PL199545B1 - Zastosowanie glikoproteiny D HSV lub jej immunologicznego fragmentu i adiuwantu - Google Patents

Abstract

Opisano sposób podawania szczepionki kobietom dla zapobiegania lub leczenia zaka ze n zwi a- zanych z patogenami wywo luj acymi choroby przenoszone drog a p lciow a. Szczepionka zawiera jeden lub wi ecej ni z jeden antygen dla zapobiegania lub leczenia chorób przenoszonych drog a p lciow a, na przyk lad glikoprotein e D HSV lub jej immunologiczny fragment i adjuwant, zw laszcza adjuwant induku- j acy TH-1. Opisano te z stosowanie sk ladników szczepionki do formulowania kompozycji szczepionki dla zapobiegania lub leczenia chorób przenoszonych drog a p lciow a u kobiet. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie glikoproteiny D HSV lub jej immunologicznego fragmentu i adiuwantu.

Wynalazek dotyczy zastosowania jednego lub więcej niż jednego antygenu do zapobiegania lub leczenia chorób przenoszonych drogą płciową przez wytwarzanie preparatu szczepionki do podawania kobietom w celu zapobiegania lub leczenia zakażeń związanych z patogenami, które wywołują choroby przenoszone drogą płciową. Patogeny, które wywołują choroby przenoszone drogą płciową (sexually transmitted diseases - STD) są znane i występuje pilna potrzeba stworzenia skutecznych szczepionek do leczenia lub zapobiegania takim stanom.

Czasami choroby przenoszone drogą płciową są wywoływane przez jeden lub więcej niż jeden patogen. Szczepionki skojarzone zdolne do zapobiegania i/lub leczenia jednej lub więcej niż jednej z STD są zatem również potrzebne.

Stwierdzono, że pewne preparaty szczepionek są nieoczekiwanie skuteczne w zapobieganiu lub leczeniu chorób STD u kobiet, które są podatne lub cierpią na takie choroby STD.

Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania glikoproteiny D HSV lub jej immunologicznego fragmentu i adiuwantu do wytwarzania szczepionki do podawania kobietom HSV1-/-2 w celu zapobiegania opryszczce narządów płciowych.

Korzystnie adiuwantem jest adiuwant indukujący TH-1, korzystniej 3D-MPL.

Korzystnie glikoproteina D HSV jest glikoproteiną skróconą bardziej korzystnie pozbawioną C-końcowego regionu kotwiczącego (gD2t).

Korzystnie szczepionka ponadto obejmuje antygen pochodzący z HPV i w takiej szczepionce korzystnym adiuwantem indukującym TH-1 jest 3D-MPL.

Korzystnie w szczepionce wytwarzanej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku antygen lub kombinacja antygenów jest formułowana z odpowiednim nośnikiem korzystnie z wodorotlenkiem glinu (alum), fosforanem glinu albo emulsją olej w wodzie.

Korzystnie w szczepionce wytwarzanej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku cząstki

3D-MPL są wystarczająco małe do sterylnej filtracji przez membranę 0,22 μm.

Korzystnie preparat szczepionki zawiera gD2t (1-1000 pg), 3D-MPL (10-200 pg) i sól glinu (100-1000 pg).

Bardziej korzystny preparat szczepionki zawiera gD2t (20 pg), 3D-MPL (50 pg) i alum (500 pg).

Korzystny preparat szczepionki wytwarzany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku przeznaczony jest do podawania kobietom w odstępach 0, 1 i 6 miesięcy.

Korzystny preparat szczepionki jest wytwarzany do podawania domięśniowego.

Przykłady antygenów pochodzących z lub związanych z patogenem wywołującym choroby STD obejmują antygeny pochodzące z lub związane z wirusami opryszczki (HSV-1 i HSV-2), wirusami brodawczaka ludzkiego (HPV - wszystkie rodzaje), Chlamydia trachomatis, Neiserria gonnorhea, Treponema pallidum (syfilis) i Haemophilus ducreyi (wrzód weneryczny).

Można korzystać też z innych źródeł antygenów obejmujących rekombinowane bakterie, rekombinowane wirusy, białka fuzyjne, peptydy i mimotopy.

Powyższa lista nie jest wyczerpująca i inne patogeny są dobrze znane praktykującym lekarzom oraz innym specjalistom w tej dziedzinie i są wymienione w standardowych publikacjach książkowych.

Adiuwanty odpowiednie do stosowania w wynalazku obejmują adiuwanty, które są dobrze znane w dziedzinie formułowania szczepionek. „Adiuwant indukujący TH-1” oznacza adiuwant, który jest preferencyjnym stymulatorem odpowiedzi komórki TH1.

Rozpoznawalnym sygnałem, że odpowiedź TH1 została zastymulowana, jest zwiększenie wytwarzania cytokin typu TH1, na przykład IFN-γ i IL-2. Sekrecja IFN-γ jest związana z ochronnymi odpowiedziami na pozakomórkowe patogeny, włączając w to pasożyty, bakterie i wirusy. Aktywacja leukocytów przez IFN-γ zwiększa zabijanie pozakomórkowych patogenów i zwiększa ekspresję receptorów Fc. Może wystąpić również bezpośrednia cytotoksyczność, zwłaszcza w synergistycznym współdziałaniu z limfotoksyną (inny produkt limfocytów TH-1). INF-γ jest zarówno induktorem jak i produktem komórek NK, które są głównymi wrodzonymi efektorami ochronnymi. Odpowiedzi typu TH-1 zarówno przez IFN-γ jak i w innych mechanizmach, dostarczają preferencyjnej pomocy imunoglobinowym izotypom mysiej IgG2a.

Przeciwnie, odpowiedzi typu TH-2 są związane z mechanizmami humoralnymi i sekrecją IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 i czynnikiem martwicy nowotworu beta.

PL 199 545 B1

Adiuwanty, które są zdolne do preferencyjnego stymulowania odpowiedzi limfocytów TH-1 opisano w międzynarodowych zgłoszeniach patentowych WO 94/00153 i WO 95/17209.

3-de-O-acylowany monofosforylolipid A (3D-MPL) jest takim adiuwantem. Jest on znany z patentu GB-2220211 (Ribi). Chemicznie jest on mieszaniną 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A z 4, 5 lub 6 acylowanymi ła ń cuchami i jest wytwarzany przez Ribi Immunochem Montana. Korzystne „małe cząstki” 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A ujawniono w patencie EP-0689454B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA).

Takie „małe cząstki” 3-DMPL są wystarczająco małe, aby mogły być sterylnie filtrowane przez membranę 0,22 μm (jak opisano w patencie EP-0689454).

Innym korzystnym adiuwantem, który może być zastosowany w niniejszym wynalazku jest QS21, oczyszczona metodą HPLC nietoksyczna frakcja pochodząca z kory Quillaja Saponaria Molina. Nietoksyczna frakcja może być ewentualnie zmieszana z 3-de-O-acylowanym monofosforylolipidem A (3D-MPL), ewentualnie razem z nośnikiem.

Sposób wytwarzania QS21 ujawniono (jako QS21) w patencie US nr 5,057,540 i jest on dostępny z firmy Aquilla Pharmaceuticals.

Niereaktogenne preparaty adiuwanta zawierające QS21 zostały wcześniej opisane (WO 96/33739). Wykazano, że takie preparaty zawierające QS21 i cholesterol, gdy są sformułowane razem z antygenem, są skutecznymi adiuwantami stymulującymi TH1. Zatem szczepionki wytworzone zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, mogą zawierać kombinację QS21 i cholesterolu.

Inne adiuwanty, które są preferencyjnymi stymulatorami odpowiedzi limfocytów TH-1 obejmują immunomodulatoryjne oligonukleotydy, na przykład niemetylowane sekwencje CpG, jak ujawnione w WO 96/02555.

Jako adiuwant, który jest preferencyjnym stymulatorem odpowiedzi Th-1 jest rozważana kombinacja różnych adiuwantów stymulujących TH-1, takie jak wyżej wspomniane. Na przykład QS21 może być formułowany razem z 3D-MPL. Stosunek QS21:3D-MPL zazwyczaj jest w zakresie 1:10 do 10:1, korzystnie 1:5 do 5:1, a często zasadniczo 1:1. Korzystnym zakresem 3D-MPL:QS21 dla optymalnego synergizmu jest od 2,5:1 do 1:1.

Korzystnie w kompozycjach szczepionki wytwarzanej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku występuje również nośnik. Nośnik może być emulsją olej w wodzie lub solą glinu. Inne sole mineralne również mogą być zastosowane jako nośnik, takie jak sole wapnia, żelaza lub cynku. Inne nośniki obejmują polifosfazynę, liposomy i ISCOMS.

Nietoksyczne emulsje olej w wodzie korzystnie zawierają nietoksyczny olej, na przykład skwalan lub skwalen, emulgator, na przykład Tween 80, w nośniku wodnym. Nośnikiem wodnym może być na przykład solanka buforowana fosforanem. Korzystna emulsja olej w wodzie zawiera ulegający metabolizmowi olej, taki jak skwalen, alfa-tokoferol i Tween 80. Ponadto emulsja olej w wodzie może zawierać Span 85 i/lub lecytynę.

Typowo do podawania ludziom QS21 i 3D-MPL występują w szczepionce w zakresie 1 μg - 500 μg, tak jak 10 - 100 μg, korzystnie 10 μg - 50 μg na dawkę. Typowo emulsja olej w wodzie zawiera od 2 do 10% skwalenu, od 2 do 10% alfa-tokoferolu i od 0,3 do 3% Tween 80. Korzystnie stosunek skwalen:alfa-tokoferol jest równy lub mniejszy niż 1, ponieważ taki stosunek daje bardziej stabilną emulsję. Span 85 również może występować na poziomie 1%. W niektórych przypadkach może być korzystne, aby szczepionki wytwarzane zgodnie z zastosowaniem według wynalazku ponadto zawierały stabilizator.

Szczególnie odpowiednie preparaty adiuwanta zawierające QS21, 3D-MPL i tokoferol w emulsji olej w wodzie opisano w publikacji WO 95/17210.

W korzystnym wykonaniu wodorotlenek glinu (alum) lub fosforan glinu jest włączany do kompozycji szczepionki wytwarzanej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku.

W szczególnie korzystnym aspekcie antygeny w kompozycji szczepionki wytwarzanej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, są połączone z 3D-MPL i alumem.

Szczepionki wytwarzane zgodnie z zastosowanem według wynalazku mogą, jeżeli to konieczne, zawierać cząsteczki adiuwanta o wzorze ogólnym (I):

HO(CH2CH2O)n-A-R gdzie n oznacza 1-50, A oznacza wiązanie lub -C(O)-, R oznacza C1-50 alkil lub fenylo-C1-50 alkil.

W jednym z wykonań preparat szczepionki wytwarzanej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku zawiera eter polioksyetylenowy o wzorze ogólnym (I), gdzie n oznacza 1-50, korzystnie 4-24, najbardziej korzystnie 9; składnik R oznacza C1-50 korzystnie C4-C20 alkil, a najbardziej korzystnie C12 alkil,

PL 199 545 B1

A oznacza wiązanie. Stężenie eterów polioksyetylenowych powinno mieścić się w zakresie 0,1-20%, korzystnie 0,1-10%, a najbardziej korzystnie w zakresie 0,1-1%. Korzystnie etery polioksyetylenowe są wybrane z następującej grupy: eter polioksyetylenowo-9-laurylowy, eter polioksyetylenowo-9-stearylowy, eter polioksyetylenowo-8-stearylowy, eter polioksyetylenowo-4-laurylowy, eter polioksyetylenowo-35-laurylowy i eter polioksyetylenowo-23-laurylowy. Etery polioksyetylenowe, takie jak eter polioksyetylenowolaurylowy, są opisane w Merck Index (wydanie 12, początek 7717).

HSV-2 jest głównym etiologicznym czynnikiem opryszczki narządów płciowych. HSV-1 jest czynnikiem wywołującym opryszczkę wargową. Wirusy te charakteryzują się zdolnością do wywoływania zarówno ostrych chorób jak i wywoływania utajonych zakażeń, głównie w neuronowych komórkach zwoju nerwowego.

W publikacji WO 92/16231 dostarczono dalszych podstawowych informacji o opryszczce narządów płciowych i opisano szczepionkę, która może być stosowana do leczenia ludzi podatnych na zakażenia HSV, zawierającą glikoproteinę D HSV lub jej immunologiczny fragment w połączeniu z 3-O-deacylowanym monofosforylolipidem A i odpowiednim nośnikiem.

W opisie WO 92/16231 przedstawiono szczegół owe glikoproteiny D, jej immunologiczne fragmenty i 3-DMPL oraz sposoby ich otrzymania. W opisie podano pewne obiecujące testy szczepionekkandydatów na modelach zwierzęcych, ale nie podano danych dotyczących ludzi.

Szczepionka wytwarzana zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku zawiera glikoproteinę D lub jej immunologiczny fragment, który zazwyczaj pochodzi z HSV-2.

Glikoproteina D jest umiejscowiona na błonie wirusowej, a także występuje w cytoplazmie zainfekowanych komórek (Eisenberg R.J. i in., J. of Virol. 1980 35 428-435). Obejmuje ona 393 aminokwasy, w tym, sygnalne białko i ma masę cząsteczkową w przybliżeniu 60 kD. Ze wszystkich otoczkowych glikoprotein HSV glikoproteina D jest prawdopodobnie najlepiej scharakteryzowana (Cohen i in., J. Virology 60 157-166). Na podstawie badań in vivo wiadomo, że odgrywa ona główną rolę w przyłączaniu do błon komórek. Ponadto, wykazano, że glikoproteina D jest zdolna do wywoływania neutralizujących przeciwciał in vivo (Eing i in., Med. Virology 127: 59-65). Jednak utajone wirusy HSV-2 mogą być wciąż reaktywowane i wywołują nawrót choroby pomimo obecności wysoko neutralizującego miana przeciwciał w surowicy pacjentów.

Jak opisano w WO 92/16231, korzystną postacią jest skrócona glikoproteina D HSV-2 o 308 aminokwasach, która zawiera aminokwasy od 1 do 306 naturalnie występującej glikoproteiny z dodatkiem asparaginy i glutaminy na C-terminalnym końcu skróconego białka pozbawionego błonowego regionu kotwiczącego. Ta postać białka obejmuje białko sygnalne, które jest odcinane dając dojrzałe 283 aminokwasowe białko. Wytwarzanie takiego białka w komórkach jajnika chomika chińskiego zostało opisane w publikacji patentowej EP-B-139417.

Dojrzałe skrócone białko korzystnie stosowane w preparatach szczepionki wytwarzanej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku może być oznaczane jako rekombinantowe gD2t (rgD2t) lub po prostu (jak stosowano poniżej) gD2t.

Antygen HSV może być chemicznie lub inaczej skoniugowany z rozdrobnionym nośnikiem, jak opisano w WO 92/16231.

W korzystnym wykonaniu szczepionka wytwarzana zgodnie z zastosowaniem wedł ug wynalazku gD2t, 3-DMPL (zwłaszcza małe cząstki 3-DMPL) i wodorotlenek glinu (alum).

Wirusy brodawczaka ludzkiego (papillomawirusy) są nowotworowymi wirusami o małym DNA, które są wysoce specyficzne gatunkowo. Jak dotąd opisano ponad 70 poszczególnych genotypów wirusów brodawczaka ludzkiego (HPV). HPV są na ogół specyficzne zarówno wobec skóry (na przykład HPV-1 i -2) jak i powierzchni śluzówkowych (na przykład HPV-6 i -11) i zazwyczaj powodują łagodne nowotwory (brodawki), które utrzymują się przez kilka miesięcy lub lat. Takie łagodne nowotwory mogą być stresujące dla osób nimi dotkniętych, ale nie zagrażają życiu, z kilkoma wyjątkami.

Pewne HPV są również związane z rakami. Najsilniejszym niebudzącym wątpliwości powiązaniem między HPV a ludzkim rakiem jest to, które występuje między HPV-16 i HPV-18 i rakiem szyjki macicy. Rak szyjki macicy jest najpowszechniejszym nowotworem złośliwym w krajach rozwijających się, którego około 500000 nowych przypadków występuje na świecie każdego roku. Aktywne zwalczanie najważniejszych zakażeń HPV-16, a nawet ustalonych raków zawierających HPV-16, jest technicznie wykonalne za pomocą szczepionek. W celu dokonania przeglądu perspektyw profilaktycznych i terapeutycznych szczepień przeciwko HPV-16 patrz Cason J. Clin. Immunother. 1994; 1(4) 293-306 i Hagenesee M.E., Infections in Medicine 1997 14(7) 555-556, 559-564. Obecnie różne typy HPV zostały wyizolowane i opisane za pomocą systemów klonowania w bakteriach, a ostatnio przez amplifikację PCR.

PL 199 545 B1

Organizacja cząsteczkowa genomów HPV została określona na podstawie porównania z dobrze scharakteryzowanym bydlęcym wirusem brodawczaka typu 1 (BPV1).

Chociaż występują odmiany o mniejszym znaczeniu, to wszystkie opisane genomy HPV mają co najmniej siedem wczesnych genów, E1 do E7 i dwa późne geny L1 i L2. Ponadto region regulatorowy powyżej niesie sekwencje regulatorowe, które wydają się kontrolować najbardziej transkrypcyjne wydarzenia genomu HPV.

Geny E1 i E2 są zaangażowane odpowiednio, w replikację wirusów i kontrolę transkrypcyjną i czę sto są rozrywane przez integrację wirusową . E6 i E7, a ostatnie dane pokazują , ż e również E5, są zaangażowane w transformację wirusa.

W HPV związanych z rakiem szyjki macicy, takich jak HPV 16 i 18, proces onkogenny rozpoczyna się po integracji DNA wirusa. Integracja powoduje inaktywację genów kodujących kapsydowe białka L1 i L2 i ciągłe instalowanie nadekspresji dwóch wczesnych białek E6 i E7, co prowadzi do stopniowej utraty prawidłowego różnicowania komórkowego i rozwoju raka.

Rak szyjki macicy jest powszechny u kobiet i rozwija się przez pośredni stan przedrakowy do raka inwazyjnego, który często prowadzi do śmierci. Stany pośrednie choroby są znane jako śródnabłonkowe powstawanie nowotworu szyjki macicy i są stopniowane od I do III zgodnie ze zwiększającym się nasileniem.

Klinicznie zakażenia HPV żeńskich dróg odbytowo-płciowych manifestują się jako szyjkowa kłykcina płaska, której cechą jest to, że koilocytoza oddziaływuje głównie na komórki powierzchniowe i pośrednie szyjkowego łuskowatego nabłonka.

Koilocyty, które są konsekwencją efektu cytopatycznego wirusa, występują jako wielojądrzaste komórki z okołojądrową przezroczystą obwódką. Nabłonek jest pogrubiony przez nienormalną keratynizację odpowiedzialną za brodawkowaty wygląd zmian chorobowych.

Takie kłykciny płaskie, gdy są dodatnie dla serotypów HPV 16 lub 18, są czynnikami wysokiego ryzyka rozwoju w kierunku wewnątrznabłonkowej neoplazji szyjki macicy (cervical intraepithelial neoplasia - CIN) i raka in situ (CIS), które są uważane za prekursory zmian chorobowych inwazyjnego raka szyjki macicy.

W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 96/19496 ujawniono odmiany białek wirusa ludzkiego brodawczaka, zwłaszcza białka fuzyjne E6/E7 z delecją w obu białkach E6 i E7. Te delecyjne białka fuzyjne uważa się za immunogenne.

Szczepionki na bazie L1 HPV ujawniono w publikacjach WO 94/00152, WO 94/20137, WO 93/02184 i WO 94/05792. Takie szczepionki mogą zawierać antygen L1 jako monomer, kapsomer lub czą stkę podobną do wirusa. Takie cząstki mogą ponadto zawierać białka L2. Inne szczepionki HPV są oparte na wczesnych białkach, takich jak E7 lub białkach fuzyjnych, takich L2-E7.

Szczepionki skojarzone wytworzone zgodnie z zastosowaniem według wynalazku zawierają immunochronną ilość antygenów i mogą być wytwarzane i podawane konwencjonalnymi technikami.

Wytwarzanie szczepionek jest generalnie opisane w publikacji New Trends and Developments in Vaccines, wydanej przez Voller i in., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Kapsułkowanie w liposomach opisał, na przykład Fullerton, w patencie US 4235877. Koniugację protein z makrocząsteczkami ujawnił, na przykład Likhite, w patencie US-4372945 i Armor i in., w patencie US-4474757.

Ilość antygenu w każdej dawce szczepionki jest wybrana jako ilość, która wzbudza immunoochronną lub terapeutyczną odpowiedź bez istotnych szkodliwych działań ubocznych w typowych szczepionkach. Taka ilość zmienia się w zależności od tego, jaki specyficzny immunogen został zastosowany. Na ogół oczekuje się, że każda dawka będzie zawierała 1-1000 μg białka, korzystnie 2-100 μg, najbardziej korzystnie 4-40 μg. Optymalną ilość dla poszczególnej szczepionki można określić przez standardowe badania obejmujące obserwację mian przeciwciał i inne odpowiedzi osobników. Po około 4 tygodniach po pierwszym szczepieniu osobnicy mogą otrzymać dawkę przypominającą po.

Ilość antygenu w każdej dawce szczepionki jest ilością, która wywołuje skuteczną immunoochronną lub terapeutyczną odpowiedź bez istotnych szkodliwych działań ubocznych w typowych szczepionkach dla kobiet.

Na ogół oczekuje się, że każda dawka będzie zawierała 1-1000 μg antygenu, korzystnie 2-100 μg, najbardziej korzystnie 4-40 g. Adiuwant wzbudzający TH-1, na przykład 3-DMPL, zazwyczaj będzie obecny w zakresie 10-200 μq, korzystnie 25-74 μg, zwłaszcza około 50 μg na dawkę.

PL 199 545 B1

Ilość nośnika może się zmieniać i może być wybrana zgodnie z wiedzą specjalisty w tej dziedzinie. Jeżeli wodorotlenek glinu (alum) lub fosforan glinu stosowany, jego ilość generalnie będzie mieściła się w zakresie 100-1000 μg, na przykład 250-750 μg, korzystnie około 500 μg na dawkę szczepionki.

W korzystnym wykonaniu szczepionka wytwarzana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku zawiera gD2t, 3-DMPL (zwłaszcza małe cząstki 3-DMPL) i wodorotlenek glinu (alum).

W korzystnym reżimie szczepionka może być podawana w odstępach 0, 1 i 6 miesięcy. Mogą być również stosowane inne reżimy dawkowania, w tym dawki przypominające. Szczepionka może być podawana domięśniowo.

Wytwarzanie szczepionki zgodnie z zastosowaniem według wynalazku może być prowadzone konwencjonalnymi technikami, takimi jak opisane w publikacji patentowej WO 92/16231. Sposób zazwyczaj obejmuje mieszanie jednego lub więcej antygenu pochodzącego z lub związanego z HSV i ewentualnie HPV z adiuwantem, zwłaszcza adiuwantem wzbudzającym TH-1, i ewentualnie nośnikiem jak opisane powyżej. Otrzymana kompozycja szczepionki może podawana kobietom, zwłaszcza kobietom aktywnym seksualnie cierpiącym na lub z ryzykiem nabycia choroby STD.

Generalnie będą to kobiety w wieku 12-70 lat, częściej nastolatki i kobiety do 60 lat, na przykład 14-60, zazwyczaj 18-45, jak w badaniach opisanych poniżej. W jednym aspekcie odpowiednia grupa kobiet obejmuje cierpiące na lub z ryzykiem nabycia zakażenia opryszczką narządów płciowych. Zastosowanie według wynalazku może, na przykład być wykorzystane u seronegatywnych zdrowych partnerów osobników z opryszczką narządów płciowych.

Wynalazek został zilustrowany, bez ograniczania, następującymi przykładami, przedstawiającymi wyniki uzyskane, gdy szczepionkę opryszczki podawano kobietom. Podobne wyniki można otrzymać ze szczepionkami przeciw innym chorobom STD, takim jak HPV i w połączeniu lub w szczepionkach poliwalentnych przeciw więcej niż jednej chorobie STD, zwłaszcza szczepionkom połączonym zawierającym antygen związany z Herpes Simplex (opryszczką zwykła), bardziej dokładnie gD HSV-2 lub jej immunologiczne fragmenty, takie jak gD2t opisane powyżej.

P r z y k ł a d 1 - plan badań

Badana szczepionka

Szczepionka-kandydat SmithKline Beecham Biologicals Herpes Simplex (gD2t-20 μg) z alumem (500 μg) i 3-DMPL (50 μg).

Badanie

Randomizowane badania metodą podwójnie-ślepej próby z placebo w grupie kontrolnej dla oceny skuteczności szczepionki-kandydat SmithKline Beecham Biologicals Herpes Simplex (gD2t) z 3-DMPL do zapobiegania opryszczce narządów płciowych u zdrowych partnerów osobników z opryszczką narządów płciowych.

Wskazanie/badana populacja

Zdrowi dorośli ochotnicy, mężczyźni i kobiety w wieku 18 do 45 lat z negatywnymi serologicznymi znacznikami zakażenia opryszczką zwykłą (HSV-1 i -2), i których partner miał kliniczną opryszczkę narządów płciowych.

Cele badań

Główne

Porównanie z placebo, w okresie 17 miesięcy począwszy od pierwszego miesiąca po drugim szczepieniu, skuteczności ochronnej szczepionki gD-alum-3-DMPL w zapobieganiu klinicznej chorobie opryszczce narządów płciowych.

Drugorzędne

Porównanie z placebo, począwszy od jednego miesiąca po drugim szczepieniu, skuteczności ochronnej szczepionki gD-alum-3-DMPL w zapobieganiu zakażeniu opryszczką narządów płciowych.

Porównanie z placebo po pełnym przebiegu szczepienia skuteczności ochronnej szczepionki gD-alum-3-DMPL w zapobieganiu zakażeniu opryszczką narządów płciowych.

Porównanie z placebo, po pełnym przebiegu szczepienia skuteczności ochronnej szczepionki gD-alum-3-DMPL w zapobieganiu zakażeniu opryszczką narządów płciowych w przedłużonym okresie obserwacji.

Porównanie z placebo, po pełnym przebiegu szczepienia skuteczności ochronnej szczepionki gD-alum-3-DMPL w zapobieganiu opryszczce narządów płciowych.

Porównanie z placebo, po pełnym przebiegu szczepienia skuteczności ochronnej szczepionki gD-alum-3-DMPL w zapobieganiu klinicznej chorobie opryszczce narządów płciowych w przedłużonym okresie obserwacji.

PL 199 545 B1

Ocena, począwszy od jednego miesiąca po drugim szczepieniu, czasu do wystąpienia choroby w każdej grupie.

Ocena, począwszy od jednego miesiąca po drugim szczepieniu, czasu do wystąpienia zakażenia w każdej grupie.

Ocena, w każdej grupie, liczby typowych i atypowych przypadków choroby opryszczki narządów płciowych.

Ocena nasilenia pierwotnej choroby w obu grupach.

Ocena humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej na szczepionkę (z wyłączeniem osobników z ośrodków badawczych wprowadzonych po 1 lipca 1995).

Określenie serologicznych lub immunologicznych zależności skuteczności ochronnej (z wyłączeniem osobników z ośrodków badawczych wprowadzonych po 1 lipca 1995).

W przypadku pierwotnej choroby lub zakażenia ocena liczby kolejnych nawrotów w dwóch grupach.

Ocena bezpieczeństwa i reaktogenności szczepionki-kandydata SmithKline Beecham Biologicals Herpes Simplex (z 3-DMPL) u zdrowych HSV seronegatywnych osobników.

Ocena liczby przypadków choroby opryszczki ustno-wargowej (niedotyczącej narządów płciowych).

Porównanie z placebo, począwszy od jednego miesiąca po drugim szczepieniu, skuteczności ochronnej gD-alum-3-DMPL w zapobieganiu podejrzewanym oznakom opryszczki narządów płciowych i objawom związanym zarówno z serokonwersją w Western Blot do antygenów nie-szczepionkowych lub z wykrywaniem DNA HSV techniką PCR w wymazach z narządów płciowych.

Ocena zapadalności na opryszczkę narządów płciowych i zakażenia HSV u biorców szczepionki w przedłużonym okresie obserwacji.

Plan badań

Randomizowane badania metodą podwójnie-ślepej próby z placebo w grupie kontrolnej.

Schemat szczepienia 0-1-6 miesiący.

Początkowy okres obserwacji - 17 miesięcy dla każdego osobnika, począwszy od 1 miesiąca po drugim szczepieniu.

Wydłużony okres obserwacji - 24 miesiące dla każdego osobnika począwszy (od wizyty u lekarza w 19 miesiącu do wizyty w 43 miesiącu).

Faza A (podwójnie ślepa próba, biorcy otrzymywali szczepionkę i placebo) kończy się, gdy ostatni zaangażowany osobnik zakończy początkowy okres obserwacji (mniej więcej w czasie, gdy badanie przestaje być ślepe (nieoznakowane?) do analizy).

Faza B (otwarta, tylko biorcy szczepionki) rozpoczyna się, gdy ostatni zaangażowany osobnik zakończy początkowy okres obserwacji (wizyta w 19 miesiącu) i kończy się wraz z ostatnią wizytą ostatniego zaangażowanego osobnika osobnik w 43 miesiącu.

Ponieważ może wystąpić okres kilku miesięcy między datą, gdy ostatni chory zaangażowany do badań zakończy początkowy okres obserwacji, a datą gdy badania przestaną być ślepe do analizy (z powodu czasu wymaganego na odkodowanie i opracowanie wszystkich danych badawczych zabranych w czasie początkowego okresu obserwacji a fazą A przedłużonego okresu obserwacji), początkowa część fazy B przedłużonego okresu obserwacji może obejmować zarówno biorców szczepionki jak i placebo.

grupy: I. gD2t-Alum-3-DMPL

Alum-3-DMPL jako placebo

Schematyczny plan badań HSV-007 - okresy badań: faza szczepienia (V); początkowy okres* obserwacji (początkowy f/u*); wydłużony okres obserwacji faza A; wydłużony okres obserwacji faza B.

*Uwaga: zmodyfikowany „początkowy okres obserwacji” obecnie obejmuje 2-19 miesięcy.

Liczba osobników

800 par zaangażowanych do badań, dających co najmniej 640 osobników możliwych do oceny

Punkt końcowy pierwotnej skuteczności

Podczas 17 miesięcznego okresu, począwszy od jednego miesiąca po drugim szczepieniu (miesiące 2-19), pierwotny punkt końcowy w badaniach skuteczności będzie następujący:

Zapobieganie chorobie

Porównanie między dwoma grupami osobników z co najmniej jednym zgodnym objawem opryszczki narządów płciowych i albo równoczesnej dodatniej hodowli albo pojawienia się przeciwciał wobec nieszczepionkowych antygenów w teście Western Blot w ciągu sześciu miesięcy i dodatnie miejscowe wykrycie DNA opryszczki zwykłej w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

PL 199 545 B1

	Objaw kliniczny	Hodowla	Przeciwciała wobec antygenów nie-szczepionkowych	PCR
choroba	+	+	+/-	NA
	+	-	+	+

NA - nie stosowano

Punkty końcowe skuteczności wtórnej

1) Zapobieganie zakażeniu:

Przeprowadza się porównanie (między grupami otrzymującymi szczepionkę a otrzymującymi placebo), kilku osobników, u których rozwinęły się przeciwciała wobec antygenów nieszczepionkowych (serokonwersja) i osobników, u których rozwinęła się choroba (udowodnioną hodowlą).

Ten punkt końcowy ocenia się w następujących okresach:

Początkowy okres obserwacji (miesiące 2-19)

Miesiące 7-19

Faza A przedłużonego okresu obserwacji

Połączone początkowy okres obserwacji (miesiące 2-19) i faza A przedłużona

Połączone miesiące 7-19 i faza A przedłużonej obserwacji

Analiza danych z fazy A przedłużonego okresu obserwacji obejmuje wszystkie przypadki występujące u każdego osobnika po wizycie w 19 miesiącu i koniec fazy A (gdy ostatni zaangażowany osobnik zakończy wizytą w 19 miesiącu).

Definicja przypadków

	Objawy kliniczne	Hodowla	Przeciwciała wobec antygenów nieszczepionkowych	PCR
zakażenie	choroba	+	+	+/-	NA
zakażenie	choroba	+	-	+	+
zakażenie	+/-	NA	+	NA

NA - nie stosowano

2) Zapobieganie chorobie między miesiącami 7-19

Porównanie z placebo po pełnym przebiegu szczepienia (miesiące 7-19), u pewnej liczby osobników z co najmniej jednym zgodnym objawem opryszczki narządów płciowych i albo współistniejącą dodatnią hodowlą jak i pojawieniem się przeciwciał wobec antygenów nieszczepionkowych w teście Western Blot i dodatnim miejscowym wykryciem DNA opryszczki zwykłej w reakcji łańcuchowej polimerazy (Polymerase Chain Reaction - PCR).

3) Zapobieganie chorobie podczas fazy A przedłużonego okresu obserwacji

Podczas fazy A przedłużonego okresu obserwacji, porównanie przeprowadza się między dwiema grupami osobników z co najmniej jednym zgodnym objawem opryszczki narządów płciowych i albo współistniejącą dodatnią hodowlą albo pojawieniem się przeciwciał wobec antygenów nieszczepionkowych w teście Western Blot i miejscowym dodatnim wykryciem DNA opryszczki zwykłej w reakcji łańcuchowej polimerazy (Polymerase Chain Reaction - PCR).

Ponadto ten punkt końcowy również ocenia się dla połączonych: nowego okresu początkowego obserwacji (miesiące 2-19) i fazy A przedłużonego okresu obserwacji a również dla połączonych: miesięcy 7-19 i fazy A przedłużonego okresu obserwacji.

4) Ocena podczas okresu 17 miesięcy począwszy od jednego miesiąca po drugim szczepieniu, w każdej grupie, w czasie do wystąpienia choroby opryszczki narządów płciowych.

5) Ocena podczas okresu 17 miesięcy począwszy od jednego miesiąca po drugim szczepieniu, w każdej grupie, w czasie do wystąpienia zakażenia opryszczki narządów płciowych.

6) Ocena, w każdej grupie, liczby przypadków typowej klinicznej choroby opryszczki narządów płciowych i atypowej choroby opryszczki narządów płciowych.

Definicje przypadków opisane w pierwotnym punkcie końcowym.

7) Ocena, w każdej grupie, miejscowych i ogólnych oznak i objawów choroby HSV narządów płciowych i czasu ich trwania.

PL 199 545 B1

8) Ocena humoralnych (przeciwciał anty-gD2 w teście ELISA i przeciwciał neutralizujących anty-HSV) oraz komórkowych (limfoproliferacja, sekrecja gamma interferonu) odpowiedzi na szczepionkę (z wyłączeniem osobników z badań rozpoczętych po 1 lipca 1995).

9) Jeżeli wykazana jest kliniczna skuteczność, to znaczniki serologiczne i immunologiczne będą oceniane ekstensywnie z zastosowaniem surowicy i limfocytów krwi obwodowej zbieranych zgodnie ze schematem, w celu określenia zależności między skutecznością ochronną a parametrami laboratoryjnymi (z wyłączeniem osobników z badań rozpoczętych po 1 lipca 1995).

10) W przypadku pierwotnej choroby lub zakażenia, ocena liczby kolejnych powtórzeń opryszczki narządów płciowych w każdej grupie.

11) Po każdym szczepieniu będą oceniane miejscowa i ogólna reaktogenność i bezpieczeństwo przez rejestrowanie miejscowych i ogólnych oznak i objawów po każdej dawce oraz niepomyślne doświadczenia podczas przebiegu badań. Hematologiczne i biochemiczne parametry będą sprawdzane na linii odniesienia i po ostatnim szczepieniu.

Podczas przedłużonego okresu obserwacji wszystkie poważnie niepomyślne doświadczenia zgłaszane przez otrzymujących szczepionki będą odnotowywane.

12) Ocena liczby klinicznych przypadków opryszczki narządów nie płciowych, w tym opryszczek ustno-wargowych, w każdej grupie.

13) Porównania z placebo, podczas 17 miesięcznego okresu, począwszy od jednego miesiąca po drugim szczepieniu, pewnej liczby osób, które otrzymały szczepionkę, u których rozwinęły się oznaki i objawy opryszczki narządów płciowych związane zarówno z serokonwersją do antygenów nie-szczepionkowych w teście Western Blot (w ciągu sześciomiesięcznego okresu od pojawienia się oznak lub objawów opryszczki narządów płciowych) lub u osób, u których wykryto DNA HSV techniką PCR w wymazach z narządów płciowych.

14) Podczas fazy B przedłużonego okresu, analizuje się pewną liczbę osób, które otrzymały szczepionkę, u których rozwinęły się przeciwciała wobec antygenów nie-szczepionkowych (serokonwersja) i osobników, u których rozwój choroby (potwierdzony hodowlą) analizuje się w powiązaniu z okresem od podania ostatniej szczepionki. Te dane stosuje się do obliczania szybkości ataku choroby i zakażenia opryszczką narządów płciowych.

P r z y k ł a d 2

Analiza pierwotnego punktu końcowego jest oparta na porównaniu szybkości ataku choroby między grupą otrzymującą placebo, a grupą szczepioną jak opisano w RAP. Analiza drugorzędowego punktu końcowego jest oparta na porównaniu szybkości ataku lub porównaniu czasu do wystąpienia punktów końcowych choroby lub zakażenia, jak opisano poniżej.

Statystyczne testy są dwustronne i przeprowadzone przy użyciu oprogramowania SAS przy poziomie α 0,05. Należy zauważyć, że odnotowano wiele statystycznych analiz, ale dla drugorzędowego punktu końcowego wskaźnik błędu (α) nie jest kontrolowany. Ponieważ nie przeprowadzono wyrównania α dla drugorzędowych punktów końcowych, wartości p muszą być interpretowane ostrożnie i tylko jako opisowe.

Populacje analizowane pod względem skuteczności szczepionki

Analizy skuteczności prowadzi się na dwóch populacjach osobników: populacja ITT (zgodna z zaplanowanym leczeniem) (intention-to-treat - ITT) i populacja według protokołu (according-to-protocol ATP). Grupa ATP jest dalej również określana jako grupa zgodna z protokołem (per-protocol -PP).

Analiza populacji według protokołu jest pierwotną analizą. Określenie populacji ATP (lub PP) jest zdefiniowane przez brany pod uwagę okres badania 1) dla okresu między 2-19 miesiącami, populacja ATP składa się z osobników:

- którzy spełniają wszystkie kryteria;

- którzy otrzymali trzy dawki szczepionki/placebo;

- lub którzy otrzymali dwie dawki szczepionki/placebo i u których rozważane przypadki (choroba lub zakażenia) wystąpiły przed wizytą w 6 miesiącu;

- u których rozważane przypadki (choroba lub zakażenie) wystąpiły przed rozpoczęciem okresu 2-19 miesięcy.

2) dla okresu między 7-19 miesiącami, populacja ATP składała się z osobników:

- którzy spełniają wszystkie kryteria;

- którzy otrzymali trzy dawki szczepionki/placebo;

- u których rozważane przypadki (choroba lub zakażenie) nie wystąpiły przed rozpoczęciem okresu 7-19 miesięcy.

PL 199 545 B1

Analiza populacji ITT jest rozważana jako analiza wtórna. Ta analiza obejmuje wszystkich osobników, którzy otrzymali co najmniej jedną dawkę badanej szczepionki mieli co najmniej jedną ocenę szczepionki.

Celem tych dwóch analiz jest zapewnienie, że naruszenia protokołu, zwolnienia osobników i wycofania nie są związane z leczeniem i nie prowadzą do żadnego odchylenia wyników skuteczności.

Populacje włączone do badań immunogenności i bezpieczeństwa zostaną dokładnie opisane w końcowym raporcie z badań.

Okresy oceniania

Okresy oceniania, podczas których prowadzono analizę obejmują:

- miesiące 2-19 (populacja ATP)

- miesiące 7-19 (populacja ATP)

- miesiące 0-19 (populacja ITT)

Wybrane wyniki przedstawiono poniżej, razem z podsumowaniem końcowych wniosków z badań.

T a b e l a 1a

Określenie wpływu szczepionki na występowanie opryszczki narządów płciowych ze względu na płeć - populacja ITT

Dane stałe w modelu	Odchylenie	Stopień swobody	Wartość p
grupa leczona	320,5561	845
grupa leczona, płeć	317,2083	844	0,067
grupa leczona, płeć i interakcje	312,0443	843	0,023

T a b e l a 1b

Określenie wpływu szczepionki na występowanie zakażenia opryszczką narządów płciowych ze względu na płeć - populacja ITT

Dane stałe w modelu	Odchylenie	Stopień swobody	Wartość p
grupa leczona	510,8654	845
grupa leczona, płeć	494,9266	844	<0,001
grupa leczona, płeć i oddziaływanie	491,5551	843	0,066

Rozkład przypadków choroby opryszczki narządów płciowych i zakażenia HSV w leczonych grupach

T a b e l a 2a

Przypadki choroby opryszczki narządów płciowych w grupie leczonej - mężczyźni i kobiety

Przedział	ITT (N=847)	Per-protokół*
Szczepionka (425)	Placebo (422)	Szczepionka	Placebo
M 0-2	2	7
M 2-7	9	8
M 7-19	4	9	3 (349)	7 (349)
M 2-19	13	17	12 (371)	16 (369)
>M19	1	0
sumarycznie	16	24

* dla każ dego okresu liczba osobników ocenianych w pre-protokole podana jest w nawiasach

PL 199 545 B1

T a b e l a 2b

Przypadki choroby opryszczki narządów płciowych w grupie leczonej - tylko mężczyźni

Przedział	ITT (N=579)	Per-protokół*
Szczepionka (288)	Placebo (291)	Szczepionka	Placebo
M 0-2	2	2
M 2-7	6	5
M 7-19	3	3	2 (240)	2 (247)
M 2-19	9	8	8 (252)	8(261)
>M19	1	0
sumarycznie	12	10

* dla każ dego okresu liczba osobników ocenianych w pre-protokole podana jest w nawiasach

T a b e l a 2c

Przypadki choroby opryszczki narządów płciowych w grupie leczonej - tylko kobiety

Przedział	ITT (N=268)	Per-protokół*
Szczepionka (137)	Placebo (131)	Szczepionka	Placebo
M 0-2	0	5
M 2-7	3	3
M 7-19	1	6	1 (109)	5 (102)
M 2-19	4	9	4 (119)	8 (108)
>M19	0	0
sumarycznie	4	14

* dla każ dego okresu liczba obiektów ocenianych w pre-protokole podana jest w nawiasach

T a b e l a 3a

Przypadki zakażenia opryszczką narządów płciowych w grupie leczonej - mężczyźni i kobiety

Przedział	ITT (N=847)	Per-protokół*
Szczepionka (425)	Placebo (422)	Szczepionka	Placebo
M 0-2	2	10
M 2-7	17	13
M 7-19	11	16	10 (349)	16 (349)
M 2-19	28	30	26 (371)	29 (369)
>M19	5	2
sumarycznie	35	41

* dla każ dego okresu liczba obiektów ocenianych w pre-protokole podana jest w nawiasach

PL 199 545 B1

T a b e l a 3b

Przypadki zakażenia opryszczką narządów płciowych w grupie leczonej - tylko mężczyźni

Przedział	ITT (N=579)	Per-protokół*
	Szczepionka (288)	Placebo (291)	Szczepionka	Placebo
M 0-2	2	2
M 2-7	9	8
M 7-19	6	6	5 (240)	6 (247)
M 2-19	15	14	13 (252)	14 (261)
>M19	3	0
sumarycznie	20	16

* dla każ dego okresu liczba obiektów ocenianych w pre-protokole podana jest w nawiasach

T a b e l a 3c

Przypadki zakażenia opryszczką narządów płciowych w grupie leczonej - tylko kobiety

Przedział	ITT (N=268)	Per-protokół*
	Szczepionka (137)	Placebo (131)	Szczepionka	Placebo
M 0-2	0	8
M 2-7	8	5
M 7-19	5	10	5 (109)	10 (102)
M 2-19	13	15	13 (119)	15 (108)
>M19	2	2
sumarycznie	15	25

* dla każ dego okresu liczba obiektów ocenianych w pre-protokole podana jest w nawiasach

Wstępna analiza skuteczności

Pierwotny punkt końcowy w badaniu skuteczności

Podczas 17 miesięcy, począwszy od pierwszego miesiąca po drugim szczepieniu (miesiące 2-19), pierwotny punkt końcowy w badaniu skuteczności był następujący:

Zapobieganie chorobie:

Porównanie między dwoma grupami kilku osobników z co najmniej jednym zgodnym objawem opryszki narządów płciowych i albo równoczesną dodatnią hodowlą albo pojawieniem się przeciwciał wobec antygenów nie-szczepionkowych w teście Western Blot w ciągu sześciu miesięcy i lokalnym wykryciem DNA opryszczki zwykłej w reakcji łańcuchowej polimerazy (Polymerase Chain Reaction - PCR).

T a b e l a 4a

Zapobieganie opryszczce narządów płciowych - mężczyźni i kobiety

Przedział	Populacja	Skuteczność (95% CI)
Cały	ITT	33,8 (-22,8; 64,3%)
M 2-19	PP	25,4% (-55,5; 64,2%)

T a b e l a 4b

Zapobieganie opryszczce narządów płciowych - tylko mężczyźni

Przedział	Populacja	Skuteczność (95% CI)
Cały	ITT	-21,1 (-176,2; 46,8%)
M 2-19	PP	3,6% (-171,7; 60,5%)

PL 199 545 B1

T a b e l a 4c

Zapobieganie opryszczce narządów płciowych - tylko kobiety

Przedział	Populacja	Skuteczność (95% CI)
Cały	ITT	72,7% (19,1; 90,8%)
M 2-19	PP	54,6% (-46,4; 85,9%)

Wtórne punkty końcowe w badaniu skuteczności

1) Zapobieganie zakażeniu:

Przeprowadzono porównanie (między grupą szczepioną szczepionką a grupą z placebo), kilku osobników, u których rozwinęły się przeciwciała wobec antygenów nie-szczepionkowych (serokonwersja) i osobników, u których rozwinęła się choroba (dowiedziona hodowlą) w początkowym okresie (miesiące 2-19).

T a b e l a 5a

Zapobieganie zakażeniu opryszczką narządów płciowych - mężczyźni i kobiety

Przedział	Populacja	Skuteczność (95% CI)
Cały	ITT	15,2% (-30,4; 44,0%)
M 2-19	PP	10,8% (-48,4; 46,4%)

T a b e l a 5b

Zapobieganie zakażeniu opryszczką narządów płciowych - tylko mężczyźni

Przedział	Populacja	Skuteczność (95% CI)
Cały	ITT	-26,3% (-138,8; 33,2%)
M 2-19	PP	3,8% (-100,5; 53,9%)

T a b e l a 5c

Zapobieganie zakażeniu opryszczką narządów płciowych - tylko kobiety

Przedział	Populacja	Skuteczność (95% CI)
Cały	ITT	42,6% (-3,9; 68,3%)
M 2-19	PP	21,3% (-57,7; 60,8%)

2) Zapobieganie zakażeniu:

Przeprowadzono porównanie (między grupą szczepioną szczepionką a grupą z placebo), liczby osobników, u których rozwinęły się przeciwciała wobec antygenów nie-szczepionkowych (serokonwersja) i osobników, u których rozwinęła się choroba (udowodniona hodowlą) w miesiącach 7-19.

T a b e l a 6a

Zapobieganie zakażeniu opryszczką narządów płciowych - mężczyźni i kobiety

Przedział	Populacja	Skuteczność (95% CI)
M 7-19	PP	37,5% (-35,8; 71,2%)

T a b e l a 6b

Ochrona przed zakażeniem opryszczką narządów płciowych - tylko mężczyźni

Przedział	Populacja	Skuteczność (95% CI)
M 7-19	PP	14,2% (-177,3; 73,5%)

PL 199 545 B1

T a b e l a 6c

Zapobieganie zakażeniu opryszczką narządów płciowych - tylko kobiety

Przedział	Populacja	Skuteczność (95% CI)
M 7-19	PP	53,2% (-32,2; 83,4%)

3) Zapobieganie chorobie między 7-19 miesiącem

Porównanie z placebo po pełnym przebiegu szczepienia (miesiące 7-19), pewnej liczby osobników z co najmniej jednym zgodnym objawem opryszki narządów płciowych i albo równoczesną dodatnią hodowlą albo pojawieniem się przeciwciał wobec antygenów nie-szczepionkowych w teście Western Blot i dodatnim miejscowym wykryciem DNA opryszczki zwykłej w reakcji łańcuchowej polimerazy (Polymerase Chain Reaction - PCR).

T a b e l a 7a

Zapobieganie opryszczce narządów płciowych - mężczyźni i kobiety

Przedział	Populacja	Skuteczność (95% CI)
M 7-19	PP	57,1% (-64,4; 88,8%)

T a b e l a 7b

Zapobieganie opryszczce narządów płciowych - tylko mężczyźni

Przedział	Populacja	Skuteczność (95% CI)
M 7-19	PP	-2,9% (-624,7; 85,4%)

T a b e l a 7c

Zapobieganie opryszczce narządów płciowych - tylko i kobiety

Przedział	Populacja	Skuteczność (95% CI)
M 7-19	PP	81,3% (-57,5, 97,8%)

W celu oceny podczas okresu 17 miesięcy począwszy od pierwszego miesiąca po drugim szczepieniu, w każdej grupie, badano czas do wystąpienia opryszczki narządów płciowych.

Czas do wystąpienia opryszczki narządów płciowych w populacji ITT przedstawiono na figurach: 1a (mężczyźni i kobiety), 1b (tylko mężczyźni) i 1c (tylko kobiety). Analizę skuteczności w czasie do wystąpienia opryszczki narządów płciowych w populacji ITT przedstawiono w Tabelach 8a (mężczyźni i kobiety), 8b (tylko mężczyźni) i 8c (tylko kobiety). Czas do wystąpienia nie był analizowany dla populacji per-protokół (miesiące 2-19) ponieważ wczesne różnice w przeżyciu bez choroby zaobserwowano między biorcami, otrzymującymi szczepionkę lub placebo przed 2 miesiącem.

Uwaga: czas do wystąpienia obejmuje analizę z wyłączeniem przypadków opryszczki narządów płciowych występującej po miesiącu 19.

T a b e l a 8a

Zapobieganie opryszczce narządów płciowych w czasie przed wystąpieniem - mężczyźni i kobiety

Przedział	Populacja	Wartość p (Long Rank Test)	Skuteczność (95% CI)
M 0-19	ITT	0,1432	37,9% (-18,27; 67,45%)

T a b e l a 8b

Zapobieganie opryszczce narządów płciowych w czasie przed wystąpieniem - tylko mężczyźni

Przedział	Populacja	Wartość p (Long Rank Test)	Skuteczność (95% CI)
M 0-19	ITT	0,8025	-11,54% (-12,55; 52,3%)

PL 199 545 B1

T a b e l a 8c

Zapobieganie opryszczce narządów płciowych w czasie przed wystąpieniem - tylko kobiety

Przedział	Populacja	Wartość p (Long Rank Test)	Skuteczność (95% CI)
M 0-19	ITT	0,013	73,24% (18,69; 91,19%)

Podsumowanie i wnioski po szczegółowej analizie wyników próby

Ocena demograficznych cech charakterystycznych i czynników ryzyka.

Zaangażowani osobnicy ogólnie 847 osób (425 szczepionka i 422 placebo), 697 osób (344 szczepionka i 353 placebo) przeszło pełne badania do 19 miesiąca. Stu pięćdziesięciu (150) osobników odpadło z badań, żaden z osobników nie odpadł z powodu silnie niesprzyjających wydarzeń.

Trzystu siedemdziesięciu (370) osobników w grupie szczepionej i 369 osobników w grupie placebo oceniano w miesiącach 2-19 w populacji ATP. Grupy leczone były zrównoważone pod względem wszystkich demograficznych cech charakterystycznych, a dobór protokołu dla analizy populacji ATP nie skutkował wprowadzeniem odchylenia w leczonych grupach.

Czynniki ryzyka, które mogłyby mieć wpływ na szybkość nabycia choroby lub zakażenia opryszczką narządów płciowych były oceniane i obejmowały czas trwania związku przed rozpoczęciem badań, średni czas aż do separacji od partnera będącego źródłem, częstotliwość współżycia seksualnego (przy linii odniesienia i podczas okresu obserwacji skuteczności) oraz częstotliwość stosowania prezerwatywy (przy linii odniesienia i podczas okresu obserwacji skuteczności).

Te wyniki wskazują, że grupy szczepione szczepionką i grupy placebo były zrównoważone przy linii odniesienia dla wszystkich czynników ryzyka i równowaga utrzymywała się podczas badania. Podobieństwo profilu populacji ITT do profilu populacji ATP w sensie czynników ryzyka potwierdza również, że eliminacja niestosujących się do protokołu nie powoduje odchylenia w leczonej grupie.

Podana aliza pod względem płci wskazuje, że w każdej określonej płciowo grupie czynniki ryzyka, które mogłyby mieć wpływ na nabycie opryszczki narządów płciowych lub zakażenia opryszczką narządów płciowych są zrównoważone w leczonej grupie.

Analiza pierwotnego punktu końcowego skuteczności

Analiza pierwotnego punktu końcowego w badaniu skuteczności nie pokazuje skuteczności szczepionki przeciw opryszczce narządów płciowych w połączonej populacji mężczyzn i kobiet seronegatywnych zdrowych małżonków osobników z chorobą - opryszczką narządów płciowych.

Wyniki analizy pierwotnego punktu końcowego w badaniu skuteczności są podsumowane poniżej:

1) względna skuteczność szczepionki w całej populacji (miesiące 2-19 ATP) wynosi 25,4% (95% CI: -55,5, 64,2; p=0,449). Względna skuteczność szczepionki w populacji ITT wynosi 37,9% (95% CI; -16,6, 67,0; p=0,143).

2) Statystyczne istotna płeć w interakcjach grupowych na analizę skuteczności populacji ITT (p=0,03).

3) Odrębna analiza pod względem płci pokazuje skuteczność szczepionki 54,2% w miesiącach 2-19 w populacji kobiet ATP (95% CI: -47,7, 85,8; p=0,238) i statystycznie istotną skuteczność szczepionki 72,7% (95% CI: 19,1, 90,8; p=0,014) w populacji kobiet ITT. W populacji mężczyzn brak dowodów na skuteczność szczepionki. W miesiącach 2-19 w populacji mężczyzn ATP skuteczność szczepionki wynosi 3,6% (95% CI: -171, 60,5) i -11,1% (95% CI: -157,6, 52,1) w populacji mężczyzn ITT.

Badano kilka linii odniesienia partnerów dla określenia czy mogą mieć wpływ na skuteczność: płeć, wiek, częstotliwość stosowania prezerwatywy przy linii odniesienia, częstotliwość współżycia seksualnego i czas trwania związku przed rozpoczęciem badań. Tendencja w kierunku skuteczności szczepionki była związana z płcią żeńską, wiekiem powyżej 30 lat, częstością stosowania prezerwatywy, współżyciem seksualnym mniejszym niż średnia częstotliwość i krótszym czasem trwania związku. Te obserwacje wystąpiły w obu populacjach ATP i ITT.

Wtórne punkty końcowe w analizach skuteczności

Zapobieganie opryszczce narządów płciowych (miesiące 7-19)

Po 3 dawkach szczepionki (między badanymi miesiącami 7-19) zaobserwowano skuteczność szczepionki 81,1% (95% CI: -58,9, 97,8) w zapobieganiu opryszczce narządów płciowych u kobiet (p=0,111). Nie wystąpiła tendencja w kierunku skuteczności u mężczyzn podczas okresu obserwacji w miesią cach 7-19 (-2,9% skutecznoś ci szczepionki, 95% CI: -24,7, 85,4; p=0,99). Ta tendencja skuteczności szczepionki w miesiącach 7-19 u kobiet w populacji ATP jest zgodna z obserwacją skuteczności szczepionki u kobiet w analizie populacji ITT w pierwotnym punkcie końcowym.

PL 199 545 B1

Zapobieganie zakażeniu HSV

Porównano grupy szczepione szczepionką i placebo pod względem skuteczności szczepionki do zapobiegania zakażeniu HSV. Ogólnie, nie było skuteczności szczepionki przeciw zakażeniu HSV. Jednak zgodność z analizą punktu końcowego choroby, tendencję skuteczności szczepionki przeciw zakażeniu HSV sugerowano u kobiet w populacji ITT (skuteczność szczepionki 46,0%, 95% CI: -2,1; 71,4; p=0,072), a w miesiącach 7-19 w populacji ATP (skuteczność szczepionki 52,8%, 95% CI: -33,4; 83,3; p=0,184).

Czas do wystąpienia opryszczki narządów płciowych

Czas do wystąpienia opryszczki narządów płciowych był obliczany z badań wejściowych do wystąpienia choroby. Główną analizę prowadzono w teście long rank; dla każdej grupy wykreślono krzywe Kaplan-Meier'a. U kobiet (miesiące 2-19 populacja ATP) oddzielenie krzywych wskazujące na pojawienie się przypadków choroby jest oczywiste dla w przybliżeniu dziewięciu miesięcy z przypadkami choroby kontynuującymi występowanie w grupie placebo. Skuteczność szczepionki jest oceniana na 53,6% (95% CI: -54,2, 86,0) u kobiet. W populacji kobiet ITT gdzie oddzielenie krzywych placebo i szczepionki jest oczywiste od miesiąca 0, statystycznie istotna skuteczność szczepionki jest oceniana na 73,2% (95% CI: 18,7, 91,2; p=0,013). W populacji mężczyzn nie obserwuje się skuteczności szczepionki. Ponownie, wyniki analizy „czasu do wystąpienia” są zgodne z analizą w pierwotnym punkcie końcowym.

Nasilenie opryszki narządów płciowych

Do oceny nasilenia choroby w obu grupach stosowano parametry obejmujące trwanie zmian patologicznych, trwanie objawów w epizodzie, liczbę objawów w epizodzie i intensywność objawów w epizodzie. W połączonych miesiącach 2-19 w populacji ATP trwanie objawów w epizodzie jest istotnie dłuższe w małej liczbie przypadków występowania w grupie szczepionej (p=0,031). Dane swoiste dla płci również ujawniają, że u kobiet w grupie szczepionej jest istotnie wyższa statystycznie liczba zmian opryszczkowych narządów płciowych na epizod (p=0,010). Te obserwacje sugerują, że chociaż szczepienie może zapobiegać łagodnej do średnio nasilonej chorobie w grupie szczepionej, to szczepienie nie zapobiega chorobie o bardziej nasilonych objawach.

Wnioski podsumowujące

Analiza pokazuje, że chociaż może być tendencja skuteczności szczepionki przeciw opryszczce wirusowej narządów płciowych, to analiza pierwotnego punktu końcowego nie wykazuje skuteczności szczepionki w połączonej populacji mężczyzn i kobiet seronegatywnych zdrowych partnerów osobników z opryszczką narządów płciowych. Jednak oddzielna pod-analiza według płci, oparta na zaobserwowanej interakcji zależnej od płci, nieoczekiwanie wykazuje tendencję skuteczności u kobiet, która jest statystycznie istotna w populacji ITT. Brak dowodów skuteczności szczepionki w populacji mężczyzn.

Dodatkowe odnośniki literaturowe

1. Washington AE, Johnson RE i Sanders LL. Chlamydia trachomatis infections in the United States: what are the costing us. JAMA 1987, 257, 20702072.

2. Grayston JT i Wang SP. New knowledge of Chlamydiae i the diseases they cause. The Journal of Infectious Diseases 1975, 132: 87-105.

3. Grayston JT i Wang SP, Yeh LJ, i Kuo CC. Importance of reinfection in the pathogenesis of trachoma. Reviews of Infectious Diseases 1985, 7, 717-725.

4. Morrison RP, RJ Belland, K Lyng i HD Caldwell. Chalmydial disease pathogenesis. The 57-kD Chlamydial hypersensitivity antigen is a stress response protein. J. Exp. Med. 1989, 170, 1271-1283.

5. Blander SJ i Amortegui AJ. Mice immunized with a chlamydial extract have no increase in early protective immu8nity despite increased inflammation following genital infection by the mouse pneumonitis agent of Chlamydia trachomatis. Infec. Immun. 1994, 62, 3617-3624. μg

6. Wang SP, Kuo CC, Barnes RC, Stephens RS i Grayston JT. Immunotyping of Chlamydia trachomatis with monolonal antibodies. The Journal of Infectious Diseases 1985, 152, 791-800.

7. Bavoil P, Ohlin A, i Schachter J. Role of bonding in outer membrane structure i permrability in Chlamydia trachmatis. Infect. Immun. 1984, 44, 479-485.

8. Hath TP, Miceli M, Sublett JE. Synthesis of disulfide-bonded outer membrane proteins during development cycle of Chlamydia psittaci i Chlamydia trachomatis. J. Bacteriol. 1986, 165, 379-385.

9. Stephens RS, R Sanchez-Pescador, EA Wagar, C Inouye i MS Urdea. Diversity of Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein genes. J. Bacteriol. 1987, 169, 3879-3885.

PL 199 545 B1

10. Yuan Y, Zhang YX, Watkins Ng, i Caldwell Hd. Nucleotide i deduced amino acid sequences for the our variable domains of the major outer membrane proteins of the 15 Chlamydia trachomatis serovars. Infect. Immun. 1989, 57, 1040-1049.

11. Baehr W, Zhang YX, Joseph T, Su H, Nano FE, Everett EK i Calwell HD. Mapping antigenic domains expressed by Chlamydia trachomatis majorouter membrane protein genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 4000-4004.

12. Lucero ME i Kuo CC. neutralization of Chlamydia trachomatis cell culture infection by serovar-specific monoclonal antibodies. Infect. Immun. 1985, 50, 595-597.

13. Zhang YX, Stewart S, Joseph T, Taylor HR i HD Caldwell. Protective monoclonal antibodies recognize epitopes located on the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. J. Imunol. 1987, 138, 575-581.

14. Peterson E, Zhong G, Catrlson E i de la Maza LM. Protective role of magnesium in the neutralization by monoclonal antibodies of Chlamydia trachomatis infectivity. Infect. Immun. 1988, 56, 885-891.

15. Zhang YX, Stewart SJ i Caldwell HD. Protective monoclonal antibodies to Chlamydia trachomatis serovar- i serogroup- specific major outer membrane protein determinants. Infect. Immun. 1989, 57, 636-638.

16. Allen JE, RM Loksley i RS Stephens. A single peptide from the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis elictis T cell help for the production o antibodies to protective determinants. J. Immunol. 1991, 147, 674-679.

17. Su H, RP Morrison, Watkins i HD Caldwell. Identification i characterization of T Helper cell epitopes of the major outer membrane proteinof Chlamydia trachomatis. J. Exp. Med. 1990, 172, 203-212.

18. Manning DS i SJ Stewart. Expression of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis in Escherichia coli. Infect. Immun. 1993, 61, 4093-4098.

19. Koehler JE, Birkelund S i Stephens RS. Overexpression i surface localization of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein Escherichia coli. Molecular Microbiology 1992, 6, 1087-1094.

20. Pickett MA, ME Ward i IN Clarke. High Level Expression i epitope localization of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis serovar L1. Molecular Microbiology 1988, 2, 681-685.

21. Taylor HR, J Whittum-Hudson, J Schacher, HD Caldwell i RA Prendergast. Oral immunization with chlamydial major outer membrane protein (MOMP). Investigative Ophthalmology i visual Science 1988, 29, 1847-1853.

22. Batteiger BE, RG Rank, PM Bavoil i LSF Sonderberg. Partial protection against genital reinfection by immunization of guinea-pig with isolated mouter membrane proteins of the chlamydial agent of guinea-pig inclusion conjunctivitis. Journal of General Microbiology 1993, 139, 2965-2972.

23. Tuffrey M, F Alexander, W Conlan, C Woods i M Ward. Heterotypic protection of mice against chlamydial salpingitis i colonization of the lower genital tract with a human serovar F isolate of Chlamydia trachomatis by prior immunization with recombinant L1 major outer-membrane protein. Journal of General Microbiology 1992, 138, 1707-1715.

24. Tuffrey M, P Falder, J Gale i D Taylor -Robinson. Salpingitis in mice induced by human strains of Chlamydia trachomatis. Br. J. exp. Path. 1986, 67, 605-616.

25. Tuffrey M, P Falder, J Gale, R Quinn i D taylor -Robinson. Infertility in mice infected genitally with a human strain of Chlamydia trachomatis. Br. J. exp. Path. 1986, 78, 251-260.

26. Ramsey KH, LSF Soderberg i RG Rank. Resolution of Chlamydial genital infection in B-cell deficient mice i immunity to reinfection. Infect. Immun. 1988, 56, 1320-1325.

27. Rank RG, LSF Soderberg i AL Barron. Chronic chlamydial genital infection in congenitally athymic nude mice. Infect. Immun. 1985, 48, 847-849.

28. Igietseme JU i RG Rank. Susceptibility to reinfection after a primary chlamydial genital infection is associated with a decrease of antigen-specific T cell in the genital tract. Infect. Immun. 1991, 59, 1346-1351.

29. Igietseme JU, KH Ramsey, DM Magee, DM Williams TJ Kincy i RG Rank. Resolution of murine chlamydial genital infection by the adoptive transfer of a biovar-specific, TH1 Lymphocyte clone.

Regional Immunology 1993, 5, 317-324.

30. Igietseme JU, DM Magee, DM Williams i RG Rank. Role for CD8+T cell in anichlamydial immunity defined by chlamydial-specific T-lymphocyte clones. Infect. Immun. 1994, 62, 5195-5197.

Claims (16)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie glikoproteiny D HSV lub jej immunologicznego fragmentu i adiuwantu do wytwarzania szczepionki do podawania kobietom HSV-1/-2 w celu zapobiegania opryszczce narządów płciowych.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że adiuwantem jest adiuwant indukujący TH-1.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że glikoproteina D HSV jest glikoproteiną skróconą.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że glikoproteina skrócona jest gD2 HSV i jest pozbawiona C-końcowego regionu kotwiczącego (gD2t).
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, że szczepionka ponadto obejmuje antygen pochodzący z HPV.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, że antygen lub kombinacja antygenów jest formułowana z odpowiednim nośnikiem.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że antygen lub kombinacja antygenów jest formułowana z odpowiednim nośnikiem.
8. 8. Zastosowanie według zastrz. 6 albo 7, znamienne tym, że nośnikiem jest wodorotlenek glinu (alum), fosforan glinu albo emulsja olej w wodzie.
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, że adiuwant jest adiuwantem 3D-MPL indukującym TH-1.
10. 10. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że adiuwant jest adiuwantem 3D-MPL indukującym TH-1.
11. 11. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że adiuwant jest adiuwantem 3D-MPL indukującym TH-1.
12. 12. Zastosowanie według zastrz. 8 albo 9, albo 10, znamienne tym, że cząstki 3D-MPL są wystarczająco małe do sterylnej filtracji przez membranę 0,22 μm.
13. 13. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że preparat szczepionki zawiera gD2t (1-1000 pg), 3D-MPL (10-200 pg) i sól glinu (100-1000 pg).
14. 14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że preparat szczepionki zawiera gD2t (20 pg), 3D-MPL (50 pg) i alum (500 pg).
15. 15. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 5, znamienne tym, że preparat szczepionki jest wytwarzany do podawania kobietom w odstępach 0, 1 i 6 miesięcy.
16. 16. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 5, znamienne tym, że preparat szczepionki jest wytwarzany do podawania domięśniowego.