PL200404B1

PL200404B1 - Antagoniści receptora witronektyny-arylopodstawione pochodne kwasu butanowego, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i ich zastosowania

Info

Publication number: PL200404B1
Application number: PL354176A
Authority: PL
Inventors: Peter J. Manley; William H. Miller; Irene N. Uzinskas
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 1999-09-07
Filing date: 2000-09-07
Publication date: 2009-01-30
Also published as: EP1218005B1; ES2234658T3; NO20021113L; ZA200201780B; PL354176A1; KR20020027624A; MXPA02002455A; NO20021113D0; AR025589A1; HK1049110A1; PE20010582A1; UY26329A1; CZ2002822A3; IL148325A0; CN1377269A; AU768918B2; DE60016769T2; PT1218005E; IL148325A; EP1218005A4

Abstract

Przedstawiono arylopodstawione pochodne kwasu butanowego o wzorze (I), w którym podstawniki maj a znaczenia podane w opisie, albo jego farmaceutycznie dopuszczaln a sól. Ponadto przedstawiono kompozycj e farmaceutyczn a zawieraj ac a wy zej okre slony zwi azek i farmaceu- tycznie dopuszczalny no snik, oraz zastosowanie tego zwi azku jako leku i do wytwarzania leku do le- czenia osteoporozy, albo leku do hamowania angiogenezy, wzrostu nowotworu albo przerzutów no- wotworu, albo leku do leczenia mia zd zycy t etnic, nawrotu zwezenia naczy n albo reumatoidalnego zapalenia stawów. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są farmaceutycznie aktywne związki hamujące receptor witronektynowy użyteczne do leczenia zapalenia, raka i schorzeń sercowo-naczyniowych, jak miażdżyca tętnic i restenoza, oraz chorób w których jednym z czynników jest resorpcja kości, jak osteoporoza, a także zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i zastosowania tych związków.

Integryny stanowią nadrodzinę receptorów wspomagających adhezję komórek, którymi są transmembranowe glikoproteiny wyrażane na wielu komórkach. Te powierzchniowe receptory adhezji obejmują gpIIb/IIIa (receptor fibrynogenowy) i α_νβ₃ (receptor witronektynowy). Receptor fibrynogenowy gpIIb/IIIa wyrażany jest na powierzchni płytek krwi i pośredniczy w agregacji płytek krwi i w tworzeniu hemostatycznych skrzepów w obrębie krwawiącej rany. Philips i wsp., Blood., 1988, 71, 831. Receptor witronektynowy a_ve₃ wyrażany jest na wielu komórkach, między innymi na komórkach śródbłonka, mięśni gładkich, osteoklastach i komórkach rakowych, a więc ma on wiele funkcji. Receptor a_ve₃ wyrażony na błonie komórek osteoklastów pośredniczy w przyleganiu (adhezji) osteoklastów do substancji międzykomórkowej kości, które jest kluczowym etapem w procesie resorpcji kości. Ross, i wsp., J. Biol;. Chem., 1987, 262, 7703. Chorobą, którą charakteryzuje nadmierna resorpcja kości jest osteoporoza. Receptor a_ve₃ wyrażony na komórkach aortalnego mięśnia gładkiego pośredniczy w ich migracji do nowej błony wewnętrznej naczynia, który to proces może prowadzić do restenozy po przezskórnej chirurgii plastycznej naczyń wieńcowych. Brown i wsp., Cardiovascular Res., 1994, 28, 1815. Dodatkowo, Brooks i wsp., Cell, 1994, 79, 1157 wykazali że antagoniści a_ve₃ mogą promować regresję nowotworu przez wywołanie apoptozy nowych naczyń krwionośnych. Tak więc środki, które blokują receptor witronektynowy mogą być użyteczne w leczeniu chorób, takich jak osteoporoza, restenoza i rak.

Wiadomo, że receptor witronektynowy ma związek z trzema różnymi integrynami, oznaczonym a_ve₁, a_ve₃ i a_ve₅. Horton i wsp., Jnt . J. Exp. Pathol., 1990, 71, 741. a_ve₁ wiąże fibronektynę i witronektynę. a_ve₃ wiąże wiele różnych ligandów, między innymi fibrynę, fibrogen, lamininę, trombospondynę, witronektynę, czynnik von Willebranda, osteopontynę i sialoproteinę kości I. a_ve₅ wiąże witronektynę. Wykazano, że receptor witronektynowy a_ve₅ bierze udział w przyleganiu komórek różnych typów, między innymi śródbłonkowych komórek drobnych naczyń, (Davis i wsp., J. Cell. Bio., 1993, 51, 206) i jego rola w angiogenezie została potwierdzona. Brooks i wsp., Science, 1994, 264, 569. Ta integryna wyrażona jest na naczyniach krwionośnych w ludzkiej tkance, ziarninowej rany, ale nie na normalnej skórze.

Wiadomo, że receptor witronektynowy wiąże się do białek substancji międzykomórkowej kostnej, która zawiera odcinek trój-peptydowy Arg-Gly-Asp (albo RGD). Zatem Horton i wsp., Exp., Cell Res., 1991, 195, 368, ujawnili, że peptydy zawierające RGD i przeciwciało anty-receptora witronektynowego (23C6) hamuje resorpcję zębiny i rozciąganie komórek przez osteoklast. Dodatkowo Sato i wsp., J. Cell Biol. 1990, 111, 1713 ujawniali, że echistatyna, peptyd z jadu węża, który zawiera sekwencję RGD jest silnym inhibitorem resorpcji kości w kulturach tkankowych i hamuje przyłączanie osteoklastów do kości.

Obecnie stwierdzono, że pewne związki są silnymi inhibitorami receptorów a_ve₃ i a_ve₅. W szczególności stwierdzono, że takie związki są silniejszymi inhibitorami receptora witronektynowego niż receptora fibrynogenowego.

Przedmiotem wynalazku są związki o wzorze (I), jak opisano poniżej, o aktywności farmakologicznej do hamowania receptora witronektynowego, użyteczne do leczenia zapalenia, raka i schorzeń sercowo-naczyniowych, jak miażdżyca tętnic, restenoza albo reumatoidalne zapalenie stawów, oraz chorób w których czynnikiem jest resorpcja kości, jak osteoporoza.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek o wzorze (I) i farmaceutyczny nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie tych związków, jako leku w sposobie leczenia chorób, w których pośredniczy receptor witronektynowy. W konkretnym aspekcie, związki według wynalazku są użyteczne w zastosowaniu do wytwarzania leku do leczenia miażdżycy tętnic, nawrotu zwężenia naczyń (restenozy), albo leku do hamowania angiogenezy, wzrostu nowotworu (raka) albo przerzutów nowotworów, oraz chorób w których czynnikiem jest resorpcja kości, jak osteoporoza.

Przedmiotem wynalazku są nowe związki które są silniejszymi inhibitorami receptora witronektynowego niż receptora fibrynogenowego tj. arylopodstawione pochodne kwasu butanowego o wzorze (I):

PL 200 404 B1

(I) w którym:

R¹ oznacza:

w którym R' oznacza grupę C1-4alkilową ewentualnie podstawioną przez R^x, a R oznacza grupę fenylową, benzylową albo -CH2CF3; albo R' i R są połączone i tworzą pierścień morfolinylowy;

R^x oznacza grupę C1-4alkilową, OR*, SR*, grupę C1-4alkilosulfonywą, C1-4alkilosulfoksylową, -CN, N(R*)2, CH2N(R*)2, -NO2, -CF3, -CO2R*, -CON(R*)2' -COR*, -SO2N(R*)2, -NR*C(O)R*, F, Cl, Br, J albo CF3S(O)r-;

r oznacza 0, 1 albo 2;

R* oznacza H, grupę C1-4alkilową, fenylową albo benzylową;

R² oznacza:

albo jego farmaceutycznie dopuszczalna sól Korzystnie R² oznacza:

₂ albo R oznacza:

Korzystnym związkiem według wynalazku jest:

kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]-fenylo]-3-[4-(trifluorometylo)fenylo]butanowy;

kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]-fenylo]-3-[4-[(N-metylo-N-fenyloamino)-karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]butanowy;

kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]-fenylo]-3-[4-[(morfolin-4-ylo)karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]butanowy;

kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]-fenylo]-3-[4-[[N-metylo-N-(2,2,2-trifluoro-etylo)amino]-karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]butanowy;

PL 200 404 B1 kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]-fenylo]-3-[4-(trifluorometylo)tiazol-2-ylo]butanowy;

kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]-fenylo]-3-(5-metylotiazol-2-ylo)butanowy; kwas (S)-3-(3-fluorofenylo)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)etoksy]fenylo]butanowy; kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]etoksy]-fenylo]-3-(pirydyn-3-ylo)butanowy; kwas (S)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]etoksy]-fenylo]-3-(pirydyn-3-ylo)butanowy; albo kwas (S)-3-(pirydyn-3-ylo)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)etoksy]fenylo]-butanowy; albo ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierają wyżej określony związek i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wyżej określonego związku jako leku.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wyżej określonego związku o wzorze (I) do wytwarzania leku do leczenia osteoporozy, albo do wytwarzania leku do hamowania angiogenezy, wzrostu nowotworu albo przerzutów nowotworu, albo do wytwarzania leku do leczenia miażdżycy tętnic, nawrotu zwężenia naczyń albo reumatoidalnego zapalenia stawów.

Wynalazek obejmuje również farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne i kompleksy związków według wynalazku. W przypadkach gdy związki według wynalazku mogą mieć jedno lub więcej centrów chiralności, jeżeli nie podano inaczej, wynalazek obejmuje każdy pojedynczy związek nieracemiczny, który może być otrzymany i rozdzielony zwykłymi technikami. Zgodnie z wynalazkiem konfiguracja (S) związków o wzorze (I) jest korzystna.

W przypadkach, gdy związki zawierają podwójne wią zania nienasycone wę giel-wę giel, zakres wynalazku obejmuje oba izomery cis (Z) i trans (E). W przypadkach, gdy związki mogą występować

O OR’ w postaciach tautomerycznych, takich jak tautomery ketoenolowe, takie jak i Aas, wszelkie postaci tautomeryczne należą do zakresu wynalazku, bez względu, czy istnieją w równowadze, czy są zablokowane w jednej postaci przez odpowiednie podstawienie grupą R'.

Związki o wzorze (I) hamują wiązanie witronektyny i innych peptydów zawierających RGD do receptora witronektynowego. Hamowanie receptora witronektynowego na osteoklasty hamuje osteoklastyczną resorpcję kości i jest użyteczne w leczeniu chorób, których patologia związana jest z resorpcją kości, jak osteoporoza oraz zapalenie kości i stawów.

Wynalazek ma zastosowanie w sposobie stymulowania tworzenia kości obejmującym podawanie związku, który powoduje wzrost uwalania osteokalcyny.

Zwiększone wytwarzanie kości jest oczywistą korzyścią w tych stanach chorobowych, w których występuje niedobór zmineralizowanej masy kostnej albo, gdy pożądane jest przemodelowanie kości, jak w leczeniu złamania kości albo zapobieganiu złamaniom kości. W chorobach i zaburzeniach metabolizmu, których skutkiem jest utrata struktury kostnej, takie leczenie również może być korzystne. Korzyści z podawania związku według wynalazku odnieść można, na przykład, w nadczynności przytarczyc, chorobie Pageta, hiperkalcemii będącej wynikiem nowotworu, osteolitycznym uszkodzeniu wywołanym metastazą kości, ubytku kości wywołanym unieruchomieniem lub deficytem hormonów płciowych, chorobie Behceta, demineralizacji kości, hiperostozie i marmurowatości kości.

Dodatkowo, ponieważ związki według wynalazku hamują receptory witronektynowe na wielu różnych typach komórek, to mogą być użyteczne w leczeniu schorzeń zapalnych, jak reumatoidalne zapalenie stawów i łuszczyca, oraz w chorobach sercowo-naczyniowych, takich jak miażdżyca tętnic i restenoza. Związki o wzorze (I) według wynalazku mogą być użyteczne do leczenia albo zapobiegania innym chorobom, obejmującym, między innymi, zaburzenia krzepnięcia, astmę, alergie, zespół ostrego wyczerpania oddechowego dorosłych, reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi, odrzucenie przeszczepu narządu, wstrząs septyczny, egzema, zapalenie skóry kontaktowe, zapalenie jelita i inne choroby autoimmunologiczne. Związki według wynalazku mogą być również użyteczne przy leczeniu ran.

Związki według wynalazku są również użyteczne w leczeniu i zapobieganiu schorzeniom angiogenicznym. Termin schorzenie angiogeniczne stosowany tutaj obejmuje stany związane z nieprawidłowym tworzeniem nowych naczyń. Gdy wzrost nowych naczyń krwionośnych jest przyczyną, albo bierze udział w patologii choroby, to hamowanie angiogenezy zmniejsza niekorzystne efekty choroby. Przykładem takiej choroby jest retynopatia cukrzycowa. Tam, gdzie wzrost nowych naczyń krwionośnych potrzebny jest do wspomagania wzrostu szkodliwej tkanki, hamowanie angiogenezy zmniejszy zaopatrzenie w krew tej tkanki, a przez to przyczynia się do redukcji masy tkanki opartej na wymogu dostaw krwi. Przykłady obejmują wzrost guzów, dla których powstawanie nowych naczyń jest ciągłą

PL 200 404 B1 koniecznością warunkującą wzrost guza, i powstawanie przerzutów guzów litych. Zatem, związki według wynalazku hamują angiogenezę tkanki guza, przez co zapobiegają przerzutom guza i wzrostowi guza.

Zatem, hamowanie angiogenezy przy użyciu związków według wynalazku może leczyć objawy choroby a w niektórych przypadkach może leczyć chorobę.

Kolejnym celem terapeutycznym dla związków według wynalazku są choroby oczne związane z tworzeniem nowych naczyń krwionoś nych. Takie choroby oczne obejmują zaburzenia rogówki zwią zane z tworzeniem nowych naczyń krwionośnych, jak przeszczep rogówki, zapalenie rogówki opryszczkowe, zapalenie rogówki na skutek kiły, skrzydlik i nowonaczyniowa łuszczka rogówki związana z użyciem soczewki kontaktowej.

Dodatkowe schorzenia oczne obejmują również związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej, przypuszczalną histoplazmozę oczną, fibroplazję pozasoczewkową i jaskrę nowonaczyniową.

Sposób hamowania wzrostu guza obejmuje podanie następcze albo w kombinacji związku o wzorze (I) i ś rodka przeciwnowotworowego, jak topotekan lub cysplatyna.

W przypadkach, w których związki wedł ug wynalazku mogą mieć jedno lub wię cej centrów chiralności, jeżeli nie podano inaczej to wynalazek obejmuje każdy pojedynczy związek nieracemiczny który może być otrzymany i rozdzielony zwykłymi technikami.

W przypadkach, gdy związki zawierają podwójne wią zania nienasycone węgiel-wę giel, zakres wynalazku obejmuje oba izomery cis (Z) i trans (E). Znaczenie dowolnego podstawnika w każdym dowolnym położeniu jest niezależne od jego znaczenia, albo znaczenia każdego innego podstawnika w dowolnej innej pozycji.

Do opisu związków według wynalazku stosowano skróty i symbole powszechnie stosowne w dziedzinie peptydów i w chemii. Ogólnie, skróty nazw aminokwasów zgodne są z IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, jak opisano w Eur. J. Biochem., 158, 9 (1984).

Grupa C1-4alkilowa oznacza tu ewentualnie podstawioną grupę alkilową zawierającą 1-4 atomy węgla, i obejmuje grupę metylową, etylową, n-propylową, izopropylową, n-butylową, izobutylową, i t-butylową. Dowolna grupa C1-4alkilowa może być ewentualnie podstawiona grupą R^x, która moż e występować na dowolnym atomie węgla, byleby tworzyła trwałą strukturę, i była możliwa do uzyskania na drodze konwencjonalnych technik syntetycznych. Odpowiednimi grupami R^x są grupa C1-4alkilowa, OR*, SR*, C1-4alkilosulfonylowa, C1-4alkilosulfoksylowa, -CN, N(R*)2, CH2N(R*)2, -NO2, -CF3, -CO2R*, -CON(R*)2, -COR*, -SO2N(R*)2, -NR*C(O)R*, F, Cl, Br, J albo CF3S(O)r-, gdzie r wynosi 0, 1 albo 2, a R* oznacza H, grupę C1-4alkilową, fenylową albo benzylową .

Atom fluorowca albo halogen oznacza F, Cl, Br oraz J.

Pewne grupy oznaczono w opisie skrótami, t-Bu oznacza trzeciorzędowy rodnik butylowy, Boc oznacza rodnik t-butoksykarbonylowy, Fmoc oznacza rodnik fluorenylometoksykarbonylkowy, Ph oznacza rodnik fenylowy, Cbz oznacza rodnik benzyloksykarbonylowy, Bn oznacza rodnik benzylowy, Me oznacza grupę metylową, Et - etylową, Ac - acetylową, Alk oznacza grupę C1-4alkilową, Nph oznacza grupę 1- albo 2-naftylową, a cHex oznacza grupę cykloheksylową. Tet oznacza 5-tetrazolil.

Pewne odczynniki oznaczone są w opisie skrótami. DCC oznacza dicykloheksylokarbodiimid, DMAP oznacza dimetyloaminopirydynę, DIEA oznacza diizopropyloetyloaminę, EDC oznacza chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodimidu. HOBt oznacza 1-hydroksybenzotriazol, THF oznacza tetrahydrofuran, DIEA oznacza diizopropyloetyloaminę, DEAD oznacza azodikarboksylan dietylu, PPh3 oznacza trifenylofosfinę, DIAD oznacza azodikarboksylan diizopropylu, DME oznacza dimetoksyetan, DMF oznacza dimetyloformamid, NBS oznacza N-bromocukcynimid, Pd/C oznacza katalizator, pallad na węglu, PPA oznacza kwas polifosforowy, DPPA oznacza azydek difenylofosforylu, BOP oznacza heksafluorofosforan benzotriazol-1-iloksy-tris(dimetyloamino)fosfoniowy, HF oznacza kwas fluorowodorowy, TEA oznacza trietyloaminę, TFA oznacza kwas trifluorooctowy, PCC oznacza chlorochromian pirydynowy.

Związki według wynalazku wytwarza się ogólnymi sposobami opisanymi na schematach I-VI.

PL 200 404 B1

SCHEMAT I

(a) CH3NH(OCH3)-HCl, EDC, HOBt-H2O, EtaN, DMF; (b) 4-bromobenzotrójfluorek, sec-BuLi, THF; (c) (EtO)2P(O)CH2CO2Et, NaH, toluen; (d) H2, 10% Pd/C, E-tOH; (e) BBr3, CH2Cl2; (f) 6-(metyloamino)-2-pirydyloetanol, DIAD, (Ph)3P, THF; (g) (g) 1,0 N NaOH, MeOH, następnie zakwaszenie.

Odpowiedni kwas alkoksyfenylooctowy, na przykład, kwas 4-metoksyfenylooctowy (I-1) przekształca się w pochodną deoksybenzoinową I-3 w reakcji odpowiedniego N-metoksy-N-metyloamidu (I-2) z aromatyczną pochodną metaliczną, zgodnie z ogólną metodą Winreba (Tetrahedron Lett., 1981, 22, 3815). Związek I-3 przekształca się w α,β-nienasycony ester I-4, na drodze znanej reakcji Wittiga. Optymalnie, reakcję prowadzi się przy użyciu fosfonooctanu trietylu w obecności odpowiedniej zasady, na ogół wodorku sodu lub bis(trimetylosililo)amidu litu w aprotonowym rozpuszczalniku takim jak toluen, THF, albo ich mieszaniny.

Redukcja grupy olefinowej związku I-4 optymalnie zachodzi na drodze uwodornienia w obecności katalizatora palladowego, na przykład palladu na aktywowanym węglu drzewnym, w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak EtOAc, MeOH, EtOH i i-PrOH lub ich mieszaninach. Eter metylowy I-5może być odszczepiony za pomocą trójbromku boru (BBr3) w biernym rozpuszczalniku, korzystnie CH2Cl2, albo etanotiolem (EtSH) i trójchlorkiem glinu (AlCl3) w rozpuszczalniku biernym, takim jak CH2Cl2. Inne użyteczne metody usuwania grupy ochronnej estru metylowego opisane są w pracy Greena „Protective Groups in Organic Synthesis (wydanej przez Wiley-Interscience). Otrzymany fenol I-6 poddaje się reakcji z 5-(metyloamino)-2-pirydyloetanolem w reakcji sprzęgania Mitsunobu (Organic Reactions, 1992, 42, 335-656; Synthesis 1981, 1-28) i otrzymuje się I-7. W reakcji pośredniczy kompleks tworzony między diestrem azodikarboksylanowym, takim jak azodikarboksylan dietylu albo azodikarboksylan diizopropylu i trifenylofosfina, i prowadzona jest ona w aprotonowym rozpuszczalniku, na przykład THF, CH2Cl2 lub DMF.

Ester etylowy związku I-7 poddaje się hydrolizie stosując wodną zasadę, na przykład LiOH w wodnym roztworze THF lub NaOH w wodnym roztworze metanolu lub etanolu, a przejściową sól karboksylanową zakwasza się odpowiednim kwasem, na przykład TFA lub HCl, co daje kwas karboksylowy I-8. Alternatywnie, pośrednia sól karboksylanowa może zostać wyizolowana, jeśli to pożądane, albo karboksylanowa sól wolnego kwasu karboksylowego może być wytworzona sposobami dobrze znanymi specjaliście.

PL 200 404 B1

(a) Chlorek triizopropylosililu, imidazol, DMF;

(b) 3-(benzyloksykarbonylo)-3-butenian metylu, Pd(OAc)2, P(tol)3, (i-Pr)2NEt, propiononitryl; (c)

H₂, 10% Pd/C, EtOAc; (d) chlorowodorek estru benzylowego seryny, EDC, HoBtH₂O, Et₃N, DMF; (e) odczynnik Burgessa, THF; (f) Cl3CBr, DBU, CH2Cl2; (g) TBAF, THF; (h) (Boc)2O, pirydyna, THF; (i) H2, 10% Pd/C, EtOH; (j) N-metyloaminilina, EDC, BPFFH, (i-Pr)2NEt, pirydyna, DMF; (k) 4N HCl/dioksan; (l) 6-(metyloamino)-2-pirydyloetanol, DIAD, (Ph)3P, THF; (m) LiOH, THF, H2O, po czym zakwaszenie.

Pochodną halogenofenolu, na przykład 4-bromofenol (II-1), przekształca się w odpowiednio chronioną pochodną, na przykład 4-bromo-1-(triizopropylosililoksy)benzen (II-2). Grupa ochronna fenolu musi być dostosowana do dalszych reakcji, jak również ma mieć możliwość selektywnego jej usunięcia w odpowiednim momencie. Sposoby ochrony fenoli opisane są w zwykłych odnośnikach, takich jak Greene, „Protective Groups in Organic Synthesis (wydane przez Wiley-Interscience). Związek II-2-reaguje z 3-(benzyloksykarbonylo)-3-butenianem metylu w reakcji typu Hecka (patrz Heck,

PL 200 404 B1

Org. Reactions 1982, 27, 345) i otrzymuje się II-3. W reakcji pośredniczy pallad (0), i na ogół prowadzi się ją w biernym rozpuszczalniku, takim jak CH3CN, propiononitryl lub toluen, w obecności odpowiedniego zmiatacza kwasu, takiego jak trietyloamina (Et3N) albo diizopropyloetyloamina ((i-Pr)2NEt). Typowym źródłem palladu (0) jest octan palladu (II) (Pd(OAc)2) i chlorek palladu (II) (PdCl2), a często dołączone są ligandy fosfinowe, na przykład trifenylofosfina (PPh3) albo tri-orto-tolilofosfina (P(tol)3).

α,β-nie-nasycony ester II-3 redukuje się do nasyconego związku II-4 w reakcji z gazowym wodorem w obecności odpowiedniego katalizatora, korzystnie metalicznego palladu na aktywowanym węglu (Pd/C) w biernym rozpuszczalniku, na ogół MeOH, EtOH, EtOAc lub ich mieszaninie. Kwas karboksylowy II-4 przekształca się w postać aktywną przy użyciu, na przykład EDC i HOBt, SOCl2 albo 1,1'-karbonylodiimidazolu (CDI), po czym aktywna postać reaguje z odpowiednią aminą, na przykład estrem benzylowym seryny w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak DMF, co daje II-5. W zależności od tego, czy potrzebne jest zobojętnienie kwasu, dodaje się zasadę, taką jak trietyloamina (Et3N), diizopropyloetyloamina ((i-Pr)2NEt) albo pirydyna. Znanych jest wiele dodatkowych metod przekształcenia kwasu karboksylowego w amid, i mogą być one znalezione w standardowych odnośnikach, takich jak „Compendium of Organic Synthetic Methods” Vol. I-VI (wydana przez Wiley-Interscience) albo Bodansky, „The Practice of Peptide Synthesis” (wydana przez Springer-Verlag). II-5 przekształca się następnie w pochodną oksazolową II-7-. Znanych jest kilka metod przekształcenia amidoalkoholi w oksazole (Meyers, Tetrahedron 1994, 50, 2297-2360; Wipf, J. Org. Chem., 19893, 58, 3604-3606). Na przykład, amidoalkohol II-5- może być przekształcony najpierw w oksazolinę II-6. Transformacji tej dokonuje się na ogół w warunkach odwadniających, takich jak reakcja z odczynnikiem Burgessa w THF. Oksazoline II-6 utlenia się następnie do oksazolu II-7-, stosując, na przykład, bromotrichlorometan i BDU w CH2Cl2 (Williams, Tetrahedron Letters 1997,38,331-334) lub CuBr2 i DBU w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak EtOIAc/CHCl3 lub CH2Cl2 (Barrish, J. Org. Chem. 1993, 58, 44944496). Usunięcie ochronnej grupy sililowej w standardowych warunkach fluorkowych (patrz Greene powyżej) daje fenol II-8, który przekształca się w pochodną węglanu tert-butylu II-9 przy użyciu diwęglanu di-tert-butylu w obecności zasady, na ogół pirydyny, w polarnym obojętnym rozpuszczalniku, takim jak THF. Tę nową grupę ochronną wybiera się, jak podano powyżej. Związek II-9 przekształca się w pochodną kwasu karboksylowego II-10 przez uwodornienie, jak opisano powyżej, a II-10 przekształca się w amid II-11 zgodnie z ogólną metodą Caprino i Aymana (J. Am Chem. Soc., 1995, 117, 5401-5402). W tych warunkach kwas karboksylowy II-10 poddaje się reakcji z odpowiednią aminą, na przykład N-metyloaniliną, w obecności heksafluorofosforanu bis(tetrametyleno)fluoroformamidynowego (BPFFH) i odpowiedniej zasady, na ogół Et3N, (i-Pr)2NEt, pirydyny albo ich mieszanin, w polarnym, obojętnym rozpuszczalniku, takim jak DMF. Karbaminianowa tert-butoksylowa grupa ochronna usuwana jest w standardowych kwaśnych warunkach (patrz Greene powyżej), a otrzymany fenol II-12 przekształca się w II-14 sposobem opisanym na schemacie I.

SCHEMAT III

PL 200 404 B1 (a) EtOH, temp. wrzenia; (b) 4-(benzyloksy)benzaldehyd, NaOEt, EtOH; (c) Al2O3, Na-OCl,

CH3CN; (d). EtaSiH, BF3.OEt2, CH2Cl2; (e) n-Bu4NF, THF; (f) (EtO)2 P(=O)CH2CO2Et, NaH, THF, temp. wrzenia; (g) Mg, MeOH; (h) BF₃OEt₂, EtSH; (i) 6-(metyloamino)-2-pirydyloetanol, DIAD, (Ph)₃P, THF; (j) LiOH, THF, H2O, po czym zakwaszenie.

Pochodną tiazolu III-3 wytwarza się przez kondensację 2-cyjanoacetamidu (III-1) i 3-bromo-1,1,1-trifluoroacetonu (III-2) we wrzącym etanolu, przez odpowiednią modyfikację procedury Schaefera i Gewalda (J. Prkat. Chem., 1974, 316, 684-692) wytwarzania 4-fenylo-2-(cyjanometylo)tiazolu. Kondensacja aldolowa III-3 z odpowiednio podstawioną pochodną benzaldehydu, na przykład 4-(benzyloksy)benzaldehydem, daje III-4. Reakcję katalizuje odpowiednia zasada, korzystnie etanolan sodu, i prowadzi się ją w polarnym rozpuszczalniku, na ogół etanol. Epoksydowanie III-4 w celu otrzymania III-5 prowadzi się za pomocą podchlorynu sodu w obecności obojętnego tlenku glinu, zgodnie z ogólną metodą Foucauda (Synthesis 1987, 9, 854-856). Inne znane warunki epoksydowania, takie jak mCPBA, zasadowy nadtlenek wodoru, albo zasadowy nadtlenek tert-butylu, mogą być również stosowane, o ile warunki są zgodne z grupami funkcyjnymi substratu. Po podziałaniu trietylosilanem w obecności odpowiedniego kwasu Lewisa, takiego jak BF₃OEt₂ albo odpowiedniego kwasu protonowego, na przykład, TFA lub HCl, pierścień epoksydowy związku III-5-otwiera się redukcyjnie, w wysoko regioselektywny sposób, co daje keton III-6-, wraz z odpowiednią cyjanohydryną, trimetylosililową związku III-6. Tę cyjanohydrynę dogodnie przekształca się w keton III-6 przez podziałanie fluorkiem tetrabutyloamonowym w aprotonowym rozpuszczalniku, na ogół THF. Ten keton reaguje w reakcji typu Wittiga z fosfonooctanem trietylu, w obecności odpowiedniej zasady, na przykład LiN(TMS)₂ lub NaH w polarnym, aprotonowym rozpuszczalniku, korzystnie THF, co daje α,β-nienasycony ester III-7- w postaci mieszaniny izomerycznych olefin. W reakcji z metalicznym magnezem w MeOH olefina III-7 ulega selektywnej redukcji i daje nasyconą pochodną III-8. Ester etylowy przekształca się w tych warunkach w ester metylowy. Usunięcie grupy benzylowej prowadzi się za pomocą etanotiolu i BF3OEt₂/ co daje fenol III-9, który przekształca się w III-10 sposobem opisanym w schemacie I.

SCHEMAT IV

S

(a) BnCl, K2CO3, aceton; (b) 5-metylotiazol, n-BuLi, THF; (c) (EtO)2P(=O)CH2CO2Et, NaH, THF; (d) Mg, MeOH; (e) BF₃OEt₂, EtSH; (f) 6-(metyloamino)-2 -pirydyloetanol, DIAD, (Ph)₃P, THF; (g) LiOH, THF, H2O, po czym zakwaszenie.

Grupę fenolową dostępnego w handlu 4-hydroksyfenylooctanu metylu (IV-1) zabezpiecza się odpowiednią grupą ochronną, na przykład w postaci eteru metylowego, eteru benzylowego albo eteru triizopropylosililowego. Ochrona fenoli jest dobrze znana w tej dziedzinie i odpowiednie grupy ochronne opisane są w standardowych odsyłaczach, takich jak Greene „Protective Grous in Organic Synthesis” (wydana przez Wiley-Interscience). Otrzymany związek (IV-2) poddaje się reakcji z odpowiednim odczynnikiem Grignarda lub litoorganicznym, co daje ketony. Na przykład 2-lito-5-metylotiazol, wytworzony z 5-metylotiazolu i n-butylolitu reaguje z IV-1- w rozpuszczalniku eterowym, takim jak THF lub DME i daje pochodną ketonową IV-3. Keton ten przekształca się w IV-6 sposobem opisanym na schemacie III.

PL 200 404 B1

SCHEMAT V

(a) TBDMSCl, KCN, ZnJ2, CH3CN; (b) LDA, THF, następnie chlorek 4-benzyloksybenzylu; (c) TBAF, THF; (d) (EtO)2P(=O)CH2CO2Et, NaH, THF; (e) H2, Pd/C, E-tOH; (f) 6-(metyloamino)-2-pirydyloetanol, DIAD, (Ph)3P, THF; (g) LiOH, THF, H2O, po czym zakwaszenie.

Wybrany aldehyd aromatyczny, na przykład 3-pirydynokarboksyaldehyd (V-1) przekształca się w zabezpieczoną grupą sililową cyjanohydrynę, taką jak V-2 w reakcji z jonem cyjankowym w obecności odpowiedniego halogenku sililu, na przykład chlorku trimetylosililu (TMSCl), chlorku triizopropylosililu (TIPSCl) albo chlorku tert-butylodimetylosililu (TBDMSCl lub TBSCl). Typowe źródła jonu cyjankowego obejmują cyjanek potasu (KCN), cyjanek sodu (NaCN) i cyjanek tetrabutyloamonowy (BU4NCN). Reakcję często prowadzi się w obecności katalitycznej ilości kwasu Lewisa, na ogół ZnJ2, i korzystny jest polarny, aprotonowy rozpuszczalnik, taki jak acetonitryl (CH3CN). Inne chronione cyjanohydryny, na przykład, chroniona grupą etoksyetylową cyjanohydryna może być stosowana, o ile grupa ochronna jest zgodna z dalszymi procesami i może być w razie potrzeby selektywnie usunięta. Opis grup ochronnych znaleźć można w standardowych odnośnikach, takich jak Greene, „Protective Groups in Organic Synthesis” (wydana przez Wiley-Interscience). Związek V-2 C-alkiluje się za pomocą odpowiedniego halogenku benzylu, na przykład chlorku 4-benzyloksybenzylu, i otrzymuje się V-3. Reakcja wymaga początkowego deprotonowania w celu uzyskania pośredniego anionu, którego nie izoluje się, ale poddaje reakcji in situ ze środkiem alkilującym. Typowe zasady do reakcji tego typu obejmują diizopropyloamid litu (LDA) i heksametylodisilazydek litu (LiN(TMS)2), i korzystne są polarne, aprotonowe rozpuszczalniki, takie jak THF lub DME. TBS-cyjanohydrynę V-3 przekształca się dogodnie w keton V-4 w reakcji z fluorkiem tetrabutyloamonowym (TBAF). Do tej transformacji stosuje się również procedurę dwuetapową. Na przykład sililowa grupa ochronna związku V-3 może być usunięta w warunkach kwaśnych, jak w reakcji z HF, i otrzymuje się cyjanohydrynę, którą przekształcić moż na w keton V-4 w reakcji z odpowiednią zasadą. Związek V-4 przekształca się w α,β-nienasycony ester V-5, na drodze znanej reakcji Wittiga. Zwykle, reakcję prowadzi się z użyciem fosfonooctanu trietylu w obecności odpowiedniej zasady, na ogół wodorku sodu (NaH) albo LiN(TMS)2, w aprotonowym rozpuszczalniku, takim jak toluen, THF lub ich mieszaniny. Redukcję grupy olefinowej związku V-5 optymalnie przeprowadza się przez uwodornienie w obecności katalizatora palladowego, na przykład palladu na aktywowanym węglu drzewnym, w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak EtOAc, MeOH, EtOH, i-PrOH i ich mieszaniny. W tych warunkach benzyIowa grupa ochronna w fenolu również jest usuwana. Otrzymany fenol V-6 poddaje się reakcji z 6-(metyloamino)-2-pirydyloetanolem w reakcji sprzęgania Mitsunobu (Organic Reactions, 1992, 42, 335-656; Synthesis 1981, 1-28) i otrzymuje się V-7. W reakcji pośredniczy kompleks tworzony między diestrem azodikarboksylanowym, takim jak azodikarboksylan dietylu albo azodikarboksylan diizopropylu i trifenylofosfiną, i prowadzona jest ona

PL 200 404 B1 w aprotonowym rozpuszczalniku, na przykład THF, CH2Cl2 lub DMF. Ester etylowy związku V-7 poddaje się hydrolizie stosując wodną zasadę, na przykład LiOH lub NaOH w wodnym roztworze dioksanu, THF, metanolu lub etanolu, a przejściową sól karboksylanową zakwasza się odpowiednim kwasem, na przykład TFA lub HCl, co daje kwas karboksylowy V-8. Jeśli to pożądane, pośrednia sól karboksylanowa może zostać wyizolowana. Dodatkowo, odpowiednie sole karboksylanowe kwasu karboksylowego lub aminy mogą zostać wytworzone sposobami dobrze znanymi specjaliście.

SCHEMAT VI

(a) chlorek akryloilu, (i-Pr)2NEt, CuCl, CH2Cl2; (b) 3-bromopirydyna, Pd(OAc)2, P(tol)3, (i-Pr)2NEt, DMF; (c) chlorek 4-metoksybenzylomagnezu, ZnJ2, CuBr.DMS, THF, toluen; (d) NaOEt, THF; (e) AlCl3, EtSH, CH2Cl2; (f) 6-(metyloamino)-pirydyloetanol, DIAD, (Ph)3P, THF; (g) NaOH, dioksan, H2O, po czym zakwaszenie.

Dostępny w handlu (4S, 5R)-1,5-dimeylo-4-fenylo-2-imidazolidynon (VI-1) poddaje się reakcji z odpowiednim α,β-nienasyconym chlorkiem kwasowym, na przykład chlorkiem akryloilu, i otrzymuje się imid VI-2. W reakcji pośredniczy odpowiednia zasada, zwykle trietyloamina (Et3N) lub diizopropyloetyloamina ((i-Pr)2NEt), i prowadzi się ją w obecności katalitycznej ilości halogenku miedziawego, na przykład chlorku miedzi (I). Korzystny jest obojętny rozpuszczalnik, taki jak CH2Cl2. Związek VI-2 reaguje z odpowiednim halogenkiem arylu, takim jak 3-bromopirydyna w reakcji typu Hecka (patrz, Heck Org. Reactions, 1982, 27, 345) i otrzymuje się związek VI-3. W reakcji pośredniczy pallad(O), i na ogół prowadzi się ją w biernym rozpuszczalniku, takim jak CH3CN, propiononitryl, toluen lub DMF w obecności odpowiedniego zmiatacza kwasu, takiego jak trietyloamina (Et3N) albo diizopropyloetyloamina ((i-Pr)2NEt). Typowym źródłem palladu (0) jest octan palladu (II) (Pd(OAc)2) i chlorek palladu (II) (PdCl2), a często dołączone są ligandy fosfinowe, na przykład trifenylofosfina (PPh3) albo triortotolilofosfina (P(tol)3). Związek VI-3 reaguje ze związkiem miedzioorganicznym w reakcji 1,4-addycji i otrzymuje się sprzężony produkt addycji VI-4 (patrz Melbyk, O.; Sthepan, E.; Pourcelot, G.; Cresson, P. Tetrahedron 1992, 48, 841-850; Bongini, A.l Cardillo, G.; Mingardi, A.; Tomasini, C.; Tetrahedron Asymmetry 1996, 7, 1457-1466; van Heerden, P.S.; Bezuidenhoudt, B.C.B.; Ferreira, D. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 1821-1824. Przegląd reakcji związków miedzioorganicznych znaleźć można w Posner, G. Organic Reactions 1972, 19, 1-113; Lipshutz, B. Organic Reactions 1992, 41, 135-631). Tworzenie związku miedzioorganicznego może być dokonane przez dodanie odczynnika litoorganicznego lub magnezoorganicznego, na przykład chlorku 4-metoksybenzylomagnezu do źródła miedzi (I), na przykład CuCl, CuBrOMS lub CuJ, w biernym rozpuszczalniku, takim jak Et₂O, THF, DME, toluen lub ich mieszaniny. Diastereoselektywność reakcji może być poprawiona przez pewne kwasy Lewisa, na

PL 200 404 B1 przykład MgBr2, Bu2BOTf lub ZnJ2. Pomocnik chiralny związku VI-4 usuwany jest dogodnie na drodze etanolizy w warunkach zasadowych. Na przykład, podziałanie na VI-4 etanolanem sodu w THF daje VI-5. Ester metylowy VI-5 może być odszczepiony trójbromkiem boru (BBr3) w biernym rozpuszczalniku, korzystnie CH2Cl2, albo etanotiolem (EtSH) i trójchlorkiem glinu (AlCl3) w rozpuszczalniku biernym, takim jak CH2Cl2, w wyniku czego otrzymuje się fenol VI-6. Inne użyteczne metody usuwania grupy ochronnej estru metylowego opisane są w standardowych odnośnikach (patrz schemat V). Fenol VI-6 przekształca się w VT-8 jak opisano na schemacie V.

Odczynniki sprzęgające amidy, stosowane w niniejszym opisie, oznaczają odczynniki, które mogą być stosowane do tworzenia wiązania peptydowego. Typowe metody sprzęgania wykorzystując karbodiimidy, aktywne bezwodniki i estry i halogenki acylowe. Typowe odczynniki to: EDC, DCC, DPPA, odczynnik BOP, HOBt, N-hydroksysukcynimid i chlorek oksalilu.

Metody sprzęgania prowadzące do powstania wiązania peptydowego są dobrze znane w tej dziedzinie. Sposoby syntezy peptydów ogólnie podane zostały przez Bodansky'ego i wsp., The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin, 1984, Ali i wsp., J. Med. Chem., 29, 984 (1986) i J. Med. Chem., 30, 2291 (1987) i ogólnie ilustrują one technikę i wprowadzone są tu na zasadzie odniesienia.

Zwykle aminę lub anilinę sprzęga się przez jej wolną grupę aminową z odpowiednim kwasem karboksylowym, przy użyciu odpowiedniego karbodiimidowego odczynnika sprzęgającego, takiego jak N,N'-dicykloheksylokarbodiimidu (DCC), ewentualnie w obecności katalizatora, takiego jak 1-hydroksybenzotriazol (HOBt) i dimetyloaminopirydyna (DMAP). Inne metody, takie jak tworzenie estrów aktywnych, bezwodników halogenków kwasowych wolnych lub odpowiednio zabezpieczonych kwasów karboksylowych, i dalszej reakcji z wolną grupą aminową odpowiednio chronionej aminy, ewentualnie w obecności zasady są również odpowiednie. Na przykład chroniony Boc-aminokwas albo kwas Cbz-amidynobenzoesowy traktowany jest w bezwodnym rozpuszczalniku, takim jak chlorek metylenu albo tetrahydrofuran (THF) w obecności zasady, takiej jak N-metylomorfolina, DMAP lub trialkiloamina, za pomocą chloromrówczanu izobutylu w celu utworzenia „bezwodnika aktywnego”, który następnie poddaje się reakcji z wolną grupą aminową drugiego chronionego aminokwasu lub aniliny.

Użyteczne związki pośrednie do wytwarzania związków o wzorze, w których R2 oznacza benzimidazol ujawnione są w Nestor i wsp., J. Med. Chem., 1984, 27, 320. Reprezentatywne metody wytwarzania pochodnych benzimidazolowych użytecznych jako związki pośrednie w niniejszym wynalazku są również znane w tej dziedzinie i mogą być znalezione, na przykład, w EP-A 0 381 033.

Sole addycyjne z kwasami związków wytwarza się zwykłym sposobem w odpowiednim rozpuszczalniku z rodzimych związków i nadmiaru kwasu, takiego jak kwas chlorowodorowy, bromowodorowy, fluorowodorowy, siarkowy, fosforowy, octowy, trifluorooctowy, maleinowy, bursztynowy albo metanosulfonowy. Pewne związki tworzą sole wewnętrzne albo jony obojnacze, które mogą być dopuszczalne. Sole kationowe wytwarza się przez traktowanie związków rodzimych nadmiarem odczynnika alkalicznego, takiego jak wodorotlenek, węglan albo alkoholan, zawierającego odpowiedni kation; lub odpowiednią aminą organiczną. Konkretnymi przykładami kationów, które są obecne w farmaceutycznie dopuszczalnych solach są: Li⁺, Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ i NH₄ ⁺.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek o wzorze (I) i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. W związku z tym związek o wzorze (I) może być stosowany do wytwarzania leku. Kompozycje farmaceutyczne związków o wzorze (I) wytworzonego jak opisano powyżej mogą mieć postać roztworów lub liofilizowanych proszków do podawania pozajelitowego. Proszki mogą być odtworzone przez dodanie przed użyciem odpowiedniego rozcieńczalnika lub innego farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika. Preparaty ciekłe mogą być buforowanymi, izotonicznymi, wodnymi roztworami. Przykładami odpowiednich rozcieńczalników są zwykłe izotoniczne roztwory soli, standardowa 5% dekstroza w wodzie albo buforowe roztworu octanu sodu albo amonu. Takie preparaty są szczególnie odpowiednie do stosowania pozajelitowego, ale mogą być również stosowane do podawania doustnego, albo zawarte w odmierzonej dawce inhalatora albo nebulizera do wdychania. Pożądane może być dodawanie rozczynników, takich jak poliwinylopirolidon, żelatyna, hydroksyceluloza, guma arabska, glikol polietylenowy, mannitol, chlorek sodu lub cytrynian sodu.

Alternatywnie, związki te mogą zostać zamknięte w kapsułce, uformowane w tabletkę albo przygotowane w emulsji lub syropie do podawania doustnego. Farmaceutycznie dopuszczalne stałe lub ciekłe nośniki mogą być dodane w celu poprawy lub stabilizacji kompozycji, albo dla ułatwienia wytwarzania kompozycji. Stałe nośniki obejmują skrobię, laktozę, dwuwodzian siarczanu wapnia, kaolin, stearynian magnezu lub kwas stearynowy, talk, pektyny, gumę arabską, agar lub żelatynę. Ciekłe nośniki obejmują syrop, olej arachidowy, olej z oliwek, sól fizjologiczną i wodę. Nośniki może również

PL 200 404 B1 zawierać materiał zawieszony, taki jak monostearynian glicerylu lub distearynian glicerylu, sam lub w wosku. Ilość stałego nośnika zmienia się, ale korzystnie wynosi pomiędzy około 20 mg do około 1 g na dawkę jednostkową. Preparaty farmaceutyczne wytwarza się zwykłymi metodami farmacji, obejmującymi mielenie, mieszanie, granulowanie i prasowanie, gdy to konieczne, przy tworzeniu tabletki; lub mielenie, mieszanie i wypełnianie, przy tworzeniu kapsułek z twardej żelatyny. Gdy stosowany jest nośnik ciekły, preparat ma postać syropu, eliksiru, emulsji albo zawiesiny wodnej lub niewodnej. Takie ciekłe preparaty mogą być podawane bezpośrednio doustnie lub umieszczane w miękkich kapsułkach żelatynowych.

Do podawania doodbytniczego związki według wynalazku mogą być mieszane z rozczynnikami, takimi jak masło kakaowe, gliceryna, żelatyna lub glikole polietylenowe i formowane w czopki.

Związki opisane tu są antagonistami receptora witronektynowego i są użyteczne do leczenia chorób, których patologia związana jest z ligandem lub komórką, która oddziałuje z receptorem witronektynowym. Na przykład związki te są użyteczne do leczenia chorób, których powodem jest ubytek substancji międzykomórkowej kości. Zatem niniejsze związki są użyteczne w leczeniu osteoporozy, nadczynności przytarczyc, choroby Pageta, hiperkalcemii będącej wynikiem nowotworu, osteolitycznego uszkodzenia wywołanego metastazą kości, ubytku kości wywołanego unieruchomieniem lub deficytem hormonów płciowych. Uważa się, że związki według wynalazku są również użyteczne jako środki przeciwnowotworowe, przeciw angiogenezie, przeciwzapalne i przeciw metastazie i mogą być użyteczne w leczeniu miażdżycy tętnic i restenozy.

Związek podaje się doustnie lub pozajelitowo pacjentowi w taki sposób, aby stężenie leku było odpowiednie do zahamowania resorpcji kości lub do innego celu. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek podawany jest w dawce doustnej o wielkości pomiędzy około 0,1 a około 50 mg/kg w sposób odpowiadają cy stanowi pacjenta. Korzystnie dawka doustna wynosi okoł o 0,5 do okoł o 20 mg/kg. W leczeniu stanów ostrych korzystne jest podawanie pozajelitowe. Wlew dożylny peptydu w 5% dekstrozie w wodzie lub soli fizjologicznej lub preparat podobny z odpowiednimi rozczynnikami jest najskuteczniejszy, jednak użyteczna jest również duża iniekcja domięśniowa. Zwykle dawka pozajelitowa wynosi około 0,01 do około 100 mg/kg; korzystnie pomiędzy 0,1 a 20 mg/kg. Związki podawane są jeden do czterech razy dziennie, w ilości umożliwiającej uzyskanie całkowitej dawki dziennej wynoszącej około 0,4 do około 400 mg/kg/dzień. Dokładna ilość i sposób podawania związku łatwo określi specjalista w tej dziedzinie, przez porównanie zawartości środka we krwi ze stężeniem potrzebnym do uzyskania działania leczniczego.

Sposób leczenia osteoporozy lub hamowania ubytków kości, obejmuje podanie kolejno lub w kombinacji zwią zku o wzorze (I) i innych inhibitorów resorpcji koś ci, takich jak bisfosfoniany (czyli allendronat), zastępczej terapii hormonalnej, anty-estrogenów lub kalcytoniny. Dodatkowo sposób leczenia wykorzystuje związek według wynalazku i środek anaboliczny, jak białko morfogenezy kości, ipoflawon, użyteczny w zapobieganiu ubytkom kości i/lub do zwiększania masy kostnej.

Sposób hamowania wzrostu guza, obejmuje podawania kolejno albo w kombinacji związku o wzorze (I) i ś rodka przeciwnowotworowego. Znaną grupą ś rodków przeciwnowotworowych jest klasa analogów kamptotecyny, jak topotekan, irynotekan, 9-aminokamptotecyna i kompleksy koordynacyjne platyny, jak cysplatyna, ormaplatyna i tetraplatyna. Związki z klasy analogów kamptotecyny opisane są w opisach patentowych USA o numerach US-5004758, US-4604463, US-4473692, US-4545880, US-4342776, US-4513138, US-4399276, europejskich zgłoszeniach patentowych EP-0418099 i EP-0088642, Wani i wsp., J. Med. Chem., 1986, 29, 2358, Wani i wsp., J. Med. Chem., 198, 23, 554, Wani i wsp., J. Med. Chem., 1987, 30 1774 i Nitta i wsp., Proc. 14th International Congr. Chemotherapy., 1985, Anticancer Section 1, 28, które w całości są wprowadzone jako odnośniki literaturowe. Kompleks koordynacyjny platyny, cysplatyna dostępny jest pod nazwą Platinol® z firmy Bristol MyersSquibb Corporation. Użyteczne preparaty cysplatyny opisane są w opisach patentowych US-5562925 i US-4310515, które w całości wprowadza się jako odnośniki literaturowe.

W sposobie hamowania wzrostu guza, obejmują cym podawania kolejno lub w kombinacji związku o wzorze (I) i środka przeciwnowotworowego, związek koordynacyjny platyny, na przykład, cysplatyna, może być podawany przy użyciu wolnego wlewu dożylnego. Korzystnym nośnikiem jest roztwór dekstrozy/soli fizjologicznej zawierający mannitol. Schemat dawek związku koordynacyjnego platyny może wynosić od około 1 do około 500 mg na metr kwadratowy (mg/m²) powierzchni ciała na cykl leczenia. Wlew związku koordynacyjnego platyny może być podawany jeden do dwóch razy w tygodniu, a tygodniowe cykle mogą być powtarzane kilka razy. Stosując związek z klasy analogów kaptotecyny w podawaniu pozajelitowym, tryb terapii na ogół wykorzystuje od około 0,1 do 300,0 mg/m² powierzchni ciała na dzień, przez około pięć kolejnych dni. Najkorzystniej tryb terapii stosowany dla topotekanu wynosi

PL 200 404 B1 od około 1,0 do około 2,0 mg/m² powierzchni ciała na dzień przez około pięć kolejnych dni. Korzystnie tryb terapii powtarza się co najmniej raz po około siedmio- do dwudziestoośmiodniowej przerwie.

Kompozycja farmaceutyczna może być wytworzona ze związku o wzorze (I) i środka przeciwnowotworowego w tym samym zbiorniku, ale korzystnie są to różne zbiorniki. Gdy oba środki dostarczane są w postaci roztworów, mogą być one zawarte w układzie wlewu/iniekcji do podawania jednoczesnego albo jeden za drugim.

Dla wygody podawania związku o wzorze (I) i środka przeciwnowotworowego w tym samym czasie lub nie, wytwarza się zestaw, zawierający, w pojedynczym pojemniku, na przykład pudełku, opakowaniu kartonowym lub w innym zbiorniku, pojedyncze butelki, torby, fiolki lub inne zbiorniki, z których każdy zawiera skuteczną ilość związku o wzorze (I) do podawania pozajelitowego, jak opisano powyżej, i skuteczną dawkę środka przeciwnowotworowego do podawania pozajelitowego, jak opisano powyżej. Taki zestaw zawiera, na przykład, oba środki farmaceutyczne w oddzielnych pojemnikach albo w tym samym pojemniku, ewentualnie jako liofilizowane wkłady, i zbiorniki z roztworami do ich odtworzenia. Jedna z wersji tego zestawu zawiera roztwór do odtworzenia i liofilizowany wkład w dwóch komorach pojedynczego zbiornika, które mogą zostać zmieszane przed zastosowaniem. W takim układzie środek przeciwnowotworowy i związek według wynalazku mogą być spakowane oddzielnie, tak jak w dwóch pojemnikach, albo zliofilizowane razem, jako proszki i dostarczone w jednym pojemniku.

Gdy oba środki dostarczone są w postaci roztworów, mogą być one zawarte w układzie wlewu/iniekcji do podawania jednoczesnego albo jeden za drugim. Na przykład, związek o wzorze (I) może być w postaci do zastrzyków dożylnych albo w torbie do wlewu, połączonych rurkami w serię ze środkiem przeciwnowotworowym zawartym w drugiej torbie do wlewu. Przy stosowaniu takiego układu pacjent otrzymuje początkową dużą iniekcję lub wlew związku o wzorze (I), a następnie wlew środka przeciwnowotworowego.

Związki mogą być testowane jednym z kilku testów biologicznych w celu określenia stężenia związku, które jest konieczne do uzyskania efektu farmakologicznego.

Hamowanie wiązania witronektyny

Wiązanie do a_ve₃ [³H]-SK&F-107260 na nośniku: a_ve₃ z ludzkiego łożyska lub płytki krwi (0,10,3 mg/ml) w buforze T (zawierającym 2 mM CaCl2 i 1% oktyloglukozydu) rozcieńczono buforem T zawierającym 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2 (bufor A) i 0,05 NaN3, po czym natychmiast dodano do 96-cio studzienkowych płytek ELISA (Corning, New York, NY) przy 0,1 ml na studzienkę. Dodano 0,1-0,2 μg a_ve₃ na studzienkę. Płytki inkubowano przez noc w 4°C. Podczas eksperymentu studzienki przemyto raz buforem A i inkubowano z 0,1 ml 3,5% albumin osocza wołu w tym samym buforze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji studzienki całkowicie odessano i przemyto dwa razy 0,2 ml buforu A.

Związki rozpuszczono w 100% DMSO i otrzymano 2 mM roztwór wyjściowy, który rozcieńczany buforem wiążącym (15 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2) do ostatecznego stężenia 100 μM. Ten roztwór następnie rozcieńczano do pożądanego stężenia końcowego związku. Do studzienek dodano różne stężenia nieznakowanych antagonistów (0,001-100 μM) w trzech powtórzeniach, po czym dodano 5,0 nM [³H]-SK&F-107260 (65-86 Ci/mmol).

Płytki inkubowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Po inkubacji studzienki odessano całkowicie i przemyto raz 0,2 ml lodowatego buforu A, ze studzienki do studzienki. Receptory rozpuszczono w 0,1 ml 1% SDS i określano wiązanie [³H]-SK&F-107260 za pomocą cieczowego licznika scyntylacyjnego z dodaniem 3 ml Ready Safe w Beckamn LS Liquid Scintillation Counter, z 40% skutecznością. Nieswoiste wiązanie [³H]-SK&F-107260 określano w obecności 2 μM SK&F-107260, i było ono konsekwentnie niższe niż 1% całkowitego wkładu radioligandu. IC50 (stężenie antagonisty do hamowania 50% wiązania [³H]-SK&F-107260) określono metodą nieliniowego pasowania krzywej metodą najmniejszych kwadratów, modyfikowaną programem LUNDON-2 Ki stała dysocjacji antagonisty) wyliczona została z równania: Ki = IC50/(1 + L/Kd), gdzie L i Kd oznaczają odpowiednio stężenie i stałą dysocjacji [³H] -SK&F-107260.

Związki według niniejszego wynalazku hamują wiązanie witronektyny do SK&F-107260 w stężeniu w zakresie około 0,060 do około 0,0005 mikromolarnym.

Związki według wynalazku testowano również pod względem resorpcji kości in vitro i in vivo w standardowych testach do oceniania hamowania tworzenia kości, takich jak test tworzenia wgłębienia, ujawniony w EP 528 587, który można również przeprowadzić stosując ludzkie osteoklasty w miejsce szczurzych osteoklastów i w modelu szczura po wycięciu jajników, opisanym przez Wroński i wsp., Cells and Materials 1991, Sup. 1, 69-74.

PL 200 404 B1

Test migracji komórek mięśni gładkich naczynia

Zastosowano szczurze albo ludzkie komórki aortalnego mięśnia gładkiego. Migrację komórek monitorowano w komorze hodowli tkanki Transwell stosując błonę poliwęglanową z porami 8 um (Costar). Dolna powierzchnia filtra była pokryta witronektyną. Komórki zawieszono w DMEM z dodatkiem

0,2% albumin osocza wołu, w stężeniu 2,5-5,0x10⁶ komórek/ml i traktowano wstępnie związkiem testowym w różnych stężeniach przez 20 minut w 20°C. Jako próbę ślepą zastosowano sam rozpuszczalnik 0,2 ml zawiesiny komórek umieszczono w górnym pomieszczaniu komory. Dolne pomieszczenie zawierało 0,6 ml DMEM wzbogaconego 0,2% albuminy osocza wołu. Inkubację prowadzono w 37°C w atmosferze 95% powietrza/5% CO2 przez 24 godziny. Po inkubacji komórki, które nie migrowały, z górnej powierzchni filtra usunięto przez ostrożne zdrapanie. Następnie filtr umieszczono w metanolu i barwiono 10% barwnikiem Giemsa. Migrację mierzono albo przez a) zliczenie licznych komórek, które przemigrowały do dolnej powierzchni filtra albo przez b) ekstrakcję zabarwionych komórek 10% kwasem octowym i zmierzenie absorbancji przy 600 nM.

Model szczura z wyciętą tarczycą i przytarczycami

Każda grupa testowa składała się z 5-6 dorosłych samców szczura Sprague-Dawley (250-400 g masa ciała). Szczurom wycięto tarczycę z przytarczycami (sprzedawca, Taconic Farms) 7 dni przed użyciem w teście. Wszystkie szczury otrzymały zastępczą dawkę tyroksyny co 3 dni. Po odbiorze szczurów zmierzono poziom obwodowego zjonizowanego wapnia we krwi pełnej, natychmiast po pobraniu przez nakłucie żyły ogonowej do heparynizowanych tubek. Szczur był włączany do testu, gdy poziom zjonizowanego Ca (zmierzony analizatorem pH wapnia model Ciba-Corning 634) wynosił <1,2 mM/l. Każdy szczur został zaopatrzony w założony na stałe cewnik żylny i tętniczy, w celu, odpowiednio, dostarczania substancji testowych i pobierania krwi. Następnie szczury poddano diecie bezwapniowej z wodą dejonizowaną. Zmierzono linię zerową Ca, po czym każdemu szczurowi podano kontrolnie nośnik lub ludzki hormon przytarczycy, 1-34 peptyd (hPTH1-34, dawka 1,25 ug/kg/godz. w soli fizjologicznej/0,1% albuminy osocza wołu. Bachem, Ca) albo mieszaninę hPTH1-34 i substancji testowej, przez ciągły wlew przez cewnik dożylny przy użyciu zewnętrznej strzykawki. Odpowiedź wapniową każdego szczura mierzono co dwie godziny podczas wlewu przez 6-8 godzin.

Test resorpcji i adhezji ludzkiego osteoklastu

Test resorpcji wgłębienia i adhezji opracowano i znormalizowano przy użyciu zwykłego ludzkiego osteoklastu pochodzącego z tkanki osteoklastomy. Test 1 opracowano w celu zmierzenia objętości wgłębień osteoklastu metodą konfokalnej laserowej mikroskopii. Test 2 opracowano jako wydajniejszy test skriningowy, w którym mierzy się fragmenty kolagenu (uwalniane w czasie resorpcji) metodą kompetycyjną ELISA.

Test 1 (wykorzystujący metodę konfokalnej laserowej mikroskopii)

Podwielokrotność zawiesiny komórek ludzkiej osteoklastomy usunięto z przechowalni w ciekłym azocie, ocieplono szybko do 37°C i przemyto x1 w pożywce RPMI-1640 przez odwirowanie (1000 obrotów na minutę, 5 min. w 4°C)

Odessano pożywkę i podstawiono mysie przeciwciało anty-HLA-DR, po czym rozcieńczono 1:3 w pożywce RPMI-1640. Zawiesinę inkubowano przez 30 minut w lodzie i co jakiś czas mieszano. Komórki przemyto x2 zimnym RPMI-1640, po czym odwirowano (1000 obrotów na min., 5 min. w 4°C) i komórki przeniesiono do sterylnych probówek o pojemności 15 ml. Liczbę komórek jednojądrzastych określono stosując ulepszoną komorę zliczeniową Neubauer.

Odpowiednie paciorki magnetyczne (5/komórkę jednojądrzastą) powleczone koźlim anty-mysim IgG (Dynal, Great Neck, NY) wyjęto z naczynia i umieszczono w 5 ml świeżej pożywki (co wymyje toksyczne konserwanty azydkowe). Pożywkę usunięto przez unieruchomienie paciorków na magnesie i zastąpiono ją świeżą pożywką.

Paciorki mieszano z komórkami i zawiesinę inkubowano przez 30 minut w lodzie. Zawiesinę mieszano co jakiś czas.

Powleczone paciorkami komórki unieruchomiono na magnesie i pozostałe komórki (frakcja bogata w osteoklasty) zdekantowano do sterylnej probówki do odwirowania na 50 ml.

Do komórek powleczonych paciorkami dodano świeżą pożywkę w celu wyparcia wszystkich zatrzymanych osteoklastów. Proces ten powtórzono x10. Odrzucono komórki pokryte paciorkami.

Żywe osteoklasty zliczono w komorze zliczeniowej, przy użyciu dioctanu fluoresceiny w celu oznaczenia żywych komórek. W celu przeniesienia próbki do komory zastosowano plastikową pipetę Pasteura z dużym otworem.

PL 200 404 B1

Osteoklasty zgranulowano przez odwirowanie i gęstość dostosowano do odpowiedniego numeru w pożywce EMEM (liczna osteoklastów różni się między guzami), wzbogaconej 10% osocza płodu cielęcia i 1,7 g/litr wodorowęglanu sodu.

ml podwielokrotności zawiesiny komórek (na związek) zdekantowano do probówek do odwirowania na 15 ml. Komórki zgranulowano przez odwirowanie.

Do każdej probówki dodano 3 ml odpowiedniego związku (rozcieńczonego do 50 uM w pożywce EMEM). Przeprowadzono również odpowiednie próby ślepe z nośnikiem i próby dodatnie (monoklonalne przeciwciało receptora mysiego anty-witronektyny [87MEM1] rozcieńczone do 100 μg/ml) i próbę izotopową (igG2a rozcieńczone do 100 ug/ml). Próbki inkubowano w 37°C przez 30 minut.

0,5 ml podwielokrotności komórek posiano na sterylne plastry zębiny na 48 studzienkowej płytce i inkubowano w 37°C przez 2 godziny. Każde podziałanie związkiem badano w poczwórnym powtórzeniu.

Plastry przemyto sześcioma porcjami PBS (10 ml/ studzienkę w 6-cio studzienkowej płytce), po czym umieszczono w świeżej pożywce zawierającej związek lub próbę kontrolną. Próbki inkubowano w 37°C przez 48 godzin.

Fosfataza kwaśna odporna na winian (TRAP) (selektywne barwienie komórek szczepu osteoklastu)

Plastry kości zawierające przyczepione osteoklasty przemyto solą fizjologiczną w buforze fosforanowym i umieszczono na 5 minut w 2% gluteraldehydzie (w 0,2M kakodylan sodu)

Następnie przemyto je wodą i inkubowano przez 4 minuty w buforze TRAP w 37°C (0,5 mg/ml naftolu AS-BI fosforanu rozpuszczonego w N,N-dimetyloformamidzie i zmieszano z 0,25M buforu cytrynianowego (pH 4,5) zawierającego 10 mM winianu sodu.

Po przemyciu zimną wodą plastry zanurzono w zimnym buforze octanowym (0,1M, pH 6,2), zawierającym 1 mg/ml szybkiej czerwieni granatu i inkubowano w 4°C przez 4 minuty.

Nadmiar bufora odessano, a plastry suszono na powietrzu, po czym przemyto wodą.

TRAP-dodatnie osteoklasty (ceglastoczerwony/ purpurowy osad) policzono za pomocą mikroskopu z jasnym polem, po czym usunięto z powierzchni zębiny za pomocą ultradźwięków.

Objętości wgłębień określono stosując mikroskop konfokalny Nikon/Lasertec ILM21W

Test 2 (przy użyciu odczytu ELISA)

Osteoklasty ludzkie wzbogacono i przygotowano do skriningu związków jak opisano w początkowych 9 etapach testu 1. Dla jasności, etapy te są poniżej powtórzone.

Osteoklasty zgranulowano przez odwirowanie i gęstość dostosowano do odpowiedniego numeru w pożywce EMEM (liczba osteoklastów różni się między guzami), wzbogaconej 10% osocza płodu cielęcia i 1,7 g/litr wodorowęglanu sodu.

W przeciwieństwie do metody opisanej powyżej w teście I związki badano przesiewowo w 4 dawkach w celu otrzymania IC50, jak podano poniżej:

PL 200 404 B1

Preparat osteoklastów inkubowano wstępnie przez 30 minuty w 37°C ze związkiem testowym (4 dawki) lub z próbą kontrolną.

Następnie posiano je na plastry bydlęcej kości korowej w studzienkach 48 studzienkowych płytek do hodowli tkanek i inkubowano przez kolejne 2 godziny w 37°C.

Plastry kości przemywano sześcioma zmianami ciepłego buforu fosforanowego (PBS) w celu usunięcia nieprzyklejonych komórek, a następnie zawracano je do studzienek 48 studzienkowej płytki zawierającej świeży związek lub próbę kontrolną.

Płytki hodowli tkanek inkubowano przez 48 godzin w 37°C.

Ciecz znad osadu z każdej studzienki odessano do pojedynczych probówek i testowano kompetycyjnym testem ELISA, który wykrywa c-telopeptyd kolageny typu I, który jest uwalniany podczas procesu resorpcji. Jest to dostępny w handlu test ELISA (Osteometr, Denmark), który zawiera przeciwciało królicze, które reaguje specyficznie z sekwencją 8 aminokwasów (Glu-Lys-Ala-His-Asp-GlyGly-Arg), która jest obecna w C-końcowym telopeptydzie łańcucha a1 kolageny typu I. Wyniki wyrażono jako % zahamowania resorpcji w porównaniu do próby kontrolnej zawierającej nośnik.

Test adhezji ludzkiego osteoklastu

Odessano pożywkę i podstawiono mysie przeciwciało anty-HLA-DR, po czym rozcieńczono 1:3 w poż ywce RPMI-1640. Zawiesinę inkubowano przez 30 minut w lodzie i co jakiś czas mieszano. Komórki przemyto x2 zimnym RPMI-1640, po czym odwirowano (1000 obrotów na min., 5 min. w 4°C) i komórki przeniesiono do sterylnych probówek o pojemnoś ci 15 ml. Liczbę komórek jednojądrzastych określono stosując ulepszoną komorę zliczeniową Neubauer.

Odpowiednie paciorki magnetyczne (5/komórkę jednojądrzastą) powleczone koźlim anty-mysim IgG (Dynal, Great Neck, NY) wyjęto z naczynia i umieszczono w 5 ml świeżej pożywki (co wymyje toksyczne konserwanty azydkowe). Pożywkę usunięto przez unieruchomienie paciorków na magnesie i zastąpiono ją ś wieżą poż ywką .

Osteoklasty pochodzące z osteoklastomy inkubowano wstępnie ze związkiem (4 dawki) albo próbą kontrolną w 37°C przez 30 minut

Następnie komórki posiano na plastry powleczone osteopontyną (ludzka lub szczurza osteopontyna, 25 μg/ml) i inkubowano przez 2 godziny w 37°C

Nieprzyklejone komórki usunięto przez energiczne przemycie plastrów w buforze fosforanowym, a komórki pozostałe na plastrach umieszczono w acetonie. Osteoklasty barwiono fosfatazą kwaśną odporną na winian (TRAP), która jest selektywnym markerem komórek tego fenotypu (patrz etapy 1517) i zliczono pod mikroskopem optycznym. Wyniki podano jako % zahamowania adhezji w porównaniu do próby kontrolnej.

Test adhezji komórek

Komórki i hodowla komórek

Ludzkie komórki nerek embrionu (komórki HEK293) uzyskano z ATCC (nr katalogowy CRL 1473). Komórki wzrastały w pożywce Earl's minimal essentail (EMEM) zawierającej sól Earl's, 10% płodowego serum wołowego, 1% glutaminy i 1% Peniciliny-Streptomycyny.

PL 200 404 B1

Budowa i transfekcja

3,2 kb fragment EcoRI-KpnI podjednostki a_v i 2,4 kb fragment XbaI-XhoI podjednostki β₃umieszcza się w obszarach klonujących EcoRI-EcoRV wektora pCDN (Aiyar i wsp., 1994), który zawiera promotor CMV i wybierany marker G418, przez stępienie i podwiązanie. Dla trwałego wyrażenia 80x10⁶ komórek HEK 293 eletrotransformowano z konstruktami a_v+e₅ (20 μg DNA każdej podjednostki) stosując Gene Pulser (Hensley i wsp., 1994) i posiano w 100 mm płytkach (5x10⁵ komórek na płytkę). Po 48 godzinach pożywkę wzrostową wzbogacono 450 μg/ml Geneticin (siarczan G418, GIBCOBRL, Bethesda, MD). Komórki utrzymywano w selekcyjnej pożywce aż kolonie były dostatecznie duże, aby przeprowadzić test.

Immunocytochemiczna analiza transfekowanych komórek

W celu określenia czy transfektanty HEK 293 wyrażają receptor witronektynowy, komórki unieruchomiono na szkiełku mikroskopowym przez odwirowanie, umieszczono w acetonie na 2 minuty w temperaturze pokojowej i wysuszono na powietrzu. Specyficzną reaktywność względem 23C6, monoklonalnego przeciwciała specyficznego na kompleks a_ve₃, wykazano stosując standardową pośrednią metodę immunofluorescencji.

Badanie adhezji komórki

96-cio studzienkowe płytki Elisa Corning pokryto wstępnie przez noc 24°C za pomocą 0,1 ml ludzkiej witronektyny (0,2 μg/ml w pożywce RPMI). W czasie testu płytki przemywa się raz pożywką RPMI i blokuje 3,5% BSA w pożywce RPMI przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Transfektowane komórki 293 zawiesza się ponownie w pożywce RPMI wzbogaconej 20 mM Hepes, pH 7,4 i 0,1% BSA przy zagęszczeniu 0,5x10⁶ komórek/ml. 0,1 ml zawiesiny komórek dodaje się do każdej studzienki i inkubuje przez 1 godzinę w 37°C w obecności lub nieobecności różnych antagonistów a_ve₃. Po inkubacji dodaje się 0,025 ml 10% roztworu formaldehydu, pH 7,4 i komórki umieszcza się w temperaturze pokojowej na 10 minut. Płytki przemywa się 3 razy 0,2 ml pożywki RPMI i komórki, które przywarły barwi się 0,1 ml 0,5% błękitu toluidynowego przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Nadmiar barwnika usuwa się intensywnie przemywając wodą zdejonizowaną. Błękit toluidynowy wprowadzony do komórek wymywa się przez dodanie 0,1 ml 50% etanolu zawierającego 50 mM HCl. Adhezję komórek mierzy się ilościowo jako gęstość optyczną przy 600 nm na czytniku płytek do mikromiareczkowania (Titertek Multiskan MS, Sterling, VA).

Wiązanie do a_ve₃ na nośniku:

Receptor witronektynowy a_ve₃ oczyszcza się z ludzkiego łożyska. Preparat receptora rozcieńczono 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2 (bufor A), po czym natychmiast dodano do 96-cio studzienkowych płytek ELISA przy 0,1 ml na studzienkę. Dodano 0,1-0,2 μg a_ve₅ na studzienkę. Płytki inkubowano przez noc w 4°C. Podczas eksperymentu studzienki przemyto raz buforem A i inkubowano z 0,1 ml 3,5% albumin osocza wołu w tym samym buforze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji studzienki całkowicie odessano i przemyto dwa razy 0,2 ml buforu A.

W teście kompetycyjnym [³H]-SK&F-107260 do studzienek dodano różne stężenia nieznakowanych antagonistów (0,001-100 μM), po czym dodano 5,0 nM [³H]-SK&F-107260. Płytki inkubowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Po inkubacji studzienki odessano całkowicie i przemyto raz 0,2 ml lodowatego buforu A, ze studzienki do studzienki. Receptory rozpuszczono w 0,1 ml 1% SDS i określano wiązanie [³H]-SK&F-107260 za pomocą cieczowego licznika scyntylacyjnego z dodaniem 3 ml Ready Safe w Beckamn LS Liguid Scintillation Counter, z 40% skutecznością. Nieswoiste wiązanie [³H]-SK&F-107260 określano w obecności 2 μM SK&F-107260, i było ono konsekwentnie niższe niż 1% całkowitego wkładu radioligandu. IC50 (stężenie antagonisty do hamowania 50% wiązania [³H]-SK&F-107260) określono metodą nieliniowego pasowania krzywej metodą najmniejszych kwadratów, modyfikowaną programem LUNDON-2. Ki (stała dysocjacji antagonisty) wyliczona została z równania Chenga i Prusoffa:

Ki=IC50/(1+L/Kd), gdzie L i Kd oznaczają odpowiednio stężenie i stałą dysocjacji [³H]-SK&F-107260.

Hamowanie wiązania GPIIb-IIIa, w którym pośredniczy RGD

Oczyszczanie GPIIb-IIIa

Dziesięć jednostek przestarzałych, przemytych ludzkich płytek krwi (uzyskane z Czerwonego Krzyża) lizowano mieszając ostrożnie w 3% oktyloglukozydzie, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2 mM CaCl2 w 4°C przez 2 godziny. Lizat odwirowano przy 100 000 g przez 1 godzinę. Uzyskaną ciecz znad osadu naniesiono na 5 ml kolumnę sefarozy 4B lektyny soczewicy (E.Y.Labs) zrównoważoną wstępnie 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1% oktyloglukozydu (bufor A).

PL 200 404 B1

Po 2 godzinach inkubacji kolumnę przemywa się 50 ml zimnego bufora A. Zatrzymany przez lektynę GPIIb-IIIa wymywa się buforem A zawierającym 10% dekstrozy. Wszystkie procedury wykonuje się w 4°C. Uzyskany GPIIb-IIIa ma czystość >95%, jak stwierdzono metodą elektroforezy na żelu SDS poliakryloamidowym.

Korzystne związki według niniejszego wynalazku wykazują powinowactwo do receptora witronektynowego względem receptora fibrynogenowego powyżej 10:1. Najkorzystniej, związki mają stosunek aktywności powyżej 100:1.

Skuteczność związków o wzorze (I) samych albo w kombinacji ze środkiem przeciwnowotworowym może być określona przy użyciu kilku przeszczepialnych mysich modeli nowotworów. Szczegóły dotyczące tych modeli znaleźć można w opisach patentowych US-5004758 i US-5633016.

Uwagi ogólne

Widma protonowego jądrowego rezonansu magnetycznego (¹H NMR) rejestrowano albo przy 250, 300 albo 400 MHz. Przesunięcia chemiczne podane są w częściach na milion (δ) poniżej wzorca wewnętrznego, tetrametylosilanu (TMS). Skróty stosowane danych NMR są następujące: s=singlet, d=dublet, t=tryplet, q=kwartet, m=multiplet, dd=dublet dubletów, dt=dublet trypletów, app=pozorny, br =szeroki. J oznacza stałe sprzężenia NMR, mierzone w Hertzach. CDCl3 oznacza deuterochloroform, DMSO-d6 oznacza heksadeutertodimetylosulfotlenek, a CD3OD oznacza tetradeutertometanol. Widma w podczerwieni (IR) rejestrowano w trybie transmisji, a pozycje pasm podane są w odwrotnych liczbach falowych (cm^-1). Widma masowe uzyskuje się stosując techniki jonizacji elektrosprej (ES) albo FAB (ang. fast atom bombardment - bombardowanie szybkimi atomami). Analizę elementarną przeprowadzono albo na miejscu albo w Quantitative Technologies Inc., Whitehouse, NJ. Temperatury topnienia zarejestrowano przy użyciu aparatu do mierzenia temperatury topnienia Thomas-Hoover i są niekorygowane. Wszystkie temperatury podane są w stopniach Celsjusza. Do przeprowadzania chromatografii cienkowarstwowej zastosowano płytki do chromatografii cienkowarstwowej Analtech Silica Gel GF i E. Merck Silica Gel 60 F-254. Zarówno szybką jak i grawitacyjną chromatografię przeprowadzono na silikażelu E. Merck Kieslgel 60 (ziarno 230-400). Analityczną i preparatywną HPLC przeprowadzano na chromatografach Rainin albo Beckman. ODS oznacza nośnik chromatograficzny, silikażel funkcjonalizowany grupami oktadekasililowymi. 5 μ, Apex-ODS oznacza nośnik chromatograficzny, silikażel funkcjonalizowany grupami oktadekasililowymi o nominalnej średnicy cząstek wynoszącej 5 μ, wytworzony przez firmę Jones Chromatography, Littleton Colorado. YMC ODS-AQ® oznacza nośnik chromatograficzny ODS i jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy YMC Co., Ltd., Kyoto, Japan. PRP-1® stanowi polimeryczny (styren-diwinylobenzen) nośnik chromatograficzny i jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy Hamilton Co., Reno, Nevada. Celit® jest pomocniczym materiałem filtracyjnym złożonym z przemytej kwasem krzemionki okrzemkowej i stanowi zastrzeżony znak towarowy firmy Manville Corp., Denver, Colorado.

Preparat 1

Wytwarzanie 6-(metyloamino)-2-pirydyloetanolu

a) 2-(tert-butoksykarbonyloamino)-6-pikolina

Roztwór 2-amino-6-pikoliny (21,63 g, 200 mmoli) i diwęglanu di-tert-butylu (52,38 g, 240 mmola) w CH2Cl2 (200 ml) zatęża się na wyparce obrotowej w 50°C, a otrzymaną pozostałość obraca się na wyparce w 50°C pod zmniejszonym ciśnieniem. Po 21,5 godz. reakcję rozcieńcza się mieszaniną heksanów (400 ml) i przesącza przez silikażel (heksany, a następnie 20% EtOAc/heksany). Po zatężeniu otrzymuje się tytułowy związek (41,84 g, ilościowo) w postaci jasnożółtego oleju, który stopniowo, po pewnym czasie krzepnie:

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,71 (d, J=8,3 Hz, 1H), 7,40-7,65 (m, 2H), 6,80 (d, J=7,5Hz, 1H), 2,43 (s, 3H), 1,50 (s, 9H); MS (ES) m/e 153 (M+H - C4H8)⁺.

b) 2-[(tert-butoksykarbonylo)metyloamino]-6-pikolina

NaH (60% w oleju mineralnym, 3,60 g, 90 mmoli) dodaje się porcjami przez kilka minut do roztworu 2-(tert-butoksykarbonyloamino)-6-pikoliny (15,62 g, 75 mmoli) i jodometanu (9,3 ml, 150 mmoli) w bezwodnym DMSO (75 m) w 15°C (łaź nia z zimną wodą). Wewnętrzna temperatura rośnie do 35°C. Gdy zmniejszy się wydzielanie gazu odstawia się łaźnię z zimną wodą i reakcję miesza się w temperaturze pokojowej. Po 0,5 godz. ciemnożółtą mieszaninę wylewa się na lód/H2O (300 ml) i ekstrahuje Et2O (3x300 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemywa się kolejno H2O (2x75 ml) i solanką (74 ml). Po wysuszeniu (MgSO4) i zatężeniu otrzymuje się żółty olej, który poddaje się chromatografii na silikażeli (7% EtOAc/heksany). Tytułowy związek (13,01 g, 78%) otrzymuje się w postaci bladożółtego oleju:

PL 200 404 B1 ¹H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,51 (pozorny t, 1H), 7,37 (d, J=8,2 Hz, 1H), 6,86 (d, J=7,2Hz, 1H), 3,38 (s, 3H), 2,49 (s, 3H), 1,50 (s, 9H); MS (ES) m/e 223 (+H)⁺.

c) 6-[(tert-butoksykarbonylo)metyloamino]-2-pirydylooctan etylu

LDA wytwarza się w 0°C w atmosferze argonu z diizopropyloaminy (19,5 ml, 139,14 mmola) i 2,5 M n-BuLi w heksanach (46,4 ml, 115,95 mmola) w suchym THF (350 ml). Roztwór ten schładza się do -78°C i dodaje kroplami przez 10 minut roztwór 2-[(tert-butoksykarbonylo)metyloamino]-6-pikoliny (10,31 g, 46,38 mmola) w suchym THF (46 ml). Do przeniesienia stosuje się dodatkową ilość suchego THF (2 ml). Pomarańczowy roztwór miesza się w -78°C przez 15 minut, następnie szybko dodaje się węglan dietylu (6,2 ml, 51,02 mmola). Czerwony roztwór miesza się w -78°C przez 15 minut po czym reakcję przerywa półnasyconym NH4Cl (175 ml). Mieszaninę ociepla się do +5°C i ekstrahuje EtOac (175 ml), a następnie CH2Cl2 (2x100 ml). Połączone ekstrakty przemywa się solanką (100 ml), suszy (MgSO4) i zatęża. Mętny, żółty olej poddaje się chromatografii na silikażelu (15% EtOAc/heksan) i otrzymuje tytułowy związek (10,72 g, 79%) w postaci jasnożółtego oleju:

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,51-7,63 (m, 2H), 6,91-7,03 (m, 1H), 4,19 (q, J=7,1 Hz, 2H), 3,77 (s, 2H), 3,38 (s, 3H), 1,27 (t, J=7,1 Hz, 3H), 1,51 (s, 9H); MS (ES) m/e 295 (M+H)⁺.

d) 6-[(tert-butoksykarbonylo)metyloamino]-2-pirydyloetanol

Roztwór 2N LiBH4 w THF (7 ml, 14 mmoli) dodaje się ze strzykawki do mieszanego roztworu 6-[(tert-butoksykarbonylo)metyloamino]-2-pirydylooctanu etylu (6,97 g, 23,7 mmola) w bezwodnym THF (30 ml) w atmosferze argonu. Reakcję ogrzewa się następnie powoli do temperatury wrzenia (początkowo egzotermicznie). Po 16 godz. ogrzewania w temperaturze wrzenia mieszaninę reakcyjną schładza się do 0°C i ostrożnie przerywa się ją wodą (50 ml). Mieszaninę reakcyjną ekstrahuje się EtOAc (150 ml) i warstwę organiczną przemywa się solanką, suszy (Na2SO4) i zatęża. Oczyszczanie metodą szybkiej chromatografii na silikażeli (35% EtO-Ac/heksan) daje tytułowy związek (5,26, 88%) w postaci klarownego oleju:

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,57 (m, 2H), 6,88 (d, J=7,2 Hz, 1H), 4,01 (t, 2H), 3,39 (s, 3H), 3,00 (t, 2H), 1,53 (s, 9H); MS (ES) m/e 253,2 (M+H)⁺.

e) 6-metyloamino-2-pirydyloetanol

Do 6-[(tert-butoksykarbonylo)metyloamino]-2-pirydyloetanolu (17,9 g, 71 mmoli) dodaje się roztwór 4N HCl w dioksanie (200 ml). Reakcję miesza się w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę (obserwuje się powolne wydzielanie gazu), następnie zatęża do sucha. Produkt w postaci soli chlorowodorowej krzepnie pod zmniejszonym ciśnieniem. Osad rozpuszcza się w nasyconym NaCl 1,0 N roztworze NaOH (75 ml), roztwór ekstrahuje się Et2O (2x200 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemywa się solanką, suszy (Na2SO4) i zatęża, po czym otrzymuje się tytułowy związek (9,12 g, 85%) w postaci woskowego ciała stałego:

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,37 (t, 1H), 6,42 (d, J=7,3Hz, 1H), 6,27 (d, J=8,3Hz, 1H), 4,62 (szer. s, 1H), 3,96 (t, 2H), 2,90 (d, J=5,2 Hz, 3H), 2,84 (t, 2H); MS (ES) m/e 153 (M+H)⁺.

Preparat 2

Wytwarzanie 2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)-1-etanolu

a) 2-(piwaloiloamino)pirydyna

Do roztworu 2-aminopirydyny (94,12 g, 1 mol) i Et3N (167,3 ml, 1,2 mmola) w CH2Cl2 (1 l) dodaje się kroplami w 0°C chlorek piwaloilu (135,5 ml, 1,1 mola).

W trakcie ocieplania ła źni, mieszanina ociepla się do temperatury pokojowej. Po 18 godz. mieszaninę przesącza się. Przesącz przemywa się kolejno H2O (1,5 l) i nasyconym roztworem NaHCO3 (2x1,5 l), następnie suszy (MgSO4) i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymuje tytułowy związek (183 g, 103%) w postaci brudnobiałego ciała stałego:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,28 (m, 2H), 8,00 (szer. s, 1H), 7,70 (m, 1H), 7,03 (m, 1H), 1,31 (s, 9H); MS (ES) m/e 179 (M+H)⁺.

Przypis: Widmo ¹H NMR wykazuje obecność małych ilości zanieczyszczeń zawierających grupę tert-butylową, ale substancja jest dostatecznie czysta do zastosowania w następnym etapie.

b) 2-(piwaloiloamino)-3-pirydynokarboksyaldehyd

Do roztworu 2-(piwaloiloamino)pirydyny (17,8 g, 100 mmoli) w suchym THF (250 ml) w -20°C dodaje się kroplami przez 30 minut n-BuLi (2,5M roztwór w heksanach, 100 ml, 250 mmoli). Po 2 godz. dodaje się kroplami przez 30 minut DMF (21 ml, 275 mmoli). W trakcie ocieplania łaźni, mieszanina ociepla się do temperatury pokojowej. Po 18 godz. reakcję przerywa się nasyconym NH4Cl (300 ml), a otrzymaną mieszaninę ekstrahuje EtOAc (3x400 ml). Połączone warstwy organiczne suszy się (MgSO4) i zatęża, co daje tytułowy związek w postaci mieszaniny 2:1 z 2-(piwaloiloamino)-pirydyną (22 g).

PL 200 404 B1 ¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 10,95 (szer. s, 1H), 9,95 (s, 1H), 8,96 (m, 1H), 8,02 (m, 2H), 7,20 (m, 1H), 1,38 (s, 9H); MS (ES) m/e 207 (M+H)⁺.

Przypis: Powyższą procedurę powtarza się stosując w miejsce DMF 1-formylopiperydynę (30,5 ml, 275 mmoli) i otrzymuje się tytułowy związek w postaci mieszaniny 4:1 z 2-(piwaloiloamino)pirydyną (21 g).

c) 2-amino-3-pirydynokarboksyaldehyd

Surowy 2-(piwaloiloamino)-3-pirydynokarboksyaldehyd (z etapu b, 43 g) rozpuszcza się w 3 M HCl (500 ml) i roztwór ogrzewa się w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Po 18 godzinach mieszaninę schładza się do temperatury pokojowej, a pH ostrożnie doprowadza się do wartości 7 stosując stały K2CO3. Wodny roztwór ekstrahuje się EtOAc (3x500 ml). Połączone warstwy organiczne suszy się (MgSO4) i zatęża, co daje tytułowy związek (24,57 g, 101%) w postaci czerwonawobrązowego ciała stałego:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 9,85 (s, 1H), 8,24 (m 1H), 7,80 (m, 1H), 6,90 (szer. s, 2H), 6,74 (m, 2H); MS (ES) m/e 123 (M+H)⁺.

d) 2-metylo-1,8-naftyrydyna

Do roztworu 2-amino-3-pirydynokarboksyaldehydu (z etapu c, 24,57 g) w acetonie (750 ml) dodaje się prolinę (2,3 g, 20 mmoli), następnie mieszaninę ogrzewa się do temperatury wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Po 48 godzinach mieszaninę schładza się do temperatury pokojowej, przesącza i zatęża. Po szybkiej chromatografii na silikażelu (35% aceton/heksany) otrzymuje się tytułowy związek (18,5 g, 64% po 3 etapach) w postaci pomarańczowo-żółtego ciała stałego:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 9,07 (m, 1H), 8,10 (m, 2H), 7,40 (m, 2H), 2,80 (s, 3H); MS (ES) 145 (M+H)⁺.

e) 2-metylo-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyna

Mieszaninę 2-metylo-1,8-naftyrydyny (18,5 g, 128 mmoli), 10% Pd/C (5 g) i absolutnego EtOH (150 ml) wytrząsa się w atmosferze wodoru 103,42·10³ Pa (15 psi) w aparacie Parr. Po 24 godzinach mieszaninę przesącza się przez celite® i sączek przemywa się kolejno absolutnym EtOH i EtOAc. Przesącz zatęża się do sucha i otrzymuje tytułowy związek (18,85, 99%) w postaci brudnobiałego osadu:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,02 (d, J=7,5 Hz, 1H), 6,34 (d, J=7,5 Hz, 1H), 4,80 (szer. s, 1H), 3,38 (m, 2H), 2,74 (m, 2H), 2,30 (s, 3H), 1,88 (m, 2H); MS (ES m/e 149 (M+H)⁺.

f) 2-metylo-8-(tert-butoksykarbonylo)-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyna

Do roztworu 2-metylo-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyny (23,32 g, 157 mmoli) i diwęglanu ditert-butylu (44,74 g, 205 mmoli) w suchym THF (750 ml) w 0°C dodaje się kroplami LiHMDS (1,0 M roztwór w THF, 205 ml, 205 mmoli). 30 minut po zakończeniu dodawania reakcję przerywa się nasyconym NH4Cl (500 ml) i ekstrahuje EtOAc (3x500 ml). Połączone ekstrakty organiczne suszy się (MgSO4) i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Po szybkiej chromatografii kolumnowej na silikażelu (40% EtOAc/heksany) otrzymuje się tytułowy związek (32,3 g, 83%) w postaci jasnożółtego oleju:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,27 (d, J=7,6 Hz, 1H), 6,81 (d, J=7,6 Hz, 1H), 3,69-3,79 (m, 2H), 2,65-2,75 (m, 2H), 2,48 (s, 3H), 1,83-1,98 (m, 2H), 1,52 (s, 9H); MS (ES) m/e 249 (M+H)⁺.

g) [8-(tert-butoksykarbonylo)-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo]octan etylu

Do roztworu diizopropyloaminy (47,7 ml, 364 mmole) w suchym THF (250 ml) w 0°C dodaje się kroplami n-BuLi (2,5 M w heksanach, 145,6 ml, 364 mmole). Po 15 minutach roztwór ten dodaje się kroplami do roztworu 2-metylo-8-(tert-butoksykarbonylo)-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyny (32,3 g, 130 mmoli) i węglanu dietylu (56,9 ml, 481 mmola) w suchym THF (400 ml) w -78°C. Po 30 minutach reakcję przerywa się nasyconym NH4Cl (500 ml), ociepla do temperatury pokojowej i ekstrahuje EtOAc (3x500 ml). Połączone ekstrakty organiczne suszy się (MgSO4), przesącza i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Po wysuszeniu w warunkach wysokiej próżni przez noc otrzymuje się tytułowy związek (42,52 g, 102%) w postaci jasnożółtego oleju:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,35 (d, J=7,5 Hz, 1H), 6,96 (d, J=7,5 Hz, 1H), 4,18 (t, 2H), 3,75 (m, 4H), 2,72 (t, 2H), 1,91 (m, 2H), 1,52 (s, 9H), 1,24 (m, 3H); MS (ES) m/e 321 (M+H)⁺.

Przypis: Widmo ¹H NMR wykazuje małe ilości węglanu dietylu obecne w produkcie, ale substancja jest dostatecznie czysta do stosowania w kolejnym etapie.

h) 2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)-1-etanol

Do roztworu [8-(tert-butoksykarbonylo)-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo]octanu etylu (42,52 g, 130 mmoli) w suchym THF (650 ml) w temperaturze pokojowej dodaje się LiBH4 (2,0 M w THF, 65 ml, 130 mmoli) i otrzymaną mieszaninę ogrzewa się w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Po 18 godzinach mieszaninę schładza się do 0°C i ostrożnie przerywa reakcję dodając H2O

PL 200 404 B1 (300 ml). Po 10 minutach mieszaninę ekstrahuje się EtOAc (3x500 ml). Połączone ekstrakty organiczne suszy się (MgSO4), przesącza i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem.

Powyższą pozostałość rozpuszcza się w CH2Cl2 (300 ml). Do tego roztworu dodaje się powoli w temperaturze pokojowej 4N HCl w dioksanie (300 ml). Po 4 godz. mieszaninę zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszcza się w mieszaninie 1:1 1,0 N NaOH i nasyconego roztworu NaCl (300 ml) i ekstrahuje CH2Cl2 (3x300 ml). Połączone ekstrakty organiczne suszy się (MgSO4), przesącza i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszcza się w Et2O (250 ml) i kroplami dodaje 96% kwas mrówkowy (130 mmoli). Otrzymany osad odsącza się i przemywa Et2O. Osad rozpuszcza się w mieszaninie 1:1 1,0 N NaOH i nasyconego NaCl (300 ml) i roztwór ekstrahuje CH2Cl2 (3x300 ml). Połączone ekstrakty organiczne suszy się (MgSO4), przesącza i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem, i otrzymuje tytułowy związek (11,1 g, 48% po 4 etapach) w postaci żółtego ciała stałego.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,05 (d, J=7,6 Hz, 1H), 6,33 (d, 7,6 Hz, 1H), 3,90 (t, 2H), 3,39 (m, 2H), 2,75 (t, 2H), 2,70 (t, 2H), 1,90 (m, 2H); MS (ES) m/e 179 (M+H)⁺.

Preparat 3

Wytwarzanie (±)-4-(4-hydroksyfenylo)-3-[4-(trifluorometylo)fenylo]butanianu etylu

a) N-metoksy-N-metylo-2-(4-metoksyfenylo)-acetamid

Do roztworu kwasu 4-metoksyfenylooctowego (3,3 g, 20 mmoli) w suchym DMF (75 ml) dodaje się chlorowodorek N-metoksy-N-metyloaminy (1,95 g, 20 mmoli), Et₃N (3,1 ml, 22 mmole), HOBt-H₂O (1,95 g, 22 mmole) i EDC (2,7 g, 22 mmole). Roztwór miesza się w temperaturze pokojowej przez noc, a następnie zatęża pod próżnią. Pozostałość rozpuszcza się w 5% roztworze Na2HCO3 (10 ml) i ekstrahuje CH2Cl2 (3x20 ml).

Połączone ekstrakty organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża. Pozostałość poddaje się chromatografii na silikażelu (3% MeOH/CH2Cl2) i otrzymuje się tytułowy związek (1,54 g, 37%) w postaci białego ciała stałego: MS (ES) m/e 210 (M+H)⁺.

b) 2-(4-metoksyfenylo)-1-[4-(trifluorometylo)-fenylo)etanon

Do roztworu sec-BuLi (1,3 M w THF, 22,6 ml, 29,5 mmola) w suchym THF (50 ml) dodaje się kroplami w -78°C 4 -bromobenzotrifluorek (3,3 g, 14,7 mmola) w suchym THF (20 ml). Po 20 minutach dodaje się kroplami N-metoksy-N-metylo-2-(4-metoksyfenylo)acetamid (1,5 g, 7,4 mmola) w suchym THF (20 ml). Po 1 godz. reakcję przerywa się nasyconym NH4Cl (10 ml), ociepla do temperatury pokojowej i ekstrahuje Et2O (3x20 ml). Połączone ekstrakty organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża. Pozostałość poddaje się chromatografii na silikażelu (15% EtOAc/heksany) i otrzymuje tytułowy związek (2,2 g, 100%) w postaci lekko żółtego ciała stałego:

TLC (1,5% EtOAc/heksany) Rf 0,81; ¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,10 (d, J=8,2 Hz, 2H), 7,72 (d, J=8,2 Hz, 2H), 7,18 (d, J=8,7 Hz, 2H), 6,88 (d, J=8,7 Hz, 2H), 4,25 (s, 2H), 3,79 (s, 3H).

c) (±)-4-(4-metoksyfenylo)-3-[4-(trifluorometylo)fenylo]krotonian etylu

Do zawiesiny 60% NaH (350 mg, 8,84 mmola) w suchym toluenie (30 ml) dodaje się kroplami w temperaturze pokojowej fosfonooctan trietylu (2,0 g, 8,84 mmola) w suchym toluenie (20 ml). Po 15 minutach dodaje się kroplami roztwór 2-(4-metoksyfenylo)-1-[4-(trifluorometylo)fenylo]etanonu (1,3 g, 4,42 mmola) w suchym toluenie (15 ml) i roztwór ogrzewa się w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Po 16 godz. reakcję przerywa się nasyconym NH4Cl (10 ml) i mieszaninę ekstrahuje się EtOAc (3x20 ml). Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża. Tytułowy związek (2,2 g, 56% mieszanina dwóch związków) otrzymuje się w postaci jasnożółtego oleju: TLC (5% EtOAc/heksany) Rf 0,42, 0,44. Substancję tę stosuje się bez dalszego oczyszczania.

d) (±)-4-(4-metoksyfenylo)3-[4-(trifluorometylo)fenylo]butanian etylu

Do zawiesiny 10% Pd/C (600 mg) w absolutnym EtOH (50 ml) dodaje się (±)-4-(4-metoksyfenylo)-3-[4-(trifluorometylo)fenylo]krotonian etylu (2,2 g, 6 mmoli) i mieszaninę wytrząsa się w aparacie Parr w temperaturze pokojowej w atmosferze H2 344,74·10³ Pa (50 psi). Po 4 godz. mieszaninę przesącza się przez celite®, a przesącz zatęża. Tę sekwencję operacji powtarza się trzy razy. Pozostałość poddaje się chromatografii na silikażelu (35% EtOAc/heksany) i otrzymuje się tytułowy związek (900 mg, 56%) w postaci oleju:

TLC (5% EtOAc/heksany) Rf 0,46;

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,51 (d, J=8,2 Hz, 2H), 7,24 (d, J=8,2 Hz, 2H), 6,94 (d, J=8,7, 2H), 6,76 (d, J=8,7 Hz, 2H), 3,99 (q, J=7,1 Hz, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,35-3,50 (m, 1H), 2,75-2,93 (m, 2H), 2,69 (dd, J=15,6, 6,4 Hz, 1H), 2,60 (dd, J=15,6, 8,9 Hz, 1H), 1,11 (t, J=7,1 Hz, 3H).

PL 200 404 B1

e) (±)-4-(4-hydroksyfenylo)-3-[4-(trifluorometylo)fenylo]butanian etylu

Do roztworu (±)-4-(4-metoksyfenylo)-3-[4-(trifluorometylo)fenylo]butanianu etylu (450 mg, 1,23 mmola) w CH2Cl2 (5 ml) dodaje się w temperaturze -10°C BBr3 (1,5 ml, 1,48 mmola). Po 3 godz. reakcję ostrożnie przerywa się za pomocą EtOH (10 ml) i roztwór ociepla się do temperatury pokojowej. Mieszaninę zatęża się, a pozostałość poddaje chromatografii na silikażelu (20% EtOAc/heksany) i otrzymuje tytułowy związek (270 mg, 63%) w postaci żółtego oleju:

TLC (20% EtOAc/heksany) Rf 0,22.

Preparat 4

Wytwarzanie (±)-3-[4-karboksy-1,3-oksazol-2-ylo]-4-[4-[(tert-butoksykarbonylo)oksy]fenylo]butanianu etylu

a) 4-bromo-1-(triizopropylosiloksy)benzen

Do roztworu 4-bromofenolu (17,3 g, 100 mmoli) w suchym DMF (100 ml) w temperaturze pokojowej dodaje się imidazol (13,62 g, 200 mmoli), a następnie chlorek triizopropylosililu (22,5 ml, 105 mmoli). Po 4 godz. mieszaninę rozcieńcza się H2O (50 ml) i ekstrahuje heksanami (3x75 ml). Połączone ekstrakty organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża, i otrzymuje tytułowy związek (32,23 g, 100%) w postaci klarownego oleju, który stosuje się bez dalszego oczyszczania:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,29 (d, J=6 Hz, 2H), 6,71 (d, J=6 HZ, 2H), 1,22 (m, 3H), 1,09 (m, 18H).

b) 3-(benzyloksykarbonylo)-3-butenian metylu

Azodikarboksylan diizopropylu (32,8 ml, 1,66 mmola) dodaje się w 0°C do roztworu 3-karboksy3-butenianu metylu (20 g, 139 mmoli), alkoholu benzylowego (17,2 mg, 166 mmole) i trifenylofosfiny (43,7 g, 166 mmoli) w bezwodnym THF (500 ml). W trakcie ocieplania się łaźni, mieszanina ociepla się do temperatury pokojowej. Po 3 godz. mieszaninę zatęża się, a pozostałość poddaje chromatografii na silikażelu (10% EtOAc/heksany). Tytułowy związek (29,46 g, 91%) otrzymuje się w postaci bezbarwnego oleju:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,35 (m, 5H), 6,48 (s, 1H), 5,71 (s, 1H), 5,20 (s, 2H), 3,63 (s, 3H), 3,37 (s, 2H).

c) (±)-4-(4-triizopropylosililoksyfenylo)-3-karboksybutanian metylu

Roztwór 4-bromo-1-(triizopropylosililoksy)-benzenu (33,23 g, 100 mmoli) 3-(benzyloksykarbonylo)-3-butanianu metylu (28,11 g, 120 mmoli), Pd(OAc)2 (2,24 g, 10 mmoli), P(o-tolil)3 (6,09 g, 20 mmoli) i (i-Pr)2NEt (34,8 ml, 200 mmoli) w propionitrylu (350 ml) odtlenia się (3 cykle usuwania gazu/przepuszczania N2), po czym ogrzewa do temperatury wrzenia. Po 18 godz. mieszaninę zatęża się, a pozostałość poddaje chromatografii na silikażelu (10% EtO-Ac/heksany) i otrzymuje się żółty olej. Olej ten rozpuszcza się w 5% roztworze EtOAc/heksany (100 ml) i roztwór pozostawia się w temperaturze pokojowej. Po 72 godz. mieszaninę przesącza się, a przesącz zatęża i otrzymuje surowy (±)-4-(4-triizopropylosililoksyfenylo)-3-(benzyloksykarbonylo)-3-butenian metylu w postaci mieszaniny izomerów olefinowych. Stosuje się go natychmiast w kolejnym etapie.

Powyższą mieszaninę olefin dzieli się na dwie części. Każdą część poddaje się reakcji w następujący sposób, po czym po przesączeniu, łączy: do zawiesiny 10% Pd/C (7,4 g) w EtOAc (100 ml) dodaje się do powyższej mieszaniny olefin. Mieszaninę odtlenia się (3 cykle usuwania gazu/przepuszczania N2), a następnie nasyca się H2 344,74·10³ Pa (50 psi). Po 4 godz. usuwa się H2 i mieszaninę przesącza przez sączek z celitu®. Przesącz zatęża się i otrzymuje tytułowy związek (24,64 g, 89% z 4-bromo-1-triizopropylosililoksy)benzenu) w postaci klarownego oleju:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,01 (d, J=6 Hz, 2H), 6,80 (d, J=6 Hz, 2H), 3,62 (s, 3H), 3,05 (m, 2H), 2,65 (m, 1H), 2,40 (m, 2H), 1,21 (m, 3H), 1,09 (m, 18H).

d) ester benzylowy (±)-N-[2-[4-(triizopropylosililoksy)benzylo]-3-(karbometoksy)propionylo]seryny

Do roztworu (±)-4-(4-triizopropylosililoksyfenylo)-3-karboksybutanianu metylu (5,00 g, 12,67 mmola) w suchym DMF (60 ml) w temperaturze pokojowej dodaje się chlorowodorek estru benzylowego seryny (3,52 g, 15,21 mmola), HOBt (2,06 g, 15,21 mmola), Et3N (5,3 ml, 38,01 mmola) i EDC (2,92 g, 15,21 mmola). Po 18 godzinach mieszaninę zatęża się. Pozostałość poddaje się chromatografii na silikażelu (80% EtOAc/heksany) i otrzymuje się tytułowy związek (5,76 mg, 79%) w postaci bladożółtego oleju: MS (ES) m/e 572 (M+H)⁺.

e) (±)-3-[4-(benzyloksykarbonylo)-1,3-oksazolin-2-ylo]-4-[4-(triizopropylosililoksy)fenylo]butanian metylu

Do roztworu estru benzylowego (±)-N-[2-[4-(triizopropylosililoksy)benzylo]-3-(karbometoksy)propionylo]seryny (5,76 g, 10,07 mmola) w suchym THF (50 ml) dodaje się odczynnik Burgessa (2,88 g, 12,08 mmola), następnie mieszaninę ogrzewa się do temperatury wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Po

PL 200 404 B1 godz. mieszaninę schładza się do temperatury pokojowej i zatęża. Pozostałość poddaje się chromatografii na silikażelu (35% EtOAc/heksany) i otrzymuje się tytułowy związek (4,45 g, 80%) w postaci klarownego oleju: MS (ES) m/e (M+H)⁺.

f) (±)-3-[4-benzyloksykarbonylo)-1,3-oksazol-2-ylo]-4-[4-(triizopropylosililoksy)fenylo]butanian metylu

Do roztworu (±)-3-[4-(benzyloksykarbonylo)-1,3-oksazolin-2-ylo]-4-[4-(triizopropylosililoksy)fenylo]butanianu metylu (4,45 g, 8,03 mmola) w CH2Cl2 (40 ml) w 0°C dodaje się DBU (1,4 ml, 9,64 mmola), a następnie bromotrichlorometan (0,95 ml, 9,64 mmola).

Mieszanina ociepla się do temperatury pokojowej, w czasie ocieplania łaźni. Po 18 godz. mieszaninę zatęża się. Pozostałość poddaje się chromatografii na silikażelu (20% EtOAc/heksany) i otrzymuje tytułowy związek (2,23 g, 50%) w postaci klarownego oleju: MS (ES) m/e 552 (M+H)⁺.

g) (±)-3-[4-(benzyloksykarbonylo)-1,3-oksazol-2-ylo]-4-(4-hydroksyfenylo)butanian metylu

Do roztworu (+)-3-[4-benzyloksykarbonylo)-1,3-oksazol-2-ylo]-4-[4-(triizopropylosililoksy)fenylo]butanianu metylu (2,23 g, 4,04 mmola) w suchym THF (20 ml) w 0°C dodaje się roztwór TBAF w THF (1,0 M, 6,06 ml, 6,06 mmola). Po 2 godz. mieszaninę rozcieńcza się nasyconym NH4Cl (10 ml) i ekstrahuje CH2Cl2 (3x15 ml). Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża. Pozostałość poddaje się chromatografii na silikażelu (40% EtOAc/heksany) i otrzymuje tytułowy związek (1,4 g, 88%) w postaci brudnobiałej piany: MS (ES) m/e 396 (M+H)⁺.

h) (±)-3-[4-(benzyloksykarbonylo)-1,3-oksazol-2-ylo]-4-[4-[(tert-butoksykabonylo)oksy]fenylo)butanian metylu

Do roztworu (±)-3-[4-(benzyloksykarbonylo)-1,3-oksazol-2-ylo]-4-(4-hydroksyfenylo)butanianu metylu (700 mg, 1,77 mmola) i diwęglanu di-tert-butylu (463 mg, 2,12 mmola) w suchym THF (10 ml) dodaje się w temperaturze pokojowej pirydynę (0,17 mol, 2,12 mmola). Po 18 godz. mieszaninę zatęża się. Pozostałość rozciera się w heksanach, przesącza i suszy pod próżnią, w wyniku czego otrzymuje się tytułowy związek (765 mg, 87%) w postaci białego ciała stałego: MS (ES) m/e 496 (M+H)⁺.

i) (±)-3-[4-karboksy-1,3-oksazol-2-ylo]-4-[4-[(tert-butoksykarbonylo)oksy]fenylo]butanian metylu

Mieszaninę (±)-3-[4-(benzyloksykarbonylo)-1,3-oksazol-2-ylo]-4-[4-[(tert-butoksykabonylo)oksy]-fenylo]butanianu metylu (765 mg, 1,54 mmola) i 10% Pd/C (164 mg) w EtOH (20 ml) odtlenia się (3 cykle usuwania gazu/przepuszczania N2), a następnie nasyca się H2 344,74·10³ Pa (50 psi). Po 4 godz. usuwa się H2 i mieszaninę przesącza przez sączek z celitu®. Przesącz zatęża się i otrzymuje tytułowy związek (659 mg, 100%) w postaci białego ciała stałego: MS (ES) m/e 811 (2M+H)⁺.

Preparat 5

Wytwarzanie (±)-3-[4-(trifluorometylo)tiazol-2-ylo]-4-(4-hydroksyfenylo)butanianu metylu

a) 2-cyjanometylo-4-(trifluorometylo)tiazolu 2-cyjanotioacetamid (1,00 g, 9,99 mmola) i 3-bromo-1-trifluoropropan-2-on (1,04 ml, 9,99 mmola) miesza się w absolutnym EtOH (50 ml) i ogrzewa do temperatury wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Po 18 godz. mieszaninę schładza się do temperatury pokojowej i zatęża. Pozostałość poddaje się chromatografii na silikażelu (15% EtOAc/heksany) i otrzymuje się tytułowy związek (1,24 g) w postaci mieszaniny 2:1 z 2-cyjanooctanem etylu: MS (ES) m/e 385 (2M+H)⁺.

b) 3-(4-benzyloksyfenylo)-2-[(4-trifluorometylo)tiazol-2-ylo]akrylonitryl

NaH (516 mg, 60% dyspersja w oleju mineralnym, 12,9 mmola) poddaje się reakcji z absolutnym EtOH (10 ml) w 0°C. Po zakończeniu wydzielania gazu mieszaninę ociepla się do temperatury pokojowej. W jednej porcji dodaje się stały 4-benzloksybanzaldehyd (2,05 g, 9,68 mmola). Do tej mieszaniny dodaje się kroplami roztwór 2-cyjanometylo-4-(trifluorometylo)tiazolu (1,24 g) w absolutnym EtOH (20 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 4 godziny, następnie osad odsącza się i przemywa heksanami i otrzymuje tytułowy związek (1,64 g, 42% po 2 etapach) w postaci żółtego ciała stałego:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,25 (s, 1H), 8,00 (d, J=6 Hz, 2H), 7,79 (s, 1H), 7,40 (m, 5H), 7,10 (d, J=6 Hz, 2H), 5,18 (s, 2H).

c) 3-(4-benzyloksyfenylo)-2-cyjano-2-[(4-trifluorometylo)tiazol-2-ylo]oksiran

Do roztworu 3-(4-benzyloksyfenylo)-2-[(4-trifluorometylo)tiazol-2-ylo]akrylonitrylu (500 mg, 1,29 mmola) w CH2CN (5 ml) dodaje się obojętny tlenek glinu (1,3 g). Dodaje się w temperaturze pokojowej wybielacz Clorox (5 ml). Po 1 godzinie mieszaninę odsącza się. Przesącz rozcieńcza się H2O (20 ml) i ekstrahuje CH2Cl2 (3x20 ml). Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża, po czym otrzymuje się tytułowy związek (425 mg, 82%) w postaci żółtego oleju, który jest wystarczająco czysty do stosowania w kolejnym etapie.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,90 (s, 1H), 7,40 (m, 7H), 7,06 (d, J=6 Hz, 2H), 5,10 (s, 2H), 4,59 (s, 1H).

PL 200 404 B1

d) 2-(4-benzyloksyfenylo)-1-[4-(trifluorometylo)tiazol-2-ylo]etanon

Do roztworu 3-(4-benzyloksyfenylo)-2-cyjano-2-[(4-trifluorometylo)tiazol-2-ylo]oksiranu (425 mg, 1,06 mmola) w CH2Cl2 (7 ml) dodaje się Et3SiH (0,85 ml, 5,3 mmola), a następnie kroplami w 0°C

BF₃-OEt₂ (0,39 ml, 3,17 mmola). Po 2 godz. mieszaninę przelewa się do H₂O (20 ml) i ekstrahuje

CH2Cl2 (3x20 ml). Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża.

Powyższą pozostałość w suchym THF (7 ml) dodaje się do roztworu TBAF w THF (1,0 M, 1,6 ml, 1,6 mmola) w 0°C. Po 1 godz. mieszaninę przelewa się do nasyconego NH4Cl (20 ml) i ekstrahuje EtOAc (3x20 ml). Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża. Pozostałość poddaje się chromatografii na silikażelu (5% EtOAc/heksany) i otrzymuje się tytułowy związek (167 mg, 40%) w postaci białego ciała stałego:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,05 (s, 1H), 7,35 (m, 7H), 6,92 (d, J=6 Hz, 2H), 5,05 (s, 2H), 4,40 (s, 1H).

e) (±)-3-[4-(trifluorometylo)tiazol-2-ylo]-4-(4-hydroksyfenylo)butanian metylu

Do zawiesiny NaH (35 mg, 0,88 mmola) w suchym THF (2 ml) dodaje się kroplami w temperaturze pokojowej fosfonooctan trietylu (0,17 ml, 0,88 mmola). Po 15 minutach dodaje się kroplami roztwór 2-(4-benzyloksyfenylo)-1-[4-(trifluorometylo)tiazol-2-ylo]etanonu (167 mg, 0,44 mmola) w suchym THF (2 ml) i mieszaninę ogrzewa się w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Po 18 godz. mieszaninę schładza się do temperatury pokojowej, reakcję przerywa nasyconym NH4Cl (10 ml) i ekstrahuje EtOAc (3x20 ml). Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża, co daje surowy (±)-3-[4-(trifluorometylo)tiazol-2-ylo]-4-(4-benzyloksyfenylo)krotonian etylu w postaci oleju. Substancję tę stosuje się bez dalszego oczyszczania.

(±)-3-[4-(trifluorometylo)tiazol-2-ylo]-4-(4-benzyloksyfenylo)krotonian etylu (0,44 mmola, surowy) rozpuszcza się w MeOH (4 ml) i dodaje się w temperaturze pokojowej wiórki magnezu (53 mg, 2,20 mmola). Po 72 godz. mieszaninę przelewa się do 10% HCl (75 ml) i ekstrahuje CH2Cl2 (3x50 ml). Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża, co daje surowy (±)-3-[4-(trifluorometylo)tiazol-2-ylo]-4-(4-benzyloksyfenylo)butanian metylu. Substancję tę stosuje się bez dalszego oczyszczania.

Do roztworu (±)-3-[4-(trifluorometylo)tiazol-2-ylo]-4-(4-benzyloksyfenylo)butanianu metylu (0,44 mmola, surowy) w EtSH (5 ml) w temperaturze pokojowej dodaje się BF₃-OEt₂ (0,3 ml). Po 18 godz. dodaje się kolejną porcję BF₃-OEt₂ (0,3 ml). Po kolejnych 18 godz. mieszaninę schładza się do 0°C i ostrożnie przerywa reakcję nasyconym NaHCO3. Otrzymaną mieszaninę ekstrahuje się CH2Cl2 (3x25 ml). Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża. Pozostałość poddaje się chromatografii na silikażelu (30% EtOAc/heksany) i otrzymuje tytułowy związek (123 mg, 81% po 3 etapach) w postaci żółtego oleju: MS (ES) m/e 346 (M+H)⁺.

Preparat 6

Wytwarzanie (±)-3-(5-metylotiazol-2-ilo)-4-(4-hydroksyfenylo)butanianu metylu

a) 4-(benzyloksy)fenylooctan metylu

Do zawiesiny K2CO3 (20,7 g, 150 mmoli) w acetonie (50 ml) dodaje się 4-hydroksyfenylooctan metylu (5,0 g, 30 mmoli) i chlorek benzylu (10,4 ml, 90 mmoli) i mieszaninę ogrzewa się do temperatury wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Po 24 godz. mieszaninę schładza się do temperatury pokojowej, przesącza i zatęża. Pozostałość poddaje się chromatografii na silikażelu (10% EtOAc/heksany) i otrzymuje się tytułowy związek (7,7 g, 100%) w postaci białego ciała stałego:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,40 (m, 5H), 7,21 (d, J=6,6 Hz, 2H), 6,95 (d, J=6,6 Hz, 2H), 5,05 (s, 2H), 3,70 (s, 3H), 3,59 (s, 2H).

b) 2-(4-benzyloksyfenylo)-1-(5-metylotiazol-2-ilo)etanon

Do roztworu 5-metylotiazolu (0,21 ml, 2,34 mmola) w suchym THF (10 ml) dodaje się kroplami w -78°C n-BuLi (0,94 ml, 2,5 M roztworu w heksanach, 2,34 mmola). Po 15 minutach dodaje się kroplami 4-benzyloksyfenylooctan metylu (0,5 g, 1,95 mmola) w suchym THF (5 ml). Po 30 minutach reakcję przerywa się nasyconym NH4Cl (10 ml), ociepla do temperatury pokojowej i ekstrahuje EtOAc (3x20 ml). Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża. Pozostałość poddaje się chromatografii na silikażelu (15% EtOAc/heksany) i otrzymuje tytułowy związek w postaci białego ciała stałego (532 mg, 51%): MS (ES) m/e 324 (M+H)⁺.

c) (±)-4-(4-benzyloksyfenylo)-3-(5-metylotiazol-2-ilo)krotonian etylu

Do zawiesiny NaH (79 mg, 1,98 mmola) w suchym THF (2 ml) dodaje się kroplami w temperaturze pokojowej fosfonooctan trietylu (0,39 ml, 1,98 mmola). Po 15 minutach dodaje się kroplami roztwór 2-(4-benzyloksyfenylo)-1-(5-metylotiazol-2-ilo)etanonu (320 mg, 0,99 mmola) w suchym THF (3 ml) i mieszaninę ogrzewa się w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Po 18 godz. mieszaninę

PL 200 404 B1 schładza się do temperatury pokojowej, reakcję przerywa nasyconym NH4Cl (10 ml) i ekstrahuje EtOAc (3x20 ml). Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża. Otrzymany żółty olej stosuje się w następnym etapie bez oczyszczania; MS (ES) m/e 394 (M+H)⁺.

d) (±)-3-(5-metylotiazol-2-ilo)-4-(4-benzyloksyfenylo)butanian metylu (±)-4-(4-benzyloksyfenylo)-3-(5-metylotiazol-2-ilo)krotonian etylu (0,99 mmola, surowy) rozpuszcza się w MeOH (5 ml) i w temperaturze pokojowej dodaje się wiórki magnezu (120 mg, 4,95 mmola). Po 72 godz. mieszaninę przelewa się do 10% HCl (75 ml) i ekstrahuje CH2Cl2 (3x50 ml). Połączone ekstrakty organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża, po czym otrzymuje się tytułowy związek. Stosuje się go bez dalszego oczyszczania: MS (ES) m/e 382 (M+H)⁺.

e) (±)-3-(5-metylotiazol-2-ilo)-4-(4-hydroksyfenylo)butanian metylu

Do roztworu (±)-3-(5-metylotiazol-2-ilo)-4-(4-benzyloksyfenylo)butanianu metylu (0,99 mmola, surowy) w EtSH (5 ml) dodaje się w temperaturze pokojowej BF₃OEt₂ (0,6 ml). Po 18 godz. dodaje się kolejną porcję BF₃OEt₂ (0,6 ml). Po kolejnych 18 godz. mieszaninę schładza się do 0°C i ostrożnie przerywa reakcję nasyconym NaHCO3. Otrzymaną mieszaninę ekstrahuje się CH2Cl2 (3x25 ml). Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża. Pozostałość poddaje się chromatografii na silikażelu (50% EtOAc/heksany) i otrzymuje tytułowy związek (249 mg, 86% po 3 etapach) w postaci żółtego ciała stałego: MS (ES) m/e 292 (M+H)⁺.

Preparat 7

Wytwarzanie (4R,5S)-1-akroilo-3,4-dimetylo-5-fenyloimidazolidyn-2-onu

Do roztworu (4S,5R)-1,5-dimetylo-4-fenylo-2-imidazolidynonu (45,0 g, 237 mmoli) i (i-Pr)2NEt (62 ml, 355 mmole) w CH2Cl2 (1200 ml) dodaje się CuCl (50 mg, 0,51 mmola), a następnie chlorek akryloilu (29 ml, 355 mmoli) i mieszaninę ogrzewa się do temperatury wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Po 2 godz. mieszaninę schładza się do RT temperatury pokojowej, przemywa H2O (3x400 ml), suszy nad MgSO4 i zatęża. Otrzymany osad rozciera się z Et2O (300 ml) i odsącza, po czym otrzymuje się tytułowy związek (45,15 g, 78%):

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,72 (dd, J=17,0, 10,5 Hz, 1H), 7,20-7,38 (m, 3H), 7,10-7,20 (m, 2H), 6,40 (dd, J=17,0, 2,1 Hz, 1H), 5,77 (dd, J=10,4, 2,0 Hz, 1H), 5,36 (d, J=8,5 Hz, 1H), 3,85-4,00 (m, 1H), 2,85 (s, 3H), 0,82 (d, J=6,6 Hz, 3H); MS (ES) m/e 245 (M+H)⁺.

Preparat 8

Wytwarzanie bromku 4-metoksyfenylomagnezu

Roztwór chlorku 4-metoksybenzylu (120 g, 766 mmoli) w suchym THF (1,0 l) dodaje się kroplami w temperaturze pokojowej przez 1,5 godz. do mieszaniny wiórek magnezu (74 g, 3,04 mola) i J2 (50 mg, 0,20 mmola) w suchym THF (0,5 l). Podczas pierwszych 10 minut dodawania brązowy kolor rozprasza się i mieszanina reakcyjna staje się ciepła. Jedną godzinę po zakończeniu dodawania reakcja powraca do temperatury pokojowej. Miareczkowanie przy użyciu 1,10-fenantroliny wykazuje, że roztwór ma stężenie 0,36 M odczynnika Grignarda w THF.

Preparat 9

Wytwarzanie (S)-3-(3-fluorofenylo)-4-(4-hydroksyfenylo)butanianu etylu (a) (4R,5S)-3,4-dimetylo-1-[(E)-3-(3-fluorofenylo)prop-2-enoilo]-5-fenyloimidazolidyn-2-on

Roztwór 1-bromo-3-fluorobenzenu (525 mg, 3 mmole), (4R, 5S)-1-akryloilo-3,4-dimetylo-5-fenyloimidazolidyn-2-onu (500 mg, 2 mmole), Pd(OAc)2 (22 mg, 0,10 mmola), P(o-tolil)3 (61 mg, 0,20 mmola) i (i-Pr)2NEt (0,73 ml, 4,2 mmola) w suchym DMF (10 ml) odgazowuje się (3x próżnia/przepuszczenie N2), po czym ogrzewa do 110°C. Po 2 godz. mieszaninę schładza się i przelewa do EtOAc. Otrzymaną mieszaninę przemywa się H2O (3x), a połączone warstwy wodne ponownie ekstrahuje się EtOAc. Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza przez sączek z silikażelu i zatęża. Pozostałość rozpuszcza się w mieszaninie 1:1 Et2O/heksany (10 ml) i schładza do -20°C na noc. Osad odsącza się i suszy pod próżnią, po czym otrzymuje tytułowy związek (514 mg, 76%):

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,18 (d, J=15,9 Hz, 1H), 7,64 (d, J=15,9 Hz, 1H), 7,15-7,45 (m, 8H), 6,98-7,10 (m, 1H), 5,42 (d, J=8,5 Hz, 1H), 3,88-4,03 (m, 1H), 2,88 (s, 3H), 0,85 (d, J=6,6 Hz, 3H); MS (ES) m/e 339 (M+H)⁺.

(b) (4R,5S)-3,4-dimetylo-1-[(S)-3-(3-fluorofenylo)-4-(4-metoksyfenylo)butanoilo]-5-fenyloimidazolidyn-2-on

Roztwór bromku 4-metoksyfenylomagnezu w THF (0,31 M, 14,7 ml, 4,56 mmola) dodaje się kroplami w -15°C do mieszanej zawiesiny (4R,5S)-3,4-dimetylo-1-[(E)-3-(3-fluorofenylo)prop-2-enoilo]-5-fenyloimidazolidyn-2-onu (514 mg, 1,52 mmola), kompleksu CuBr-DMS (229 mg, 1,06 mmola)

PL 200 404 B1 i ZnJ2 (582 mg, 1,82 mmola) w układzie THF/toluen (10 ml). Po 1,5 godz. reakcję przerywa się nasyconym NH4Cl i ekstrahuje EtOAc (3x). Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4 i zatęża do sucha. Pozostałość rozpuszcza się w 1:1 Et2O/heksany i schładza do -20°C na 18 godzin. Odsącza się osad, przemywa układem 1:1 Et2O/heksany i suszy pod próżnią, po czym otrzymuje się pierwszy rzut tytułowego związku. Przesącz zatęża się, a pozostałość oczyszcza metodą szybkiej chromatografii na silikażelu (30% EtOAc/heksany) i otrzymuje dodatkową porcję tytułowego związku w postaci żółtego oleju, który krzepnie pod próżnią. Całkowita wydajność tytułowego związku wynosi 0,62 g (91%):

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 6,75-7,37 (m, 13H), 5,10 (d, J=8,5 Hz, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,65-3,85 (m, 1H), 3,63 (dd, J=16,7, 9,6 Hz, 1H), 3,36-3,41 (m, 1H), 3,14 (dd, J=16,7, 4,98 Hz, 1H), 2,72-2,88 (m, 2H), 2,79 (s, 3H), 0,74 (d, J=6,6 Hz, 3H).

(c) (S)-3-(3-fluorofenylo)-4-(4-metoksyfenylo)butanian etylu

Roztwór 21% NaOEt w EtOH (0,6 ml, 1,8 mmola) dodaje się do roztworu (4R, 5S)-3,4-dimetylo-1-[(S)-3-(3-fluorofenylo)-4-(4-metoksyfenylo)butanoilo]-5-fenyloimidazolidyn-2-onu (620 mg, 1,38 mmola) w THF (10 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 1 godz., następnie reakcję przerywa nasyconym NH4Cl. Po ekstrakcji EtOAc, suszeniu (MgSO4) i zatężeniu otrzymuje się pozostałość, którą przesącza się przez sączek z silikażelu (15% EtOAc/heksany). Przesącz zatęża się i otrzymuje tytułowy związek (263 mg, 60%), w postaci klarownego oleju:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,13-7,35 (m, 1H), 6,80-7,00 (m, 5H), 6,70-6,80 (m, 2H), 4,00 (q, J=7,1 Hz, 2H), 3,81 (s, 3H), 3,28-3,45 (m, 1H), 2,83 (d, J=7,5 Hz, 2H), 2,65 (dd, J=15,4, 6,4 Hz, 1H), 2,56 (dd, J=15,4, 8,7 Hz, 1H), 1,12 (t, J=7,1 Hz, 3H).

(d) (S)-3-(3-fluorofenylo)-4-(4-hydroksyfenylo)butanian etylu

Do roztworu (S)-3-(3-fluorofenylo)-4-(4-metoksyfenylo)butanianu etylu (263 mg, 0,83 mmola) w CH2Cl2 (5 ml) dodaje się w temperaturze -15°C etanotiol (0,30 ml, 4,16 mmola), następnie AlCl3 (555 mg, 4,16 mmola). Po 30 minutach mieszaninę ociepla się do temperatury pokojowej, miesza przez kolejne 30 minut, następnie wylewa na lód. Po stopieniu lodu mieszaninę ekstrahuje się CH2Cl2 (3x). Po wysuszeniu (MgSO4) i zatężeniu otrzymuje się pozostałość, którą przesącza się przez sączek z silikażelu (30% EtOAc/heksany). Po zatężeniu przesączu otrzymuje się tytułowy związek (250 mg, ilościowo):

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,10-7,35 (m, 1H), 6,78-7,00 (m, 5H), 6,58-6,78 (m, 2H), 5,00 (s, 1H), 4,00 (q, 2H), 3,28-3,45 (m, 1H), 2,83 (d, 2H), 2,50-2,75 (m, 2H), 1,17 (t, 3H).

Preparat 10

Wytwarzanie (±)-4-(4-hydroksyfenylo)-3-(pirydyn-3-ylo)butanianu etylu (a) 2-(tert-butylodimetylosililoksy)-2-(pirydyn-3-ylo)acetonitryl

Do roztworu 3-pirydynokarboksyaldehydu (1,0 g, 9,34 mmola) w CH3CN (45 ml) dodaje się KCN (6,0 g, 93 mmole), TBDMSCl (1,7 g, 11,21 mmola) i ZnJ2 (50 mg, 0,16 mmola). Po 4 godz. w temperaturze pokojowej mieszaninę przesącza się przez celite® i przesącz zatęża. Po szybkiej chromatografii na silikażelu (25% EtOAc/heksany) otrzymuje się tytułowy związek (2,17 g, 94%) w postaci klarownego oleju:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,63-8,73 (m, 2H), 7,80-7,87 (m, 1H), 7,33-7,41 (m, 1H), 5,57 (s, 1H), 0,91 (s, 9H), 0,27 (s, 3H), 0,19 (s, 3H).

(b) (±)-3-(4-benzyloksyfenylo)-2-(tert-butylodimetylosililoksy)-2-(pirydyn-3-ylo)propiononitryl

LDA wytwarza się przez dodanie n-BuLi (2,5 M w heksanach, 1,93 ml, 4,83 mmola) do roztworu diizopropyloaminy (0,63 ml, 4,83 mmola) w suchym THF (5 ml) w temperaturze 0°C. Roztwór LDA dodaje się kroplami w -78°C do roztworu 2-(tert-butylodimetylosililoksy)-2-(pirydyn-3-ylo)acetonitrylu (1,0 g, 4,03 mmola) w suchym THF (15 ml). Roztwór miesza się przez 15 minut, następnie dodaje się w jednej porcji stały chlorek 4-benzyloksybenzylu (1,41 g, 6,05 mmola). Mieszaninę utrzymuje się w temperaturze -78°C przez 15 minut, po czym ociepla do temperatury pokojowej. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej reakcję przerywa się nasyconym wodnym roztworem NH4Cl i miesza przez 20 minut. Ekstrakcja EtOAc (3x), suszenie (MgSO4), zatężenie i szybka chromatografia na silikażelu (20% (EtOAc/heksany) daje tytułowy związek (769 mg, 43%) w postaci żółtego oleju:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,80 (wąski S, 1H), 8,67-8,70 (m, 1H), 7,75-7,80 (m, 1H), 7,337,53 (m, 6H), 7,08 (d, 2H), 6,93 (d, 2H), 5,10 (s, 2H), 3,30 (1/2 Abq, 1H), 3,18 (1/2Abq, 1H), 0,99 (s, 9H), 0,12 (s, 3H), 0,08 (s, 3H).

(c) 2-(4-benzyloksyfenylo)-1-(pirydyn-3-ylo)-etanon

Roztwór TBAF w THF (1,0 M, 2,2 ml, 2,2 mmola) dodaje się kroplami w temperaturze -15°C do roztworu (±)-3-(4-benzyloksyfenylo)-2-(tert-butylodimetylosililoksy)-2-(pirydyn-3-ylo)propiononitrylu (769 mg,

PL 200 404 B1

1,73 mmole) w suchym THF (10 ml). Po 30 minutach reakcję rozdziela się pomiędzy EtOAc i H2O.Warstwy rozdzielają się i warstwę organiczną przemywa się H2O, suszy (MgSO4), przesącza przez sączek z silikażelu i zatęża, co daje zanieczyszczony związek tytułowy (492 mg, 94%) w postaci żółtego ciała stałego: MS (ES) m/e 304 (M+H)⁺. Substancję tę stosuje się bez dalszego oczyszczania.

(d) 4-(4-benzyloksyfenylo)-3-pirydyn-3-ylo)but-2-enian etylu

Fosfonooctan trietylu (0,70 ml, 3,46 mmola) dodaje się kroplami w temperaturze pokojowej do zawiesiny NaH (60% dyspersja w oleju mineralnym, 138 mg, 3,46 mmola) w suchym THF (5 ml). Gdy zanika wydzielanie gazu dodaje się roztwór 2-(4-benzyloksyfenylo)-1-(pirydyn-3-ylo)etanonu (około 1,73 mmola, zanieczyszczona substancja z preparatu 10 (c)) w suchym THF (5 ml) i mieszaninę ogrzewa się w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Po 19 godzinach mieszaninę schładza się do temperatury pokojowej, reakcję przerywa nasyconym wodnym NH4Cl i ekstrahuje EtOAc (3x). Połączone warstwy organiczne suszy się (MgSO4) i zatęża, po czym otrzymuje surowy tytułowy związek: MS (ES) m/e 374 (M+H)⁺. Substancję tę stosuje się bez dalszego oczyszczania.

(e) (±)-4-(4-hydroksyfenylo)-3-(pirydyn-3-ylo)-butanian etylu

Mieszaninę 4-(4-benzyloksyfenylo)-3-pirydyn-3-ylo)but-2-enianu etylu (1,73 mmola) i 10% Pd/C (200 mg) w EtOH (10 ml) wytrząsa się w atmosferze H2 344,74·10³ Pa (50 psi) w aparacie Parr. Po 4 godz. mieszaninę przesącza się przez celite®, a przesącz zatęża się. Po szybkiej chromatografii na silikażelu (50% EtOAc/heksany) otrzymuje się zanieczyszczony związek tytułowy (327 mg, 66% po trzech etapach) w postaci żółtego oleju: MS (ES) m/e 286 (M+H)⁺. Substancję tę stosuje się bez dalszego oczyszczania.

Preparat 11

Wytwarzanie (S)-4-(4-hydroksyfenylo)-3-(pirydyn-3-ylo)butanianu etylu (a) (4R, 5S)-3,4-dimetylo-1-[(E)-3-(pirydyn-3-ylo)prop-2-enoilo]-5-fenyloimidazolidyn-2-on

Roztwór 3-bromopirydyny (8,6 ml, 88,5 mmola), (4R, 5S)-1-akryloilo-3,4-dimetylo-5-fenyloimidazolidyn-2-onu (14,4 g, 59 mmoli), Pd(OAc)2 (662 mg, 2,95 mmola), P(o-tolil)3 (1,82 g, 5,9 mmola) i (i-Pr)2NEt (22 ml, 124 mmola) w suchym DMF (300 ml) odgazowuje się (3x próżnia/przepuszczenie N2), po czym ogrzewa do 110°C. Po 2 godz. mieszaninę schładza się i przelewa do EtOAc. Otrzymaną mieszaninę przemywa się H2O (3x), a połączone warstwy wodne ponownie ekstrahuje się EtOAc. Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza przez sączek z silikażelu i zatęża. Pozostałość rozpuszcza się w mieszaninie 1:1 Et2O/heksany i odsącza się osad, przemywa układem 1:1 EtOAc/heksany, suszy pod próżnią i otrzymuje pierwszą porcję tytułowego związku. Przesącz zateża się i powtarza proces krystalizacji, po czym otrzymuje się drugą porcję. Całkowita wydajność tytułowego związku wynosi 17,53 g (92%):

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,48-8,85 (m, 2H), 8,25 D, J=15,9 Hz, 1H), 7,89-7,97 (m, 1H), 7,68 (d, J=15,9 HZ, 1H), 7,15-7,38 (m, 6H), 5,43 (d, J=8,5 Hz, 1H), 3,90-4,02 (m, 1H), 2,88 (s, 3H), 0,85 (d, J=6,6 Hz, 3H); MS (ES) m/e 322 (M+H)⁺.

(b) (4R, 5S)-3,4-dimetylo-1-[(S)-4-(4-metoksyfenylo)-3-(pirydyn-3-ylo)butanoilo]-5-fenyloimidazolidyn-2-on

Roztwór bromku 4-metoksyfenylomagnezu w THF (0,33 M, 495 ml, 163,5 mmola) dodaje się kroplami w -15°C do mieszanej zawiesiny (4R, 5S)-3,4-dimetylo-1-[(E)-3-(pirydyn-3-ylo)prop-2-enoilo]-5-fenyloimidazolidyn-2-on (17,53 g, 54,5 mmola), kompleksu CuBr-DMS (14,1 g, 65,4 mmola) i ZnJ2 (20,9 mg, 65,4 mmola) w układzie THF/toluen (270 ml). Po 1 godz. reakcję przerywa się układem 9:1 nasycony NH4Cl/stęż. NH4OH i mieszaninę miesza się na powietrzu przez 30 minut. Mieszaninę rozcieńcza się H2O i ekstrahuje EtOAc (3x). Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4 i zatęża. Pozostałość rozpuszcza się w eterze metylowo-tert-butylowym (MTBE, 200 ml) i przechowuje przez noc w -20°C. Osad odsącza się, przemywa MTBE i suszy pod próżnią. Substancję tę rekrystalizuje się z układu 3:1 heksany/EtOAc i otrzymuje tytułowy związek (19,408 g, 80%):

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,72 (szer. s, 2H), 7,50 (wąski m, 1H), 7,12-7,35 (m, 4H), 6,977,03 (m, 2H), 6,94 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,72 (d, J=8,6 Hz, 2HO, 5,11 (d, J=8,4 Hz, 1H), 3,70-3,90 (m, 2H), 3,70 (s, 3H), 3,43-3,58 (m, 1H), 3,03-3,18 (m, 1H), 2,75-2,95 (m, 2H), 2,71 (s, 3H), 0,66 (d, J=6,5 Hz, 3H); MS (ES) m/e 444 (M+H⁺).

(c) ( S)-4-(4-metoksyfenylo)-3-(pirydyn-3-ylo)-butanian etylu

Roztwór 21% NaOEt w EtOH (18,4 ml, 56,88 mmola) dodaje się w 0°C do roztworu (4R, 5S)-3,4-dimetylo-1-[(S)-4-(4-metoksyfenylo)-3-(pirydyn-3-ylo)butano-ylo]-5-fenyloimidazolidyn-2-onu (19,408 g, 43,8 mmola) w THF (200 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 1 godz., następnie reakcję przerywa nasyconym NH4Cl i ekstrahuje EtOAc (3x). Połączone warstwy organiczne suszy się (MgSO4)

PL 200 404 B1 i zatęża. Pozostałość rozpuszcza się w układzie 1:1 EtOAc/heksany i przesącza, a przesącz przesącza się przez sączek z silikażelu (1:1 EtOAc/heksany). Przesącz zatęża się i otrzymuje tytułowy związek (9,25 g, 71%), w postaci pomarańczowego oleju:

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,57 (szer. s, 2H), 7,44 (wąski m, 1H), 7,17-7,25 (m, 1H), 6,95 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,76 (d, J=8,6 Hz, 2H), 4,01 (q, J=7,1 Hz, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,33-3,48 (m, 1H), 2,911 (dd, J=13,7, 7,3 Hz, 1H), 2,85 (dd, J=13,7, 7,8, 1H), 2,71 (dd, J=15,6, 6,5, 1H), 2,61 (dd, J=15,6, 8,7 Hz, 1H), 1,13 (t, J=7,1 Hz, 3H); MS (ES) m/e 300 (M+H)⁺.

(d) (S)-4-(4-hydroksyfenylo)-3-(pirydyn-3-ylo)-butanian etylu

Roztwór (S)-4-(4-metoksyfenylo)-3-(pirydyn-3-ylo)butanianu etylu (9,25 g, 31 mmoli) w CH2Cl2 (150 ml) schładza się do 0°C. Dodaje się etanotiol (11,5 ml, 155 mmoli), następnie porcjami AlCl3 (20,7 g, 155 mmoli). Po 2 godz. mieszaninę wylewa się na lód, ociepla do temperatury pokojowej i zobojętnia NaHCO3. Otrzymaną zawiesinę przesącza się przez celit® i sączek przemywa CH2Cl2. Warstwy rozdzielają się i warstwę wodną ekstrahuje się CH2Cl2. Połączone warstwy organiczne suszy się (MgSO4) i zatęża. Szybka chromatografia na silikażelu (1:1 EtOAc/heksany) daje tytułowy związek (6,453 g, 73%):

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,72, 7,41 (dd, J=4,9, 1,5 Hz, 1H), 8,24 (wąski m, 1H), 7,26 (dd, J=7,8, 4,9 Hz, 1H), 6,78 (d, J=8,5 Hz, 2H), 6,64 (d, J=8,5 Hz, 2H), 4,03 (q, J=7,1 Hz, 2H), 3,34-3,48 (m, 1H), 2,92 (dd, J=13,7, 6,1 Hz, 1H), 2,69-2,81 (m, 2H), 2,64 (dd, J=15,6, 8,7 Hz, 1H), 1,13 (t, J=7,1 Hz, 3H); MS (ES) m/e 286 (M+H)⁺.

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie kwasu (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]fenylo]-3-[4-(trifluorometylo)fenylo]butanowego

a) (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]fenylo]-3-[4-(trifluorometylo)fenylo]butanian etylu

Azodikarboksylan diizopropylu (0,15 ml, 0,767 mmola) dodaje się przez 2 minuty w temperaturze 0°C w atmosferze N2 do roztworu (±)-4-(4-hydroksyfenylo)-3-[4-(trifluorometylo)fenylo]-butanianu etylu (270 mg, 0,767 mmola), 6-(metyloamino)-2-pirydyloetanolu (130 mg, 0,92 mmola) i trifenylofosfiny (200 mg, 0,767 mmola) w bezwodnym THF (5 ml). Żółty roztwór utrzymuje się w 0°C przez 10 minut, po czym ociepla do temperatury pokojowej. Po 2 godz. reakcję zatęża się, a pozostałość poddaje chromatografii na silikażelu (20 EtOAc/heksany). Tytułowy związek (100 mg, 54%) otrzymuje się w postaci bezbarwnego oleju: MS (ES) m/e 487 (M+H)⁺.

b) kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]fenylo]-3-[4-(trifluorometylo)fenylo]butanowy

1,0 N NaOH (8,2 ml, 0,823 mmola) dodaje się kroplami do schłodzonego (15°C) roztworu (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]fenylo]-3-[4-(trifluorometylo)fenylo]butanianu etylu (200 mg, 0,41 mmola) w MeOH (3 ml) i mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej przez 24 godz. Otrzymany roztwór zatęża się pod próżnią, a pozostałość rozpuszcza w H2O (5 ml). Wartość pH doprowadza się do 5 za pomocą 1,0 N HCl, odsącza się osad, przemywa małą ilością wody i suszy pod próżnią w temperaturze 60°C. Tytułowy związek (120 mg, 64%) otrzymuje się w postaci białego, pienistego osadu:

MS (ES) m/e 459 (M+H)⁺.

Analiza dla C25H25FN₂O3^0,85 H₂O: obliczono: C 63,35; H, 5,68; N, 5,91. znaleziono: C, 63,23; H, 5,41; N 5,73.

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie kwasu (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]fenylo]-3-[4-[(N-metylo-N-fenyloamino)karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]butanowego

a) (±)-3-[4-[(N-metylo-N-fenyloamino)karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]-4-(4-hydroksyfenylo)butanian metylu

Do roztworu (±)-3-[4-karboksy-1,3-oksazol-2-ylo]4-[4-[(tert-butoksykarbonylo)oksy]fenylo]-butanianu metylu (150 mg, 0,37 mmola), (i-Pr)2NEt (0,1 ml, 0,56 mmola), pirydyny (0,09 ml, 1,11 mmola) i N-metyloaniliny (0,06 ml, 0,56 mmola) w suchym DMF (2 ml) dodaje się w temperaturze pokojowej BPFFH (382 mg, 1,11 mmola). Po 18 godz. mieszaninę zatęża się. Pozostałość rozpuszcza się w 10% HCl (20 ml) i ekstrahuje CH2Cl2 (3x20 ml). Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża.

Powyższą pozostałość rozpuszcza się w 4N HCl w dioksanie (10 ml) w temperaturze pokojowej. Po 18 godz. mieszaninę zatęża się. Pozostałość poddaje chromatografii na silikażelu (75% EtO30

PL 200 404 B1

Ac/heksany) i otrzymuje tytułowy związek (146 mg) w postaci pomarańczowej pianki zanieczyszczonej bis(pentametyleno)-mocznikiem; MS (ES) m/e 417 (M+H)⁺.

b) (±)-4-[4-[2-(6-metyloaminopirydyn-2-ylo)-1-etoksy]fenylo]-3-[4-[(N-metylo-N-fenyloamino)-karbonylo]-1,3-oksazol-2-ilo)]butanian metylu

Azodikarboksylan diizopropylu (0,15 ml, 0,74 mmola) dodaje się w temperaturze 0°C do roztworu (±)-3-[4-[(N-metylo-N-fenyloamino)karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]-4-(4-hydroksyfenylo)butanianu metylu (146 mg, 0,37 mmola), 6-(metyloamino)-2-pirydyloetanolu (113 mg, 0,74 mmola) i trifenylofosfiny (194 mg, 0,74 mmola) w CH2Cl2 (2 ml). Mieszanina ociepla się do temperatury pokojowej wraz z ocieplaniem łaźni. Po 18 godz. mieszaninę zatęża się, a pozostałość poddaje chromatografii na silikażelu (50% THF/heksany). Frakcje zawierające produkt zatęża się i otrzymuje tytułowy związek (322 mg) zanieczyszczony tlenkiem trifenylofosfiny: MS (ES) m/e 529 (M+H)⁺.

c) Kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]fenylo]-3-[4-[(N-metylo-N-fenyloamino)karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]butanowego

Do roztworu (±)-4-[4-[2-(6-metyloaminopirydyn-2-ylo)-1-etoksy]fenylo]-3-[4-[(N-metylo-N-fenyloamino)-karbonylo]-1,3-oksazol-2-ilo)]butanianu metylu (322 mg) w 1:1 THF/H2O (2 ml) w temperaturze pokojowej dodaje się 1,0 N LiOH (0,35 ml, 0,35 mmola). Po 18 godz. mieszaninę zakwasza się do pH 6 stosując 10% HCl, następnie zatęża do sucha. Pozostałość oczyszcza się metodą HPLC w odwróconych fazach (gradient 10-80% CH3CN/H2O, zawierający 0,1% TFA). Frakcje zawierające produkt łączy się i zatęża w celu usunięcia CH3CN. Otrzymany wodny roztwór liofilizuje się i otrzymuje tytułowy związek (33 mg, 29% po 3 etapach) w postaci białego ciała stałego:

MS (ES) m/e 515 (M+H)⁺.

Analiza dla C₂₉H₃₀N₄O₅-1,85 TFA wyliczono: C, 54,13; H, 4,42; N, 7,72, znaleziono: C, 54,17; H, 4,50; N, 7,52.

P r z y k ł a d 3

Wytwarzanie kwasu (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]fenylo]-3-[4-[(morfoliny-4-ylo)karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]butanowego

a) (±)-3-[4-(morfolin-4-ylo)karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]-4-(4-hydroksyfenylo)butanian metylu

Do roztworu (±)-3-[4-karboksy-1,3-oksazol-2-ylo]-4-[4-[(tert-butoksykarbonylo)oksy]fenylo]-butanianu metylu (150 mg, 0,37 mmola), (i-Pr)2NEt (0,1 ml, 0,56 mmola), pirydyny (0,09 ml, 1,11 mmola) i morfoliny (0,05 ml, 0,56 mmola) w suchym DMF (2 ml) dodaje się w temperaturze pokojowej BPFFH (382 mg, 1,11 mmola). Po 18 godz. mieszaninę zatęża się. Pozostałość rozpuszcza się w 10% HCl (20 ml) i ekstrahuje CH2Cl2 (3x20 ml). Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża.

Powyższą pozostałość rozpuszcza się w 4N HCl w dioksanie (10 ml) w temperaturze pokojowej. Po 18 godz. mieszaninę zatęża się. Pozostałość poddaje chromatografii na silikażelu (100% EtOAc) i otrzymuje tytułowy związek (122 mg, 88%) w postaci klarownego oleju:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,05 (s, 1H), 7,88 (d, J=6,6 Hz, 2H), 6,70 (d, J=6,6 Hz, 2H), 5,9 (s, 1H), 3,73 (szer. s, 8H), 3,62 (s, 3H), 2,85 (m, 5H).

b) (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]fenylo]-3-[4-[(morfolin-4-ylo)karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]butanian metylu

Azodikarboksylan diizopropylu (0,13 ml, 0,66 mmola) dodaje się w temperaturze 0°C do roztworu (±)-3-[4-(morfolin-4-ylo)karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]-4-(4-hydroksyfenylo)butanian metylu (122 mg, 0,37 mmola), 6-(metyloamino)-2-pirydyloetanolu (100 mg, 0,66 mmola) i trifenylofosfiny (173 mg, 0,66 mmola) w CH2Cl2 (2 ml). Mieszanina ociepla się do temperatury pokojowej wraz z ocieplaniem łaźni. Po 18 godz. mieszaninę zatęża się, a pozostałość poddaje chromatografii na silikażelu (100% EtOAc). Frakcje zawierające produkt zatęża się i otrzymuje tytułowy związek (94 mg) zanieczyszczony tlenkiem trifenylofosfiny: MS (ES) m/e 509 (M+H)⁺.

c) kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]fenylo]-3-[4-[(morfolin-4-ylo)karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]butanowy

Do roztworu (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]fenylo]-3-[4-[(morfolin-4-ylo)karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]butanianu metylu (94 mg, 0,18 mmola) w 1:1 THF/H2O (2 ml) w temperaturze pokojowej dodaje się 1,0 N LiOH (0,25 ml, 0,25 mmola). Po 18 godz. mieszaninę zakwasza się do pH 6 stosując 10% HCl, następnie zatęża do sucha. Pozostałość oczyszcza się metodą HPLC w odwróconych fazach (gradient 15-35% CH3CN/H2O, zawierający 0,1% TFA). Frakcje zawierające produkt łączy się i zatęża w celu usunięcia CH3CN. Otrzymany wodny roztwór liofilizuje się i otrzymuje tytułowy związek (23 mg, 26% po 2 etapach) w postaci białego ciała stałego:

PL 200 404 B1

MS (ES) m/e 495 (M+H)⁺.

Analiza dla C26H30N4O6 . 1,75 TFA: wyliczono; C, 49,76; H, 4,78; N, 7,87, znaleziono: C, 49,93; H, 4,97; N, 7,84.

P r z y k ł a d 4

Wytwarzanie kwasu (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]fenylo]-3-[4-[[N-metylo-N-(2,2,2-trifluoroetylo)amino]karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]butanowego

a) (±)-3-[4-[[N-metylo-N-(2,2,2-trifluoroetylo)-amino]karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]-4-(4-hydroksyfenylo)butanian metylu

Do roztworu (±)-3-[4-karboksy-1,3-oksazol-2-ylo]4-[4-[(tert-butoksykarbonylo)oksy]fenylo]-butanianu metylu (150 mg, 0,37 mmola), (i-Pr)2NEt (0,1 ml, 0,56 mmola), pirydyny (0,09 ml, 1,11 mmola) i chlorowodorku N-metylo-N-(2,2,2-trifluoroetylo)aminy (84 mg, 0,56 mmola) w suchym DMF (2 ml) dodaje się w temperaturze pokojowej BPFFH (382 mg, 1,11 mmola). Po 18 godz. mieszaninę zatęża się. Pozostałość rozpuszcza się w 10% HCl (20 ml) i ekstrahuje CH2Cl2 (3x20 ml). Połączone warstwy organiczne suszy się nad MgSO4, przesącza i zatęża.

Powyższą pozostałość rozpuszcza się w 4N HCl w dioksanie (10 ml) w temperaturze pokojowej. Po 18 godz. mieszaninę zatęża się. Pozostałość poddaje chromatografii na silikażelu (60% EtOAc/heksany) i otrzymuje tytułowy związek (289 mg) w postaci klarownego oleju zanieczyszczonego bis(pentametyleno)-mocznikiem. Olej ten stosuje się w kolejnym etapie bez dalszego oczyszczania.

b) (±)-4-[4-[2-(6-metyloaminopirydyn-2-ylo)-1-etoksy]fenylo]-3-[4-[[N-metylo-N-(2,2,2-trifluoroetylo)amino]karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]butanian metylu

Azodikarboksylan diizopropylu (0,15 ml, 0,74 mmola) dodaje się w temperaturze 0°C do roztworu (±)-3-[4-[[N-metylo-N-(2,2,2-trifluoroetylo)-amino]karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]-4-(4-hydroksyfenylo)butanianu metylu (289 mg, 0,37 mmola), 6-(metyloamino)-2-pirydyloetanolu (113 mg, 0,74 mmola) i trifenylofosfiny (194 mg, 0,74 mmola) w CH2Cl2 (2 ml). Mieszanina ociepla się do temperatury pokojowej wraz z ocieplaniem łaźni. Po 18 godz. mieszaninę zatęża się, a pozostałość poddaje chromatografii na silikażelu (40% EtOAc/heksany). Frakcje zawierające produkt zatęża się i otrzymuje tytułowy związek (115 mg) zanieczyszczony tlenkiem trifenylofosfiny: MS (ES) m/e 535 (M+H)⁺.

c) kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]fenylo]-3-[4-[[N-metylo-N-(2,2,2-trifluoroetylo)amino]karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]butanowy

Do roztworu (±)-4-[4-[2-(6-metyloaminopirydyn-2-ylo)-1-etoksy]fenylo]-3-[4-[[N-metylo-N-(2,2,2-trifluoroetylo)amino]karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]butanianu metylu (115 mg, 0,22 mmola) w 1:1 THF/H2O (2 ml) w temperaturze pokojowej dodaje się 1,0 N LiOH (0,32 ml, 0,32 mmola). Po 18 godz. mieszaninę zakwasza się do pH 6 stosując 10% HCl, następnie zatęża do sucha. Pozostałość oczyszcza się metodą HPLC w odwróconych fazach (gradient 10-80% CH3CN/H2O, zawierający 0,1% TFA). Frakcje zawierające produkt łączy się i zatęża w celu usunięcia CH3CN. Otrzymany wodny roztwór liofilizuje się i otrzymuje tytułowy związek (42 mg, 37% po 3 etapach) w postaci białego ciała stałego:

MS (ES) m/e 522 (M+H)⁺.

Analiza dla C2sH27F3N4O5'1,4 TFA:

wyliczono; C, 49,09; H, 4,21; N, 8,24, znaleziono: C, 49,18; H, 4,18; N, 8,22.

P r z y k ł a d 5

Wytwarzanie kwasu (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]fenylo]-3-[4-(trifluorometylo)tiazol-2-ylo]butanowego

a) (±)-4-[4-[2-(6-metyloaminopirydyn-2-ylo)-1-etoksy]fenylo]-3-[4-(trifluorometylo)tiazol-2-ylo]butanian metylu

Azodikarboksylan diizopropylu (0,14 ml, 0,71 mmola) dodaje się w temperaturze 0°C do roztworu (±)-3-[4-(trifluorometylo)tiazol-2-ylo]-4-hydroksyfenylo)butanianu metylu (123 mg, 0,37 mmola), 6-(metyloamino)-2-pirydyloetanolu (108 mg, 0,71 mmola) 1 trifenylofosfiny (186 mg, 0,71 mmola) w CH2Cl2 (2 ml). Mieszanina ociepla się do temperatury pokojowej wraz z ocieplaniem łaźni. Po 18 godz. mieszaninę zatęża się, a pozostałość poddaje chromatografii na silikażelu (40% EtOAc/heksany). Frakcje zawierające produkt zatęża się i otrzymuje tytułowy związek (114 mg, zanieczyszczony zredukowanym DIAD): MS (ES) m/e 480 (M+H)⁺.

b) kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]fenylo]-3-[4-(trifluorometylo)tiazol-2-ylo]butanowy

PL 200 404 B1

Do roztworu (±)-4-[4-[2-(6-metyloaminopirydyn-2-ylo)-1-etoksy]fenylo]-3-[4-(trifluorometylo)tiazol-2-ylo]butanianu metylu (114 mg, 0,24 mmola) w 1:1 THF/H2O (2 ml) w temperaturze pokojowej dodaje się 1,0 N LiOH (0,36 ml, 0,36 mmola). Po 18 godz. mieszaninę zakwasza się do pH 6 stosując 10% HCl. Otrzymany osad odsącza się, suszy pod próżnią w 50°C i otrzymuje tytułowy związek (43 mg, 42%) w postaci białego ciała stałego:

MS (ES) m/e 466 (M+H)⁺.

Analiza dla C22H₂₂F3N3O3SO,2 H₂O: wyliczono: C, 56,33; H, 4,81; N, 8,96, znaleziono: C, 56,34; H, 4,96; N, 8,88.

P r z y k ł a d 6

Wytwarzanie kwasu (±)-4-[4-[2-(6-metyloaminopirydyn-2-ylo)-1-etoksy]fenylo]-3-(5-metylotiazol-2-ilo)butanowego

a) (±)-4-[4-[2-(6-metyloaminopirydyn-2-ylo)-1-etoksy]fenylo]-3-(5-metylotiazol-2-ilo)butanian metylu

Azodikarboksylan diizopropylu (0,25 ml, 1,28 mmola) dodaje się w temperaturze 0°C do zawiesiny (±)-4-[4-(hydroksyfenylo)-3-(5-metylotiazol-2-ilo)butanianu metylu (249 mg, 0,85 mmola), 6-(metyloamino)-2-pirydyloetanolu (194 mg, 1,28 mmola) i trifenylofosfiny (336 mg, 1,28 mmola) w TBME (5 ml). Mieszanina ociepla się do temperatury pokojowej wraz z ocieplaniem łaźni. Po 72 godz. mieszaninę zatęża się, a pozostałość poddaje chromatografii na silikażelu (30% EtOAc/heksany). Frakcje zawierające produkt zatęża się i otrzymuje tytułowy związek (385 mg, zanieczyszczony tlenkiem trifenylofosfiny): MS (ES) m/e 426 (M+H)⁺.

b) kwas (±)-4-[4-[2-(6-metyloaminopirydyn-2-ylo)-1-etoksy]fenylo]-3-(5-metylotiazol-2-ilo)butanowy

Do roztworu (±)-4-[4-[2-(6-metyloaminopirydyn-2-ylo)-1-etoksy]fenylo]-3-(5-metylotiazol-2-ilo)-butanianu metylu (0,85 mmola) w 1:1 THF/H2O (5 ml) dodaje się 1,0 N NaOH (1,28 ml, 1,28 mmola). Po 18 godz. mieszaninę zakwasza się do pH 6 stosując 10% HCl, po czym zatęża do sucha. Pozostałość poddaje się chromatografii na silikażelu (EtOH) i otrzymuje tytułowy związek w postaci żółtego ciała stałego (217 mg, 62% po 2 etapach):

MS (ES) m/e 412 (M+H)⁺.

Analiza dla C₂₂H₂₅N₃O₃S · 1,2 H₂O wyliczono; C, 61,01; H, 6,38; N, 9,70, znaleziono: C, 61,25; H, 6,06; N, 9,32.

P r z y k ł a d 7

Wytwarzanie kwasu (S)-3-(3-fluorofenylo)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)etoksy]fenylo]butanowego (a) (S)-3-(3-fluorofenylo)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)etoksy]fenylo]-butanian etylu

Azodikarboksylan diizopropylu (0,20 ml, 1,0 mmola) dodaje się kroplami w temperaturze pokojowej do roztworu (S)-3-(3-fluorofenylo)-4-(4-hydroksyfenylo)butanianu etylu (250 mg, 0,83 mmole), 2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)-1-etanolu (178 mg, 1,0 mmola) i trifenylofosfiny (262 mg, 1,0 mmola) w bezwodnym THF (5 ml). Po 18 godz. reakcję zatęża się, a pozostałość oczyszcza się metodą szybkiej chromatografii na silikażelu (5:1 Et2O/heksany) i otrzymuje zanieczyszczony tytułowy związek (236 mg, 61%): MS (ES) m/e 463 (M+H)⁺. Stosuje się go bez dalszego oczyszczania.

(b) kwas (S)-3-(3-fluorofenylo)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)etoksy]-fenylo]butanowy

Do roztworu (S)-3-(3-fluorofenylo)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)etoksy]-fenylo]butanianu etylu (236 mg, 0,51 mmola) w THF/H2O (3 ml) dodaje się 1,0 N LiOH (0,76 ml, 0,76 mmola) i mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 50°C. Po 18 godz. mieszaninę schładza się do temperatury pokojowej i zakwasza do pH 6 za pomocą 10% wodnego HCl. Dodaje się EtOAc (5 ml) i mieszaninę energicznie miesza się. Osad odsącza się sącząc pod zmniejszonym ciśnieniem, przemywa H2O (2x) i Et2O (2x) i suszy w próżni w 50°C, po czym otrzymuje się tytułowy związek:

MS (ES) m/e 435 (M+H)⁺.

Analiza dla C26H27FN2O3 · 2,25 HCl wyliczono; C, 60,46; H, 5,71; N, 5,42, znaleziono: C, 60,44; H, 5,34; N, 5,45.

P r z y k ł a d 8

Wytwarzanie kwasu (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]etoksy]fenylo]-3-(pirydyn-3-ylo)butanowego (a) (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]-etoksy]fenylo]-3-(pirydyn-3-ylo)-butanian etylu

PL 200 404 B1

Sposobem opisanym w przykładzie 7 (a), zastępując (S)-3-(3-fluorofenylo)-4-(4-hydroksyfenylo)butanian etylu 4-(4-hydroksyfenylo)-3-(pirydyn-3-ylo)butanianem etylu (327 mg, zanieczyszczony, 1,15 mmola) i zastępując 2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)-1-etanol 6-(metyloamino)-2-pirydyloetanolem (210 mg, 1,38 mmola) wytwarza się związek tytułowy w postaci zanieczyszczonego, jasno-pomarańczowego ciała stałego, które poddaje się szybkiej chromatografii na silikażelu (100% EtOAc): MS (ES) m/e 420 (M+H). Substancję tę stosuje się bez dalszego oczyszczania.

(b) kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]etoksy]fenylo]-3-(pirydyn-3-ylo)-butanowy

Do roztworu (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]-etoksy]fenylo]-3-(pirydyn-3-ylo)-butanianu etylu (1,15 mmola) w THF/H2O (5 ml) dodaje się 1,0 N LiOH (3,45 ml, 3,45 mmola) i mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 50°C. Po 18 godz. mieszaninę schładza się do temperatury pokojowej i zakwasza do pH 6 za pomocą 10% wodnego HCl. Mieszaninę ekstrahuje się CHCl3 (3x), a połączone warstwy organiczne suszy się (MgSO4) i zatęża. Pozostałość poddaje się chromatografii ma kolumnie C-18 Bond-Elute (10% CH3CN/H2O). Frakcje zawierające produkt zlewa się i ekstrahuje CHCl3 (3x), połączone warstwy organiczne suszy się (MgSO4) i zatęża. Otrzymany osad rozpuszcza się w 2M NaOH i przemywa EtOAc (2x). Ekstrakty EtOAc odrzuca się. Warstwę wodną zakwasza się do pH 6 i ekstrahuje CHCl3 (3x). Połączone warstwy organiczne suszy się (MgSO4) i zatęża, po czym otrzymuje się tytułowy związek (51 mg, 11%) w postaci białego ciała stałego:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,32 (m, 2H), 7,54 (dd, J=8,7, 7,2 Hz, 1H), 7,38-7,46 (m, 1H), 7,12 (dd, J=7,8, 4,9 Hz, 1H), 6,86 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,68 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,52 (d, J=7,2 Hz, 1H), 6,37 (d, J=8,7 Hz, 1H), 4,15-4,30 (m, 2H), 3,39-3,52 (m, 1H), 2,98-3,20 (m, 3H), 2,85 (s, 3H), 2,80 (dd, J=13,7, 8,9 Hz, 1H), 2,68 (dd, J=15,1, 8,3 Hz, 1H), 2,59 (dd, J=15,1, 6,7 Hz, 1H)

MS (ES) m/e 392 (M+H)⁺.

Analiza dla C23H25N3O3^1,3 HCl wyliczono; C, 62,95; H, 6,04; N, 9,57, znaleziono: C, 62,84; H, 5,87; N, 9,20.

P r z y k ł a d 9

Wytwarzanie kwasu (S)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]etoksy]fenylo]-3-(pirydyn-3-ylo)butanowego (a) (S)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]-etoksy]fenylo]-3-(pirydyn-3-ylo)butanian etylu

Azodikarboksylan diizopropylu (7,8 ml, 39,8 mmola) dodaje się kroplami w 0°C do roztworu (S)-4-(4-hydroksyfenylo)-3-pirydyn-3-ylo)butanianu etylu (9,455 g, 33,1 mmola), 6-(metyloamino)-2-pirydyloetanolu (6,06 g, 39,8 mmola) i trifenylofosfiny (10,44 g, 39,8 mmola) w bezwodnym THF (150 ml). Mieszanina ociepla się do temperatury pokojowej wraz z ocieplaniem łaźni. Po 18 godz. reakcję zatęża się, a pozostałość poddaje szybkiej chromatografii na silikażelu (3% MeOH w 1:1 EtOAc/CHCl3) i otrzymuje tytułowy związek (9,2 g, 66%) w postaci lepkiego żółtego oleju:

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,43 (dd, J=4,8, 1,6 Hz, 1H), 8,39 (d, J=1,9 Hz, 1H) , 7,31-7,45 (m, 2H), 7,13-7,21 (m, 1H), 6,91 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,77 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,53 (d, J=7,3 Hz, 1H), 6,24 (d, J=8,2 Hz, 1H), 4,43-4,58 (m, 1H), 4,26 (t, J=7,0 Hz, 2H), 3,92-4,05 (m, 2H), 3,32-3,45 (m, 1H), 3,04 (t, J=7,0 Hz, 2H), 2,89 (d, J=5,3 Hz, 3H), 2,88 (dd, J=13,7, 7,2 Hz, 1H), 2,82 (dd, J=13,7, 7,8 Hz, 1H), 2,70 (dd, J=15,6, 6,3 Hz, 1H), 2,59 (dd, J=15,6, 9,0 Hz, 1H), 1,11 (t, 7,1 Hz, 3H); MS (ES) m/e 420 (M+H)⁺.

(b) kwas (S)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]etoksy]fenylo]-3-(pirydyn-3-ylo)-butanowy

Do roztworu (S)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)-pirydyn-2-ylo]-etoksy]fenylo]-3-(pirydyn-3-ylo)butanianu etylu (9,2 g, 22 mmola) w układzie dioksan/H2O (100 ml) dodaje się 2,0M NaOH (15 ml, 30 mmola) i mieszaninę ogrzewa się w 50°C. Po 18 godz. mieszaninę reakcyjną schładza się do temperatury pokojowej, zakwasza 10% HCl (25 ml) i zatęża do 1/3 objętości, co powoduje wytrącenie żywicy. Ciecz znad osadu dekantuje się, a żywicę rozdziela się pomiędzy H2O i CHCl3. Warstwy oddziela się i warstwę wodną ekstrahuje się CHCl3 ( 3x). Połączone warstwy organiczne suszy się (MgSO4) i zatęża, a pozostałość rozpuszcza się w H2O i 2M NaOH (30 ml). Roztwór przemywa się Et2O (3x) i ekstrakty Et2O odrzuca się. Wodny roztwór zakwasza się 10% HCl (50 ml), zatęża do 1/3 objętości i ekstrahuje CHCl3 (3x). Warstwy organiczne łączy się, suszy (MgSO4) i zatęża, przez co otrzymuje się pianę. Rozpuszcza się ją w CH2Cl2 i roztwór rozcieńcza się heksanami i zatęża. Proces ten powtarza się trzy razy. Otrzymany osad suszy się pod próżnią w 65°C i otrzymuje tytułowy związek (7,96 g, 92%):

¹H NMR (400 MHz, MeOH-d4) δ 8,28 (wąski m, 1H), 8,21 (d, J=1,7 Hz, 1H), 7,68 (wąski m, 1H), 7,48 (dd, J=8,5, 7,3 Hz, 1H), 7,30 (dd, J=7,9, 4,9 Hz, 1H), 6,91 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,72 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,56 (d, J=7,3 Hz, 1H), 6,44 (d, J=8,5 Hz, 1H), 4,20 (t, J=6,6 Hz, 2H), 3,31-3,42 (m, 1H), 3,02

PL 200 404 B1 (t, J=6,6 Hz, 2H), 2,97 (dd, J=13,6, 6,5 Hz, 1H), 2,87 (s, 3H), 2,77 (dd, J=13,6, 8,9 Hz, 1H), 2,71 (dd, J=15,6, 6,4 Hz, 1H), 2,62 (dd, J=15,6, 8,9 Hz, 1H);

MS (ES) m/e 392 (M+H)⁺.

Analiza dla C₂3H₂₃N3O3^0,1 H₂O wyliczono; C, 70,25; H, 6,46; N, 10,68, znaleziono: C, 70,32; H, 6,50; N, 10,32.

P r z y k ł a d 10

Wytwarzanie kwasu (S)-3-(pirydyn-3-ylo)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)etoksy]-fenylo]butanowego (a) (S)-3-(pirydyn-3-ylo)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)etoksy]-fenylo]-butanian etylu

Azodikarboksylan diizopropylu (0,41 ml, 2,1 mmola) dodaje się kroplami w temperaturze pokojowej do roztworu (S)-4-(4-hydroksyfenylo)-3-pirydyn-3-ylo)butanianu etylu (500 mg, 1,75 mmola), 2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)-1-etanolu (374 mg, 2,1 mmola) i trifenylofosfiny (551 mg, 2,1 mmola) w bezwodnym THF (8 ml). Po 18 godz. reakcję zatęża się, a pozostałość poddaje szybkiej chromatografii na silikażelu (90% EtOAc/heksany, następnie 5% EtOH/EtOAc) i otrzymuje tytułowy związek (572 mg, 73%) w postaci oleju:

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,43 (dd, J=4,8, 1,6 Hz, 1H), 8,39 (d, J=1,9 Hz, 1H), 7,41 (wąski m, 1H), 7,17 (dd, J=7,8, 4,8 Hz, 1H), 7,07 (d, J=7,3 Hz, 1H), 6,90 (d, J=8,6, 1H), 6,76 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,44 (d, J=7,3 Hz, 1H), 4,45 (szer. s, 1H), 4,21 (t, J=7,0 Hz, 2H), 3,93-4,08 (m, 2H), 3,31-3,45 (m, 3H), 2,99 (t, J=7,0 Hz, 2H), 2,88 (dd, J=13,7, 7,2 Hz, 1H), 2,82 (dd, J=13,7, 7,8 Hz, 1H), 2,65-2,75 (m, 3H), 2,59 (dd, J=15,6, 9,0 Hz, 1H), 1,85-1,95 (m, 2H), 1,13 (t, J=7,1 Hz, 3H); MS (ES) m/e 446 (M+H)⁺.

(b) kwas (S)-3-(pirydyn-3-ylo)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)etoksy]-fenylo]-butanowy

Do roztworu (S)-3-(pirydyn-3-ylo)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)etoksy]-fenylo]-butanianu etylu (572 mg, 1,28 mmola) w THF/H2O (8 ml) dodaje się 1,0 M LiOH (2,6 ml, 2,6 mmola) i mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 50°C. Po 18 godz. mieszaninę schładza się do temperatury pokojowej i zakwasza do pH 6 za pomocą 10% wodnego HCl. Osad odsącza się sącząc pod zmniejszonym ciśnieniem, przemywa H2O i suszy w próżni, po czym otrzymuje się tytułowy związek (414 mg, 77%):

¹H NMR (400 MHz, MeOH-d4) δ 8,28 (dd, J=4,9, 1,4 Hz, 1H), 8,21 (d, J=1,8 Hz, 1H), 7,68 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,25-7,27 (m, 2H), 6,91 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,71 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,53 (d, J=7,3 Hz, 1H), 4,08-4,22 (m, 2H), 3,30-3,45 (m, 3H), 2,90-3,05 (m, 3H), 2,70-2,85 (m, 3H), 2,68 (dd, J=15,2, 6,7 Hz, 1H), 2,58 (dd, J=15,2, 8,5 Hz, 1H), 1,80-1,97 (m, 2H); MS (ES) m/e 418 (M+H)⁺.

Analiza dla C₂3H₂₃N3O3^0,25 H₂O wyliczono; C, 71,15; H, 6,57; N, 9,96, znaleziono: C, 71,11; H, 6,66; N, 9,82.

P r z y k ł a d 11

Pozajelitowa kompozycja dawki jednostkowej

Preparat zawierający 20 mg związku z przykładu 1 w postaci sterylnego suchego proszku wytwarza się w następujący sposób: 20 mg związku rozpuszcza się w 15 ml destylowanej wody. Roztwór przesącza się w warunkach sterylnych do 25 ml wielodawkowej ampułki i liofilizuje. Do iniekcji dożylnej albo domięśniowej proszek odtwarza się przez dodanie 20 ml 5% dekstrozy w wodzie (D5W). Zatem dawkę określa objętość iniekcji. Dokonane może być kolejne rozcieńczenie przez dodanie odmierzonej ilości tej dawki jednostkowej do kolejnej objętości D5W do iniekcji, albo odmierzona dawka może zostać dodana do innego urządzenia do podawania leku, jak butelka lub torba do wlewu kroplowego IV albo innego układu iniekcji-wlewu.

P r z y k ł a d 12

Doustna kompozycja dawki jednostkowej

Kapsułkę do podawania doustnego wytwarza się przez zmieszanie i zmielenie 50 mg związku z przykładu 1 z 75 mg laktozy i 5 mg stearynianu magnezu. Uzyskany proszek przesiewa się i wypełnia nim kapsułkę z twardej żelatyny.

P r z y k ł a d 13

Doustna kompozycja dawki jednostkowej

Tabletkę do podawania doustnego wytwarza się przez zmieszanie i zgranulowanie 20 mg sacharozy, 150 mg dwuwodzianu siarczanu wapnia i 50 mg związku z przykładu 1 z 10% roztworem żelatyny. Wilgotne granulki przesiewa się, miesza z 10 mg skrobi, 5 mg, talku i 3 mg kwasu stearynowego; i sprasowuje w tabletkę.

PL 200 404 B1

Powyższy opis w pełni ujawnia sposób wykonania i zastosowania niniejszego wynalazku. Jednakże niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do konkretnych wersji wykonania opisanych powyżej, ale obejmuje ich wszystkie modyfikacje leżące w zakresie dołączonych zastrzeżeń. Różne odnośniki do czasopism, patentów i innych publikacji, które są tu cytowane, stanowią stan techniki i wprowadzone są tu na zasadzie odniesienia, jak w pełni podano powyżej.

Claims

1. Arylopodstawione pochodne kwasu butanowego o wzorze (I) (I) w którym:

R¹ oznacza:

R^x oznacza grupę C1-4alkilową, OR*, SR* grupę C1-4alkilosulfonywą, C1-4alkilosulfoksylową, -CN, N(R*)2, CH2N(R*)2, -NO2, -CF3, -CO2R*, -CON(R*)2' -COR*, -SO2N(R*)2, -NR*C(O)R*, F, Cl, Br, J albo CF3S(O)r-;

r oznacza 0, 1 albo 2;

R* oznacza H, grupę C1-4alkilową, fenylową albo benzylową;

R² oznacza:

Κ ,Ν.

albo jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

2. Arylopodstawione pochodne według zastrz. 1, w którym R² oznacza:

PL 200 404 B1

CH.

(CH₂)₈.

3. Arylopodstawione pochodne według zastrz

1, w którym R² oznacza:

H (CH₂);

4. Arylopodstawione pochodne według zastrz. 1, którymi są:

kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]-fenylo]-3-[4-(trifluorometylo)fenylo]-butanowy; kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]-fenylo]-3-[4-[(N-metylo-N-fenyloamino)-karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]butanowy;

kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]-fenylo]-3-[4-[[N-metylo-N-(2,2,2-trifluoroetylo)amino]-karbonylo]-1,3-oksazol-2-ylo]butanowy;

kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]-fenylo]-3-[4-(trifluorometylo)tiazol-2-ylo]butanowy;

kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]-1-etoksy]-fenylo]-3-(5-metylotiazol-2-ylo)butanowy; kwas (S)-3-(3-fluorofenylo)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1, 8-naftyrydyn-2-ylo)etoksy]fenylo]butanowy; kwas (±)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]etoksy]-fenylo]-3-(pirydyn-3-ylo)butanowy; kwas (S)-4-[4-[2-[6-(metyloamino)pirydyn-2-ylo]etoksy]-fenylo]-3-(pirydyn-3-ylo)butanowy; albo kwas (S)-3-(pirydyn-3-ylo)-4-[4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naftyrydyn-2-ylo)etoksy]fenylo]butanowy; albo ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

5. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera związek jak określony w zastrz. 1-4 i farmaceutycznie dopuszczalny noś nik.

6. Związek jak określony w zastrz. 1 do 4 do stosowania jako lek.

7. Zastosowanie związku o wzorze (I) jak określony w zastrz. 1, do wytwarzania leku do leczenia osteoporozy.

8. Zastosowanie związku o wzorze (I) jak określony w zastrz. 1, do wytwarzania leku do hamowania angiogenezy, wzrostu nowotworu albo przerzutów nowotworu.

9. Zastosowanie związku o wzorze (I) jak określony w zastrz. 1, do wytwarzania leku do leczenia miażdżycy tętnic, nawrotu zwężenia naczyń albo reumatoidalnego zapalenia stawów.