JPS606637B2 - モノメチルアミンの定量法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はモノメチルアミンの定量法に関する。

モノメチルアミンは、皮革工業に於いては皮なめし‘こ
用いられ、有機化合物合成工業に於いてはメチル基を導
入する際に用いられる有用な化合物である。また該モノ
メチルアミンは人体に対して悪影響を与える危険性を有
し、一方食品の腐敗の過程においてアミノ酸の分解に伴
って生成することから、それを定量することは食品衛生
上重要であるばかりでなく食品の腐敗の程度を知る手掛
りとなる。さらにまた臨床化学の分野において糞尿中の
モノメチルアミンは腸内細菌の状態および窒素化合物の
代謝異常を知る手掛りともなる。従って、モノメチルア
ミンの定量を行うことは皮革工業、有機化合物合成工業
の製造管理分析の立場から重要であるばかりでなく食品
の安全性を認知する上で、また生体内の異常を診断する
意味で極めて重要なことである。

従来、試料中のモノメチルアミンを測定する方法として
は、例えばモノメチルアミンを２・４−ジニトロフェニ
ル誘導体としたのちペーパークロマトグラフィーで分析
する方法〔ェー・ェム・アサトール（ＡＭ．Ａｓａｔｏ
ｏｒ）；ジヤーナル・オブ・クロマトグラフィー（Ｊ．
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．）、第４巻、第１４４頁、１９
６申王〕、ガスクロマトグラフィ一による方法〔ェス・
アール・ダン等（Ｓ．Ｒ．Ｄｕｎｎｅｔａｌ．）；アナ
リテイカル・ケミストリー（ＡＭＩ．Ｃｈｅｍ．）第４
群登、第４１〜４４頁、１９７句王〕、は操作が非常に
煩雑である欠点を有する。また、アルカリ性でモノメチ
ルアミンをＴ．Ｎ．ＢＳ．（２・４・６ートリニトロベ
ンゼンスルフオン酸ナトリウム塩）水溶液と反応させ、
４２仇仇で比色定量する方法（Ｔ．Ｎ．Ｂ．Ｓ法）〔テ
ィ・オクャマ等（Ｔ○ｋｕｙａｍａｅｔａｌ．）；ジヤ
ーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．）第４７巻「第４５４頁、１９６の王〕、クエン酸
緩衝液（ｐＨ５）中でモノメチルアミンをニンヒドリン
試薬と加熱反応させ、５７加川で比色定量する方法〔ィ
ー・ィヱム等（Ｅ．Ｙｅｍｍｅｔａｌ．）；アナリスト
（Ａｎａｌｙｓｔ）第８０巻、第２０９頁、１９５５手
〕およびオルトーフタルアルデヒドを用いて第１級アミ
ンを蟹光発色させ「励起波長３４仇肌、蟹光波長４５５
ｎので蟹光強度を測定する方法〔ェム・ロス（Ｍ．Ｒｏ
比）；アナリティカル・ケミストリー（Ａｈａｌ．Ｃｈ
ｅｍ．）第４３巻、第８８０頁、１９７１年〕の方法等
が挙げられるが、これらはいずれもモノメチルアミンに
対して特異的でないため精度が悪く、ペーパークロマト
グラフイ−、ガスクロマトグラフイ一、またはイオン交
換クロマトグラフィーと組合せる必要があり操作が煩雑
である等の欠点を有している。また、メチルアミン脱水
素酵素を使用する方法〔アール・アール・イエデイ（Ｒ
．Ｒ．Ｅａｄｙ）ら；バイオケミカル・ジャ−ナル（Ｂ
ｊｏｃｈｅｍ．Ｊ．）第１０６巻、第２４５〜２５５頁
、１９６８王〕は、電子受容体として別にフヱナジン・
メトサルフエイトおよび２１６−ジクロロフヱノールー
インドフェノールの試薬を必要とする欠点を有する。そ
こで、本発明者等は、上記実情に鑑み、種々検討した結
果、モノメチルアミンを定量すべき試料に、モノメチル
ァミン酸化酵素を作用させ、生成するホルムアルデヒド
、アンモニアまたは過酸化水素の量を測定することによ
り、極めて簡便な操作で、短時間にモノメチルアミンの
定量が出来、しかもその感度も極めて良好に測定出釆る
こと等の知見を得、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、モノメチルアミンを定量すべき試
料に、モノメチルアミン酸化酵素を作用させ、該反応に
より生成するホルムァルデヒド、アンモニアまたは過酸
化水素の量を測定することにより試料中のモノメチルア
ミンを定量することを特徴とするモノメチルアミンの定
量法である。

以下、本発明について詳細に説明する。本発明において
、モノメチルアミンを定量すべき試料としては、モノメ
チルアミンを含有するものであれば、如何なるものでも
良く、例えば、肉、魚などの食品、糞、尿、およびメチ
ルグアニジン含有試料にメチルグアニジン分解酵素を作
用させ、該反応により得られるモノメチルアミン含有液
等が挙げられる。

なお、上記試料のうち固形物含量の多い試料は粉砕機、
スラィザー等で粉砕、もしくは薄片状としたもの「ある
いはさらに必要によりこれらをホモジナィザ一等でホモ
ジナィズしたものを「冷水もしくは温水等で抽出して得
た抽出液等として用いることが好ましい。

そして上記試料のｐＨは、無調整でも良いが、これを適
宜なｐＨ調整剤、例えば塩酸、硫酸、硝酸、水酸化ナト
リウム、水酸化カリウム等により、ｐＨ５〜１０、好ま
しくはｐＨ６〜９に調整することが望ましい。

上記試料は、そのままあるいは水、緩衝液等で適宜な濃
度となる如く希釈して定量に用いられる。

次に前述の如く調整した試料にモノメチルアミン酸化酵
素を作用させて、モノメチルアミンをホルムアルデヒド
、アンモニアおよび過酸化水素に分解する。

これに使用するモノメチルアミン酸化酵素としては、微
生物、動物、植物等如何なる起源のものでも良い。

例えばバチルス属等の微生物により生産されるモノメチ
ルアミン酸化酵素を使用する場合、このモノメチルァミ
ン酸化酵素生産菌を培養して得られる菌体より常法によ
り抽出して得た粗酵素液、該粗酵素液を常法により精製
して得られた精製酵素、あるいは該粗酵素液もしくは該
精製酵素を常法により固定化して得られる固定化酵素等
が好適に用いられる。モノメチルアミン酸化酵素を生産
する微生物の具体例としては、例えばバチルス・ェスピ
ー・Ｎ−１０１が挙げられる。

上記のバチルス・ェスピー・Ｎ−１０１はいずれも本発
明者等が土壌中より新に検索して得た菌で、その菌学的
性質は以下に示す通りである。

バチルス・ェスピ−・Ｎ−１０１の菌学的性質（ａ｝
形態■ 細胞の形および大きさ：１．５〜２×３〜５ミ
クロンの短樟菌。

■ 細胞の多形性の有無：無し。

■ 運動性の有無：周鞭毛を有し、運動性有り。

■ 胞子の有無：有り。

■ グラム染色性：陽・性。

｛ｂ｝ 各培地における生育状態 ■ 肉汁寒天平板培養 ３０００、４細時間の培養で、直径０．５〜１側の円形
コロニー。

表面は平滑で黄色を呈し光沢がある。■ 肉汁寒天斜面
培養 ３０００、４糊寺間の培養で、糸状で、生育は弱い。

表面は平滑で黄色を呈し、光沢がある。■ 肉汁液体培
養３０００、４糊寺間の静暦培養でわずかに濁りを生ず
る。■ 肉汁ゼラチン穿刺培養 ２０００、４２日間の静瞳培養でゆっくりとゼラチンを
液化。

■ リトマスミルク培養 ３０００、１４日間の静暦培養で変化なし。

（ｃ｝ 生理的性質■ 硝酸塩の還元：弱いながら還元
。

■ 脱窒反応：陽性、ガスの生成なし。

■ Ｍ旧テスト；陰性。

■ ＶＰテスト：陰性。

■ インドールの生成：生成しない。

■ 硫化水素の生成：生成しない。

■ デンプンの加水分解：弱いながら分解する。

■ クエン酸の利用：利用する。

■ 無機窒素源：利用しない。

■ 色素の生成：生成しない。

■ ゥレアーゼ：陽性。

■ オキシダーゼ：陰性。

■ カタラーゼ：陽性。

■ 生育の範囲： 温度：１５〜４４００。

ｐＨ：５〜９．５。

■ 酸素に対する態度：好気性。

■ ○−Ｆテスト（Ｈｕ幼いｉｆｓｏｎ法）：陰性。

■ 炭素源の利用：フラクトーヌより酸の生成。

■ メタノールの資化性を有する。

なお上記バチルス・ェスピー（ＳＰ．）・Ｎ−１０１は
工業技術院微生物工業技術研究所に徴工研条客第５叫号
（ＦＥＲＭＢＰ−５９）として寄託されている。

次に、上記した菌学的性質を有するバチルス・ェスピー
・Ｎ−１０１の分類学上の位置についてバーヂーズ・マ
ニュアル・オブ・デタミネイテイフ・バクテリオロジィ
第８版（１９７４手）の分類と対比検討した結果、本菌
は芽胞子を形成すること、樟菌であること、好気性菌で
あること、カタラーゼ生産能を有すること、およびグラ
ム陽・性菌であることからバチルス属に属するものと判
定された。

そして、さらに本菌を既知バチルス属に属する種と対比
すると、細胞の大きさが非常に大きい（１．５〜２×３
〜５ｒ）ことから、バチルス・セレウス、同アンスラン
ス、同チユーリンジエンシス、同メガテリウムに近似し
ているが、本菌をこれらの菌と対比すると、本菌はグル
コースから酸を生成しないこと、メタノ−ル資化性を有
することが相違するので、バチルス属に属する新菌種の
菌と判定された。

次に、バチルス・ェスピ−・Ｎ−１０１の培養により得
られるモノメチルアミン酸化酵素の理化学的性質を示す
と、次のとおりである。

【１｝ 作用 本酵素は公知のアミン酸化酵素と同様に水と酸素の存在
下においてモノアミンのアミノ基を酸化的に脱アミノし
てアルデヒド、アンモニア、過酸化水素を生成するが、
モノメチルアミンにきわめて基質特異性が高いという特
徴を有する新規なアミン酸化酵素である。

モノメチルアミンを基質にした場合、下記反応式の如く
、モノメチルアミン１モルにつき、１モルの水と１モル
の酸素を要求し、１モルのホルムアルデヒド、１モルの
アンモニア、１モルの過酸化水素を生成する。ＣＨ３Ｎ
Ｈ２十ＱＯ＋０２→ＨＣＨＯ＋Ｎ比十日２０２■ 基質
特異性精製された本酵素に対して下表のような種々の基
質（ｌｏｗＭ）を作用させ、酵素活性を測定した結果、
下表の通り本酵素はモノメチルアミンに高い基質特異性
を示した。

なお、本酵素はモノメチルアミンに対して靴値が６．２
×１０‐５Ｍ（ｐＨ９．０）ときわめて低く、その濃度
が低い場合でもモノメチルアミンに対して基質特異性の
高し、モノメチルアミン酸化酵素であることが認められ
た。第１表 ‘３’力価測定法 基質モノメチルアミン塩酸塩を０．１ＭのＫＨ２Ｐ０４
−Ｎａ２Ｂ４０７緩衝液（ｐＨ７．０）中に、溶かして
基質濃度ｌｍＭに調製する。

この基質溶液１．０の‘もこ同じ緩衝液で稀釈した酵素
液０．１の上を混和し、３０℃で１び分間反応させた後
刊−ＫＯＨＩ地加え酵素反応を停止する。このような酵
素反応によりモノメチルアミンは酸化分解され、該酵素
反応停止液にはホルムアルデヒド、アンモニアおよび過
酸化水素が生成する。次いで、酵素反応停止液に０．１
％の４−アミノ−３−ヒドラジノ−５−メルカプト−１
・２・４−トリアゾール（以下ＡＨＭＴと略的する）の
０．即日ＣＩ溶液を１泌加え、３０００で１５分間反応
させたのちこれに０．７５％ＫＩ０４の０．州ＫＯＨ溶
液を１肌加え、充分に櫨拝し、得られた発色液を透明セ
ルに入れ、５５仇爪での吸収を測定し、前記ホルムアル
デヒドを定量する。

このような測定条件で、１分間にモノメチルアミンを酸
化し、１マイクロモル（Ａｍｏｌ）のホルムアルデヒド
を生成する酵素量を１単位として、活性を表示する。

（４｝ 至適ｐＨ 緩衝液として、０．１モルＫＨ２Ｐ０４一Ｎａ２ＨＰ０
４緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）、０．１モルＫＨ２Ｐ
０４−Ｎａ２Ｂ４０７緩衝液（ｐＨ６．０〜９．５）、
０．１モルヴェロナ−ル（Ｖｅｒｏｎａｌ）緩衝液（ｐ
Ｈ７．５〜９．５）、０．１モル日３Ｂ０４−Ｋｃｌ−
Ｎａ２Ｃ０３緩衝液（ｐＨ８．０〜１１．０）および０
．１モルＮａ２Ｃ０３一ＮａＨＣ０３緩衝液（冊８．５
〜１０．５）を使用してモノメチルアミン酸化酵素の各
ｐＨにおけるモノメチルアミンに対する酵素活性を測定
した結果、至適ｐＨは８〜９であると認められた。

｛５｝ 軸安定性 緩衝液として、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５、４．
０）、０．１Ｍ・ＫＨよ０４−Ｎａ２ＫＯ７緩衝液（Ｆ
Ｈ５．０、６．０、７．０ト８．０、９．０）、０．１
Ｍ、Ｖｅｒｏｎａｌ緩衝液（ｐＨ８．０、８．５ ９．
０）０．１ＭＮａ２Ｃ０３−ＮａＨＣ０３緩衝液（ｐＨ
ＩＯ．０、１１．０）を用い、ｐＨ３．５〜１１におい
て３０００で３粉ご間それぞれ保持した後に、酵素活性
を測定した結果、第２図に示す如く安定ｐＨ範囲は６〜
９であると認められた。

■ 熱安定性 本酵素をｐＨ７．０で各温度で１び分間処理後、１のＭ
のモノメチルアミン溶液を基質として、本酵素の残存活
性を測定すると第３図に示す如く、７０００以上で完全
に失活する。

また、同様にＰＨ９．０では６３００以上で完全に失活
する。‘７｝ 作用適温の範囲０．１モルＫＨ２Ｐ０４
−ＮａＢ４０７緩衝液により反応系のｐＨを７．０に設
定し、各温度における酵素活性を調べ、また、０．１Ｍ
・Ｖｅｍｎａｌ緩衝液により反応系のｐＨを９．０に設
定し、各温度における酵素活性を調べたところ、第４図
に示す如く「最適作用温度はｐＨ７のとき、４０〜５０
００付近、ｐＨ９のとき３０〜４０ｑｏであると認めら
れた。

｛８） ＰＨによる失活の条件３０ｑｏでＰＨ３．０以
下およびＰＨＩ沙〆上で完全に失活する。

｛９） 阻害 阻害剤無添加時の酵素活性値を１００とし、それぞれ終
濃度５肌ＡになるようＫＣＮ、８ーオキシ・キノリン、
〇ーフエナントロリン、ジエチルチオカルバミン酸ナト
リウムを加え、ｐＨ９温度３０００で１０分間処理後の
残存活性は各々５．７、３４．０、７０．９５９．３％
であった。

また終濃度ｌｍＭになるようにＨｇＣ１２、パラクロロ
マーキュリ安息香酸、モノョード酢酸、ヨードアセトア
シド、塩酸セミカルバジドを加え、同様に処理した後の
残存活性は０、０．７、３４．０、２．２、０％であっ
た。（１０｝ 安定化 ２％（Ｗ／Ｖ）ショ糖、乳糖を添加することにより安定
化される。

ＯＵ 精製方法 培養物を遠心分離して湿潤菌体を集菌し、得られた菌体
を０．０１％リゾチーム０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に懸濁し、３７０で１時間熔菌する。

次に０．４％エチルィミンポリマー水溶液を２．５％添
加し生成した沈澱を遠心分離で除去した後上情液則ち、
粗酵素液を得る。この粗酵素液を硫酸アルモニゥムで塩
析し、０．３５飽和から０．５飽和迄の沈澱区分を得た
。

この沈澱を少量の、０．５ＭＫＣＩ含有０．０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、トョパールＨＷ−５
＄（東洋曹達製）の充填カラムを用い、同一緩衝液で流
速１の上／分でゲル薄遇クロマトグラフィーを行う。得
られた活性区分を０．１Ｍ−ＫＨ２Ｐ０４−Ｎａ２Ｂ４
０７緩衝液（ｐＨ８）で透析後、オメガーアミノヘキシ
ルアガロース（マイルズ．ラボラトリー製）充填カラム
に同一緩衝液で吸着した。

禾吸着区分を充分に溶出した後０．２ＭＫＣＩを含有す
る同一緩衝液で溶出する親和クロマトグラフィーを行う
。活性区分は０．００１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
に透析後、同じ緩衝液に平衡化したハイドロオキシアパ
タイド（バイオラツド製）を充填したカラムに吸着し、
リン酸濃度を０．０１Ｍ、０．０２Ｍと段階的に上昇さ
せ最後に０．０８Ｍを使用して本酵素の活性区分を分駁
する。このようにして得られた活性区分をイオン交換水
を用いて透析後凍結乾燥し、本発明の精製酵素粉末を得
る。

この精製酵素はポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
り測定した結果、本発明のこの酵素は霞気泳動的に均一
である。

０２ 分子量 本発明の酵素の分子量はトョパールＨＷ−５＄を用いた
ゲル櫨過法〔Ｐ．仇ｄｒｅ船（１９６５）Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．、Ｖｏｌ ９６、５９５〕で測定したところ、
３２００００であった。

次にモノメチルアミンを定量すべき試料に、モノメチル
アミン酸化酵素を作用させる際、該酵素の添加量は、モ
ノメチルアミンを定量すべき試料中のモノメチルアミン
舎量、反応条件等により適宜調整される。

そして、試料に、モノメチルアミン酸化酵素を作用させ
る際の分解温度は、２０〜６０ｏｏ、好ましくは３０〜
５０℃であり、該温度で前記酵素を添加した試料を、静
層もしくは燈辞しつつモノメチルアミンを分解するのに
充分な時間、好ましくは５〜６０分酵素反応させて、モ
ノメチルアミンをホルムアルデヒド、アンモニアと過酸
化水素とに酵素分解する。

なお、モノメチルアミン酸化酵素は公知の方法によって
アガロース、カラギーナンなどの担体またはナイロン膜
、セロフアン膜などの膜に固定化し、固定化酵素カラム
または固定化酵素膜として定量に用いることもできる。
次いで、ホルムアルデヒド、アンモニアまたは過酸化水
素の含有量を夫々公知の方法で測定する。

なお、試料にモノメチルアミン酸化酵素を作用させる際
に、試料中に既にホルムアルデヒド、アンモニアまたは
過酸化水素等が存在している場合には、予めそれらの含
有量を夫々公知の方法で測定しておき、それらの値を上
述の酵素分解反応により生成するホルムアルデヒド、ア
ンモニアまたは過酸化水素の含有量より差し引いて算出
する。次に、ホルムアルデヒドの測定法としては、如何
なる測定法を用いても良いが、例えば、■アンモニウム
塩存在下でアセチルァセトン試薬と反応し、生成するデ
イアセチルデイヒドロルチジンを比色定量する方法〔テ
ー・ナッシュ（Ｔ．Ｎａｓｈ）：バイオケミカル・ジヤ
ーナル（ＢｉｏｃｈｅｍＪ．）第５５蓋、第４１６〜４
２１頁、１９５３手〕、■上記■で得られるディアセチ
ルディヒドロルチジンを蟹光測定する方法〔ェス・ベル
マン（Ｓ．茂ｌｍａｎ）：アナリテイ力・ケミ力・アク
タ（抑ａｌ．ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）第２９巻、第１２０
〜１２６頁、１９６３年〕、■硫酸酸性下クロモトロプ
酸ナトリウムと加熱反応して、この呈色を比色定量する
方法〔ィー・サミキ等（Ｅ．Ｓａｍｉｃｈｊｅｔａｌ．
）：アナリテイカル・ケミストリー（Ａｎａｌ．ｃｈｅ
ｍ．）第３４巻、第１４６０〜１４６４頁、１９６２王
〕、■アルカリ性下で前述のＡＨＭＴと反応後、過ヨウ
素酸で酸化し、呈色度を比色する方法〔アール・ジー・
ディケンソン等（Ｒ．Ｇ．Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎｅｔａｌ
．）：ケミカル・コミニケーション（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍ
ｍ．）第１７１９〜１７２０頁、１９７位主〕および■
ホルムアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（Ｆｏｒｍａｌｄ
ｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅ順ｓｅ）を用いて酸化し
、ＮＡＤＨの生成を比色定量する方法〔ゼット・ビー」
ローズ等（Ｚ．Ｂ．Ｒｏｓｅｅｔａｌ．）：メソージ・
イン・エンザイモロジー（ＭｅｍｏｄｓｉｎＥ皿ｗｍｏ
ｌｏ期）第９巻、第３５７〜３６０頁、１９６６年〕が
挙げられる。

またアンモニアの測定法としては如何なる測定法を用い
ても良いが「例えば■ネスラー反応を用いて測定する方
法、■インドフェノール反応を行ない比色定量する方法
および■アンモニア電極を用いる方法等が挙げられる。

また過酸化水素の測定法としては「如何なる測定法を用
いても良いが、例えば■オルソ・ディアニシジン（０−
ｄｉａｎｊｓｉｄｉｎｅ）を水素供与体としてベルオキ
シダーゼを作用させ、生成する色素を比色定量する方法
〔エッチ・ポール等（日．ｐａ山ｅｔａｌ．）：クリニ
カル・ケミストリー（ｄｉｎ．ｃｈｅｍ．）第１母筈、
第４２７〜４３０頁、１９７位王〕、■４−アミノアン
チピリンとフェノールの共存下ベルオキシダーゼを作用
させ「生成する色を比色定量する方法〔ピー・トリンダ
ー（Ｐ．Ｔｒｉｎｄｅｒ）：アナルス。クリニカル・バ
イオケミストリー（Ａｎｎ。ｃｌｉｎ。Ｂｉｏｃｈｅｍ
）第６巻、第２４頁、１９６単モ〕、■２４帥肌での吸
光度の増加を測定する方法〔アール・ヱフ・ビール等（
Ｒ．Ｆ．Ｂｅｅｒｅｔａｌ．）ごジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．）第１９５頁、第１３３頁、１９５２年〕、■メタノ
−ルの存在下カタラーゼを作用させ、生成するホルムア
ルデヒドを測定する方法および■カタラーゼを作用させ
「生成する酸素ガスをマノメー夕で測定するか、酸素電
極で測定する方法等が挙げられる。次にホルムアルデヒ
ド、アンモニアまたは過酸化水素量と０．Ｄ．値あるい
は相対蟹光強度の相関を求め、これを基にして標準検量
線を作成することが必要である。

そこで試料中のモノメチルアミン量とＯＤ．値との相関
を検討するため以下の実験を行った。実験例 １ アンモニウム塩存在下でアセチルアセトン試薬と反応さ
せ生成するディアセチルディヒドロルチジンを比色定量
することによる、モノメチルアミン量の測定１ 試薬の
調整 （１｝ モノメチルアミン酸化酵素液 モノメチルアミン塩酸塩０．１％（ＷノＶ）（以下％は
ことわりない限りＷ／Ｖとする）、グルコース１％、酵
母エキス１％、リン酸二カリ０．１％、硫酸マグネシウ
ム０．０５％、硫酸第１鉄０．０１％、塩化マンガン０
．０１％および水からなる培地（ｐＨ７．２）２でを縄
梓式小型培養装置（いわしや社製）の培養槽に入れて高
圧滅菌したものに、バチルス・ェスピー・Ｎ−１０４（
徴工研条寄第５９号「 ＦＥＲＭ ＢＰ−５９）の保存
スラントに滅菌生理的食塩水を加えて得た繭体懸濁液２
０叫を接種し、３０ｏｏで４８時間通気縄拝深部培養を
行った。

このようにして得た培養液を遠心分離して得た湿潤菌体
を２％トリトンＸ−１０の容液４００の‘に懸濁し、３
０ｏｏで１時間放置して溶菌した。

次いで、沈澱部を遠心分離機により除去して、上清（粗
酵素液）を得、これに常法により硫酸アンニウム０．５
飽和量添加し、塩析して生成した沈澱区分を集め、これ
を０．０１モル・リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し
たものを同一緩衝液で透析脱塩してモノメチルアミン酸
化酵素液１８０のと（酵素活性１。

３８単位／机上）を得た。

■ アセチルアセトン試薬 ２モル・酢酸アンモニウム溶液（酢酸を加えてｐＨ６．
０に調製したもの）にアセチルアセトンを０．２％加え
溶解する。

‘３｝ 緩衝液 ０．１モル・リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）｛４｝ モノ
メチルアミン溶液（標準液）塩酸モノメチルアミンを１
００仏そ中に ０．００７、０．０１５、０．０３、０．０６、０．１
２、０．２３、０．４６、０．９２マイクロモル（仏ｍ
ｏｌｅ）含有するように、上述の緩衝液に溶解。

０ モノメチルアミンより生成するホルムアルデヒドの
測定。

上述の各種濃度のモノメチルアミン溶液（標準液）１０
０仏〆それぞれに、上述したモノメチルアミン酸化酵素
液１００仏〆および上述した緩衝液１．８机‘を加え充
分混和したのち、３７０で３０分間静置条件下で反応さ
せた。

次いで得られた酵素反応物に上述したアセチルアセトン
試薬２机を加え充分混合したのち３７℃で４粉ふ間静暦
条件下で発色反応を行わせた。

このようにして得られた発色反応液は、モノメチルアミ
ン濃度が０．１２マイクロモル（１２０ナノモル）以下
の低い区分については励起波長４１かの、蟹光波長５１
仇肌で蟹光測定し（第１図参照）、モノメチルアミン濃
度が０．０３マイクロモル以上の高い区分については４
１か肌の波長で比色定量した（第２図参照）。なおブラ
ンク値は、上記操作において「モノメチルアミン酸化酵
素液１００〆〆に代えて緩衝液ｌｏｏ仏夕を用いる以外
は全く同様にして測定したものである。

そして、得られた５１仇仇に於る相対鞍光強度値よりブ
ランク値を差し引いた相対蟹光強度値、または得られた
４１か肌に於る０．Ｄ．値よりブランク値を差し引いた
０．Ｄ．値と、モノメチルアミン量の相関を求めたとこ
ろ、それぞれ第１図または第２図に示す如き結果が得ら
れた。

この結果よりモノメチルアミン量と上記相対蟹光強度値
または０．Ｄ．値との間には直線的な相関があり、充分
標準検査線として用いることができることが判明した。
次に、モノメチルアミン含有液にモノメチルアミン酸化
酵素を作用させ該反応により生成する過酸化水素を、４
ーアミノアンチピリンとフェノールの共存下において、
ベルオキシダーゼと反応させ生成する色を比色定量する
ことにより、モノメチルアミンを定量することについて
実験例を挙げて説明する。

実験例 ２ １ 試薬の調整 ■ モノメチルアミン酸化酵素液 上記実験例１で得たモノメチルアミン酸化酵素液（酵素
活性１．３８単位／の‘）を限外薄遇システム（旭化成
社製ミニモジュール・Ｍ−３）を用いて１の音‘こ濃縮
し、これを０．５モルのＫｃｌを含む０．０１モルリン
酸緩衝液で平衡化したトョパールＴＳＫ−５＄（東洋曹
達製）を充填したカラムに通過し、高速ゲル猿過クロマ
トグラフィーを行った。

次いで、この操作の活性区分を集め、これを０．０５モ
ルのＫｃｌを含む０．０１モル・リン酸緩衝液で透析し
、同一緩衝液で平衡化したオメガーアミノヘキシル．ア
ガロース（マイルズ・ラボラトリイズ製）カラムに吸着
させたのち、同一緩衝液で不純蛋白を充分に溶出除去し
、次いでＫｃｌ濃度を０．２モルにあげた０．０１モル
・リン酸緩衝液でアフイニティークロマトグラフイ−を
行つた。

このようにして得られた活性区分を蒸溜水を用いて透析
し、凍結乾燥してモノメチルアミン酸化酵素の精製酵素
標品（酵素活性１８筆位ノの９）を得た。

これを０．５の９とり、０．１モル・リン酸緩衝液５の
‘に溶解して、酵素液とした。■ 緩衝液 ０．１モル・リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）■ ４−アミ
ノアンチピリンーフェノール−ベルオキシダーゼ試薬（
発色試薬）４ーアミノアンチピリン１６．２の９とフエ
ノール１３１．７の９を０．１モル・リン酸緩衝液に熔
解し、更にベルオキシダーゼ（西独国べーリンガーマン
ハィム製、約１００単位／の９の標品）１００山筆位（
１０の９）を溶解し、総量を緩衝液で１００の‘とする
。

■ モノメチルアミン溶液（標準液） 塩酸モノメチルアミンを１００仏〆中に ０．０３０ ０．０７入 ０．１４６ ０．２９２、０
．５８４、１．１６８マイクロモル含有するように上記
緩衝液に溶解。

ロ モノメチルアミンより生成する過酸化水素の測定。

上述した各種濃度のモノメチルアミン溶液それぞれ１０
０仏夕に上述した緩衝液１．８の‘を加え「更に上述し
たモノメチルアミン酸化酵素液１００仏そを加え３７ｑ
０で２び分間静置条件下で反応させた。このようにして
得られた反応液に上述した４ーアミノアンチピリンーフ
エノール−ベルオキシダーゼ試薬２風とを加え、充分混
和したのち３７００で１び分間発色反応を行い、得られ
た発色液を５０仇肌の波長で比色定量した。なおブラン
ク値は、上言己操作においてモノメチルアミン酸化酵素
液１００仏のこ代えて緩衝液１００山夕を用いる以外は
全く同様にして測定したものである。

（後述の実施例２についても同様）。そして、夫々得ら
れた５０仇のにおける０．Ｄ．値よりブランク値を差し
引いた０．Ｄ．値と、モノメチルアミンの相関を求めた
ところ「第３図に示す如き結果が得られた。

この結果よりモノメチルアミン量と〇Ｄ．値との間には
直線的な相関があり、充分標準検量線として用いられる
ことが判明した。

以上の説明から明らかなように、本発明によれば、極め
て簡単な操作で、短時間にしかも感度と精度が非常に良
好にモノメチルアミンを定量することができる。

次に、メチルグァニジン含有試料にメチルグアニジン分
解酵素を反応させ、該反応生成物（モノメチルアミソ含
有液）にモノメチルアミン酸化酵素を作用させ、生成す
るホルムアルデヒドを測定して、メチルグアニジンを定
量する。

実験例 ３ １ 試薬の調製 ｍ メチルグアニジン分解酵素液 グリセリン１．０％（Ｗ／Ｖ）（以下％はことわりのな
い限りＷ／Ｖとする）、メチルグアニジン硫酸塩０．２
％、ＩＪ・ン酸ニナトリウム０．１％、硫酸マグネシウ
ム０．１％、酵母エキス０．０５％、硫酸第１鉄０．０
１％、塩化マンガン０．０１％および水からなる培地（
ｐＨ７．２）２そを、損梓式小型培養装置（いわしや社
製）の培養槽に入れて高圧滅菌したものに、上記培地と
同一組成の培地（ｐＨ７．２）で４８時間培養したアル
カリゲネスＮ−２４３（徴工研菌客第４３６ヅ号、ＡＴ
ＣＣ Ｎｏ．３１３７０）の種菌液２０机‘を接種し、
３０００で４斑寺間通気櫨拝深部培養を行つた。

このようにして得た培養液を遠０分離して得た湿潤菌体
１７夕を、０．０５ Ｍ・ベロナール緩衝液（ｐＨ９．
０）５０の‘に懸濁し、超音波破壊機（ブロンソン社製
）で氷冷しつつ１０分間細胞を破壊した。

次いで、沈澱部を遠心分離機により除去したのち、上清
（粗酵素液）４８の‘（酵素活性：４３．３単位／泌）
を得た。

さらに上記粗酵素液を常法により硫酸アンモニウムを用
い塩折して生成した沈澱区分を水２５肌に熔解したもの
を、０．０５Ｍ・トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８−０）を
用いて透析し、メチルグアニジン分解酵素液（酵素活性
；６０．５単＆ノの【）を得た。

‘２）炭酸緩衝液 ０．１モル炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨＩＯ．０）（３１モノメチルアミン酸化酵素液 実験例１の方法により得られたものを使用する。

■ アセチルアセトン試薬 実験例１の方法により得られたものを使用する。

｛５｝ 緩衝液 実験例１の方法により得られたものを使用する。

■ メチルグアニジン溶液（標準液） 硫酸メチルグアニジンを１００山そ中に ０．００３７、０．００９２、０．０１８４、０．０３
６９ ０．９２２マイクロモル（Ａｍｏｌｅ）含有する
ように、０．１モル炭酸緩衝液（ｐＨＩＯ．０）に溶解
する。

ロ 操作各種濃度のメチルグアニジン溶液（標準液）１
００仏〆それぞれに、０．１Ｍ炭酸緩衝液０．４の‘と
上述したメチルグアニジン分解酵素液１０仏〆を加え、
４５００で１５分間酵素反応を行った。

次いで反応終了液に０．１モルリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）１．４のＺを加え、更に上述したモノメチルアミン
酸化酵素液１００Ａ〆を加え４５００で１５分間酵素反
応を行った。次いで得られた酵素反応液にアセチルアセ
トン試薬２の‘を加え充分損拝し、４５００で２０分間
発色反応を行なわせた。次いで得られた発色液は励起波
長４１５ｎの、蟹光波長５１仇肌で蟹光測定した。なお
ブランク値は、上記操作において、メチルグアニジン分
解酵素液１０仏ク‘こ代えて緩衝液１０〆そを用いる以
外は全く同様にして測定したものである。

そして、夫々得られた蟹光波長５１触れにおける蟹光強
度値よりブランク値を差し引いた相対蟹光強度値と、メ
チルグアニジンの相関を求めたところ、第４図が得られ
た。

この結果よりメチルグアニジン量と相対蚤光強度値との
間には直線的な相関があり、充分標準検量線として用い
ることができることが判明した。

以下実施例を示して、本発明を更に詳細に説明する。

実施例 １ モノメチルアミン含有試料液１００山そに、前述の実験
例１で調製したモノメチルアミン酸化酵素液１００仏そ
および実験例１で調製した緩衝液１．８の‘を加え充分
混和したのち、３７ｑ０で３０分間静置条件下で反応さ
せた。

次いで得られた酵素反応物に実験例１で調製したアセチ
ルアセトン試薬２のとを加え、充分混和したのち、３７
０で４粉ご間静暦条件下で発色反応を行なわせた。

次いで得られた発色反応液は４１松風の波長で比色定量
した。

なおブランク値は、上記操作においてモノメチルアミン
酸化酵素液１００ぶれこ代えて緩衝液１００仏夕を用い
る以外は全く同様にして測定したものである。

そして得られた４１か肌における０．Ｄ．値からブラン
ク値を差し引いた０．Ｄ．値は０．８３２であった。

この値から第２図の標準検量線を使ってモノメチルアミ
ン量を求めると、試料１００ムそ中に０．４２５マイク
ロモルのモノメチルアミンが含まれていることが判明し
た。実施例 ２ モノメチルアミン含有試料液１００仏〆に、実験例２で
調製した緩衝液１．８の‘を加え、更に実験例２で調製
したモノメチルアミン酸化酵素液１００仏〆を加え、３
７００で２０分間静暦条件下で反応させた。

このようにして得られた反応液に実験例２で論製した４
ーアミノアンチピリンーフェノールーベルオキシダーゼ
試薬２の‘を加え、充分混和したのち３７０で１淵ご間
発色反応を行い得られた発色液を５００ｎ肌の波長で比
色定量した。

そして、５０瓜机における０．Ｄ．値よりブランク値を
差し引いた０．Ｄ．値を求めたところ、０．０９８であ
った。

そこで、この値を第３図の標準検量線を使って、モノメ
チルアミン量を測定すると、試料液１００ムク中０．０
６２マイクロモルのモノメチルアミンが含まれているこ
とが判明した。実施例 ３ メチルグアニジン含有試料液１００仏〆に、実験例３で
調製した０．１Ｍ・炭酸緩衝液０．４叫とメチルグアニ
ジン分解酵素液１０山そを加え、４５００で１５分間酵
素反応を行った。

次いで得られた酵素反応終了液に０．１モルリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）１．４の‘を加え、更に実験例１で調
製したモノメチルアミン酸化酵素１００仏〆を加え、４
５℃で１５分酵素反応を行った。次いでこの酵素反応終
了液に実験例１で調製したアセチルアセトン試薬２の‘
を加え、充分濃拝したのち、４５ｑ０で２び分発色反応
を行った。次いで得られた発色液は室温に１５分放置し
、励起波長４１５ｎの、蟹光波長５１０ｎｍで蟹光測定
した。そして、５１ｍｍにおける相対笛光強度値から、
ブランク値を差し引いた値は１．７５であった。この値
を第４図の検量線を使ってメチルグアニジン量を求める
と、試料１００仏そ中に０．０６３マイクロモルのメチ
ルグアニジンが含有されていることが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、生成ホルムアルデヒドがアンモニウム塩存在
下でアセチルアセトン試薬と反応し、生成するジアセチ
ルデヒドロルチジンを鞍光定量及び比色定量する方法に
よるモノメチルアミン量と相対蟹光強度値の相関を示す
グラフ（標準検量線）、第２図は同方法によるモノメチ
ルアミン量と０．Ｄ．値の相関を示すグラフ（標準検量
線）、第３図は４ーアミノアンチピリンとフェノールの
共存下ベルオキシダーゼを生成する過酸化水素と作用さ
せ、生成する色を比色定量する方法によるモノメチルア
ミン量と０．Ｄ．値の相関を示すグラフ（標準検量線）
および第４図はメチルグアニジン含有試料にメチルグア
ニジン分解酵素を反応させ、該反応生成物にモノメチル
アミン酸化酵素を作用させ、生成するホルムアルデヒド
を測定する方法によるメチルグァニジン量と相対蟹光強
度値の相関を示すグラフ（標準検量線）である。 弟’図弟之図第３図 第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ モノメチルアミンを定量すべき試料に、モノメチル
   アミン酸化酵素を作用させ、該反応により生成するホル
   ムアルデヒド、アンモニアまたは過酸化水素の量を測定
   することにより、試料中のモノメチルアミンを定量する
   ことを特徴とするモノメチルアミンの定量法。 ２ モノメチルアミン酸化酵素がバチルス属の細菌によ
   り生産されるモノメチルアミン酸化酵素である特許請求
   の範囲第１項記載のモノメチルアミンの定量法。 ３ モノメチルアミンを定量すべき試量が、メチルグア
   ニジン含有試料に、メチルグアニジン分解酵素を作用さ
   せ、該反応により得られたモノメチルアミン含有液であ
   る特許請求の範囲第１項または第２項記載のモノメチル
   アミンの定量法。