PL189128B1 - Zastosowanie przeciwciał ptasich skierowanych przeciwko antygenowi/patogenowi wywołującemu infekcjeukładu oddechowego - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie przeciwcial ptasich skierowanych przeciwko antygenowi/pato- genowi wywolujacemu infekcje ukladu oddechowego do wytwarzania roztworu farmaceu- tycznego do leczenia i/lub zapobiegania infekcjom w jamie nosowej, zatokach przynoso- wych, pierscieniu limfatycznym gardla, krtani, tchawicy, oskrzelach, oskrzelikach, i/lub pecherzykach, przeznaczonego do podawania przez stosowanie miejscowe w jamie ustnej i/lub gardle. 2. Zastosowanie wedlug zastrz. 1, znamienne tym, ze infekcje ukladu oddechowego spowodowane sa przez bakterie, wirusy lub grzyby. 3. Zastosowanie wedlug zastrz. 2, znamienne tym, ze infekcje ukladu oddechowego spowodowane sa przez gatunki Pseudomonas. 4. Zastosowanie wedlug dowolnego zastrz. 1-3, znamienne tym, ze lek podaje sie przez plukanie gardla i/lub przelykanie. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciał ptasich skierowanych przeciwko antygenowi/patogenowi wywołującemu infekcje układu oddechowego do wytwarzania roztworu farmaceutycznego do leczenia i/lub zapobiegania infekcjom do podawania przez stosowanie miejscowe w jamie ustnej i/lub gardle.

Wiadomo, że gatunki ptaków domowych, np. kury, wytwarzają w swych jajach wysokie miana przeciwciał przeciwko czynnikom, przeciwko którym je immunizowano (4). W kilku badaniach, ptasie przeciwciała zastosowano do zapobiegania albo leczenia zakażeń bakteryjnych albo wirusowych w przewodzie pokarmowym różnych zwierząt z obiecującymi wynikami (12-17), ale nie ma dowodów w literaturze naukowej, że ptasie przeciwciała albo przeciwciała jakiegokolwiek pochodzenia zastosowano do zapobiegania albo leczenia zakażeń dróg oddechowych, ani u ssaków, ani u ludzi. Tradycyjnie, zakażenia dróg oddechowych leczy się konwencjonalną terapią taką jak antybiotykoterapia. Powodem nie stosowania przeciwciał jest brak możliwości podania przeciwciał przy leczeniu dróg oddechowych. Nieoczekiwanie, wynalazcy stwierdzili, że podanie przeciwciał miejscowo do jamy ustnej i/lub krtani można zastosować do leczenia zakażeń układu oddechowego.

Wynalazek dotyczy zastosowania po raz pierwszy przeciwciał ptasich skierowanych przeciwko antygenowi/patogenowi wywołującemu infekcje układu oddechowego do wytwarzania roztworu farmaceutycznego do leczenia i/lub zapobiegania infekcjom w jamie nosowej, zatokach przynosowych, pierścieniu limfatycznym gardła, krtani, tchawicy, oskrzelach, oskrzelikach, i/lub pęcherzykach, przeznaczonego do podawania przez stosowanie miejscowe w jamie ustnej i/lub gardle.

Infekcje układu oddechowego, które można leczyć wytworzonym roztworem spowodowane są przez bakterie, wirusy lub grzyby, korzystniej infekcje układu oddechowego spowodowane są przez gatunki Pseudomonas.

Korzystnie, lek podaje się przez płukanie gardła i/lub przełykanie.

Korzystnie, lek podaje się ludziom wykazującym zwiększoną podatność na zakażenia, która może wynikać z mukowiscydozy;

Nieoczekiwanie, wynalazek wskazuje po raz pierwszy, że przeciwciała ptasie można zastosować do zapobiegania i/lub leczenia zakażeń dróg oddechowych przez podanie miejscowe do jamy ustnej i/lub krtani, korzystnie przez płukanie i/lub połknięcie, co wynalazcy potwierdzili przez przeprowadzone badania kliniczne na ludziach.

Leczenie i/lub zapobieganie zakażeniom dróg oddechowych jest szczególnie przydatne u osobników o zwiększonej podatności na zakażenia albo zwiększonym ryzyku zakażenia, ponieważ leczenie jest łagodne i nie towarzyszą mu niepożądane efekty uboczne.

W celu zbadania zastosowania przeciwciał w roztworze w leczeniu zakażeń dróg oddechowych, wynalazcy wybrali grupę pacjentów cierpiących na mukowiscydozę (CF). Tacy pacjenci wykazują zwiększoną podatność na zakażenia z nawracającymi albo przewlekłymi zakażeniami układu oddechowego przez Pseudomonas aeruginosa. Pacjenci z mukowiscydozą do tej pory podlegali konwencjonalnej terapii, takiej jak antybiotykoterapia, która czasami nie była pomyślna i towarzyszyły jej niepożądane objawy uboczne.

Przewlekła kolonizacja układu oddechowego pacjentów z mukowiscydozą przez Pseudomonas aeruginosa jest główną przyczyną wysokiej zachorowalności i śmiertelności w tej chorobie. Niezwykle ciężko jest usunąć Pseudomonas aeruginosa, gdy się stwierdzi tę bakterię w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą. Przy użyciu energicznej antybiotykoterapii można jedynie osiągnąć czasową eradykację patogenu, zaś bakteria powróci bardzo szybko (1-3). Do tej pory najlepsze rezultaty osiągnięto u pacjentów w ośrodku leczenia mukowiscydozy w Kopenhadze (2), gdzie 14 pacjentów leczono codzienną dawką doustną ciprofloksacyny i inhalacjami z kolistyny przez 3 tygodnie podczas pierwszego pozytywnego posiewu na Pseudomonas aeruginosa. Po leczeniu, pacjenci z mukowiscydozą poddani byli obserwacji przez 27 miesięcy (w sumie 214 miesięcy; średnia 15,3). W tym czasie 2 z pacjentów' uległo przewlekłej kolonizacji Pseudomonas aeruginosa (określone na podstawie sześciu kolejnych hodowli z plwociny, pozytywnych pod względem tej bakterii), i było 49 hodowli z plwociny pozytywnych pod względem Pseudomonas aeruginosa na 214 (= 23%). Z innego badania z Kopenhagi, opisywano ponowne pojawienie się Pseudomonas aeruginosa w hodowli z plwociny już po 4 miesiącach po kursie chemioterapii przeciwko pseudomonas u 98,3% pacjentów z mukowiscydozą (3).

Każde kurze jajo zawiera ponad 100 mg przeciwciał. Przeciwciała te są wytwarzane przez kury i przenoszone do jaj, gdzie znajduje się je w wysokim stężeniu. Wysokie miana swoistych przeciwciał przeciwbakteryjnych uzyskano przez kolejne immunizacje kur zabitymi bakteriami albo ich fragmentami. Swoiste przeciwciała przeciwko Pseudomonas aeruginosa wytworzono przez kolejne immunizację kur zabitymi Pseudomonas aeruginosa. Jaja od tych kur zastosowano do wytworzenia roztworu o wysokim stężeniu przeciwciał.

Przeciwciało składa się z dwóch części: fragmentu Fab, który jest częścią przeciwciała wiążącą antygen i fragmentu Fc, pozbawionego właściwości wiązania antygenu. Podstawę podawania doustnego immunoglobulin przypisuje się zakłócaniu przylegania bakterii i neutralizacji toksyn wytworzonych przez patogeny. Ochronny efekt powinien, więc być przeniesiony przez całą cząsteczkę IgY albo przez ich fragment wiążący antygen, ponieważ obie cząsteczki mogą spełniać tę funkcję. W rzeczywistości, wykazano to w pracy Ahren i Svennerholm (5), którzy zaobserwowali, że fragment Fab przeciwciała anty CFA/I zmniejszał wydzielanie płynu (biegunka) niemal równie skutecznie co nie cięta frakcja immunoglobulin surowicy. Fragmenty Fab z kurzych IgY będą, więc pełnić podobne funkcje ochronne przeciw zakażeniom bakteryjnym, co cała cząsteczka IgY.

W przeciwieństwie do przeciwciał ssaków (np. bydlęcych), przeciwciała z jaj (6) nie aktywują ludzkiego układu dopełniacza (7). Jest to niezwykle istotna zaleta, ponieważ aktywowane czynniki dopełniacza są bardzo skutecznymi mediatorami reakcji zapalnych. Oprócz tego, przeciwciała z jaj nie reagują z czynnikami reumatoidalnymi (8), ludzkimi receptorami Fc (9), bakteryjnymi receptorami Fc (10) albo ludzkimi przeciwciałami przeciwko mysim IgG (11), co czyni je bezpiecznymi w stosowaniu.

Poniższe przykłady przedstawiono w celu dalszego zilustrowania wynalazku, bez jego ograniczania.

Przykład 1

Wytwarzanie ptasich przeciwciał przeciwko Pseudomonas aeruginosa

Bakterie, Pseudomonas aeruginosa, zabito przez utrwalenie w formaldehydzie. Zabite bakterie płukano w 0,9% NaCl i zamrożono w -20°C. 0,5 ml bakterii zmieszano z 0,5 ml niekompletnego adiuwantu Freunda i zastosowano do domięśniowej immunizacji kur domowych. Kury immunizowano czterokrotnie w odstępach 2-tygodniowych. Jaja zbierano po okresie początkowej immunizacji 8 tygodni, a następnie w sposób ciągły'. Kury otrzymały dalsze dawki przypominające w odstępach 2-3-miesięcznych, tak, że pozostawały w stanie hiperimmunizacji. Przeciwciała oczyszczono metodą rozcieńczenia w wodzie według Akita i Nakai, 1993 (18). Po usunięciu precypitatu przez wirowanie, nadsącz zamrożono w -20°C w porcjach po 30-70 ml.

Miano przeciwciał w preparacie końcowym zbadano metodą immunoblot.

Przykład 2

Opis przypadku

Podczas pierwszej kolonizacji układu oddechowego przez Pseudomonas aeruginosa, dwóch pacjentów z mukowiscydozą leczono doustnie ciprofloksacyną i inhalacjami z kolistyny albo tobramycyny przez 3 tygodnie. Równocześnie z antybiotykoterapią, rozpoczęli codzienne płukanie gardła (przez 2 minuty) roztworem według przykładu 1, a następnie połykali przeciwciała przeciwko Pseudomonas aeruginosa. Po okresie trzech tygodni, pacjenci wciąż otrzymywali przeciwciała według powyższej procedury, ale bez antybiotyków, w sumie przez ponad 30 miesięcy (odpowiednio, 26 i 4 miesiące). Wszystkie hodowle z plwociny podczas pierwszego okresu leczenia były negatywne pod względem Pseudomonas aeruginosa (0 pozytywnych na 28 = 0%; co należy porównać z badaniem z Kopenhagi, opisanym wyżej, w którym pozytywnych było 49 na 214 = 23%, p < 0,005). Tak więc, osiągnięto całkowitą eradykację Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych pacjentów z mukowiscydozą. Wynik ten wskazuje wyraźnie, że leczenie przez płukanie gardła i przełykanie przeciwciał przeciwko Pseudomonas aeruginosa według wynalazku skutecznie chroni przed przewlekłą kolonizacją przez bakterie. Efekt ten jest wywołany prawdopodobnie miejscowym działaniem przeciwciał ptasich w jamie ustnej i/lub krtani, ponieważ przeciwciała po połknięciu ulegają rozłożeniu przez proteolityczne enzymy jelitowe i nie przenikaj ą do krwi.

Dla tych pacjentów, korzystna jest dawka około 50 mg IgY na dzień. Podjęto środki zapobiegawcze w celu uniknięcia zakażenia bakteryjnego roztworów, które następnie trzymano w -20°C. Pacjenci z mukowiscydozą mieli pobierać butelkę z 30-70 ml roztworu z zamrażalnika każdego dnia rano i płukać gardło tym roztworem po południu przez 2 minuty, a następnie połknąć.

Przypadek 1. 21-letnia kobieta z mukowiscydozą. Diagnozowano przy urodzeniu przez badanie przesiewowe na albuminy w smółce (179 mg/g suchej masy smółki), a następnie przez badanie potu (Na 101, Cl 122 mmol/kg potu). Podczas pierwszych trzech tygodni życia wystąpiły ciężkie powikłania. Częste stolce i wymioty, z utratą ciężaru ciała z 3430 g do 2930 g, mimo znacznego apetytu. Po wdrożeniu odpowiedniej terapii (enzymy trzustkowe, karmienie piersią, dodatkowe witaminy, namiot z nawilżaniem, fizykoterapia i antybiotyki przeciwgronkowcowe przy każdym zakażeniu dróg oddechowych) zaczęła przybierać na wadze i znajdowała się w dość dobrym stanie. Jej wzrost zawsze wynosił nieco powyżej średniej dla wieku, osiągając w końcu 169 cm; jej ciężar ciała zwykle wynosił poniżej średniej dla wieku, ze znacznym spadkiem w wieku 7-8 lat, średnią osiągnęła dopiero w 15 roku życia. W ostatnich dwóch latach ciężar ciała wynosił około 53 kg, t j. BMI (wskaźnik ciężaru ciała) wynosił 18,6. Od wieku 7,5 lat w plwocinie stwierdzano Staphyiococcus aureus, i okazjonalnie Hemophilus influenzae albo Proteus mirabilis. Zdjęcia rentgenowskie płuc wykazywały niewielki, ale ciągły postęp zmian typowych dla mukowiscydozy, zaś czynność płuc pogarszała się stopniowo pod względem FVC (nasilona pojemność życiowa) o około 75%, i FEV1 (frakcja 1-minutowa nasilonej objętości wydechowej) do około 50% przewidywanych wartości dla wieku 19 lat. Pierwsza kolonizacja Pseudomonas aeruginosa w listopadzie 1989. Leczono ją

189 128 skutecznie azactamem i gentamycyną iv w dwóch okresach po 14 dni każdy, oraz dodatkowo ciprofloksacyjnąw trakcie drugiego kursu.

Po leczeniu, flora w plwocinie powróciła do wcześniejszego wzorca Staphylococcus aureus i Hemophilus influenzae do sierpnia 1994. Wtedy to bakterie zostały wyeliminowane po 14-dniowym kursie leczenia ceftazydymem i tobramycyną iv.

Jednakże, już w styczniu 1995 ponownie stwierdzono u niej w plwocinie Pseudomonas aeruginosa. W tym momencie zdecydowano podać kurs według modelu kopenhaskiego (2) z cyprofloksacyną 750 mg x 3 doustnie i kolistymą2 miliony jednostek x 2 w inhalacji, przez 3 tygodnie i w tym samym czasie rozpocząć płukanie gardła i przełykanie ptasich przeciwciał przeciwko Pseudomonas aeruginosa. Codzienne przyjmowanie przeciwciał prowadzono od tamtego momentu obecnie 26 miesięcy). Nie stwierdzono ponownego pojawienia się Pseudomonas aeruginosa, zaś wzorzec bakterii w plwocinie powrócił do normy. Nie stwierdzono nigdy ' przeciwciał precypitujących ani przeciwciał przeciwko Pseudomonas aeruginosa w surowicy. Nie obserwowano objawów niepożądanych we krwi (białe i czerwone krwinki, trombocyty, enzymy wątrobowe i wartości kreatyniny). Obraz rentgenowski płuc pozostał zasadniczo niezmieniony od 1995, jak również wartości testów czynności płuc (FVC 75% i FEV1 45% wartości przewidywanych). Jest niezwykle aktywną kobietą, zaś jej sprawność robocza (150 wat) musi być uznana za bardzo wysoką w świetle jej ciężkiej choroby.

Przypadek 2. 17-letnia dziewczynka z mukowiscydozą.

Podczas pierwszych dwóch lat życia wystąpiły nawracające obturacyjne zapalenia oskrzeli, częste stolce tłuszczowe i słaby przyrost ciężaru ciała (9,5 kg w wieku 2 lat). W tym czasie przeprowadzono badanie potu i stwierdzono mukowiscydozę. Wdrożono intensywne leczenie. Ciężar ciała powrócił do wartości średniej, ale wysokość ciała leżała na krzywej -2SD i zatrzymała się na wysokości 151 cm. Jej główną dolegliwością były częste bóle brzucha o typie „zespołu niedrożności odcinka dalszego jelita (DIOS)”. Obraz płuc był zawsze bardzo dobry - minimalne zmiany w obrazie radiologicznym, badania czynnościowe płuc były powyżej średniej dla wieku i wzrostu (szczególnie RV (objętość zalegająca): 1,14 = 186% przewidywanej). Jej sprawność robocza (120 wat) jest niemal normalna. W plwocinie zawsze hodowano Staphylococcus aureus i/lub Hemophilus influenzae do listopada 1996, gdy po raz pierwszy wyhodowano Pseudomonas aeruginosa. Otrzymała natychmiast 3-tygodniowy kurs leczenia ciprofloksacyną 750 mg x 2 doustnie i tobramycyną 320 mg x 2 w inhalacjach (kolistyna nie była dostępna). Równocześnie rozpoczęto płukanie gardła i przełykanie ptasich przeciwciał przeciwko Pseudomonas aeruginosa, co trwa do dziś. Pseudomonas eradykowano całkowicie i od tej pory (obecnie 4 miesiące) w jej plwocinie występują zwyczajne bakterie. Obecnie czuje się dobrze.

Równie dobre wyniki uzyskano dla innych 9 pacjentów, zaś wyniki przemawiają za profilaktycznym i terapeutycznym efektem leczenia zakażeń dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa ptasimi przeciwciałami według wynalazku. W 30 hodowlach z plwociny podczas okresu leczenia dwóch pacjentów opisanych powyżej nie stwierdzono hodowli pozytywnych pod względem Pseudomonas aeruginosa. W przeciwieństwie, w opisanym wyżej badaniu z Kopenhagi, stwierdzono 23% pozytywnych hodowli, zaś 75-100% pacjentów miało przynajmniej jedną hodowlę pozytywną podczas okresu obserwacji podobnego do opisanego w wynalazku.

189 128

Literatura

1. Hoiby N., Pseudomonas infection in Cystic fibrosis, In Cystic Fibrosis, Current topics: Vol. 1, edited by Dodge JA, Brock D.J.H. & Widdicombe J.H., John Wiley & Sons Ltd., London, 1993, pp 251-268.

2. Valerius N.H., Koch C., Hoiby N., Prevention of chronic Pseudomonas aeruginosa colonisation in cystic fibrosis by early treatment; The Lancet 1991; 338; 725-726.

3. Szaff M., Hoiby N. and Flensborg E.W.; Frequent antibiotic therapy improves survival of cystic fibrosis patients with chronic Pseudomonas aeruginosa infection; Acta Pcediatr Scand 72:651-657, 1983.

4. Larsson A., B&ów R.-M., Lindahl T.L. and Forsberg P.-O. (1993) Chicken IgG: Utilizing the evolutionary advantage; Poultry Science, 72, 1807-1812.

5. Ahren CM., Svennerholm AM. (1982) Synergistic protective effect of antibodies against E. coli enterotoxin and colonization factor antigens. Infec. Immun. 28, 74.

6. Larsson A. and Lindahl T.L. (1993) Chicken antibodies: A tool to avoid interference in immunological assays; Avian immunology in progress, 62, 97-102.

7. Larsson A., Wejaker P.-E., Forsberg P.O. and Lindahl T.L. (1992) Chicken antibodies: A tool to avoid interference by complement activation in ELISA; J. Immunol. Methods (1992) 156, 79-83.

8. Larsson A. and Sjoquist J. (1988) Chicken antibodies: A tool to avoid false positive results by rheumatoid factor in latex fixation tests; J Immunol. Methods 108, 205-208.

9. Lindahl T.L., Festin R. and Larsson A. (1992), Studies of fibrinogen binding to platelets by flow cytometry: An improved method for detection of platelet activation; Thrombosis and Haemostasis, 68, 221-225.

10. Larsson A. and Lindahl T.L. (1993), Chicken anti-protein G for the detection of small amounts of protein G. Hybridoma, 12, 143-147.

11. Larsson A. and Mellstedt H. (1992), Chicken antibodies: a tool to avoid interference by human anti-mouse antibodies in ELISA after in vivo treatment with murine monoclonal antibodies; Hybridoma 11, 33-39.

12. Bartz C.R., Conklin R.H., Tunstall C.B. and Steele J.H., Prevention of murine rotavirus infection with chicken egg yolk immunoglobulins; J. Infect. Dis., 142: (1980) 439.

13. Ebina T., Tsukada K., Umezu K., Nose M., Tsuda K., Hatta H., Kim M. and Yamamoto T., Gastroenteritis in suckling mice caused by human rotavirus can be prevented with egg yolk immunoglobulin (IgY) and treated with a protein-bound polysaccharide preparation (PSK); Microbiol. Immunol., 34: (1990) 617.

14. Hiraga C., Kodama Y., Sugiyama T. and Ichikawa Y., Prevention of human rotavirus infection with chicken egg yolk immunoglobulins containing rotavirus antibody in cat; J Jpn. Assoc. Infect. Dis, 156: (1990) 118.

15. Ikemori Y., Kuroki M., Peralta R.C., Yokoyama H. and Kodama Y., Protection of neonatal calves against fatal enteric colibacillosis by administration of egg yolk powder from hens immunized with K99-piliated enterotoxigenic Escherichia coli; Am. J. Vet. Res, 53: (1992) 2005.

16. O'Farrelly C., Branton D. and Wanke CA, Oral ingestion of egg yolk immunoglobulin from hens immunized with an enterotoxigenic Escherichia coli strain prevents diarrhoea in rabbits challenged with the same strain; Infect. Immun, 60: (1992) 2593.

17. European Patent Office publication number 225 254 Bl.

18. Akita, EM and Nakai, S. (1993) Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. Coli strain. J Immunol. Methods, 60, 207-214.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie przeciwciał ptasich skierowanych przeciwko antygenowi/patogenowi wywołującemu infekcje układu oddechowego do wytwarzania roztworu farmaceutycznego do leczenia i/lub zapobiegania infekcjom w jamie nosowej, zatokach przynosowych, pierścieniu limfatycznym gardła, krtani, tchawicy, oskrzelach, oskrzelikach, 'i/lub pęcherzykach, przeznaczonego do podawania przez stosowanie miejscowe w jamie ustnej i/lub gardle.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że infekcje układu oddechowego spowodowane są przez bakterie, wirusy lub grzyby.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że infekcje układu oddechowego spowodowane są przez gatunki Pseudomonas.
4. 4. Zastosowanie według dowolnego zastrz. 1-3, znamienne tym, że lek podaje się przez płukanie gardła i/lub przełykanie.
5. 5. Zastosowanie według dowolnego zastrz. 1-3, znamienne tym, że lek podaje się ludziom wykazującym zwiększoną podatność na zakażenia.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że zwiększona podatność na zakażenia wynika z mukowiscydozy.