowaniu, umieszczonej w termostatowanej łaźni wodnej o temperaturze 40°C, dodano wodny roztwór związku markerowego (Patent Blue Violet) (20 mg w 10 ml) o tej samej temperaturze, a następnie zawartość kolby wytrząsano energicznie przez

188 497 minut. Po tych operacjach substancja aktywna jest w większości zawarta w rozproszonej warstwie lipidowej. Badanie zawartości kolby po wytrząsaniu, przeprowadzone przy użyciu mikroskopu optycznego z głowicą kontrastowo-fazową, przy powiększeniu 2250 razy pozwala obserwować struktury liposomowe, wypełnione barwną zawartością. Sączenie molekularne zawiesiny liposomów przez kolumnę z wypełnieniem Sephadex G 50 Fine (Sigma, St. Louis, MO, USA) prowadzi do oddzielenia niezamkniętej w liposomach substancji. Ilość zamkniętej w liposomach substancji określona jest we frakcjach wycieku z kolumny sefadeksowej, po rozbiciu struktur liposomowych przez użycie detergentu (np. Triton X-100), przez zmierzenie ekstynkcji roztworu przy długości fali odpowiadającej zamkniętej w liposomach substancji. Niezależny pomiar zawartości fosforu (metoda z kwasem nadchlorowym, molibdenianem amonu i kwasem askorbinowym z pomiarem ekstynkcji przy 812 nm), pozwolił oznaczyć stopień enkapsulacji badanych próbek na poziomie czterokrotnie wyższym od oznaczanego dla liposomów niezawierających lipidów rezorcynolowych i/lub ich pochodnych.

Przykład 3. Kompozycja lipidowa składa się z 25% wagowych lecytyny jajecznej, 25% wagowych uwodornionej lecytyny jajecznej i 50% wagowych 1-mirystyloksy-5-pentadecylobenzeno-3-siarczanu. Sposób wytwarzania liposomów z przykładowej kompozycji lipidowej jest następujący. W kolbie okrągłodennej, o pojemności 250 ml, umieszczono 25 mg lecytyny jajecznej, firmy Lipid Products, Wielka Brytania, 25 mg uwodornionej lecytyny jajecznej, firmy Lipid Products, Wielka Brytania, i 50 mg 1-mirystyloksy-5-pentadecylobenzeno-3-siarczanu w postaci rozpuszczonej w chloroformie, a następnie odparowano rozpuszczalnik na wyparce obrotowej, pod zmniejszonym ciśnieniem. Do kolby z pozostałością po odparowaniu, umieszczonej w termostatowanej łaźni wodnej o temperaturze 40°C, dodano wodny roztwór chlorowodorku doksorubicyny (20 mg w 10 ml) i całość poddano procesom dalszej obróbki w sposób opisany w przykładzie pierwszym. Badanie zawartości kolby po wytrząsaniu, przeprowadzone przy użyciu mikroskopu optycznego z głowicą kontrastowo-fazową, przy powiększeniu 2250 razy pozwala obserwować struktury liposomowe, wypełnione barwną zawartością. Roztwór wodny otrzymany przez odwirowanie (16 tys. obr/min, przez 6 min) jest bezbarwny i nie wykazuje maksimów absorpcji charakterystycznych dla pochodnych antracyklinowych w widmie ultrafioletowym. Również sączenie molekularne zawiesiny liposomów przez kolumnę z wypełnieniem Sephadex G 50 Fine (Sigma, St. Louis, MO, USA) nie prowadzi do zatrzymania wykrywalnych ilości doksorubicyny na złożu, co dowodzi całkowitej enkapsulacji. Całość substancji czynnej można natomiast oznaczyć we frakcjach wycieku z kolumny sefadeksowej, po rozbiciu struktur liposomowych przez użycie detergentu (np. Triton X100), przez zmierzenie ekstynkcji roztworu przy długości fali 489 nm. Stopień enkapsulacji badanych próbek kształtuje się na poziomie 98%, czyli poziomie dwu-, trzykrotnie wyższym od oznaczanego dla liposomów niezawierających lipidów rezorcynolowych lub ich pochodnych. Poddając zawiesinę liposomów z substancją czynną ekstruzji, stosując membrany o średnicy porów 100 nm, uzyskuje się sterylny preparat liposomów o średniej wielkości około 180 nm. Proces ekstruzji nie zmieniał przy tym ilości zamykanego w liposomach leku (98%).

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz Cena 2,00 zł.

Claims (2)

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja lipidowa do wytwarzania liposomów, zawierająca znane składniki lipidowe, korzystnie fosfolipidy pochodzenia naturalnego i/lub fosfolipidy syntetyczne, znamienna tym, że zawiera modyfikator, korzystnie w ilości od 15% wagowych do 50% wagowych, w postaci 1,3-dihydroksy-5-alkilobenzenu albo O-acylo-alkilobenzeno-O-siarczanu.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako O-acylo-alkilobenzeno-O-siarczan stosuje się 1-mirystyloksy-5-pentadecylobenzeno-3-siarczan.