PL190991B1

PL190991B1 - Zastosowanie peptydu

Info

Publication number: PL190991B1
Application number: PL332003A
Authority: PL
Inventors: Suad Efendic
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1997-08-26
Publication date: 2006-02-28
Also published as: IL128740A0; CN1235611A; NO990915L; ATE418996T1; PL332003A1; WO1998008873A1; EP0964873B1; EA199900169A1; AU734140B2; KR20000035895A; UA58519C2; KR100365606B1; NZ334270A; DK0964873T3; US6006753A; DE69739189D1; EP0964873A1; CA2263802A1; ES2318861T3; NO323338B1

Abstract

1. Zastosowanie peptydu wykazujacego aktywnosc insulinotropowa przez oddzialywanie z re- ceptorem GLP-1 do wytwarzania leku do leczenia pacjentów, u których stwierdzono hiperglikemie wywolana stresem. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie peptydu wykazującego aktywność insulinotropową przez oddziaływanie z receptorem GLP-1.

Rocznie na zachodzie przeprowadza się około 20000 - 25000 operacji na milion mieszkańców. Zabieg operacyjny jak każdy uraz zapoczątkowuje znaczące zmiany w metabolizmie [Shaw, J.H.F. i in., Ann. Surg., 209(1):63-72 (1989); Little, R. A. i in., Prog. Clin. Biol. Res. 263A:463-475 (1987); Frayn, K. N. Clin. Endocrinol. 24:577-599 (1986); Brandi L. i in., Clin. Sci. 85:525-35 (1993)]. Przyspieszona synteza glukozy, podstawowego źródła energii dla procesu gojenia tkanek jest ważną zmianą metaboliczną zachodzącą po zabiegu operacyjnym i występuje kosztem białek organizmu i zapasów energetycznych [Gump F.E. i in., J. Trauma, 14:378-88 (1974); Black R.B. i in., Ann. Surg. 196:420-35 (1982)].

Zmiany te poprzednio przypisywano hormonom stresu odpowiedzialnym za regulację gospodarki węglowodanowej i innym czynnikom katabolicznym, takim jak cytokiny, które są uwalniane jako odpowiedź na uraz. Im bardziej wyrażone są zmiany w kierunku katabolizmu, tym większa jest śmiertelność i wolniejszy powrót do zdrowia pacjenta [Thorell, A. i in., Eur. J. Surg., 159:593-99 (1993); Chernow, B. i in. Arch. Intern. Med., 147:1273-8 (1987)].

Pooperacyjne stany kataboliczne można leczyć hormonami anabolicznymi, a zwłaszcza hormonem wzrostu i IGF-I [Hammarkvist, F. i in., Ann. Surg., 216(2):184-190 (1991); Ziegler T. i in., Annu. Rev. Med., 45:459-80 (1994); Ziegler T.R. i in., J. Parent. Ent. Nutr. 14(6); 574-81 (1990)]. Niektóre badania pokazują wyraźne korzyści z leczenia insuliną pacjentów z urazem katabolicznym [Hinton P. i in., Lancet, 17 (kwiecień):767-69 (1971); Shizgal, H. i in., Am. J. Clin. Nutr., 50:1355-63 (1989); Woolfson, A.M.J. i in., N. Clin. Nutr., 50:1355-63 (1989); Woolfson, A.M.J. i in., N. Engl. J. Med. 300:14-17 (1979); Brooks, D. i in., J. Surg. Res. 40:395-405 (1986); Sakuraiy. i in., Ann. Surg. 222:283-97(1995)].

Jednakże w jeszcze innych badaniach pokazano, że pooperacyjne korzyści insuliny są często narażone na szwank przez istniejącą oporność na insulinę.

W przypadku oporności na insulinę normalne stężenie insuliny wywołuje mniejszą niż zwykle odpowiedź. Oporność na insulinę może zależeć od zmniejszenia wiązania insuliny do receptorów powierzchni komórek, albo od zmian wewnątrzkomórkowego metabolizmu. Pierwszy rodzaj charakteryzujący się zmniejszeniem wrażliwości na insulinę zwykle może być przezwyciężony zwiększonym stężeniem insuliny. Drugi rodzaj charakteryzujący się zmniejszoną odpowiedzią na insulinę nie może być przezwyciężony dużą ilością insuliny.

Oporność na insulinę występująca po urazie może być przezwyciężona przez dawki insuliny proporcjonalne do stopnia oporności na insulinę tak więc występuje wtedy w sposób oczywisty zmniejszenie wrażliwości na insulinę [Brandi L. S. i in., Clin. Science 79:443-450 (1990); Henderson A.A. i in., Clin. Sci. 80:25-32 (1990)]. Zmniejszenie wrażliwości na insulinę występujące po planowej operacji brzusznej trwa przynajmniej pięć dni, lecz nie dłużej niż trzy tygodnie i jest najsilniejsze w pierwszym dniu po operacji a normalizacja może potrwać trzy tygodnie [Thorell A. i in., (1993)].

Przyczyny obserwowanej przemijającej oporności na insulinę nie są całkowicie zrozumiałe. Zarówno kortyzol, jak i glukagon mogą być odpowiedzialne za kataboliczną odpowiedź na uraz [Alberti K.G.M.M. i in., J. Parent. Ent. Nutr. 4(2):141-46 (1980); Gelfand R.A. i in., J. Clin. Invest. 74(grudzień):2238-2248 (1984); Maerliss E.B. i in., J. Clin. Invest. 49:2256-70 (1970)]. Jednakże w badaniach pooperacyjnej oporności na insulinę nie udało się wykazać żadnej korelacji pomiędzy zmianami tych hormonów katabolicznych, a zmianami oporności na insulinę po zabiegu operacyjnym [Thorell A. i in. (1993); Thorel A. Karolińska Hospital and Institute, 104 01 Sztokholm, Szwecja (1993); Thorell A. i in., BR. J. Surg. 81:59-63 (1994)].

Zwiększona dostępność lipidów po urazie może wywoływać oporność na insulinę przez cykl glukoza-kwasy tłuszczowe [Randle P.J. i in., Diab. Metab. Rev. 4(7):623-38 (1988)]. Zwiększona dostępność wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) wywołuje oporność na insulinę i zmienia substrat utleniania, z glukozy na tłuszcz nawet w trakcie jednoczesnego wlewu insuliny [Ferranini E. i in., J. Clin. Invest. 72:1737-47 (1983); Bevilacqua S. i in., Diabetes 39:383-89 (1990); Bonadonna R. C. i in., Am. J. Physiol. 259:E736-50 (1990); Bonadonna R. C. i in., Am. J. Physiol. 257:E49-56 (1989)].

Planowe zabiegi operacyjne rutynowo przeprowadza się po nocnej głodówce w celu zmniejszenia ryzyka znieczulenia. Ta ustalona praktyka utrzymywania pacjenta na czczo przez noc (10-16 godzin) przed zabiegiem operacyjnym nasila rozwój stanu katabolicznego i pogarsza oporność

PL 190 991 B1 na insulinę. Badania szczurów poddanych stresowi, takiemu jak krwawienie i endotoksemia wykazują, że głodzenie przez okres krótszy niż 24 godziny znacząco wpływa na odpowiedź kataboliczną na uraz [Alibegovic A. i in., Circ. Shock, 39:1-6 (1993); Eshali A.H. i in., Eur. J. Surg. 157:85-89 (1991); Ljunggvist O. i in., Am. J. Physiol., 22:E692-98 (1990)]. U szczurów nawet krótki okres głodówki przed wystąpieniem urazu znacząco zmniejsza rezerwy węglowodanowe, zasadniczo zmienia środowisko hormonalne, zwiększa odpowiedź na stres i, co najważniejsze, zwiększa śmiertelność [Alibegovic A. i in., Circ. Shock, 39:1-6 (1993)].

Podawanie glukozy przed zabiegiem operacyjnym zarówno doustnie [Nygren J. i in., Ann. Surg. 222:728-34 (1995)], jak i we wlewie zmniejsza oporność na insulinę po zabiegu operacyjnym w porównaniu z pacjentami głodzonymi. Pacjenci, którzy otrzymywali przez noc wlew glukozy (5 mg/kg/min) przed planowym zabiegiem operacyjnym na jamie brzusznej utracili po operacji średnio 32% wrażliwości na insulinę, podczas gdy pacjenci rutynowo głodzeni przez noc utracili średnio 55% swojej wrażliwości na insulinę [Ljunggvist O. i in., Am. J. Coll. Surg., 178:329-36(1994)].

Problem zwiększenia oporności na insulinę po zabiegach operacyjnych poruszono również w publikacji w Hormone and Metabolic Research, tom 26, nr 10, 1994, str. 474-477. Pacjenci poddawani operacji laparoskopowej lub laparotomii utrzymywani byli na czczo od północy przed planowanym zabiegiem operacyjnym po czym podawano im wlew glukozy w dawce 80 g/24 godziny oraz wlewy insuliny. Stwierdzono, że oporność na insulinę u tych pacjentów utrzymywała się 24 godziny po operacji laparoskopowej. Wlewy insulinowe stwarzają ryzyko wystąpienia poważnych skutków ubocznych w postaci hipoglikemii, co z kolei zwiększa ryzyko wystąpienia arytmii komór, dlatego tego rodzaju pacjenci muszą być w sposób ciągły monitorowani, co przyczynia się do wzrostu kosztów leczenia. W przypadku tego badania u jednej trzeciej z tych pacjentów wystąpiła hipoglikemia.

Dodatkowo do niekorzystnych efektów głodzenia na zdrowienie po zabiegu operacyjnym, unieruchomienie pacjenta i odżywianie niskokaloryczne w trakcie i po zabiegu operacyjnym również zwiększa oporność na insulinę po operacji. U zdrowych osobników wykazano, że 24 godziny unieruchomienia i dieta niskokaloryczna wywołuje 20-30% wzrost obwodowej oporności na insulinę zdrowych ochotników. Tak więc, pooperacyjna oporność na insulinę po przedoperacyjnym wlewie glukozy, o której wcześniej donoszono [Ljunggvist O. (1994)] może w części być zależna od dodatkowych efektów pooperacyjnego przebywania w łóżku i odżywiania niskokalorycznego.

Ze względu na znaczenie zabiegu operacyjnego ważne jest zminimalizowanie negatywnych efektów ubocznych, takich jak odpowiedź kataboliczna i oporność na insulinę, w celu poprawy procesu zdrowienia i zmniejszenia śmiertelności. Pooperacyjna oporność na insulinę udaremnia leczenie stanu katabolicznego insuliną. Rutynowa praktyka lekarska głodzenia w okresie przedoperacyjnym nasila pooperacyjny stan kataboliczny i oporność na insulinę. Tak więc, jest potrzebne leczenie przezwyciężające zarówno stan kataboliczny jak i oporność na insulinę.

Jak tu ujawniono jednym takim postępowaniem leczniczym przezwyciężającym zarówno stan kataboliczny jak i oporność na insulinę jest podawanie przed, w trakcie i po operacji glukozy z insuliną łącznie.

Jednakże wlew insuliny może potencjalnie wywołać hipoglikemię, definiowaną jako poziom glukozy we krwi poniżej 0,3 mM. Hipoglikemia zwiększa ryzyko komorowych zaburzeń rytmu serca i jest niebezpiecznym następstwem wlewu insuliny. Algorytm wlewu insuliny dla osób chorujących na cukrzycę stworzono w celu zapobieżenia hipoglikemii [Hendra T.J. i in., Diabetes Res. Clin. Pract., 16:213-220 (1992)]. Mimo tego 21% pacjentów rozwija hipoglikemię przy zastosowaniu tego algorytmu. W innym badaniu kontroli poziomu glukozy po zawale serca 18% pacjentów rozwinęło hipoglikemię po wlewie glukozy z insuliną [Malmberg K.A. i in., Diabetes Care 17:1007-1014 (1994)].

Wlew insuliny wymaga również częstego monitorowania poziomów glukozy we krwi tak by można było rozpoznać początek hipoglikemii i podjąć kroki zaradcze tak szybko jak to jest możliwe. U pacjentów otrzymujących wlew insuliny w cytowanym badaniu [Malmberg (1994)] poziom glukozy we krwi był mierzony przynajmniej co dwie godziny i zgodnie z tym dopasowywano wielkość i szybkość wlewu. Tak więc, bezpieczeństwo i skuteczność terapii wlewem glukoza-insulina u pacjentów po zawale serca zależy od łatwego i szybkiego dostępu do danych dotyczących poziomu glukozy we krwi. Potrzeba tak intensywnego monitorowania poziomu glukozy we krwi obciąża pracowników oddziałów intensywnej terapii i zwiększa niedogodności i koszty leczenia. W wyniku tego, często przedoperacyjne oddziały intensywnej opieki nie przeznaczają środków na monitorowanie i normalizację poziomów glukozy we krwi przed zabiegiem operacyjnym, tak jak mogłyby być to osiągnięte przez dożylne podawanie insuliny. Rozważając ryzyka i utrudnienia związane nieodłącznie z wle4

PL 190 991 B1 wem glukozy potrzebne jest alternatywne podejście do przed-/pooperacyjnej kontroli reakcji katabolicznej na uraz.

Hormon wydzielania wewnętrznego, peptyd-1 glukagonopodobny, zwany w skrócie GLP-1 powstaje z proglukagonu w przewodzie pokarmowym i nasila uwalnianie insuliny wywoływane przez pokarm [Krcymann B. i in., lancet 2:1300-1303 (1987)]. Znane są różnorodne postacie skróconych GLP-1 wywołujące wydzielanie insuliny (działanie insulinotropowe) i powstawanie cAMP [patrz np. Mojsov S. i in., Int. J. Peptide Research, 40:333-343 (1992)]. W przeprowadzanych różnych doświadczeniach laboratoryjnych i doświadczeniach przeprowadzanych na ssakach, a zwłaszcza ludziach wykazano związek pomiędzy insulinotropową odpowiedzią a egzogennym podaniem GPL-1, amidu GLP-1(7-36) i kwasu GLP-1(7-36) [patrz np., Nauck M.A. i in., Diabetologia, 36:741-744 (1993); Gutniak M. i in., New England J. of Medicine, 326 (20):1316-1322 (1992); Nauck M.A. i in., J. Clin. Invest., 91:301-307 (1993); i Thorens B. i in., Diabetes, 42:1219-1225 (1993)]. Amid GLP-1 (7-36) nasila przedłużony wpływ przeciwcukrzycowy u pacjentów z cukrzycą insulinozależną przez wywoływanie wrażliwości na insulinę i przez nasilanie wydzielania insuliny indukowane przez glukozę w stężeniach fizjologicznych [Gutniak M. i in., New England J. med. 326:1316-1322 (1992)]. Podanie amidu GLP-1 (7-36) u pacjentów z cukrzycą insulinoniezależną stymuluje uwalnianie insuliny, zmniejsza wydzielanie glukagonu, hamuje opróżnianie żołądka i nasila wykorzystanie glukozy [Nauck, 1993; Gutniak, 1992, Nauck, 1993].

Wykorzystanie insulinotropowej aktywności GLP-1 i jego analogów w celu zmniejszenia dolegliwości spowodowanych cukrzycą przedstawiono w opisie patentowym nr EP 619322. Cukrzyca spowodowana jest zaburzeniem metabolizmu glukozy w organizmie. W celu zrekompensowana braku endogennej insuliny pacjentom podawano GLP-1, który wykazuje działanie insulinotropowe.

Zastosowanie cząsteczek typu GLP-1 w długotrwałym leczeniu było jednakże utrudnione ze względu na to, że czas półtrwania tych peptydów jest dość krótki.

Na przykład czas półtrwania GLP-1(7-36) wynosi jedynie od 3 do 5 minut. Czas półtrwania amidu GLP-1 (7-36) po podaniu podskórnym wynosi około 50 minut. Tak więc, cząsteczki GLP by osiągnąć przedłużony efekt muszą być podawane w ciągłym wlewie [Gutniak M. i in., Diabetes Care 17:1039-1044 (1994)]. W niniejszym wynalazku krótki czas półtrwania GLP-1 i w związku z tym konieczność ciągłego podawania nie są niekorzystne ze względu na to, że pacjenci są zwykle hospitalizowani przed zabiegiem operacyjnym i przed, po i w trakcie operacji są podawane pozajelitowe płyny w sposób ciągły.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie peptydu wykazującego aktywność insulinotropową przez oddziaływanie z receptorem GLP-1 do wytwarzania leku do leczenia pacjentów, u których stwierdzono hiperglikemię wywołaną stresem, przy czym korzystnie peptyd ten wybrany z grupy obejmującej GLP-1, analogi GLP-1 i pochodne GLP-1, a stres stanowi stres związany z operacją.

W korzystnej postaci realizacji peptyd podawany jest przed, w trakcie lub po operacji, w szczególności by znormalizować poziom glukozy we krwi, przy czym korzystnie poziom glukozy we krwi wynosi od około 4,1 mM do 7,5 mM.

W korzystnej postaci realizacji wynalazku GLP-1, analog GPL-1 i pochodną GLP-1 do zastosowania według wynalazku wybiera się z grupy obejmującej GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), GLP-1(7-37) i amidowaną postać któregokolwiek z nich, a zwłaszcza GLP-1, analog GPL-1 lub pochodną GLP-1 z przynajmniej jedną modyfikacją wybraną z grupy obejmującej:

a) substytucję gllcyny, seryny, cysteiny, treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny, alaniny, wallny, izoleucyny, leucyny, metioniny, fenyloalaniny, argininy lub D-lizyny za lizynę w pozycji 26 i/lub pozycji 34; lub substytucję glicyny, seryny, cysteiny, treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny, fenyloalaniny, lizyny lub D-argininy za argininę w pozycji 36;

b) substytucję aminokwasu odpornego na utlenianie zamiast tryptofanu w pozycji 31;

c) substytucję przynajmniej jednej tyrozyny za walinę w pozycji 16; lizyny za serynę w pozycji 18; kwasu asparaginowego za kwas glutaminowy w pozycji 21; seryny za glicynę w pozycji 22; argininy za glutaminę w pozycji 23; argininy za alaninę w pozycji 24; i glutaminy za lizynę w pozycji 26;

d) substytugę obejmującej co naimniej jedną: glicynę, serynę, lub cysteinę zamiast alaniny w pozycji 8; kwas asparaginowy, glicynę, serynę, cysteinę, treoninę, asparagininę, glutaminę, tyrozynę, alaninę, walinę, izoleucynę, leucynę, metioninę, lub fenyloalaninę zamiast kwasu glutaminowego w pozycji 9; serynę, cysteinę, treoninę, asparaginę, glutaminę, tyrozynę, alaninę, walinę, izoPL 190 991 B1 leucynę, leucynę, metioninę, lub fenyloalaninę zamiast glicyny w pozycji 10; i kwas glutaminowy zamiast kwasu asparaginowego w pozycji 15; i

e) substytucję glicyny, seryny, cysteiny, treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny, lub fenyloalaniny lub D- lub N-acylowanej lub alkilowanej postaci histydyny za histydynę w pozycji 7.

Korzystniej analog GLP-1 jest wybrany z grupy obejmującej GLP-l(7-34), GLP-1 (7-35), GLP-1(7-36), GLP-1(7-37), i amidowaną postać któregokolwiek z nich, przy czym zawiera argininę podstawioną zamiast lizyny w pozycji 34. Analog GLP-1 stanowi w szczególności pochodna GLP-1, przy czym korzystnie epsilon aminowa grupa lizyny jest acylowana.

W kolejnej korzystnej postaci realizacji zastosowania według wynalazku GLP-1, analog GPL-1 lub pochodna GLP-1 mają wzór:

R^1-X^-Gl^u-Gl^y10-Thr^-Phe^-Thr^-Ser^-As^p15-Val^-Ser^-Ser^-T^yr^-LeLi^20-Y^-Gl^y-Gln^-Ala^-Ala^25-L^ys^-Z^-Phe^-Ile^- Ala^-Trp-Leu^al-Lys-Gly^-Arg-R², w którym:

R1 wybrany jest spośród L-histydyny, D-histydyny, dezamino-histydyny, 2-amino-histydyny, β-hydroksy-histydyny, homohistydyny, alfa-fluorometylo-histydyny i alfa-metylo-histydyny;

X wybrany jest spośród Ala, Gly, Val, Thr, Ile, i alfa-metylo-Ala;

Y wybrany jest spośród Glu, Gln, Ala, Thr, Ser i Gly;

Z wybrany jest spośród Glu, Gln, Ala, Thr, Ser i Gly; i

R2 wybrany jest spośród NH2 i Gly-OH.

Korzystniej GLP-1, analog GPL-1 lub pochodna GLP-1 zabezpieczone są przed aktywnością dipeptydylo-peptydazy IV.

W innej korzystnej postaci realizacji wynalazku GLP-1, analog GPL-1 lub pochodna GLP-1 jes^t w^ybrana z ^gru^py o^bejmuj^ącej: ^Gly8-^GLP-¹(⁷-³⁶)^{NH2, V}a^l8-GLP-1(7-37)^OH, atfa-metyb-Ab⁸ ^-GLP^-1⁽7^-36)NH₂ i Gl^y8-Gln^21-GLP^-1⁽7^-37) OH.

W następnej korzystnej postaci realizacji zastosowania według wynalazku GLP-1, analog GPL-1 lub pochodna GLP-1 jest wytworzona w sposobie derywatyzowania analoga GLP-1 wybranego z grupy obejmującej GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), GLP-1(7-37) i amidowaną postać któregokolwiek z nich, w których GLP-1, analog GPL-1 lub pochodna GLP-1 posiada przynajmniej jedną modyfikację wybraną z grupy obejmującej:

a) substytucję glicyny, seryny, cysteiny, treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny, fenyloalaniny, argininy lub D-lizyny za lizynę w pozycji 26 i/lub pozycji 34; lub substytucji glicyny, seryny, cysteiny, treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny, fenyloalaniny, lizyny lub D-argininy za argininę w pozycji 36;

d) substytucję obejmującą co najmniej jedną: glicynę, serynę, lub cysteinę zamiast alaniny w pozycji 8; kwas asparaginowy, glicynę, serynę, cysteinę, treoninę, asparagininę, glutaminę, tyrozynę, alaninę, walinę, izoleucynę, leucynę, metioninę, lub fenyloalaninę zamiast kwasu glutaminowego w pozycji 9; serynę, cysteinę, treoninę, asparaginę, glutaminę, tyrozynę, alaninę, walinę, izoleucynę, leucynę, metioninę, lub fenyloalaninę zamiast glicyny w pozycji 10; i kwas glutaminowy zamiast kwasu asparaginowego w pozycji 15; i

Korzystniej analog GLP-1 wybrany jest z grupy obejmującej: GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1 (7-36), GLP-1(7-37) i amidowaną postać któregokolwiek z poprzedzających, przy czym zawiera argininę podstawioną zamiast lizyny w pozycji 34. Korzystniej analog GLP-1 derywatyzowany jest poprzez acylowanie grupy epsilon-aminowej lizyny.

W również korzystnej postaci realizacji zastosowania według wynalazku analog GLP-1 zawiera substytucję waliny zamiast alaniny w pozycji 8 i dodatkowo zawiera jedną lub więcej substytucji, delecji, inwersji lub addycji aminokwasowych.

PL 190 991 B1

Figura 1 jest graficznym przedstawieniem procentowych zmian szybkości wlewu glukozy (GIR) w okresie pooperacyjnym (postop) w stosunku do okresu przedoperacyjnego (preop) dla (6) pacjentów grupy kontrolnej (O) i siedmiu pacjentów otrzymujących wlew hiperinsulinowy, normoglikemiczny () przed i w czasie planowego zabiegu operacyjnego.

Figura 2 graficznie przedstawia wpływ ciągłego wlewu amidu GLP-1 (7-36) na średnie stężenie glukozy we krwi (nM) (----) u pięciu pacjentów z cukrzycą insulinoniezależną (NIDDM) w trakcie nocy. Wykres pokazuje również wpływ ciągłego wlewu glukozy na średnie stężenie glukozy we krwi (- -O--) u tych samych pięciu pacjentów z NIDDM innej nocy.

Figura 3 graficznie przedstawia wpływ ciągłego wlewu amidu GLP-1(7-36) na średnie stężenie glukozy we krwi (nM) (----) u pięciu z NIDDM przeprowadzonego w ciągu dnia, trwającego 3 godziny i rozpoczynanego wraz z każdym z trzech posiłków. Wykres pokazuje również wpływ ciągłego wlewu glukozy na średnie stężenie glukozy we krwi (- -O- -) u tych samych pięciu pacjentów z NIDDM innego dnia, wlew rozpoczynano na krótko przed każdym posiłkiem.

„GLP-1” oznacza GLP-1(7-37). Zgodnie ze stanem techniki, końcowi aminowemu GLP-1(7-37) nadano numer 7, zaś końcowi karboksylowemu numer 37. Sekwencja aminokwasowa GLP-1(7-37) jest dobrze znana ale podana jest niżej dla wygody czytelnika:

NH^2-His^7-Ala^-Gl^u-Gl^y10-Thr^-Phe^-Thr^-Ser^-As^p15-Val^-Ser^-Ser^-T^yr^-LeLi^20-Gl^u-Gl^y-Gln^-Ala^-Ala^25-L^ys^-Gl^u-Phe^-Ile^-Ala^30-Tr^p-Le^u-Val^-L^ys^-Gl^y35-Ar^g-Gl^y37-COOH ⁽Id. Sek^w. nr1) „Analog GLP-1” określony jest jako cząsteczka posiadająca jedno albo wiele podstawień, delecji, inwersji albo addycji w porównaniu z GLP-1. Analogi GLP-1 znane w stanie techniki obejmują, ptr^kłado^ GLP^-1⁽7^-34) i GLP-1(7-35), GLP^-1⁽7^-36) Gln⁹-GLP-(7-37), D^-Gln^9-(7^-37^), Thr^16-L^ys¹⁸-GLP-1(7-37) i Lys¹⁸-GLP-1(7-37). Do zastosowania według wynalazku zaleca się użycie analogów GLP-1, takich jak GLP-1(7-34) i GLP-1(7-35), które ujawniono w patencie USA nr 5,118,666, który jest załączony tu jako odnośnik, jak również GLP-1(7-36), który jest biologicznie przetworzoną postacią GLP-1 posiadającą właściwości insulinotropowe. Inne analogi GLP-1 ujawniono w patencie USA nr 5,545,618, który jest załączony tu jako odnośnik.

„Pochodna GLP-1” określona jest jako cząsteczka o sekwencji aminokwasowej GLP-1 albo analoga GLP-1, ale dodatkowo posiadająca modyfikację chemiczną jednej albo wielu aminokwasowych grup bocznych, atomów węgla α, końcowych grup aminowych albo końcowych grup karboksylowych. Chemiczne modyfikacje obejmują, choć nie są ograniczone do dodania reszt chemicznych, wytworzenia nowych wiązań i usunięcia reszt chemicznych. Modyfikacje bocznych grup aminokwasowych obejmują, choć nie są ograniczone do acylacji grup ε-aminowych lizyny, N-alkilacji argininy, histydyny albo lizyny, alkilacji grup karboksylowych glutaminy albo asparaginy i dezaminacji glutaminy albo asparaginy. Modyfikacje końcowych grup aminowych obejmują choć nie są ograniczone do modyfikacji desaminowych, N-niższym alkilem, N-di-niższym alkilem i N-acylowych. Modyfikacje końcowych grup karboksylowych obejmują, choć nie są ograniczone do modyfikacji amidem, amidem niższego alikilu, amidem dialikilu oraz estrem niższego alkilu. Niższym alkilem jest alkil C1-C4. Ponadto, jedną albo wiele grup bocznych można chronić grupami zabezpieczającymi znanymi przeciętnemu chemikowi. Węgiel α aminokwasu może być mono- albo dimetylowany.

Do zastosowania według wynalazku zaleca się również użycie grupy analogów GLP-1 i pochodnych obejmujących cząsteczkę o wzorze:

R^1-X^-Gl^u-Gl^y10-Thr^-Phe^-Thr^-Ser^-As^p15-Val^-Ser^-Ser^-T^yr^-LeLi^20-Y^-Gl^y-Gln^-Ala^-Ala^25-L^ys^-Z^-Phe-^Ile-^Ala³⁰-^Tr^p-^Leu-^Va^l-^Lys-^Gly35-^Ar^g-^R2 (te. ^Se^kw. nr:²) i ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, w którym R1 wybrane jest z grupy obejmującej L-histydynę, D-histydynę, dezaminohistydynę, 2-aminohistydynę, β-hydroksyhistydynę, homohistydynę, α-fluorometylohistydynę i α-metylohistydynę; X wybrane jest z grupy obejmującej Ala, Gly, Val, Thr, Ile i α-metylo-Ala; Y wybrane jest z grupy obejmującej Glu, Gln, Ala, Thr, Ser i Gly; Z wybrane jest z grupy obejmującej Glu, Gln, Ala, Thr, Ser i Gly; zaś R2 wybrane jest z grupy obejmującej NH2 i Gly-OH; przy założeniu, że związek ma punkt izoelektryczny w zakresie od około 6,0 do około 9,0 i dalej, zakładając, że R1 oznacza His, X oznacza Ala, Y oznacza Glu zaś Z oznacza Glu, R2 musi oznaczać NH2.

Ujawniono liczne analogi GLP-1 i pochodne o punkcie izoelektrycznym w tym zakresie i obejmują one:

GLP-1(7-36)NH2,

Gl^y8-Gl^p-1⁽7^-36)NH^2,

Gln⁹-GLP-1(7-37),

PL 190 991 B1

D-Gln⁹-GLP(7-37), acetylo-Lys⁹-GLP-1(7-37),

Thr⁹-GLP-1(7-37),

D^-Thr^9-GLP^-1⁽7^-37),

Asn^9-Glp^-1⁽7^-37),

D^-Asn^9-Glp^-1⁽7^-37),

Ser^22-Arg^23-Arg^24-Gln^26-Gl^p-1⁽7^-37⁾,

Thr^16-L^ys^18-GLP^-1⁽7^-37),

L^ys^18-GLP^-1⁽7^-37),

Arg²³-GLP-1(7-37),

Ar^g24-GLP^-1⁽7^-37) it^p., ^(patrz, n^p. WO 91/11457).

Inną zalecaną grupę związków czynnych do zastosowania według wynalazku ujawniono w publikacji nr WO 91/1457, która obejmuje zasadniczo GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36) albo GLP-1(7-37) albo ich postaci amidowe i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole posiadające przynajmniej jedną z następujących modyfikacji wybranych z grupy obejmującej:

(a) subbtytucję ę liccny,sep/ny,ccsteiny,treeniny, asppraainy,g lutaminy,tyroozny, a laniny,waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny, fenyloalaniny, argininy albo D-lizyny za lizynę w pozycji 26 i/lub pozycji 34; albo substytucję glicyny, seryny, cysteiny, treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozynny, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny, fenyloalaniny, lizyny albo D-argininy za argininę w pozycji 36;

(b) substytucję opornych na utlenienie aminokwasów za tryptofan w pozycji 31;

(c) substyrucję ^przznyjmniej j eenyj ryroozny zz waliny w ppozcji r6, I izzyiy zz seryny w ppoyy cji 18, kwasu asparaginowego za kwas glutaminowy w pozycji 21, seryny za glicynę w pozycji 22, argininy za glutaminę w pozycji 23; argininy za alaninę w pozycji 24, oraz glutaminy za lizynę w pozycji 26; i (d) substyrubje oobeTnuć^cą j jedą substyrubje: gliccny, sejyny. zz nę w pozycji 8, kwas asparaginowy, glicynę, serynę, cysteinę, treoninę, asparagininę, glutaminę, tyrozynę, alaninę, walinę, izoleucynę, leucynę, metioninę, lub fenyloalaninę zamiast kwasu glutaminowego w pozycji 9; serynę, cysteinę, treoninę, asparaginę, glutaminę, tyrozynę, alaninę, walinę, izoleucynę, leucynę, metioninę, lub fenyloalaninę zamiast glicyny w pozycji 10; i kwas glutaminowy zamiast kwasu asparaginowego w pozycji 15; i (e) substyrubje gUccmy, sej·yny, ccsteiny, rreominy, as^ppraainy, Izmozmy, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny albo fenyloalaniny, albo D-albo N-acylowanych albo alkilowanych postaci histydyny za histydynę w pozycji 7, podczas gdy w substytucjach (a), (b), (d) i (e) podstawiane aminokwasy mogą być ewentualnie w postaci D, zaś aminokwasy podstawione w pozycji 7 mogą być ewentualnie w postaci N-acylowanej albo N-alkilowanej.

Ze względu na enzym, dipeptydylo-peptydazę IV (DPP IV), który może być odpowiedzialny za obserwowaną gwałtowną inaktywację in vivo podawanego GLP-1 (patrz, np. Mentlein i in., Eur. J. Biochem., 214:829-835 (1993)), zaleca się podawanie analogów GLP-1 i pochodnych, zabezpieczon^yc^{h p}rze^d a^ktywno^śc^ią D^PP IV a zwbszcza p^awanb G^|s8-GLP-1(7-3⁶)^NH2, ^vs^|8-GLP-1(7-3⁶), Val⁸-GLP-1(7-37)OH, s-metylo-Ala⁸-GLP-1(7-36)NH2 i Gly⁸-Gln21-GLP-1(7-37)OH albo ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

Do zastosowania według wynalazku zaleca się również użycie cząsteczki ujawnionej w patencie USA nr 5,188,666, który załączono tu jako odnośnik. Taka cząsteczka wybrana jest z grupy obejmującej peptydy o sekwencji aminokwasowej:

NH₂ ^-His^7-Ala^-Gl^u-Gl^y10-Thr^-Phe^-Thr^-Ser^-As^p15-Val^-Ser^-Ser^-T^yr^-Le^u20-Gl^u-Gl^y-Gln^-Ala^-Ala²⁵-^Lys-^Glu-^Phe-^Ile-^Ala^3CI-^Tr^p-^Leu-^Va^l-X (b. ^Se^kw. nr:³) w której X wybrany jest z grupy obejmującej Lys i Lys-Gly, i pochodnej tego peptydu, przy czym peptyd wybrany jest z grupy obejmującej: dopuszczalną farmaceutycznie sól addycyjną peptydu; farmaceutycznie dopuszczalną sól karboksylową peptydu; dopuszczalny farmaceutycznie ester niższego alkilu peptydu i farmaceutycznie dopuszczalny amid peptydu wybranego z grupy obejmującej amid, amid niższego alkilu i amid niższego dialkilu.

Inną zalecaną grupę cząsteczek do zastosowania według wynalazku stanowią związki ujawnione w patencie USA nr 5,512,549, załączonym tu jako odnośnik, o wzorze ogólnym:

R^1-Ala^-Gl^u-Gl^y1C-Thr^-Phe^-Thr^-Ser^-As^p15-Val^-Ser^-Ser^-T^yr^-Le^u2C-Gl^u-Gl^y-Gln^-Ala^-Ala^25-Xaa^-Gl^u-Phe^-Ile^-Ala^3C-Tr^p-Le^u-Val^-L^ys^-Gl^y35-Ar^g-R^{3 (}id. Sek^w. Nr4)

I

R²

PL 190 991 B1 i ich dopuszczalne farmaceutycznie sole, w którym R¹ wybrany jest z grupy obejmującej 4-imidazopropionyl, 4-imidazoacetyl albo 4-imidazo-a, α-dimetyloacetyl; R² wybrany jest z grupy obejmującej nierozgałęziony acetyl Οθ-Ο-ιο albo nie występuje; R³ wybrany jest z grupy obejmującej Gly-OH albo NH2; zaś Xaa oznacza Lys albo Arg.

Do zastosowania według wynalazku szczególnie zaleca się użycie takich związków o Id. Sekw. nr 4, w których Xaa oznacza Arg, zaś Rj jest nierozgałęzionym acylem Οθ-Ο₁ο oraz takich związków o Id. Sekw. nr 4 do, w których Xaa oznacza Arg, Rj oznacza nierozgałęziony acyl Οθ-Οιο, zaś r3 oznacza Gly-OH, a zwłaszcza takich związków o Id. Sekw. nr 4, w których Xaa oznacza Arg, R oznacza

1 nierozgałęziony acyl Οθ-Οιο, R oznacza Gly-OH, zaś R oznacza 4-imidazopropionyl oraz takich

3 związków o Id. Sekw. nr 4, w których Xaa oznacza Arg, R oznacza nierozgałęziony acyl Ο₈, R oznacza Gly-OH, zaś R oznacza 4-imidazopropionyl.

Do zastosowania według wynalazku zaleca się również użycie w szczególności cząsteczki ujawnionej w patencie USA nr 5,120,712, który jest załączony jako odnośnik. Taka cząsteczka wybrana jest z grupy obejmującej peptyd o sekwencji aminokwasowej:

NH^2-His^7-Ala^-Gl^u-Gl^y10-Thr^-Phe^-Thr^-Ser^-As^p15-Val^-Ser^-Ser^-T^yr^-LeLi^j0-Gl^u-Gl^y-Gln^-Ala^-Ala^j5-L^ys^-Gl^u-Phe^-Ile^-Ala^30-Tr^p-Le^u-Val^-L^ys^-Gl^y35-Ar^g-Gl^y37-ΟOOH (Id. Sek^w. nrl) i pochodne peptydu, przy czym peptyd wybrany jest z grupy obejmującej: dopuszczalną farmaceutycznie sól addycyjną peptydu; farmaceutycznie dopuszczalną sól karboksylową peptydu; dopuszczalny farmaceutycznie ester niższego alkilu peptydu i farmaceutycznie dopuszczalny amid peptydu wybranego z grupy obejmującej amid, amid niższego alkilu i amid niższego dialkilu.

Do zastosowania według wynalazku zaleca się ponadto najbardziej użycie GLP-1(7-36) albo jego dopuszczalnych farmaceutycznie soli. Sekwencję aminokwasową GLP-1(7-36) stanowi:

NH^2-His^7-Ala^-Gl^u-Gl^y10-Thr^-Phe^-Thr^-Ser^-As^p15-Val^-Ser^-Ser^-T^yr^-LeLi^j0-Gl^u-Gl^y-Gln^-Ala^-Ala^j5-L^ys^-Gl^u-Phe^-Ile^-Ala^30-Tr^p-Le^u-Val^-L^ys^-Gl^y35-Ar^g-Gl^y37- NH^{j (}Id. Sek^w. nr5)

Sposoby wytwarzania aktywnych związków do zastosowania według wynalazku, konkretnie, GLP-1, analoga GLP-1 albo pochodnej GLP-1 są dobrze znane i opisane w patentach USA nr 5,118,666, 5,120,712 i 5,523,549, załączonych tu jako odnośniki.

Οzęść aminokwasowa związku czynnego zastosowanego według wynalazku albo jego prekursora, wytworzona jest przez 1) syntezę chemiczną na podłożu stałym; 2) oczyszczanie cząsteczek GLP ze źródeł naturalnych; albo 3) technologię rekombinowanego DNA.

Synteza chemiczna na podłożu stałym jest znana w stanie techniki i można ją znaleźć w ogólnych opisach w dziedzinie wiedzy jak np. Dugas H. i Penney Ο., Bioorganic Οhemistry, Springer-Verlag, Nowy Jork (1981), str. 54-92, Merrifield J.M., Οhem. Soc., 85:2149 (1962) i Steward i Young, Solid phase peptide Synthesis, Freeman, San Francisco (1969) str. 24-66.

Przykładowo, część aminokwasową można syntetyzować metodyką na podłożu stałym przy użyciu urządzenia (PE-Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Οenter Drive, Foster Ο^, ΟA 94404) i cykli syntezy dostarczonych przez PE-Applied Biosystems. Aminokwasy-BOΟ i inne reagenty są dostępne w handlu z PE-Applied Biosystems albo innych źródeł surowców chemicznych. Sekwencyjną reakcję chemiczną Boc z użyciem protokołu podwójnego sprzęgania stosuje się wobec wyjściowych żywic p-metylo-benzohydrylo-aminowych w celu wytworzenia karboksamidów Ο-końcowych. Do wytwarzania aminokwasów Ο-końcowych stosuje się odpowiednią żywicę PAM. Asn, Gln i Arg sprzęga się przy użyciu preformowanych estrów hydroksy-benzotriazolowych. Można zastosować następujące grupy zabezpieczające łańcuchów bocznych:

Arg, tosyl,

Asp, cykloheksyl,

Glu, cykloheksyl,

Ser, benzyl,

Thr, benzyl,

Tyr. 4-bromo-karbenzoksy

Odbezpieczanie Boc można osiągnąć przy użyciu kwasu trifluorooctowego w chlorku metylenu. Po zakończeniu syntezy peptydy można odblokować i odciąć od żywicy przy użyciu bezwodnego fluorowodoru (HF) zawierającego 10% metakrezol. Odcięcie grup zabezpieczających łańcuchów bocznych oraz peptydu od żywicy prowadzi się w temperaturze -5°Ο do 5°Ο, dogodnie na lodzie przez 60 minut. Żywicę płucze się eterem po czym peptyd ekstrahuje się lodowatym kwasem octowym i liofilizuje.

PL 190 991 B1

W celu wytworzenia związku czynnego do zastosowania według wynalazku stosuje się dobrze znaną technologię rekombinowanego DNA. W rzeczywistości, metody rekombinowania DNA mogą być dogodniejsze z powodu wyższej wydajności. Podstawowymi etapami wytwarzania rekombinacyjnego jest:

a) izolowanie naturalnej sekwencji DNA kodującej cząsteczkę GLP-1 albo konstruowanie syntetycznego albo półsyntetycznego DNA kodującego cząsteczkę GLP-1;

b) sekwencji kodującej w wektorze ekspresyjnym w sposób odpowiedni do wyrażania białek samych albo w postaci białek fuzyjnych;

c) transformowanie odpowiedniej komórki gospodarza eukariotycznego albo wektorem ekspresyjnym;

d) hodowanie transformowanej komórki gospodarza w warunkach umożliwiających wyrażenie cząsteczki GLP-1, i

e) pozyskiwanie i oczyszczanie rekombinacyjnie wytworzonej cząsteczki GLP-1.

Jak stwierdzono poprzednio, sekwencje kodujące mogą być całkowicie syntetyczne albo mogą być wynikiem modyfikacji większego DNA kodującego natywny glukagon. Sekwencja DNA, która koduje preproglukagon pokazana została przez Lund i in., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:345-349 (1982) i można ją zastosować jako materiał wyjściowy w półsyntetycznej produkcji związków według wynalazku przez zmianę natywnej sekwencji w celu uzyskania pożądanych rezultatów.

Syntetyczne geny, transkrypcja i translacja in vivo i in vitro, które dają w wyniku cząsteczkę GLP-1 można przeprowadzić dobrze znanymi technikami. Z powodu naturalnej degeneracji kodu genetycznego specjalista zauważy, że można skonstruować skończoną liczbę sekwencji DNA, z których wszystkie kodują cząsteczki GLP-1.

Metodyka konstruowania genów syntetycznych jest dobrze znana. Patrz, Brown i in., (1979) Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., 68:109-151. Sekwencję DNA projektuje się z pożądanej sekwencji aminokwasowej, stosując kod genetyczny który jest łatwo dostępny.

Po zaprojektowaniu, sekwencję można wytworzyć przy użyciu konwencjonalnych urządzeń syntetyzujących DNA takich jak Model 380A albo 380B DNA Synthesizer (PE-Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404).

W celu wyrażenia części aminokwasowej związku do zastosowania według wynalazku, wprowadza się zaprojektowaną sekwencję do jednego z odpowiednich wektorów ekspresyjnych rekombinowanego DNA przez zastosowanie odpowiednich endonukleaz restrykcyjnych. Patrz ogólnie, Maniatis i in., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, tom 1-3. Miejsca cięcia przez endonukleazy restrykcyjne wprowadza się na końcu DNA kodującego GLP-1 w celu ułatwienia izolowania go oraz integrowania go ze znanymi wektorami do amplifikacji i ekspresji. Szczególne zastosowane endonukleazy będą określone wzorcem cięcia endonukleaz restrykcyjnych zastosowanego wyjściowego wektora ekspresyjnego. Miejsca restrykcyjne dobiera się tak, aby prawidłowo ukierunkowały sekwencję kodującą, co pozwala na otrzymanie w ten sposób prawidłowej ramki odczytu i ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Sekwencja kodująca musi być położona w prawidłowej ramce odczytu z promotorem i miejscem wiązania rybosomu wektora ekspresyjnego, z których oba są funkcjonalne w komórce gospodarza w której wyrażane jest białko.

W celu osiągnięcia wydajnej transkrypcji syntetycznego genu, musi on być połączony funkcjonalnie z regionem promotora operatora. Stąd, region promotora-operatora syntetycznego genu umieszcza się w tej samej orientacji w odniesieniu do kodonu startowego ATG syntetycznego genu.

Znanych jest wiele wektorów ekspresyjnych przydatnych do transformowania komórek prokariotycznych i eukariotycznych. Patrz, The Promega Biological Research Products Catalogue (1992) (Promega Corp., 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, 53711-5399); oraz The Stratagene Cloning Systems Catalogue (1992) (Stratagene Corp., 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037). Patrz również patent USA nr 4,710,473 opisujący transformację kolistych plazmidów DNA przydatnych do ekspresji egzogennych genów w E. coli w znacznej ilości. Plazmidy te są przydatne jako wektory do transformowania w procedurach rekombinowanego DNA oraz:

(a) zapewniają plazmidowi zdolność autonomicznej replikacji w komórkach gospodarza;

(b) kontrolują autonomiczną replikację plazmidu w zależności od temperatury, w której prowadzona jest hodowla komórki gospodarza;

(c) stabilizują utrzymywanie plazmidu w populacji komórek gospodarza;

PL 190 991 B1 (d) kierują syntezą produktu białkowego wskazującego na utrzymywanie pl^^rmc^u w populacji komórek gospodarza;

(e) zapewniająszereg miejscrozpoznawanych przez egzonukieazy resSryrkcyjne, unikalnych dla plazmidu; i (f) przerywają transkrypcję mRNA.

Te koliste plazmidy DNA są przydatne jako wektory w procedurach rekombinowanego DNA dla zapewnienia wysokiego poziomu ekspresji genów egzogennych.

Po skonstruowaniu wektora ekspresyjnego dla części aminokwasowej związku do zastosowania według wynalazku, następnym etapem jest umieszczenie wektora w odpowiedniej komórce, konstruując w ten sposób rekombinowaną komórkę gospodarza przydatną do wyrażania polipeptydu. Techniki transformowania komórek rekombinowanymi wektorami DNA są dobrze znane i można je znaleźć w takich ogólnych odnośnikach jak Maniatis i in., wyżej. Komórki gospodarza można konstruować zarówno z komórek prokariotycznych jak i eukariotycznych.

Komórki gospodarza ogólnie wytwarzają białko w większej ilości i są łatwiejsze w hodowli. Białka wyrażane w bakteryjnych układach ekspresyjnych na wysokim poziomie charakterystycznie agregują w postaci granulek albo ciałek wtrętowych, które zawierają znaczny poziom wyrażanego białka. Takie agregaty białka zwykle pozyskuje się, rozpuszcza, denaturuje i ponownie fałduje stosując dobrze znane techniki. Patrz, Kreuger i in., (1990) w Protein Folding, Gierasch i King, (wyd.) str. 136-142, American Associacion for the Advancement of Science, publikacja nr 89-18S, Washington DC; oraz patent USA nr 4,923,967.

Zmiany w sekwencji prekursora GLP-1 albo analoga GLP-1 w celu wytworzenia pożądanego analoga GLP-1 albo pochodnej GLP-1 tworzy się znanymi sposobami takimi jak: modyfikacja chemiczna, modyfikacja enzymatyczna albo kombinacja modyfikacji chemicznej i enzymatycznej prekursorów GLP-1. Klasyczną technikę fazy ciekłej i metody pół-syntetyczne mogą być również przydatne do wytwarzania cząsteczek GLP-1 do zastosowania według wynalazku. Sposoby wytwarzania cząsteczek GLP-1 do zastosowania według wynalazku są dobrze znane przeciętnemu chemikowi.

Dodanie grup acylowych do grupy ε-aminowej Lys³⁴ można osiągnąć jednym z wielu znanych sposobów. Patrz, Bioconjugate Chem. „Chemical Modifications of Proteins: History and Applications” strony 1,2-12 (1990) i Hashimoto i in., Pharmaceutical Res. 6(2):171-176 (1989).

Przykładowo, do aminy lizylo-ε można dołączyć ester N-hydroksy-sukcynimidowy kwasu oktanowego, stosując 50% acetonitryl w buforze boranowym. Peptyd można acylować przed albo po dodaniu grupy imidazolowej. Ponadto, jeżeli peptyd wytwarza się rekombinacyjnie, możliwa jest acylacja przed cięciem enzymatycznym. Również, lizynę w pochodnej GLP-1 można acylować jak opisano w publikacji nr WO 96-29342, załączonej tu jako odnośnik.

Występowanie i wytwarzanie wielu zabezpieczonych, nie zabezpieczonych i częściowo zabezpieczonych naturalnych i nienaturalnych analogów funkcjonalnych i pochodnych GLP-1(7-34) amidu i cząsteczek GLP-1(7-37) opisano w stanie techniki (patrz np., Patent USA nr 5,120,712 i 5,118,666, włączone tutaj przez odnośniki i Orskov C. i in., J. Biol. Chem., 264 (22) :12826-12829 (1989) i WO 91/11457 (Buckley D.I. i in., opublikowane 8 sierpień 1991)).

Ewentualnie, reszty aminokwasowe końca karboksylowego pochodnych GLP-1 mogą być zabezpieczone, albo ewentualnie, tylko jeden z końców jest zabezpieczony. Reakcje wytwarzania i usuwania takich grup zabezpieczających opisano w standardowych pracach, przykładowo, „Protective Groups in Organic Chemistry”, Plenum Press, Londyn i Nowy Jork (1973); Green T.H. „Protective Groups in Organic Synthesis”, Wiley, Nowy Jork (1981) i „The Peptides”, tom I, Schroeder i Luebke, Academic Press Londyn i Nowy Jork (1965). Reprezentatywne grupy zabezpieczające obejmują przykładowo, grupę formylową, acetylową, izopropylową, butoksykarbonylową, fluorenylometoksykarbonylową, karbobenzyloksylową itp. Reprezentatywne grupy karboksy-zabezpieczające obejmują, przykładowo, ester benzylu, ester metylu, ester etylu, ester t-butylu, ester p-nitrofenylu itp.

Pochodne GLP-1 z karboksy-końcowym estrem niższego alkilu do zastosowania według wynalazku wytwarza się przez poddanie reakcji pożądanego (C1-C4) alkanolu z pożądanym polipeptydem w obecności katalitycznego kwasu takiego jak kwas chlorowodorowy. Odpowiednie warunki do wytworzenia takiego estru alkilu obejmują temperaturę reakcji około 50°C i czas reakcji około 1 godziny do około 3 godzin. Podobnie, można wytworzyć pochodne estru alkilu Asp i/lub Glu.

Wytwarzanie pochodnych karboksyamidowych związku zastosowanego według wynalazku prowadzi się, przykładowo, jak to opisano w Stewart J.M. i in., Solid Phase peptide Synthesis, Pierce Chemical Company Press, 1984.

PL 190 991 B1

W wynalazku można zastosować dopuszczalną farmaceutycznie sól GLP-1, analoga GLP-1 albo pochodnej GLP-1. Kwasami powszechnie stosowanymi do tworzenia soli addycyjnych kwasów są kwasy nieorganiczne takie jak kwas chlorowodorowy, bromowodorowy, jodowodorowy, siarkowy, fosforowy itp. oraz kwasy organiczne takie jak kwas p-toluenosulfonowy, metanosulfonowy, szczawiowy, p-bromofenylosulfonowy, węglowy, bursztynowy, cytrynowy, benzoesowy, octowy itp. Przykłady takich soli obejmują siarczan, pirosiarczan, bisiarczan, siarczek, bisiarczek, fosforan, fosforan jednowodorowy, fosforan dwuwodorowy, metafosforan, pirofosforan, chlorek, bromek, jodek, octan, propionian, dekanonian, oktanian, akrylan, mrówczan, izomaślan, heksanian, heptanian, propiolan, szczawian, malonian, bursztynian, suberynian, sebacynian, fumaran, maleinian, butyno-1,4-dian, heksyno-1,6-dian, benzoesan, chlorobenzoesan, metylobenzoesan, ftalan, sulfonian, ksylenosulfonian, fenylooctan, fenylopropionian, fenylomaślan, cytrynian, mleczan, γ-hydroksymaślan, glikolan, winian, metanosulfonian, propanosulfonian, naftaleno-1-sulfonian, naftaleno-2-sulfonian, sól kwasu migdałowego itp. Dogodnymi solami addycyjnymi kwasów są sole z kwasami mineralnymi takimi jak kwas chlorowodorowy i bromowodorowy, zaś szczególnie chlorowodorowy.

Sole addycyjne zasad obejmują sole pochodzące z zasad nieorganicznych takie jak sole amonowe albo alkaliczne albo wodorotlenki metali ziem alkalicznych, węglany, biwęglany itp. Zasady przydatne w wytwarzaniu soli według wynalazku obejmują więc wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek amonu, węglan potasu itp. Szczególnie zalecane są postaci soli.

GLP-1, analog GLP-1 albo pochodną GLP-1 do zastosowania według wynalazku można przed zastosowaniem w wynalazku formułować z jedną albo wieloma zaróbkami. Przykładowo, związek czynny do zastosowania według wynalazku można kompleksować z dwuwartościowym kationem metalu dobrze znanymi sposobami. Takie kationy metali obejmują, przykładowo Zn²⁺, Mn²⁺ Fe²+, Co²+, Cd²+, Ni²+ ^itp.

Ewentualnie, aktywny związek stosowany w niniejszym wynalazku można połączyć z farmaceutycznie dopuszczalnym buforem i dopasować pH tak by zapewnić dopuszczalną stabilność i pH dopuszczalne do podawania pozajelitowego.

Ewentualnie, można dodać jeden lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych czynników przeciwbakteryjnych. Zalecanymi czynnikami przeciwbakteryjnymi są meta-krezol i fenol. Można dodać jedną lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych soli w celu uzyskania odpowiedniej siły jonowej i toniczności. Można następnie dodać jedną lub więcej zaróbek w celu uzyskania izotoniczności formulacji. Gliceryna jest przykładem zaróbki kontrolującej izotoniczność.

Podawanie można prowadzić każdą skuteczną drogą podawania znaną praktykującym lekarzom. Zalecaną drogą podawania jest droga pozajelitowa. Podawanie pozajelitowe w literaturze medycznej jest zwykle rozumiane jako wstrzykiwanie postaci dawkowania do ustroju sterylną strzykawką albo przy użyciu innych mechanicznych przyrządów takich jak pompa infuzyjna. Pozajelitowe drogi podawania obejmują podawanie dożylne, domięśniowe, podskórne, dootrzewnowe, dordzeniowe, dokanałowe, do komór mózgu, dotętnicze, podpajęczynówkowe i nadtwardówkowe. Do zastosowania według niniejszego wynalazku bardziej zalecane jest dożylne, domięśniowe i podskórne podawanie związku. Jeszcze bardziej zalecane jest podawanie związku do zastosowania według niniejszego wynalazku drogami dożylną i podskórną. Do podawania pozajelitowego aktywny związek stosowany w niniejszym wynalazku jest połączony z wodą destylowaną przy odpowiednim pH.

Dodatkowe metody farmaceutyczne mogą zostać wykorzystane w celu kontrolowania czasu działania. Preparaty uwalniające w sposób kontrolowany można uzyskać przez wykorzystanie polimerów do stworzenia kompleksu lub adsorbowania aktywnego związku do zastosowania według niniejszego wynalazku. Wydłużony czas trwania można uzyskać przez wybranie odpowiednich makrocząsteczek, na przykład poliestrów, poliaminokwasów, poliwinylopirolidonu, octanu etylenowinylowego, metylocelulozy, karboksymetylocelulozy albo siarczanu protaminy, i poprzez wybranie stężenia makrocząsteczek, jak również przez sposoby jego włączania w celu wydłużenia czasu uwalniania. Innym możliwym sposobem wydłużenia czasu działania przez preparaty o przedłużonym uwalnianiu jest włączenie aktywnego związku według wynalazku w cząstki materiału polimerowego takiego jak poliestry, poliaminokwasy, hydrożele, poli(kwas mlekowy), albo kopolimery octanu etylenowinylu. Alternatywnie, jest możliwe zamiast włączania związku w te cząstki polimerowe zamknięcie związku stosowanego w niniejszym wynalazku w przygotowane mikrokapsułki, na przykład, przez techniki koacerwacji albo przez polimeryzację interfazową, na przykład, odpowiednio z hydroksymetylocelulozą albo mikrokapsułkami żelatynowymi, albo w koloidalne układy przenoszenia

PL 190 991 B1 leku, na przykład, liposomy, mikrosfery albuminowe, mikroemulsje, nanocząstki i nanokapsułki albo w makroemulsje. Takie techniki są ujawnione w Remington's Pharmaceutical Sciences (1980).

Zastosowanie według wynalazku obejmuje podawanie związku do zastosowania według niniejszego wynalazku na około 1-16 godzin przed przeprowadzanym zabiegiem chirurgicznym, w trakcie operowania tego pacjenta i po zabiegu operacyjnym tego pacjenta przez okres nie dłuższy niż około 5 dni.

Jak wspomniano powyżej, długość czasu od rozpoczęcia podawania związku według niniejszego wynalazku do rozpoczęcia zabiegu operacyjnego wynosi od około 16 godzin do około godziny. Długość czasu podawania przed operacją związku według niniejszego wynalazku w celu zmniejszenia efektów katabolicznych i oporności na insulinę będzie zależeć od czynników których skutki są znane specjaliście w dziedzinie i obejmują przede wszystkim to czy pacjent był głodzony, albo otrzymywał glukozę we wlewie, albo w płynie do picia, albo w jakiejś innej postaci podtrzymywania glikemii w trakcie okresu przygotowawczego do zabiegu operacyjnego i również bez ograniczania obejmują płeć pacjenta, masa ciała i wiek, nasilenie niezdolności do normowania poziomu glukozy, przyczyny powodujące niezdolność do normowania poziomu glukozy i oczekiwane nasilenie urazu wywoływanego przez zabieg chirurgiczny, drogę podawania, biodostępność, utrzymywanie się w organizmie, rodzaj preparatu i siłę działania podawanego związku. Zalecany przedział czasu, w trakcie którego rozpoczęte jest podawanie związku według wynalazku waha się od około godziny do około dziesięciu godzin przed zabiegiem operacyjnym. Najbardziej zalecany przedział czasu w którym rozpoczyna się podawanie waha się od dwóch do ośmiu godzin przez operacją.

Jak zostało tutaj wyjaśnione, oporność na insulinę, która występuje po konkretnym rodzaju zabiegu chirurgicznego, po planowych operacjach brzusznych jest największa w pierwszym dniu po zabiegu, trwa przynajmniej pięć dni i normalizacja tego stanu trwa do trzech tygodni (Thorell, A. i in., (1991). Tak więc pacjent po operacji może potrzebować podawania związku według wynalazku przez okres występujący po urazie chirurgicznym, który lekarze specjaliści w dziedzinie rozpoznają i ocenią. Między tymi czynnikami jest to czy pacjent był utrzymywany na czczo, czy podawano mu glukozę we wlewie lub w płynach doustnych, albo w inny sposób przeprowadzano podtrzymywanie pacjenta po operacji, są nimi również bez ograniczania; płeć pacjenta, masa ciała i wiek, nasilenie niezdolności do kontrolowania poziomu glukozy we krwi, przyczyny powodujące niezdolność do kontrolowania poziomu glukozy we krwi, aktualne nasilenie urazu powodowanego przez zabieg operacyjny, droga podawania i biodostępność, utrzymywanie się w ustroju, rodzaj preparatu i siła działania podawanego związku. Odpowiedni czas trwania podawania związków według niniejszego wynalazku nie wynosi dłużej niż pięć dni po operacji.

Termin „pooperacyjne zmiany kataboliczne” jest dobrze znany chirurgom specjalistom [Shaw J.H.F. i in., Ann. Surg. (1989); Little R.A. i in. , (1987); Frayn K.N. (1986); Brandi L. i in., (1993)] i jest określany tutaj jako stan metabolizmu wywoływany przez uraz zabiegu operacyjnego, który może być scharakteryzowany przez jedno lub więcej następujących zjawisk: ujemny bilans azotowy z utratą azotu ustrojowego [Wernerman J. i in., J. Parent. Enter. Nutr. 10:578-82 (1986); Tashiro T. i in.,

J. Parent. Enter. Nutr. 9:452-5 (1985)]; wykorzystywanie tłuszczów preferencyjnie w stosunku do glukozy ze zmniejszeniem wskaźnika oddechowego [Frayn K.N i in., Arch. Emerg. med. 4:91-9 (1987); Stjernstrom H. i in., Clin. Physiol. 1:59-72 (1981)], endogenna produkcja glukozy kosztem białek ustrojowych i zapasów energetycznych pomimo hiperglikemii [Gump F.E. i. in., (1974); Black R.B. i in., (1982); Frayn K.N. i in., (1987); Frayn K.N. i in., Br. Med. Bull. 41(3):232-9 (1985)].

Termin oporność na insulinę jest również dobrze znany lekarzom specjalistom w dziedzinie i jest zdefiniowany tutaj jako stan fizjologiczny, w którym normalne stężenie insuliny wywołuje mniejszą niż zwykle odpowiedź. Oporność na insulinę może zależeć od zmniejszenia wiązania insuliny do receptorów powierzchni komórek, albo od zmian wewnątrzkomórkowego metabolizmu. Pierwszy rodzaj charakteryzujący się zmniejszeniem wrażliwości na insulinę zwykle może być przezwyciężony zwiększonym stężeniem insuliny. Drugi rodzaj charakteryzujący się zmniejszoną odpowiedzią na insulinę nie może być przezwyciężony wielką ilością insuliny. Oporność na insulinę występująca po urazie może być przezwyciężona przez dawki insuliny proporcjonalne do stopnia oporności na insulinę tak więc występuje wtedy w sposób oczywisty zmniejszenie wrażliwości na insulinę [Brandi L. S. i in., Clin. Science 79:443-450 (1990); Henderson A. A. i in., Clin. Sci. 80:25-32 (1990)]. Zmniejszenie wrażliwości na insulinę występujące po planowej operacji brzusznej trwa przynajmniej pięć dni, lecz nie dłużej niż trzy tygodnie i jest najsilniejsze w pierwszym dniu pooperacyjnym, normalizacja może potrwać trzy

PL 190 991 B1 tygodnie [Thorell A. i in., (1993)]. Przyczyny obserwowanej przemijającej oporności na insulinę występującej po urazie nie są całkowicie zrozumiałe.

Dawka GLP-1, analoga GLP-1 lub pochodnej GLP-1 skutecznie normalizująca poziom glukozy we krwi pacjenta może zależeć od wielu czynników, które obejmują bez ograniczeń płeć pacjenta, masa ciała i wiek, nasilenie niezdolności do normowania poziomu glukozy, przyczyny powodujące niezdolność do normowania poziomu glukozy, to czy glukoza lub inne źródło węglowodanów jest jednocześnie podawane, drogę podawania, biodostępność, utrzymywanie się w organizmie, rodzaj preparatu i siłę działania. Podczas ciągłego podawania odpowiednia ilość na jednostkę czasu wynosi pomiędzy 0,25 a 6 pmol/kg masy ciała/min, przy czym zaleca się od około 0,5 do około

I, 2 pmol/kg/min. Przy podawaniu przerywanym dawka na pojedyncze podanie powinna uwzględniać przerwy między dawkami, biodostępność GLP-1, analoga GLP-1 albo pochodnej GLP-1 i poziom potrzebny do skutecznej normalizacji poziomu glukozy. W zakresie możliwości przeciętnego lekarza jest ustalenie dawki i częstotliwości podawania GLP-1, analoga GLP-1 albo pochodnej GLP-1 w celu osiągnięcia pożądanego efektu klinicznego.

Niniejszy wynalazek stanie się bardziej zrozumiały przez odniesienie do określonych przykładów, których celem jest zilustrowanie, a nie ograniczanie niniejszego wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Trzynastu pacjentów zakwalifikowanych do planowej operacji ortopedycznej (plastyka stawu biodrowego) wzięło udział w tym badaniu. Żaden z pacjentów nie miał wywiadu, ani objawów choroby metabolicznej, uszkodzenia wątroby albo cukrzycy. Poziomy glukozy we krwi na czczo, CRP i badania czynności wątroby (bilirubina, fosfataza alkaliczna, AST i ALT) były prawidłowe u wszystkich trzynastu pacjentów.

Badanie siedmiu pacjentów (grupa insuliny, wiek 56±5 lat, BMI 25±1 kg/m²) rozpoczęto o 08:00 po nocnym głodzeniu. Po początkowym okresie podstawowym, w trakcie którego pobierano próbki do pomiarów glukozy we krwi i hormonów oraz przeprowadzono pośrednią kalorymetrię przez 30 min, podawano dożylnie wlew insuliny (Acrtapid®, Novo, Kopenhaga) ze stałą prędkością 0,8 mU/kg/min, podczas którego podawano zmienny wlew glukozy (200 mg/ml) w celu utrzymania poziomu glukozy we krwi na stałym poziomie (4,5 mM). Po godzinie stanu stabilnego, wszyscy pacjenci przeszli standardowe leczenie operacyjne (plastykę stawu biodrowego). Operacja rozpoczęła się 290±23 minuty po rozpoczęciu wlewu insuliny. Okres hiperinsulinemii, normoglikemii utrzymywano następnie podczas zabiegu operacyjnego i kontynuowano przez następne 3-4 godziny po operacji. Dane zostaną zaprezentowane zgodnie z następującym nazewnictwem:

basal - 00 minpreddrzpoczęcciem wlewuinsuliny preop clamp - okres stabilnego stanu hiperinsulinemii, normoglikemii 60 min przed zabiegiem operacyjnym early op - od 10 do 40 min po rozpoczęciu zabiegu operacyjnego late op - nstatnio00 mioabbigsopeprcyyjngoo postop clamp - orren stbbilnego stanu hiperinsulinem,i, nprmgglikemi i l^wyj^ącyn 60 min rozpoczynający się 143±30 min po rozpoczęciu zabiegu operacyjnego.

Druga grupa pacjentów (grupa kontrolna, n=6, wiek 59±3 lata; BMI 26±1 kg/m²) odpowiadała grupie insulinowej co do wieku i BMI, otrzymała ten sam protokół przedoperacyjny (basal i preop clamp) siedem dni przed zabiegiem operacyjnym. Grupa kontrolna nie otrzymała schematu basal i preop clamp w dniu operacji. Jednakże bezpośrednio przed zabiegiem każdy pacjent w grupie kontrolnej otrzymał wlew insuliny (0,8 nU/kg/min), i rozpoczęto podawanie schematu clamp (postop) hiperinsulinemii i normoglikemii (4,5 mM).

Przez 30 min okresu podstawowego przeprowadzono kalorymetrię pośrednią [Frayn K.N. i in.,

J. Appl. Physiol. 55(2):628-34 (1983); Takala J. i in., Crit. Care Med. 17(10):1041-47 (1989)] i w trakcie ostatnich 30 min okresów preop i postop. Przeprowadzono określone w czasie pobieranie próbek moczu, w celu określenia wydzielania mocznika zawartego w moczu. Po korekcji zmian w wielkości puli mocznika [Tappy L. i in., Diabetes 37:1212-16 (1988)] wyliczono niebiałkowy wydatek energetyczny (EE), wskaźniki oddechowe (RQ) i podstawową przemianę tlenową.

Próbki krwi pobierano z żyły ogrzanej dłoni powtarzalnie w trakcie okresów basal, preop, early op, late op i postop. Poziom glukozy mierzono od razu wykorzystując metodę oksydazy glukozowej (Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, Ohio)[Hugget A.S i in., Lancet 2:368-70 (1957)]. Testy radioimmunologiczne (RIA) wykorzystywano do zmierzenia stężenia insuliny w surowicy [Grill V. i in., Metabolism 39:251-58 (1990)]; peptydu C [Novo Research, Bagsvaerd, Dania); kortyzolu [Harris V. i in.,

PL 190 991 B1

In Jaffe B.M. & Behrmann H.R, eds., Methods of hormone radioimmunoassay, Academic Press, New York and London (1979) str. 643-56] i glukagonu (Euro-Diagnostica AB, Malmo, Szwecja) [Faloona G.R i in., Glucagon radioimmunoassay technique, tom 1: Academic Press, Nowy Jork (1974)].

Wszystkie wartości są konkretnymi wartościami albo średnią ±SEM (błąd standardowy średniej). Za statystyczną znamienność uznawano p<0,05 odpowiednio przy zastosowaniu test istotności rangowania Wilcoxon'a i testu U Mann'a-Whitney'a dla danych sparowanych i niesparowanych. Ze względu na to, że w okresie postop poziomy insuliny w surowicy wykazywały tendencję w kierunku wartości niższych w grupie kontrolnej w porównaniu z grupą insulinową (p=0,06), GIR w trakcie okresów również korygowano w stosunku do przeważających wartości poziomów insuliny przez dzielenie GIR i średniego poziomu insuliny w trakcie 60 min okresu stabilnego.

Poziomy insuliny w surowicy były podobne w obu grupach, zarówno w okresie basal jak i preop. W grupie insuliny, poziomy insuliny utrzymywały się na poziomie około 60 pU/ml w trakcie operacji i okresu postop. W grupie kontrolnej były niezmienione w trakcie zabiegu operacyjnego w porównaniu z okresem basal. Poziomy insuliny w okresie postop w grupie kontrolnej nie różniły się znacząco, ani w stosunku do okresu preop, ani w stosunku do okresu postop grupy insulinowej.

Poziomy peptydu C (tabela 1) były podobne w obu grupach w okresach basal, preop i postop. Poziomy peptydu C były niższe w grupie insulinowej w trakcie operacji w porównaniu z grupą kontrolną.

Poziomy glukagonu w surowicy zmniejszyły się (p<0,05) w trakcie trwania zabiegu operacyjnego w obu grupach, jednakże relatywne zmiany po operacji (% vs preop) były większe w grupie insulinowej (p<0,01 vs kontrola).

Poziomy kortyzolu w surowicy (tabela I) zmniejszyły się po operacji w grupie insulinowej, podczas gdy w grupie kontrolnej miały tendencję wzrostową (p=0,1). Pooperacyjne poziomy kortyzolu były niższe w grupie insulinowej w porównaniu z grupą kontrolną (p<0,05).

T a b e l a I

Poziomy hormonów u pacjentów poddanych zabiegowi plastyki stawu biodrowego po nocnym głodzeniu (kontrola, n=6), albo po 4 godzinach fizjologicznej hiperinsulinomii (insulina, n=7)

	Basal	Preop	Early op	Late op	Post op
Peptyd C kontrola	0,68±0,08	0,41±0,09	0,70±0,11	0,70±0,13	0,31±0,09
insulina	0,68±0,09	0,45±0,05	0,42±0,06*	0,58±0,12	0,52±0,11
Glukagon kontrola	48±2	42±1	43±3	41±3	37±2*
insulina	58±7	52±3*	40±3	35±4	33±4*
Kortyzol kontrola	229±39	238±21	154±63	116±43	366±83*
insulina	171±41	266±35	234±46	212±44	172±83*·

* p<0,05 w porównaniu z preop w teście istotności rangownia Wilcoxon'a • p,O,05 w porównaniu z kontrolą w teście U Mann-Whitney'a

Poziomy glukagonu maleją w obu grupach po zabiegu operacyjnym, jednakże większy spadek (%) znaleziono w grupie insulinowej (p<0,01 vs kontrola). Poziomy glukagonu maleją po operacji w grupie insulinowej (p<0,05 vs preop), podczas gdy w grupie kontrolnej obserwowana jest tendencja wzrostowa (p=0,1). Tak więc, po zabiegu operacyjnym poziomy kortyzolu są znacząco niższe w grupie insulinowej w porównaniu z grupą kontrolną (p<0,05).

Prędkości wlewu glukozy (ilość glukozy na jednostkę czasu) (GIR) nie różniły się znacząco w obu grupach w trakcie okresu preop. Grupa kontrolna miała mniejszy średni GIR wymagany do utrzymania normoglikemii w trakcie okresu postop w porównaniu z okresem preop (-39±5%, p<0,05). w przeciwieństwie do tego w grupie insulinowej utrzymywano stały GIR w trakcie zabiegu operacyjnego i średnio, GIR miał nawet tendencję wzrostową w okresie postop (+16±20%, p=0,2). Bardziej znaczące i niespodziewane jest to, że średni GIR w trakcie okresu postop w grupie insulinowej był znacząco wyższy w porównaniu z grupą kontrolną (p<0,05) (patrz fig. 1). Wszystkie zmiany GIR w okresach preop i postop były znaczące statystycznie (p<0,05), bez względu na to czy GIR był korygowany dla średnich stężeń insuliny w trakcie okresu stabilnego.

Współczynniki utleniania glukozy i tłuszczów były podobne w obu grupach przed zabiegiem operacyjnym. W trakcie operacji współczynniki utleniania glukozy były znacząco wyższe, podczas

PL 190 991 B1 gdy współczynniki utleniania tłuszczów były znacząco niższe w grupie insulinowej (p<0,05 vs kontrola). W. okresie postop nie znaleziono żadnych zmian we współczynnikach substratów utleniania w grupie insulinowej w porównaniu z okresem preop. Spoczynkowy wydatek energetyczny (EE) nie różnił się w obu grupach w trakcie i po zabiegu operacyjnym i utrzymywał się na tym samym poziomie w obu grupach po operacji w porównaniu z okresem preop.

Poziomy glukozy na czczo były podobne w grupie insulinowej i kontrolnej. W stanie stabilnym w trakcie wlewu utrzymywano normoglikemię, wynikiem tego był stały międzyosobniczy wskaźnik wariacji dla glukozy 4,6% w grupie kontrolnej i 6,2% w grupie insulinowej.

Stwierdzenia te jednoznacznie wskazują na to, że pacjenci poddani planowemu zabiegowi operacyjnemu na czczo rozwijają pooperacyjną oporność na insulinę i zwiększone spalanie tłuszczów. Następnie stwierdzenia te wykazują po raz pierwszy, że pooperacyjne zmiany kataboliczne mogą być całkowicie zniesione i może zostać całkowicie złagodzona hormonalna odpowiedź na stres jeśli pacjenci w momencie rozpoczęcia zabiegu operacyjnego mają podniesione poziomy insuliny i jest to utrzymywane w trakcie operacji.

P r zykła d 2

Amid GLP-1(7-36) podawano we wlewie podskórnym z prędkością 1,2 pmol/kg/godz. przez 10 godzin nocnych pięciu pacjentom z cukrzycą insulinoniezależną (NIDDM). Jako kontrola prowadzony był wlew insuliny tym samym pięciu pacjentom, lecz innego dnia niż wlew amidu GLP-1(7-36). Prędkość wlewu insuliny dopasowywano co dwie godziny w celu osiągnięcia optymalnej kontroli i uniknięcia hipoglikemii. Jak wykazano na podstawie danych w tab. II i na fig. 2, podskórny wlew amidu GLP-1(7-36) prawie normalizował poziom glukozy we krwi bez wywołania hipoglikemii u któregokolwiek z pacjentów. Metaboliczna kontrola, którą zapewniał GLP-1(7-36) była lepsza niż osiągana przy wlewie insuliny i średni poziom glukozy we krwi był niższy dla leczenia GLP-1(7-36) niż w grupie kontrolnej, było to znaczące statystycznie w godzinach 23:00, 0:00 i o 1:00.

T a b e l a II

Średnie poziomy glukozy pięciu pacjentów z NIDDM, u których prowadzono ciągły wlew amidu GLP-1(7-36). W badaniu kontrolnym w innym dniu w ciągłym wlewie podawano insulinę tym samym pacjentom.

Wlew GLP-1	Wlew insuliny (kontrola)
godzina	średni poziom glukozy we krwi (mM)	błąd standardowy (mM)	średni poziom glukozy we krwi (mM)	błąd standardowy (mM)
21:00	7,5	0,4	6,9	0,68
22:00	5,4	0,7	6,6	0,55
23:00	4,1	0,1	5,9	0,98
0:00	4,4	0,2	5,6	0,90
1:00	4,4	0,2	5,1	0,58
2:00	4,8	0,3	5,2	0,58
3:00	5,2	0,4	5,4	0,30
4:00	5,4	0,4	5,7	0,25
5:00	5,8	0,4	6,0	0,30
6:00	6,0	0,4	6,1	0,38
7:00	6,2	0,4	6,1	0,33

P r zykła d 3

W trakcie dnia podawano wlew amidu GLP-1(7-36) pięciu pacjentom z NIDDM przez trzy godziny w trakcie śniadania, obiadu i kolacji. Godziny wlewu to 7:30 - 10:30 (śniadanie), 10:30 - 1:30 (obiad) i 4:30 - 7:30 (kolacja), jak to pokazano na fig. 3. W badaniu kontrolnym przeprowadzonym innego dnia tym samym pacjentom z NIDDM wstrzykiwano podskórnie insulinę bezpośrednio przed rozpoczęciem posiłków, jak to pokazano na fig. 3. Podczas wlewu GLP-1 poposiłkowy wzrost poziomu glukozy

PL 190 991 B1 obserwowany po wstrzyknięciu insuliny został wyeliminowany i utrzymany normalny poziom glukozy we krwi. Bezpośrednio po zakończeniu każdego z wlewów GLP-1(7-36) poziom glukozy we krwi znacząco wzrósł. Nie obserwowano innych niepomyślnych skutków amidu GLP-1(7-36).Dane te wskazują, że amid GLP-1(7-36) skuteczniej kontroluje poposiłkowe poziomy glukozy niż wstrzyknięcie insuliny i to, że kontrola ta jest skuteczna tak długo jak długo prowadzony jest wlew GLP-1(7-36).

T a b e l a III

Średnie poziomy glukozy pięciu pacjentów z NIDDM, u których rozpoczynając z początkiem każdego posiłku prowadzono wlew amidu GLP-1(7-36) przez trzy godziny. W badaniu kontrolnym tym samym pacjentom w innym dniu podawano insulinę podskórnie bezpośrednio przed każdym posiłkiem.

Posiłki rozpoczynały się o 7:30, 10:30 i o 4:30.

Wlew GLP-1	Wlew insuliny (kontrola)
godzina	średni poziom glukozy we krwi (mM)	błąd otanUarUoąy (mM)	średni poziom glukozy we krwi (mM)	błąd standardowy (mM)
7:00	5,4	0,35	6,1	0, 41
8:00	4,9	0,38	7,0	0,51
9:00	5,7	0,59	9,1	0,74
10:00	5,8	1,06	9,9	0,78
11:00	8,1	0,94	8,2	0,76
12:00	9,4	0,59	6,5	0,74
13:00	7,2	1,18	9,1	0,90
14:00	5,3	1,21	8,1	0,91
15:00	7,2	0,71	7,0	0,87
16:00	10,4	0,26	7,2	0,57
17:00	9,2	1,06	6,5	0,59
18:00	5,7	1,59	7,3	0,65
19:00	6,6	0,94	6,1	0,59
20:00	8,3	0,71	6,0	0,41
21:00	9,3	0,71	6,4	0,44

Zastrzeżenia patentowe

Claims

1. Zastosowanie peetyyu wykaaującceg aktywnośśinsslinotrooową przze oddziaływanie z reecetorem GLP-1 do wytwarzania leku do leczenia pacjentów, u których stwierdzono hieerglikemię wywołaną stresem.

2. Zantosowaniewaeług zzas^ 0, z znmieenntym. że stossjąsię peetyywayronoz gruppoobjmującej GLP-1, analogi GLP-1 i pochodne GLP-1.

3. Zastosowanie według zas^z. 1 albo 2, znamienne tym, że s^es stanowi s^es związany z operacją.

4. Zantosowanie weeług zantro. 3, znnmiennn tym, że peppyd ροεΙ^ się; proee, w i ub po operacji.

5. Zantosowanie według zantyz. 4, znamiennn tym, że peptyd ροό3^ się aby znormallzować poziom glukozy we krwi.

6. ZantosowaniewaełupzzntrOi5, z znmieenntym. żż ppoiom gluPaoz ww kiwi wakosio0oSato 4,1 mM do 7,5 mM.

PL 190 991 B1

7. Zastosowaniewedług zastrz.2,znnmliennn tym, żeGLP-1, analogGPL-1i pochodnąGLP-1 wybiera oię a grupy obejmującej GLL-1(7-34), GLL-1(7-35), GLL-1(7-36), GLL-1(7- 37) i sminswsaą osotsć któregokolwiek a osoraenaicO.

8. Zaatosowaaiewaeług zaatrz. 7, z nnmliennn tym, żeGLP-1, analog (SL^LLliug posCodna GLP-1 ma orayaajmaiej jenaą msnyfikację wybraaą a gruoy sbejmującej:

a) sogbtytugjęgliccna,soiyna,ccyteina,t reegina,aaooraaina,glutamina, tyrosana,alanina,waliay, iasleucyay, leucyay, metisaiay, feaylsslsaiay, argiaiay lub D-liayay aa liayaę w osaycji 26 i/lub osaycji 34; lub oubotytucję glicyay, oernay, cyoteiay, tresaiay, soosrsgiay, glutsmiay, tyrsayay, alaaiay, waliay, iasleucyay, legcyay, metisaiay, feaylsslsaiay, liayay lgb D-argiaiay aa argiaiaę w osaycji 36;

b) oubotytucję smiaskwsou snosraegs aa utleaisaie asmisot trnotsfsau w osaycji 31;

c) oubotytucję orayaajmaiej jedaej tyrsayay aa waliaę w osaycji 16; liayay aa teryaę w osaycji 18; kwatg atoaragiaswegs aa kwat glutamiaswy w osaycji 21; teryay aa glicyaę w osaycji 22; argiaiay aa glgtamiaę w osaycji 23; argiaiay aa alaaiaę w osaycji 24; i glgtamiay aa liayaę w osaycji 26;

d) stgstytugję osejmującą co najmniej j eena: gliccna, steyna, I ut> ccnteina ζζιήθιΟ w osaycji 8; kwat atoaragiaswy, glicyaę, teryaę, cytteiaę, tresaiaę, atoaragiaiaę, glgtamiaę, tyrsayaę, alaaiaę, waliaę, iasleucyaę, leucyaę, metisaiaę, lgb feaylsalaaiaę aamiatt kwatg glutamiaswegs w osaycji 9; teryaę, cytteiaę, tresaiaę, atoaragiaę, glgtamiaę, tyrsayaę, alaaiaę, waliaę, iasleucyaę, leucyaę, metisaiaę, lgb feaylsalaaiaę aamiatt glicyay w osaycji 10; i kwat glutamiaswy aamiatt kwatg atoaragiaswegs w osaycji 15; i

e) oubotytucję glicyay, teryay, cytteiay, tresaiay, atoaragiay, glutamiay, tyrsayay, alaaiay, waliay, iasleucyay, legcmay, metisaiay, lgb feaylsalaaiay lgb D- lgb N-acylswaaej lgb alkilswaaej osotaci Oittynyay aa Oittynyaę w osaycji 7.

9. Zastogowanie waeług zaattz. 8, znnmiennn tym, że arnalos GLP-- j^et wayrana z grupo sbejmgjącej GLP-1(7-34), GL--^^), GLP-1(7-36), GLP-1(7-37), i aminswaaą osttać któregskslwiek a osoraenaicO, osł wargakiem, że argiaiaę osnotawisas aamiatt liayay w osaycji 34.

10. Zattstswaaie wenłgg ζιοΤζ. 9, nnmminnnn tym, że aaalsg GLP-1 ttaaswi oscOsnaa GLP-1.

11. Zattstswaaie wenłgg aaotra. 10, nnmminnnn tym, że eotilsa amiaswa grgoa liayay jett acylswaaa.

12. Zastogowaniewaełup zzatrz. z, znnmiennn tym. że GL^--1 cnalos GF^--- I uP goscOsna GLP-1 ma wzór:

R^1-X^-Gl^g-Gl^y10-TOr^-POe^-TOr^-Ser^-At^o15-Val^-Ser^-Ser^-T^yr^-Le^g20-Y^-Gl^y-Gla^-Ala^-Ala^25-L^yt^-Z^-POe^-Ile^- ^-Ala^30-Tr^o-Le^g-Val^-L^yt^-Gl^y35-Ar^g-R^2, w którym:

R1 wybraay jett tosśrón L-Oittynyay, D-Oittynyay, neaamias-Oittynyay, 2-amias-Oittynyay, β-Oynrskty-Oittynyay, OsmsOittynyay, alfa-flgsrsmetyls-Oittynyay i alfa-metyls-Oittynyay;

X wybraay jett tosśrón Ala, Gly, Val, TOr, Ile, i alfa-metyls-Ala;

Y wybraay jett tosśrón Glu, Gla, Ala, TOr, Ser i Gly;

Z wybraay jett tosśrón Glu, Gla, Ala, TOr, Ser i Gly; i R2 wybraay jett tosśrón NH2 i Gly-OH.

13. Zattstswaaie wenług aaotra. 2, nnmminnnn tym, że GL--1, aaalsg G-L-1 lub oscOsnaa GL--1 aabeaoiecasae tą or2en aktywasścią nioeotynyls-oeotynaay IV.

14. Zattstswaaie wenług aaotra. 2, nnmminnnn tym, że GL--1, aaalsg G-L-1 lub oscOsnaa ^GL--¹ jeo^t w^ybraaa a ^gru^oy s^bejmuj^ącej: ^G|y8-^GLp-¹(⁷-³⁶)^NH2^{, V}a^|8-^GLp-¹(⁷-³⁷)^OH, a^lfa- metyls-^^--1(7-36^² i Gl^Gla^GL-^^OH.

15. Zattstswaaie wenług aaotra. 2, nnmminnnn tym, że G—-1, aaalsg G-L-1 lub oscOsnaa G—-1 jett wytwsrasaa w tostsbie nerywatyaswaaia aaalsgu G—-1 wybraaegs a gruoy sbejmującej GL--1(7-34), GL--1(7-35), GL--1(7-36), GL--1(7-37) i aminswaaą osttać któregskslwiek a osoraenaającycO, w którycO G—-1, aaalsg G-L-1 lub oscOsnaa G—-1 ostiana orayaajmaiej jenaą msnyfikację wybraaą a gruoy sbejmującej:

a) oubotytucję glicyay, teryay, cytteiay, tresaiay, atoaragiay, glutamiay, tyrsayay, alaaiay, waliay, iasleucyay, leucyay, metisaiay, feaylsalaaiay, argiaiay lub D-liayay aa liayaę w osaycji 26 i/lub osaycji 34; lub oubotytucji glicyay, teryay, cytteiay, tresaiay, atoaragiay, glutamiay, tyrsayay, alaaiay, waliay, iasleucyay, leucyay, metisaiay, feaylsalaaiay, liayay lub D-argiaiay aa argiaiaę w osaycji 36;

b) oubotytucję amiaskwatu snosraegs aa utleaiaaie aamiatt tryotsfaau w osaycji 31;

PL 190 991 B1

c) substytucję przynajmniej jednej za walinę w pozycji 16; lizyny za serynę w pozycji 18; kwasu asparaginowego za kwas glutaminowy w pozycji 21; seryny za glicynę w pozycji 22; argininy za glutaminę w pozycji 23; argininy za alaninę w pozycji 24; i glutaminy za lizynę w pozycji 26;

16. Zastosowanie według 15, znamienne tym, że analog GLP-1 wybrany jess z grupy obejmującej: GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), GLP-1(7-37) i amidowaną postać któregokolwiek z poprzedzających, i pod warunkiem, że argininę podstawia się zamiast lizyny w pozycji 34.

17. według zaslirz. 16, znamienne tym, że analog GLP-1 jest poprzez acylowanie grupy epsilon-aminowej lizyny.

18. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że analog GLP-1 zawiera substytucję waliny zamiast alaniny w pozycji 8 i dodatkowo zawiera jedną lub więcej substytucji, delecji, inwersji lub addycji aminokwasowych.