PL195772B1

PL195772B1 - Zastosowanie prekursora sterydów płciowych w kombinacji z selektywnym modulatorem receptora estrogenu

Info

Publication number: PL195772B1
Application number: PL99379648A
Authority: PL
Inventors: Fernand Labrie
Original assignee: Endorech Inc
Priority date: 1998-06-11
Filing date: 1999-06-10
Publication date: 2007-10-31
Also published as: KR100944261B1; CA2768841C; US6670346B1; MY157030A; CA2768773A1; CA2632567A1; EP2399582B9; IL140178A; HK1040367B; HK1040367A1; PL203343B1; DK2386305T3; EP1623712A3; EP1623712B1; ES2399051T3; EP2386305B9; WO1999063974A2; AU4253099A; US7884092B2; TR200100551T2

Abstract

1. Zastosowanie prekursora sterydów p lciowych wybranego z grupy obejmuj acej androst-5-eno-3 ß, 17 ß-diol i prolek androst-5-eno-3 ß,17 ß-diolu, przy czym prolek jest przekszta lcany do prekursora in vivo, w polaczeniu z leczniczo skuteczn a ilo sci a selektywnego modulatora receptora estrogenu do wytwarzania leku do po laczonej terapii lub zmniejszania ryzyka naby- cia osteoporozy, przy czym selektywny modulator receptora estrogenu ma nast epuj acy wzór: w którym R 1 i R 2 oznaczaj a niezale znie atom wodoru, hydroksyl lub ugrupowanie, które przekszta lca si e w hydroksyl in vivo; w którym Z oznacza dwuwarto sciowe zamykaj ace ugrupowanie; w którym R 100 oznacza dwuwarto sciowe ugrupowanie, które oddziela L od pier scienia B 4-10 odgradzaj acymi atomami; w którym L oznacza dwuwarto sciowe lub trójwarto sciowe polarne ugrupowanie wybrane z grupy obejmuj acej -SO-, -CON-, -N< i -SON<; w którym G 1 wybiera si e z grupy obejmuj acej atom wodoru, w eglowodór C 1 do C 5 lub dwuwarto sciowe ugrupowanie, które laczy G 2 i L z wytworzeniem 5-do 7-cz lonowego pier scienia heterocyklicznego, oraz chlorowiec lub nienasycone pochod- ne powy zszych; w którym G 2 nie ma lub wybiera si e j a z grupy obejmuj acej atom wodoru, w eglowodór C 1 do C 5 lub dwuwarto sciowe ugrupowanie, które laczy G 1 i L z wytworzeniem 5- do 7-cz lonowego pier scienia heterocyklicznego, oraz chlorowiec lub niena- sycone pochodne powy zszych; w którym G 3 wybiera si e z grupy obejmuj acej atom wodoru, metyl i etyl; przy czym prolek przekszta lcany in vivo w pre- kursor sterydu p lciowego ma ogólny wzór: . . . . . . . . . . . PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie prekursora sterydów płciowych w kombinacji z selektywnym modulatorem receptora estrogenu w leczeniu lub zmniejszaniu prawdopodobieństwa nabycia osteoporozy. Stosuje się nową kombinowaną terapię na podatne ciepłokrwiste zwierzęta, w tym ludziach. W szczególności, kombinacja obejmuje podawanie selektywnego modulatora receptora estrogenu (SERM) i podnoszenie poziomu prekursora sterydów płciowych u pacjenta, przy czym prekursor stanowi androst-5-eno-3e,17e-diol (5-diol).

Człowiek ma cechę unikalną, wraz z pewnymi innymi naczelnymi, posiadania nadnerczy, które wydzielają wielkie ilości prekursorowych sterydów, siarczanu dehydroepiandrosteronu (DHEA-S) i dehydroepiandrosteronu (DHEA), które przekształcają się w androstenodiol (5-diol), a następnie w czynne androgeny i/lub estrogeny w tkankach obwodowych (Labrie i in., w: Important Advances in Oncology. Red. V.T. de Vita, S. Hellman, S.A. Rosenberg. J.B. Uppincott, Philadelphia, 193-217, 1985; Labrie, Mol. Cell. Endocrinol. 78: C113-C118, 1991; Labrie, i in., w Signal Transduction in Testicular Cells. Ernst Schering Research Foundation Workshop. Red. V. Hansson, F.O. Levy, K. Tasken. Springer-Verlag, Berlin-New York (Supl. 2), str. 185-218, 1996; Labrie i in., Steroids, 62:148-158, 1997). W ostatnich badaniach (Labrie, i in., J. Clin. Endocrinol. Metab., 82: 2403-2409, 1997), opisaliśmy ostry spadek krążących ilości dehydroepiandrosteronu (DHEA), siarczanu DHEA (DHEA-S), androst-5-eno-3e,17e-diolu (5-diolu), 5-diol-S, estrów kwasów tłuszczowych 5-diolu i androstenodionu u mężczyzn i kobiet w wieku pomiędzy 20 i 80 lat.

Pomimo znaczącego spadku ilości endogennych androgenów u kobiet podczas starzenia, zastosowanie androgenów u kobiet po menopauzie ograniczano głównie z powodu obawy o zwiększone ryzyko choroby sercowo-naczyniowej, w oparciu o dawniejsze badania pokazujące niekorzystny profil lipidów przy androgenach. Ostatnie badania nie wykazały jednak znaczącego wpływu kombinowanej terapii estrogenowej i androgenowej na poziomy w osoczu cholesterolu, triglicerydów, HDL, LDL i stosunek HDL/LDL w porównaniu z samym estrogenem (Sherwin i in., Am. J. Obstet. Gynecol., 156: 414-419, 1987). Zgodnie z tymi obserwacjami pokazaliśmy, że DHEA, związek mający głównie androgenny wpływ, nie wykazuje wyraźnie szkodliwego wpływu na profil lipidów w osoczu (Diamond, i in., J. Endocrinol., 150: S43-S50, 1996). Podobnie, nie stwierdzono zmian w stężeniach cholesterolu, jego podfrakcji lub triglicerydów, w czasie terapii samym estradiolem po 6 miesiącach terapii implantami estradiol + testosteron (Burger i in., Br. Med. J. Clin. Res. Ed., 294: 936-937, 1987). Należy wspomnieć, że badanie u mężczyzn wykazało odwrotną korelację pomiędzy DHEA-5 w osoczu i lipoproteinami o niskiej gęstości (Parker i in., Science, 208: 512-514, 1980). Niedawno znaleziono korelację pomiędzy niskim poziomem w osoczu testosteronu i DHEA a zwiększonym otłuszczeniem trzewi, parametrem wyższego zagrożenia sercowo-naczyniowego (Tchernof i in., Metabolism, 44: 513-519, 1995).

5-diol jest związkiem biosyntetyzowanym z DHEA pod działaniem redukcyjnej dehydrogenazy 17e-hydroksysterydowej (17e-HSD) i jest słabym estrogenem. Wykazuje 85-krotnie niższe powinowactwo niż 17e-estradiol (E2) do receptora estrogenu w cytosolu przedniego płata przysadki szczura (Simard i Labrie, J. Steroid Biochem., 26: 539-546, 1987), potwierdzając dodatkowo dane otrzymane dla tego samego parametru w ludzkiej tkance raka macicy i piersi (Kreitmann i Bayard, J. Steroid Biochem., 11: 1589-1595,1979; Adams i in., Cancer Res., 41: 4720-4926, 1981; Poulin i Labrie, Cancer Res., 46: 4933-4937, 1986). Jednakże przy stężeniach w zakresie poziomów w osoczu u dorosłych kobiet, 5-diol wspomaga namnażanie komórek i zwiększa poziomy receptora progesteronu w komórkach ludzkiego raka piersi ZR-75-1 (Poulin i Labrie, Cancer Res., 46: 4933-4937, 1986) i zwiększa zależną od estrogenu syntezę glikoproteiny 52 kDa w komórkach MCF-7 (Adams i in., Cancer Res., 41: 4720-4926, 1981).

Jak wspomniano powyżej, wiadomo, że poziomy w osoczu DHEA, DHEA-S i 5-diolu spadają z wiekiem i odpowiednio, że występuje silna zależna od wieku redukcja wytwarzania androgenów i estrogenów w obwodowych docelowych tkankach. Takie zmiany w sekrecji DHEA-S i DHEA powodują znaczący spadek biochemicznych i komórkowych funkcji stymulowanych sterydami płciowymi. W wyniku tego, DHEA i DHEA-S stosowano ostatnio w leczeniu wielu stanów, które są związane ze spadkiem i/lub nierównowagą w poziomach sterydów płciowych.

Osteoporoza, stan powstający u mężczyzn i kobiet, jest związana ze spadkiem ilości androgenów i estrogenów. Estrogeny okazały się zmniejszać szybkość degradacji kości, podczas gdy androgeny okazały się budować masę kości. Jednakże terapia podawania estrogenu zwykle stosowana wobec osteoporozy wymaga dodania progestyn dla przeciwdziałania przerostom macicy i ryzyku raka

PL 195 772 B1 macicy indukowanego przez estrogeny. Ponadto, ponieważ estrogeny i progestyny zwiększają prawdopodobnie ryzyko raka piersi (Bardon i in., J. Clin. Endocrinol. Metab., 60: 692-697, 1985; Colditz i in., N. Engl. J. Med., 332: 1589-1593, 1995), stosowanie terapii substytucyjnej estrogen-progestyn jest akceptowane przez niewiele kobiet i zwykle przez zbyt krótkie okresy.

Pewne badania sugerują, że osteoporoza jest kliniczną manifestacją niedoboru androgenu u mężczyzn (Baran i in., Calcif. Tissue Res. 26: 103-106, 1978; Odell i Swerdloff, West J. Med. 124: 446-475, 1976; Smith i Walker, Calif. Tissue Res. 22 (Suppl.): 225-228, 1976). Terapia androgenowa, jak zauważono dla dekanianu nandrolonu, okazała się zwiększać gęstość minerałów kości kręgów kobiet po menopauzie (Need i in., Arch. Intern. Med., 149: 57-60, 1989). Terapia kobiet po menopauzie nandrolonem zwiększała zawartość minerałów w korze kości (Need i in., Clin. Orthop. 225: 273-278, 1987). Androgenne skutki uboczne zarejestrowano jednak u 50% pacjentów. Takie dane są interesujące, ponieważ chociaż prawie wszystkie obecne terapie są ograniczone do redukcji utraty kości, wzrost masy kości stwierdzono przy stosowaniu anabolicznego sterydu nandrolonu. Podobną stymulację tworzenia kości przez androgeny proponowano u mężczyzny z niedoczynnością gonad (Baran i in., Calcif. Tissue Res. 26: 103, 1978). Stymulację tworzenia kości u kobiet po menopauzie potraktowanych DHEA przez 12 miesięcy opisuje Labrie i in. (J. Clin. Endocrinol. 82: 3498-3505, 1997). DHEA (450 mg/kg, b.w., 3 razy tygodniowo) znacząco opóźniał pojawianie się guzów piersi u myszy C3H, które genetycznie wyhodowano z rozwojem raka piersi (Schwartz, Cancer Res. 39: 1129-1132, 1979). Ponadto, ryzyko powstania raka pęcherza wzrastało u mężczyzn mających niższe poziomy w osoczu DHEA (Gordon i in., Cancer Res. 51:1366-1369, 1991).

Zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych nr U.S. 5550107 odnosi się do sposobu leczenia raka piersi i macicy u podatnych ciepłokrwistych zwierząt, który to sposób może obejmować inhibicję hormonalnej sekrecji jajników metodą chirurgiczną (wycięcie jajników) lub chemiczną (zastosowanie agonisty LHRH, np. [D-Trp⁶,des-Gly-NH2¹⁰]LHRH-etyloamidu, lub antagonisty) jako część terapii kombinacyjnej. Omówiono antyestrogeny, androgeny, progestyny, inhibitory tworzenia sterydów płciowych (szczególnie katalizowanego 17β - hydroksysterydową dehydrogenazą lub aromatazą wytwarzania sterydów płciowych), inhibitory sekrecji prolaktyny i sekrecji hormonu wzrostu oraz sekrecji ACTH. Odpowiednik opublikowano pod numerem publikacji międzynarodowej WO 90/10462.

Ponadto choroby sercowo-naczyniowe wiąże się ze spadkiem poziomów w osoczu DHEA i DHEA-S, i zaproponowano, ż e DHEA oraz DHEA-5 zapobiegają lub leczą te stany (Barrett-Connor i in., N. Engl. J. Med. 315: 1519-1524, 1986).

U dorosłych szczurów Sprague-Dawley, Schwartz (w Kent, Geriatrics 37:157-160,1982) zauważył, że masa ciała spadła z 600 do 550 g przy pomocy DHEA nie naruszając poboru pożywienia. Schwartz (Cancer 39: 1129-1132, 1979) zauważył, że myszy C3H otrzymujące DHEA (450 mg/kg, 3 razy tygodniowo) uzyskały znacząco mniejszą masę i wyższy wiek niż kontrolne zwierzęta, miały mniej tłuszczu w ciele i były bardziej aktywne. Redukcję masy ciała uzyskano bez utraty apetytu lub ograniczania pokarmu. Ponadto DHEA może zapobiegać zwiększaniu masy u zwierząt hodowanych do uzyskania otyłości w stanie dorosłym (Kent, Geriatrics 37: 157-160, 1982).

Podawanie DHEA chudym szczurom Zucher zmniejszyło przyrost masy ciała pomimo większego poboru pokarmu. Potraktowane zwierzęta miały mniejsze poduszki tłuszczu, co ogólnie sugeruje, że DHEA zwiększa przemianę pokarmu, zmniejszając przyrost masy i akumulację tłuszczu (Svec i in., Proc. 2^nd Int Conf. Cortisol and Anti-Cortisols, Las Vegas, Nevada, USA, str. 56 abst., 1997).

Otyłość zwiększyła się u zmutowanych myszy A^vy (Yen i in., Lipids 12: 409-413, 1977) i szczurze Zucker (Cleary i Zisk, Fed. Proc. 42: 536, 1983). Potraktowane DHEA myszy C3H miały młodszy wygląd niż kontrolne (Schwartz, Cancer Res. 39: 1129-1132, 1979).

DHEA ogranicza występowanie miażdżycy tętnic u karmionych cholesterolem królików (Gordon i in., J. Clin. Invest 82: 712-720, 1988; Arad i in., Arteriosclerosis 9: 159-166, 1989). Ponadto, wysokie stężenia w osoczu DHEA-S opisano jako chroniące przed śmiercią od chorób sercowo-naczyniowych u mężczyzn (Barrett-Connor i in., N. Engl. J. Med. 315: 1519-1524, 1986). Poziomy w krążeniu DHEA i DHEA-S okazał y się więc być odwrotnie skorelowane ze ś miertelnością z powodu chorób sercowo-naczyniowych (Barrett-Connor i in., N. Engl. J. Med. 315: 1519-1524, 1986) i zmniejszają się równolegle ze zmniejszaniem immunokompetencji (Thoman i Weigle, Adv. Immunol. 46: 221-222,1989). Badanie u człowieka wykazało odwrotną korelację pomiędzy DHEA-S w surowicy płodowej i niskimi gęstościami lipoprotein (LDL) (Parker i in., Science 208: 512, 1980). Zastosowania DHEA, jak też korzyści z terapii androgenowej i estrogenowej omówiono w międzynarodowej publikacji patentowej WO 94/16709.

PL 195 772 B1

Nie sądzi się, że korelacje zauważone w dziedzinie sugerują skuteczne sposoby leczenia lub profilaktyki, lub są wolne od niepożądanych skutków ubocznych, jak terapie kombinacyjne ujawnione w wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie prekursora sterydów płciowych wybranego z grupy obejmującej androst-5-eno-3e,17e-diol i prolek androst-5-eno-3e,17e-diolu, przy czym prolek jest przekształcany do prekursora in vivo, w połączeniu z leczniczo skuteczną ilością selektywnego modulatora receptora estrogenu do wytwarzania leku do połączonej terapii lub zmniejszania ryzyka nabycia osteoporozy, przy czym selektywny modulator receptora estrogenu ma następujący wzór:

G.

w którym R1 i R2 oznaczają niezależnie atom wodoru, hydroksyl lub ugrupowanie, które przekształca się w hydroksyl in vivo;

w którym Z oznacza dwuwartościowe zamykające ugrupowanie; w którym R100 oznacza dwuwartościowe ugrupowanie, które oddziela L od pierścienia B 4-10 odgradzającymi atomami;

w którym L oznacza dwuwartościowe lub trójwartościowe polarne ugrupowanie wybrane z grupy obejmującej -SO-, -CON-, -N< i -SON<;

w którym G1 wybiera się z grupy obejmującej atom wodoru, węglowodór C1 do C5 lub dwuwartościowe ugrupowanie, które łączy G2 i L z wytworzeniem 5- do 7-członowego pierścienia heterocyklicznego, oraz chlorowiec lub nienasycone pochodne powyższych;

w którym G2 nie ma lub wybiera się ją z grupy obejmującej atom wodoru, węglowodór C1 do C5 lub dwuwartościowe ugrupowanie, które łączy G1 i L z wytworzeniem 5- do 7-członowego pierścienia heterocyklicznego, oraz chlorowiec lub nienasycone pochodne powyższych;

w którym G3 wybiera się z grupy obejmującej atom wodoru, metyl i etyl; przy czym prolek przekształcany in vivo w prekursor sterydu płciowego ma ogólny wzór:

xo w którym X wybiera się z grupy obejmującej H-, ROC-, RCO2CHRa- i RbSO2-, R wybrana z grupy obejmującej atom wodoru, prosty lub rozgałęziony (C1-C18)alkil, prosty lub rozgałęziony (C2-C18) alkenyl, prosty lub rozgałęziony (C2-C18) alkinyl, aryl, furyl, prosty lub rozgałęziony (C1-C18)alkoksyl, prosty lub rozgałęziony (C2-C18) alkenyloksyl, prosty lub rozgałęziony (C2-C18) alkinyloksyl, aryloksyl, furyloksyl i chlorowcowe lub karboksylowe analogi powyższych; Ra oznacza atom wodoru lub (C1-C6) alkil; i Rb wybiera się z grupy obejmującej hydroksyl lub jego sole, metyl, fenyl i p-toluil;

w którym Y oznacza karbonyl, tlen lub Y oznacza β-ΟΧ, przy czym X ma to samo znaczenie jak powyżej oraz α-H, i w którym Y ma inne znaczenie niż karbonyl, tlen gdy X oznacza H-.

Zastosowanie według wynalazku obejmuje dodawanie leczniczo skutecznej ilości bisfosfonianu w wytwarzaniu leku do terapii kombinacyjnej, ponadto podaje się leczniczo skuteczną ilość progestynu w wytwarzaniu leku do terapii kombinacyjnej.

Korzystnie Z w selektywnym modulatorze receptora estrogenu wybiera się z grupy obejmującej -O-, -NH-, -S- i -CH2-.

Selektywnym modulatorem receptora estrogenu jest pochodna benzopiranu o następującym ogólnym wzorze:

PL 195 772 B1

w którym D oznacza -OCH2CH2N(R3)R4, R3 i R4 niezależnie wybrane z grupy obejmującej C1-C4 alkil, lub R3, R4 i atom azotu, z którym są związane, razem tworzą strukturę pierścieniową wybraną z grupy obejmują cej pirolidyno, dimetylo-1-pirolidyno, metylo-1-pirolidynyl, piperydyno, heksametylenoimino, morfolino, w którym R1 i R2 niezależnie wybiera się z grupy obejmującej: atom wodoru, hydroksyl i ugrupowanie przekształcane in vivo w hydroksyl.

Pochodna benzopiranowa jest optycznie czynnym związkiem mającym absolutną konfigurację S na węglu 2 lub jego farmaceutycznie dopuszczalną solą, przy czym związek ma budowę cząsteczkową:

w którym R1 i R2 niezależ nie wybiera się z grupy obejmującej hydroksyl i ugrupowanie prze₃ kształcane in vivo do hydroksylu; w którym R³ oznacza grupę wybraną z grupy obejmującej nasycony, nienasycony lub podstawiony pirolidynyl, nasyconą, nienasyconą lub podstawioną piperydyno, nasycony, nienasycony lub podstawiony piperydynyl, nasyconą, nienasyconą lub podstawioną morfolino, zawierające azot cykliczne ugrupowanie, zawierające azot policykliczne ugrupowanie, oraz NRaRb, Ra i Rb oznaczają niezależnie atom wodoru, prosty lub rozgałęziony C1-C6 alkil, prosty lub rozgałęziony C2-C6 alkenyl, oraz prosty lub rozgałęziony C2-C6 alkinyl.

W zastosowaniu wedł ug wynalazku zwią zek lub sól nie zawiera zasadniczo enancjomeru (2R). Selektywny modulator receptora estrogenu wybiera się z grupy obejmującej:

PL 195 772 B1

Pochodna benzopiranu oznacza sól kwasu wybranego z grupy obejmującej kwas octowy, adypinowy, benzenosulfonowy, benzoesowy, kamforosulfonowy, cytrynowy, fumarowy, jodowodorowy, bromowodorowy, chlorowodorowy, hydrochlorotiazydowy, hydroksynaftoesowy, mlekowy, maleinowy, metanosulfonowy, metylosiarkowy, 1,5-naftalenodisulfonowy, azotowy, palmitynowy, piwalinowy, fosforowy, propionowy, bursztynowy, siarkowy, winowy, tereftalowy, p-tolueno-sulfonowy i walerianowy.

Korzystnie kwasem jest kwas chlorowodorowy.

Korzystnie selektywnym modulatorem receptora estrogenu jest:

Prolek przekształcany in vivo w prekursor sterydu płciowego wybiera się z grupy obejmującej:

W niniejszym opisie selektywny modulator receptora estrogenu (SERM) jest związkiem, który bezpośrednio lub przez aktywny metabolit działa jako antagonista receptora estrogenu („antyestrogen”) w tkance piersi, wytwarzają c estrogenne lub estrogenopodobne działanie na tkankę koś ci i poziomy

PL 195 772 B1 cholesterolu we krwi (to jest przez obniżenie cholesterolu w osoczu). Niesterydowe związki działające jako antagoniści receptora estrogenu in vitro lub w ludzkiej lub szczurzej tkance piersi (szczególnie jeśli związek działa jak antyestrogen na ludzkie komórki raka piersi) mogą działać jako SERM. Odwrotnie, sterydowe antyestrogeny mogą działać jako SERM, ponieważ nie wykazują żadnego korzystnego działania na cholesterol w osoczu. Niesterydowe antyestrogeny, które zbadaliśmy i stwierdzili ś my, ż e dział ają jako SERM, obejmują EM-800, EM-01538, Raloxifene, Tamoxifene i Droloxifene. Zbadaliśmy sterydowy antyestrogen ICI 182780 i stwierdziliśmy, że nie działa jako SERM. SERM według wynalazku można podawać w takich samych dawkach jak znane w dziedzinie, gdy te związki stosuje się jako antyestrogeny.

Zauważyliśmy też korelację pomiędzy korzystnym wpływem SERM na cholesterol w osoczu i korzystnym wpływem estrogennym lub estrogenopodobnym na kości i lipidy w osoczu. SERM, które w naszych badaniach działały korzystnie na wszystkie te parametry, obejmują masę kości, poziomy cholesterolu i triglicerydów. Bez wiązania się z teorią, można sądzić, że SERM, wiele z których korzystnie ma dwa pierścienie aromatyczne związane przez jeden do dwu atomów węgla, mogą oddziaływać z receptorem estrogenu dzięki powyższej części cząsteczki, która jest najlepiej rozpoznawana przez receptor. Korzystne SERM mają łańcuchy boczne, które mogą selektywnie wykazywać antagonistyczne właściwości w tkance piersi bez wykazywania znaczących antagonistycznych właściwości w innych tkankach. Tak więc SERM mogą działać w sposób pożądany jako antyestrogeny w piersi, podczas gdy niespodziewanie i w sposób pożądany działają jako estrogeny (lub wykazują estrogenopodobną aktywność) w kościach i we krwi (gdzie korzystnie wpływają na stężenia lipidu i cholesterolu). Korzystny wpływ na cholesterol i lipid przekłada się na korzystny wpływ na miażdżycę tętnic, na którą niekorzystnie wpływają niewłaściwe poziomy cholesterolu i lipidu.

Choroby leczone jak omówiono w opisie reagują korzystnie na androgeny. Zamiast stosować androgeny jako takie, zgłaszający stosują prekursory sterydów płciowych, takie jak 5-diol, lub proleki przekształcane w dowolne takie prekursory sterydów płciowych. In vivo, DHEA-S przekształca się w DHEA, który z kolei przekształca się w 5-diol. Można sądzić, że dowolna tkanka reagująca korzystnie na jeden z nich może odpowiadać prawdopodobnie korzystnie na inne. Postaci proleków aktywnych metabolitów są dobrze znane w dziedzinie. Patrz np. H. Bundgaard “Design and Application of Prodrugs” (w: A Textbook of Drug Design and Development. Red. H. Bundgaard i P. Krogsgaard-Larsen; Harwook Academic Publishers GmfH, Chur: Szwajcaria, 1991), dołączane niniejszym jako odnośniki. W szczególności, patrz str. 154-155 opisujące różne grupy funkcyjne aktywnych metabolitów i odpowiednie grupy proleków, które przekszałcają się in vivo w każdą grupę funkcyjną. Gdy poziomy prekursorów sterydów płciowych u pacjentów są podniesione zgodnie z wynalazkiem, można zwykle tego dokonać przez podawanie takiego prekursora lub podawanie prekursora takiego prekursora. Stosując prekursory zamiast androgenów zmniejsza się niepożądaną androgenną aktywność w tkankach innych niż docelowe. Tkanki przekształcają prekursory, takie jak DHEA, w androgeny tylko w naturalnym i bardziej regulowanym procesie. Znaczny procent androgenów powstaje lokalnie w obwodowych tkankach i w różnym stopniu w różnych tkankach.

Osteoporoza reaguje korzystnie na estrogenną lub estrogenopodobną aktywność. Stosując SERM według wynalazku uzyskuje się pożądane efekty w docelowych tkankach bez niepożądanego wpływu w pewnych innych tkankach. Np., SERM może mieć korzystne działanie estrogenne w kości (lub na lipid lub cholesterol) unikając niekorzystnego działania estrogennego na piersi.

Tak więc prekursor i SERM wywierają korzystny wpływ na docelowe tkanki, minimalizując niekorzystny wpływ na pewne inne tkanki. Ponadto istnieją istotne synergie przy stosowaniu obu razem według wynalazku. Np., estrogeny i androgeny wywierają korzystne działanie na osteoporozę różnymi mechanizmami (estrogen redukując resorpcję kości, androgen pomagając w tworzeniu kości). Kombinacja tu stosowana zapewnia kościom korzystne działanie estrogenu lub estrogenopodobne przez aktywność SERM, a także zapewnia korzystny androgen przez lokalną konwersję prekursora do androgenu w kości. Sądzi się, że prekursor także dostarcza estrogen.

W pewnych odmianach dodaje się progestyny uzyskują c dalsze dział anie androgenne. Progestyny można stosować w niskich dawkach znanych w dziedzinie bez niekorzystnego wpływania na receptory inne niż receptory androgenu (np. receptory glukokortykoidu). Są one także względnie wolne od niechcianych androgennych skutków ubocznych (takich jak włosy na twarzy żeńskich pacjentów).

Pacjent potrzebujący leczenia lub zmniejszania ryzyka ataku danej choroby jest tym, u którego zdiagnozowano taką chorobę lub który jest podatny na atak takiej choroby.

PL 195 772 B1

Jeśli nie powiedziano inaczej, korzystna dawka czynnych związków (stężeń i trybów podawania) według wynalazku jest identyczna dla leczniczych i profilaktycznych celów. Dawkowanie dla każdego składnika czynnego przedyskutowanego w wynalazku jest taka sama niezależnie od choroby leczonej (lub choroby, której możliwość ataku zmniejszono).

Jeśli nie powiedziano inaczej lub gdzie tak wynika z kontekstu, dawki odnoszą się do masy związków czynnych bez farmaceutycznych zaróbek, rozcieńczalników, nośników lub innych składników, chociaż takie dodatkowe składniki dołącza się użytecznie, jak pokazano w przykładach. Dowolna postać dawki (kapsułka, tabletka, zastrzyk lub tym podobne) zwykle stosowana w przemyśle farmaceutycznym nadaje się do stosowania w wynalazku, i terminy „zaróbka”, „rozcieńczalnik” lub „nośnik” obejmują takie nieaktywne składniki, jakie dołącza się typowo, wraz z czynnymi składnikami w takich postaciach dawek w przemyśle. Np., można stosować typowe kapsułki, pigułki, powłoki jelitowe, stałe lub ciekłe rozcieńczalniki lub zaróbki, środki smakowe, konserwanty, lub tym podobne.

Terapie kombinacyjne omówione w wynalazku obejmują także zastosowanie składnika czynnego (kombinacji) do wytwarzania leku do leczenia (lub zmniejszania ryzyka) danej choroby, gdzie leczenie lub zapobieganie obejmuje ponadto inny składnik czynny kombinacji. Na przykład w jednej odmianie, przedmiotem wynalazku zastosowanie SERM do wytwarzania leku do stosowania, w kombinacji z prekursorem sterydu pł ciowego 5-diolu i proleku przekształcanego w prekursor sterydu płciowego, in vivo, w leczeniu osteoporozy, dla której uważa się, że obecna terapia kombinacyjna jest skuteczna.

Krótki opis rysunków

Figura 1 pokazuje wpływ leczenia DHEA (10 mg, przezskórnie, raz dziennie) lub EM-800 (75 μg, doustnie, raz dziennie) samym lub w kombinacji przez 9 miesięcy od wystąpienia indukowanego DMBA raka sutka u szczura przez okres obserwacji 279 dni. Dane wyrażono jako procent łącznej liczby zwierząt w każdej grupie.

Figura 2 pokazuje wpływ leczenia DHEA (10 mg, przezskórnie, raz dziennie) lub EM-800 (75 μg, doustnie, raz dziennie) samym lub w kombinacji przez 9 miesięcy przy przeciętnej liczbie guzów na mające guzy zwierzę (A) i przy przeciętnych rozmiarach guza na mającego guzy szczura (B) przez okres obserwacji 279 dni. Dane wyrażono jako średnie ± SEM.

Figura 3 pokazuje wpływ leczenia DHEA (10 mg, przezskórnie, raz dziennie) lub EM-800 (75 μg, doustnie, raz dziennie) samym lub w kombinacji przez 9 miesięcy na poziomy w osoczu triglicerydu (A) i cholesterolu (B) u szczura. Dane wyrażono jako średnie ± SEM. **: P<0,01 doświadczalne wobec odpowiednich kontrolnych.

Figura 4 pokazuje: A) Wpływ zwiększania dawek DHEA (0,3 mg, 1,0 mg lub 3,0 mg) podawanych przezskórnie dwa razy dziennie przy przeciętnych rozmiarach guzów ZR-75-1 u nagich myszy z wyciętymi jajnikami (OVX) uzupełnianych estronem. Kontrolne myszy OVX otrzymujące sam nośnik stosuje się jako dodatkowe kontrole. Początkowy rozmiar guza przyjęto jako 100%. DHEA podawano przezskórnie (p.c.) w 0,02 ml 50% roztworu etanolu - 50% glikolu propylenowego na skórze grzbietu. B) Wpływ leczenia rosnącymi dawkami DHEA lub EM-800 samym lub w kombinacji przez 9,5 miesiąca na guzy ZR-75-1 u nagich myszy OVX uzupełnianych estronem. **, p < 0,01, potraktowane względem kontrolnych myszy OVX uzupełnianych estronem.

Figura 5 pokazuje wpływ rosnących dawek doustnych antyestrogenu EM-800 (15 μg, 50 μg lub 100 μg) (A) lub przezskórnego podawania rosnących dawek DHEA (0,3, 1,0 lub 3,0 mg) kombinowanych z EM-800 (15 μg) lub samego EM-800 (B) przez 9,5 miesiąca przy przeciętnych rozmiarach guzów ZR-75-1 u nagich myszy z wyciętymi jajnikami (OVX) uzupełnianych estronem. Początkowy rozmiar guza przyjęto jako 100%. Kontrolne myszy OVX otrzymujące sam nośnik użyto jako dodatkowe zwierzęta kontrolne. Estron podawano podskórnie w dawce 0,5 μg raz dziennie, podczas gdy DHEA rozpuszczano w 50% etanolu - 50% glikolu propylenowym i nakładano na powierzchnię skóry grzbietu dwa razy dziennie w objętości 0,02 ml. Dokonuje się też porównania ze zwierzętami OVX otrzymującymi sam nośnik.

Figura 6 pokazuje wpływ 12-miesięcznego traktowania dehydroepiandrosteronem (DHEA) samym lub w kombinacji z Flutamidem lub EM-800 na objętość kości beleczkowatej u szczurów z wyciętymi jajnikami. Nietknięte zwierzęta dodaje się jako dodatkowe zwierzęta kontrolne. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM ** p<0,01 względem kontrolnej OVX.

Figura 7 pokazuje wpływ 12-miesięcznego leczenia dehydroepiandrosteronem (DHEA) samym lub w kombinacji z Flutamidem lub EM-800 na liczbę beleczek u szczurów z wyciętymi jajnikami. Nietknięte zwierzęta dodaje się jako dodatkowe zwierzęta kontrolne. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM ** p < 0,01 względem kontrolnej OVX.

PL 195 772 B1

Figura 8 pokazuje bliższe przynasady piszczeli z nietkniętych szczurów kontrolnych (A), kontrolnych z wyciętymi jajnikami (B), i z wyciętymi jajnikami potraktowanych samym DHEA (C) lub w kombinacji z Flutamidem (D) lub EM-800 (E). Należy zauważyć zmniejszoną ilość kości beleczkowatych (T) u kontrolnych zwierząt z wyciętymi jajnikami (B), i znaczący wzrost objętości kości beleczkowatej (T) indukowany po podawaniu DHEA podawanie (C). Dodanie Flutamidu do DHEA częściowo zablokowało wpływ DHEA na objętość kości beleczkowatej (D), podczas gdy kombinacja DHEA i EM-800 dała pełną ochronę wobec związanej z wycięciem jajników utraty kości. Zmodyfikowany trójbarwny Masson-Goldner, powiększenie x 80. T: Beleczki, GP: Płytka wzrostowa.

Figura 9 pokazuje wpływ rosnących dawek (0,01, 0,03, 0,1, 0,3 i 1 mg/kg) EM-800, EM-1538 i Raloxifene (EM-1105) podawanych doustnie dziennie przez 4 dni na poziom cholesterolu u szczura z wyciętymi jajnikami.

Figura 10 pokazuje wpływ 34-tygodniowego leczenia dehydroepiandrosteronem (DHEA) samym lub w kombinacji z EM-1538 (EM-652-HCl) na gęstość minerałów w kręgach lędźwiowych u szczurów z wyciętymi jajnikami. Nietknięte zwierzęta dodaje się jako dodatkowe zwierzęta kontrolne. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM ** p<0,01 względem kontrolnej OVX.

Figura 11 pokazuje połączone efekty SERM (EM-652) i DHEA na parametry menopauzy. Nie oczekiwano negatywnego wpływu.

Figura 12 pokazuje stężenia w osoczu DHEA (ng/ml) (oś Y) w funkcji czasu (oś X) po pojedynczej doustnej absorpcji korzystnych prekursorów sterydów płciowych według wynalazku (150 μmol/szczura) u samców szczurów. W ramce podano AUC 24 godziny DHEA indukowanego przez te związki.

EM-760 dehydroepiandrosteron

EM-900 androst-5-eno-3e,17e-diol

EM-1304 3-octan androst-5-eno-3e,17e-diolu

EM-1305-CS dioctan androst-5-eno-3e,17e-diolu

EM-1397 3-octan, 17-benzoesan androst-5-eno-3e,17ediol

EM-1400 dibenzoesan androst-5-eno-3e,17e-diolu

EM-1410 dipropionian androst-5-eno-3e,17e-diolu

EM-1474-D dihemisukcynian androst-5-eno-3e,17e-diolu

Figura 13 pokazuje stężenie w osoczu androst-5-eno-3e,17e- diolu (ng/ml) (oś Y) w funkcji czasu (oś X) po doustnej absorpcji prekursora sterydu płciowego według wynalazku (150 μmol/szczura) u samców szczurów. W ramce podano AUC 24 godziny androst-5-eno-3e,17e-diolu indukowane przez te związki.

EM-760 dehydroepiandrosteron

EM-900 androst-5-eno-3e,17e-diol

EM-1304 3-octan androst-5-eno-3e,17e-diolu

EM-1305-CS dioctan androst-5-eno-3e,17e-diolu

EM-1397 3-octan, 17-benzoesan androst-5-eno-3e,17e-diol

EM-1400 dibenzoesan androst-5-eno-3e,17e-diolu

EM-1410 dipropionian androst-5-eno-3e,17e-diolu

EM-1474-D dihemisukcynian androst-5-eno-3e,17e-diolu

Estrogeny są dobrze znane ze stymulacji namnażania komórek nabłonka piersi, a samo namnażanie komórek uważa się za zwiększające ryzyko raka przez akumulację przypadkowych błędów genetycznych, które mogą spowodować nowotworzenie (Preston Martin i in., Cancer. Res. 50: 7415-21,1990). W oparciu o tę koncepcję wprowadzono antyestrogeny dla zapobiegania rakowi piersi w celu zmniejszenia szybkości podziału komórek stymulowanego przez estrogeny.

Utracie cykliczności jajeczkowania stwierdzanej u samic szczurów Sprague-Dawley po 10 miesiącach życia towarzyszy zwiększony poziom estrogenu i prolaktyny w osoczu i spadek stężeń w osoczu androgenu i progesteronu (Lu i in., 61st Annual Meeting of the Endocrine Society 106 (abst. #134), 1979; Tang i in., Biol. Reprod. 31: 399-413, 1984; Russo i in., Monographs on Pathology of Laboratory Animals: Integument and Mammary Glands 252-266, 1989; Sortino i Wise, Endocrinology 124: 90-96, 1989; Cardy, Vet. Pathol. 28: 139-145, 1991). Te zmiany hormonalne, które spontanicznie zachodzą u starzejących się samic szczurów, są związane z wieloogniskowym rozrostem i zwiększoną aktywnością wydzielniczą tkanki gronowej/pęcherzykowej, jak też rozszerzeniem kanału gruczołu sutkowego i tworzeniem cyst (Boorman i in., 433, 1990; Cardy, Vet. Pathol. 28:139-145, 1991). Należy wspomnieć, że zmianom rozrostowym i nowotworowym gruczołu sutkowego szczura często towarzyszą zwiększone poziomy estrogenów i prolaktyny (Meites, J. Neural. Transm. 48: 25-42, 1980). Leczenie

PL 195 772 B1

EM-800, SERM indukuje zanik gruczołu sutkowego, co charakteryzuje się spadkiem rozmiarów i liczby struktur zrazikowych, i brakiem dowodów aktywności wydzielniczej, co wskazuje na silną antyestrogenową aktywność EM-800 w gruczole sutkowym (Luo i in., Endocrinology 138: 4435 1144, 1997).

Leczenie DHEA, prekursorem sterydu płciowego prowadzi do podwyższenia DHEA i 5-diol w osoczu, podczas gdy poziomy w osoczu 4-dionu, testosteronu, dihydrotestosteronu i estradiolu wzrastają tylko umiarkowanie lub częściej pozostają niezmienione, ograniczając wewnątrzkomórkową biotransformację tego prekursora sterydu do tkanek obwodowych (Labrie i in., Mol. Cell. Endocrinol. 78: C113-C118, 1991). Jednakże wpływ stymulujący doustnie podawanego DHEA na poziomy w osoczu androgenów, takich jak testosteron i dihydrotestosteron, ma większą amplitudę niż efekt na poziomy w osoczu estrogenów, sugerując, że DHEA jest głównie transformowany do androgenów w tych zwierzętach. Ta obserwacja zgadza się z danymi otrzymanymi u kobiet, gdzie tworzenie androgenów z DHEA był o waż niejszym szlakiem niż konwersja DHEA w estrogeny (Morales i in., J. Clin. Endocrinol. Metab. 78: 1360-1367, 1994; Labrie i in., Ann. N. Y. Acad. Sci. 774: 16-28, 1995; Labrie i in., Steroids 62: 148-158, 1997).

Wiedząc o powyżej opisanej silnej antyestrogennej aktywności powstałej z atrofii gruczołu sutkowego i dominującego androgennego wpływu DHEA na gruczoł sutkowy, histomorfologiczne zmiany widziane u zwierząt potraktowanych kombinacją SERM i prekursora sterydu płciowego wyjaśnia się najlepiej bezkonkurencyjnym działaniem androgennym DHEA w gruczole sutkowym szczura.

Co ważniejsze, zauważono, że androgeny wywierają bezpośrednią przeciwrozrostową aktywność na wzrost ludzkich komórek ZR-75-1 raka piersi in vitro i że takie działanie hamujące androgenów dodaje się do działania antyestrogenów (Poulin i Labrie, Cancer Res. 46: 4933-4937,1986; Poulin i in., Breast Cancer Res. Treat. 12: 213-225,1988). Podobne dział anie hamują ce zaobserwowano in vivo na heteroprzeszczepach ZR-75-1 u nagich myszy (Dauvois i in., Cancer Res. 51: 3131-3135, 1991). Androgeny okazały się także hamować wzrost indukowanego DMBA raka sutka u szczura, i tę inhibicję odwracało równoczesne podawanie czystego antyandrogenu Flutamidu (Dauvois i in., Breast Cancer Res. Treat. 14: 299-306,1989). Łącznie, niniejsze dane wskazują na zaangażowanie receptora androgenu w działanie hamujące DHEA na raka piersi.

Ponieważ antyestrogeny i prekursory sterydów płciowych wywierają działanie hamujące na raka piersi różnymi mechanizmami, wykazano, że kombinacja SERM (EM-800) i prekursora sterydu płciowego (DHEA) wywiera silniejsze działanie hamujące niż każdy związek użyty samodzielnie na rozwój indukowanego DMBA raka sutka szczura, jak pokazano na fig. 1 i 2. Istotnie, nie znaleziono indukowanego DMBA guza na koniec eksperymentu u zwierząt otrzymujących DHEA i EM-800.

Kombinacja prekursora sterydu płciowego (DHEA) i SERM (EM-800) zachowywała wpływ stymulujący DHEA na tworzenie kości i wzmacniała działanie hamujące samego SERM (EM-800) na obrót metaboliczny i resorpcję kości, jak pokazał dalszy spadek wydalania w moczu hydroksyproliny i wapnia przy połączeniu obu zwią zków.

Pokazaliśmy, że DHEA wykazuje korzystne działanie na kości u samic szczurów (Luo i in., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997) i kobiet po menopauzie (Labrie i in., J. Clin. Endocrinol. Metab. 82: 3498-3505,1997). Tak więc u nietkniętych samic szczurów, terapia DHEA zwiększa gęstość mineralną kości (BMD) całego kośćca, kręgów lędźwiowych i kości udowej (Luo i in., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).

Z drugiej strony, terapia EM-800 nie miał a znaczą cego wpł ywu na BMD u nietknię tych zwierzą t, chociaż zaobserwowano silne wpływy stymulujące u szczurów z wyciętymi jajnikami (Martel i in., niepublikowane dane). Ponieważ EM-800 wywiera takie wpływy stymulujące na BMD całego kośćca, kręgi lędźwiowe i kości udowe u szczurów z wyciętymi jajnikami, brak znaczącego wpływu stymulującego EM-800 u nietkniętych zwierząt może być spowodowany tym, że sterydy płciowe obecne u nietkniętych samic szczurów wywierają maksymalny wpływ na BMD (Luo i in., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997). Podobnie, brak znaczącego wpływu EM-800 u szczurów z wyciętymi jajnikami już pobierających DHEA jest prawdopodobnie spowodowany maksymalnymi wpływami stymulującymi wywieranymi przez androgeny (i zapewne estrogeny) zsyntetyzowane w komórkach kości z egzogennego DHEA.

Wiadomo, że estrogeny obniżają poziomy w osoczu cholesterolu, lecz zwiększają lub nie mają wpływu na poziomy w osoczu triglicerydów (Love i in., Ann. Intern. Med. 115: 860-864, 1991; Walsh i in., New Engl. J. Med. 325: 1196-1204, 1991; Barrett-Connor, Am. J. Med. 95 (Suppl. 5A) : 40S-43S, 1993; Russell i in., Atherosclerosis 100:113-122, 1993; Black i in., J. Clin. Invest. 93: 63-69, 1994; Dipippo i in., Endocrinology 136: 1020-1033 ,1995; Ke i in., Endocrinology 136: 2435-2441, 1995). Fig. 3 pokazuje, że EM-800 wykazuje działanie hipocholesterolemiczne i hipotriglicerydemiczne u szczura,

PL 195 772 B1 przedstawiając w ten sposób swoje unikalne działanie na profil lipidów w osoczu, które jest zupełnie różne od działania innych SERM, takich jak tamoxifene (Bruning i in., Br. J. Cancer 58: 497-499, 1988; Love i in., J. Natl. Cancer Inst. 82: 1327-1332, 1990; Dipippo i in., Endocrinology 136: 1020-1033, 1995; Ke i in., Endocrinology 136: 2435-2441,1995), droloxifene (Ke i in., Endocrinology 136: 2435-2441, 1995) i raloxifene (Black i in. , J. Clin. Invest. 93: 63-69, 1994). Kombinacja DHEA i EM-800 zachowała działanie hipocholesterolemiczne i hypotriglicerydemiczne EM-800, co sugeruje, że taka kombinacja może wywierać korzystne działanie na lipidy w osoczu.

Należy zauważyć, że profil lipidów w osoczu jest znacząco różny u szczurów i ludzi. Jednakże, ponieważ mechanizm mediacji przez receptor estrogenu jest zaangażowany w efekt hipocholesterolemiczny estrogenów, jak też antyestrogenów (Lundeen i in., Endocrinology 138: 1552-1558, 1997), szczur pozostaje przydatnym modelem do badania działania obniżającego poziom cholesterolu estrogenów i „antyestrogenów” u ludzi.

W skrócie, powyż ej opisane dane wskazują wyraźnie wpływy kombinacji SERM (EM-800) i prekursora sterydu płciowego (DHEA) na rozwój raka sutka indukowanego przez DMBA, jak też działanie zabezpieczające takiej kombinacji na masę kości i lipidy w osoczu. Dane te sugerują dodatkowe korzystne działanie takiej kombinacji w leczeniu i zapobieganiu osteoporozie przy polepszaniu profilu lipidów.

Zbadaliśmy także potencjalne interakcje efektu hamującego nowego antyestrogenu (EM-800) z działaniem prekursora sterydu płciowego (DHEA) na wzrost ludzkiego raka piersi ZR-75-1 w heteroprzeszczepach u nagich myszy przez kombinowane podawanie dwu leków. Fig. 4 i 5 pokazują, że sam DHEA, w użytych dawkach, powoduje 50 do 80% inhibicji wzrostu guza, podczas gdy prawie całkowita inhibicja wzrostu guza uzyskiwana przy niskiej dawce antyestrogenu nie była zakłócana przez DHEA.

Ograniczenia pomiarów gęstości mineralnej kości (BMD) są dobrze znane. Przykładowo, pomiary BMD nie wykazały zmian u szczurów potraktowanych sterydowym antyestrogenem ICI 182780 (Wakeling, Breast Cancer Res. Treat. 25: 1-9, 1993), podczas gdy widoczne były histomorfometrycznie zmiany inhibicyjne (Gallagher i in., Endocrinology 133: 2787-2791, 1993). Podobne różnice opisywano dla Tamoxifene (Jordan i in., Breast Cancer Res. Treat. 10: 31-35, 1987; Sibonga i in., Breast Cancer Res. Treatm. 41: 71-79, 1996).

Należy wskazać, że zmniejszona gęstość mineralna kości nie jest jedyną nienormalnością związaną ze zmniejszoną wytrzymałością kości. (Guidelines for preclinical and clinical evaluation of agents used in the prevention or treatment of postmenopausal osteoporosis. Division of Metabolism and Endocrine Drug Products, FDA, May 1994). Jest zatem ważne zanalizowanie zmian w biochemicznych parametrach metabolizmu kości indukowanych przez różne związki i terapie w celu uzyskania lepszej wiedzy o ich działaniu.

Szczególnie ważne jest wskazanie, że kombinacje DHEA i EM-800 wywierały niespodziewane korzystne działanie na ważne biochemiczne parametry metabolizmu kości. W istocie, sam DHEA nie wpływał na stosunek hydroksyprolina/kreatynina w moczu, znacznik resorpcji kości. Ponadto, brak wpływu DHEA można wykryć w dziennym wydalaniu z moczem wapnia lub fosforu (Luo i in., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997). EM-800, z drugiej strony, obniżał w moczu stosunek hydroksyprolina/kreatynina o 48%, podczas gdy, podobnie jak u DHEA, nie było widać wpływu EM-800 na wydalanie w moczu wapnia lub fosforu. Ponadto EM-800 nie miał wpływu na poziomy w osoczu aktywności zasadowej fosfatazy, znacznika tworzenia kości, podczas gdy DHEA zwiększał wartość parametru o okoł o 75% (Luo i in., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).

Jeden z niespodziewanych efektów kombinacji DHEA i EM-800 odnosi się do stosunku w moczu hydroksyprolina/kreatynina, znacznika resorpcji kości, który zmniejszył się o 69%, gdy połączyło się DHEA i EM-800, i ta wartość była statystycznie różna (p < 0,01) od 48% inhibicji uzyskanej przez sam EM-800, podczas gdy sam DHEA nie wykazał żadnego działania. Tak więc dodanie DHEA do EM-800 zwiększa o 50% efekt hamujący EM-800 na reabsorpcję kości. Co ważne, innym niespodziewanym efektem dodania DHEA do EM-800 był około 84% spadek ilości wapnia w moczu (od 23,17 ± 1,55 do 3,71 ± 0,75 μmol/24 godziny/100 g (p < 0,01) i 55% spadek ilości fosforu w moczu (od 132,72 ± 6,08 do 59,06 ± 4,76 μmol/24 godziny/100 g (p < 0,01) odpowiednio, (Luo i in., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).

PL 195 772 B1

T a b e l a 1

Grupa	Mocz	Osocze
Wapń ^mol/24 godz./100 g)	fosfor ^mol/ 24 godz./100 g)	HP/Cr ^mol /mmol)	tALP (IU/1)
Kontrolna	23,17±1,55	132,72±6,08	13,04±2,19	114,25414,04
DHEA (10 mg)	25,87±3,54	151,41±14,57	14,02±1,59	198,38±30,76*
EM-800 (75 μg)	17,44±4,5	102,03±25,13	6,81±0,84**	114,11±11,26
HEA+EM-800	3,71±0,75**	59,06±4,76**	4,06±0,28**	204,38±14,20**

Ciekawie jest także zauważyć, że silnemu działaniu hamującemu EM-800 na cholesterol w osoczu nie zapobiega równoczesna terapia DHEA (Luo i in., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).

Podczas gdy Raloxifene i podobne związki zapobiegają utracie kości i spadkowi ilości cholesterolu w osoczu (jak estrogeny), należy zauważyć, że gdy Raloxifene porównywano z Premarinem pod względem BMD, wpływ Raloxifene na BMD był słabszy niż wpływ Premarinu (Minutes of the Endocrinology and Metabolism Drugs Advisory Committee, PDA Thursday, Meeting #68, November 20^th1997). Ze względu na jego dobrze znane niekorzystne wpływy na raka piersi i macicy, dodanie estrogenu do Raloxifene, EM-800 lub innych podobnych związków nie jest dopuszczalnym rozwiązaniem.

Niniejsze wyniki otrzymano dla szczura wyraźnie pokazują, że DHEA może dać korzystne wyniki, których nie osiąga się użyciem samego selektywnego modulatora receptora estrogenu (SERM) takiego jak EM-800, Raloxifene, itp. Podczas gdy SERM ogranicza swoje działanie do inhibicji resorpcji kości, dodanie DHEA, 5-diolu, DHEA-S prawdopodobnie stymuluje tworzenie kości (efekt nie stwierdzony dla SERM lub estrogenu) i dalsze zmniejszenie resorpcji kości ponad efekt uzyskany przez EM-800.

Co ważne, kombinacja EM-800 i DHEA u szczurów z wyciętymi jajnikami leczonymi dla 12 miesięcy wykazuje korzystny wpływ na morfometrię kości. Objętość kości beleczkowatej jest szczególnie ważna dla wytrzymałości kości i dla zapobiegania pęknięciom kości. Tak więc w powyżej wspomnianym studium, objętość kości beleczkowatej piszczeli wzrosła od 4,1±0,7% u szczurów z wyciętymi jajnikami do 11,9±0,6% (p < 0,01) dla samego DHEA, podczas gdy dodanie EM-800 do DHEA dodatkowo zwiększyło objętość kości beleczkowatej o 14,7±1,4%, wartość podobna do znalezionej u nietkniętych zwierząt kontrolnych (fig. 6).

Od wartości 0,57±0,08 na mm u szczurów z wyciętymi jajnikami, terapia DHEA dała 137% wzrost liczby kości beleczkowych w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi z wyciętymi jajnikami. Wpływ stymulujący DHEA osiągnął więc 1,27±0,1 na mm, podczas gdy równoczesna terapia EM-800 i DHEA dał a dodatkowy 28% wzrost liczby koś ci beleczkowych (p < 0,01) w porównaniu z uzyskanym przez sam DHEA (fig. 7). Podobnie, dodanie EM-800 do terapii DHEA dało dodatkowy 15% (p < 0,05) spadek oddzielania kości beleczkowych, w porównaniu z uzyskiwanym z samym DHEA, prowadząc do wartości nie różniących się od obserwowanych u nietkniętych zwierząt kontrolnych.

W uzupeł nieniu do danych numerycznych przedstawionych na fig. 6 i 7, fig. 8 ilustruje wzrost objętości kości beleczkowatej w bliskiej przynasadzie piszczeli indukowany przez DHEA u potraktowanych zwierząt z wyciętymi jajnikami (C) w porównaniu z kontrolnymi z wyciętymi jajnikami (B), jak też częściową inhibicję wpływu stymulującego DHEA po dodaniu Flutamidu do terapii DHEA (D). Z drugiej strony, podawanie DHEA w kombinacji z EM-800 spowodowało całkowite zapobiegnięcie indukowanej wycięciem jajników osteopenii (E), przy czym objętość kości beleczkowatej jest porównywalna z obserwowaną u nietkniętych zwierząt kontrolnych (A).

Utrata kości obserwowana przy menopauzie u kobiet jest prawdopodobnie spokrewniona ze wzrostem szybkości resorpcji kości, która nie jest w pełni skompensowana przez wtórne zwiększenie tworzenia kości. Istotnie, parametry tworzenia kości i resorpcji kości rosną w osteoporozie i resorpcja kości i jej tworzenie są hamowane estrogenową terapią substytucyjną. Działanie hamujące substytucji estrogenowej na tworzenie kości prawdopodobnie wynika ze sprzężonego mechanizmu pomiędzy resorpcją kości i tworzeniem kości, takiego, że pierwotna indukowana estrogenem redukcja resorpcji kości pociąga za sobą redukcję tworzenia kości (Parfitt, Calcified Tissue International 36 Suppl. 1: S37-S45, 1984).

PL 195 772 B1

Wytrzymałość kości gąbczastej i dalsza odporność na pękanie zależy nie tylko od całkowitej ilości kości gąbczastej, lecz także od beleczkowatej mikrostruktury, określanej liczbą, rozmiarem i dystrybucją beleczek. Utracie funkcji jajeczkowania u kobiet po menopauzie towarzyszy znaczący spadek łącznej objętości kości beleczkowatej (Melsen i in., Acta Pathologica & Microbiologica Scandinavia 86: 70-81, 1978; Vakamatsou i in., Calcified Tissue International 37: 594-597, 1985), głównie związany ze spadkiem liczby i w mniejszym stopniu szerokości beleczek (Weinstein i Hutson, Bone 8: 137-142, 1987).

W niniejszym badaniu androgenny wpływ stymulujący DHEA obserwowano na prawie wszystkich badanych parametrach histomorfometrycznych kości. DHEA spowodował więc znaczący wzrost objętości kości beleczkowatej, jak też liczby beleczek, podczas gdy zmniejszył powierzchnię międzybeleczkowatą.

Kompozycje farmaceutyczne, które obejmują SERM lub bisfosfonian oraz prekursor sterydu płciowego (5-diol) w pojedynczej kompozycji do równoczesnego podawania może być odpowiednia do podawania w dowolny tradycyjny sposób, w tym między innymi doustnego podawania, podskórnej iniekcji, domięśniowej iniekcji lub przezskórnego podawania.

Stosuje się postaci do doustnego podawania, np. tabletki, kapsułki, syropy i tym podobne, oraz do przezskórnego podawania, np., maści, mleczka, żele, kremy, plastry przedłużonego uwalniania i tym podobne.

Podawanie SERM i prekursorów sterydów płciowych można wykorzystać w leczeniu i/lub zapobieganiu rozwoju osteoporozy, raka piersi, hipercholesterolemii, hiperlipidemii lub miażdżycy tętnic. Składniki czynne (SERM lub prekursor lub bisfosfonian, lub inny) można komponować i podawać na różne sposoby.

Składnik czynny do podawania przezskórnego lub przezśluzówkowego jest korzystnie obecny w ilości od 0,5% do 20% wagowych łącznej masy kompozycji farmaceutycznej, korzystniej pomiędzy 2 i 10%. DHEA lub 5-diol powinien występować w stężeniu co najmniej 7% dla przezskórnego podawania. Alternatywnie, składnik czynny można umieścić w transdermalnym plastrze mającym struktury znane w dziedzinie, np., struktury takie jak przedstawione w europejskim opisie patentowym nr 0279982.

Przy komponowaniu jako maść, mleczko, żel lub krem lub tym podobne, związek czynny miesza się z odpowiednim nośnikiem, który jest kompatybilny z ludzką skórą lub śluzówką i który polepsza przezskórną penetrację związku przez skórę lub śluzówkę. Odpowiednie nośniki są znane w dziedzinie i obejmują między innymi Klucel HP i podstawę Glaxal. Pewne są dostępne w handlu, np., podstawa Glaxal dostępna z Glaxal Canada Limited Company. Inne odpowiednie nośniki można znaleźć u Kollera i Buri, S.T.P. Pharma 3(2), 115-124, 1987. Nośnik jest korzystnie takim, w którym składnik(i) czynny(e) jest (są) rozpuszczalny w temperaturze otoczenia przy stosowanym stężeniu składnika czynnego. Nośnik powinien mieć dostateczną lepkość dla utrzymania inhibitora na zlokalizowanej powierzchni skóry lub śluzówki, na którą nałożono kompozycję, bez spływania lub parowania przez okres dostateczny do zapewnienia dostatecznej penetracji prekursora przez zlokalizowaną powierzchnię skóry lub śluzówki i do strumienia krwi, gdzie spowoduje pożądany efekt kliniczny. Nośnik jest typowo mieszaniną kilku składników, np. farmaceutycznie dopuszczalnych rozpuszczalników i środka zagęszczającego. Mieszanina organicznych i nieorganicznych rozpuszczalników może polepszyć hydrofilową i lipofilową rozpuszczalność, np. woda i alkohol, taki jak etanol.

Korzystnymi prekursorami sterydów płciowych są dehydroepiandrosteron (DHEA) (dostępny z Diosynth Inc., Chicago, Illinois, USA), jego proleki (dostępne z Steraloids, Wilton, New Hampshire,

USA), 5-androsten-3e,17e-diol i jego proleki EM-1304 i EM-01474-D (dostępne z Steraloids, Wilton, New Hampshire USA).

PL 195 772 B1

Korzystnie prekursor sterydu płciowego komponuje się jako żel alkoholowy zawierający 2,0 do

10% triglicerydu kaprylowego-kaprynowego (Neobee M-5); 10 do 20% glikolu heksylenowego; 2,0 do

10% eteru monometylowego glikolu dietylenowego (Transutol); 2,0 do 10% Cyklomethicone (Dow

Corning 345); 1,0 do 2% alkoholu benzylowego i 1,0 do 5,0% hydroksypropylocelulozy (Klucel HF).

Nośnik może także obejmować różne dodatki zwykle stosowana w maściach i mleczkach i dobrze znane w sztuce kosmetycznej i medycznej. Np. można stosować środki zapachowe, przeciwutleniacze, perfumy, środki żelujące, środki zagęszczające, takie jak karboksymetyloceluloza, surfaktanty, stabilizatory, zmiękczacze, środki barwiące i inne podobne środki. Przy zastosowaniu do leczenia chorób układowych, miejsce nakładania na skórę powinno się zmieniać w celu uniknięcia nadmiernego miejscowego stężenia składnika czynnego i możliwej nadmiernej stymulacji skóry i gruczołów łojowych przez androgenne metabolity prekursora sterydu płciowego.

W kompozycji farmaceutycznej do doustnego podawania, DHEA lub inny prekursor jest korzystnie obecny w stężeniu pomiędzy 5 i 98% wagowych całkowitej masy kompozycji, korzystniej pomiędzy 50 i 98%, szczególnie pomiędzy 80 i 98%. Pojedynczy prekursor, taki jak DHEA, może być jedynym składnikiem czynnym, lub alternatywnie, można stosować wiele prekursorów i/lub ich analogów (np., kombinacji DHEA, DHEA-S, 5-diolu, lub kombinacji dwu lub wielu związków przekształcanych in vivo w DHEA, DHEA-S lub 5-diol lub kombinacji DHEA lub 5-diolu i jednego lub wielu ich analogów, które przekształcają się w DHEA lub 5-diol in vivo, itp. Poziom DHEA w krwi jest końcowym kryterium adekwatnego dawkowania, który uwzględnia indywidualne różnice w absorpcji i metabolizmie.

Korzystnie, lekarz leczący, szczególnie na początku leczenia, obserwuje całkowitą reakcję indywidualnego pacjenta i poziomy DHEA w osoczu (w porównaniu z korzystnymi stężeniami w osoczu omówionymi powyżej), i obserwuje całkowitą reakcję pacjenta na leczenie, regulując dawki w miarę potrzeby, gdy metabolizm lub reakcja pacjentów na leczenie jest nietypowa.

Terapia nadaje się do nieokreślonej kontynuacji. Należy oczekiwać, że terapia DHEA i/lub 5-diolem będzie po prostu utrzymywała poziomy DHEA w zakresie podobnym do występującego naturalnie u kobiet przed menopauzą (stężenie w osoczu pomiędzy 4 i 10 μg na litr), lub naturalnie u młodych dorosłych mężczyzn (stężenie w osoczu pomiędzy 4 i 10 μg na litr).

Związek SERM lub bisfosfonian i/lub prekursor sterydu płciowego można także podawać drogą doustną, i można komponować z konwencjonalnymi farmaceutycznymi zaróbkami, np. rozpryskowo suszoną laktozą, mikrokrystaliczną celulozą i stearynianem magnezu w tabletki lub kapsułki do doustnego podawania.

Czynną substancję można przetworzyć w tabletki lub rdzenie drażetek mieszając ze stałym, proszkowym nośnikiem, takim jak cytrynian sodu, węglan wapnia lub fosforan diwapnia, oraz środkami wiążącymi takimi jak poliwinylopirolidon, żelatyna lub pochodna celulozy, możliwie dodając także środki smarujące, takie jak stearynian magnezu, laurylosiarczan sodu, „Carbowax” lub poli(glikol etylenowy). Oczywiście można dodawać poprawiające smak substancje w przypadku postaci do doustnego podawania.

Jako dalsze postaci można stosować zamykane kapsułki, np. z twardej żelatyny, jak też dawkujące miękkie żelatynowe kapsułki obejmujące zmiękczacz lub plastyfikator, np. glicerynę. Zamykane kapsułki zawierają czynną substancję, korzystnie w postaci granulatu, np. w mieszaninie z wypełniaczami, takimi jak laktoza, sacharoza, mannitol, skrobie, takie jak skrobia kukurydziana lub amylopektyna, pochodne celulozy lub dobrze zdyspergowane kwasy krzemowe. W miękkich żelatynowych kapsułkach, czynna substancja jest korzystnie rozpuszczona lub zawieszona w odpowiednich cieczach, takich jak oleje roślinne lub ciekłe poli(glikole etylenowe).

Mleczko, maść, żel lub krem powinien być starannie wtarty w skórę, aby nie było widać żadnego nadmiaru, a skóra nie powinna być przemywana w tym regionie aż do zajścia większości przezskórnej penetracji, korzystnie co najmniej 4 godziny i korzystniej co najmniej 6 godzin.

Przezskórny plaster można stosować do dostarczania prekursora znanymi technikami. Typowo nakłada się go na znacznie dłuższy czas, np., 1 do 4 dni, lecz typowo styka składnik czynny na mniejszej powierzchni, pozwalając na powolne i ciągłe dostarczanie składnika czynnego.

Kilka systemów dostarczania przezskórnego leków, opracowanych i zastosowanych, jest odpowiednich do dostarczania składnika czynnego. Szybkość uwalniania jest typowo kontrolowana przez dyfuzję z matrycy, lub przez przechodzenie składnika czynnego przez kontrolującą błonę.

Mechaniczne aspekty urządzeń przezskórnych są dobrze znane u szczurów, i wyjaśniają je, np., opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5162037, 5154922, 5135480, 4666441, 4624665, 3742951, 3797444, 4568343, 5064654, 5071644, 5071657, których opisy dołącza się niPL 195 772 B1 niejszym jako odnośniki. Dodatkowe wyjaśnienia daje europejski opis patentowy nr 0279982 i brytyjskie zgłoszenie patentowe nr 2185187.

Urządzenie może być dowolnego ogólnego typu znanego w dziedzinie, w tym urządzeniem przezskórnego podawania z przylepną matrycą i zbiorniczkiem. Urządzenie może obejmować zawierające lek matryce zawierające włókna, które absorbują składnik czynny i/lub nośnik. W urządzeniu typu zbiorniczka, zbiorniczek można zdefiniować polimeryczną błoną nieprzepuszczalną dla nośnika i skł adnika czynnego.

W urządzeniu przezskórnym, samo urządzenie utrzymuje składnik czynny w kontakcie z żądaną zlokalizowaną powierzchnią skóry. W takim urządzeniu, lepkość nośnika dla składnika czynnego jest mniej ważna niż w kremie lub żelu. System rozpuszczalników do przezskórnego urządzenia może obejmować, np. kwas oleinowy, mleczan liniowego alkoholu i glikol dipropylenowy, lub inny układ rozpuszczalników znany w dziedzinie. Składnik czynny można rozpuścić lub zawiesić w nośniku.

W celu przyczepienia do skóry przezskórny plaster można umieścić na chirurgicznej taśmie przylepnej mającej otwór przekłuty na środku. Lepiszcze jest korzystnie pokryte odlepianą nakładką do jego ochrony przed użyciem. Typowa substancja odpowiednia dla odlepiania obejmuje polietylen i powlekany polietylenem papier, korzystnie powlekany silikonem dla ł atwiejszego usuwania. Dla zastosowania urządzenia, odlepianą nakładkę po prostu zdziera się i lepiszcze przyczepia do skóry pacjenta. W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5135480, którego opis dołącza się niniejszym jako odnośnik, Bannon i in. opisują alternatywne urządzenie mające nieprzylepne środki do mocowania urządzenia na skórze.

Przezskórne lub przezśluzówkowe układy dostarczające można także stosować jako nowe i polepszone układy dostarczające dla zapobiegania i/lub leczenia osteoporozy lub innych chorób, które reagują korzystnie na terapię androgenami i/lub estrogenami.

Selektywny modulator receptora estrogenu ma wzór cząsteczkowy z następującymi cechami:

a) dwa pierścienie aromatyczne oddzielone 1 do 2 atomami węgla, oba pierścienie aromatyczne niepodstawione lub podstawione grupą hydroksylową lub grupą przekształcaną in vivo w hydroksyl; oraz

b) łańcuch boczny zawierający pierścień aromatyczny i grupę funkcyjną trzeciorzędowej aminy lub jej sól.

Jednym z korzystnych SERM jest EM-800 omawiany w PCT/CA96/00097 (WO 96/26201). Budowa cząsteczkowa EM-800 jest następująca:

Innym korzystnym SERM według wynalazku jest EM-01538:

EM-1538 (także nazywany EM-652-HCl) jest chlorowodorkiem silnego antyestrogenu EM-652, w porównaniu z EM-800, EM-1538 jest prostszą i łatwiejszą w syntezie solą . Jest także łatwy do wydzielenia, oczyszczenia, krystalizuje i wykazuje dobrą trwałość w stanie stałym. Przy podawaniu EM-800 lub EM-1538 uważa się, że dają one ten sam czynny związek in vivo.

Inne korzystne SERM obejmują Tamoxifene ((Z)-2-[4-(1,2-difenylo-1-butenylo)]-N,N-dimetyloetanoamina) (dostępny z Zeneca, UK), Toremifene (dostępny z Orion-Farmos Pharmaceuticla, Finland, lub Schering-Plough), Droloxifene i CP-336156 (cis-1R-[4'-pirolidyno-etoksyfenylo]-2S-fenylo-6-hydroksy-1,2,3,4,-tetrahydronaftalen, D-(-)-winian) (Pfizer Inc., USA), Raloxifene (Eli Lilly i Co., USA), LY 335563 i LY 353381 (Eli Lilly i Co., USA), Iodoxifene (SmithKline Beecham, USA), Levormeloxifene

PL 195 772 B1 (3,4-trans-2,2-dimetylo-3-fenylo-4-[4-(2-(2-(pirolidyn-1-ylo)etoksy)fenylo]-7-metoksychroman) (Novo Nordisk, A/S/ Dania), który ujawniają Shalmi i in., WO 97/25034, WO 97/25035, WO 97/25037, WO 97/25038; i Korsgaard i in. WO 97/25036), GW5638 (opisany przez Willsona i in., Endocrinology, 138(9), 3901-3911, 1997) i pochodne indolowe (ujawnione przez Millera i in. EP 0802183A1) i TSE 424 opracowane przez Wyeth Ayers (USA) i ujawnione w JP10036347 (American home products corporation) oraz pochodne niesterydowych estrogenów opisane w WO 97/32837.

Można stosować dowolny SERM użyty zgodnie z wymaganiami skuteczności, jak zaleca producent. Odpowiednie dawki są znane w dziedzinie. Można stosować dowolny inny niesterydowy antyestrogen dostępny w handlu. Można stosować dowolny związek mający aktywność podobną do SERM (przykład: Raloxifene).

SERM korzystnie podaje się w zakresie dawek 0,01 do 10 mg/kg masy ciała dziennie (korzystnie 0,05 do 1,0 mg/kg), korzystnie 5 mg dziennie, szczególnie 10 mg dziennie, w dwu równo podzielonych dawkach dla osoby o przeciętnej masie ciała przy doustnym podawaniu, lub w zakresie dawek 0,003 do 3,0 mg/kg masy ciała dziennie (korzystnie 0,015 do 0,3 mg/ml), korzystnie 1,5 mg dziennie, szczególnie 3,0 mg dziennie, w dwu równo podzielonych dawkach dla osoby o przeciętnej masie ciała przy pozajelitowym podawaniu (to jest domięśniowym, podskórnym lub przezskórnym). Korzystnie SERM podaje się wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem lub nośnikiem, jak opisano poniżej.

Korzystne bisfosfoniany obejmują alendronian [kwas (4-amino-1-hydroksybutylideno)bisfosfonowy, sól disodowa, hydrat] dostępny z Merck Shape and Dohme pod nazwą handlową Fosamax, etidronian [kwas (1-hydroksyetylideno)bisfosfonowy, 2,2'-iminobisetanol] dostępny z Procter and Gamble pod nazwami handlowymi Didrocal i Didronel, klodronian [kwas (dichlorometyleno)bisfosfonowy, sól disodowa] dostępny z Rhone-Poulenc Rorer pod nazwą handlową Bonefos lub dostępny z Boehringer Mannheim pod nazwą handlową Ostac, oraz pamidronian kwas (3-amino-1-hydroksypropylideno)bisfosfonowy, sól disodowa) dostępny z Geigy pod nazwą handlową Aredia. Risedronian (kwas 1-hydroksy-2-(3-pirydynylo)etylidenobisfosfonowy, sól monosodowa) jest w badaniach klinicznych. Wszelkie inne bisfosfoniany dostępne w handlu można stosować, wszystkie w dawkach zalecanych przez producenta. Podobnie można stosować prekursory sterydów płciowych w dawkach zalecanych w dziedzinie, korzystnie w dawkach odtwarzających poziomy w krążeniu do poziomów zdrowych mężczyzn w wieku 20-30 lat lub przedmenopauzalnych dorosłych kobiet.

W odniesieniu do wszystkich dawek zalecanych w wynalazku, leczący lekarz powinien monitorować reakcję indywidualnego pacjenta i odpowiednio ustawiać dawkowanie.

P r z y k ł a d 1

Androsteno-3e,17e-diol (5-diol) wykazuje wewnętrzną aktywność estrogenną. Ponadto, jako prekursor sterydów płciowych, może być przekształcony w aktywne androgeny i/lub inne estrogeny w obwodowych wydzielniczych tkankach. W celu przetestowania względnej ważności androgennych i estrogennych składników działania 5-diolu na masę kości, 21-tygodniowym szczurom wycięto jajniki i traktowano przezskórnie raz dziennie 2, 5 lub 12,5 mg 5-diolu samego lub w kombinacji z antyandrogenem Flutamide (FLU, 10 mg, podskórnie, raz dziennie) i/lub antyestrogenem EM-800 (100 μg, podskórnie, raz dziennie) przez 12 miesięcy. Gęstość mineralną kości (BMD) zmierzono po 11 miesiącach terapii. Wycięcie jajników (OVX) doprowadziło do 12,8% spadku w udowym BMD (p < 0,01), podczas gdy terapia najwyższą dawką 5-diolu odtworzyła 34,3% udowego BMD utraconego podczas 11 miesięcy po OVX (p < 0,01). Jednoczesne podawanie FLU całkowicie zapobiegło wpływowi stymulującemu 5-diolu na udowe BMD, podczas gdy dodanie EM-800 spowodowało dodatkową 28,4% stymulację w porównaniu z wpływem samego 5-diolu. Równoczesne podawanie 5-diolu, FLU i EM-800 tylko wyjawiło wpływ EM-800 (27%), ponieważ wpływ 5-diolu został całkowicie zablokowany przez FLU. Porównywalne wyniki otrzymano dla BMD kręgów lędźwiowych, chociaż BMD kręgów lędźwiowych u szczurów OVX otrzymujących 12,5 mg samego 5-diolu, 12,5 mg 5-diolu + EM-800 lub 5-diol + FLU + EM-800 powróciła do wartości nie różniących się znacząco od tych dla nietkniętych zwierząt. Histomorfometryczna analiza pokazuje, że wpływy stymulujące 5-diolu na objętość kości, liczbę beleczek i działanie hamujące na oddzielanie beleczek we wtórnej gąbczastości obszaru bliskiej przynasady piszczeli są hamowane przez FLU, lecz z kolei wzmagane przez EM-800. Znacząca stymulacja poziomu aktywności w osoczu zasadowej fosfatazy uzyskana po terapii 5-diolem wynosi 57% (p < 0,01 wobec 12,5 mg samego 5-diolu) i jest odwracana równoczesnym podawaniem FLU. Terapia 5-diolem nie miała statystyczne znaczącego działania hamującego na stosunek wapnia do kreatyniny w moczu. Najwyższa dawka 5-diolu powodowała znaczące 23% (p < 0,01) zmniejszenie ilości cholesterolu w osoPL 195 772 B1 czu, podczas gdy dodanie EM-800 zmniejszyło ilość cholesterolu w osoczu o 62% (p < 0,01). Niniejsze dane wyraźnie pokazują wpływ stymulujący 5-diolu on tworzenie kości i sugerują, że chociaż 5-diol jest słabym estrogenem. Jego wpływ stymulujący na tworzenie kości jest głównie mediowany efektem androgennym. Ponadto, dodatkowe wpływy stymulujące EM-800 i 5-diolu na masę kości pokazują oszczędzający kości wpływ anty-estrogenu EM-800 u szczura. Aktywność obniżania poziomu cholesterolu 5-diolu i EM-800 może mieć interesujące zastosowanie przy zapobieganiu chorobom sercowonaczyniowym.

P r z y k ł a d 2

Przykład syntezy korzystnego związku stosowanego w zastosowaniu według wynalazku

Synteza chlorowodorku (S)-(+)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4-(2'-piperydynoetoksy)fenylo)-2H-1-benzopiranu, EM-01538 (EM-652, HCl)

Etap A: BF₃-Et₂O, toluen; 100°C; 1 godzina.

Etap C: 3,4-dihydropiran, monohydrat kwasu p-toluenosulfonowego, octan etylu; 25°C pod azotem, 16 godzin, a następnie krystalizacja w izopropanolu.

Etapy D, E i F:

(1) piperydyna, toluen, aparat Deana i Starka, refluks pod azotem; (2) 1,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en, DMF, refluks 3 godziny;

(3) CH3MgCl, THF, -20 do 0°C i następnie temperatura pokojowa przez 24 godziny;

Etapy G, H: Kwas (1S)-(+)-10-kamforosulfonowy, aceton, woda, toluen, temperatura pokojowa, 48 godzin.

Etap HH: 95% etanol, 70°C, następnie temperatura pokojowa 3 dni.

Etap HHR: Zawracanie cieczy macierzystej i przemywanie z etapu HH

Kwas (1S)-10-kamforosulfonowy, refluks; 36 godzin, następnie temperatura pokojowa przez 16 godzin.

PL 195 772 B1

Etap I:

(1) wodny roztwór DMF, Na2CO3, octan etylu;

(2) etanol, rozcieńczony HCl;

(3) woda.

Synteza 2-tetrahydropiranyloksy-4-hydroksy-2'-(4-tetrahydropiranyloksyfenylo)acetofenonu (4). Zawiesinę 2,4-dihydroksy-2'-(4-hydroksyfenylo)acetofenonu 3 (97,6 g, 0,4 mol) (dostępny z Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas) w 3,4-dihydropiranie (218 ml, 3,39 mol) i octanu etylu (520 ml) potraktowano monohydratem kwasu p-toluenosulfonowego (0,03 g, 0,158 mmol) w temperaturze około 25°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano pod azotem bez zewnętrznego ogrzewania przez około 16 godzin. Mieszaninę przemyto następnie roztworem wodorowęglanu sodu (1 g) i chlorku sodu (5 g) w wodzie (100 ml). Fazy oddzielono i fazę organiczną przemyto solanką (20 ml). Ka ż de popłuczyny ekstrahowano ponownie 50 ml octanu etylu. Wszystkie fazy organiczne połączono i przesączono przez siarczan sodu.

Rozpuszczalnik (około 600 ml) usunięto przez destylację pod ciśnieniem atmosferycznym i dodano izopropanol (250 ml). Dodatkowy rozpuszczalnik (około 300 ml) destylowano pod ciśnieniem atmosferycznym i dodano izopropanol (250 ml). Dodatkowy rozpuszczalnik (około 275 ml) destylowano pod ciśnieniem atmosferycznym i dodano izopropanol (250 ml). Roztwór ochłodzono w temperaturze okoł o 25°C z mieszaniem i po okoł o 12 godzinach krystaliczne ciał o stał e przesą czono, przemyto izopropanolem i osuszono (116,5 g, 70%).

Synteza 4-hydroksy-4-metylo-2-(4'-[2-piperydyno]-etoksy)fenylo-3-(4'-tetrahydropiranyloksy)fenylo-7-tetrahydropiranyloksy-chromanu (10). Roztwór 2-tetrahydropiranyloksy-4-hydroksy-2'-(4-tetrahydropiranyloksyfenylo)acetofenonu 4 (1 kg, 2,42 mol), 4-[2-(1-piperydyno)etoksy]benzaldehydu 5 (594 g, 2,55 mol) (dostę pny z Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas) i piperydynę (82,4 g, 0,97 mol) (dostępny z Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.) w toluenie (8 l) poddawano refluksowi pod azotem z aparatem Deana i Starka do zebrania jednego równoważnika wody (44 ml).

Toluen (6,5 l) usunięto z roztworu przez destylację pod ciśnieniem atmosferycznym. Dodano dimetyloformamid (6,5 l) i 1,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en (110,5 g, 0,726 mol). Roztwór mieszano przez około 8 godzin w temperaturze pokojowej do izomeryzacji chalkonu 8 do chromanonu 9 i następnie dodano do mieszaniny wody z lodem (8 l) i toluenem (4 l). Fazy oddzielono i warstwę toluenową przemyto wodą (5 l). Połączone wodne popłuczyny ekstrahowano toluenem (3 x 4 l). Połączone ekstrakty toluenowe przemyto na koniec solanką (3 x 4 l), zatężono pod ciśnieniem atmosferycznym do 5,5 l i następnie ochłodzono do -10°C.

Przy ciągłym zewnętrznym chłodzeniu i mieszaniu pod azotem dodano 3M roztwór chlorku metylomagnezu w THF (2,5 l, 7,5 mol) (dostępny z Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.), utrzymując temperaturę poniżej 0°C. Po dodaniu całości reagentu Grignarda zewnętrzne chłodzenie usunięto i mieszaninę pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej. Mieszaninę mieszano w tej temperaturze przez około 24 godziny.

Mieszaninę ponownie ochłodzono do około -20°C i przy ciągłym zewnętrznym chłodzeniu i mieszaniu dodano powoli nasycony roztwór chlorku amonu (200 ml), utrzymując temperaturę poniżej 20°C. Mieszaninę mieszano przez 2 godziny i następnie dodano nasycony roztwór chlorku amonu (2 l) i toluen (4 l) i mieszano przez 5 minut. Fazy oddzielono i warstwę wodną ekstrahowano toluenem (2 x 4 l). Połączone toluenowe ekstrakty przemyto rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym, aż roztwór stał się jednorodny, i następnie solanką (3x 4 l). Roztwór toluenowy zatężono na koniec pod ciśnieniem atmosferycznym do 2 l. Ten roztwór użyto bezpośrednio w następnym etapie.

Synteza soli kwasu (1S)-10-kamforosulfonowego (2R,S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4-[2'-piperydyno]etoksy) fenylo)-2H-1-benzopiranu (±12). Do roztworu toluenowego 4-hydroksy-4-metylo-2-(4'-[-2-piperydyno]-etoksy)-fenylo-3-(4'-tetrahydropiranyloksy)fenylo-7-tetrahydropiranyloksychromanu (10) dodano aceton (6 l), wodę (0,3 l) i kwas (S)-10-kamforosulfonowy (561 g, 2,42 mol) (dostępny z Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.). Mieszaninę mieszano pod azotem przez 48 godzin, po czym stałą sól kwasu (1S)-10-kamforosulfonowego (2R,S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4-[2'-piperydyno]-etoksy)fenylo)-2H-1-benzopiranu (12) przesączono, przemyto acetonem i osuszono (883 g). Tej substancji użyto w następnym (HH) etapie bez dalszego oczyszczania.

Synteza soli kwasu (1S)-10-kamforosulfonowego (2S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4-[2'-piperydyno]etoksy)fenylo)-2H-1-benzopiranu (13, sól (+)-EM-652(1S)-CSA). Zawiesinę soli kwasu (1S)-10-kamforosulfonowego (2R,S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4-[2'-piperydyno]etoksy)fenylo)-2H-benzopiranu 12 (759 g) w 95% etanolu ogrzewano z mieszaniem

PL 195 772 B1 do około 70°C, aż ciało stałe rozpuszczono. Roztwór pozostawiono do ochłodzenia do temperatury pokojowej z mieszaniem, następnie zaszczepiono kilkoma kryształami soli kwasu (1S)-10-kamforosulfonowego (2S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4-[2'-piperydyno]etoksy)fenylo)-2H-1-benzopiranu 13. Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez około trzy dni łącznie. Kryształy przesączono, przemyto 95% etanolem i osuszono (291 g, 76%). Wydajność produktu wynosiła 94,2% i czystość 98,8%.

Synteza chlorowodorku (S)-(+)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4-(2'-piperydynoetoksy)fenylo)-2H-1-benzopiranu, EM-01538 (EM-652, HCl). Zawiesinę związku 13 (sól EM-652-(+)-CSA, 500 mg, 0,726 mmol) w dimetyloformamidzie (11 μ!, 0,15 mmol) potraktowano 0,5 M wodnym roztworem węglanu sodu (7,0 ml, 3,6 mmol) i mieszano przez 15 minut. Zawiesinę potraktowano octanem etylu (7,0 ml) i mieszano przez 4 godziny. Fazę organiczną przemyto wodnym nasyconym roztworem węglanu sodu (2 x 5 ml) i solanką (1 x 5 ml), osuszono nad siarczanem magnezu i zatężono. Roztwór powstałej różowej piany (EM-652) w etanolu (2 ml) potraktowano 2 N kwasem chlorowodorowym (400 μ!, 0,80 mmol), mieszano przez 1 godzinę, potraktowano destylowaną wodą (5 ml) i mieszano przez 30 minut. Powstałą zawiesinę przesączono, przemyto wodą destylowaną (5 ml), osuszono na powietrzu i pod silnie zmniejszonym ciśnieniem (65°C) z wytworzeniem kremowego proszku (276 mg, 77%): Drobny białawy proszek; kalorymetria skaningowa: początek piku topnienia w temperaturze 219°C, ΔΗ = 83 J/g; [a]²⁴D = 154° w metanolu 10 mg/ml. ¹H NMR (300 MHz, CD₃OD) δ (ppm) 1,6 (szerokie, 2H, H-4'), 1,85 (szerokie, 4H, H-3 i 5), 2,03 (s, 3H, CH3), 3,0 i 3,45 (szerokie, 4H, H-2 i 6), 3,47 (t, J=4,9 Hz, 2H, H-3'), 4,26 (t, J°4,9 Hz, 2H, H-2'), 5,82 (s, 1H, H-2), 6,10 (d, J=2, 3 Hz, 1H, H-8), 6,35 (dd, J=8,4, 2,43 Hz, 1H, H-6), 6,70 (d, J=8,6 Hz, 2H, H-3' i H-5'), 6,83 (d, J=8,7 Hz, 2H, H-3 i H-5), 7,01 (d, J=8,5 Hz, 2H, H-2' i H-6'), 7,12 (d, J=8,4 Hz, 1H, H-5), 7,24 (d, J=8,6 Hz, 2H, H-2 i H-6); ¹³C RMN (CD3OD, 75 MHz) δ ppm 14,84, 22,50, 23,99, 54,78, 57,03, 62,97, 81,22, 104,38, 109,11, 115,35, 116,01, 118,68, 125,78, 126,33, 130,26, 130,72, 131,29, 131,59, 134,26, 154,42, 157,56, 158,96, 159,33. Skład elementarny: C, H, N, Cl: teoretycznie; 70,51, 6,53, 2,84, 7,18%, znalezione: 70,31, 6,75, 2,65, 6,89%.

P r z y k ł a d 3

Testy in vivo biodostępności proleków androst-5-eno-33,173-diolu

1) Zasada

Testy biodostępności proleków prekursorów sterydów płciowych przeprowadzono na samcach szczurów Sprague Dawley mierząc stężenia w osoczu związków po pojedynczym doustnym podawaniu związków.

a) Zwierzęta i terapia

Samce szczurów Sprague-Dawley [Crl:CD(SD)Br] ważące 275-350 g otrzymano z Charles-River Canada Inc. i trzymano po 2 na klatkę podczas okresu przyzwyczajania i indywidualnie podczas okresu badań. Zwierzęta trzymano w reżimie 12 godzin oświetlenia: 12 godzin ciemności (zapalanie światła o 08:00).

Zwierzęta otrzymywały certyfikowany pokarm dla gryzoni (Lab Diet # 5002, granulki) i wodę z kranu w dowolnej ilości. Szczury wyposzczono (dostęp tylko do wody) rozpoczynając od wieczora przed dawkowaniem.

Każdy związek testowany podawano trzem zwierzętom jako zawiesinę w 0,4% metylocelulozie zgłębnikiem doustnym przy dawce 150 μg/szczura. Jedną próbkę krwi ~0,7 ml pobrano z żyły szyjnej szczurów pod znieczuleniem indukowanym Izofluranem w 1, 2, 3, 4 i 7 godzin po stosowaniu zgłębnika. Próbki krwi natychmiast przeniesiono do ochłodzonego pojemnika 0,75 ml Microtainer zawierającego EDTA i trzymano w łaźni z wodą z lodem do odwirowania przy 3000 obrotach na minutę przez 10 minut. Oddzielanie osocza przeprowadzono szybko (mniej niż 50 minut) po zebraniu krwi. Jedną próbkę 0,25 ml osocza przeniesiono następnie do borokrzemianowej probówki (13 x 100) i szybko zamrożono na suchym lodzie. Próbki osocza trzymano w temperaturze -80°C aż do pomiaru stężenia w osoczu sterydów płciowych lub prekursorów sterydów płciowych metodą GC-MS.

Wyniki:

Doustną absorpcję i AUC pokazano na fig. 12 i 13.

Claims

1. Zastosowanie prekursora sterydów płciowych wybranego z grupy obejmującej androst-5-eno-3β, 17p-diol i prolek androst-5-eno-3e,17p-diolu, przy czym prolek jest przekształcany do prekursora in vivo, w połączeniu z leczniczo skuteczną ilością selektywnego modulatora receptora estrogenu do wytwarzania leku do połączonej terapii lub zmniejszania ryzyka nabycia osteoporozy, przy czym selektywny modulator receptora estrogenu ma następujący wzór:

w którym Z oznacza dwuwartościowe zamykające ugrupowanie;

w którym R100 oznacza dwuwartościowe ugrupowanie, które oddziela L od pierścienia B 4-10 odgradzającymi atomami;

w którym G1 wybiera się z grupy obejmującej atom wodoru, węglowodór C1 do C5 lub dwuwartościowe ugrupowanie, które łączy G2 i L z wytworzeniem 5-do 7-członowego pierścienia heterocyklicznego, oraz chlorowiec lub nienasycone pochodne powyższych;

xo w którym X wybiera się z grupy obejmującej H-, ROC-, RCO2CHRa- i RbSO2-, R wybrana z grupy obejmującej atom wodoru, prosty lub rozgałęziony (C1-C18)alkil, prosty lub rozgałęziony (C2-C18)alkenyl, prosty lub rozgałęziony (C2-C18) alkinyl, aryl, furyl, prosty lub rozgałęziony (C1-C18) alkoksyl, prosty lub rozgałęziony (C2-C18) alkenyloksyl, prosty lub rozgałęziony (C2-C18) alkinyloksyl, aryloksyl, furyloksyl i chlorowcowe lub karboksylowe analogi powyższych; Ra oznacza atom wodoru lub (C1-C6) alkil; i Rb wybiera się z grupy obejmującej hydroksyl lub jego sole, metyl, fenyl i p-toluil;

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje dodawanie leczniczo skutecznej ilości bisfosfonianu w wytwarzaniu leku do terapii kombinacyjnej.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że ponadto podaje się leczniczo skuteczną ilość progestinu w wytwarzaniu leku do terapii kombinacyjnej.

4. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienne tym, że Z w selektywnym modulatorze receptora estrogenu wybiera się z grupy obejmującej -O-, -NH-, -S- i - CH2-.

5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że selektywnym modulatorem receptora estrogenu jest pochodna benzopiranu o następującym ogólnym wzorze:

PL 195 772 B1 w którym D oznacza -OCH2CH2N(R3)R4, R3 i R4 niezależnie wybrane z grupy obejmującej C1-C4 alkil, lub R3, R4 i atom azotu, z którym są związane, razem tworzą strukturę pierścieniową wybraną z grupy obejmują cej pirolidyno, dimetylo-1-pirolidyno, metylo-1-pirolidynyl, piperydyno, heksametylenoimino, morfolino, w którym R1 i R2 niezależnie wybiera się z grupy obejmującej: atom wodoru, hydroksyl i ugrupowanie przekształcane in vivo w hydroksyl.

6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że pochodna benzopiranowa jest optycznie czynnym związkiem mającym absolutną konfigurację S na węglu 2 lub jego farmaceutycznie dopuszczalną solą, przy czym związek ma budowę cząsteczkową:

w którym R1 i R2 niezależnie wybiera się z grupy obejmującej hydroksyl i ugrupowanie przekształcane in vivo do hydroksylu;

w którym R³ oznacza grupę wybraną z grupy obejmującej nasycony, nienasycony lub podstawiony pirolidynyl, nasyconą, nienasyconą lub podstawioną piperydyno, nasycony, nienasycony lub podstawiony piperydynyl, nasyconą, nienasyconą lub podstawioną morfolino, zawierające azot cykliczne ugrupowanie, zawierające azot policykliczne ugrupowanie, oraz NRaRb, Ra i Rb oznaczają niezależnie atom wodoru, prosty lub rozgałęziony C1-C6 alkil, prosty lub rozgałęziony C2-C6 alkenyl, oraz prosty lub rozgałęziony C2-C6 alkinyl.

7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że związek lub sól nie zawiera zasadniczo enancjomeru (2R).

8. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że selektywny modulator receptora estrogenu wybiera się z grupy obejmującej:

PL 195 772 B1

9. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że pochodna benzopiranu oznacza sól kwasu wybranego z grupy obejmującej kwas octowy, adypinowy, benzenosulfonowy, benzoesowy, kamforosulfonowy, cytrynowy, fumarowy, jodowodorowy, bromowodorowy, chlorowodorowy, hydrochlorotiazydowy, hydroksynaftoesowy, mlekowy, maleinowy, metanosulfonowy, metylosiarkowy, 1,5-naftalenodisulfonowy, azotowy, palmitynowy, piwalinowy, fosforowy, propionowy, bursztynowy, siarkowy, winowy, tereftalowy, p-toluenosulfonowy i walerianowy.

10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że kwasem jest kwas chlorowodorowy.

11. Zastosowanie według 1 albo 2, albo 3, znamienne tym, że selektywnym modulatorem receptora estrogenu jest:

12. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienne tym, że prolek przekształcany in vivo w prekursor sterydu płciowego wybiera się z grupy obejmującej: