PL196787B1

PL196787B1 - Nowy sposób zatężania epotylonów, nowe pożywki hodowlane oraz nowy sposób wytwarzania epotylonów

Info

Publication number: PL196787B1
Application number: PL342423A
Authority: PL
Inventors: Hans Hofmann; Marion Mahnke; Klaus Memmert; Frank Petersen; Thomas Schupp; Ernst Küsters; Michael Mutz
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1999-02-17
Publication date: 2008-01-31
Also published as: US7101702B2; HUP0100855A2; TR200002431T2; CN1291239A; SK287677B6; US6380227B1; KR20070058021A; DK1054994T3; JP2005068156A; HK1034100A1; NZ506138A; US20030220379A1; CZ301517B6; EP1054994A4; US20020165256A1; NO322588B1; NO20061736L; US6656711B2; NO20004114L; US6194181B1

Abstract

1. Sposób zat ezania epotylonów w po zywkach hodowlanych w celu biotechnologicznego wytwarzania tych zwi azków, znamienny tym, ze wykorzystuje drobnoustroje, które wytwarzaj a te zwi azki, przy czym do po zywek dodaje si e co najmniej jedn a cyklodekstryn e jako sk ladnik kompleksotwórczy, przy czym co najmniej jedna cyklodekstryna wybrana jest z grupy obejmuj acej a-cyklodekstryn e, ß-cyklodekstryn e, ?-cyklodeksrryn e, d-cyklodekstryn e, e-cyklodekstryn e, ?-cyklodekstryn e, ?-cyklodekstryn e oraz ?-cyklodekstryn e albo grupy pochodnych cyklodekstryny obejmuj acej: cyklodekstryny, w których co najmniej jedna albo wszystkie grupy hydroksylowe s a eteryfikowane do eterów alkilowych, eterów arylohydroksyalkilowych; eterów hydroksyalkilowych; eterów karboksyalkilowych; pochodnych ni zszych eterów karboksylalkilowych, w których grupa karboksylowa oznacza aminokarbonyl, mono- lub di-ni zszy-alkiloaminokarbonyl, morfolino-, piperydyno, pirolidyno- lub piperazynokarbonyl, albo alkoksykarbonyl; eterów sulfoalkilowych; albo cyklodekstryn, w których co najmniej jedna grupa OH jest eteryfikowana rodnikiem o ogólnym wzorze -O-[alk- -O-] n -H, w którym alk oznacza alkil, za s n oznacza, liczb e ca lkowit a od 2 do 12 w lacznie; albo cyklodekstryn, w których co najmniej jedna grupa OH jest eteryfikowana rodnikiem o ogólnym wzorze: w których R' oznacza wodór, hydroksyl, albo -O-(alk-O) 2 -H, -; alk we wszystkich przypadkach oznacza alkil; m, n oraz z oznaczaj a liczby ca lkowite od 1 do 12; za s Y oznacza OR 1 lub NR 2 R 3 , gdzie R 1 , R 2 oraz R 3 niezale znie od siebie oznaczaj a wodór lub ni zszy alkil, albo R 2 oraz R 3 , po laczone wi azacym je azotem, oznaczaj a grup e morfolinow a, piperydynow a, pirolidynow a lub piperazyno- w a; albo rozga lezionych cyklodekstryn, w których wyst epuj a eteryfikacje lub acetale z cz asteczkami innych cukrów, wybranych spo sród glukozylo-, diglukozylo-(G 2 - ß-cyklodekstryn), maltozylo- i dimaltozylocyklodekstryn albo N-acetyloglukozaminylo-, gluko- zaminylo-, N-acetylogalaktozaminylo- i galaktozaminylodekstryn; oraz ni zszy-alkanoilo-cyklodekstryn, takich jak acetylowe estry cyklodekstryn; albo mieszanin dwóch lub wi ecej wymienionych cyklodekstryn i/lub pochodnych cyklodekstryn, przy czym przedro- stek „ni zszy” wskazuje, ze rodnik zawiera maksymalnie do 7 atomów w egla. PL PL PL PL PL

Description

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 17.02.1999 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

17.02.1999, PCT/EP99/01025 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

26.08.1999, WO99/42602 PCT Gazette nr 34/99 (51) Int.Cl.

C12P 17/18 (2006.01) C07D 493/04 (2006.01) B01D 15/08 (2006.01) A61K 31/335 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) C12R 1/01 (2006.01)

₍₅₄₎ Nowy sposób zatężania epotylonów, nowe pożywki hodowlane ⁽⁵⁴⁾ oraz nowy sposób wytwarzania epotylonów
	(73) Uprawniony z patentu: NOVARTIS AG,Bazylea,CH
(30) Pierwszeństwo:
19.02.1998,CH,396/98	(72) Twórca(y) wynalazku:
05.05.1998,CH,1007/98	Hans Hofmann,Ettingen,CH
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	Marion Mahnke,Steinen,DE Klaus Memmert,Lorrach,DE Frank Petersen,Weil am Rhein,DE
04.06.2001 BUP 12/01	Thomas Schupp,Mohlin,CH
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.01.2008 WUP 01/08	Ernst Msters,Eschbach,DE Michael Mutz,Freiburg,DE (74) Pełnomocnik: Łazewska Sławomira, ŁAZEWSKA & ŁAZEWSKI

(57) 1. Sposób zatężania epotylonów w pożywkach hodowlanych w celu biotechnologiczneg o wytwarzania tych związków, znamienny tym, że wykorzystuje drobnoustroje, które wytwarzają te związki, przy czym do pożywek dodaje się co najmniej jedną cyklodekstrynę jako składnik kompleksotwórczy, przy czym co najmniej jedna cyklodekstryna wybrana jest z grupy obejmującej α-cyklodekstrynę, β-cyklodekstrynę, γ-cyklodeksrrynę, δ-cyklodekstrynę, ε-cyklodekstrynę, Z-cyklodekstrynę, η-cyklodekstrynę oraz θ-cyklodekstrynę albo grupy pochodnych cyklodekstryny obejmującej: cyklodekstryny, w których co najmniej jedna albo wszystkie grupy hydroksylowe są eteryfikowane do eterów alkilowych, eterów arylohydroksyalkilowych; eterów hydroksyalkilowych; eterów karboksyalkilowych; pochodnych niższych eterów karboksylalkilowych, w których grupa karboksylowa oznacza aminokarbonyl, mono- lub di-niższy-alkiloaminokarbonyl, morfolino-, piperydyno, pirolidyno- lub piperazynokarbonyl, albo alkoksykarbonyl; eterów sulfoalkilowych; albo cyklodekstryn, w których co najmniej jedna grupa OH jest eteryfikowana rodnikiem o ogólnym wzorze -O-[alk-O-]n-H, w którym alk oznacza alkil, zaś n oznacza, liczbę całkowitą od 2 do 12 włącznie; albo cyklodekstryn, w których co najmniej jedna grupa OH jest eteryfikowana rodnikiem o ogólnym wzorze:

w których R' oznacza wodór, hydroksyl, albo -O-(alk-O)2-H, -; alk we wszystkich przypadkach oznacza alkil; m, n oraz z oznaczają liczby całkowite od 1 do 12; zaś Y oznacza OR1 lub NR2R3, gdzie R1, R2 oraz R3 niezależnie od siebie oznaczają wodór lub niższy alkil, albo R2 oraz R3, połączone wiążącym je azotem, oznaczają grupę morfolinową, piperydynową, pirolidynową lub piperazynową; albo rozgałęzionych cyklodekstryn, w których występują eteryfikacje lub acetale z cząsteczkami innych cukrów, wybranych spośród glukozylo-, diglukozylo-(G₂-e-cyklodekstryn), maltozylo- i dimaltozylocyklodekstryn albo N-acetyloglukozaminylo-, glukozaminylo-, N-acetylogalaktozaminylo- i galaktozaminylodekstryn; oraz niższy-alkanoilo-cyklodekstryn, takich jak acetylowe estry cyklodekstryn; albo mieszanin dwóch lub więcej wymienionych cyklodekstryn i/lub pochodnych cyklodekstryn, przy czym przedrostek „niższy” wskazuje, że rodnik zawiera maksymalnie do 7 atomów węgla.

PL 196 787 B1

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek obejmuje nowy sposób zatężania epotylonów, nowe pożywki hodowlane oraz nowy sposób wytwarzania epotylonów.

Sposób według wynalazku może być wykorzystany w skali przemysłowej.

Wśród istniejących cytotoksycznie działających składników w leczeniu guzów ważną rolę odgrywa Taxol^® (Paclitaxel; Bristol-Myers Squibb), środek stabilizujący mikrotubule i odnosi on znaczne sukcesy handlowe. Taxol wykazuje jednak liczne wady. W szczególności problemy stwarza jego bardzo słaba rozpuszczalność w wodzie. Staje się więc konieczne podawanie Taxolu^® w postaci kompozycji z Cremophorem EL^® (polioksyetylowanym olejem rycynowym; BASF, Ludwigshafen, Niemcy). Cremophor EL^® wykazuje ciężkie skutki uboczne; powoduje on np. alergie, które przynajmniej w jednym przypadku doprowadziły nawet do śmierci pacjenta.

Chociaż klasę przeciwrakowych środków stabilizujących mikrotubule - Taxan zalecano jako „być może najważniejszy dodatek do farmaceutycznego arsenału przeciw rakowi w ostatniej dekadzie” (patrz Rowinsky E. K., Ann. Rev. Med. 48, 353-374 (1997)) oraz mimo handlowych sukcesów Taxolu^®związki te nie wykazywały dotychczas, że reprezentują rzeczywiście wielki przełom w chemioterapii raka. Leczenie z zastosowaniem Taxolu^® jest związane z licznymi istotnymi skutkami ubocznymi, a kilka głównych klas spoistych guzów, a mianowicie guzy okrężnicy i gruczołu krokowego, reagują na ten związek jedynie w małym stopniu (patrz m.in. Rowinsky E. K.). Ponadto skuteczność działania Taxolu^®może być osłabiona lub nawet całkowicie zneutralizowana przez mechanizmy nabytej oporności, zwłaszcza takie, które bazują na nadekspresji fosfoprotein, działających jak pompy powodujące wypływ czynnych składników, takie jak „oporność wielolekowa”, wynikająca z nadekspresji wielolekowego transportu glikoproteiny „glikoproteiny-P”.

Epotylony A oraz B reprezentują nową klasę cytoksycznych czynnych składników stabilizujących mikrotubule (patrz Gerth, K. i in., J. Antibiol. 49, 560-3 (1966) o ogólnym wzorze (I):

w którym R oznacza wodór (epotylon A) lub metyl (epotylon B).

_®

Związki te wykazują następujące zalety w porównaniu z Taxolem :

a) wykazują lepszą rozpuszczalność w wodzie, są więc łatwiejsze do wprowadzania do kompozycji;

b) stwierdzono, że w doświadczeniach z hodowlą komórek działają one również przeciw rozrostowi takich komórek, które - wskutek pompującego działania glikoproteiny-P powodującego wypływ i nadającego im „oporność wielolekową” - wykazują opór na leczenie innymi środkami chemioterapeutycznymi włącznie z Taxolem^® (patrz Bolag, D. M. i in., „Epothilones, a new class of microtubulestabilizing agents with a Taxol-like mechanism of action” (Epotylony, nowa klasa środków stabilizujących mikrotubule o mechanizmie działania podobnym, jak w przypadku Taxolu), Cancer Research 55, 2325-33 (1995);

c) można wykazać, że działają one również bardzo skutecznie in vitro przeciw opornej na Taxol® linii rakowych komórek jajnikowych ze zmodyfikowaną β-tubuliną (patrz Kowalski, R. J. i in., J. Biol. Chem. 272 (4), 2534-2541 (1997).

Farmaceutyczne stosowanie epotylonów, np. do leczenia guzów, jest możliwe w sposób analogiczny do opisanego dla Taxolu (patrz np. amerykańskie dokumenty patentowe nr 5 641 803, 5 496 804, 5 565 478).

PL 196 787 B1

W celu umoż liwienia stosowania epotylonów na wię ksza skalę dla celów farmaceutycznych konieczne jest jednak wytwarzanie odpowiednich ilości tych związków.

Dotychczas opisano w literaturze wydobywanie naturalnych związków z pomocą miksobakterii, zwłaszcza epotylonów ze szczepu komórkowego Sorangium Cellulosum Soce90 (zdeponowanego pod numerem 6773 w German Collection of Microorganisms (Niemieckim Zbiorze Drobnoustrojów), patrz WO 93/10121. W celu uzyskania zadowalających stężeń tych związków naturalnych, zwłaszcza epotylonów, w pożywce hodowlanej dla późniejszego ich wydobycia uprzednio zawsze dodawano żywicę adsorbującą bazującą na polistyrenie, np. Amberlit XAD1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, Niemcy).

Wadą tego sposobu jest jednak to, że w dużej skali prowadzi on do licznych problemów. Kulki żywicy uszkadzają zawory, mogą zatykać przewody i urządzenia mogą ulegać większemu zużyciu w wyniku mechanicznego tarcia. Kulki żywicy są porowate i w związku z tym mają duż e wewnętrzne pole powierzchni (około 825 m³ na gram żywicy). Sterylizacja staje się problemem, ponieważ powietrze zamknięte w żywicy nie ulega autoklawowaniu. Sposób ten nie może być więc praktycznie prowadzony w dużej skali ze stosowaniem dodatku żywicy.

Z drugiej strony bez dodawania kulek żywicy nie moż na osiągać w pożywce hodowlanej zadowalających stężeń epotylonów.

Obecnie nieoczekiwanie odkryto warunki, niezbędne do znalezienia rozwiązania tego problemu, umożliwiające zadowalające zatężanie naturalnych substancji otrzymywanych z drobnoustrojów, zwłaszcza z miksobakterii, które wytwarzają epotylony, takie jak epotylon A lub B, a w szczególności zatężanie epotylonów A oraz B w pożywce hodowlanej bez dodatku żywic i dzięki temu umożliwiające wytwarzanie tych związków, a zwłaszcza epotylonów, w skali technicznej i przemysłowej bez wyżej wymienionych wad.

Przedmiotem wynalazku jest sposób zatężania epotylonów w pożywkach hodowlanych w celu biotechnologicznego wytwarzania tych związków.

Istotą wynalazku jest fakt, iż wykorzystuje drobnoustroje, które wytwarzają te związki, przy czym do pożywek dodaje się co najmniej jedną cyklodekstrynę jako składnik kompleksotwórczy, przy czym co najmniej jedna cyklodekstryna wybrana jest z: grupy obejmującej α-cyklodekstrynę, β-cyklodekstrynę, γ-cyklodekstrynę, δ-cyklodekstrynę, ε-cyklodekstrynę, Z-cyklodekstrynę, η-cyklodekstrynę oraz θ-cyklodekstrynę albo grupy pochodnych cyklodekstryny obejmującej: cyklodekstryny, w których co najmniej jedna albo wszystkie grupy hydroksylowe są eteryfikowane do eterów alkilowych, eterów arylohydroksyalkilowych; eterów hydroksyalkilowych; eterów karboksyalkilowych; pochodnych niższych eterów karboksyalkilowych, w których grupa karboksylowa oznacza aminokarbonyl, mono- lub di-niższy-alkiloaminokarbonyl, morfolino-, piperydyno, pirolidyno- lub piperazynokarbonyl, albo alkoksykarbonyl; eterów sulfoalkilowych; albo cyklodekstryn, w których co najmniej jedna grupa OH jest eteryfikowana rodnikiem o ogólnym wzorze -O-[alk-O-]n-H, w którym alk oznacza alkil, zaś n oznacza, liczbę całkowitą od 2 do 12 włącznie; albo cyklodekstryn, w których co najmniej jedna grupa OH jest eteryfikowana rodnikiem o ogólnym wzorze:

w których R' oznacza wodór, hydroksyl, albo -O-(alk-O)2-H, -; alk we wszystkich przypadkach oznacza alkil; m, n oraz z oznaczają liczby całkowite od 1 do 12; zaś Y oznacza OR1 lub NR2R3, gdzie R1, R2 oraz R3 niezależnie od siebie oznaczają wodór lub niższy alkil, albo R2 oraz R3, połączone wiążącym je azotem, oznaczają grupę morfolinową, piperydynową, pirolidynową lub piperazynową; albo rozgałęzionych cyklodekstryn, w których występują eteryfikacje lub acetale z cząsteczkami innych cukrów, wybranych spośród glukozylo-, diglukozylo-(G₂-e-cyklodekstryn), maltozylo- i dimaltozylocyklodekstryn albo N-acetyloglukozaminylo-, glukozaminylo-, N-acetylogalaktozaminylo- i galaktozaminylodekstryn; oraz niższy-alkanoilo-cyklodekstryn, takich jak acetylowe estry cyklodekstryn; albo mieszanin dwóch lub więcej wymienionych cyklodekstryn i/lub pochodnych cyklodekstryn, przy czym, przedrostek „niższy” wskazuje, że rodnik zawiera maksymalnie do 7 atomów węgla.

Korzystnie jako producentów naturalnych substancji wykorzystuje się miksobakterie.

PL 196 787 B1

Korzystnie, pożywka zawiera szczepy Sorangium nadające się do wytwarzania epotylonów, wodę i inne odpowiednie zwykle stosowane składniki pożywek hodowlanych

Korzystnie, cyklodekstryny i/lub pochodne cyklodekstryn dodaje się do pożywek hodowlanych w iloś ci od 0,05 do 10% (stężenie wagowe).

W innym korzystnym wariancie, cyklodekstryny i/lub pochodne cyklodekstryn dodaje się w nim w iloś ci od 0,1 do 2% (stężenie wagowe).

Korzystnie, pochodne cyklodekstryn wybiera się spośród cyklodekstryn i hydroksy-niższych-alkilocyklodekstryn albo mieszanin jednej lub większej ich liczby, przy czym przedrostek „niższy” oznacza, że rodnik zawiera maksymalnie do 7 atomów węgla.

Korzystnie, jako składnik kompleksotwórczy stosuje się 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę.

Przedmiotem wynalazku są także pożywki hodowlane.

Istotą wynalazku jest to, że pożywki zawierają co najmniej jedną cyklodekstrynę określoną powyżej oraz drobnoustroje odpowiednie do wytwarzania epotylonów.

Korzystnie, jako drobnoustroje pożywki hodowlane zawierają miksobakterie.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania epotylonów.

Istotą wynalazku jest to, że epotylony wytwarza się przez obróbkę pożywek hodowlanych, przeznaczonych do biotechnologicznego wytwarzania tych związków, zawierających drobnoustroje, które nadają się do wytwarzania epotylonów, korzystnie miksobakterie, jako producentów naturalnych substancji, do których to pożywek dodaje się co najmniej jedną cyklodekstrynę określoną powyżej, a następnie oczyszcza się i w razie potrzeby rozdziela uzyskane epotylony.

Korzystnie, stosuje się pożywki hodowlane zawierające miksobakterie rodzaju Sorangium, przy czym pożywki rozdziela się na fazę stałą i na fazę ciekłą - odciek przez odwirowywanie, odciek miesza się z żywicą lub przepuszcza przez kolumnę wypełnioną taką żywicą, w razie potrzeby żywicę przemywa się wodą, epotylon lub epotylony desorbuje się z żywicy polarnym rozpuszczalnikiem, dodaje się organiczny rozpuszczalnik, który nie miesza się z wodą, przenosi się epotylon lub epotylony do fazy organicznej, po czym uzyskane z fazy organicznej epotylony zatęża się na sitach molekularnych o niskich masach cząsteczkowych; a następnie frakcje zawierające epotylony rozdziela się w kolumnach z układem odwróconych faz, przy czym wytwarza się oddzielnie epotylony A i B, a w razie potrzeby można je dalej zatężać przez rekrystalizację.

Jeszcze jednym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania epotylonów, w którym zatęża się epotylony w pożywkach hodowlanych, przeznaczonych do biotechnologicznego wytwarzania tych związków, zawierających drobnoustroje nadające się do wytwarzania tych związków, wodę i inne odpowiednie zwykłe składniki pożywek hodowlanych, przy czym do tych pożywek hodowlanych dodaje się cyklodekstryny lub pochodne cyklodekstryn albo mieszaniny dwóch lub większej liczby tych związków; który to sposób obejmuje etap rozdzielania epotylonów.

Istotą wynalazku jest to, że stosuje się rozdzielanie chromatograficzne na kolumnie w układzie odwróconych faz z użyciem eluentów, zawierających niższe cyjanki alkilowe, przy czym rozdzielanie chromatograficzne prowadzi się na materiale kolumny zawierającym łańcuchy węglowodorowe, a eluenty zawierają niższe nitryle alkilowe.

Ogólne pojęcia, używane tu wcześniej oraz dalej, korzystnie mają niżej podane znaczenia.

Jeżeli wcześniej oraz dalej podaje się tu odsyłacze do dokumentów, to są one tu w razie potrzeby włączane.

Dodane słowo „niższy” zawsze wskazuje, że odpowiednio nazwany rodnik korzystnie zawiera maksymalnie do 7 atomów węgla, a zwłaszcza do 4 atomów węgla i jest rozgałęziony lub nie rozgałęziony. Niższy alkil może np. oznaczać alkil nie rozgałęziony lub rozgałęziony raz lub więcej razy i oznacza np. metyl, etyl, propyl, taki jak izopropyl lub n-propyl, butyl, taki jak izobutyl, sec-butyl, tert-butyl lub n-butyl albo również pentyl, taki jak amyl lub n-pentyl.

Pożywka hodowlana dla biotechnologicznego wytwarzania epotylonów, która zawiera drobnoustroje wytwarzające te związki, zwłaszcza miksobakterie, jako producentów naturalnych substancji, oznacza zwłaszcza pożywkę, która zawiera odpowiednie drobnoustroje (występujące w sposób naturalny lub też możliwe do wytworzenia przez hodowanie lub w szczególności przez modyfikację genetyczną), zwłaszcza szczepy miksobakteryjne, które są w stanie wytwarzać te związki, w szczególności miksobakterie z rodzaju Sorangium, korzystnie (zwłaszcza do wytwarzania epotylonów) drobnoustroje typu Sorangium Cellulosum Soce90 (patrz WO 93/10121) albo pochodzące z nich materiały biologiczne (np. wytworzone przez mutagenezę lub technologię genów rekombinacyjnych) lub z części tych miksobakterii, zwłaszcza odpowiednie szczepy pochodne, w szczególności zaś szczep o oznaczeniu

PL 196 787 B1

BCE33/10 lub jego mutanty, a ponadto, oprócz wody, korzystnie zawiera też inne powszechnie stosowane i odpowiednie składniki pożywek hodowlanych, takie jak biopolimery, cukier, aminokwasy, sole, kwasy nukleinowe, witaminy, antybiotyki, semiochemikalia, pożywki wzrostu, wyciągi z takich materiałów biologicznych jak drożdże lub inne wyciągi komórkowe, mąka sojowa, skrobia, taka jak np. skrobia ziemniaczana i/lub pierwiastki śladowe, np. jony żelaza w postaci związanej w kompleks albo odpowiednie mieszaniny wszystkich lub niektórych spośród tych składników i/lub także analogicznych dodatków. Odpowiednie pożywki hodowlane są znane specjalistom w branży lub można je wytwarzać znanymi sposobami (patrz np. pożywki hodowlane w przykładach niniejszego ujawnienia lub w WO 93/10121).

Jedną z korzystnych miksobakterii jest szczep dobrany przez mutagenezę promieniowaniem nadfioletowym i selekcję dla podwyższonego wytwarzania epotylonu A i/lub B w porównaniu z Sorangium cellulosum Soce90, który jest zdeponowany w OSM pod numerem 6773, a zwłaszcza mutant BCE 33/10, który został zdeponowany pod numerem OSM 11999 9 lutego 1998 w Niemieckim Zbiorze Drobnoustrojów i Hodowli Komórek (OSMZ, Braunschweig, Niemcy).

Hodowla szczepu i morfologiczny opis szczepu BCE 33/10

Szczep ten może rozrastać się na celulozie jako jedynym źródle węgla i energii z azotanem potasowym jako jedynym źródłem azotu, np. na bibule filtracyjnej z agarem z solami mineralnymi ST21 (0,1%, KNO3; 0,1% MgSO4 · 7H2O; 0,1% CaCl2 · 2H2O; 0,1% K2HPO4; 0,01% MnSO4 · 7H2O; 0,02% FeCl3; 0,002% wyciąg drożdżowy; standardowy roztwór pierwiastków śladowych; 1% agar). Na tej pożywce powstają ciemne, od czerwonawobrązowych do czarnobrązowych, owocniki grzybów. Stanowią one małe ugrupowania zarodni (o średnicy od około 15 do 30 μm) i występują w postaci gęstych kopczyków lub pakiecików o różnych rozmiarach.

Wegetatywne laseczki mają kształt typowy dla Sorangium (stosunkowo spoiste, ciemne pod mikroskopem z kontrastem fazowym, cylindryczne laseczki z szeroko zaokrąglonymi końcami o średniej długości od 3 do 6 μm i grubości 1 μm).

Epotylony są to głównie epotylon A i/lub B, ale również i inne epotylony, np. epotylony C i D, wymienione w międzynarodowych zgłoszeniach WO 97/19086 oraz WO 98/22461, epotylony E i F, wymienione w WO 98/22461 oraz dalsze epotylony, które można wytwarzać z odpowiednich drobnoustrojów.

Rozpuszczalne w wodzie składniki kompleksotwórcze oznaczają zwłaszcza rozpuszczalne w wodzie pochodne oligopeptydów lub polipeptydów albo w szczególności pochodne oligosacharydów lub polisacharydów o strukturze pierścieniowej lub spiralnej, tworzące wewnątrzcząsteczkowe wnęki, które dzięki ich wystarczająco hydrofobowym własnościom są w stanie wiązać epotylony, a zwłaszcza epotylon A i/lub epotylon B. Szczególnie korzystnymi rozpuszczalnymi w wodzie składnikami kompleksotwórczymi są takie, które wybiera się spośród cyklodekstryn lub (zwłaszcza) spośród pochodnych cyklodekstryn albo ich mieszanin.

Cyklodekstryny są to pierścieniowe oligosacharydy z wiązaniami (α-1,4) α-D-glukopiranozy ze stosunkowo hydrofobowymi centralnymi wnękami i hydrofilowymi polami powierzchni zewnętrznej.

Szczególnie wyróżniają się następujące cyklodekstryny (liczby w nawiasach oznaczają liczby jednostek glukozowych w cząsteczce): α-cyklodekstryna (6), β-cyklodekstryna (7), γ-cyklodekstryna (8), δ-cyklodekstryna (9), ε-cyklodekstryna (10), Z-cyklodekstryna (11), η-cyklodekstryna (12) oraz θ-cyklodekstryna (13).

Szczególnie korzystne są: δ-cyklodekstryna, a zwłaszcza α-cyklodekstryna, β-cyklodekstryna lub γ-cyklodekstryna albo ich mieszaniny.

Pochodne cylodekstryn oznaczają przede wszystkim pochodne wyżej wymienionych cyklodekstryn, a zwłaszcza α-cyklodekstryny, β-cyklodekstryny lub γ-cyklodekstryny, głównie takie, w których jedna lub więcej aż do wszystkich (3) grup hydroksylowych w rodniku glukozowym są eteryfikowane lub estryfikowane. Etery oznaczają zwłaszcza etery alkilowe, w szczególności etery niższych alkilów, takie jak etery metylowe lub etylowe, a także etery propylowe lub butylowe; etery arylohydroksyalkilowe, takie jak niższe etery fenylohydroksyalkilowe, a zwłaszcza etery fenylohydroksyetylowe; etery hydroksyalkilowe, w szczególności niższe etery hydroksyalkilowe, zwłaszcza etery 2-hydroksyetylowe, etery hydroksypropylowe, takie jak 2-hydroksypropylowe lub etery hydroksybutylowe, takie jak 2-hydroksybutylowe; etery karboksyalkilowe, w szczególności niższe etery karboksyalkilowe, zwłaszcza etery karboksymetylowe lub karboksyetylowe; pochodne eterów karboksyalkilowych, w szczególności pochodne niższych eterów karboksyloalkilowych, w których tworzący pochodną karboksyl oznacza karboksyl eteryfikowany lub amidowany (zwłaszcza aminokarbonyl, mono lub di-niższy-alkilo6

PL 196 787 B1 amino karbonyl, morfolino-, piperydyno-, pirolidyno lub piperazynokarbonyl, albo alkoksykarbonyl), w szczególności etery niższy-alkoksykarbonylo-niższy-alkilowe, np. etery metoksykarbonylopropylowe lub etery etoksykarbonylopropylowe; etery sulfoalkilowe, w szczególności niższe etery sulfoalkilowe, zwłaszcza etery sulfobutylowe; cyklodekstryny, w których jedna lub więcej grup OH są eteryfikowane rodnikami o ogólnym wzorze -O-[alk-O-]n-H, w których alk oznacza alkil, zwłaszcza niższy alkil, zaś n oznacza liczbę całkowitą od 2 do 12, korzystnie od 2 do 5, a zwłaszcza 2 lub 3; cyklodekstryny, w których jedna lub więcej grup OH są eteryfikowane rodnikami o ogólnym wzorze

w których R' oznacza wodór, hydroksyl, -O-(alk-O)z-H, -O-(alk(-R)-O-)p-H lub -O-(alk(-R)-O)q-alk-CO-Y; Alk we wszystkich przypadkach oznacza alkil, zwłaszcza niższy alkil; m, n, p, q oraz z oznaczają liczby całkowite od 1 do 12, korzystnie od 1 do 5, a jeszcze korzystniej od 1 do 3; zaś Y oznacza OR1 lub NR2R3, gdzie R1, R2 oraz R3 niezależnie od siebie oznaczają wodór lub niższy alkil, albo R2 oraz R3 połączone razem wraz z wiążącym je azotem oznaczają grupę morfolinową, piperydynową, pirolidynową lub piperazynową, albo rozgałęzione cyklodekstryny, w których występują eteryfikacje lub acetale z cząsteczkami innych cukrów, zwłaszcza glukozylo-, diglukozylo-(G₂-e-cykłodekstryny), maltozylolub dimaltozylocyklodekstryny, albo N-acetyloglukozaminylo-, glukozaminylo-, N-acetylogalaktozaminylo- lub galaktozaminylocyklodekstryny.

Estry oznaczają zwłaszcza estry alkanoilowe, w szczególności estry niższych alkanoilów, takie jak acetylowe estry cyklodekstryn.

Możliwe jest również stosowanie takich cyklodekstryn, w których jednocześnie występują dwie lub większa liczba różnych wymienionych wyżej grup eterowych i estrowych.

Mogą występować również mieszaniny dwóch lub więcej wyżej wymienionych cyklodekstryn i/lub pochodnych cyklodekstryn.

Korzystne są zwłaszcza α-, β- lub γ-cyklodekstryny albo ich etery z niższymi alkilami, takie jak metylo-e-cyklodekstryna lub zwłaszcza 2,6-di-O-metylo-e-cyklodekstryna albo w szczególności ich etery z niższymi hydroksyalkilami, takie jak 2-hydroksypropylo-a-, 2-hydroksypropylo-e- lub 2-hydroksypropylo-Y-cyklodekstryna.

Te cyklodekstryny lub pochodne cyklodekstryn dodaje się do pożywek hodowlanych korzystnie w stężeniach od 0,02 do 10, bardziej korzystnie od 0,05 do 5, a zwłaszcza od 0,1 do 4, np. od 0,1 do 2% stęż. wagowego.

Cyklodekstryny lub pochodne cyklodekstryn są znane lub można je wytwarzać znanymi sposobami (patrz np. dokumenty patentowe nr US 3 459 731; US 4 383 992; US 4 535 152; US 4 659 696; EP 0094 157; EP 0149 197; EP 0197 571; EP 0 300 526; EP 0 320 032; EP 0 499 322; EP 0 503 710; EP 0 818 469; WO 90/12035; WO 91/11200; WO 93/19061; WO 95/08993; WO 96/14090; GB 2 189 245;

DE 3 118 218; DE 3 317 064 oraz wymienione tu źródła literaturowe, które również dotyczą syntezy cyklodekstryn lub pochodnych cyklodekstryn albo również: T. Loftsson i M. E. Brewster (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: Drug Solubilization and Stabilisation (Farmaceutyczne zastosowania cyklodekstryn: rozpuszczanie i stabilizacja leków): Journal of Pharmaceutical Science 85 (10): 1017-1025; R. A. Rajewski i V. J. Stella (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: In vivo Drug Delivery (Farmaceutyczne zastosowania cyklodekstryn: dostarczanie leków in vivo): Journal of Pharmaceutical Science 85 (11): 1142-1169).

W niniejszym opisie, obróbki i oczyszczania przez epotylony rozumie się takie epotylony, które można wytwarzać z odpowiednich drobnoustrojów, korzystnie epotylony C, D, E, F lub zwłaszcza A albo w szczególności epotylon B. Jeśli nie określono inaczej, to tam, gdzie wymienia się „epotylony”, ma to oznaczać ogólne pojęcie, które obejmuje poszczególne epotylony lub ich mieszaniny.

Obróbkę epotylonów prowadzi się powszechnie stosowanymi sposobami; przede wszystkim przez rozdzielenie pożywek wprowadzanych do ciekłej fazy (odcieku z odwirowywania lub przesączu)

PL 196 787 B1 oraz stałej fazy (komórek) na drodze filtracji lub odwirowywania (w wirówce rurowej lub separatorze). Następnie część (główną) epotylonów, znajdujących się w odcieku z odwirowywania lub w przesączu, miesza się bezpośrednio z syntetyczną żywicą, np. z żywicą bazującą na polistyrenie jako matrycy (zwaną tu dalej również po prostu żywicą polistyrenową), taką jak Amberlit XAO-16 [Rohm & Haas Germany GmbH, Frankfurt] lub Diaion HP- 20 [Resindion S. R. L., Mitsubishi Chemical Co., Mediolan] (korzystnie w objętościowym stosunku odcieku z wirówki do żywicy, wynoszącym od około 10:1 do 100:1, korzystnie około 50:1). Po upływie czasu kontaktu, wynoszącego korzystnie od 0,25 do 50 godzin, zwłaszcza od 0,8 do 22 godzin, żywicę oddziela się np. przez filtrację lub odwirowywanie. W razie potrzeby ż ywicę tę po absorpcji przemywa się silnie polarnym rozpuszczalnikiem, korzystnie wodą. Następnie prowadzi się desorpcję epotylonów odpowiednim rozpuszczalnikiem, korzystnie alkoholem, zwłaszcza izopropanolem.

Fazę rozpuszczalnika, korzystnie fazę izopropanolu, uwalnia się następnie od tego rozpuszczalnika, korzystnie przez uprzednie, równoczesne lub późniejsze dodanie wody, zwłaszcza w wyparce cyrkulacyjnej, dzięki czemu w razie potrzeby uzyskuje się zatężenia, a wytworzoną wodną fazę ekstrahuje się rozpuszczalnikami, nadającymi się do tworzenia drugiej fazy, takimi jak estry, np. niższe alkanolany niższych alkoholi, najczęściej octan etylowy lub octan izopropylowy.

W ten sposób epotylony przenosi się do fazy organicznej. Następnie tę fazę organiczn ą zatęża się do niezbędnego stopnia, korzystnie do sucha, np. z zastosowaniem wyparki obrotowej.

Następnie zachodzi dalsza obróbka z zastosowaniem następujących etapów, przy czym etap oczyszczania chromatograficznego w układzie odwróconych faz z elucją z użyciem nitryli jest etapem według niniejszego wynalazku i w związku z tym jest obowiązkowy, podczas gdy inne etapy opcjonalne:

- są czenie molekularne (chromatografia ż elowa), np. w kolumnie z takiego materiał u jak Sephadex LH-20 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) z użyciem alkoholu, takiego jak metanol jako eluenta;

- wydzielanie epotylonów na przy wykorzystaniu chromatografii w układzie odwróconych faz po umieszczeniu ich w odpowiednim rozpuszczalniku i elucji mieszaniną nitrylu i wody (obowiązkowej), korzystnie znamienne tym, że rozdzielanie chromatograficzne prowadzi się w kolumnie ze specjalnego materiału, zwłaszcza z materiału RP-18, który zawiera łańcuchy węglowodorowe, takie jak łańcuchy węglowodorowe zawierające 18 atomów węgla, zaś jako eluent stosuje się eluent, który zawiera nitryle, korzystnie niższe nitryle alkilowe, zwłaszcza acetonitryl, a w szczególności stosuje się mieszaniny nitryli z wodą, zwłaszcza mieszaniny acetonitrylu z wodą, korzystnie w stosunkach nitryli do wody wynoszących od około 1:99 do 99:1, zwłaszcza od 1:9 do 9:1, np. od 2:8 do 7:3, np. 3:7 lub 4:6;

- pojedyncza lub wielokrotna ekstrakcja pozostałości (zwłaszcza po odparowaniu) w układzie dwufazowym, składającym się z wody i rozpuszczalnika nie mieszającego się z wodą, korzystnie estru, zwłaszcza niższego alkanolanu niższego alkilu, takiego jak octan etylowy lub octan izopropylowy;

- chromatografia adsorpcyjna, zwłaszcza przez dodanie do kolumny ż elu krzemionkowego i elucję odpowiednim rozpuszczalnikiem lub mieszaniną rozpuszczalników, zwłaszcza mieszaniną estru i węglowodoru, np. alkanolanu niższego alkilu (alkan C4-C1a, w szczególności octan etylowy lub izopropylowy) i n-heksanu, w której stosunek estru do węglowodoru korzystnie zawiera się w zakresie od 99:1 do 1:99, jeszcze korzystniej od 10:1 do 1:10, np. 4:1;

- rozpuszczanie pozostałości, którą można uzyskać po zatężeniu w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak alkohol, np. metanol;

- wymieszanie z wę glem aktywowanym oraz jego usuni ę cie;

- rekrystalizacja, np. z odpowiednich rozpuszczalników lub mieszanin rozpuszczalników, np. stanowiących estry, mieszaniny estrów i węglowodorów lub alkohole, zwłaszcza octan etylowy lub izopropylowy : toluen w stosunku od 1:10 do 10:1, korzystnie 2:3 (epotylon A), albo metanol lub octan etylowy (epotylon B); przy czym między wszystkimi stosowanymi etapami wytworzone roztwory lub zawiesiny zatęża się w razie potrzeby i/lub rozdziela się ciekłe i stałe składniki, zwłaszcza przez sączenie lub odwirowywanie roztworów i zawiesin. W wyżej wymienionych poszczególnych etapach można korzystnie stosować dokładniejsze określenia, przedstawione niżej.

Obróbkę oraz oczyszczanie można korzystnie prowadzić w następujący sposób: po zebraniu pożywek rozdziela się je wprowadzając do ciekłej fazy (odcieku z odwirowywania) oraz stałej fazy (komórek) na drodze odwirowywania (w wirówce rurowej lub separatorze). Główna część epotylonów znajduje się w odcieku z odwirowywania, który następnie miesza się bezpośrednio z żywicą polistyrenową, taką jak Amberlit XAD-16 [Rohm & Haas Germany GmbH, Frankfurt] lub Diaion H-20 [Resindion S. R. L., Mitsubishi Chemical Co., Mediolan] korzystnie w objętościowym stosunku odcieku z wirówki do żywicy, wynoszącym od około 10:1 do 100:1, korzystnie około 50:1) i miesza w mieszalniku.

PL 196 787 B1

W tym etapie epotylony są przenoszone z cyklodekstryn do żywicy. Po okresie kontaktu, wynoszącym około 1 godziny, żywicę oddziela się przez odwirowanie lub filtrację. Adsorpcję epotylonów na żywicy można również prowadzić w kolumnie chromatograficznej, umieszczając żywicę w tej kolumnie i przepuszczając odciek z odwirowywania przez tę żywicę. Po adsorpcji żywicę przemywa się wodą. Desorpcję epotylonów z żywicy prowadzi się z użyciem izopropanolu. Fazę izopropanolową uwalnia się następnie od izopropanolu korzystnie przez dodanie wody, zwłaszcza w wyparce cyrkulacyjnej, a pozostałą fazę wodną ekstrahuje się octanem etylowym. Epotylony są przenoszone z tej wodnej fazy do fazy octanu etylowego. Następnie ekstrakt octanu etylowego zatęża się do sucha z użyciem wyparki obrotowej. Początkowe zatężenie epotylonów uzyskuje się następnie przez sączenie molekularne (np. stosując Sephadex LH20 [Pharmacia, Uppsala, Szwecja] z użyciem metanolu jako eluenta). Frakcje z piku z sączenia molekularnego zawierają epotylon A i B i wykazują całkowitą zawartość 16 epotylonów >10%. Rozdzielanie tych frakcji z piku, które zawierają mieszaninę epotylonów A i B na poszczególne składniki następuje potem przy wykorzystaniu chromatografii „w układzie odwróconych faz”, np. z fazą RP-18 (faza, która jest zmodyfikowana rodnikami alkilowymi, zawierającymi 18 atomów węgla w łańcuchu), z użyciem odpowiedniego eluenta, korzystnie zawierającego nitryl, taki jak acetonitryl (daje to lepsze rozdzielenie niż np. z użyciem alkoholi, takich jak metanol). Epotylon A wymywa się przed epotylonem B. Frakcje z piku z epotylonem B mogą jeszcze zawierać małe ilości epotylonu A, które można usunąć przez dalsze rozdzielanie z użyciem RP-18. Wreszcie frakcję epotylonu A krystalizuje się bezpośrednio z mieszaniny octanu etylowego i toluenu 2:3, a frakcję epotylonu B z metanolu lub octanu etylowego.

Niniejszy wynalazek korzystnie dotyczy sposobu zatężania epotylonów, zwłaszcza epotylonu A i/lub B, a w szczególności epotylonu B, w pożywkach hodowlanych do biotechnologicznego wytwarzania tego związku (tych związków), które zawierają drobnoustroje odpowiednie do takiego wytwarzania, zwłaszcza szczepów Sorangium, w szczególności typu Sorangium Cellulosum Soce90 albo powstające z nich mutanty, zwłaszcza szczep mający oznakowanie BCE 33/10, wodę i inne zwykłe odpowiednie składniki pożywek hodowlanych.

Szczególnie korzystny jest sposób, w którym cyklodekstryny i/lub pochodne cyklodekstryn dodaje się do pożywek hodowlanych w stężeniach od 0,02 do 10, korzystnie od 0,005 do 10, jeszcze korzystniej od 0,05 do 5, a najkorzystniej od 0,1 do 4, np. od 0,1 do 2% (stężenia wagowego).

Korzystny jest zwłaszcza sposób według jednego lub dwóch poprzednich ustępów, w którym pochodne cyklodekstryny wybiera się spośród cyklodekstryn, zwłaszcza β-cyklodekstryn oraz niższych hydroksy-alkilo-cyklodekstryn, zwłaszcza 2-hydroksypropylo-a-, β- lub γ-cyklodekstryn albo mieszanin jednej lub więcej spośród nich; przy czym szczególnie korzystna jest 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryna użyta samodzielnie.

Niniejszy wynalazek dotyczy w szczególności takich pożywek hodowlanych, które zawierają cyklodekstryny, pochodne cyklodekstryn lub mieszaniny dwóch lub więcej składników kompleksotwórczych, wybranych spośród cyklodekstryn i pochodnych cyklodekstryn, zwłaszcza cyklodekstryn lub pochodnych cyklodekstryn określonych w trzecim od końca akapicie, a w szczególności w akapicie drugim od końca albo mieszaniny jednego lub większej liczby tych związków oraz drobnoustroje, które nadają się do wytwarzania epotylonów, zwłaszcza epotylonu A i/lub B, korzystnie szczepy z rodzaju Sporangium, zwłaszcza szczepy Sorangium Cellulosum, np. szczep Soce90 lub powstałe z niego mutanty, w szczególności szczep BCE 33/10.

Niniejszy wynalazek dotyczy w szczególności poszczególnych etapów, wymienionych w przykładach lub ich dowolnych połączeń oraz wymienionych w nich pożywek hodowlanych.

Następujące przykłady służą do zilustrowania niniejszego wynalazku bez ograniczenia jego zakresu.

Ostrzeżenie: podczas manipulowania epotylonami z uwagi na ich wysoką toksyczność należy w razie potrzeby stosować odpowiednie środki ochronne.

Stosowany dalej 750 dm³ fermentor stanowi fermentor ze stali rafinowanej z firmy Alpha AG, Nidau, Szwajcaria.

P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie szczepu BCE 33/10 przez mutacje i selekcję

Stosowanym szczepem jest mutant BCE 33/10 (zdeponowany w Niemieckim Zbiorze Drobnoustrojów i Hodowli Komórek pod numerem OSM 11999 9 lutego 1998), który pochodzi ze szczepu Sorangium cellulosum Soce90, wytworzony na drodze mutacji i selekcji, jak to przedstawiono niżej. W ciekłym środowisku mutant BCE 33/10 tworzy laseczki typowe dla Sorangia z zaokrąglonymi końPL 196 787 B1 cami, o długości 3-6 μm oraz szerokości około 1 μm. Sorangium cellulosum Soce90 otrzymano z Niemieckiego Zbioru Drobnoustrojów pod numerem OSM 6773.

Wytwarzanie mutanta BCE 33/10 obejmuje trzy etapy mutacji z zastosowaniem światła nadfioletowego i selekcji poszczególnych kolonii. Sposób postępowania szczegółowo prowadzi się według następujących etapów operacyjnych.

Hodowla z ampułki ₃ komórki z ampułki OSM 6773 przenosi się do 10 cm³ pożywki G52 w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 cm³ i inkubuje przez 6 dni w 30°C w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę. 5 cm³ tej hodowli przenosi się do 50 cm³ pożywki G52 (w kolbie Erlenmeyera o pojemności ₃

200 cm³) i inkubuje przez 3 dni w 30°C w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę.

Pierwszy etap mutacji promieniowaniem nadfioletowym i selekcji

Porcje po 0,1 cm³ wyżej wymienionej hodowli nanosi się na kilka szalek Petriego, zawierających pożywkę agarową 842. Następnie każdą z tych płytek napromieniowuje się światłem nadfioletowym (maksymalny zakres promieniowania 250-300 nm) przez okres czasu od 90 do 120 sekund z natężeniem energii 500 μwat na cm². Potem płytki te inkubuje się przez 7-9 dni w 30°C, aż uzyska się poszczególne kolonie o rozmiarach 1-2 mm. Następnie z tych poszczególnych kolonii pobiera się kolonie zawierające 100-150 komórek z użyciem pętli z tworzywa sztucznego i nanosi na sektory szalek Petriego, zawierające agar 842 (4 sektory na płytkę) i inkubuje przez 7 dni w 30°C. Komórki, które zostały wyhodowane na powierzchni około 1 cm² agaru, przenosi się z użyciem pętli z tworzywa sztucznego do 10 cm³ pożywki G52 w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 cm³ i inkubuje przez 7 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C. 5 cm³ tej hodowli przenosi się do 50 cm³ pożywki G52 (w kolbie Erlenmeyera o pojemności 200 cm³) i inkubuje przez 3 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C. 10 cm³ tej pożywki przenosi się do 50 cm³ pożywki 23B3 i inkubuje przez 7 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C.

W celu oznaczenia ilości epotylonu A i epotylonu B wytworzonych w tej hodowli stosuje się następujący sposób postępowania. 50 cm³ roztworu hodowli przesącza się przez sito nylonowe (rozmiar porów 150 μm) i pozostałą na sicie polistyrenową żywicę Amberlit XA016 przemywa się małą ilością wody, a następnie umieszcza ją wraz z sączkiem w 50 cm³ probówce wirówkowej (Falcon Labware, Becton Dickinson AG Immengasse 7, 4056 Bazylea). Do tej probówki z sączkiem dodaje się 10 cm³izopropanolu (> 99%). Następnie dobrze uszczelnioną probówkę wstrząsa się przez 1 godzinę z prędkością 180 obrotów na minutę w celu rozpuszczenia epotylonów A i B, które są związane z żywicą w izopropanolu. Odwirowuje się potem 1,5 cm³ tej cieczy i około 0,8 cm³ roztworu znad osadu przenosi się pipetą do probówki HPLC. Analizę HPLC tych próbek wykonuje się tak, jak to opisano niżej pod tytułem „analiza HPLC” w części dotyczącej analizy produktu. Z pomocą analizy HPLC określa się, która hodowla wykazuje największa zawartość epotylonu B. Z wyżej opisanych płytek z sektorami odpowiednią kolonię komórek (płytki przechowuje się przez ten czas w 4°C) z około 1 cm³ powierzchni ₃ agaru przenosi się z użyciem pętli z tworzywa sztucznego do 10 cm³ pożywki G52 w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 cm³ i inkubuje przez 7 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C. 5 cm³ tej hodowli przenosi się do 50 cm³ pożywki G52 (w kolbie Erlenmeyera o pojemności 200 cm³) i inkubuje w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę przez 3 dni w 30°C.

Drugi i trzeci etap mutacji promieniowaniem nadfioletowym selekcji

Sposób postępowania jest dokładnie taki sam, jak przedstawiony wyżej dla pierwszego etapu mutacji promieniowaniem nadfioletowym, przy czym do drugiej mutagenezy wykorzystuje się wybraną hodowlę najlepszej kolonii z pierwszej mutacji promieniowaniem nadfioletowym. Odpowiednio w trzeciej mutagenezie stosuje się hodowlę najlepszej kolonii z drugiej mutagenezy. Najlepsza kolonia po tym trzecim cyklu etapowym mutacji promieniowaniem nadfioletowym, a następnie selekcja wytworzonych szczepów dla ulepszonego wytwarzania epotylonu B, odpowiada mutantowi BCE 33/10.

Konserwacja szczepu cm³ hodowli w wieku 3 dni w pożywce G52 (50 cm³ pożywki w kolbie Erlenmeyera o pojemności 200 cm, 30°C i 180 obrotów na minutę) przenosi się do 50 cm pożywki 23B3 (w kolbie Erlenmeyera o pojemności 200 cm³) i inkubuje się przez 3 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C. Pobiera się 1 cm³ porcje tej hodowli w możliwie jednorodnej postaci (przed każdym pobraniem hodowlę tę wstrząsa się ręcznie w kolbie Erlenmeyera) wraz z polistyreno10

PL 196 787 B1 wą żywicą Amberlit XAD16 (polistyrenowa żywica adsorpcyjna, Rohm & Haas, Frankfurt, Niemcy), następnie umieszcza w probówkach do zamrażania Nunc o pojemności 1,8 cm³ (A/S Nunc, OK 4000 Roslide, Dania) i przechowuje albo w -70°C, albo w ciekłym azocie.

Hodowlę szczepów z tych ampułek prowadzi się przez ich ogrzanie w powietrzu do pokojowej temperatury, a następnie przeniesienie całej zawartości z probówek do zamrażania do porcji po 10 cm³pożywki G52 w kolbach Erlenmeyera o pojemności 50 cm³ i inkubowanie przez 5-7 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C.

Pożywki Pożywka G52:

Ekstrakt drożdżowy o niskiej zawartości soli (Springer, Maison Alfort, Francja) 2 g/l

MgSO4 (7 H2O) 1 g/l

CaCl2 (2 H2O) 1 g/l

Odtłuszczona mąka sojowa (Mucedola S.r.l., Settimo Milan, Włochy) 2 g/l

Skrobia ziemniaczana Noredux (Blattmann, Wadenswil, Szwajcaria) 8 g/l

Bezwodna glukoza 2 g/l

Fe-EDTA 8 g/dm³ (produkt nr 03625, Fluka Chemie AG, Szwajcaria) wartość pH 7,4, regulowana z użyciem KOH 1 ml/l

Sterylizacja 20 minut, 120°C

Pożywka agarowa S42 jak opisana przez S. Jaoua In., Plasmid 28, 157-165 (1992)

Pożywka 23B3

Glukoza 2 g/l

Skrobia ziemniaczana Noredux (Blattmann, Wadenswil, Szwajcaria) 20 g/l

Odtłuszczona mąka sojowa (Mucedola S.r.l., Settimo Milan, Włochy) 16 g/l

Fe-EDTA (produkt nr 03625, Fluka, Buchs, Szwajcaria) 8 g/l

HEPES (Fluka, Buchs, Szwajcaria) 5 g/l

Polistyrenowa żywica XAD16 (Rohm and Haas) 2% obj.

H2O dejonizowana

Regulacja pH do wartości 7,8 z użyciem NaOH

Sterylizacja przez 20 minut w 120°C (HEPES - kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy) P r z y k ł a d 2. Hodowla w celu wytworzenia epotylonów Szczep: Sorangium cellulosum Soce-90 BCE 33/10 (przykład 1) Konserwacja szczepu: w ciekłym N2, jak w przykładzie 1.

Pożywki

Hodowle wstępne i pośrednie: G52 Hodowla główna: 1B12 Pożywka G52

MgSO4 (7 H2O) 1 g/l

CaCl2 (2 H2O) 1 g/l

Odtłuszczona mąka sojowa (Mucedola S.r.l., Settimo Milan, Włochy) 2 g/l

Skrobia ziemniaczana Noredux A-150 (Blattmann, Wadenswil, Szwajcaria) 8 g/l

Bezwodna glukoza 2 g/l

Sterylizacja: 20 minut, 120°C

Pożywka 1B12

Skrobia ziemniaczana Noredux A-150 (Blattmann, Wadenswil, Szwajcaria) 20 g/l

Odtłuszczona mąka sojowa (Lucas Meyer, Hamburg, Niemcy) 11 g/l

EDTA-Fe (III) sól Na 8 g/l

Regulacja pH do wartości 7,8 z użyciem NaOH

Sterylizacja przez 20 minut w 120°C

Dodawanie cyklodekstryn i pochodnych cyklodekstryn

Cyklodekstryny (Fluka, Buchs, Szwajcaria lub Wacker Chemie, Monachium, Niemcy) w różnych stężeniach sterylizuje się osobno i dodaje do pożywki 1B12 przed posiewem.

PL 196 787 B1

Hodowla cm³ zawiesiny Sorangium cellulosum Soce-90 BCE 33/10 przenosi się z ampułki przechowywanej w ciekłym N2 do 10 cm³ pożywki G52 (w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 cm³) i inkubuje przez 3 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C, z przesunięciem 25 mm. 5 cm³ tej hodowli dodaje się do 45 cm³ pożywki G52 (w kolbie Erlenmeyera o pojemności 200 cm³) i inkubuje przez 3 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C, z przesunięciem 25 mm. Następnie 50 cm³ tej hodowli dodaje się do 450 cm³ pożywki G52 (w kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 dm³) i inkubuje przez 3 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C, z przesunięciem 50 mm.

Hodowla utrzymywana

Hodowlę tę dodatkowo posiewa się co 3-4 dni przez dodanie 50 cm³ hodowli do 450 cm³ pożywki G52 (w kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 dm³). Wszystkie doświadczenia i fermentacje prowadzi się rozpoczynając od tej hodowli utrzymywanej.

Próby w kolbach (1) Wstępna hodowla w kolbach z mieszaniem.

Wychodząc z 500 cm³ hodowli utrzymywanej do 1 x 450 cm pożywki G52 posiewa się 50 cm³hodowli utrzymywanej i inkubuje przez 4 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C, z przesunięciem 50 mm.

(2) Główna hodowla w kolbach z mieszaniem.

cm³ pożywki 1B12 i 5 g/dm³ sproszkowanego kwasu 4-morfolinopropanosulfonowego (MOPS) (w kolbie Erlenmeyera o pojemności 200 cm³) miesza się z 5 cm³ dziesięciokrotnie zatężonego roztworu cyklodekstryny, posiewa do tego 10 cm³ hodowli wstępnej i inkubuje przez 5 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C, z przesunięciem 50 mm.

Fermentacja

Fermentacje prowadzi się w skalach 10 dm³, 100 dm³ i 500 dm³. Fermentacje 20 dm³ oraz 100 dm³ służą jako etapy hodowli pośredniej. Wstępne hodowle i hodowle pośrednie posiewa się jako 10% objętościowo hodowle utrzymywane, natomiast główne hodowle posiewa się jako 20% obj. hodowle pośrednie.

Ważna uwaga: w przeciwieństwie do hodowli z mieszaniem składniki pożywek do fermentacji oblicza się na końcową objętość hodowli włącznie z materiałem inokulacyjnym. Jeśli np. miesza się 18 dm³ pożywki i 2 dm³ materiału inokulacyjnego, to odważa się substancje na 20 cm ale miesza je tylko z 18 dm³.

Wstępna hodowla w kolbach z mieszaniem

Wychodząc z 500 cm³ hodowli utrzymywanej do 4 x 450 cm³ pożywki G52 (w kolbach Erlenmeyera o pojemności 2 dm³) do każdej porcji posiewa się 50 cm tej hodowli i inkubuje przez 4 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C, z przesunięciem 50 mm.

Hodowla pośrednia, 20 dm³ lub 100 dm³

3 3 dm³: do 18 dm³ pożywki G52 w fermentorze o całkowitej pojemności 30 dm³ posiewa się ₃ dm³ wstępnej hodowli. Hodowanie trwa 3-4 dni w następujących warunkach: 30°C, 250 obrotów na minutę, 0,5 dm³ powietrza na dm³ cieczy na minutę, nadciśnienie 0,5 bar, bez regulacji pH.

3 3

100 dm³: do 90 dm³ pożywki G52 w fermentorze o całkowitej pojemności 150 dm³ posiewa się 10 dm³ z 20 dm³ hodowli pośredniej. Hodowanie trwa 3-4 dni w następujących warunkach: 30°C, 150 obrotów na minutę, 0,5 dm³ powietrza na dm³ cieczy na minutę, nadciśnienie 0,5 bar, bez regulacji pH.

Główna hodowla, 10 dm³, 100 dm³ lub 500 dm³:

dm³: substancje pożywki liczone na 10 dm³ pożywki 1B12 sterylizuje się w 7 dm³ wody, a następnie dodaje się 1 dm³ sterylnego 10% roztworu 2-(hydroksypropylo)-(3-cyklodekstryny) i posiewa 2 dm³ z 20 dm³ hodowli pośredniej. Czas trwania głównej hodowli wynosi 6-7 dni w następujących warunkach: 30°C, 250 obrotów na minutę, 0,5 dm³ powietrza na dm³ cieczy na minutę, nadciśnienie 0,5 bar, regulacja pH z użyciem H2SO4 lub KOH do wartości pH 1,6 ± 1-0,5 (tj. nie ma regulacji między wartościami pH między 7,1oraz 8,1).

100 dm³: substancje pożywki liczone na 100 dm³ pożywki 1B12 sterylizuje się w 70 dm³ wody, a następnie dodaje się 10 dm³ sterylnego 10% roztworu 2-(hydroksypropylo)-e-cyklodekstryny (HP-β-CD) i posiewa 20 dm³ z 20 dm³ hodowli pośredniej. Czas trwania głównej hodowli wynosi 6-7 dni w następujących warunkach: 30°C, 200 obrotów na minutę, 0,5 dm³ powietrza na dm³ cieczy na minu12

PL 196 787 B1 tę, nadciśnienie 0,5 bar, regulacja pH z użyciem H2SO4 lub KOH do wartości pH 7,6 ± 0,5. Kolejność posiewów dla 100 dm³ fermentacji przedstawiono na następującym schemacie:

Hodowla utrzymywana (500 cm³)

500 dm³: substancje pożywki liczone na 500 dni³ pożywki 1B12 sterylizuje się w 350 dm³ wody, a następnie dodaje się 50 dm³ sterylnego 10% roztworu 2-(hydroksypropylo)-p-cyklodekstryny (HP-β-CO) i posiewa 100 dm³ z 100 dm³ hodowli pośredniej. Czas trwania głównej hodowli wynosi 6-7 dni w następujących warunkach: 30°C, 120 obrotów na minutę, 0,5 dm³ powietrza na dm³ cieczy na minutę, nadciśnienie 0,5 bar, regulacja pH z użyciem H2SO4 lub KOH do wartości pH 7,6 ± 0,5.

Analiza produktów

Przygotowywanie próbek

Próbki o objętości 50 cm³ miesza się z 2 cm³ polistyrenowej żywicy Amberlit XA016 (Rohm + Haas, Frankfurt, Niemcy) i wstrząsa z prędkością 180 obrotów na minutę przez jedną godzinę w 30°C. Następnie żywicę tę odsącza się z zastosowaniem nylonowego sita o porach 150 pm, przemywa małą ilością wody, a potem umieszcza wraz z sączkiem w probówce Nunc o pojemności 15 cm³.

Elucja produktu z żywicy ₃

Do probówki z sączkiem i żywicą dodaje się 10 cm³ izopropanolu (> 99%). Następnie szczelnie zamkniętą probówkę wstrząsa się przez 30 minut w pokojowej temperaturze w urządzeniu Rota-Mixer (Labinco BV, Holandia). Potem odwirowuje się 2 cm³ cieczy i roztwór znad osadu przenosi się pipetami do probówek HPLC.

Analiza HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa):

Kolumna: Waters-Symmetry C18, 100 x 4 mm, 3,5 pm WAT066220 + wstępna kolumna 3,9 x 20 mm WAT054225

Rozpuszczalniki:

A: 0,02% kwas fosforowy,

B: Acetonitryl (jakość HPLC)

Gradient: 41% B od 0 do 7 min,

100% B od 7,2 do 7,8 min,

41% B od 8 do 12 min

Temperatura pieca: 30°C

Wykrywanie: 250 nm, wykrywanie UV-DAD

Obj. wstrzykiwana: 0,01 cm³

Czas retencji: epotylon A : 4,30 min, epotylon B: 5,38 min

PL 196 787 B1

P r z y k ł a d 2A. Wpływ dodatku cyklodekstryny i pochodnych cyklodekstryny na uzyskiwane stężenia epotylonów

Wszystkie badane tutaj pochodne cyklodekstryn pochodzą z firmy Fluka, Suchs, Szwajcaria. Próby prowadzi się w kolbach o pojemności 200 cm³ z mieszaniem, stosując objętości hodowli 50 cm³. Jako kontrolne stosuje się kolby z adsorbującą żywicą Amberlit XAD16 (Rohm & Haas, Frankfurt, Niemcy) oraz bez dodatku jakiegokolwiek adsorbenta.

Po inkubacji trwającej 5 dni można oznaczyć metodą HPLC następujące stężenia epotylonów, podane w tabeli 1.

T a b e l a 1

Dodatek	Numer porządkowy	Stężenie [% stęż. wag.]¹	Epotylon A [mg/dm³]	Epotylon B [mg/dm³]
AmberlitXAD-16 (obj.)		2,0 (%obj.)	9,2	3,8
2-hydroksypropylo-p-cyklodekstryna	56332	0,1	2,7	1,7
2-hydroksypropylo-p-cyklodekstryna		0,5	4,7	3,3
2-hydroksypropylo-p-cyklodekstryna		1,0	4,7	3,4
2 -hydroksypropylo-p-cyklodekstryna		2,0	4,7	4,1
2-hydroksypropylo-p-cyklodekstryna		5,0	1,7	0,5
2-hydroksypropylo-p-cyklodekstryna	56330	0,5	1,2	1,2
2-hydroksypropylo-a-cyklodekstryna	II	1,0	1,2	1,2
2-hydroksypropylo-a-cyklodekstryna	II	5,0	2,5	2,3
p-cyklodekstryna	28707	0,1	1,6	1,3
p-cyklodekstryna	II	0,5	3,6	2,5
p-cyklodekstryna	II	1,0	4,8	3,7
p-cyklodekstryna	II	2,0	4,8	2,9
p-cyklodekstryna	II	5,0	1,1	0,4
metylo-p-cyklodekstryna	66292	0,5	0,8	0,3
metylo-p-cyklodekstryna	II	1,0	0,3	0,3
metylo-p-cyklodekstryna	II	2,0	< 0,3	0,3
2,6-di-o-metylo-p-cyklodekstryna	39915	1,0	0,3	0,3
2 -hydroksypropylo-y-cyklodekstryna	56334	0,1	0,3	0,3
2 -hydroksypropylo y-cyklodekstryna	II	0,5	0,9	0,8
2 -hydroksypropylo y-cyklodekstryna	II	1,0	1,1	0,7
2 -hydroksypropylo y-cyklodekstryna	II	2,0	2,6	0,7
2 -hydroksypropylo y-cyklodekstryna	II	5,0	5,0	1,1
bez dodatku			0,5	0,5

¹⁾ Oprócz przypadku Amberlitu (% obj.) wszystkie procenty oznaczają procenty stęż. wag.

Niektóre badane pochodne cyklodekstryny (2,6-di-o-metylo-e-cyklodekstryna, metylo-e-cyklodekstryna) w zastosowanych stężeniach nie wywierają wpływu lub wywierają negatywny wpływ na wytwarzanie epotylonów.

Natomiast 1-2% 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryna i β-cyklodekstryna podwyższają wytwarzanie epotylonów w tych przykładach 6 do 8 razy w porównaniu z ich wytwarzaniem bez użycia cyklodekstryn.

PL 196 787 B1

P r z y k ł a d 2B. Fermentacja w objętości 10 cm³ z użyciem 1% 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryny

Fermentację prowadzi się w fermentorach szklanych o pojemności 15 dm³. Pożywka zawiera 10 g/dm³ 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryny z firmy Wacker Chemie, Monachium, Niemcy.

Przebieg fermentacji ilustruje tabela 2. Fermentację kończy się po 6 dniach i prowadzi obróbkę.

T a b e l a 2

Przebieg fermentacji w objętości 10 dm³

Czas trwania hodowli [dni]	Epotylon A [mg/dm³]	Epotylon B [mg/dm³]
0	0	0
1	0	0
2	0,5	0,3
3	1,8	2,5
4	3,0	5,1
5	3,7	5,9
6	3,6	5,7

₃

P r z y k ł a d 2C. Fermentacja w objętości 100 dm z użyciem 1% 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryny

Fermentację prowadzi się w fermentorach o pojemności 150 dm³. Pożywka zawiera 10 g/dm³2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryny. Przebieg fermentacji ilustruje tabela 3. Produkty fermentacji zbiera się po 7 dniach i poddaje obróbce.

T a b e l a 3

Przebieg fermentacji w objętości 100 dm³

Czas trwania hodowli [dni]	Epotylon A [mg/dm³]	Epotylon B [mg/dm³]
0	0	0
1	0	0
2	0,3	0
3	0,9	1,1
4	1,5	2,3
5	1,6	3,3
6	1,8	3,7
7	1,8	3,5

₃

P r z y k ł a d 2D. Fermentacja w objętości 500 dm z użyciem 1% 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryny

Fermentację prowadzi się w fermentorach o pojemności 750 dm³. Pożywka zawiera 10 g/dm³2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryny. Przebieg fermentacji ilustruje tabela 4. Produkty fermentacji zbiera się po 7 dniach i poddaje obróbce.

T a b e l a 4

Przebieg fermentacji w objętości 500 dm³

Czas trwania hodowli [dni]	Epotylon A [mg/dm³]	Epotylon B [mg/dm³]
1	2	3
0	0	0

PL 196 787 B1 ciąg dalszy tabeli 4

1	2	3
1	0	0
2	0	0
3	0,6	0,6
4	1,7	2,2
5	3,1	4,5
6	3,1	5,1

₃

P r z y k ł a d 2E. Porównawczy przykład fermentacji w objętości 10 dm³ bez dodatku adsorbenta

Fermentację prowadzi się w fermentorach szklanych o pojemności 15 dm³. Pożywka nie zawiera żadnej cyklodekstryny ani innego adsorbenta. Przebieg fermentacji ilustruje tabela 5. Produktów fermentacji nie zbiera się i nie poddaje obróbce.

T a b e l a 5

Przebieg fermentacji w objętości 10 dm³ bez adsorbenta

Czas trwania hodowli [dni]	Epotylon A [mg/dm³]	Epotylon B [mg/dm³]
0	0	0
1	0	0
2	0	0
3	0	0
4	0,7	0,7
5	0,7	1,0
6	0,8	1,3

P r z y k ł a d 3. Obróbka epotylonów ₃

Wydzielanie z głównej hodowli o pojemności 500 dm³ ₃

Objętość produktu zebranego z głównej hodowli o pojemności 500 dm³ z przykładu 2D wynosi

450 dm³ i rozdziela się go z użyciem separatora klarującego Westfalia typ SA-20-06 (6500 obrotów na ₃ minutę) na fazę ciekłą (odciek z odwirowywania + woda przemywająca = 650 dm³) i fazę stałą (komórki, około 15 kg). Główna część epotylonów znajduje się w odcieku z odwirowywania. Odwirowana pulpa komórek zawiera < 15% oznaczanych epotylonów i nie poddaje się jej dalszej obróbce. Następnie 650 dm³ odcieku z odwirowywania umieszcza się w mieszalniku o pojemności 4000 dm³, miesza z 10 dm³ Amberlitu XAD-16 (stosunek objętości odcieku z odwirowywania do żywicy wynosi 65:1) i dalej prowadzi mieszanie. Po czasie kontaktu, wynoszącym około 2 godzin, żywicę odwirowuje się w wirówce przelewowej Heinego (pojemność kosza 40 dm³; 2800 obrotów na 31 minutę). Żywicę wyjmuje się z wirówki i przemywa 10-15 dm³ dejonizowanej wody.

Desorpcję prowadzi się przez dwukrotne wymieszanie żywicy w szklanym mieszalniku o pojemności 30 dm³, za każdym razem z porcjami po 30 dm³ izopropanolu przez 30 minut. Oddzielanie fazy izopropanolu od żywicy odbywa się (z użyciem filtra próżniowego. Następnie izopropanol usuwa się z połączonych faz izopropanolowych przed dodanie 15-20 dm³ wody w próżniowej wyparce cyrkulacyjnej (Schmidt-Verdampfer) i otrzymaną fazę wodną o objętości około 10 dm³ poddaje się trzykrotnie ekstrakcji, używając za każdym razem po 10 dm octanu etylowego. Ekstrakcje prowadzi się w szkla33 nych mieszalnikach o pojemności 30 dm³. Ekstrakt octanu etylowego zatęża się do 3-5 dm³ w próżniowej wyparce cyrkulacyjnej (Schmidt-Verdampfer), a następnie zatęża do sucha w wyparce obrotowej (typu Btichi) pod próżnią. Uzyskuje się 50,2 g ekstraktu octanu etylowego. Ten ekstrakt octanu etylowego rozpuszcza się w 500 cm³ metanolu, odsącza części nierozpuszczalne z użyciem sączka karbowanego i podaje roztwór na kolumnę zawierającą 10 kg Sephadex LH 20 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) (średnica kolumny 20 cm, wysokość wypełnienia około 1,2 m). Elucję prowadzi się z użyciem metanolu jako eluenta. Epotylony A i B występują głównie we frakcjach 21-23 (przy wielkości

PL 196 787 B1 frakcji 1 dm³). Frakcje te zatęża się do sucha w próżni w wyparce obrotowej (całkowita masa 9,0 g). Te szczytowe frakcje Sephadexu (9,0 g) rozpuszcza się następnie w 92 cm³ mieszaniny acetonitryl:woda:chlorek metylenu = 50:40:2, przesącza roztwór przez sączek karbowany i podaje na kolumnę RP (urządzenie Prepbar 200, Merck; 2,0 kg LiChrospher RP-18 Merck, wymiary ziaren 12 pm, średnica kolumny 10 cm, poziom wypełnienia 42 cm; Merck, Darmstadt, Niemcy).

Elucję prowadzi się mieszaniną acetonitryl:woda - 3:7 (natężenie przepływu 500 cm³/min; czas retencji epotylonu A około 51-59 min; czas retencji epotylonu B około 60-69 min). Frakcjonowanie kontroluje się detektorem promieniowania nadfioletowego przy 250 nm. Frakcje zatęża się do sucha pod próżnią w wyparce obrotowej Btichi-Rotavapor. Masa frakcji z piku epotylonu A wynosi 700 mg i według HPLC (z wzorcem zewnętrznym) zawiera ona 75,1% tej substancji. Masa frakcji 32 z piku epotylonu B wynosi 1980 mg, a zawartość tej substancji według HPLC (z wzorcem zewnętrznym) wynosi 86,6%. Na końcu, frakcję epotylonu A (700 mg) krystalizuje się z 5 cm³ mieszaniny octan etylowy:toluen = 2:3 i uzyskuje się 170 mg czystego, krystalicznego epotylonu A [o zawartości według HPLC (% powierzchni), wynoszącej 94,3%].

Krystalizację frakcji epotylonu B (1980 mg) prowadzi się z 18 cm³ metanolu, uzyskując 1440 mg czystego, krystalicznego epotylonu B [o zawartości według HPLC (% powierzchni), wynoszącej 99,2%]. Temperatura topnienia epotylonu B: np. 124-125°C; dane ¹H-NMR dla epotylonu B: 500 MHz-NMR, rozpuszczalnik: DMSO-d6. Chemiczne przesunięcia (5 w ppm w stosunku do TMS. s - singlet; d - dublet;

m - multiplet.

δ multipletowość Liczba całkowita (liczba H)

7,34 (s) 1

6,50 (s) 1

5,28 (d) 1

5.08 (d) 1

4,46 (d) 1

4,08 (m) 1

3,11 (m) 1

2.83 (dd) 1

2,64 (s) 3

2,36 (m) 2

2.09 (s) 3

2,04 (m) 1

1.83 (m) 1

1,61 (m) 1

1,47-1,24 (m) 4

1,18 (s) 6

1,13 (m) 2

1,06 (d) 3

0,89 (d + s, zachodzenie na siebie) 6

Σ = 41

W tym przykładzie (przykład 3) epotylon B uzyskuje się w krystalicznej odmianie A, która charakteryzuje się dyfraktogramem rentgenowskim odmiany A.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób zatężania epotylonów w pożywkach hodowlanych w celu biotechnologicznego wytwarzania tych związków, znamienny tym, że wykorzystuje drobnoustroje, które wytwarzają te związki, przy czym do pożywek dodaje się co najmniej jedną cyklodekstrynę jako składnik kompleksotwórczy, przy czym co najmniej jedna cyklodekstryna wybrana jest z grupy obejmującej α-cyklodekstrynę, β-cyklodekstrynę, γ-cyklodeksrrynę, δ-cyklodekstrynę, ε-cyklodekstrynę, Z-cyklodekstrynę, η-cyklodekstrynę oraz θ-cyklodekstrynę albo grupy pochodnych cyklodekstryny obejmującej:

cyklodekstryny, w których co najmniej jedna albo wszystkie grupy hydroksylowe są eteryfikowane do eterów alkilowych, eterów arylohydroksyalkilowych; eterów hydroksyalkilowych; eterów karboksyalkilowych; pochodnych niższych eterów karboksylalkilowych, w których grupa karboksylowa oznaPL 196 787 B1 cza aminokarbonyl, mono- lub di-niższy-alkiloaminokarbonyl, morfolino-, piperydyno, pirolidyno- lub piperazynokarbonyl, albo alkoksykarbonyl; eterów sulfoalkilowych; albo cyklodekstryn, w których co najmniej jedna grupa OH jest eteryfikowana rodnikiem o ogólnym wzorze -O-[alk-O-]n-H, w którym alk oznacza alkil, zaś n oznacza, liczbę całkowitą od 2 do 12 włącznie; albo cyklodekstryn, w których co najmniej jedna grupa OH jest eteryfikowana rodnikiem o ogólnym wzorze:

R' (Alk-O)m—Alk w których R' oznacza wodór, hydroksyl, albo -O-(alk-O)2-H, -; alk we wszystkich przypadkach oznacza alkil; m, n oraz z oznaczają liczby całkowite od 1 do 12; zaś Y oznacza OR1 lub NR2R3, gdzie R1, R2 oraz R3 niezależnie od siebie oznaczają wodór lub niższy alkil, albo R2 oraz R3, połączone wiążącym je azotem, oznaczają grupę morfolinową, piperydynową, pirolidynową lub piperazynową; albo rozgałęzionych cyklodekstryn, w których występują eteryfikacje lub acetale z cząsteczkami innych cukrów, wybranych spośród glukozylo-, diglukozylo-(G₂-e-cyklodekstryn), maltozylo- i dimaltozylocyklodekstryn albo N-acetyloglukozaminylo-, glukozaminylo-, N-acetylogalaktozaminylo- i galaktozaminylodekstryn; oraz niższy-alkanoilo-cyklodekstryn, takich jak acetylowe estry cyklodekstryn; albo mieszanin dwóch lub więcej wymienionych cyklodekstryn i/lub pochodnych cyklodekstryn, przy czym, przedrostek „niższy” wskazuje, że rodnik zawiera maksymalnie do 7 atomów węgla.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako producentów naturalnych substancji wykorzystuje się miksobakterie.
3. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że pożywka zawiera szczepy Sorangium nadające się do wytwarzania epotylonów, wodę i inne odpowiednie zwykle stosowane składniki pożywek hodowlanych.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że cyklodekstryny i/lub pochodne cyklodekstryn dodaje się do pożywek hodowlanych w ilości od 0,05 do 10% (stężenie wagowe).
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że cyklodekstryny i/lub pochodne cyklodekstryn dodaje się w nim w ilości od 0,1 do 2% (stężenie wagowe).
6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że pochodne cyklodekstryn wybiera się spośród cyklodekstryn i hydroksy-niższych-alkilocyklodekstryn, albo mieszanin jednej lub większej ich liczby, przy czym przedrostek „niższy” oznacza, że rodnik zawiera maksymalnie do 7 atomów węgla
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako składnik kompleksotwórczy stosuje się 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę.
8. Pożywki hodowlane, znamienne tym, że zawierają co najmniej jedną cyklodekstrynę określoną w zastrz. 1 oraz drobnoustroje odpowiednie do wytwarzania epotylonów.
9. Pożywki hodowlane według zastrz. 9, znamienne tym, że jako drobnoustroje zawierają miksobakterie.
10. Sposób wytwarzania epotylonów, znamienny tym, że epotylony wytwarza się przez obróbkę pożywek hodowlanych, przeznaczonych do biotechnologicznego wytwarzania tych związków, zawierających drobnoustroje, które nadają się do wytwarzania epotylonów, korzystnie miksobakterie, jako producentów naturalnych substancji, do których to pożywek dodaje się co najmniej jedną cyklodekstrynę, określoną w zastrz. 1, a następnie oczyszcza się i w razie potrzeby rozdziela uzyskane epotylony.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, stosuje się pożywki hodowlane zawierające miksobakterie rodzaju Sorangium, przy czym pożywki rozdziela się na fazę stałą i na fazę ciekłą odciek przez odwirowywanie, odciek miesza się z żywicą lub przepuszcza przez kolumnę wypełnioną taką żywicą, w razie potrzeby żywicę przemywa się wodą, epotylon lub epotylony desorbuje się z żywicy polarnym rozpuszczalnikiem, dodaje się organiczny rozpuszczalnik, który nie miesza się z wodą, przenosi się epotylon lub epotylony do fazy organicznej, po czym uzyskane z fazy organicznej epotylony zatęża się na sitach molekularnych o niskich masach cząsteczkowych; a następnie frakcje zawierające epotylony rozdziela się w kolumnach z układem odwróconych faz, przy czym wytwarza się oddzielnie epotylony A i B, a w razie potrzeby można je dalej zatężać przez rekrystalizację.

PL 196 787 B1
12. Sposób wytwarzania epotylonów, w którym zatęża się epotylony w pożywkach hodowlanych, przeznaczonych do biotechnologicznego wytwarzania tych związków, zawierających drobnoustroje nadające się do wytwarzania tych związków, wodę i inne odpowiednie zwykłe składniki pożywek hodowlanych, przy czym do tych pożywek hodowlanych dodaje się cyklodekstryny lub pochodne cyklodekstryn, albo mieszaniny dwóch lub większej liczby tych związków; który to sposób obejmuje etap rozdzielania epotylonów, znamienny tym, że stosuje się rozdzielanie chromatograficzne na kolumnie w układzie odwróconych faz z użyciem eluentów, zawierających niższe cyjanki alkilowe, przy czym rozdzielanie chromatograficzne prowadzi się na materiale kolumny zawierającym łańcuchy węglowodorowe, a eluenty zawierają niższe nitryle alkilowe.