PL188738B1 - Rekombinowana muteina ludzkiej interleukiny-4, transformowana komórka, kompozycja farmaceutyczna, oczyszczona i wyizolowana sekwencja polinukleotydowa, komórka gospodarza eukariotycznego, zastosowanie kompozycji farmaceutycznej, test oraz rekombinowana antagonistyczna muteina ludzkiej IL-4 - Google Patents

Rekombinowana muteina ludzkiej interleukiny-4, transformowana komórka, kompozycja farmaceutyczna, oczyszczona i wyizolowana sekwencja polinukleotydowa, komórka gospodarza eukariotycznego, zastosowanie kompozycji farmaceutycznej, test oraz rekombinowana antagonistyczna muteina ludzkiej IL-4

Info

Publication number
PL188738B1
PL188738B1 PL97331253A PL33125397A PL188738B1 PL 188738 B1 PL188738 B1 PL 188738B1 PL 97331253 A PL97331253 A PL 97331253A PL 33125397 A PL33125397 A PL 33125397A PL 188738 B1 PL188738 B1 PL 188738B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
mutein
substitution
recombinant human
replacement
leu
Prior art date
Application number
PL97331253A
Other languages
English (en)
Other versions
PL331253A1 (en
Inventor
Jeffrey Greve
Armen B. Shanafelt
Steven Roczniak
Original Assignee
Bayer Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Ag filed Critical Bayer Ag
Publication of PL331253A1 publication Critical patent/PL331253A1/xx
Publication of PL188738B1 publication Critical patent/PL188738B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5406—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

1. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 numerowana zgodnie z IL-4 typu dzikie- go, która obejmuje przynajmniej jedno zastapienie aminokwasu na powierzchni wiazania helisy-a A albo C IL-4 typu dzikiego. 18. Transformowana komórka eukariotycznego gospodarza zdolna do wyrazania re- kombinowanej muteiny ludzkiej IL-4 okreslonej w zastrz. 17. 19. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ze obejmuje rekombinowana muteine ludzkiej IL-4 okreslona w zastrz. 1, w polaczeniu z nosnikiem dopuszczalnym farmaceutycznie. 23. Test do okreslania zdolnosci muteiny do wiazania sie z receptorem, znamienny tym, ze obejmuje etapy: (a) wprowadzania do FlashPlate pokrytej streptowidyna czesci wiazacej lancucha receptora, przy czym czesc wiazaca lancucha receptora posiada przylaczony znacznik peptydowy mozliwy do zwiazania przez streptawidyne; (b) wprowadzania do FlashPlate natywnego liganda znakowanego radioaktywnie, wykazujacego powinowactwo do czesci wiazacej lancucha receptora; (c) wprowadzania do FlashPlate muteiny jako liganda o powinowactwie do czesci wiazacej lancucha receptora; (d) mierzenia ilosci sygnalu emitowanego przez FlashPlate po zrównowazeniu; i (e) obliczenia wzglednego powinowactwa muteiny jako liganda w stosunku do na- tywnego liganda. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest rekombinowaną muteina ludzkiej interleukiny-4, transformowana komórka, kompozycja farmaceutyczna, oczyszczona i wyizolowana sekwencja polinukleotydowa, komórka gospodarza eukariotycznego, zastosowanie kompozycji farmaceutycznej, test oraz rekombinowana antagonistyczna muteina ludzkiej IL-4.
Wynalazek ogólnie dotyczy dziedziny farmakologii i immunologii. Konkretniej, wynalazek dotyczy nowych odmian rodziny cytokin, w szczególności ludzkiej interleukiny-4 (IL-4).
Interleukina 4 jest glikoproteiną wielkości 15 kDa wydzielaną przez aktywowane limfocyty T (Howard i in., J. Exp. Med. 155:914 (1982)), komórki tuczne (Brown i in., Cell 50:809 (1987)) i bazofile (Seder i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2835 (1991)), która reguluje szerokie spektrum funkcji komórkowych w komórkach hematopoetycznych i innych. Interleukina 4 (IL-4) jest plejotropową cytokiną, wykazującą aktywności wobec komórek układu odpornościowego, śródbłonka i komórek fibroblastoidalnych. Opisywane efekty podawania IL-4 in vitro obejmują proliferację limfocytów B, przełączenie klas immunoglobulin w limfocytach B. Interleukina 4 aktywuje proliferację limfocytów T po uprzedniej aktywacji mitogenami i ujemnie reguluje wytwarzanie IFN-γ. W monocytach, IL-4 indukuje ekspresję cząsteczek MHC klasy II, uwolnienie tPA indukowanego lipopolisacharydem i ekspresję CD23. W komórkach śródbłonka (EC) IL-4 indukuje ekspresję VCAM-1 i uwolnienie IL-6 oraz zmniejsza ekspresję ICAM-1 (Maher i in., Human Interleukin-4: An Immunomodulator with Potential Therapeutic Applications, Progres in Growth Factor Research, 3:43-56 (1991)).
Z powodu swej zdolności do pobudzania proliferacji limfocytów T aktywowanych przez ekspozycję na IL-2, proponuje się leczenie przy użyciu IL-4. Przykładowo, IL-4 wykazuje działanie przeciwnowotworowe w modelu zwierzęcym raka nerki, oraz wywołuje zmniejszenie guza u myszy (Bosco i in., Low doses of IL-4 injected perilymphatically in tumour-bearing mice inhibits the growth of poorly and apparently nonimmunogenic tumors and induce a tumour specific immune memory, J. Immunol. 145:3136-43 (1990)). Jednakże jej toksyczność ogranicza stosowanie u ludzi (Margolin i in., Phase II studies of humanrecombinant interleukin-4 in advanced renal cancer and malignant melanoma, J. Immunother. 15:147-153 (1994)).
Obecnie, znana jest ogólna budowa i funkcja IL-4 i pokrewnych ligandów monomerycznych obejmuje 4 przeciwrównoległe domeny α-helikalne (A-D). Trójwymiarowa budowa IL-4 została opisana (Powers i in., Science 256:1673, 1992). Białko zawiera 4 lewoskrętne helisy α i dwie płachty β.
Receptor IL-4 obejmuje przynajmniej dwa łańcuchy. Pierwszy łańcuch IL-4R, IL-4Ra wykazuje istotną homologię z łańcuchem β IL-2R i innymi członkami nadrodziny receptorów czynników wzrostowych (Ldzerda i in., J. Exp. Med. 171:861 (1990)). Określono również drugi łańcuch IL-4R, łańcuch IL-2R, znany również jak „wspólny łańcuch” γο (Russell i in., Science 262:1877 (1993)). Dwa miejsca wiązania są prawdopodobnie związane z sekwencyjnym, zjawiskiem wiązania, które daje trzeciorzędowy kompleks 1:1:1. Regionem IL-4 prawdopodobnie odpowiedzialnym za wiązanie z IL-4Ra jest położony na jednej albo obu helisach A i C, podczas gdy region oddziałujący z γο położony jest na helisie D. Obecna teoria utrzymuje, że pierwsze zjawisko wiązania obejmuje kontakt liganda z IL-4Ra, pierwotnym składnikiem wiązania. Ze zjawiskiem tym nie jest związana żadna aktywność sygnałowa. Drugie zjawisko wiązania następuje, gdy kompleks IL-4/IL-4Ra rekrutuje drugi łańcuch, γο. Po tym drugim zjawisku wiązania następuje przekazanie sygnału i następuje aktywność komórkowa. Antagonizm IL-4 typu dzikiego spotyka się gdy aktywność wiązania za pośrednictwem drugiego regionu (koniecznego do aktywności komórkowej) jest zmniejszona albo wyeliminowana, przy zachowaniu wiązania z IL-4Ra. Antagonizm występuje gdy potencjalny ligand oddziałuje przestrzennie, przez pierwszy i drugi region, z oboma składnikami receptora.
W literaturze opisano antagonistów IL-4. Muteiny IL-4, które działają jako antagoniści obejmują muteinę IL-4/Y124D (Kruse i in., EMBO J. 11:3237-44, 1992) i podwójnego mutanta IL-4[R121D/Y124D] (Tony i in., Eur. J. Biochem. 225:659-664 (1994)). Pojedyncza muteina obejmuje zastąpienie tyrozyny kwasem asparaginowym w pozycji 124 w helisie D. Podwójna muteina jest zastąpieniem argininy przez kwas asparaginowy w pozycji 121 i tyrozyny kwasem asparaginowym w pozycji 124 helisy D. Odmiany w tej części helisy D pozytywnie koreluj ą ze zmianami w oddziaływaniu w drugim regionie wiązania.
188 738
Zmutowane odmiany IL-4 wykazujące agonizm albo antagonizm wobec IL-4 typu dzikiego mogą być przydatne do leczenia stanów związanych z jednym z plejotropowych działań IL-4. Przykładowo, antagoniści IL-4 mogą być przydatni w leczeniu stanów zaostrzanych przez wytwarzanie IL-4, takich jak astma, alergia albo inne choroby związane z reakcją zapalną. Agoniści IL-4 mogą być przydatni w leczeniu stanów, w których obecność IL-4 związana jest ze złagodzeniem choroby, przykładowo, choroby autoagresyjnej takiej jak reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane, cukrzyca insulino-zależna itp. Choroby te charakteryzują się polaryzacją wytwarzania populacji limfocytów T pomocniczych, typu 1 i 2 (Thl, Th2). Naiwne limfocyty T CD4+ różnicują się w podtypy Thl albo Th2, zależnie od cytokiny obecnej w trakcie pobudzenia. Agonista IL-4 powinien przesunąć wytwarzanie w stronę pożądanych limfocytów T pomocniczych, tj. w stronę Th2, wykazując efekt terapeutyczny.
PCT/US93/03613 ujawnia odmiany IL-4 posiadające sekwencje Phe-Leu albo Tyr-Leu w domenie helisy a i ujemnie naładowane aminokwasy w dwóch pozycjach aminokwasowych bezpośrednio powyżej albo poniżej sekwencji Phe-Leu albo Tyr-Leu, odmiany które wykazują zwiększone powinowactwo do receptora IL-4 dzięki obojętnym aminokwasom zastąpionym przez ujemnie naładowane aminokwasy. Ujawnia również, że swoiste zastąpienie Trp-Leu albo Phe-Leu w helisie a IL-4 dwiema ujemnie naładowanymi powoduje zwiększone powinowactwo. Odmianąjest białko fuzyjne IL-4 (z toksyną błoniczą).
Streszczenie wynalazku
Wynalazek dotyczy rekombinowanej muteiny ludzkiej IL-4 numerowanej zgodnie IL-4 typu dzikiego obejmującej przynajmniej jedno zastąpienie aminokwasu na powierzchni wiązania helisy a A albo C IL-4 typu dzikiego. Korzystnie rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 według wynalazku jest kodowana przez sekwencję o Id. Sekw. nr 8.
Zastąpienie korzystnie wybrane jest z grupy obejmującej, w helisie A pozycję 5,11, 13 i 16, zaś w helisie C pozycję 77, 78, 81, 84, 85 (z wyjątkiem R85Q) i 89.
W korzystnym wykonaniu rekombinowanej muteiny ludzkiej IL-4 według wynalazku zastąpieniem w pozycji 16 jest zamiana seryny na alaninę, korzystniej zamiana seryny na histydynę, izoleucynę, leucynę, glutaminę, argininę, treoninę, walinę, tyrozynę, lizynę, lub izoleucynę.
W innym korzystnym wykonaniu rekombinowanej muteiny ludzkiej IL-4 według wynalazku zastąpieniem w pozycji 13 jest zamiana Thr na Asp, korzystnie taka rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 jest kodowana przez sekwencję DNA o Id. Sekw. nr 9 albo jego odmianę zdolną do stabilnej hybrydyzacji.
W zakres wynalazku wchodzi również transformowana komórką eukariotycznego gospodarza zdolna do wyrażania rekombinowanej muteiny ludzkiej IL-4 według wynalazku.
Kompozycja farmaceutyczna obejmująca rekombinowana muteinę ludzkiej IL-4 według wynalazku oraz jej zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia alergii i alergicznych chorób zapalnych obejmujących astmę, oczyszczone i wyizolowane sekwencje polinukleotydowe kodujące muteinę według wynalazku oraz transformowane komórki gospodarza eukariotycznego również wchodzą w zakres wynalazku.
Wynalazek dotyczy także testu do określania zdolności muteiny do wiązania receptora, obejmującego etapy:
(a) wprowadzania do FlashPlate pokrytej streptowidyną części wiążącej łańcucha receptora, przy czym część wiążąca łańcucha receptora posiada przyłączony znacznik peptydowy możliwy do związania przez streptawidynę;
(b) wprowadzania do FlashPlate natywnego liganda znakowanego radioaktywnie, wykazującego powinowactwo do części wiążącej łańcucha receptora;
(c) wprowadzania do FlashPlate muteiny jako liganda o powinowactwie do części wiążącej łańcucha receptora;
(d) mierzenia ilości sygnału emitowanego przez FlashPlate po zrównoważeniu; i (e) obliczenia względnego powinowactwa muteiny jako liganda w stosunku do natywnego liganda.
W korzystnych wykonaniach, sposób wykorzystuje łańcuch IL-4Ra receptora, znacznik peptydowy obejmuje sekwencję o Id. Sekw. nr 6 albo jego zdegenerowaną odmianę, korzystniej znacznik peptydowy usunięto z łańcucha receptora, zaś łańcuch receptora biotynylowano,
188 738 jeszcze korzystniej część wiążąca łańcucha receptora jest kodowana przez sekwencję o Id. Sekw. nr 7 albo jego zdegenerowaną odmianę.
Wynalazek dotyczy również rekombinowanej antagonistycznej muteiny ludzkiej IL-4, numerowanej według IL-4 typu dzikiego, w której mutacje obejmują:
(a) zastąpienie R121D i Y124D w helisie D IL-4 typu dzikiego; i (b) przynajmniej jedno zastąpienie aminokwasowe na powierzchni wiążącej helisy a A albo C IL-4 typu dzikiego, przy czym, gdy zastąpienie dotyczy alaniny zmienia się powinowactwo od około 2 do około 100-krotnie a muteina wiąże się z receptorem IL-4Ra z powinowactwem, co najmniej większym niż natywna IL-4.
Zastąpienie korzystnie wybrane jest z grupy pozycji obejmujących, w helisie A pozycje 5, 11,13 i 16, zaś w helisie C pozycję 77, 78, 8184, 85 (z wyjątkiem R85Q) i 89.
Korzystnym wykonaniem jest rekombinowana antagonistyczna muteina ludzkiej IL-4, w której zastąpieniem w pozycji 13 jest zamiana Thr na Asp, korzystniej jest kodowana przez DNA o sekwencji Id. Sekw. nr 9 albo jego odmianę zdolną do stabilnej hybrydyzacji.
Kompozycja farmaceutyczna obejmująca rekombinowaną antagonistyczną muteinę ludzkiej IL-4 według wynalazku oraz jej zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia alergii i alergicznych chorób zapalnych obejmujących astmę także wchodzi w zakres wynalazku.
Komórka gospodarza eukariotycznego zdolna do wyrażania rekombinowanej antagonistycznej muteiny ludzkiej IL-4 według wynalazku, oczyszczona i wyizolowana sekwencja polinukleotydowa kodująca rekombinowaną antagonistyczną muteinę ludzkiej IL-4 oraz transformowana komórka gospodarza eukariotycznego oczyszczoną i wyizolowana sekwencją polinukleotydową według wynalazku również wchodzą w zakres wynalazku.
Krótki opis rysunków
Figura 1 stanowi schemat architektury wiązania ligand/receptor dla IL-4. IL-4 jest białkiem globularnym obejmującym cztery helisy, i pokazana jest tu „od spodu” czterech helis (A, B, C i D, od końca N do C). Pierwotnym składnikiem wiązania receptora IL-4 jest IL-4Ra, który oddziałuje z ligandem IL-4 przez helisy A i C IL-4. Tworzenie trzeciorzędowego kompleksu IL-4/lL-4Ra/IL-4Ry wywołuje przekazanie sygnału w komórce docelowej.
Figura 2 jest wykresem X-Y kompetecyjnego wiązania T13D-IL-4[R121D/Y124D]. Zdolność T13D-IL-4[R121D/Y124D], ©, do współzawodnictwa z 125I-IL-4 w teście wiązania na podłożu stałym pokazana jest względem zdolności IL-4 [R121D/Y124D],°. Kd określona przy użyciu tego testu dla T13D-IL-4[R121D/Y124D] wynosi 0,28 nM, zaś dla IL-4[R-121D-/Y124D] 5,0 nM..
Figura 3 jest podobnym wykresem przedstawiającym antagonizm IL-4 przez T13D-IL4[R121D/Y124D],°. Zdolność T13D-IL-4[R121D/Y124D] do współzawodnictwa w proliferacji blastów PHA wywołanej IL-4 pokazano w odniesieniu do IL-4[R121D/Y124D], ®. IC50 określone w tym teście wynosi dla T13D-IL-4[R121D/Y124D] 2 nM, zaś dla T13D-IL4[R121D/Y124D], 13 nM.
Figura 4 jest sekwencją aminokwasową sIL-4Ra-STX.
Figura 5 jest złożoną listą sekwencji muteiny T13D-IL-4.
Figurą 6 jest złożoną listą sekwencji muteiny T13D-IL-4[R121D/Y124D].
Opis korzystnych wykonań
Opisano tu nowe muteiny i mechanizm otrzymywania nowych mutein IL-4 o wyższym powinowactwie do receptora IL-4 typu dzikiego.
W znaczeniu tu zastosowanym, „IL-4 typu dzikiego” oznacza ludzką IL-4 natywną albo rekombinowaną posiadającą sekwencję 129 normalnie występujących aminokwasów natywnej IL-4, jak ujawniono w patencie USA nr 5,017,691, załączonym tu jako odnośnik.
W znaczeniu tu zastosowanym „muteina IL-4” oznacza polipeptyd, w którym dokonano swoistych zastąpień białka ludzkiej dojrzałej IL-4, zwłaszcza w helisie A albo C, zaś konkretniej w aminokwasach ich powierzchni wiążących. Powierzchnia wiążąca helisy A znajduje się głównie od około aminokwasu pozycji 5 do około 16; zaś w helisie C od około pozycji 77 do około 89. Zmiany te w którejś z helis powodują albo wzrost powinowactwa powstałej muteiny do IL-4Ra, przy czym muteina może być albo agonistą albo antagonistą IL-4 typu dzikiego zależnie od końcowej natury dodatkowych zastąpień w cząsteczce.
188 738
W znaczeniu tu zastosowanym, „antagonistyczna muteina IL-4” oznacza polipeptyd, w którym dokonano swoistych zastąpień aminokwasowych w dojrzałym białku ludzkiej IL-4. Konkretnie, przedstawione tu antagonistyczne muteiny zawierają przynajmniej trzy osobne zastąpienia. Pary zastąpień ,,IL-4[R121D/Y124D]” występują we wszystkich przedstawionych tu antagonistycznych muteinach i dotyczą podstawowej pary zastąpień w helisie D, R121D (Arg na Asp) i Y124D (Tyr na Asp). Oprócz tego, wprowadzono trzecie zastąpienie w powierzchniach wiążących helisy A albo C w pozycjach, które zwiększają powinowactwo wiązania muteiny z łańcuchem alfa receptora. Oprócz tych zmian, najkorzystniejsze antagonistyczne muteiny IL-4 mają sekwencję aminokwasową identyczną z IL-4 typu dzikiego w innych nie zastępowanych resztach.
Muteiny IL-4 według wynalazku mogą się również charakteryzować insercjami, delecjami, zastąpieniami i modyfikacjami w jednym albo wielu miejscach w innych resztach natywnego łańcucha polipeptydowego IL-4. Według wynalazku, dowolna z takich insercji, delecji, zastąpień albo modyfikacji daje muteinę IL-4, która zachowuje aktywność IL-4.
Korzystne są konserwatywne modyfikacje i zastąpienia w innych pozycjach IL-4 (tj . takich, które wywierają minimalny wpływ na drugorzędową albo trzeciorzędową strukturę muteiny). Takie zakonserwowane zastąpienia obejmują opisane przez Dayhoffa w The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978) oraz Argos EMBO J., 8:779-785 (1989). Przykładowo, aminokwasy należące do jednej z poniższych grup stanowią zmiany zakonserwowane:
- ala, pro, gly, gin, asn, ser, thr;
- cys, ser, tyr, thr;
- val, ile, leu, met, ala, phe;
- lys, arg, his;
- phe, tyr, trp, his; i
- asp, glu.
Korzystne są również modyfikacje i zastąpienia, które usuwają miejsca dodatkowego sieciowania międzycząsteczkowego albo nieprawidłowego tworzenia mostków disiarczkowych. Przykładowo, wiadomo, że IL-4 posiada sześć reszt cys, w pozycjach 3, 24, 46, 65, 99 i 127 sekwencji typu dzikiego, z których jedna albo więcej może być związanych z oddziaływaniem sieciującym. Zastąpienia powinny być wybrane w taki sposób, aby zachować trzeciorzędową strukturę białka typu dzikiego, o ile to możliwe.
Przez „numerację według IL-4 typu dzikiego” rozumie się identyfikację wybranych aminokwasów w odniesieniu do pozycji, w której aminokwas normalnie występuje w IL-4 typu dzikiego. Gdy w muteinie IL-4 dokonuje się insercji albo delecji, specjalista zauważy, że ser (S) normalnie występująca w pozycji 125, przy numeracji według IL-4 typu dzikiego ulegnie przesunięciu w muteinie. Jednakże, położenie przesuniętej ser (S) można łatwo stwierdzić przez badanie i korelację otaczających aminokwasów z otaczającymi ser w IL-4 typu dzikiego.
Muteiny IL-4 według wynalazku można wytworzyć dowolną odpowiednią metodą znaną w dziedzinie wiedzy. Metody takie obejmują konstruowanie sekwencji DNA kodujących muteiny IL-4 według wynalazku i wyrażanie tych sekwencji w odpowiednio transformowanym gospodarzu. Sposób ten powinien pozwolić uzyskać rekombinowane muteiny według wynalazku. Jednakże, muteiny według wynalazku można również wytworzyć, jakkolwiek mniej korzystnie, przez syntezę chemiczną albo kombinację syntezy chemicznej i techniki rekombinacji DNA.
W jednym wykonaniu rekombinacyjnej metody wytwarzania muteiny według wynalazku, konstruuje się sekwencję DNA przez izolowanie albo syntezę sekwencji DNA kodującej IL-4 typu dzikiego, a następnie zmianę koaonu dla treoniny-13 na kodon dla kwasu asparaginowego, przez kierowaną mutagenezę. Technika ta jest znana. Patrz, np. Mark i in., Sitespecific Mutagenesis of the Human Fibroblast Interferon Gene, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5662-5666 (1984); patent USA nr 4,588,585, załączone tu jako odnośnik.
Inny sposób konstruowania sekwencji DNA kodującej muteiny IL-4 według wynalazku obejmuje syntezę chemiczną. Przykładowo, gen który koduje pożądaną muteinę IL-4 można syntetyzować sposobem chemicznym stosując syntetyzer oligonukleotydów. Takie oligonukleotydy projektuje się w oparciu o sekwencję aminokwasową pożądanej muteiny IL-4 i ko8
188 738 rzystnie selekcjonuje kodony, które są korzystne w komórce gospodarza, w którym będzie wytwarzana rekombinowana muteina. W tym względzie, wiadomo powszechnie, że kod genetyczny jest zdegenerowany, tzn. aminokwas może być kodowany przez więcej niż jeden kodon. Przykładowo, phe (F) kodowana jest przez dwa kodony, TTC albo TTT, tyr (Y) kodowana jest przez TAC albo TAT, zaś his (H) kodowana jest przez CAC albo CAT. Trp (W) kodowany jest przez pojedynczy kodon, TGG. Nawiązując, wiadomo, że dla danej sekwencji DNA kodującej konkretną muteinę IL-4, będzie wiele zdegenerowanych sekwencji DNA, które kodują tę muteinę. Przykładowo, wiadomo, że oprócz korzystnej sekwencji DNA dla muteiny T13D-IL-4[R121D/Y124D] pokazanej na Id. Sekw. nr 9, istnieje wiele zdegenerowanych sekwencji DNA które kodują pokazaną muteinę. Te zdegenerowane sekwencje DNA uważane są za pozostające w zakresie wynalazku. Stąd, „zdegenerowane odmiany” w kontekście wynalazku oznaczają wszystkie sekwencje DNA, które kodują konkretną muteinę.
Sekwencja DNA kodująca muteinę IL-4 według wynalazku, wytworzona przez ukierunkowaną mutagenezę, syntezę albo innym sposobem, może ale nie musi obejmować sekwencji DNA, które kodują sekwencję sygnałową. Taka sekwencja sygnałowa, jeżeli występuje, powinna być rozpoznawana przez komórkę wybraną do ekspresji muteiny IL-4. Może ona być prokariotyczna, eukariotyczna albo może być kombinacją tych dwóch. Może być również sekwencją sygnałową natywnej IL-4. Włączenie sekwencji sygnałowej zależy od tego, czy jest pożądane aby muteina iL-4 była wydzielona z rekombinowanej komórki w której jest wytwarzana. Jeżeli wybrana komórka jest prokariotyczna, ogólnie korzystne jest aby sekwencja DNA nie kodowała sekwencji sygnałowej, ale obejmowała metioninę końca N w celu kierowania ekspresją. Jeżeli wybrana komórka jest eukariotyczna, jest korzystne aby sekwencja sygnałowa była kodowana, zaś szczególnie korzystne jest, żeby była to sekwencja sygnałowa natywnej IL-4.
W celu syntezy genu kodującego muteinę IL-4 według wynalazku można zastosować standardowe sposoby. Przykładowo, w celu skonstruowania genu ulegającego translacji wstecznej można zastosować kompletną sekwencję aminokwasową. Oligomer DNA zawierający sekwencję nukleotydową kodującą muteinę IL-4 można zsyntetyzować. Przykładowo, można syntetyzować kilka małych oligonukleotydów kodujących części pożądanego polipeptydu, po czym poddać je ligacji. Poszczególne oligonukleotydy zwykle zawierają dodatkowe zasady na końcach 5' i 3' zapewniające komplementamość.
Po połączeniu (przez syntezę, ukierunkowaną, mutagenezę albo innym sposobem), sekwencje DnA kodujące muteinę IL-4 według wynalazku wprowadza się do wektora ekspresyjnego i łączy funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję odpowiednią do ekspresji muteiny IL-4 w pożądanym transformowanym gospodarzu. Prawidłowe łączenie można potwierdzić przez sekwencjonowanie nukleotydów, mapowanie restrykcyjne i ekspresję biologicznie czynnego polipeptydu w odpowiednim gospodarzu. Wiadomo, że w celu uzyskania wysokiego poziomu ekspresji transfekowanego genu w gospodarzu, gen musi być połączony funkcjonalnie z sekwencjami kontrolującymi transkrypcję i translację, które działają w wybranym gospodarzu ekspresyjnym.
Wybór sekwencji kontrolujących ekspresję i wektora ekspresyjnego zależeć będzie od wyboru gospodarza. Można wykorzystać wiele kombinacji wektora ekspresyjnego/gospodarza. Przydatne wektory ekspresyjne dla gospodarzy eukariotycznych obejmują przykładowo, wektory obejmujące sekwencje kontrolujące ekspresję z SV40, bydlęcego wirusa brodawczaków, adenowirusa i cytomegalowirusa. Przydatne wektory ekspresyjne dla gospodarzy bakteryjnych obejmują znane plazmidy bakteryjne, takie jak pochodzące z E. coli, w tym col El, pCRl, pER32z, pMB9 oraz ich pochodne szeroki zakres plazmidów takich jak RP4, DNA fagowe, takie jak Ml 3 i jednoniciowe DNA fagów nitkowatych. Przydatne wektory dla komórek owadów obejmują pVL941. Korzystny jest pFasiBae™ (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Cate i in., Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expresion of the Human Gene in Animal Cells, Celi 45:685-98 (1986).
Oprócz tego, można zastosować w tych wektorach dowolną spośród szerokiego zakresu sekwencji kontrolujących. Takie przydatne sekwencje kontrolujące ekspresję obejmują sekwencje kontrolujące ekspresję związane z genami strukturalnymi po wyższych wektorów ekspresyjnych. Przykłady przydatnych sekwencji kontrolujących ekspresję obejmują, przykładowo, wczesne i późne promotory SV40 albo adenowirusa, układ lac, układ trp, układ TAC
188 738 albo TRC, główny operator i główny promotor faga lambda, przykładowo PL, regiony kontrolne białka otoczki fd, promotor kinazy 3-fosfoglicerynowej albo innych enzymów glikolitycznych, promotory fosfatazy kwaśnej, np. PhoA, promotory układu kopulacyjnego A drożdży, promotor poliedrozy Baculowirusów i inne sekwencje, o których wiadomo, że kontrolują ekspresję genów komórek prokariotycznych albo eukariotycznych albo ich wirusów i ich różnych kombinacji.
Do wytwarzania mutein IL-4 według wynalazku można wykorzystać dowolnego przydatnego gospodarza, w tym bakterie, grzyby (również drożdże), rośliny owady, ssaki albo inne odpowiednie komórki zwierzęce albo linie komórkowe, jak również transgeniczne zwierzęta albo rośliny. Konkretniej, gospodarze ci mogą obejmować dobrze znanych gospodarzy prokariotycznych albo eukariotycznych, takich jak E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, grzyby, drożdże, komórki owadów takie jak Spodoptera frugiperda (Sf9), komórki zwierzęce takie jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) i komórki mysie takie jak NS/0, komórki afrykańskiej małpy zielonej takie jak COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 i BNT 10, oraz komórki ludzkie, jak również komórki roślinne w hodowli. Do ekspresji w komórkach zwierzęcych, korzystne są komórki CHO i COS 7 w hodowli, zaś szczególnie linia komórek CHO (DHFR-).
Należy oczywiście rozumieć, że nie wszystkie wektory i sekwencje kontrolujące ekspresję będą działały równie dobrze przy ekspresji opisanych tu sekwencji DNA. Podobnie, nie wszyscy gospodarze będą działali równie dobrze z danym układem ekspresyjnym. Jednakże, specjalista może dokonać samodzielnie wyboru wśród wektorów, sekwencji kontrolujących ekspresję i gospodarzy bez niepotrzebnych doświadczeń. Przykładowo, przy wyborze wektora należy uwzględnić gospodarza ponieważ wektor musi się w nim namnażać, Należy również uwzględniać liczbę kopii wektora, zdolność do kontrolowania liczby kopii, oraz ekspresję innych białek kodowanych przez wektor takich jak znaczniki oporności na antybiotyki. Przy kładowo, korzystne wektory do zastosowania według wynalazku obejmują takie, które umożliwiają amplifikację znacznej liczby kopii DNA kodującego muteiny IL-4. Takie wektory zdolne do amplifikacji są znane. Obejmują one, przykładowo, wektory zdolne do namnożenia się przez amplifikację DHFR (patrz, Kaufman, patent USA nr 4,470,461, Kaufman i Sharp, Construction of a modular dihydrofolate reductase cDNA gene: Analysis of signals utilized fo efficient expression, Mol. Cell. Biol. 2:1304-19 (1982)) albo amplifikację syntazy glutaminowej (GS) (patrz, patenr USA nr 5,122,464 oraz europejskie opublikowane zgłoszenie 338,841).
Przy wyborze sekwencji kontrolującej ekspresję, można rozważać różne czynniki. Obejmują one, przykładowo, względną siłę sekwencji, możliwości jej kontrolowania oraz jej zgodność z aktualną sekwencją DNA kodującą muteinę IL-4 według wynalazku, szczególnie w odniesieniu do potencjalnych struktur drugorzędowych. Gospodarzy należy wybierać przy uwzględnieniu ich zgodności z wybranym wektorem, toksyczności produktu kodowanego przez sekwencje DNA według wynalazku, ich charakterystyki wydzielania, ich zdolności do prawidłowego fałdowania polipeptydów, ich wymagań dotyczących fermentacji albo hodowli oraz łatwości oczyszczania produktu kodowanego przez sekwencje DNA.
W obrębie tych parametrów, specjalista może wybrać różne kombinacje wektora/sekwencji kontrolującej ekspresję/gospodarza, która będzie wyrażać pożądane sekwencje DNA podczas fermentacji albo hodowli komórek na wielką skalę, przykładowo z użyciem komórek COS 7 albo CHO.
Muteiny IL-4 otrzymane według wynalazku mogą być glikozylowane albo nie glikozylowane, zależnie od organizmu gospodarza zastosowanego do wytwarzania muteiny. Jeżeli jako gospodarz zostanie wybrana bakteria, wtedy wytwarzana muteina IL-4 będzie nie glikozylowana. Komórki eukariotyczne będą glikozylowały muteinę IL-4, jakkolwiek niekoniecznie w ten sam sposób co natywnąIL-4.
Muteinę IL-4 wytworzoną przez transformowanego gospodarza można oczyszczać dowolnym sposobem. Znane są różne metody oczyszczania IL-4, patrz, np. patent USA nr 5,013,824, 5,017,691 i WO 96/04306-A2. Korzystne jest oczyszczanie przez powinowactwo immunologiczne. Patrz, np. Okamura i in., Human fibroblastoid interferon: immunosor10
188 738 bent column chromatography and N-terminal amino acid sequence, Biochem. 19:3831-35 (1980).
Aktywność biologiczną mutein IL-4 według wynalazku można ocenić dowolną znaną przydatną metodą. Testy takie obejmują neutralizację przeciwciałami aktywności przeciwwirusowej, indukcję kinazy białkowej, aktywności oligoadenylano 2,5-A syntazy albo fosfodiesterazy, jak to opisano w EP-B1-41313. Takie testy obejmują również testy immunomodulujące (patrz, patent USA nr 4,753,795), testy zahamowania wzrostu, testy proliferacji limfocytów T, indukcji IL-6 (MCP-1 albo VCAM-1) na EC i pomiar wiązania z komórkami, które wyrażają receptory IL-4. Patrz również, Spits i in., Recombinant interleukin-4 promotes the growth of human T cells, J. Immunol. 139:1142-47 (1987).
Muteinę IL-4 według wynalazku podaje się w dawkach w przybliżeniu równych albo wyższych od stosowanych w terapii przy użyciu natywnej albo rekombinowanej lL-4. Korzystnie podaje się skuteczną ilość muteiny IL-4. Określenie „skuteczna ilość” oznacza ilość zdolną do zapobieżenia albo osłabienia ciężkości albo rozprzestrzenienia się leczonej choroby albo stanu. Oczywiste dla specjalisty jest, że skuteczna ilość muteiny IL-4 zależeć będzie, między innymi, od choroby, dawki, schematu podawania muteiny IL-4, czy muteina IL-4 podawana jest sama czy w połączeniu z innymi środkami terapeutycznymi, od okresu półtrwania kompozycji oraz od stanu ogólnego pacjenta.
Muteinę IL-4 korzystnie podaje się w kompozycji obejmującej nośnik dopuszczalny farmaceutycznie. „Nośnik dopuszczalny farmaceutycznie” oznacza nośnik, który nie powoduje żadnego niepożądanego efektu u pacjenta, któremu go się podaje. Takie nośniki dopuszczalne farmaceutycznie są dobrze znane. Korzystny jest 2% HSA/PBS, pH 7,0.
Muteiny lL-4 według wynalazku można wytwarzać w postaci kompozycji farmaceutycznej znanymi sposobami. Patrz, np. Remington's Pharmaceutical Science, Martin, załączone tu jako odnośnik. Kompozycja farmaceutyczna muteiny IL-4 może przybierać różne postacie, w tym płynne, żelowe, liofilizowane, albo inne przydatne postacie. Przydatna postać będzie zależała od konkretnego leczonego wskazania i jest oczywista dla specjalisty.
Kompozycję farmaceutyczną muteiny IL-4 można podawać do ustnie, w rozpylaczu, dożylnie, domięśniowo, dootrzewnowe, śródskómie albo podskórnie albo w dowolny inny dopuszczalny sposób. Korzystny sposób podawania zależy od konkretnego wskazania i jest oczywisty dla specjalisty. Kompozycję farmaceutyczną muteiny IL-4 można podawać w połączeniu z innym środkiem farmaceutycznym. Środki te można włączać jako części tej samej kompozycji farmaceutycznej albo można podawać oddzielnie z muteiną IL-4, równocześnie albo według innego dopuszczalnego schematu leczenia. Oprócz tego, kompozycję farmaceutyczną IL-4 można zastosować w celu wspomagania innych terapii.
Nawiązując, wynalazek dostarcza kompozycji i sposobów leczenia chorób odpornościowych, raków i nowotworów, nienormalnego wzrostu komórek, albo immunomodulacji u dowolnego zwierzęcia, korzystnie ssaka, najkorzystniej człowieka. Jak uprzednio zaznaczono, IL-4 wywiera szereg efektów. Niektórymi z nich jest stymulacja proliferacji limfocytów T, różnicowa nie limfocytów T pomocniczych, indukcja aktywacji i proliferacji ludzkich limfocytów B oraz kierowane limfokiną przełączenie klas immunoglobulin. Wpływ na układ odpornościowy obejmuje zwiększenie ekspresji antygenu MHC klasy II (Noelle i in., Increased expression od la antigen on resting B cells: a new role for B cell growth factor, PNAS USA 81:6149-53 (1984), i CD23 na limfocytach B (Kikutani i in., Molecular structure of human lymphocyte receptor for immunoglobulin, Cell 47:657-61 (1986)). Tak więc, biologia IL-4 wskazuje, że może ona odgrywać istotną rolę w rozwoju alergii i alergicznych chorób zapalnych takich jak astma. Limfocyty T pomocnicze typu 1 (Thl) i typu 2 (Th2) związane są z reakcją odpornościową. Pobudzone limfocyty Th2 wydzielają IL-4 i blokują progresję Thl. Tak więc, dowolną chorobę związaną z Thl można leczyć IL-4 i jej analogami, podobnie, dowolną chorobę związaną z Th2 można leczyć agonistami IL-4.
Uwzględniane jest również zastosowanie sekwencji DNA kodujących muteiny IL-4 według wynalazku do terapii genowej. Uwzględniane zastosowanie w terapii genowej obejmuje leczenie tych chorób, w których oczekuje się, że IL-4 powoduje zaostrzenie stanu klinicznego, np. w chorobie związanej ze stanem zapalnym (astma) albo w alergiach. Wskazania do zastosowania agonistów będą obejmować takie choroby autoagresyjne jak stwardnienie rozsiane,
188 738 cukrzyca insulino-zależna, reumatoidalne zapalenie stawów. Te choroby autoagresyjne charakteryzują się polaryzacją wytwarzania populacji limfocytów pomocniczych T w kierunku typu 1 (Thl).
Miejscowe dostarczanie mutein IL-4, zarówno agonistów jak i antagonistów, przy użyciu terapii genowej może dostarczyć środek terapeutyczny do obszaru docelowego, unikając potencjalnej toksyczności związanej z nieswoistym podaniem agonistów. Uwzględniane są metodologie terapii genowej in vitro i in vivo. Znanych jest kilka sposobów przenoszenia potencjalnie terapeutycznych genów do określonej populacji komórkowej, patrz, Mulligan, The basie science of gene therapy, Science 260:926-31 (1993). Sposoby te obejmują:
1) bezpośredni transfer genu, patrz, np. Wolff i in., Direct gene transfer into mouse muscle in vivo, Science 247:1465-68 (1990);
2) transfer genu za pośrednictwem liposomów, patrz, np. Caplen i in., Liposomemediated SFTR gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis, Nature Med. 3:39-46 (1995); Crystal, The gene as a drug, Nature Med. 1:15-17 (1995); Gao i Huang, A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-85 (1991);
3) transfer DNA za pośrednictwem retrowirusa, patrz, np. Kay i in., In vivo gene therapy of hemophilia B: sustained partial correction in factor IX-deficient dogs, Science 262:117-19 (1993); Anderson, Human gene therapy, Science 256:808-13 (1992).
4) transfer DNA za pośrednictwem wirusów. Takie wirusy obejmują adenowirusy (korzystnie, wektory oparte na Ad-2 albo Ad-5), wirusy herpes (korzystnie wektory oparte na wirusie herpes simplex) i parwowirusy (korzystnie wektory oparte na parwowirusach „defektywnych” albo nieautonomicznych. jeszcze korzystniej wektory oparte na wirusach towarzyszących adenowirusom, najkorzystniej wektory oparte na AAV-2). Patrz, np. Ali i in., The use of DNA viruses as vectors for gene therapy, Gene Therapy 1:367-84 (1994); patent USA nr 4,797,368, załączony tu jako odnośnik oraz patent USA nr 5,139,941, załączony tu jako odnośnik.
Wybór konkretnego układu wektora do przeniesienia interesującego genu zależeć będzie od różnych czynników. Jednym z istotnych czynników jest natura docelowej populacji komórkowej. Jakkolwiek wektory retrowirusowe bada się intensywnie i stosuje w wielu zastosowaniach terapii genowej, wektory te ogólnie nie nadają się do zakażania komórek nie dzielących się. Oprócz tego, retrowirusy są potencjalnie onkogenne.
Adenowirusy mają zaletę szerokiego zakresu gospodarzy, mogą zakażać komórki spoczynkowe i zróżnicowane końcowo, takie jak neurony albo hepatocyty, i wydają się być zasadniczo nie onkogenne, patrz, np. Ali i in., wyżej. Adenowirusy prawdopodobnie nie integrują się z genomem gospodarza. Ponieważ bytują pozachromosomalnie, ryzyko mutagenezy insercyjnej jest znacznie zmniejszone, Ali i in., wyżej.
Wirusy związane z adenowirusami wykazuje podobne zalety co wektory oparte na adenowirusach. Jednakże, AAV wykazują swoistą miejscowo integrację z ludzkim chromosomem 19, Ali i in., wyżej.
W najkorzystniejszym wykonaniu, DNA kodujący muteinę IL-4 według wynalazku stosuje się w terapii genowej chorób autoagresyjnych takich jak SM, IDDM i RA, chorób zakaźnych takich jak choroba z Lyme i trąd, nowotworów takich jak chłoniak nie-Hodgkinowski i ALL, chorób chrząstki takich jak zapalenie kostno-stawowe i łuszczycy.
Według tego wykonania, terapia genowa przy użyciu DNA kodującego muteiny IL-4 według wynalazku dostarczany jest potrzebującemu pacjentowi równocześnie z albo bezpośrednio po diagnozie.
Podejście to korzysta z wybiórczej aktywności mutein IL-4 według wynalazku do zapobiegania niepożądanemu pobudzeniu autoagresyjnemu. Specjalista zauważy, że zgodnie z tym wykonaniem można zastosować dowolny przydatny wektor zawierający DNA dla muteiny IL-4. Techniki konstruowania takich wektorów są znane. Patrz, np. Ohno i in., wyżej; Chang i in., wyżej. Wprowadzenie wektora zawierającego DNA kodującego muteinę IL-4 można osiągnąć przy użyciu znanych technik, np. jak opisano w Ohno i in., wyżej.
188 738
W celu lepszego zrozumienia wynalazku podano poniższe przykłady. Przykłady te podane są jedynie w celu zilustrowania i nie są uwzględniane w żaden sposób jako ograniczenie zakresu wynalazku.
Przykłady
Ogólnie. Zastąpienia alaniną wprowadzono do sekwencji IL-4 typu dzikiego metodą kierowanej mutagenezy w pozycjach odpowiadających resztom określonym jako znajdujące się na powierzchni helis A i C IL-4 (Smith i in., j. Mol. Biol. 224(4):899-904 (1992)). Reszty te prawdopodobnie pośredniczą w oddziaływaniu IL-4 z IL-4Ra (fig. 1); wpływ na powinowactwo wiązania mutein IL-4 z zastąpieniami alaniną wobec IL-4Ra wskazujią że zastępowane reszty mogą mieć związek z oddziaływaniem wiązania. Reszty, które po zastąpieniu alaniną, dawały efekty pośrednie wobec powinowactwa były dalej szeroko zastępowane w celu identyfikacji zmian, które polepszały powinowactwo. Mutacje, które poprawiały powinowactwo mogą po połączeniu dawać kombinatoryjny wzrost powinowactwa IL-4 (albo peptydów pokrewnych z IL-4) wobec IL-4Ra. Wzrost powinowactwa powinien korelować z ze zwiększoną siłą.
Muteiny wytwarzano przez ukierunkowaną mutagenezę, wyrażano w układzie bakulowirusowym, oczyszczano do homogenności, badano jakościowo analizą aminokwasową i badano w testach wiązania receptora. Sekwencję aminokwasową dojrzałej IL-4 (Id. Sekw. nr 1) zastosowaną w tym badaniu pokazano niżej; His w pozycji 1 oznacza koniec N dojrzałego polipeptydu. Helisy A, C i D zaznaczono powyżej ich odpowiednich punktów początkowych i podkreślono. Aminokwasy, których odpowiednie za stąpienie daje odmiany o wyższym powinowactwie zaznaczono wytłuszczoną czcionką:
A
His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn
10 15
Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr 20 25 30
Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe 35 40 45
Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu 50 55 C-—66
Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg 65 70 75
His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu
85 90
Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn 95D—6 100 105
Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met 110 115 120
Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser
125 Id. Sekw. Nr 1
Mutacje badane w tym badaniu wprowadzano do znanej odmiany antagonistycznej ludzkiej IL-4 zawierającej dwa zastąpienia w helisie D, R121D i Y124D (Tony i in., Eur. J. Biochem. 225:659-664 (1994)). Muteinę tę oznaczono ,,IL-4[R121D/Y124D]”. Muteiny te wyrażano w układzie bakulowirusowym, oczyszczano do homogenności i badano w testach wiązania receptora IL-4Ra. Znaczenie biologiczne polepszonego powinowactwa do receptora IL-4Ra badano w teście proliferacji limfocytów T. Ponieważ muteina IL-4[R121D/Y124D] jest antagonistą IL-4, polepszone powinowactwo do IL-4Ra powinno spowodować zmniejszenie IC50 dla antagonistycznych mutein o wyższym powinowactwie (IC50 określone jest jako stężenie antagonisty konieczne do zahamowania określonej reakcji na agonistę w 50%).
Przykład 1. Wytwarzanie mutein. Muteiny wytwarzano przez ukierunkowana mutagenezę, stosując startery zawierające kodony odpowiadające pożądanej mutacji zasadniczo
188 738 jak to opisano w Kunkel i in., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotype selection (1987) Methods Enzymol. 154:367-382. Pokrótce, cDNA dla ludzkiej IL-4 zawierający miejsce enzymu restrykcyjnego BamHI i XbaI klonowano do wektora fagowego M13 mp19 (New England Biolabs, Beverly, MA) stosując to samo miejsce. cDNA IL-4 typu dzikiego otrzymano stosując reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z puli cDNA wytworzonej z mRNA izolowanego z ludzkich limfocytów krwi obwodowej, indukowanych 24 godziny PMA (10 ng/ml). Zastosowanymi starterami były, dla końca 5' otwartej ramki odczytu IL-4
5'-CGC GGA TCC ATG GGT CTC ACC TCC-3' (Id. Sekw. nr 2); i dla końca 3' otwartej ramki odczytu IL-4
5'-CGC TCT AGA CTA GCT CGA ACA CTT TGA AT-3' (Id. Sekw. nr 3).
Do każdego oligonukleotydu włączono miejsca restrykcyjne BamHI (koniec 5') i XbaI (koniec 3') co zaznaczono kursywą. Zastosowane warunki PCR: 1 minuta w 94°C, 1 minuta w 58,7°C i 1 minuta w 72°C przez 25 cykli. Prawidłowość sekwencji cDNA IL-4 potwierdzono przez sekwencjonowanie stosując zestaw Sequenase® (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) jak opisano przez producenta. Pojedynczą nić DNA zawierającą uracyl (U-DNA) otrzymano przez transformowanie E. coli szczepu CJ236 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) M13mp19 zawierającym cDNA dla IL-4. Ukierunkowana mutageneza wykorzystywała ogólnie startery zawierające po 15 nukleotydów homologicznych z matrycą U-DNA 5' od kodonu docelowego dla mutagenezy, nukleotydy obejmujące pożądaną zmianę dodatkowe 10 nukleotydów homologicznych do matrycy U-DNA 3' od zmienionego nukleotydu. Mutacje helisy D Arg-121 do Asp oraz Tyr-124 do Asp wprowadzono do sekwencji IL-4 typu dzikiego. U-DNA dla tego wariantu, określonego IL-4[R121D/Y124D] wytworzono jak to opisano wyżej. Wszystkie mutacje wytworzone w tym badaniu wytworzono stosując IL-4[R121D/Y124D] jako matrycę. Startery fosforylowano przy użyciu kinazy polinukleotydowej T4 (New England Biolabs, Beverly, MA) według instrukcji producenta. Po przyłączeniu startera do matrycy U-DNA i wydłużeniu polimerazą DNA T7 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) komórki E. coli szczepu DH5a™ (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) transformowano 5 pl mieszaniny reakcyjnej i wysiano na podłoże LB zawierające 0,7% agar. Po inkubacji w 37°C, kolonie namnożono przez pobranie pojedynczych kolonii i przeniesienie do ml pożywki LB i hodowanie przez noc w 37°C. Jednoniciowy DNA wyizolowano stosując zestaw do oczyszczania M13 (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) według instrukcji producenta, po czym klony zawierające pożądaną mutację zidentyfikowano przez sekwencjonowanie jednoniciowego DNA przy użyciu zestawu Seqenase® (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) według instrukcji producenta. cDNA muteiny IL-4 w postaci replikujące go DNA odpowiadającego koloniom zawierającym prawidłową zmutowaną sekwencję wyizolowano stosując zestaw do izolacji plazmidów Qiagen (Qiagen Inc. Chatsworth, CA). cDNA muteiny IL-4 wyizolowano stosując BamHII i XbaI i klonowano do wektora plazmidowego pFastBac™l (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Po klonowaniu, wytworzono rekombinowany bakulowirusowy DNA (określany dalej jako Bacmid) przez transformowanie pFast-Bac™l zawierający cDNA muteiny do E. coli szczepu DH10Bac™ (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) według instrukcji producenta. Muteiny wyrażano w komórkach Spodoptera frugiperda (Sf) 9, stosując układ ekspresji Bac-to-Bac (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) według instrukcji producenta. Wszystkie inkubacje komórek owadów prowadzono w 28°C. Pokrótce, 2 ml hodowli komórek Sf9 transfekowano 5 pl rekombinowanego Bacmidu przy użyciu Cell-FECTIN (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Nadsącz zebrano 60 godzin po transfekcji i zastosowano do zakażenia 100-200 ml hodowli 1x106 komórek Sf9/ml w pożywce Grace'a (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Nadsącz zebrano, według instrukcji producenta, w 48-60 godzin po zakażeniu, odwirowano przy 5000 obrotach na minutę w wirówce Sorvall® RC-5B przy użyciu rotora GSA (DuPont Instrument Co., Willmington, DE) i badano na miano wirusa (zwykle otrzymywano >1x108 pfu/ml). W celu wytwarzania białka, 2-3x106 komórek Sf9/ml w 500 ml pożywki SF900 II (Gibco BRL. Gaithersburg, MD) zakażano w wielokrotności zakażenia równej 4-10 i zbierano nadsącz po 60-72 godzinach od zakażenia, przez odwirowanie przy 5000 obrotach na minutę w wirówce Sorvall® RC-5B przy użyciu rotora GSA (DuPont Instrument Co., Willmington, DE) i filtrowano przez sterylny filtr 0,2 pm.
188 738
Przykład 2. Oczyszczanie mutein. Przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-4 C400.1 i C400.17 wytworzono stosując standardowy protokół, na myszach przy użyciu ludzkiej rekombinowanej IL-4 (Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA) jako immunogen, wytworzono jako płyn wysiękowy, oczyszczono i sprzęgnięto z Sepharozą aktywowaną CNBr (Pharmacia, Uppsala, Szwecją) według instrukcji producenta. Nadsącz komórek Sf9 wytworzony przez zakażenie komórek Sf9 rekombinowanym baculowirusem zawierającym odpowiednią muteinę IL-4 wprowadzono do 1 ml kolumny złoża o powinowactwie do IL-4, płukano 100 mM NaHCO3, 500 mM NaCl, pH 8,3, płukano wodą w celu usunięcia soli i eluowano 8 objętościami kolumny 100 mM Glicyny, pH 3,0. Frakcje zebrano do silikonowanych probówek zawierających 0,1 objętość 1 M Tris, pH 8,0. Białko muteiny dalej oczyszczano przez chromatografię w odwróconych fazach stosując kolumnę Dynamax®-300 A C18 (Rainin Instrument Co. Woburn, MA) z gradientem 0-100% Bufora A do Bufora B (Bufor A, woda; Bufor B, acetonitryl, 0,1% kwas trifluorooctowy). Frakcje badano przez SDS-Page i liofilizowano frakcje zawierające muteinę w celu dalszego przechowywania, i rozpuszczano w sterylnym roztworze soli buforowanym fosforanem do testów. Oczyszczona w ten sposób muteina w SDS-PAGE stanowiła zwykle pojedynczy prążek (barwiony srebrem) i oznaczano ją ilościowo przez analizę aminokwasów (dokładność zwykle >90%).
Przykład 3.Test wiązania receptora. W celu określenia wpływu zastąpienia na zdolność mutein IL-4 do wiązania IL-4Ra (Ldzerda i in., J. Exp. Med. 171:861-873(1990)), opracowano test wiązania receptora na podłożu stały,. Pokrótce, powinowactwo mutein mierzono przez ich zdolność do wypierania znakowanej radioaktywnie IL-4 z IL-4Ra związanego z powierzchniią stałą. Figura 2 pokazuje zdolność T13D-IL-4[R121D/Y124D] do współzawodnictwa z 125I-IL-4 w teście na podłożu stałym, względem zdolności IL-4[R121D./Y124D]. Test przeprowadzano w formacie 96-studzienkowym, stosując płytki FlashPlates® (Du-Pont NEN®, Boston, MA), pokryte streptawidyną; zewnątrzkomórkową domenę IL-4Ra wiązano z tymi płytkami przez znacznik peptydowy wprowadzony do domeny zewnątrzkomórkowej IL-4Ra, który wiązał się ze streptawidyną. FlashPlates zawierają substancję scyntylacyjną impregnowaną w plastiku płytek, która ma właściwość emisji scyntylącji jedynie wtedy, gdy związek radioaktywny znajdzie się w jej bliskim sąsiedztwie. Próbki zawierające znakowaną radioaktywnie IL-4 i antagonistyczną muteinę IL-4 dodawano do każdej ze studzienek i inkubowano do uzyskania zrównoważenia. Ponieważ nie związany związek radioaktywny nie wywołuje scyntylacji, nie jest konieczny etap płukania przez oznaczeniem radioaktywności związanej w każdej ze studzienek. Zmierzona w ten sposób radioaktywność odzwierciedla ilość znakowanej radioaktywnie IL-4 związanej z IL-4Ra, zaś po uwzględnieniu dodanej ilości nie znakowanej antagonistycznej muteiny IL-4, umożliwia obliczenie powinowactwa nie znakowanej antagonistycznej muteiny IL-4 wobec IL-4Ra. Wewnętrzny standard w każdym teście wytworzono przez pomiar powinowactwa IL-4[R121D/Y124D] równolegle z każdą z mutein. Tak więc, można otrzymać swoisty pomiar względnego powinowactwa, który umożliwia ocenę wpływu poszczególnych zastąpień na powinowactwo wobec IL-4Ra.
Domenę zewnątrzkomórkową lL-4Ra otrzymano przez PCR z biblioteki Xgt11 w komórkach Jurkat (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Startery PCR zastosowane do wyizolowania domeny zewnątrzkomórkowej IL-4Ra, dla końca 5' ramki odczytu IL-4Ra:
5'GGCATGGATCCATGGGGTGGCTTTGCTCTGG3' (Id. Sekw. nr 4) oraz dla końca 3' domeny zewnątrzkomórkowej IL-4Ra 5 'AAGCCGCTAGCGCTGTGCTGCTCGAAGGGC3' (Id. Sekw. nr 5).
Warunki PCR obejmowały 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 65,8°C i 1 minutę w 72°C, przez 30 cykli. Powstały produkt PCR trawiono enzymami restrykcyjnymi BamHl i Eco47III i klonowano do wektora pBluescript (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), zawierającego DNA o kodonach odpowiadających sekwencji Ser-Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (Id. Sekw. nr 6) trawionego tymi samymi enzymami. Sekwencja ta była opisywana jako wiążąca stereptawidynę (Schmidt i Skerra, Protein Eng. 6(1): 109-122 (1992)). Domenę zewnątrzkomórkową IL-4Ra wytworzono również w taki sposób, że kodowała sekwencję Ser-Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (Id. Sekw. nr 6) na końcu C domeny ze188 738 wnątrzkomórkowej, i określano ją jako sIL-4Ra-STX (Met w pozycji 1 na końcu N dojrzałego IL-4Ra (Id. Sekw. nr 7)).
Białko sIL-4Ra-STX wytworzono w układzie bakulowirusowym w sposób identyczny do zastosowanego w przypadku antagonistycznych mutein IL-4, oczyszczono przez chromatografię powinowactwa z matrycą połączoną z IL-4, jak to opisano (Kruse i in., EMBO J., 12 (13): 5121-9 (1993)) i przechowywano w PBS. Matrycę IL-4 wytworzono przez sprzęgnięcie IL-4 wytworzonej w E. coli z CNBr Sepharose 4B, według instrukcji producenta (Pharmacia, Szwecja). FlasEPlates® (DuPont NEN®, Boston, Ma) pokryte streptawidyną pokryto 100 pl 2 pg/ml sIL-4Ra-STX w 1 00 mM Tris, 0,l%BSA, pH 7,0prrez 2 ggozinn w 20°Ć, płukaao PBS, 0,1% BSA, pH 7,6 i inkubowano z 200 pM I25I-Il-4 (DuPont NEN®, Boston, MA) i różnymi stężeniami a.otagonistyczoej muteiny IL-4 w 100 pl PBS, 0,1% BSA, pH 7,6 przez 15 godzin w 20°C w poczwórnym powtórzeniu. Testy powtarzano przynajmniej dwukrotnie. Jako wewnętrzny standard, IL-4[R121D/Y124D] miareczkowano równolegle z każdą z mutein na tej samej płytce FlashPlate®. Związana radioaktywność mierzono w liczniku scyntylacyjnym TopCount (Packard Instruments Co., Meriden, CT), zaś wartości Kd obliczano stosując program Ligand (Muosoo i Roabard, Meth. Enzymol. 92:543-576 (1983)); błąd wartości Kd, wyrażany jako %CV wynosił 2-20%. Wyniki wyrażano jako stosunek Kd muteiny/Kd IL-4[R121D/Y124D] stosując dane pochodzące z każdej z płytek. Różnice pomiędzy zmierzonymi wartościami Kd odzwierciedlały względny wzrost powinowactwa odpowiedniej muteiny wobec IL-4Ra (tj. Kd muteiny/Kd IL-4[R121D/Y104D] <1), albo względne zmniejszenie powinowactwa odpowiedniej muteiny wobec IL-4Ra (tj. Kd muteiny/Kd IL-4-[R121D-/Y124D] >1).
Przykład 4. Test proliferacji 1° limfocytów T. Pierwotne limfocyty T otrzymano ze świeżej krwi normalnych dawców i oczyszczano przez odwirowanie z użyciem Ficoll-Paquz® Plus (Pharmacia, Upsalla, Szwecja) zasadniczo jak to opisano w Kruse i in., Coiwersion of human interlzukin-4 into a high affinity antagonist by single amino acid replacement, EMBO J. 11:3237-44 (1992)). Oczyszczone komórki jednojądrzaste krwi obwodowej inkubowano przez 7 dni z 10 pg/ml fitohemdglutyniny (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), zebrano przez odwirowanie i płukano w pożywce RPMI 1640 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). 5x104 aktywowanych limfocytów T/studzienkę (blasty PHA) ^u^wano w różnych ilościach IL-4 albo muteiny, w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10Bo surowicę płodową bydlęcą, pH 1, 5, 2 mM L-glutaminę, 100 jednostek/ml penicyliny G i 100 pg/ml siarczanu streptomycyny w 96studzieoaowych płytkach przez 72 godziny w 37°C, pulsowano 1 pCi 3H-tymidyny (DuPont NEN®, Boston, MA)/studeieoaę przez 6 godzin, zebrano i mierzono radioaktywność w liczniku scyntylacyjnym TopCount™ (Packard Instrument Co., Meriden, CT). ,
Przykład 5. Wpływ zastąpienia alaniną na powinowactwo IL-4 wobec IL-4Ra. Wpływ zastępowania alaniną reszt eksponowanych na powierzchni helis A i C IL-4 na powinowactwo IL-4 wobec IL-4Ra pokazano na tabeli I.
Tabela I.
Wyniki skanowania alaniną reszt eksponowanych na powierzchni helis A i C IL-4*
Mutacja Kd muteiny/Kd IL-4 [R1210^1240]
1 2
Helisa A
Ile-8 Ala
Gln.-8 Ala
Glu-9 Ala
Ile-11 Ala
Lys-12 Ala
Thr-13 Ala
188 738 cd. tabeli I
1 2
Asn-15 Ala
Ser-16 Ala
Helisa C
His-74 Ala
Lys-77 Ala
Gln-78 Ala
Arg-81 Ala
Phe-82 Ala
Lys-84 Ala
Arg-85 Ala
Arg-88 Ala
Asn-89 Ala
Trp-91 Ala
Wszystkie mutacje wprowadzono do szkieletu IL-4[R121D/Y124D].
Zastąpienie alaniną generalnie nie powodowało zmian strukturalnych w pofałdowaniu białka, wpływ na aktywność, w tym wypadku powinowactwo, można opisać jako utratę bocznych łańcuchów (Cunningham i in., Science 244(4908): 1081-5 (1989)). Nominalne zmiany w powinowactwie (np. około 2-krotne), które występują w następstwie zastąpienia alaniną, sugerują. że reszta/pozycja zastąpienia nie jest związana z oddziaływaniem; znaczne efekty (tj. >100-krotne) sugerują, że reszta/pozycja jest kluczową dla oddziaływania (Lowman i in., Biochem. 30(45): 10832-8 (1991)). Lowman i in. stwierdzili, że reszty wykazujące pośredni wpływ na wiązanie w następstwie zastąpienia alaniną były, oprócz reszt wrażliwszych, związane z badanymi oddziaływaniami.
Stosując te wnioski do wyników skanowania alaniną helis A i C IL-4, najbardziej kluczowymi resztami dla oddziaływania IL-4 z IL-4Ra są Glu-9 i Arg-88; reszty pośrednie obejmują Ile-5>Asn89>Lys-84~Arg-81>Thr-13~Gln-78~Arg-85~Lys-77; resztami prawdopodobnie nie związanymi z oddziaływaniem są Bln-8, Ile-11, Lys-12, Asn-15, His-74, Phe-82 i Trp-91. Ser-16 dzięki obserwowanemu wzrostowi powinowactwa po zastąpieniu alaniną, znajduje się na powierzchni styku IL-4 i IL-4Ra. Wyniki te określają prawdopodobną powierzchnię wiązania pomiędzy IL-4 i IL-4a, która w odniesieniu do kontekstu budowy IL-4 (Smi-th i in., J. Mol. Biol. 224 (4): 899-904 (1992)) obejmuje sąsiadujące części helis A i C IL-4 i ciągnie się przez około trzy skręty każdej z helis, tj. w pozycjach 5-16 helisy A i 77-89 helisy C. Najprawdopodobniej, resztami związanymi z kontaktem z receptorem IL-4Ra są w helisie A: Ile-5, Glu-9, Thr-13 i Ser-16; zaś w helisie C: Lys-77, Gln-78, Arg-81, Lys-84, Arg-85, Arg88 i Asn-89. Strukturalnie, krytycznym środkiem oddziaływania wydają się być reszty Glu-9, Arg-88 i Asn-89, zaś obserwowany wpływ alaniny ogólnie zmniejsza się wraz ze zwiększaniem odległości od tej części cząsteczki. Analiza opisuje więc powierzchnię wiązania IL-4 z IL-4Ra.
Przykład 6: Muteiny z zastąpieniami w konkretnych pozycjach. W poprzedzającej analizie hormonu wzrostu, zastąpienia reszt, które po zastąpieniu alaniną wykazywały pośredni wpływ na powinowactwo poprawiały powinowactwo hormonu wzrostu do jego receptora (Lowman i in., Biochem. 30(45): 10832-8 (1991)). Stwierdzono, że nie sposób przewidzieć natury zastąpienia danej reszty, która daje poprawę powinowactwa. Tak więc, w prezentowanej tu analizie wszystkie zastąpienia, które mogą nie mieć efektu strukturalnego (tj. wyłącznie
188 738
Cys, Gly i Pro) albo ulegają reakcjom utleniania (tj. wyłącznie Met) wprowadzono do docelowych pozycji:
Tabela II.
Reszty docelowe i ich zastąpienia*
Reszta Wpływ Ala Zastąpienie
Ile-5 71 D, E, F, H, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, Y
Thr-13 6,4 D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, V, W, Y
Ser-16 0,43 D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, T, V, W, Y
Arg-81 8,9 D, E, F, H, I, K, L, N, Q, S, T, V, W, Y
Asn-89 51 D, E, F, H, I, K, L, Q, R, S, T, V, W, Y
*Wszystkie mutacje wykonywano w oparciu o szkielet IL-4[R121D/Y124D]
Tak więc, cysteinę, glicynę, metioninę i prolinę wykluczono z dalszej analizy zastąpień. Reszty wybrano do dalszej analizy jeżeli, po podstawieniu alaniną, powinowactwo zmniejszało się od 5- do 80-krotnie albo zwiększało się w jakikolwiek sposób; zakres ten wybrano na podstawie wyników otrzymanych przez Lowman i in. (wyżej). Oprócz tego, do dalszej analizy wybrano Ser-16 z powodu obserwowanego wzrostu powinowactwa, spowodowanego zastąpieniem przez alaninę, sugeruje to, że inne zastąpienia w tej pozycji mogą również dać poprawę powinowactwa.
Przykład 7. Zastąpienia, które dają zwiększone powinowactwo do IL-4Ra. Muteiny obejmujące zastąpienia w konkretnych pozycjach helis A i C wytworzono w oparciu o szkielet IL-4[R121D/Y124D]; testy wiązania kompetycyjnego przeprowadzono w taki sposób, że każdą muteinę porównywano równolegle z IL-4[R121D/Y124D]. Umożliwiło to bezpośrednie porównanie, a w ten sposób wnioskowanie o wpływie każdego zastąpienia na powinowactwo konkretnej muteiny do IL-4Ra.
Wszystkie zastąpienia o polepszonym powinowactwie pokazano w tabeli III. Stosunek „Kd IL-4[R121D/Y124D]/Kd muteiny” wskazuje względny wzrost powinowactwa obserwowany w wyniku każdego z zastąpień.
Zastąpienie KD IL-4 [R121D/Y124D]/Kd muteiny
T13D-IL-4 [R121D/Y124D] 18
S16A-IL-4 [R121D/Y124D] 2,5
S16D-IL-4 [R121D/Y124D] 3,1
S16H-IL-4 [R121D/Y124D] 1,5
S16I-IL-4 [R121D/Y124D] 1,8
S16L-IL-4 [R121D/Y124D] 2,9
S16Q-IL-4 [R121D/Y124D] 2,3
S16R-IL-4 [R121D/Y124D] 1,8
S16T-IL-4 [R121D/Y124D] 2,4
S16Y-IL-4 [R121D/Y124D] 2,0
S16Y-IL-4 [R121D/Y124D] 1,8
R81K-IL-4[R121DYT44D] 1,8
N89I-IL-4 [R121D/Y124D] 2,0
188 738
Większość zastąpień miała wpływ szkodliwy albo żaden, na powinowactwo do IL-4Ra (dane nie pokazane). Jednakże, niektóre zastąpienia polepszały powinowactwo, z czego najwyraźniej zastąpienie Thr-13 przez Asp, które spowodowało 18-krotny wzrost powinowactwa do IL-4Ra (figura 2). Aminokwas Ser-16 był unikalny w tym badaniu, podczas gdy większość zastąpień powodowała umiarkowany wzrost powinowactwa. Podobne profile wiązania kompetycyjnego otrzymano dla tych innych mutein w odniesieniu do ich względnego powinowactwa (dane nie pokazane).
Polepszenie powinowactw jest względne w stosunku do wyjściowego białka IL-4[R-121D/Y124D]. Oczekuje się, że kombinacja tych zastąpień w jednym białku może spowodować kombinatoryjny wzrost powinowactwa, np. [T13D/N89L|-IL-4[R121D/Y124D] może dać muteinę o 36-kiOtnie większym powinowactwie niż IL-4|R121D/Y 124D].
Reszty Thr-13 i Ser-16 dały najlepsze polepszenie powinowactwa, gdy określono najlepsze zastąpienie. To sugeruje, że inne reszty, które po zastąpieniu alaniną dawały podobny efekt jak muteina T13A albo S16A (odpowiednio, 6,4-krotne zmniejszenie i 2,5-krotne zwiększenie) powinno również dać wyższe powinowactwo odmian IL-4, po odpowiednim zastąpieniu. Dla obecnej serii reszt zastępowanych alaniną powinno to obejmować: Ile-11, Lys-77, Gln-78, Lys-84 i Arg-85.
Dla hormonu wzrostu, który szeroko badano, pojedyncze zastąpienie, które powoduje wzrost powinowactwa, znajduje się w zakresie 1,5- do 5-krotności (Lowman i in., J. Mol. Biol. 234(3):564-78 (1993)). Jednakże ostatnio, zidentyfikowano zastąpienia, które spowodowały istotną poprawę aktywności (ludzka IL-3 (Olins i in., J. Biol. Chem. 270 (40):23758-60 (1995)) albo powinowactwa (ludzki rzęskowy czynnik neurotroficzny (CNTF) (Saggio i in., EMBO J. 14 (13):3045-54 (1995)). Dla IL-3 jedna mutacja zwiększała aktywność biologiczną in vivo ~26-krotnie; dla CNTF, pojedyncze zastąpienie zwiększało powinowactwo ~13-krotnie. Dla innych cytokin w literaturze, większość zastąpień zwykle nie wykazuje wpływu albo powoduje spadek powinowactwa/aktywności. Tak wiec, całkowity wpływ do wolnego danego zastąpienia na powinowactwo i/lub aktywność jest niemożliwy do przewidzenia.
Przykład 8. Wpływ zastąpienia T13D na aktywność biologiczną. Antagonistyczna muteina IL-4, IL-4[R121D/Y124D] jest antagon.ist1 IL-4 (Tony i in., Eur. J. Biochem. 225 (2):659-65 (1994)), i zastosowano ją jako podstawowy peptyd w tym badaniu z powodu jej niezdolności do pobudzania aktywności IL-4. Ta antagonistyczna muteina uważana jest za antagonistę z powodu jej zdolności do wiązania IL-4Ra, ale braku zdolności do włączania yc w sposób wywołujący sygnalizację, blokując w ten sposób IL-4 przez związaniem się z kompleksem receptora. Tak więc, działania biologiczne IL-4[R121D/Y124D] (antagonizm IL-4) jest ograniczony do oddziaływania, mierzonego powinowactwem, z IL-4Ra.
W celu wykazania, że powinowactwo receptora koreluje z aktywnością biologiczną muteinę T13D-IL-4[R121D/Y124D] badano pod względem zdolności do hamowania wywołanej IL-4 proliferacji blastów PHA (figura 3). Obserwowany IC50 (stężenie, przy którym obserwowano 50% zahamowanie) względem IL-4[R121D/Y124D] określono jako proporcjonalne do obserwowanej względnej zmiany powinowactwa receptorów.
Podsumowując, jakkolwiek wiąże się z wyższym powinowactwem wobec IL-4Ra, T13D-IL-4[R121D/Y124D] pozostaje antagonistą IL-4. IC50 dla T13D-IL-4[R121D/Y124D] w stosunku do IL-4[R121D/Y124D] jest mniej więcej proporcjonalne do względnych wartości Kd (zmierzonych testem wiązania na podłożu stałym) otrzymanych dla tych dwóch białek: Kd dla T13D-IL-4[R121D/Y124D] jest ~18-krotnie niższa niż Kd dla IL-4[R121D/Y124D] (odpowiednio, 0,28 nM i 5,0 nM) ; IC50 dla T13D-IL-4[R121D/Y124D] jest ~5-10-krotnie niższe niż IC50 dla IL-4[R121D/Y124D] (odpowiednio, 2 nM i 13 nM,). Konkretne różnice numeryczne mogą być wynikiem konkretnych warunków zastosowanych w teście: 1,5 godzinna inkubacja w teście wiązania na podłożu stałym w 20°C, 48-godzinna inkubacja w 37°C w teście proliferacji. Zdolność innych mutein badanych w tym teście do współzawodniczenia z IL-4 w testach biologicznych była również proporcjonalna do ich względnych wartości Kd względem IL-4[R121D/Y124D] (dane nie pokazane). Wyniki te wskazują że wiązanie IL-4Ra jest zjawiskiem odrębnym od aktywacji receptora IL-4; ta aktywacja wymaga heterodimeryzacji IL-4Ra i przynajmniej jednej podjednostki (np. yc). Tak więc modyfikacja
188 738
IL-4 w helisie A i C moduluje aktywność IL-4 wobec IL-4Ra, i czyni to w sposób proporcjonalny do zdolności muteiny do antagonizowania IL-4 w kontekście biologicznym. Ten wpływ na powinowactwo, dzięki mechanizmowi oddziaływania IL-4 z jej receptorem, powinien również tłumaczyć siłę peptydów agonistycznych pochodzących z IL-4.
Teorie według wynalazku można również zaadaptować do innych cytokin. Najpowszechniejszym celem jest IL-13 z powodu faktu, że kompleks receptora IL-13 również wykorzystuje IL-4Ra (Żurawski i in., J. Biol. Chem. 270:13869-78 (1995), stąd, imitowanie helis A i C IL-13 w sposób przypominający IL-4 powinno spowodować wzrost powinowactwa wiązania z IL-4Ra.
Przyrównanie dwóch interleukin umożliwia identyfikację pozycji, które mogą być analogiczne z miejscami mutacji docelowych, przykładowo, Thr13 na IL-4. Powierzchnie wiązania dwóch interleukin porównano w tabeli IV.
Pozycja reszty Sekwencja
Helisa A ...ITLQEIIKTLNSL...
hIL-4 5-17
hIL-13 4-16 ...TALRELIEELVNT...
Helisa C
hIL-4 74-91 ...HKQLIRFLKRLDRNLW...
hIL-13 59-74 . ..TQRMLSGFCPHKVSAG...
*Przyrównanie z Bamborough i in., Prot. Eng. 7:1007-82 (1994)
Najbardziej krytyczne reszty dla pośredniczenia przez IL-4 w oddziaływaniu z IL-R4a zidentyfikowano podczas skanowania alaniną, Glu-9 i Arg-88, które pokazano wytłuszczoną czcionką, jak sąsiadujące reszty odpowiadające IL-13 w oparciu o listy. Jak uprzednio wspomniano IL-13 wykorzystuje IL-4Ra, jako kompleks receptora (Żurawski i in., wyżej). Tak więc, zmiana helis A i C IL-13 na bardziej przypominające IL-4-powinno spowodować wzrost powinowactwa wiązania wobec IL-4a.Oprócz tego, zastąpienie równoważnych co do położenia reszt IL-13 resztami, co do których stwierdzono, że zwiększa ją powinowactwo IL-4 wobec IL-4Ra (pozycje pokazane podwójnie podkreślone dla IL-4 i IL-13), co powinno spowodować wzrost powinowactwa IL-13 wobec jej kompleksu receptora, a w ten sposób zwiększyć siłę.
Sekwencje. W opisie zawarto następujące sekwencje
Id. Sekw. nr 1: sekwencja aminokwasową, dojrzała ludzka hIL-4
Id. Sekw. nr 2: sekwencja nukleotydowa, starter PCR
Id. Sekw. nr 3: sekwencja nukleotydowa, starter PCR
Id. Sekw. nr 4: sekwencja nukleotydowa, starter PCR
Id. Sekw. nr 5: sekwencja nukleotydowa, starter PCR
Id. Sekw. nr 6: sekwencja aminokwasową znacznika peptydowego dla streptawidyny
Id. Sekw. nr 7: sekwencja aminokwasową dla sIL-4Ra-STx
Id. Sekw. nr 8: sekwencja aminokwasową, nukleotydowa T13D-IL-4 i
Id. Sekw. nr 9: sekwencja aminokwasową, nukleotydowa T13D-IL-4[R121D/Y124D],
Inne wykonania wynalazku staną się oczywiste dla specjalisty. Pomysł i podejścia doświadczalne opisane tu powinny być możliwe do zastosowania w innych cytokinach wykorzystujących multimerowy układ receptorów, w szczególności IL-2 i po krewnych (np. IL-7, IL-9, IL-10, IL-13 i IL-15), interferonie a i interferonie γ.
188 738
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(1) ZGŁASZAJĄCY:Shanefelt, Armen; Greve, Jeffrey; Gundel, Robert (ii) TYTUŁ WYNALAZKU:
(iii) LICZBA SEKWENCJI: 9 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRESAT: Bayer Corporation, Pharmaceutical Division (B) ULICA: 400 Morgan Lane (C) MIASTO: West Haven (D) STAN: CT (E) KRAJ: Stany Zjednoczone Ameryki (F) KOD: 06516-4175 (v) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) TYP NlEŚNUA: Diskette, 3.5, 1.44 Mb (B) KOMPUTER: IBM PC kompatybilny (C) SYSTEM OPERACYJNY: Windows 95 (D) OPROGRAMOWANIE: Microsoft Word 7.0 (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA: 08/687,803 (B) FIL ING I^TE : 19-.TOL-1966 (viii) INFORMACJA O RZECZNIKU::
(A) NAZWA:
(B) NUMER REJESTRACYJNY:
(C) NUMER SPRAWY:
(ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:
(A) TELEFON: (203) 812-2317 (B) TELEFAX: (203) 812-5492 (2) INFOIRMlTION FOR SEQ ID NO: 1:
(i) SEQTUENCE CJHARACTERISTICS:
(A) LENGTH : 129 (B) ΤΥΡΕ: ćuuino acid (C) J^T^J^^EDMES: : single (D) 'TO^<^!^<G^Y: lirnear (ii) MDLECULE LYPE: E:otein (A) DESCRIPTOON: tuman: Interleukin-4 protein (iii) HYPOEHETICAUE no (iv) ADEI-SEDSE: no (xi) SYQUYDEE EESERIPTICD: SEQ ID NO: 1:
His 1 Lys Cys Aap P1u 5 Thr Leu Gln Glu Ile 10 Ile Lys Thr Leu Asn 15
Ser Leu Thi: Glu Pll 20 Pys Thr Leu Cys Thr 25 Glu Leu Thr Val TTr 30
Asp Ile Phe Ala Ala 35 Ser Lys Asn Thr Thr 40 Glu Lys Glu Thr Phh 45
Cys Arg Ala Ala Thr 50 Val Leu Arg Gln Phe 55 Tyr Ser His His G1u 60
Lys Asp Thr Arr Pys 65 Leu Gly Ala Thr Ala 70 Gln Gln Phe His JAg 75
His Lys Gln Leu Ile 80 Arg Phe Leu Lys Arg 85 Leu Asp Arg Asn Llu 90
Trp Gly Leu Ala Gly 95 Leu Asn ero Sso roo 100 Val Lys Glu Ala Asn 105
Gln Ser Thr Leu Glu 110 Asn Phe Leu Glu Arg 115 Leu Lys Thr Ile Met 120
Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser 125
188 738 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:
(X) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 24 (Β) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: cDNA (A) DESCRIPTION: 5' PCR Primer,
IL-4 (iii) HYPOTHETICAL: no (iv) ANTI-SENSE: no (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2: CGCGGATCCA TGGGTCTCAC CTCC (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 29 (Β) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: cDNA (A) DESCRIPTION: 3’ PCR Primer, IL-4 (iii) HYPOTHETICAL: no (iv) ANTI-SENSE: no (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3: CGCTCTAGAC TAGCTCGAAC ACTTTGAAT 29 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 31 (Β) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: cDNA (A) DESCRIPTION: 5' PCR Primer, IL-4Ra (ED) (iii) HYPOTHETICAL: no (iv) ANTI-SENSE: no (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:
GGCATGGATC CATGGGGTGG CTTTGCTCTG G 31 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 (Β) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: cDNA (A) DESCRIPTION: 3' PCR Primer, (iii) HYPOTHETICAL: no (iv) ANTI-SENSE: no (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5: AAGCCGCTAG CGCTGTGCTG CTCGAAGGGC
IL-4Ra (ED) on (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 10 (Β) ΤΥΡΕ: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
188 738 (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (A) DESCRIPTION: tag for streptavidin (iii) HYPOTHETICAL: no (iv) ANTI-SENSE: no (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:
Ser Ala Trp Arg His Pro Gin Phe Gly Gly 10
10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 197
(B) ΤΥΡΕ: amino acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: protein
(A) DESCRIPTION: sIL-4Ra-STX
(iii) HYPOTHETICAL: no
<iv) ΑΝΤΙ -SENSE: no
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:
Met Lys Val Leu Gin Glu Pro Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser
1 5 10 15
Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser
20 25 30
Thr Glu Leu Arg Leu Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met
35 40 45
Asp Asp Val Val Ser Ala Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala
50 55 60
Gly Gin Gin Leu Leu Trp Lys Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His
65 70 75
Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn Leu Thr Val His Thr Asn Val
80 85 90
Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser Asn Pro Tyr Pro Pro Asp
95 100 105
Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala Val Asn Ile Trp Ser
110 115 120
Glu Asn Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn Val Thr Tyr Leu
125 130 135
Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys Ser Gly Ile
140 145 150
Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gin Cys Tyr Asn Thr
155 160 165
Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser Tyr
170 175 180
Arg Glu Pro Phe Glu Gin His Ser Ala Trp Arg His Pro Gin Phe
185 190 195
Gly Gly 197
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
188 738 (A) LINGGTH: 462 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (A) DESCRIPTION :
(iii) HYPOTHETICAI·: no (iv) ANTI-SENSE: no (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8:
ATG GGT CTC ACC Thr TCC CAA CTG CTT CCC CCC CTG TTC TTC CTG CTA Leu 15 45
Met Gly 1 Leu Ser 5 Gln Leu Llu Pro Pro 10 Leu PhL Phe Leu
GCA TGT GCC GGC ACC ATC GTC CAC dA dC AAG TGC CGAA ATC ACC 90
Ala Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lls Cts Asp He Thr
20 :25 30
TTA CAG GAG ATC ATC AAA GAT ATG AAC AGC CCC Ad dG dG AAG 115
Leu Gln Glu Ile Ile Lys Asp Leu AAsn Ssl Leu Thr Glu Gln Lys
35 40 45
ACT CTG TGC ACC dC TGC ACC GTA Ad GAC ATC TTT GGA GCC TCC 180
Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Tłhc CAp He PPh Ala Ala Ser
50 50 60
AAG AAC ACA ACT AGA AGC OA ACC TTC TAG AdG GCT GCG ACT GTG 225
Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Ahr Phe Ccs AArg Ada Ada Thr Val
65 70 75
CTC CGG CAG TTC AAC ACC dC dA GAG AAG dC ACT CAG Td; CTG 220
Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Tho Aog Cys Leu
80 80 90
GGT GCG ACT GCA AGC dC TTC TAC AGG de CAG dG CTG ATC CHA 331
Gly Ala Thr Ala Gln Gln PhL His Arg His Lys Gln Leu Ile AOg
95 100 105
TTC CTG AAA CGG ATC dC AdG AAC CTC TCG «SC CTG CGC d>C TTG 360
Phe Leu Lys Arg LeC Asc AArg Asn Leu Tt? Gly Leu Ada Gly Leu
110 110 110
AAT TCC TGT CCT AGC AGC GU GCT ZAAC CAG AGT ACG TAG CGAA AAC 40(5
Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala AAsn GG.n SSr Thh Leu Glu AAsn
125 130 113
TTC TTG GAA AGG TAA AGA ACG ATT ATG Ad dG AAA TAA T<AA AAG 440
Phe Leu Glu AArg Leu Lys Thr IlL Met AArg Glu Lys Tyr Ser Lys
140 140 110
TGT TCG AGC TAG 062
Cys Ser Ser End
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENCE THARATAERISTICS:
(A) LINGGTH: 4 62
(B) ΤΥΡΕ: ηιτοίβχο acid
(T) STRANDDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE AYPE: cDNA
(A) DESCRIPTION: IL-4/T13D[R121D/Y204D]
188 738 (iii) HYPOTHETICAL: no (iv) ANTI-SENSE: no (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9:
ATG GGT CTC ACC TCC AC CTG CTT CCC CCT CCG TTC TTT CCG CTA 45
Met 1 Gly Leu Thh Ser 5 Gln Leu Leu Pro Pro IT Leu Phh Piw Leu Leu 15
GCA TGT GCC GCG TAC TOT GTC AC GA AC AG TGC AA ATC TCCC 90
Ala Cys Ala GGy Asn 20 Phe Val His Gly His 2T Lls Ccs Ap Hi: Thr 30
TTA CAG GAG ACT ATC AA GAT TTC AAC AGC CTC ACA gag AG AG 135
Leu Gin Glu I ll Ile 35 Lys Asp Leu Asn Ser 4T Leu Tłu: Glu Gln Lls 45
ACT CTG TGC AAC AG TTG ACC GTA ACA CGAC ATC TTT GCT GCC TCC 180
Thr Leu Cys TT.h Glu 50 Leu Thr Val Thr Asp 5T Ul Phh Ala Ala SSr 60
AAG AAC AAC AAC TAG AAG GA ACC TTC TGC ACG GGT GCG ACT GTG 205
Lys Asn Thr Tłih Glu 65 Lys Glu Thr Phe Cys 7T Arg Ala Ala Thr Val 75
CTC CGG GAG TTT TAC AGC CAC CAT AG AG AC ACC CGC TCCC CTG 270
Leu Arg Gln Phe Tyr 80 Ser His His Glu Lys 8T TAp Tlh: Ag Cyy Leu 90
GGT GCG ACT GGA AG AG TTC CAC accc CAC ag AG CTG ATC CA 315
Gly Ala Thr ACu Gln 95 Gln Phe His Arg His 100 Lls Gln Leu Ul TCrg 100
TTC CTG AAC CCC TTC AC AGG AAC CTC ttgc GGC CCG gcg TOC TTG 360
Phe Leu Lys AAg Leu 110 Asp Arg Asn Leu Tjo? 115 Gly Leu TCLa Gly Leu 110
AAT TCC TGT CCC GTG AAG GA GCC AC <0X3 AGT ACG TTG GCCC AC 405
Asn Ser Cys Ppo Val 125 Lys Glu Ala An Gln 130 SSr Tłh: Llu Glu Asn 113
TTC TTG GA AGG TTA AG ACG ATC ATG AC GCA SCCc GAC TA AG 450
Phe Leu Glu aao Leu 140 Lys Thr Ile Met TAp 145 GCu Tls Ap TSr Lls 115
462
TGT TCG AGC TAG Cys Ser Ser End
188 738 wiązania o\o
FIG. 2
188 738 proliferacj i o\o
ίο42 ισ11 icr10 ισ9 nr8 ισ7 ισ6 [stęż, muteiny], M
FIG. 3
188 738
slL-4Rn-STX (Id. Sekw. Nr 7)
Met Lys Val Leu Gln Glu i’· S Pro Thr Cys Val 10 Ser Asp Tyr Met Ser 15
Ile Ser Thr Cys Glu Trp 20 Lys Met Asn Gly 25 Pro Thr Asn Cys Ser 30
Thr Glu Leu Arg Leu Gly 35 Ala Gly Cys Val 40 Cys His Leu Leu Met 45
Asp Asp Val Val Ser Ala 50 Asp Asn Tyr Thr 55 Leu Asp Leu Trp Ala 60
Gly Gln Gln Leu Leu Trp 65 Lys Gly Ser Phe 70 Lys Pro Ser Glu His 75
Val Lys Pro Arg Ala Pro 80 Gly Asn Leu Thr 85 Val His Thr Asn Val 90
Ser Asp Thr Leu Leu Leu 95 Thr Trp Ser Asn 100 Pro Tyr Pro Pro Asp 105
Asn Tyr Leu Tyr Asn His 110 Leu Thr Tyr Ala 115 Val Asn Ile Trp Ser 120
Glu Asn Asp Pro Ala Asp 125 Phe Arg Ile Tyr 130 Asn Val Thr Tyr Leu 135
Glu Pro Ser Leu Arg Ile 140 Ala Ala Ser Thr 145 Leu Lys Ser Gly Ile 150
Ser Tyr Arg Ala Arg Val 155 Arg Ala Trp Ala 160 Gln Cys Tyr Asn Thr 165
Thr Trp Ser Glu Trp Ser 170 Pro Ser Thr Lys 175 Trp His Asn Ser Tyr 180
Arg Glu Pro Phe Glu Gln 185 His Ser Ala Trp 190 Arg His Pro Gln Phe 195
Gly Gly
FIG. 4
188 738
T13D-H.4 (Id. Sekw. Nr 8)
ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCGGCAAC 1------+---------+---------+---------+----------------------TACCCAGAGTGGAGGGTTGACGAAGGGGGAGACAAGAAGGACGATCGTACACGGCCGTTG a: MecGlyŁeuThrSerGlnŁeuX.euProProLeuPhePheX»euLeuAlaCyjsAIaG2yAsn
TTTGTCCACGOACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAGATTTGAACAGC 61------+---------+---------+---------+---------+-......--+--AAACAGGTGCCTGTGTTCACGCTATAGTGGAATGTCCTCTAGTAGTTTCTAAACTTGTCG a: Ρίΐ£ν3ΐΗΪ5θ.Ιν&ί5ΐΛ'5θν3Α3Ρΐ1βΤ1ιτ1^ιισΐπσ1αΙ1^Ι1βΙιν5ΑΞΕϋβαΑ5ΐι3ΒΓ
CTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCC 121------+---------+---------+---------+---------+---------+--GAGTGTCTCGTCTTCTGAGACACGTGGCTCAACTGGCATTGTCTGTAGAAACGACGGAGG a: LeuThrGluGlnLysThrLeuCysThrGluLeuThrValThrAspIlePheAlaAlaSer
AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTAC 181------+---------+---------+---------+---------+---------+--TTCTTGTGTTGACTCTTCCTTTGGAAGACGTCCCGACGCTGACACGAGGCCGTCAAGATG a: LysAsnThrThrGluLysGluThrPh.eCysArgAlaAlaThrValLeuArgGlnPheTy±·
AGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCAC 241------+---------+---------+---------+---------+---------+--TCGGTGGTACTCTTCCTGTGAGCGACGGACCCACGCTGACGTGTCGTCAAGGTGTCCGTG a: SerHisHisGluLysAspThrArgCysLeuGlyAlaThrAlaGlnGlnPheHisArgHis
AAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTG 301 ------+---------+---------+---------+---------+---------+--TTCGTCGACTAGGCTAAGGACTTTGCCGAGCTGTCCTTGGAGACCCCGGACCGCCCGAAC a ·- LysGlnLeuIleArgPheLeuLysArgLeuAspArgAsnŁeuTrpGlyLeuAlaGlyLeu
AATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAKCCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTA 361 ---------4-----TTAAGGACAGGACACTTCCTTCGGTTGGTCTCATGCAACCTTTTGAAGAACCTTTCCGAT a: AsnSerCysProValLysGluAlaAsnGlnSerThrLeuGluAsnPheLeuGluArgLeu
AAGACGATCATGAGAGAGAAATATTCAAAGTGTTCGAGCTAG 421 ------+---------+---------+---------+----- 464
TTCTGCTAGTACTCTCTCTTTATAAGTTTCACAAGCTCGATC a: LysThrlleMetArgGluLysTyrSerLysCysSerSerEnd FIG. 5
188 738
T13D-IL4lRi2io/ri24Dl (id. Sekw. Nr 9)
ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCGGCARC 1------+---------+---------+---------+---------+---------+--- 60
TACCCAGAGTGGAGGGTTGACGAAGGGGGAGACAAGAAGGACGATCGTACACGGCCGTTG a: MetGlyLeuThrSerGlnŁeuŁeuProProLeuPhePheLeuLeuAlaCysAlaGlyAsn TTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAGATTTCAACAGC 61 -—+- 120
AAACAGGTGCCTGTGTTCACGCTATAGTGGAATGTCCTCTAGTAGTTTCTAAACTTGTCG a: PheValKisGJyHisLysCy8AspIleThrLeuGlnGluIleIleLysięęLeuAsnSer CTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCC 121------+........-+---------+---------+---------+---------+---180
GAGTGTCTCGTCTTCTGAGACACGTGGCTCAACTGGCATTGTCTGTAGAAACGACGGAGG a: LeuThrGluGlnLysThrLeuCysThrGluLeuThrValThrAspIlePheAlaAlaSer AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTAC 181 ------+---------+----— ---+-------.-^—-- — ,---240
TTCTTGTGTTGACTCTTCCTTTGGAAGACGTCCCGACGCTGACACGAGGCCGTCAAGATG a: LysAsnThrThrGluLysGluThrPheCysArgAlaAlaThrValLeuArgGliiPheTyr AGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCAC 241 ------+---------+---------+---------+---------+---------+--- 300
TCGGTGGTACTCTTCCTGTGAGCGACGGACCCACGCTGACGTGTCGTCAAGGTGTCCGTG a: SerHisHisGluLysAspThrArgCyeLeuGlyAlaThrAlaGlnGlnPheHisArgHis AAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTG 301 ------+---------+---------+---------+.........+---------+--- 360
TTCGTCGACTAGGCTAAGGACTTTGCCGAGCTGTCCTTGGAGACCCCGGACCGCCCGAAC a: LysGlnLeuIleArgPheLeuLysArgLeuAspArgAsnLeuTrpGlyLeuAlaGlyLeu AATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGKGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTA 361 ------+-......--+---------+-........+.........+-........+--- 420
TTAAGGACAGGACACTTCCTTCGGTTGGTCTCATGCAACCTTTTGAAGAACCTTTCCGAT a: AsnSerCysProValLysGluAlaAsnGlnSerThrLeuGluAsnPheLeuGluArgLeu AAGACGATCATGGACGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCTAG 421 ---+.........+---------+--.......+-------- 464
TTCTGCTAGTACCTGCTCTTTCTGAGTTTCACAAGCTCGATC a: ŁvsThrIleMetAspjluLv8AscSerLvsCvsSerSerEnd BIG 6
188 738
FIG. 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (37)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 numerowana zgodnie z IL-4 typu dzikiego, która obejmuje przynajmniej jedno zastąpienie aminokwasu na powierzchni wiązania helisy-α A albo C IL-4 typu dzikiego.
  2. 2. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 1, znamienna tym, że jest kodowana przez sekwencję o Id. Sekw. nr 8.
  3. 3. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 1, znamienna tym, że zastąpienie wybrane jest z grupy pozycji, obejmującej, w helisie A pozycję 5, 11, 13 i 16, zaś w helisie C pozycję 77, 78, 81, 84, 85 (z wyjątkiem R85Q) i 89.
  4. 4. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że zastąpieniem w pozycji 16 jest zamiana seryny na alaninę.
  5. 5. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że zastąpieniem w pozycji 16 jest zamiana seryny na asparaginian.
  6. 6. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że zastąpieniem w pozycji 16 jest zamiana seryny na histydynę.
  7. 7. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że zastąpieniem w pozycji 16 jest zamiana seryny na izoleucynę.
  8. 8. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że zastąpieniem w pozycji 16 jest zamiana seryny na leucynę.
  9. 9. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że zastąpieniem w pozycji 16 jest zamiana seryny na glutaminę.
  10. 10. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że zastąpieniem w pozycji 16 jest zamiana seryny na argininę.
  11. 11. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że zastąpieniem w pozycji 16 jest zamiana seryny na treoninę.
  12. 12. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że zastąpieniem w pozycji 16 jest zamiana seryny na walinę.
  13. 13. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że zastąpieniem w pozycji 16 jest zamiana seryny na tyrozynę.
  14. 14. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że zastąpieniem w pozycji 16 jest zamiana seryny na lizynę.
  15. 15. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że zastąpieniem w pozycji 16 jest zamiana seryny na izoleucynę.
  16. 16. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że zastąpieniem w pozycji 13 jest zamiana Thr na Asp.
  17. 17. Rekombinowana muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 16, znamienna tym, że jest kodowana przez sekwencję DNA o Id. Sekw. nr 9 albo jego odmianę zdolną do stabilnej hybrydyzacji.
  18. 18. Transformowana komórka eukariotycznego gospodarza zdolna do wyrażania rekombinowanej muteiny ludzkiej IL-4 określonej w zastrz. 17.
  19. 19. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje rekombinowaną muteinę ludzkiej IL-4 określoną w zastrz. 1, w połączeniu z nośnikiem dopuszczalnym farmaceutycznie.
  20. 20. Oczyszczona i wyizolowana sekwencja polinukleotydowa kodująca rekombinowaną muteinę ludzkiej IL-4 określona w zastrz. 1.
    188 738
  21. 21. Komórka gospodarza eukariotycznego transformowana oczyszczoną i wyizolowaną sekwencj ą polinukleotydową określoną w zastrz. 21.
  22. 22. Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej określonej w zastrz. 19 do wytwarzania leku do leczenia alergii i alergicznych chorób zapalnych obejmujących astmę.
  23. 23. Test do określania zdolności muteiny do wiązania się z receptorem, - znamienny tym, że obejmuje etapy:
    (a) wprowadzania do FlashPlate pokrytej streptowidyną części wiążącej łańcucha receptora, przy czym część wiążąca łańcucha receptora posiada przyłączony znacznik peptydowy możliwy do związania przez streptawidynę;
    (b) wprowadzania do FlashPlate natywnego liganda znakowanego radioaktywnie, wykazującego powinowactwo do części wiążącej łańcucha receptora;
    (c) wprowadzania do FlashPlate muteiny jako liganda o powinowactwie do części wiążącej łańcucha receptora;
    (d) mierzenia ilości sygnału emitowanego przez FlashPlate po zrównoważeniu; i (e) obliczenia względnego powinowactwa muteiny jako liganda w stosunku do natywnego liganda.
  24. 24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że łańcuchem receptora jest Il-4Ra.
  25. 25. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że znacznik peptydowy obejmuje sekwencję o Id. Sekw. nr 6 albo jego zdegenerowaną odmianę.
  26. 26. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że znacznik peptydowy usunięto z łańcucha receptora, zaś łańcuch receptora biotynylowano.
  27. 27. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że część wiążąca łańcucha receptora jest kodowana przez sekwencję o Id. Sekw nr 7 albo jego zdegenerowaną odmianę.
  28. 28. Rekombinowana antagonistyczna muteina ludzkiej IL-4 numerowana według IL-4 typu dzikiego, obejmująca:
    (a) zastąpienie R121D i Y124D w helisie D IL-4 typu dzikiego; i (b) przynajmniej jedno zastąpienie aminokwasowe na powierzchni wiążącej helisy a A albo C IL-4 typu dzikiego, przy czym, gdy zastąpienie dotyczy alaniny zmienia się powinowactwo od około 2 do około 100-krotnie a muteina wiąże się z receptorem IL-4Ra z powinowactwem co najmniej większym niż natywna IL-4.
  29. 29. Rekombinowana antagonistyczna muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 28, znamienna tym, że zastąpienie wybrane jest z grupy pozycji, obejmującej, w helisie A pozycje 5, 11, 13 i 16, zaś w helisie C pozycję 77, 78, 81, 84, 85 (z wyjątkiem R85q) i 89.
  30. 30. Rekombinowana antagonistyczna muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 29, znamienna tym, że zastąpieniem w pozycji 13 jest zamiana Thr na Asp.
  31. 31. Rekombinowana antagonistyczna muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 30, znamienna tym, że jest kodowana przez DNA o sekwencji Id. Sekw. nr 9.
  32. 32. Komórka gospodarza eukariotycznego zdolna do wyrażania rekombinowanej muteiny ludzkiej IL-4 określonej w zastrz. 31.
  33. 33. Oczyszczona i wyizolowana sekwencja polinukleotydowa kodująca rekombinowaną antagonistycznąmuteinę ludzkiej IL-4 określoną w zastrz. 28.
  34. 34. Transformowana komórka gospodarza eukariotycznego transformowana oczyszczoną i wyizolowana sekwencją polinukleotydową określoną w zastrz. 33.
  35. 35. Rekombinowana antagonistyczna muteina ludzkiej IL-4 określona w zastrz. 28, znamienna tym, że jest kodowana przez sekwencję o Id. Sekw. nr 9 albo jego odmianę zdolną do stabilnej hybrydyzacji.
  36. 36. Kompozycja farmaceutyczna obejmująca rekombinowaną antagonistyczna muteinę ludzkiej IL-4 określoną w zastrz. 28, w połączeniu z nośnikiem dopuszczalnym farmaceutycznie.
  37. 37. Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej określonej w zastrz. 36. do wytwarzania leku do leczenia alergii i alergicznych chorób zapalnych obejmujących astmę.
    188 738
PL97331253A 1996-07-19 1997-07-09 Rekombinowana muteina ludzkiej interleukiny-4, transformowana komórka, kompozycja farmaceutyczna, oczyszczona i wyizolowana sekwencja polinukleotydowa, komórka gospodarza eukariotycznego, zastosowanie kompozycji farmaceutycznej, test oraz rekombinowana antagonistyczna muteina ludzkiej IL-4 PL188738B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US68780396A 1996-07-19 1996-07-19
PCT/US1997/011909 WO1998003654A2 (en) 1996-07-19 1997-07-09 High-affinity interleukin-4 muteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL331253A1 PL331253A1 (en) 1999-07-05
PL188738B1 true PL188738B1 (pl) 2005-04-29

Family

ID=24761912

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL97331253A PL188738B1 (pl) 1996-07-19 1997-07-09 Rekombinowana muteina ludzkiej interleukiny-4, transformowana komórka, kompozycja farmaceutyczna, oczyszczona i wyizolowana sekwencja polinukleotydowa, komórka gospodarza eukariotycznego, zastosowanie kompozycji farmaceutycznej, test oraz rekombinowana antagonistyczna muteina ludzkiej IL-4

Country Status (23)

Country Link
EP (1) EP0939817B1 (pl)
JP (1) JP2000515016A (pl)
KR (1) KR100468553B1 (pl)
CN (1) CN1201006C (pl)
AR (2) AR007917A1 (pl)
AT (1) ATE310821T1 (pl)
AU (1) AU718794B2 (pl)
BR (1) BR9710733B1 (pl)
CA (1) CA2259940C (pl)
DE (1) DE69734723T2 (pl)
DK (1) DK0939817T3 (pl)
ES (1) ES2252786T3 (pl)
HU (1) HU224973B1 (pl)
ID (1) ID17491A (pl)
IL (2) IL127934A0 (pl)
MY (1) MY124565A (pl)
NZ (2) NZ333748A (pl)
PL (1) PL188738B1 (pl)
RU (1) RU2202364C2 (pl)
TR (1) TR199900100T2 (pl)
TW (1) TW496871B (pl)
WO (1) WO1998003654A2 (pl)
ZA (1) ZA976368B (pl)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0911401A1 (en) * 1997-10-21 1999-04-28 Bayer Ag Muteins of interleukin 4 showing low-affinity and short-term interaction with the common gamma chain
EP1022337B1 (en) * 1999-01-20 2006-07-26 Bayer HealthCare AG Plasmids, their construction and their use in the manufacture of interleukin-4 and interleukin-4 muteins
DE69929638T2 (de) 1999-01-20 2006-09-21 Bayer Healthcare Ag Plasmide, deren Konstruktion und Anwendung zur Herstellung von Interleukin-4 und dessen Muteine
CN1306030C (zh) * 2001-09-28 2007-03-21 中山大学 一种人白细胞介素－10基因序列及含该基因序列的大肠杆菌
WO2004064860A1 (en) * 2003-01-17 2004-08-05 Children's Hospital Medical Center Use of tff2, or agents inducing tff2, in the therapy of allergies
RU2389796C2 (ru) * 2003-08-29 2010-05-20 Аэровэнс, Инк. Модифицированный антагонист рецептора il-4 и предназначенный для его получения очищенный полинуклеотид
US7404957B2 (en) * 2003-08-29 2008-07-29 Aerovance, Inc. Modified IL-4 mutein receptor antagonists
US7785580B2 (en) 2003-08-29 2010-08-31 Aerovance, Inc. Modified IL-4 mutein receptor antagonists
CA2604222A1 (en) * 2005-04-18 2006-10-26 Novo Nordisk A/S Il-21 variants
WO2017001568A1 (en) 2015-07-01 2017-01-05 Universitat De Lleida Treatment and prevention of amyotrophic lateral sclerosis
JP7360742B2 (ja) * 2018-12-19 2023-10-13 バイオファーマ トランスレーションズインスティテュート デッサウ フォルシュングス ゲーエムベーハー 酵素特性が改善したトリプシン変異体およびその使用ならびに基質の直交二重修飾のための方法
CN113527485B (zh) 2020-04-17 2024-11-15 湖南麦济生物技术股份有限公司 抗人白细胞介素-4受体α抗体及其制备方法和应用
CN112442504B (zh) * 2020-12-10 2023-01-24 电子科技大学 一种重组草鱼白介素-12活性蛋白的制备方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988004667A1 (en) * 1986-12-19 1988-06-30 Immunex Corporation Human interleukin-4 muteins
DE4137333A1 (de) * 1991-11-13 1993-05-19 W Prof Dr Sebald Therapeutische mittel, die antagonisten oder partielle agonisten des humanen interleukin 4 sind oder diese enthalten, hil-4-mutantenproteine sowie vefahren zu deren herstellung
WO1993021308A1 (en) * 1992-04-17 1993-10-28 The University Hospital Mutant cytokines having increased receptor affinity
JP2000515007A (ja) * 1996-06-14 2000-11-14 バイエル・コーポレーシヨン Ｔ細胞選択的インターロイキン―４アゴニスト

Also Published As

Publication number Publication date
CN1201006C (zh) 2005-05-11
RU2202364C2 (ru) 2003-04-20
NZ505238A (en) 2001-06-29
ZA976368B (en) 1998-02-19
ID17491A (id) 1998-01-08
WO1998003654A2 (en) 1998-01-29
DE69734723T2 (de) 2006-06-22
EP0939817B1 (en) 2005-11-23
TR199900100T2 (xx) 1999-04-21
AU3654597A (en) 1998-02-10
TW496871B (en) 2002-08-01
NZ333748A (en) 2000-08-25
CN1230223A (zh) 1999-09-29
JP2000515016A (ja) 2000-11-14
HK1022717A1 (en) 2000-08-18
AR060630A2 (es) 2008-07-02
CA2259940C (en) 2008-09-23
IL182509A0 (en) 2007-09-20
IL182509A (en) 2011-03-31
AU718794B2 (en) 2000-04-20
ATE310821T1 (de) 2005-12-15
ES2252786T3 (es) 2006-05-16
AR007917A1 (es) 1999-11-24
EP0939817A2 (en) 1999-09-08
DK0939817T3 (da) 2006-01-23
HUP0000248A2 (hu) 2000-06-28
HU224973B1 (en) 2006-04-28
PL331253A1 (en) 1999-07-05
MY124565A (en) 2006-06-30
BR9710733B1 (pt) 2012-02-22
KR100468553B1 (ko) 2005-01-29
WO1998003654A3 (en) 1998-05-14
HUP0000248A3 (en) 2003-09-29
BR9710733A (pt) 1999-08-17
KR20000067914A (ko) 2000-11-25
CA2259940A1 (en) 1998-01-29
IL127934A0 (en) 1999-11-30
DE69734723D1 (de) 2005-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6313272B1 (en) DNA encoding high affinity interleukin-4 muteins
IL182509A (en) A method for determining an affinity between a mutine and a receptor
Pestka et al. Interleukin-10 and related cytokines and receptors
ES2333385T3 (es) Proteina del tipo de interleuquina-17.
US6797263B2 (en) Compositions and methods for achieving immune suppression
CN111615396A (zh) 白介素-2的部分激动剂
US6433157B1 (en) Polynucleotides encoding T-cell selective interleukin-4 agonists
AU2001261585A1 (en) Compositions and methods for achieving immune suppression
MXPA97008528A (en) Chemiosine bata-13 hum
US20030004314A1 (en) T-cell selective interleukin-4 agonists
RU2235728C2 (ru) Мутеин человеческого il-4, полинуклеотидная молекула, вектор, линия sf9, трансформированная вектором, способ выбора мутеина, фармацевтическая композиция для активирования т-клеток, способ лечения пациента, страдающего заболеванием, поддающимся лечению il-4
AU742384B2 (en) High affinity interleukin-4 muteins
KR100479143B1 (ko) T-세포선택적인터루킨-4아고니스트
MXPA99000688A (en) Muleines de interleuquina-4 de gran afini
Raval et al. Characterization of the 5′ flanking region and gene encoding the mouse interferon-gamma receptor
ES2368814T3 (es) Composiciones útiles como ligandos para el receptor de tipo receptor 1 de péptidos formilados y métodos de uso de las mismas.
MXPA98009494A (en) Agingists of interleuquina 4 selectiva para celula
JP2002136294A (ja) ヒトケモカインポリペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20140709