PL191018B1 - Produkt biologiczny do zapobiegawczego lub leczniczego stosowania doustnego przeciwko psiej parwowirozie i sposób wytwarzania przeciwciał psiego parwowirusa - Google Patents

Abstract

1. Produkt biologiczny do zapobiegawczego lub leczniczego stosowania doustnego przeciwko psiej parwowirozie, znamienny tym, ze zawiera przeciwciala psiego parwowirusa uzyskane z siary uodpornionych krów i/lub zóltek jaj uodpornionych kur niosek. 2. Produkt do stosowania doustnego wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zawiera stabilizo- wane zywe kultury bakterii laktacydogennych. 3. Produkt wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zawiera minimalne stezenie przeciwcial psie- go parwowirusa na poziomie 16/100 TCID 50 . 11. Sposób wytwarzania przeciwcial psiego parwowirusa, znamienny tym, ze obejmuje uod- parnianie krów mlecznych i/lub kur niosek antygenem psiego parwowirusa, pobieranie siary od uodpornionych krów i/lub zóltek jaj od uodpornionych kur niosek oraz przetwarzanie uzyskanych substancji do postaci odpowiedniej do stosowania, np. osuszanie. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy produktu służącego zapobieganiu i leczeniu psiej parwowirozy i sposobu wytwarzania przeciwciał psiego parwowirusa.

Czynnikiem wywołującym tę chorobę jest psi parwowirus typ II (CPV-2), o którym wiadomo, że występuje w jednym typie antygenowym, który różni się zasadniczo od niechorobotwórczego parwowirusa typ I (CPV-1). Zakażenie psów przez CPV-2 następuje niemal wyłącznie drogą ustną. W związku z silnym powinowactwem wirusa do szybko reprodukujących się komórek somatycznych, zakażenie skupia się szczególnie w komórkach nabłonkowych jelita cienkiego. U szczeniąt na atak wirusa narażone są również komórki mięśnia sercowego. Zakażenie wywołuje zwyrodnienie i złuszczanie enterocytów i narażenie zrębu kosmków jelitowych, czego skutkiem jest znaczne zmniejszenie zdolności wchłaniania błony śluzowej jelita, hiperbiozy, transportu płynów z tkanek do światła jelita, zakłócenie równowagi mikroflory jelita oraz, w niektórych przypadkach, posocznica jelitowa wywołana przez patogenne dla jelit zarazki mogące żyć w różnych warunkach otoczenia (Escherichia coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp. i inne gatunki i rodzaje). Obraz kliniczny psiej parwowirozy charakteryzuje się dokuczliwymi wymiotami, silną postacią biegunki prowadzącą do odwodnienia oraz nagłej śmierci szczeniąt w przypadku zakażenia komórek mięśnia sercowego.

Poza doustnym podawaniem specyficznych przeciwciał nie ma innej znanej metody leczenia przyczynowego parwowirozy. W związku z tym leczenie psów koncentruje się na łagodzeniu objawów klinicznych, wspieraniu mechanizmów obronnych pacjenta oraz hamowaniu rozwoju wtórnych infekcji bakteryjnych. Specyficzna profilaktyka psiej parwowirozy oparta jest na uodparnianiu żywymi lub osłabionymi szczepionkami.

Powszechnie znana jest niewystarczalnośc istniejących metod terapeutycznych i immunoprofilaktycznych przeciwko psiej parwowirozie. Poniżej podsumowane są przyczyny takiego stanu.

Parwowirus jest wysoce odporny na czynniki fizyczne oraz środki chemiczne, ma zdolność przeżycia w środowisku w postaci w pełni aktywnej przez długi okres czasu.

Zakażone psy roznoszące parwowirus do otoczenia wraz z kałem są jedynym źródłem zakażenia.

Bardziej narażone na zakażenie wirusem są szczenięta, które nie posiadają w pełni rozwiniętego systemu odpornościowego we wczesnym okresie po narodzeniu. Ich odporność na zakażenie zależy od poziomu przeciwciał otrzymanych w fazie embrionalnej (5%), a szczególnie od przeciwciał siarowych (95%) pobranych w czasie pierwszych trzech dni po narodzinach. Innymi słowy, odporność szczeniąt na zakażenie parwowirusem zależy od dwóch dalece zmiennych czynników, tj. poziomu odporności matki (stężenie przeciwciał parwowirusa w siarze) oraz ilości siary otrzymanej w pierwszych dniach po urodzeniu.

Szczepienie dorosłych psów nie zapewnia dożywotniej odporności na zakażenie parwowirusem. Odporność osiąga najwyższy poziom między 28 a 35 dniem po szczepieniu, po czym jej poziom obniża się. W związku z tym konieczne jest szczepienie psów co najmniej raz do roku.

Szczepienie szczeniąt jest utrudnione przez tak zwane okno odpornościowe, tj. okres dwóch do czterech tygodni, kiedy to poziom przeciwciał siarowych obniża się poniżej progu ochronnego, ale jest wciąż wystarczająco wysoki, aby zneutralizować efekt antygenowy szczepionki. W tym okresie szczenięta są podatne na zakażenie, lecz nie mogą zostać skutecznie uodpornione. Początek okna odpornościowego różni się u poszczególnych osobników. Zwykle występuje w okresie między 6 a 12 tygodniem po narodzinach. Niektórzy autorzy uważają, że okres ten rozciąga się aż do 16 tygodnia. Jest to zatem przyczyna, dla której większość programów szczepień zaleca rozpoczęcie szczepienia w wieku 6 tygodni i jego powtórzenia w odstępach dwutygodniowych aż do wieku 12 do 16 tygodni.

Skuteczność specyficznych działań profilaktycznych przeciwko psiej parwowirozie, takich jak szczepienie czy doustne podawanie przeciwciał, jest znacznie słabsze, ponieważ przenikanie krążących przeciwciał do enterocytów jelita cienkiego, jako miejsca pierwotnego zakażenia, jest dosyć trudne. Ten sam mechanizm ogranicza skuteczność przeciwciał siarowych wchłanianych do krążenia.

W związku z szeroko rozpowszechnionym występowaniem i dramatycznym przebiegiem psia parwowiroza uważana jest za jedną z najbardziej niebezpiecznych chorób psów, wiążącą się z wysoką umieralnością, szczególnie wśród szczeniąt.

Wymienione wcześniej problemy mogą być w znacznym stopniu wyeliminowane poprzez podawanie doustnego środka służącego zapobieganiu i leczeniu psiej parwowirozy, będącego przedmiotem wynalazku, który zawiera przeciwciała psiej parwowirozy jako najważniejszy czynny składnik. Wśród innych składników znajdują się stabilizowane kultury bakterii laktacydogennych, takich jak EnPL 191 018 B1 terococcus spp i/lub Lactobacillus spp o działaniu ochronnym oraz witaminy o działaniu wspierającym. Jednorodność produktu i standardowa zawartość czynnych składników w postaciach przeznaczonych do stosowania, takich jak pasta lub proszek, zapewniona jest przez połączenie czynnych składników z odpowiednimi nośnikami. Skuteczność produktu będącego przedmiotem wynalazku polega na sztucznym wywołaniu miejscowej odporności żołądkowo-jelitowej błony śluzowej psów, a w szczególności szczeniąt, przeciwko zakażeniu parwowirusem oraz wspieranie ogólnych mechanizmów ochronnych leczonych zwierząt. Głównym czynnym składnikiem produktu doustnego są specyficzne przeciwciała parwowirusa, które neutralizują psi parwowirus w jelicie, hamują początkowe stadium infekcji polegające na przyleganiu i przenikaniu wirionów do komórek nabłonkowych jelit i w ten sposób hamują infekcję lub łagodzą jej przebieg.

Przeciwciała psiej parwowirozy uzyskiwane są z niekonwencjonalnych źródeł, takich jak np. siara pochodząca od krów lub kur niosek uodpornionych przez antygen psiej parwowirozy. Przetwarzanie surowców, takich jak siara bydlęca, lub, lepiej, żółtka jaj, polega wyłącznie na uważnym zakonserwowaniu poprzez osuszanie rozpryskowe lub fluidalne, najlepiej zaś poprzez liofilizację. Otrzymany produkt jest białym lub żółtym proszkiem o składzie odżywczym identycznym ze składnikami odżywczymi zwykle stosowanymi w odżywianiu psów. Poziom przeciwciał psiej parwowirozy w suchej siarze lub żółtku jaj musi osiągać co najmniej miano neutralizacji 16 na 100 TCID₅₀ (50% Tissue Culture Infection Dose - dawka zakażająca hodowlę tkankową w 50%) na 0,5 mg suchej masy. Aktywność biologiczna przeciwciał parwowirusa może być zwiększona poprzez ich połączenie ze składnikiem probiotycznym zapewniającym powrót do normy eubiozy biocenozy bakteryjnej jelit zniszczonej przez infekcję parwowirusem. Stabilizowane żywe kultury rodzaju laktacydogennego Enterococcus spp lub Lactobacillus spp mogą zapobiegać rozmnażaniu się potencjalnie chorobotwórczych bakterii w jelitach w ten sposób zapobiegać ryzyku wystąpienia posocznicy jelitowej lub zmniejszyć je do minimum. Składnik probiotyczny wytwarzany jest przez zanurzoną, pulsującą kulturę wybranych szczepów bakterii laktacydogennych. Po oddzieleniu od pożywki hodowlanej kultury są stabilizowane poprzez liofilizację. Stężenie żywych bakterii powinno wynosić co najmniej 50 x 10⁹ (Colony Forming Units - jednostka tworząca kolonie) na 1 g koncentratu probiotycznego. Aby zwiększyć przeciętną odporność na infekcje, lek doustny może być uzupełniany składnikiem witaminowym zawierającym witaminy A, C, D, E oraz z grupy B bądź w postaci sypkiej, bądź też jako zawiesina olejowa. Minimalne dawki dzienne dla psów powinny wynosić 500 I.E. witaminy A, 35 I.E. witaminy D3, 7 mg witaminy E, 1,2 mg witaminy C, mg niacyny oraz 0,01 mg biotyny. Produkt jest przeznaczony głównie do podawania doustnego szczeniętom w różnym wieku, które są najbardziej narażone na zakażenie parwowirusem. W związku z tym wybrane zostały dwie postaci. Pasta, pakowana w plastikowych aplikatorach, jest odpowiednia dla nowonarodzonych i ssących szczeniąt oraz dla szczeniąt w okresie karmienia mlekiem. Z drugiej strony, postać sypka (proszek lub mieszanka) pozwala na łatwe mieszanie produktu z wszelkimi rodzajami karm przeznaczonych dla szczeniąt odstawionych od sutka i psów w każdym wieku, takich jak homogenaty mięsa, mięso puszkowane oraz granulowane lub suche karmy. Podczas gdy pasta pozwala na bezpieczne i dokładne dawkowanie doustne na język bez ryzyka wyplucia lub niebezpiecznego nadmiernego pobrania, postać sproszkowana jest odpowiednia do mieszania z karmą dla starszych i/lub odstawionych od sutka szczeniąt oraz dorosłych psów ze wszystkich grup wiekowych. Podstawowe składniki nośnika pasty to koloidalny hydrat silikonowy oraz destylowane monoglicerydy, które wraz z wysokiej jakości olejem jadalnym, tworzą jednorodną substancję z siecią molekularną zapewniającą jednorodne mieszanie wszystkich czynnych i nośnych składników. Niepożądanego zanieczyszczenia bakteryjnego należy unikać na wszystkich etapach produkcyjnych, w tym podczas napełniania plastikowych aplikatorów. W końcowym etapie produkcji postaci sproszkowanej wykorzystuje się wysokoenergetyczne nośniki, takie jak glukoza, laktoza, D-sorbitol i skrobia oraz odtłuszczone mleko lub osuszona serwatka. Postać sproszkowana (proszek, mieszanka) może być dodawana do karmy podawanej szczeniętom przed odstawieniem od sutka. W przypadku starszych psów, produkt może być dodawany do każdego rodzaju karm, takich jak granulowana lub sucha karma oraz mieszanki mięsne w postaci naturalnej (nie osuszonej).

Największa zaletą produktu będącego przedmiotem wynalazku jest możliwość przezwyciężenia niedostatków obecnie stosowanych metod profilaktycznych i terapeutycznych.

Środek jest wytwarzany z surowców biologicznych, które są składnikami typowych karm dla psów. Jest całkowicie nietoksyczny, a więc nie istnieje niebezpieczeństwo przedawkowania, nawet w przypadku podawania przez osoby niewykwalifikowane, może być bezpiecznie podawany szczeniętom i dorosłym psom w każdym wieku, może być stosowany zarówno przy leczeniu zaawansowanego

PL 191 018 B1 stadium infekcji parwowirusem, jak i w celu zapobiegania zakażeniu zwierząt narażonych na zakażenie, np. występujących w widowiskach z udziałem psów, zawodach, testach sprawnościowych lub przebywających w schroniskach dla zwierząt. Podawanie środka może zwiększyć odporność szczeniąt na zakażenie parwowirusem nie tylko w okresie ssania i po odstawieniu od sutka, ale również przed każdym przeniesieniem do innej grupy psów lub przed wszelkimi zmianami środowiskowymi. Produkt będący przedmiotem wynalazku może być również podawany w celu zwiększenia odporności szczeniąt w okresie okna odpornościowego występującego w wieku 6 do 12 tygodni. Lokalnie podawane przeciwciała nie kolidują z efektem szczepienia pozajelitowego i nie hamują rozwoju odporności poszczepiennej przeciwko psiej parwowirozie. Postaci, w jakich występuje produkt, tj. pasta lub proszek, pozwalają na wybranie optymalnego sposobu podawania we wszystkich kategoriach wiekowych psów, eliminując ryzyko nadmiernego pobrania przez nowonarodzone ssące szczenięta.

Produkt przeznaczony do doustnego stosowania w celu zapobiegania i leczenia psiej parwowirozy wytwarzany jest poprzez przetwarzanie podstawowych czynnych składników, nośników i dodatków witaminowych w celu uzyskania jednej z dwóch podstawowych postaci leku. Podczas gdy środek w postaci pasty jest przeznaczony dla ssących szczeniąt we wczesnym okresie po urodzeniu, postać sproszkowana przeznaczona jest do dodawania do pokarmu dla starszych szczeniąt i dorosłych psów. Podstawowe czynne składniki produktu będącego przedmiotem wynalazku są identyczne w obu postaciach.

Psi parwowirus (taki jak szczep CAPM V-464, Collection of Animal Pathogenic Microorganisms, Hudcova 70, Brno) reprodukowany w podatnej hodowli komórkowej (takiej jak linia komórek CRFK, A-72) do osiągnięcia miana hemaglutynacji na poziomie (HT) 512 na 1024, jest wykorzystywany jako antygen odpornościowy w celu uzyskania przeciwciał parwowirusa. Ostatecznie, antygen zostaje skoncentrowany 10- do 20-krotnie poprzez ultrawirowanie. Ciężarne krowy lub kury nioski, którym domięśniowo podaje się 0,2 do 1,0 ml antygenu wirusa zmieszanego z taką samą ilością olejowego środka wspomagającego, są wykorzystywane jako dawcy przeciwciał. Krowy są dwukrotnie uodparniane przed przewidywanym porodem, natomiast kury nioski są uodparniane trzykrotnie w odstępach 21-dniowych, a następnie w miarę potrzeby, zwykle w odstępach trzytygodniowych lub czterotygodniowych.

Poziomy przeciwciał parwowirusa są sprawdzane przy zastosowaniu testów hamowania hemaglutynacji lub neutralizacji wirusów. Miano przeciwciał wyrażane jest jako wzajemne wartości surowicy krwi, siary lub rozcieńczenia zawiesiny jajka hamujących 8 jednostek aglutynacji lub neutralizujących potencjał zakażeniowy TCID50 psiej parwowirozy.

Stężenie na poziomie 16/100 TCID50 przeciwciał psiej parwowirozy na 1 g produktu jest konieczne dla osiągnięcia oczekiwanego efektu.

Krowia siara lub żółtka jaj pochodzące od uodpornionych dawców muszą być poddane pełnej homogenizacji przed przekazaniem do dalszego przetwarzania. Shomogenizowana siara lub homogenat jajka są ostatecznie konserwowane przez suszenie przez rozpylenie lub osuszanie fluidalne, bądź też najlepiej poprzez liofilizację. Uzyskany żółtawo-biały proszek jest przechowywany w suchym i chłodnym miejscu do czasu dalszego przetwarzania.

Koncentrat probiotyczny jest wytwarzany przez zanurzoną pulsującą kulturę wybranych szczepów bakterii laktacydogennych gatunku Enterococcus faecium M74 (CCM 6226) lub Lactobacillus casei (CCM 3775) dla otrzymania, po wydzieleniu z ośrodka i stabilizacji skondensowanej biomasy przez osuszanie próżniowe, suchego koncentratu bakterii zawierającego co najmniej 50x10⁹ żywych komórek (CFU 50:109 na 1 g). Probiotyczne koncentraty przechowywane są w zamrażarce w temperaturze -18°C przed dalszym przetwarzaniem.

P r z y k ł a d 1

Jedną z ostatecznych postaci podawania produktu będącego przedmiotem wynalazku może być pasta przygotowana poprzez zmieszanie czynnych składników z nośnikami, z zapewnieniem jednorodności, a więc również standardowej zawartości tych pierwszych. Poszczególne czynne składniki produktu będącego przedmiotem wynalazku, w tym specyficzne przeciwciała psiego parwowirusa w postaci siary lub żółtek jaj otrzymanych od uodpornionych zwierząt-dawców, koncentrat probiotyczny zawierający stabilizowane żywe bakterie laktacydogenne oraz dodatki witaminowe są następnie mieszane z nośnikiem w próżni w specjalnym mieszalniku.

PL 191 018 B1

T a b e l a 1: Podstawowy skład produktu w postaci pasty

Składniki nośnika % wagowy

wysokiej jakości olej jadalny (np. olej arachidowy)		40-50
koloidalny SiloiU/hyUrolizat (CABOSIL)		4-6,5
destylowane monoglicerydy		1-3
Składniki czynne
osuszona siara lub żółtka jaj od uodpornionych zwierząt		18-45
koncentrat probiotyczny CFU 400x109 na 1 g (Enterococcuo faecium,	Lactobacilluo casei)	1-2,5
Dodatek witaminowy
mieszanka koncentratów witaminowych (witaminy A, D3, E, C, K3, B1,	B2, B-, B12, biotyna,	4-5
niacyna)

Po całkowitej homogenizacji produkt będący przedmiotem wynalazku jest pakowany do plastikowych aplikatorów o objętości 15 do 30 ml. Przeciętna dawka wynosi od 0,25 do 2 ml dziennie dla zwierzęcia.

P r z y k ł a d 2

Końcowy etap produkcji postaci sproszkowanej (proszek/mieszanka) produktu będącego przedmiotem wynalazku dokonywany jest w standardowych mikserach z ostrzami poruszającymi się poziomo i pionowo w celu uzyskania możliwie największej jednorodności produktu. Następnie czynne składniki zostają dokładnie wymieszane z mniejsza ilością nośnika i wówczas mikser wypełniany jest do pełnej objętości.

T a b e l a 2 : Podstawowy skład produktu w postaci sproszkowanej (proszek/mieszanka)

Składniki nośnika % wagowy osuszone mleko lub serwatka 18-39

Składniki czynne glukoza, skrobia, D-sorbitol 18-39 osuszona siara lub żółtka jaj od uodpornionych zwierząt-dawców 20-60 koncentrat probiotyczny CFU 400x10⁹ na 1 g (Enterococcus faecium M74, Lactobacillus casei) 1-2

Dodatek witaminowy mieszanka koncentratów witaminowych (witaminy A, D3, E, C, K3, B1, B2, Be, B12, biotyna, 1-2 cholina)

Po całkowitej homogenizacji produkt będący przedmiotem wynalazku jest pakowany do opakowań zawierających 100 do 200 g. Produkt jest dodawany do karmy dla szczeniąt i psów: dawka dzienna wynosi 3 do 20 g zależnie od wieku, rasy i wagi ciała zwierzęcia.

Claims (12)

1. Proouktbiolooiccnyddzzapoieegwcczegl ubleecnicczeg stosowaniaddustneegprzzeiwko psiej parwowirozie, znamienny tym, że zawiera przeciwciała psiego parwowirusa uzyskane z siary uodpornionych krów i/lub żółtek jaj uodpornionych kur niosek.

2. ProOuUtddstosos.wniadduktneegwcełubznntrz. 1,zznmieenntym. żż zzwierastaaiiizzu wane żywe kultury bakterii laktacydogennych.

3. ProOuktwcełubzzntrz. 1 ,zznmieenntym. żż znwieraminimalnestęężnieprzzeiwciałpsiego parwowirusa na poziomie 16/100 TCID50.

4. Produkt według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera witaminy i substancje nośne.

PL 191 018 B1

5. Produkt według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera Enterococcus spp i/lub Lactobacillus spp jako stabilizowane żywe kultury z gatunku bakterii laktacydogennych.

6. Produkt według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera stężenie stabilizowanych żywych kultur bakterii laktacydogennych w przedziale od 100x10⁶ do 100x10⁹ żywych komórek na 1 g.

7. Produkt weeługzastrz. 1, znnmiennn tym. że zawiera od 115 do 60% waa. siary pochodzącej od uodpornionych krów i/lub żółtek jaj pochodzących od uodpornionych kur niosek.

8. Produld wedługzastrz. 4, znamienny tym, że zawierai ioóci witamin odpowiaaarące co naamniej 100 I.E. dla witaminy A, 10 I.E. dla witaminy D3 i 2 mg dla witaminy E.

9. Produktweeług zastrz. 4, znamiennytym, że zawiera następującei ioóci ρΓοοθη^/θζΜθόników nośnych: olej jadalny 45 do 60%, wag. hydrolizat silikonowy 4 do 6,5% wag. i destylowane glicerydy 1 do 3% wag.

10. Produkt według zastrz. 4, znamienny tym, że zawiera następujące ilości procentowe składników nośnych: glukoza i/lub sacharoza i/lub skrobia 18 do 39% wag., osuszone mleko i/lub osuszona serwatka 18 do 39% wag.

11. Sposób wytwarzania pr^^^(^i\^(^i^ł psiego parwowirusa, znam lenny tym. że οόβ^^β uodparnianie krów mlecznych i/lub kur niosek antygenem psiego parwowirusa, pobieranie siary od uodpornionych krów i/lub żółtek jaj od uodpornionych kur niosek oraz przetwarzanie uzyskanych substancji do postaci odpowiedniej do stosowania, np. osuszanie.

12. Sposób wyywarzania psiego według zasSrz. 11, znamienny tym, że stosowany jest szczep CAPMV-464 psiego parwowirusa jako antygenu.