PL189542B1

PL189542B1 - N1-(2,2-dimetylo-1S-(pirydyn-2-ylokarbamoilo)-propylo)-N4-hydroksy-2R-izobutylo-3S-metoksy-sukcynoamid, kompozycja farmaceutyczna zawierająca ten związek i jego zastosowanie

Info

Publication number: PL189542B1
Application number: PL97340494A
Authority: PL
Inventors: Raymond Beckett; Mark Whittaker; Andrew Miller; Fionna Mitchell Martin
Original assignee: Vernalis Oxford Ltd
Priority date: 1997-11-13
Filing date: 1997-11-13
Publication date: 2005-08-31
Also published as: NO20002480L; PL340494A1; EP1030842A1; DE69720554T2; WO1999025693A1; ATE236126T1; AU740420B2; CA2310593A1; DE69720554D1; TW474919B; GB2333524A; TR200001353T2; PT1030842E; KR20010031879A; HUP0002811A3; NZ503642A; NO20002480D0; RU2198164C2; EP1030842B1; JP2001523666A

Abstract

1. N 1 -[2,2-dimetylo-1S-(pirydyn-2-ylokarbamoilo)propylo]-N4 -hydroksy-2R-izobutylo- -3S-metoksysukcynoamid o wzorze II albo jego farmaceutycznie dopuszczalna sól. 2. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ze zawiera N 1 -[2,2-dimetylo-1S - -(pirydyn-2-ylokarbamoilo)-propylo]-N4 -hydroksy-2R-izobutylo-3S-metoksy-sukcyno- -amid albo jego farmaceutycznie dopuszczalna, sól oraz farmaceutycznie dopuszczalny nosnik. 4. Zastosowanie N 1 -[2,2-dimetylo-1S-(pirydyn-2-ylokarbamoilo)-propylo]-N4 -hydro- -ksy-2R-izobutylo-3S-metoksy-sukcynoamidu albo jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów, raków, stwardnienia rozsianego, zespolu Guillain-Barre'a lub luszczycy u ssaków, równiez u ludzi. PL PL PL

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest N--[2,2-dimetylos-S-[pirydyry2-ylokarbamo-[lo)-propylo]-N⁴-hydroksy-2R-[zobutylo-3S-metoksy-suUc)^κ)amid i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole, kompozycja farmaceutyczna zawierająca ten związek jako substancję czynną oraz jego zastosowanie do wytwarzania kompozycji.

W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 95/19956 (British Biotech Pharmaceuticals Ltd) opisano i zastrzeżono klasę związków będących inhibitorami metaloproteinazy macierzy (MMP) i inhibitorami uwalniania czynnika martwicy nowotworu (TNF-α) z komórek. W szczególności, w zgłoszeniu zastrzeżono związki o wzorze ogólnym I:

w którym X oznacza grupę o wzorze -CO2H lub -COłNHOH;

189 542

Ri oznacza atom wodoru; grupę (Ci-Có) alkilową; (C2-Ce) alkenylową; fenylową; podstawioną fenylową; fenylo (C i-Ce) alkilową; podstawioną fenylo (Ci-Có) alkilową; heterocyklilową; podstawioną heterocyklilową; heterocyklilo (Ci-(Ce) alkilową, podstawioną heterocyklilo (Ci-Ce) alkilową; grupę o wzorze BSOnA-, w którym n wynosi 0, 1 lub 2, a B oznacza atom wodoru lub grupę (Ci-iCe) alkilową, fenylową, podstawioną fenylową, heterocyklilową, (C ι-Ce) acylową, fenacylową lub podstawioną fenacylową, a A oznacza grupę (Cty-Ce) alkilową; aminową; zabezpieczoną grupę aminową; acyloaminową; OH; SH; (Ci-Ce) alkoksylową; (Ci-Ce) alkiloaminową; di-(Ci-Ce) alkiloaminową; (Ci-Ce) alkilotiolową; arylo (Ci-Ce) alkilową; amino (Ci-Ce) alkilową; hydroksy (Ci-Ce) alkilową, merkapto (Ci-Ce) alkilową lub karboksy (Ci-Ce) alkilową, gdzie grupy aminowa, hydroksylowa, merkapto lub karboksylowa są ewentualnie zabezpieczone lub grupa karboksylowa została przeprowadzona w amid; niższą grupę alkilową podstawioną grupą karbamoilową, mono (niższa grupa alkilo) karbamoilową, di(niższa grupa alkilo) karbamoilową, di (niższa grupa alkilo)aminową lub karboksyniższy alkanoiloaminową;

R2 oznacza grupę (Ci-Ce) alkilową, (C2-Ce) alkenylową, (C2-Ce) alkinylową, fenylo (Ci--Ce) alkilową, heteroarylo (Ci-Ce) alkilową, cykloalkilo (Ci-Ce) alkilową lub cykloalkenylo (Ci-Ce) alkilową, z których każda może być ewentualnie podstawiona jednym lub więcej podstawnikiem spośród następujących: grupa (Ci-Ce) alkilowa, —O (Ci-Ce) alkilowa, -S (Ci-Ce) alkilowa, atom fluorowca, grupa cyjanowa (-CN).

R3 oznacza grupę charakterystyczną występującego w przyrodzie lub nie a aminokwasu, w którym każde grupy funkcyjne mogą być zabezpieczone;

R4 oznacza grupę fenylową lub 5-cio lub 6-cio członowy pierścień heteroarylowy, w którym każdy atom azotu w pierścieniu może być utleniony do N-tlenku, który może być połączony z pierścieniem benzenowym lub z 5-, 6- lub 7-członowym pierścieniem heterocyklicznym i gdzie każdy z pierścieni może być ewentualnie podstawiony przez:

(a) jeden lub więcej podstawnik wybrany niezależnie spośród następujących: grupa hydroksylowa, atom fluorowca, grupa -CN, -CO2H, -CO₂(Ci-Ce) alkilowa, - (Ci-Ce) alkiloC02(Ci-Ce) alkilowa, -CONH₂, -COłNH(Ci-Ce) alkilowa, -CON(Ci-Ce) alkilo)₂, -CHO, -CH2OH, -(Ci-C0 perfluoroalkilowa, -O(Ci-Ce) alkilowa, -S(Ci-Ce) alkilowa, -SO(Ci-Ce) alkilowa, -SO₂(Ci-Ce) alkilowa, -NO₂, -NH₂, -fNH(Ci-Ce) alkilowa, -N((Ci-Ce)alkilo)₂i --NHCO(Ci-Ce) alkilowa lub (b) grupę spośród następujących: grupa (Ci-Ce) alkilowa, (C2-Ce) alkenylową, (C2-Ce) alkinylowa, (C3-Ce) cykloalkilowa, (C4-Ce) cy'kloalkenylowa, fenylowa, benzylowa, heteroarylowa lub heteroaryiometylowa, z których każda może być ewentualnie podstawiona jednym lub więcej podstawnikiem spośród następujących: atom fluorowca, grupa hydroksylowa, aminowa, karboksylowa, (Ci-^4) perfluoroalkilowa, (Ci-(Ce) alkilowa, -O(Ci-Ce) alkilowa lub -S(Ci-(Ce) alkilowa;

R5 oznacza atom wodoru lub grupę (Ci-Ce) alkilową; lub ich sól, hydrat lub solwat.

N i -[2,2-dimetylo-1S -(pirydyn-2-ylokarbamoilo)-propylo] -N⁴-hydroksy-2R-izobutylomS-metokssysukcyyoamid należy do klasy ogólnie ujawnionej i zastrzeżonej w WO 95/I9956, ale ani on, ani jego właściwości nie zostały poza tym wyszczególnione.

W WO 95/I9956 stwierdzono, że w ujawnionej klasie związków aromatyczny lub heteroarylowy podstawnik R4 na ogół wywiera niespodziewany i pożądany efekt zwiększający aktywność przeciw stromelizynie w porównaniu do znanych związków o podobnej budowie, ale zawierających inny (zwykle metylowy) podstawnik R4, przy zachowaniu aktywności przeciw kolagenazie i żelatynazie. Jako należący do tej klasy, obecnie wybrany związek, Ni-[2,2N i w, 2,2 yl 1 C f m yy r/pit ry» O nr- zylrnałb ra m, /in 1 — \ y*«ny 2 »1 xy 1 χτ4 no i^u^cK oo

-uniivLjiv-1 y-pi-in -nyui j^-au**

-keynoamid wykazuje te własności.

Jednakże wiadomo, że u niektórych zwierząt i pacjentów efektem ubocznym występującym po zastosowaniu dużych dawek i/lub długotrwałego podawania niektórych inhibitorów MMP jest ból mięśniowo-kostny (niekiedy nazywany również „zapaleniem ścięgna”) w stawach, na przykład ból ramienia. Mimo że uważa się, iż efekt ten, po zaprzestaniu podawania, jest w dużym stopniu odwracalny, jest on jednak niepożądany. Mechanizm powstawania bólu nie jest obecnie wyjaśniony i nie jest możliwe, jak dotąd, powiązanie tendeneci związku do

189 542 wywoływania bólu z konkretnymi cechami budowy lub profilem hamowania enzymu przez cząsteczkę. Zgodnie z powyższym, to czy dany inhibitor MMP spowoduje efekt uboczny i, jeżeli spowoduje, określenie jaka będzie intensywność tego efektu, nie może być obecnie przewidziane i musi być zbadane doświadczalnie.

Stwierdzono obecnie, że wybrany N^{1 * *}-[2,2-climetylo-1S-(pirydyn-2-ylokarbamoilo)propylo]-N⁴-iydroksy-2R-izobutylo-3S-metoksy-sukcynoamid ma bardzo mocno zmniejszoną tendencję do wywoływania efektu ubocznego, czyli bólu mięśniowo-kostnego. W związku z tym różni się on od analogów o zbliżonej budowie, na przykład Ni-[2,2-dimetylo-lS-(pi-cydyn-η-ηlokkrramoilo)-propylo]-N⁴-hydroksy-ηR-izobutylo-3S-ηydroksysukcynoamidu, które mają większą tendencję do wywoływania efektu ubocznego.

W WO 95/19956 stwierdzono również, że ujawniona klasa akryloamidowych inhibitorów MMP obejmuje związki przyswajalne po podaniu doustnym. Nie wszystkie związki objęte zakresem wynalazku WO 95/19956 są w użytecznym stopniu przyswajalne po podaniu doustnym, co udowodniono, na przykład, przez pomiar maksymalnego poziomu aktywności inhibitora MMP lub poziomu aktywności w czasie („powierzchnia pod krzywą”) dla leku we krwi zwierząt po podaniu doustnym. Stwierdzono, że związek wybrany według niniejszego wynalazku Nl-[2,2-ηimetylo--S-(pirydyn-2-ηlokarbamoilo)-propylo]-N⁴-hydrokuy-2R-izo-butylo-3Ξ-ηιοΡΛΒγ-.-ηυνηοΛίηid jest przyswajalny po podaniu doustnym u ludzi i innych ssaków.

Połączenie przyswajalności po podaniu doustnym i zmniejszonej .skłonności do wywoływania ubocznych zapaleń ścięgien powoduje, że związek według wynalazku powinien umożliwiać stosunkowo szeroki terapeutyczny zakres leczenia chorób wymagających średniego lub długotrwałego ogólnoustrojowego podawania inhibitora MMP. Stąd, związek ten wskazany jest do leczenia, na przykład, reumatoidalnego zapalenia stawów, raków, stwardnienia rozsianego (SM), zespołu Guillain-Bar-re'a (GBS) i łuszczycy.

Tak więc przedmiotem niniejszego wynalazku jest N^l-[2,2-ηimetyΊo-1S-(pirydyn-2-γlo-kία·bamoilo)-propylo]cN⁴-hydroksy-ηR-Czobutylo-3S-metoksy-csιkc)yloamid o wzorze II:

i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Związek według wynalazku posiada trzy asymetryczne atomy węgla, których konfiguracja stereochemiczna jest taka, jaką podaje nazwa związku i przedstawia wzór II. Jednakże należy rozumieć, że wynalazek obejmuje mieszaniny enancjomerów związku o wzorze II, przy czym wyszczególniony enancjomer przeważa. Korzystnie, 90% wagowych lub więcej takiej mieszaniny enancjomerów stanowić powinien wyszczególniony enancjomer.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca Ni-[2,2-dimetylo-1S-Cpirydyn-2-ηlokarbamoilo)-propylo]cN⁴-hydroksy-ηR-izobutylo-3S-metokuy-cukcynoamid lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sol, wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Korzystnymi kompozycjami według wynalazku są kompozycje przystosowane do podawania doustnego.

Następnie przedmiotem wynalazku jest zastosowanie Ni-[2,2-dimetylo-1S-(pirydyn-2-yk)karbamoik))-propykή-N⁴-hydroksy-ηR-iz.obutylo-3S-meto0sy-cukcynoamίdu lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej si^oli do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów, raków, stwardnienia rozsianego (SM), zespołu GuilłamBarre'a (GBS) i łuszczycy u ssaków, również u ludzi.

Sole związku według wynalazku obejmują fizjologicznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasami, na przykład chlorowodorki, bromowodorki, siarczany, metanosulfoniany, p-tolu189 542

-enosulfoniany, fosforany, octany, cytryniany, bursztyniany, mleczany, winiany, fumarany i maleiniany. Sole mogą być również tworzone z zasadami, na przykład sole sodowe, potasowe, magnezowe i wapniowe.

Wybrany związek według wynalazku może być wytworzony sposobem opisanym w poniższym przykładzie i może być zastosowany do podawania w jakikolwiek sposób zgodny z jego własnościami farmakokinetycznymi. Kompozycje do podawania doustnego mogą mieć postać tabletek, kapsułek, proszków, granulek, pastylek do ssania, ciekłych i żelowych preparatów, takich jak doustne, miejscowe lub jałowe pozajelitowe roztwory lub zawiesiny. Tabletki i kapsułki do podawania doustnego mogą mieć postać pojedynczych dawek i mogą zawierać zwykłe rozczynniki, takie jak środki wiążące; wypełniacze, środki poślizgowe do tabletkowania, środki powodujące rozpad; lub dopuszczalne środki zwilżające. Tabletki mogą być powlekane sposobami dobrze znanymi w konwencjonalnej praktyce farmaceutycznej. Preparaty ciekłe do podawania doustnego mogą mieć postać, na przykład, wodnych lub olejowych zawiesin, roztworów, emulsji, syropów, eliksirów lub mogą być wytworzone jako suchy produkt do odtworzenia, przed zastosowaniem, z wodą lub innym odpowiednim nośnikiem. Takie ciekłe preparaty mogą zawierać zwykłe dodatki, takie jak czynniki wspomagające tworzenie zawiesiny; emulgatory; nośniki niewodne (obejmujące jadalne oleje); środki konserwujące; i, jeżeli to pożądane, zwykłe środki zapachowo-smakowe i barwniki.

Składnik aktywny może być również podawany pozajelitowo w jałowym medium. W zależności od zastosowanego nośnika i stężenia, lek może być albo zawieszony albo rozpuszczony w nośniku. W nośniku mogą być rozpuszczone dodatki wspomagające, na przykład środek miejscowo znieczulający, konserwant i czynniki buforujące.

Dawka związku według wynalazku do jakichkolwiek zastosowań klinicznych przy danym trybie podawania określana jest próbami klinicznymi, zgodnie ze zwykłą praktyką, prowadzącymi do osiągnięcia akceptacji fachowców w danej branży. Na ogół przypuszcza się, że związek będzie podawany ludziom doustnie w dawkach wielkości od 5 do 100 mg, dwa lub trzy razy dziennie.

Poniższy przykład opisuje wytwarzanie związku według wynalazku. Związki wyjściowe, kwas 2R-(2,2-dime4ylc)-5-okso--l,3]dioksolan-4S-ylo)-4-metylo-w-’alerianowy i L-tert-leucyno-N--2-pirrdyio)amid wytwarza się jak opisano w WO 95/19961.

W przykładzie stosuje się następujące skróty:

DMF N^-dimetyloformamid

EDC chlorowodorek N-etylo-N'-P3-dimetyloaminopropylo)kkrro0iimiyu

HOBt 1 -hydroksybenzotriazol

NMM N-metylomorfolina.

THF tetrahydrofuran

Przykład

Wytwarzanie N¹- [2,3-dimetdlo-1S-Ppiryydn-2-plokarbamoilo)-propdlo]pN⁴-hyyroksy-2R-izobutylo-3 S-metoksy-pukcydoarn idu

Etap A:

Wytwarzanie estru dimetylowego kwasu 2S-hydroksy-PR-izobutylo-burs:Zynowego Kwas 2R-(2,2plimetylp5-okso-id,3]yioksolan-4Spyίo)p4-metylo-pentanowd (75,0 g,

0,326 mmola) rozpuszcza się w metanolu (500 ml), schładza do temperatury 0°C i otrzymany roztwór nasyca gazowym chlorowodorem. Mieszaninę reakcyjną ogrzewa się do temperatury

189 542 pokojowej i miesza przez noc. Następnie rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszcza w dichlorometanie i przemywa kolejno nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu i solanką. Fazę organiczną suszy się nad bezwodnym siarczanem magnezu, przesącza i odparowuje do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymuje się tytułowy związek w postaci żółtego oleju (53 g, 75%).

'H-NMR; 5 (CDCls), 4.10 (1H, d, J = 4.0 Hz), 3.60 (3H, s), 3.50 (3H, s), 3.18 (br s), 2.78 (1H, m), 1.61-1.40 (2H, m), 1.28 (1H, m) i 0.76-0.73 (6H, m).

Etap B:

Wytwarzanie estru dimetylowego kwasu 2R-izobutylo-3S-metoksy-bursztynowego

Ester dimetylowy kwasu 2S-hydroksy-3R-izobutylo-bursztynowego (23,9 g, 110 mmoli) rozpuszcza się w DMF (200 ml), po czym dodaje destylowany jodometan (8,2 ml, 132 mmole), a następnie tlenek srebra (I) (27,95 g, 212 mmoli). Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 7 dni w temperaturze pokojowej bez dostępu światła. Rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszcza się na kolumnie chromatograficznej (silikażel, jako eluent stosuje się dichlorometan), w wyniku czego otrzymuje się tytułowy związek w postaci lepkiego żółtego oleju (19,16 g, 75%).

¹ H-NMR; 5 (CDCls), 3.83 (1H, d, J = 7.5 Hz), 3.71 (3H, s), 3.62 (3H, s), 3.30 (3H, s), 2.85 (1H, m), 1.65-1.39 (2H, m), 1.10 (1H, m) i 0.83-0.81 (6H, m).

Etap C:

Wytwarzanie soli dilitowej kwasu 2R-izobutylo-3S-metoksy-bursztynowego

Do roztworu estru dimetylowego kwasu 2Riizobutylo-3S-metoksy-blursztynowego (4,70 g, 20,0 mmoli) w metanolu (30 ml) i wodzie (30 ml) dodaje się wodorotlenek litu (1,76 g, 42,0 mmoli). Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, po czym rozpuszczalniki usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymuje się tytułowy związek w postaci żółtego ciała stałego (4,40 g, ilościowo).

'H-NMR; 5 (CD3OD), 3.52 (1H, d, J = 5.1 Hz), 3.27 (3H, s), 2.65 (1H, m), 1.56-1.53 (2H, m), 1.31 (1H, m) i 0.82-0.78 (6H, m).

Etap D:

Wytwarzanie estru 4-metylowego kwasu 2R-izobutylo-3Simetoksy-bursztynowego

Sól dilitową kwasu 2R^-izot^v^'ylk^^3S!-metoksy-^i^i^:^;zit^i^'^^ego (25,14 g, 116 mmoli) rozpuszcza się w suchym THF (150 ml) i roztwór schładza się do temperatury 0°C. Dodaje się bezwodnik trifluorooctowy (30 ml) i mieszaninę miesza się w temperaturze 0°C przez kolejne 4 godziny. Rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszcza się, w temperaturze 0°C, w bezwodnym metanolu (200 ml) i roztwór miesza się przez noc w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymuje się tytułowy związek w postaci żółtego oleju (54,3 g, zawiera 2 równoważniki trifluorooctanu litu), który stosuje się bez dalszego oczyszczania w etapie E.

'H-NMR; 5 (CD3OD), 7.71 (1H, d, J = 7.5Hz), 3.65 (3H, s), 3.24 (3H, s), 2.72 (1H, m), 1.56-1.42 (2H, m), 1.06 (1H, m) i 0.81-0.79 (6H, m).

Etap E

Wytwarzanie estru metylowego kwasu 3R-[2,2-dimetylo-1S-(pirydylokarbamoilo)-propylokarbamollo]-2S-metoksy-5-metylo-heksanowego

Produkt wytworzony w etapie D (25,06 g, w ilości równoważnej 53,7 mmola estru 4-metylowego kwasu 2Riizobutylo-3S-metoksy-bursztynowego) rozpuszcza się w DMF (200 ml) i dodając HOBt (8,70 g, 53,7 mmola), a następnie EDC (12,35 g, 64,4 mmola), roztwór schładza się do temperatury 0°C. Mieszaninę miesza się przez 2 godziny ogrzewając do temperatury pokojowej. Utworzony w ten sposób roztwór e'stru aktywnego schładza się do temperatury 0°C, dodaje L-te—-ieucyno-N-(2-pirydyjolamid (11,11 g, 53,7 mmola) i mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej przez noc. Rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszcza się w octanie etylu. Roztwór przemywa się kolejno 1 M roztworem wodorowęglanu sodu i solankę, suszy nad siarczanem magnezu, przesącza i odparowuje do sucha. Pozostałość oczyszcza się na kolumnie chromatograficznej (silikażel, 0 do 5% roztwór metanolu w dichlorometanie) i otrzymuje się tytułowy związek w postaci białego ciała stałego (13,41 g, 61%).

189 542 'H-NMR; 5 (CDCI3), 9.61 (1H, s), 8.47 (1H, m), 8.24 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.74 (1H, m), 7.07 (1H, m), 6.97 (1H, d, J = 8.9 Hz), 4.64 (1H, d, J = 8.9 Hz), 4.01 (1H, d, J = 7.6 Hz), 3.76 (3H, s), 3.41 (3H, 5), 2.75 (1H, m), 1.79 (1H, m), 1.51 (1H, m), 1.11 (1H, m), 1.02 (9H, s), 0.84 (3H, d, J = 6.3 Hz), i 0.82 (3H, d, J = 6.3 Hz).

Etap F:

Wytwarzanie soli litowej kwasu 3R42.2-dimetyk)-1S-pirydyn-2-vlokarbarnoiio)-propykokarbanx)ilo]-2S-metoksy-5-rnetylo-heksanowego

Ester metylowy kwasu 3Rl[2,2-dimetylOl1S-(pirydyn-2---okarbamoilo)-propylokarba-moilo]-2S-metoksy-S^n^e^tt^yi^^lic^l^s^^i^i^-wego (13,4 g, 32,9 mmola) rozpuszcza się w mieszaninie THF (365 ml) i wody (65 ml) i dodaje się monohydratu wodorotlenku litu (1,396 g, 33,3 mmola). Roztwór miesza się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, po czym odparowuje pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymuje się żółty olej, który następnie suszy się przez destylację azeotropową z toluenem. Produkt (13,4 g, zawierający resztkowy rozpuszczalnik) stosuje się natychmiast bez dalszego oczyszczania.

'H-NMR; 8 (CD3OD, mieszanina diastereoizomerów w stosunku 3.5:1), 8.31 (1H, m), 7.99 (1H, d, J = 8.3Hz), 7.66 (1H, m), 7.00 (1H, m), 4.49 (0.23H, s; uboczny diastereoizomer), 4.37 (0.77H, s, główny diastereoizomer), 3.68 (0.23H, d, J = 7.6 Hz; uboczny diastereoizomer), 3.52 (0.77H, d, J = 7.6 Hz; główny diastereoizomer), 3.21 (0.69H, s; uboczny diastereoizomer), 3.20 (2.31 H, s, główny diastereoizomer), 2.64 (1H, m), 1.53 (2H, br m), 1,18 (1H, m), 1.01 (9H, s), 0.85 (3H, d, J - 6.4 Hz) i 0.81 (3H, d, J = 6.3 Hz).

Etap G:

Wytwarzanie N'¼et^zyioksy-N^l-|2.2-dimetylOl1S-lpirydynl2-ylokarbamoilo)-propy]]-2R-zobutylo-3S-metokcyjukcynoamidu

Produkt wytworzony w etapie F (13,4 g, około 33 mmoli) rozpuszcza się w suchym DMF (250 ml) i umieszcza w atmosferze argonu, po czym schładza do temperatury -10°C mieszając. Następnie dodaje się kroplami chloromrówczan etylu (3,47 ml, 36 mmoli) i NMM (1,8 ml, 16,5 mmola). Mieszaninę miesza się przez 30 minut, po czym dodaje kroplami O-benzylohydroksy-oaminę (6 g, 49 mmoli) w DMF (10 ml). Mieszaninę reakcyjną ogrzewa się do temperatury pokojowej i miesza przez noc. Rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozdziela się pomiędzy octan etylu i solankę. Warstwę organiczną przemywa się 1M roztworem wodorowęglanu sodu, suszy nad siarczanem magnezu, przesącza i odparowuje. Pozostałość oczyszcza się metodą szybkiej chromatografii (silikażel, 5% roztwór metanolu w dichlorometanie). Frakcje zawierające żądany produkt łączy się i odparowuje. Produkt rozciera się z eterem dietylowym w celu usunięcia lekko zabarwionych zanieczyszczeń. Wydajność: 9,44 g, (58%, mieszanina diastereoizomerów w stosunku >10:1). ^lIT-NMIR δ (CDCI3, główny diastereoizomer), 10.26 (1H, s), 9.93 (1H, s), 8.32 (1H, m),

8.23 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.63 (1H, m), 7.25 (5H, m), 7.12 (1H, d, J - 9.2 Hz), 7.02 (1H, m), 4.94 (1H, d, J = 10.8 Hz), 4.76 (2H, d, J = 3.8 Hz), 3.88 (1H, d, J = 5.5 Hz), 3.32 (3H, s), 2.91 (1H, m), 1.72 (1H, m), 1.55 (1H, m), 1.35 (1H, m), 1.02 (9H, s), 0.89 (3H, d, J = 6.5 Hz) i 0.85 (3H, d, J = 6.5 Hz).

Etap H:

Wytwarzanie NI-[2,2-dimetylo-1S-(pirydyn-2--jokarbamoilo)-propylo]-N⁴-hydroksy-2R-lzobutylo-3S-metoksy-ruUccyloamidu

N⁴4^enzyjoksy-^I-[2,2-d.imetyio-IS-(pirydyn----k)0arbamoiio)lpropylo]-2R-lzobutjdo-k^-^r^met^^:t_v-sukccT^(^^^nnd rozpuszcza się w mieszaninie metanolu (75 ml) i etanolu (75 ml), po czym umieszcza w atmosferze argonu. Dodaje się 10*% pallad na węglu i przez roztwór przepuszcza się przez 2 godziny gazowy wodór, po którym to czasie analiza TLC (chromatografia cienkowarstwowa) wykazuje, że związek wyjściowy został całkowicie zużyty. Układ oczyszcza się przepuszczając przez niego argon, a katalizator odsącza się. Rozpuszczalniki usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymuje się tytułowy związek w postaci białego ciała stałego (8,8 g, ilościowo, mieszanina diastereoizomerów w stosunku 12:1), temperatura topnienia 163-164°C.

'H-NMR; δ ((CD₃)₂SO), 10.77 (1H, s), 10.13 (1H, s), 8.00 (1H, s) , 8.15 (1H, mn), 7.89 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.81 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.60 (1H, m), 6.93 (1H, m), 4.53 (0.12H, d, J = 9.4 Hz), 4.43 (0.88H, d, J = 8.8 Hz), 3.74 (0.12H, d, J = 10.0 Hz), 3.32 (0.88H, d, J = 9.8 Hz),

189 542

2.98 (0.3H, s), 2.96 (2.64H, s), 2.78 (1H, m), 1.23 (2H, m), 0.84 (10H, s i m), 0.65 (3H, d, J =6.4 Hz) i 0.56 (3H, d, J = 6.3 Hz).

^C-NMR; δ (CDjOD), 172.6, 170.0, 166.0, 151.5, 147.9, 136.0, 119.5, 113.6, 61.2, 60.6, 56.7, 46.2, 37.0, 34.0, 26.5, 25.2, 23.7 i 21.7. IR; υ,,,. (KBr), 3255, 2957, 1700, 1645, 1524, 1467, 1435, 1370, 1301, 1213 i 1152 cm’¹. Znaleziono: C 58.40, H 7.92, N 13.61%; C20H32N4O5. 0.2^0 Obliczono: C 58.29, H 7.92, N 13.60%.

Przykład biologiczny A

Zdolność związku według wynalazku do hamowania śródmiąższowej kolagenazy została określona zgodnie z procedurą podaną przez Cawstona i Barretta (Anal. Biochem., 99, 340-345, 1979), według której bada się 1 mM roztwór związku, lub jego rozcieńczenia, in^ubując w temperaturze 37°C przez 16 godzin z kolagenem i kolagenazą (w buforze 25 mM Hepes, pH 7,5 zawierającym 5 mM CaCl₂, 0,05% Brji 35 i 0,02% NaNf). Kolagen stanowił acetylowany ^MC kolagen wytworzony sposobem według Cawston i Murphy (Methods in Enoymolcgy, 80, 711, 1981), przytoczonym tu jako odnośnik. Próbki odwirowano w celu osadzenia nieprzereagowancgo kolagenu, a jednakowe objętości radioaktywnego supereatantu pobrano do oznaczenia w liczniku scyntylacyjnym, co jest miarą zajścia hydrolizy. Aktywność kolagenrz^ w obecności 1 mM testowanego związku, lub jego rozcieńczenia, porównano z aktywnością próby porównawczej nie zawierającej inhibitora, a wyniki podano poniżej, jako stężenie inhibitora wywołujące 50% hamowanie aktywności kolagenazy (IC50).

Zdolność związku według wynalazku do hamowania stiOmelizyny-1 określano zgodnie z procedurą według awstona i in. (Biochem. J., 195, 159-165, 1981), w której bada się roztwór związku o stężeniu 1 mM, lub jego rozcieńczenia, inkubując w temperaturze 37°C przez 16 godzin ze stromelizyną i ^HC acetytowaną kazeiną (w buforze 25 mM Hepes, pH 7,5 zawierającym 5 mM CaCl₂, 0,05% Brji 35 i 0,02% NaN^). Kazeinę stanowi ^UC acetylowaną kazeina wytworzona sposobem według Cawston i in. (ibid). Aktywność stromelizyny w obecności 1 mM badanego związku, lub jego rozcieńczenia, porównano z aktywnością próby porównawczej nie zawierającej inhibitora, a wyniki podano poniżej, jako stężenie inhibitora wywołujące 50% hamowanie aktywności stromelizyny (IC50).

Zdolność związku według wynalazku do hamowania żelatynazy 72 kDa określano w oparciu o metodę Sellersa i in., Biochem. J., 171, 493-496 (1979). Żelatynazę 72 kDa uzyskaną z komórek RPM--7951 oczyszczano metodą chromatografii żelatynowo-agarozcwej. Enzym aktywowano przez inkubację z octanem aminofenylortęci i około 0,05 jednostek ίίΑυbowano z 50 pg znakowanej izotopem promieniotwórczym [¹⁴C] żelatyny w odpowiednim buforze przez 16 godzin w temperaturze 37°C. Na końcu inkubacji, w celu zakończenia reakcji i wytrącenia pozostałego πieyoołcżonegc substratu, dodawano 50 pg albuminy z surowicy bydlęcej, wraz z kwasem trichlorooctowym (stężenie końcowe 16%). Probówki reakcyjne umieszczano w lodzie na 15 minut, po czym odwirowywano przy 10000 g przez 15 minut w celu sedymentacji wytrąconego substratu. Pobierano jednakowe próbki po 200 pl supereatantu z mieszaniny reakcyjnej i mierzono radioaktywność w liczniku scyntylacyjnym cieczowym. Wpływ inhibitora określano w odniesieniu do krzywej odpowiedzi na dawkę. Wartość IC50 (stężenia inhibitora powodujące 50% spadek aktywności enzymu) otrzymuje się przez dopasowanie krzywej do danych i obliczenie stężenia inhibitora koniecznego do uzyskania 50% hamowania enzymu. Dla każdej operacji wyznaczenia wartości IC50 zbadano wpływ co najmniej 8 stężeń inhibitora na aktywność żelatynazy. Inhibitory rozpuszczano i rozcieńczano DMSO.

Wyniki powyższych testów związku według wynalazku są następujące:

ΤΓ%- Akii

Kolagenaz.a	10
Żelatynaza 72 kDa	70
Stromelizyną	30

189 542

Przykład biologiczny B

Zmierzono w czasie stężenie związku według wynalazku we krwi zwierząt laboratoryjnych po podaniu związków testowych. Związek podano przez zgłębnik 6 samcom szczura (300 g) na grupę. Próbki krwi pobrano przez nakłucie żyły ogonowej 0,5, 1,0, 2,0, 6,0 i 24 godziny po podaniu. 0,4 ml krwi umieszczono w probówkach o pojemności 4,5 ml zawierających 0,1 ml kwasu cytrynowego-dekstrozy (ACD) jako antykoagulanta. Ekstrakcję przeprowadza się dodając 3ml metanolu, a strąconą krew sedymentuje się przez odwirowanie (30 minut przy 3000 obr./min). Pobiera się 2ml supematantu i zatęża przez liofilizację. Ekstrakt rozpuszcza się w 200 μΐ DMSO i 10 μΐ próbki bada się na aktywność inhibitora kolagenazy. Aktywność inhibitora w ekstraktach określa się stosując oznaczenie kolagenazy opisane powyżej w przykładzie biologicznym A, a stężenie inhibitora (czyli lek plus jakiekolwiek aktywne metabolity) otrzymuje się przez porównanie z krzywymi wzorcowymi. Wyniki wyrażone są jako maksymalne stężenie w ng/ml, jako powierzchnia pod krzywą (AUC) w ng/ml x godzina, przez 0,5-24 godziny i jako AUC w liczbie IC5qx godzina

Wyniki

Stężenie maksymalne AUC ng/ml 212

AUC (0,5-24 godz.) ng/mlxgodz. 2966

AUC (0,5-24 godz.) n IC50xgodz. 674

Związek według wynalazku testowano ponadto przez podanie doustne małpom marmozetom i zdrowym ludziom-ochotnikom i, po takim podaniu, stwierdzono we krwi badanych znaczące poziomy aktywności hamującej.

Przykład biologiczny C

Związek według wynalazku poddano testowi na dwóch zwierzęcych modelach raka i stwierdzono jego aktywność:

Model czerniaka myszy BI6

W tym modelu myszy C57/BL6J zaszczepiono podskórnie 10⁵ komórkami czerniaka mysiego BI6. Nowotwory rosły przez 18 dni, a masę nowotworu obliczano przez pomiary średnicy z następującego wzoru: masa (mg) - długość (mm) x szerokość (mm) ± 4. Grupie myszy (n=19) otrzymujących związek podano go przez mini-pompki osmotyczne wszczepione podskórnie w bok przeciwny do nowotworu BI6. Pompki wszczepiono na dzień przed wstrzyknięciem nowotworu, a związek podawano w dawce 360 pg/dzień. Grupa porównawcza (n=l7) otrzymywała odpowiednią objętość nośnika z identycznych, wszczepionych pompek.

Średnia waga nowotworów w grupie porównawczej w 18 dniu wyniosła 1145±97 mg. Waga nowotworów w grupie leczonej związkiem wyniosła 774±50 mg. Taka redukcja (32% dla testowanego związku) jest znacząca (p<0,005). Ocena próbek na końcu badania wykazała, że poziom testowanego związku w osoczu krwi wyniósł 26,8±3,2 ng/ml.

Model raka sutka MDA-435

W tym modelu zwierzęta zaszczepiono komórkami MDA-43 5 (10⁶ komórek/mysz), nowotwór wzrastał przez cztery dni, po czym zwierzęta losowo, względem masy nowotworu, podzielono na trzy grupy (n=T5 na grupę). W 5 dniu wszczepiono chirurgicznie minipompki zawierające nośnik albo testowany związek w stężeniu 15 mg/ml lub 60 mg/ml (dostarczające odpowiednio 180 lub 720 pg/mysz/dzień). 19 dnia wymieniono pompki, a badanie zakończono 32 dnia. Wystąpiło uzależnione od wielkości dawki hamowanie wzrostu nowotworu, wynoszące 19% przy pg/mysz/dzień i 33% przy 720 pg/mysz/dzień. Hamowanie przy wyższej dawce jest statystycznie znaczące (p<0,005). Ocena próbek na końcu badania wykazała, że poziom w osoczu krwi wyniósł 99±6 ng/ml i 136±42 ng/ml dla grupy traktowanej odpowiednio niższą i wyższą dawką.

Przykład biologiczny D

Związek według wynalazku testowano na skłonność do wywoływania zauważalnych objawów zapalenia ścięgien u szczurów. Efekt zapalenia ścięgien u szczurów wywoływany przez związek według wynalazku („związek A”) porównano z efektem izomeru o zbliżonej budowie, dokładnie N’-[2,2-dimetylo-lS-(pirydyn-3-ylokarbamoilo)-propylo]-N-hydroksy2R-izobutylo-3S-hydroksy-sukcynoamidu („związek B”).

189 542

Użyto samców szczura Lewis. W każdym badaniu ważono do 30 szczurów i losowo względem masy ciała dzielono na grupy, n=6/grupę. W każdym badaniu tworzono odpowiadającą grupę traktowaną nośnikiem, którą porównywano z grupą traktowaną związkiem.

Związek A przygotowano w postaci jego soli mesylanowej, podczas gdy związek B wytworzono w postaci wolnej zasady. Dla związku A przy stężeniu -5 mg/ml nośnik stanowił roztwór 50% MNSO, 37% 0,- M kwasu metanosulfonowego, -3% jałowej wody; a przy stężeniu 30 mg/ml nośnik stanowił 50% DMSO, 37% 0,2 M kwasu imetanosulfonowego. -3% jałowej wody. Dla związku B przy stężeniu ł5 mg/ml nośnik stanowił 50% DMSO/woda.

Minipompki osmotyczne Alzet (znak towarowy) (2ML2, -4 dni, 5 pl/godzinę z Alza Corp., Pało Alto CA 94303) zważono puste i pełne, aby upewnić się co do właściwego ich napełnienia. Przed wszczepieniem napełnione pompki umieszczono w inkubatorze w temperaturze 37°C. Wszystkie szczury poddano narkozie halotanem. Po podaniu narkozy ogolono i zdezynfekowano karki. Na przygotowanym miejscu wykonano podłużne nacięcie skóry, o długości około 2 cm i za pomocą hemostatycznych szczypczyków utworzono kieszeń pod skórą. Minipompki umieszczono w taki sposób, że wyjście pompki odwrócono od rany. Nacięcie zaszyto, a obszar wokół rany ponownie zdezynfekowano. Natychmiast po operacji wszystkim szczurom podano lek przeciwbólowy (Temgesic - znak towarowy - Reckitt and Colman) 0,ł mg/kg podskórnie w bok. Po obudzeniu z narkozy zwierzęta wróciły do klatek zaopatrzonych w suchą ściółkę, aby nie zanieczyścić rany przed jej zagojeniem. Następnego dnia wszystkie szczury umieszczono z powrotem na zwykłej ściółce i podzielono na grupy po 3 sztuki, aby umożliwić dokładniejszą obserwację objawów zapalenia ścięgien.

Po wszczepieniu minipompek szczury zważono i obserwowano pod kątem początków zapalenia ścięgien. Początek i zaawansowanie zapalenia ścięgien zmierzono na podstawie obserwacji w oparciu o system oceny (patrz poniżej). Szczury obserwowano codziennie przez -6 dni. Średnie wartości >2 uznano za znaczące.

Zastosowano następujący system oceny:

Półleżące:	Pobudzane do ruchu zwierzęta wykazywały:
Normalnie	0	Normalny ruch	0
Odpoczywały na jednej łapie	-	Neechęć do ruchu	1
Odpoczywały na leżąco	2	Średrna niechęć do ruchu	2
		Duża niechęć do ruchu	3

Chodzące:

Normalnie 0

Unikanie używania jednej tylnej łapy 1

Unikanie używania obu tylnych łap 2

Wyniki pokazały, że szczury potraktowane związkiem A (zarówno -5 mg/ml i 30 mg/ml) oraz jedynie nośnikiem nie wykazywały znaczących objawów zapalenia ścięgien, podczas gdy szczury potraktowane związkiem B wykazywały znaczące objawy od 8 dnia (średnia wartość >2 w dniu 8, wzrastająca do około 6 w dniu ł5 i -6).

Potwierdzone zostało, że do osocza szczurów traktowanych związkami A i B w powyższych testach dostarczane były związki z minipompek. Próbki krwi w 3 i -0 dniu po wszczepieniu minipompek pobrano od lekko znieczulonych halotanem szczurów przez żyłę ogonową. Próbki krwi (0,5 ml) umieszczono w probówkach zawierających 3,0 ml metanolu w celu ekstrahowania wolnego i związanego związku. Stężenie związku A i B we krwi wyznaczono fluorometrycznie stosując kumarynowy substrat peptydowy Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-DpaAla-Arg-NH2 (Mca = (7-metoksykumaryn-4-ylo)acetyl, Dpa = N-3--2, ^^--haminopropyl) (patrz Knight i in. FEBS Lett. -992, 296, 263-266). Badania zakończono -6 lub -7 dnia po wszczepieniu, szczury ostatecznie znieczulono halotanem i pobra189 542 no próbki krwi (0,5 ml) przez nakłucie serca, po czym wyznaczono stężenie związku A i związku B we krwi.

Przykład biologiczny E

Wpływ związku według wynalazku testowano na modelu zwierzęcym GBS

Doświadczalne autoimmunizacyjne zapalenie nerwu (EAN) jest wywoływaną przez komórki T chorobą aιltoimmunizacyjną obwodowego układu nerwowego. Model ten wykazuje wiele patologicznych cech GBS, z symptomami ataksji, słabnięcia i paraliżu. EAN może zostać wywołane po wstrzyknięciu zwierzętom mieliny z nerwów obwodowych lub składników białkowych mieliny, takich jak Białko 0 w środku wspomagającym. Zmiany patologiczne EAN pojawiają się w korzeniu nerwu rdzeniowego i nerwach obwodowych i cechuje je okołonaczyniowy naciek jednojądrowej komórki, demielinacja aksonów i spadek przewodności nerwowej. W patologii GBS i EAN udział bierze TNFa; u pacjentów z GBS we krwi występuje podwyższony poziom TNFa, a przeciwciała anty-TN^a zmniejszają zaawansowanie choroby w EAN (Hartung HP. Annals of Neurology 1993; 33; 563-567.).

Związek według wynalazku testowano na modelu EAN szczura, gdzie objawy choroby wywoływano iniekcją mieliny nerwów obwodowych w środku wspomagającym.

Związek podawano z chirurgicznie wszczepionych minipompek w stężeniu 15 lub 30 mg/ml z szybkością 5 pl/godz. (patrz przykład biologiczny D), dostarczając odpowiednio 7 i 14 mg/kg/dzień. Ciągłe traktowanie związkiem w czasie trwania eksperymentu w dniach 1-15 znacząco obniżyło rozwój objawów klinicznych w sposób zależny od wielkości dawki. Ponadto związek zmniejszył objawy kliniczne, w sposób zależny od wielkości dawki, w modelu EAN przy podawaniu leczniczym w stężeniu 15 lub 30 mg/ml z szybkością 10 pl/godz., co daje odpowiednio 14 i 28 mg/kg/dzień, w dniach 8-15.

Przykład biologiczny F

Aktywność związku według wynalazku względem doświadczalnego modelu SM:

Metoda

Zastosowano model SM nadwrażliwości typu opóźnionego opisany przez Matyszaka i Perry'ego (Matyszak MK & Perry VH. 1995. Demyelination in the central nervous system following a delayed type hypersensitivity response to bacillus Calmette-Guerin. Neuroscience 64; 967-977). Samce szczura Lewis znieczulono i wstrzyknięto im w prążkowie lewej półkuli lub buforowanego fosforanem roztworu soli zawierającego 105 zabitych wysoką temperaturą laseczek Calmette-Guerin (BCG). BCG wstrzyknięto stereotaktycznie przez 27G, strzykawką o pojemności 10 μ1. Współrzędne iniekcji: górna +1,2 mm, boczna +3,0 mm i głębokość 4,5 mm. Po 4 tygodniach w tylną kończynę wstrzyknięto śródskórnie 200 pl roztworu zawierającego 10⁷ zabitych wysoką temperaturą organizmów BCG w kompletnym dodatku Freunds. Po kolejnych 15 dniach szczurom wstrzyknięto dożylnie 2750U peroksydazy chrzanowej typu II (HRP). Trzydzieści minut później szczury głęboko uśpiono pentobarbitalem sodu, po czym dokonano perfuzji serca 100 ml 0,9% (wag./obj.) roztworu NaCl zawierającego 5000U/L heparyny, a następnie potraktowano 200 ml środka utrwalającego o składzie paraformaldehyd-1 izyna-nadjodan (PLP) zawierającego 2% paraformaldehydu i 0,05% glutaradehydu. Usunięto mózgi, następnie utrwalono przez kolejne 4 godziny w PLP i kriozabezpieczono przez zanurzenie w 30% sacharozie na noc w temperaturze 4°C przed osadzeniem w TissueTek O.C.T. (miles inc Elkhart USA) i zamrożeniem w ciekłym azocie. Cięto na warstwy o grubości 50 pm w płaszczyźnie czołowej w celu lokalizacji HRP metodą HankerYates'a (Perry VH i in. 1992).

Powyższa procedura wywołuje reakcję nadwrażliwości typu opóźnionego w obszarze stereotaktycznej iniekcji BGC, którą cechują: miejscowe przebicie bariery krew-mózg, co wykazano barwiąc pozanaczyniowe miejsca występowania. HRP; infiltracja limfocytów, co wykazano barwiąc przeciwciało OX-22, charakterystyczne dla wysokocząsteczkowej postaci zwykłego antygenu leukocytu; aktywacja leukocytów, którą wykazano barwiąc przeciwciało OX-6. charakterystyczne dla głównego antygenu zgodności tkankowej klasy II; i zniszczenie mieliny, co wykazano barwiąc przeciwciało głównego białka mieliny. Wszystkie te cechy są charakterystyczne dla aktywnych uszkodzeń lub płytek obserwowanych w ośrodkowym układzie nerwowym u pacjentów cierpiących na SM. Liczbę limfocytów określono zliczając dodatnie komórki OX-22 w najintensywniej zabarwionym obszarze. Liczba komórek w poje12

189 542 dynczym polu widzenia została zarejestrowana i wyrażona w komórkach/mm². Obszar wyrażania MHC klasy II, przeciek bariery krew-mózg i demielinację przeliczono stosując komputerowo wspomaganą analizę obrazu i wyjściowe dane podano w mm2.

Wpływ związku według wynalazku oceniono podając go doustnie szczurom 30 mg/kg dwa razy dziennie, rozpoczynając od 5 dnia po drugiej iniekcji BCG i podając aż do dnia 15. Związek według wynalazku znajdował się w nośniku będącym roztworem soli w buforze fosforanowym zawierającym 0,01% Tween 80. Zwierzęta grupy kontrolnej otrzymywały jedynie nośnik.

Obszary przecieku bariery krew-mózg, wyrażanie MHC klasy II, demielinację i liczbę komórek T u zwierząt traktowanych związkiem według wynalazku porównano z grupą kontrolną traktowaną jedynie nośnikiem, stosując test Students T.

Wyniki

U zwierząt traktowanych nośnikiem odpowiedź DTH charakteryzowało przebicie bariery krew-mózg, infiltracja limfocytów, wyrażanie MHC klasy II i demielinacja. U zwierząt traktowanych związkiem według wynalazku wystąpiło znaczne zmniejszenie obszaru przecieku bariery krew-mózg (p<0,05) i liczby infiltrujących limfocytów T (p<0,0001). Obserwowano również zmniejszenie obszaru demielinacji i wyrażania MHC klasy II, ale nie osiągnęły one znaczenia statystycznego.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

-. N¹ -[2,2--2-12-40-lS-Qylsdyn-2-yrokasbamaila)nropylo]-N⁴-hy24yhsd-0R-iy2Rytylo-3S-mntoksysukcynoamid o wzorze II albo jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
2. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera N--[2,2-dimetylo--S-Spirydyn-2-ylokaabamoilo)-propylo]-N⁴-hydroksy-yR-[zobutylo-3S-metoksy-sukcynoamid albo jego farmaceutycznie dopuszczalną sól oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
3. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że jest przystosowana do podawania doustnego.
4. Zastosowanie N S-(pirydyn-2-ylokarbamoilo)-propylo]-N⁴-hydro-ksy-yR-[zoOutylo-yS-mntoksy-sukcynoamidu albo jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów, raków, stwardnienia rozsianego, zespołu Guinam-Barr^a lub łuszczycy u ssaków, również u ludzi.