PL202358B1 - Sposób wytwarzania kompozycji magnetycznych cząstek szklanych, magnetyczne cząstki szklane, kompozycja magnetycznych cząstek szklanych, zawiesina z magnetycznymi cząstkami szklanymi, probówka z kompozycją lub zawiesiną magnetycznych cząstek szklanych, zestaw części z tą probówką, zastosowanie kompozycji, zawiesiny i zestawu zawierających magnetyczne cząstki szklane, sposób izolowania materiału biologicznego - Google Patents

Sposób wytwarzania kompozycji magnetycznych cząstek szklanych, magnetyczne cząstki szklane, kompozycja magnetycznych cząstek szklanych, zawiesina z magnetycznymi cząstkami szklanymi, probówka z kompozycją lub zawiesiną magnetycznych cząstek szklanych, zestaw części z tą probówką, zastosowanie kompozycji, zawiesiny i zestawu zawierających magnetyczne cząstki szklane, sposób izolowania materiału biologicznego

Info

Publication number
PL202358B1
PL202358B1 PL356771A PL35677100A PL202358B1 PL 202358 B1 PL202358 B1 PL 202358B1 PL 356771 A PL356771 A PL 356771A PL 35677100 A PL35677100 A PL 35677100A PL 202358 B1 PL202358 B1 PL 202358B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
magnetic
composition
particles
suspension
glass
Prior art date
Application number
PL356771A
Other languages
English (en)
Other versions
PL356771A1 (pl
Inventor
Kurt Weindel
Michael Riedling
Albert Geiger
Original Assignee
Roche Diagnostics Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP00110165A external-priority patent/EP1154443A1/en
Application filed by Roche Diagnostics Gmbh filed Critical Roche Diagnostics Gmbh
Publication of PL356771A1 publication Critical patent/PL356771A1/pl
Publication of PL202358B1 publication Critical patent/PL202358B1/pl

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/005—Pretreatment specially adapted for magnetic separation
    • B03C1/01—Pretreatment specially adapted for magnetic separation by addition of magnetic adjuvants
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y25/00—Nanomagnetism, e.g. magnetoimpedance, anisotropic magnetoresistance, giant magnetoresistance or tunneling magnetoresistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03B—MANUFACTURE, SHAPING, OR SUPPLEMENTARY PROCESSES
    • C03B19/00—Other methods of shaping glass
    • C03B19/10—Forming beads
    • C03B19/1005—Forming solid beads
    • C03B19/106—Forming solid beads by chemical vapour deposition; by liquid phase reaction
    • C03B19/1065—Forming solid beads by chemical vapour deposition; by liquid phase reaction by liquid phase reactions, e.g. by means of a gel phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C1/00—Ingredients generally applicable to manufacture of glasses, glazes, or vitreous enamels
    • C03C1/006—Ingredients generally applicable to manufacture of glasses, glazes, or vitreous enamels to produce glass through wet route
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C12/00—Powdered glass; Bead compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C14/00—Glass compositions containing a non-glass component, e.g. compositions containing fibres, filaments, whiskers, platelets, or the like, dispersed in a glass matrix
    • C03C14/004—Glass compositions containing a non-glass component, e.g. compositions containing fibres, filaments, whiskers, platelets, or the like, dispersed in a glass matrix the non-glass component being in the form of particles or flakes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C3/00—Glass compositions
    • C03C3/04—Glass compositions containing silica
    • C03C3/076—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight
    • C03C3/089—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight containing boron
    • C03C3/091—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight containing boron containing aluminium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C3/00—Glass compositions
    • C03C3/04—Glass compositions containing silica
    • C03C3/076—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight
    • C03C3/089—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight containing boron
    • C03C3/091—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight containing boron containing aluminium
    • C03C3/093—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight containing boron containing aluminium containing zinc or zirconium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C23—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; CHEMICAL SURFACE TREATMENT; DIFFUSION TREATMENT OF METALLIC MATERIAL; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL; INHIBITING CORROSION OF METALLIC MATERIAL OR INCRUSTATION IN GENERAL
    • C23C—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; SURFACE TREATMENT OF METALLIC MATERIAL BY DIFFUSION INTO THE SURFACE, BY CHEMICAL CONVERSION OR SUBSTITUTION; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL
    • C23C26/00—Coating not provided for in groups C23C2/00 - C23C24/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C23—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; CHEMICAL SURFACE TREATMENT; DIFFUSION TREATMENT OF METALLIC MATERIAL; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL; INHIBITING CORROSION OF METALLIC MATERIAL OR INCRUSTATION IN GENERAL
    • C23C—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; SURFACE TREATMENT OF METALLIC MATERIAL BY DIFFUSION INTO THE SURFACE, BY CHEMICAL CONVERSION OR SUBSTITUTION; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL
    • C23C30/00—Coating with metallic material characterised only by the composition of the metallic material, i.e. not characterised by the coating process
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01F—MAGNETS; INDUCTANCES; TRANSFORMERS; SELECTION OF MATERIALS FOR THEIR MAGNETIC PROPERTIES
    • H01F1/00—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties
    • H01F1/0036—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties showing low dimensional magnetism, i.e. spin rearrangements due to a restriction of dimensions, e.g. showing giant magnetoresistivity
    • H01F1/0045—Zero dimensional, e.g. nanoparticles, soft nanoparticles for medical/biological use
    • H01F1/0054—Coated nanoparticles, e.g. nanoparticles coated with organic surfactant
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01F—MAGNETS; INDUCTANCES; TRANSFORMERS; SELECTION OF MATERIALS FOR THEIR MAGNETIC PROPERTIES
    • H01F1/00—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties
    • H01F1/0036—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties showing low dimensional magnetism, i.e. spin rearrangements due to a restriction of dimensions, e.g. showing giant magnetoresistivity
    • H01F1/0045—Zero dimensional, e.g. nanoparticles, soft nanoparticles for medical/biological use
    • H01F1/0063—Zero dimensional, e.g. nanoparticles, soft nanoparticles for medical/biological use in a non-magnetic matrix, e.g. granular solids
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01F—MAGNETS; INDUCTANCES; TRANSFORMERS; SELECTION OF MATERIALS FOR THEIR MAGNETIC PROPERTIES
    • H01F1/00—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties
    • H01F1/44—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties of magnetic liquids, e.g. ferrofluids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C2214/00—Nature of the non-vitreous component
    • C03C2214/08—Metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C2214/00—Nature of the non-vitreous component
    • C03C2214/32—Nature of the non-vitreous component comprising a sol-gel process
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/101—Taqman

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Geochemistry & Mineralogy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Power Engineering (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Metallurgy (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Glass Compositions (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Glass Melting And Manufacturing (AREA)
  • Soft Magnetic Materials (AREA)
  • Hard Magnetic Materials (AREA)

Abstract

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania kompozycji magnetycznych cz a- stek szklanych, który obejmuje a) zawieszenia w zolu przedmiotów magnetycznych o srednicy w za- kresie mi edzy 5 i 500 nm, b) suszenia rozpy lowego zawiesiny w suszarce rozpy lowej z dwiema dy- szami, i c) spiekania proszku wysuszonego rozpy lowo. Przedmiotem niniejszego wynalazku s a tak ze magnetyczne cz astki szklane, zawieraj aca je kompozycja, jak równie z zawiesina kompozycji i ich za- stosowania do oczyszczania DNA lub RNA, w szczególno sci w procesach zautomatyzowanych. Po- nadto wynalazek dotyczy sposobu izolowania materia lu biologicznego. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompozycji magnetycznych cząstek szklanych, magnetyczne cząstki szklane, kompozycja magnetycznych cząstek szklanych, zawiesina z magnetycznymi cząstkami szklanymi, probówka z kompozycją lub zawiesiną magnetycznych cząstek szklanych, zestaw części z tą probówką, zastosowanie kompozycji, zawiesiny i zestawu zawierających magnetyczne cząstki szklane, sposób izolowania materiału biologicznego, w szczególności w procesach zautomatyzowanych.
Wiele materiałów biologicznych, zwłaszcza kwasy nukleinowe, stanowią szczególne wyzwania w kategoriach ich izolacji z ich ś rodowiska naturalnego. Z jednej strony, cz ę sto są one obecne w bardzo małych stężeniach, a z drugiej strony, często występują w obecności wielu innych substancji stałych i rozpuszczonych, co utrudnia ich izolowanie lub pomiar, w szczególności w oznaczeniach biospecyficznych.
Oznaczenia wiązania biospecyficznego umożliwiają wykrywanie specyficznych analitów, np. kwasów nukleinowych, lub specyficznych właściwości analitów i odgrywają główną rolę w dziedzinie diagnostyki i bioanalityki. Ich przykłady obejmują oznaczenia hybrydyzacji, oznaczenia immunologiczne i oznaczenia receptor-ligand.
Oznaczenia hybrydyzacji wykorzystują specyficzne sparowanie zasad do molekularnej detekcji analitów kwasów nukleinowych np. RNA i DNA. Stąd, sondy oligonukleotydowe o długości 18 do 20 nukleotydów mogą umożliwić specyficzne rozpoznanie wybranej sekwencji w genomie ludzkim. Innym oznaczeniem, które wykorzystuje selektywne wiązanie dwóch starterów oligonukleotydowych, jest reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) opisana w opisie US 4683195. Ten sposób wykorzystuje selektywną amplifikację do wykrywalnych poziomów specyficznego regionu kwasu nukleinowego przez polimerazę termostabilną w obecności trifosforanów deoksynukleotydów w kilku cyklach.
Kwasy nukleinowe są to stosunkowo złożone anality, które normalnie trzeba ekstrahować ze złożonych mieszanin, zanim mogą być zastosowane w oznaczeniu z sondą.
Istnieje kilka sposobów ekstrakcji kwasów nukleinowych:
- sposoby zależne od sekwencji lub biospecyficzne, jak np.:
* chromatografia powinowactwa * hybrydyzacja do sond unieruchomionych na pereł kach
- sposoby niezależne od sekwencji lub fizykochemiczne, np.:
* ekstrakcja ciecz-ciecz np. fenolem-chloroformem * strącanie np. czystym etanolem * ekstrakcja bibułowa * ekstrakcja środkami tworzącymi micele, takimi jak bromek cetylotrimetyloamoniowy * wią zanie do unieruchomionych barwników interkalują cych, np. pochodnych akrydyny * adsorpcja do żelu krzemionkowego lub ziemi okrzemkowej * adsorpcja do magnetycznych czą stek szklanych (MGP) lub czą stek silanoorganicznych w warunkach chaotropowych.
W ostatnich latach zaproponowano wiele procedur i materiałów do izolowania kwasów nukleinowych z ich naturalnego środowiska przez wykorzystanie ich właściwości wiązania do powierzchni szklanych. Na przykład w Proc. Natl. Acad. USA 76, 615-691 (1979), proponuje się procedurę wiązania kwasów nukleinowych w żelach agarozowych w obecności jodku sodu w zmielonym szkle flintowanym.
Oczyszczanie plazmidowego DNA z bakterii na pyle szklanym w obecności nadchloranu sodu opisano w Anal. Biochem. 121, 382-387 (1982).
W DE-A-3734442 opisano izolowanie jednoniciowego DNA faga M13 na filtrach z włókna szklanego metodą strącania cząstek fagowych przy użyciu kwasu octowego i lizy cząstek fagowych nadchloranem. Kwasy nukleinowe związane z filtrami z włókna szklanego przemywa się, a następnie eluuje buforem zawierającym mentol w buforze Tris/EDTA.
Podobną procedurę oczyszczania DNA z fagów lambda opisano w Anal. Biochem. 175, 196-201 (1988).
Procedura znana ze stanu techniki obejmuje sobą selektywne wiązanie kwasów nukleinowych do powierzchni szklanych w roztworach soli chaotropowych i oddzielanie kwasów nukleinowych od zanieczyszczeń, takich jak agaroza, białka lub resztki komórek. W celu oddzielenia cząstek szklanych od zanieczyszczeń, zgodnie ze stanem techniki, albo odwirowuje się cząstki albo płyny przepuszcza
PL 202 358 B1 się przez filtry z włókna szklanego. Jest to jednak etap limitujący, który uniemożliwia zastosowanie procedury do obróbki dużych ilości próbek.
Wykazano, że uzyskuje się znaczne korzyści gdy cząstki magnetyczne powleczone powierzchnią szklaną stosuje się do izolowania materiałów biologicznych. Jeżeli cząstki magnetyczne nie były w kontakcie z polem magnetycznym, to jedyną siłą, która może spowodować ich sedymentację, jest grawitacja. Można je zawiesić ponownie przez wytrząsanie roztworu. Proces sedymentacji, który nie wykorzystuje pola magnetycznego, zachodzi wolniej niż unieruchomienie materiałów biologicznych na powierzchni cząstek. Jest to prawdziwe zwłaszcza dla kwasów nukleinowych. Cząstki magnetyczne można łatwo zebrać w konkretnym miejscu próbki płynu przy pomocy magnesu. Następnie płyn oddziela się od cząstek, a więc od unieruchomionych materiałów biologicznych.
Zastosowanie cząstek magnetycznych do unieruchomienia kwasów nukleinowych po strąceniu przez dodanie soli i etanolu jest opisane w Anal. Biochem. 201, 166-169 (1992) i PCT GB 91/00212. W tej procedurze kwasy nukleinowe aglutynują z cząstkami magnetycznymi. Aglutynat oddziela się od pierwotnego rozpuszczalnika przez przyłożenie pola magnetycznego i przeprowadzenie etapu przemywania. Po jednym etapie przemywania kwasy nukleinowe rozpuszcza się w buforze Tris.
Ta procedura ma jednak tę wadę, że strącanie nie jest selektywne wobec kwasów nukleinowych. Zamiast tego, równie dobrze aglutynują rozmaite substancje stałe i rozpuszczone. Dlatego tej procedury nie można stosować do usuwania znacznych ilości inhibitorów specyficznych reakcji enzymatycznych, które mogą być obecne.
Na rynku dostępne jest także magnetyczne, porowate szkło, które zawiera cząstki magnetyczne w porowatej, rozdrobnionej matrycy szklanej i jest powleczone warstwą zawierając ą streptawidynę. Ten produkt można stosować do izolowania materiałów biologicznych, np. białek lub kwasów nukleinowych, jeżeli są zmodyfikowane w etapie tworzenia kompleksu tak, że wiążą się kowalencyjnie do biotyny.
Rozdrobnione adsorbenty magnetyzowalne okazały się bardzo skuteczne i odpowiednie do automatycznego wytwarzania próbek. Do tego celu można stosować pigmenty ferrimagnetyczne i ferromagnetyczne, jak też superparamagnetyczne.
Cząstki, według specjalisty, są to materiały stałe mające małą średnicę. Cząstki takie jak te są często także określane jako pigmenty.
Jako magnetyczne określa się te materiały, które są przyciągane do magnesu, tj., na przykład, materiały ferromagnetyczne lub superparamagnetyczne. Superparamagnetyzm jest uważany za korzystny i zalecany w stanie techniki (np. US 5928958; US 5925573; EP 757106). Powierzchnie szklane lub silanoorganiczne często funkcjonalizuje się w celu stosowania do biospecyficznych reakcji wychwytu, np. US 5928958, US 5898071, US 5925573, EP 937497, US 4554088 lub US 4910148. Alternatywnie, powierzchnie szklane lub silanoorganiczne można potraktować rozmaitymi rozpuszczalnikami lub solami w celu zmodyfikowania ich hydrofilowości i/lub elektrododatniości, np. US 5438127.
Jednak, nie zderywatyzowane grupy silanolowe szkła lub powierzchni silanowej mogą być stosowane do adsorpcji czystymi siłami fizykochemicznymi w odpowiednich warunkach reakcji, jak opisano w DE 19520964, DE 19537985, WO 96/41840, WO 96/41811, EP 757106 lub US 5520899. Typowo, rdzenie magnetyczne lub agregaty rdzeni magnetycznych są pokrytej powierzchnią szklaną, którą tworzy się w procesie zol-żel katalizowanym kwasem lub zasadą. Te cząstki nazywa się cząstkami ze rdzeniem i powłoką. Powłoka szklana ma przeto typową grubość warstwy (patrz np. DE 19520964), przy czym wielkość i kształt pigmentu, który oprócz magnetycznego tlenku metalu może zawierać podłoże niemagnetyczne jak np. mika, określa wielkość i kształt wytworzonej cząstki (patrz np. DE 19537985 i odpowiednik WO 96/41811). Dla uzyskania wysokiej aktywności powierzchniowej stosuje się materiał szklany o wysokiej porowatości (patrz np. EP 757106; WO 99/26605). Dalej, opisane są złożone cząstki magnetyczne, np. tlenek żelazowy powleczony krzemianem pokryty nieorganiczną matrycą krzemionkową z cząstek krzemionki (EP 757106) albo mieszaniną szkła i żelu krzemionkowego (WO 95/06652).
Problem rozwiązywany przez niniejszy wynalazek można dostrzegać jako dostarczenie magnetycznych cząstek szklanych o ulepszonych właściwościach do przygotowania próbek i do testów biologicznych, w szczególności w sposobach zautomatyzowanych.
Wady magnetycznych cząstek szklanych według stanu techniki usuwa niniejszy wynalazek.
Sposób wytwarzania kompozycji magnetycznych cząstek szklanych według wynalazku obejmującego etapy:
a) zawieszenia w zolu przedmiotów magnetycznych o średnicy między 5 i 500 nm,
PL 202 358 B1
b) suszenia rozpyłowego zawiesiny w suszarce rozpyłowej z dwiema dyszami, i
c) spiekania proszku wysuszonego rozpyłowo.
Korzystnie temperatura wlotowa suszarki rozpyłowej z dwiema dyszami jest w zakresie między 120°C i 500°C, temperaturę wylotową dobiera się do temperatury wrzenia zolu, a ciśnienie rozpylania wynosi co najmniej 300000 Pa. Bardziej korzystnie temperatura wlotowa suszarki rozpyłowej z dwiema dyszami jest w zakresie między 170°C i 230°C, a zwłaszcza między 190°C i 210°C.
Korzystnie ciśnienie rozpylania jest w zakresie między 400000 Pa i 600000 Pa.
Korzystnie zol zawiera etanol jako rozpuszczalnik i wówczas korzystnie temperatura wylotowa jest w zakresie między 50°C i 300°C, korzystniej między 90°C i 100°C.
Korzystnie temperatura spiekania jest w zakresie między 400°C i 1200°C, korzystnie między 720°C i 770°C.
W zakres wynalazku wchodzą również magnetyczne cząstki szklane możliwe do otrzymania sposobem według wynalazku.
Wynalazek dotyczy również kompozycji magnetycznej cząstek szklanych możliwych do otrzymania sposobem według wynalazku zawierających co najmniej jeden przedmiot magnetyczny o średniej średnicy między 5 do 500 nm, przy czym półokres trwania sedymentacji 3 mg/ml zawiesiny kompozycji w izopropanolu wynosi więcej niż 3 minuty, korzystnie więcej niż 6 minut.
Korzystnie przedmiot magnetyczny ma średnią średnicę między 10 do 200 nm, korzystnie między 15 do 50 nm.
Korzystnie przedmiot magnetyczny ma średnią średnicę równą 23 nm.
Korzystnie stosunek średnicy rdzenia magnetycznego do średnicy powłoki szklanej wynosi mniej niż 1:10.
Korzystnie magnetyczne cząstki szklane mają średnią średnicę między 0, 5 μm i 5 μm i są mikroporowate.
Korzystnie powierzchnia porów magnetycznych cząstek szklanych wynosi mniej niż 10% powierzchni całkowitej.
Korzystnie przedmiot magnetyczny jest superparamagnetyczny, korzystnie ferrimagnetyczny lub ferromagnetyczny.
Korzystnie przedmiot magnetyczny zawiera żelazo lub tlenek żelaza, którym korzystnie jest Fe3O4 lub Y-Fe2O3.
Korzystnie magnetyczne cząstki szklane mają powierzchnię właściwą większą niż 4 m2/g, korzystniej między 5 a 100 m2/g, korzystnie w zakresie 10 do 50 m2/g, najkorzystniej w zakresie 15 do 30 m2/g.
Korzystnie magnetyczne cząstki szklane są zasadniczo sferyczne.
W zakres wynalazku wchodzi też zawiesina, która zawiera w cieczy kompozycję magnetycznych cząstek szklanych według wynalazku.
Korzystnie ciecz w kompozycji zawiera alkohol, którym korzystnie jest izopropanol lub etanol.
Korzystnie ciecz stanowi zbuforowany roztwór wodny i wówczas korzystnie zawiesina dodatkowo zawiera DNA lub RNA.
Korzystnie zawiesina dodatkowo zawiera środek chaotropowy, który korzystnie jest obecny w stężeniu między 2 i 8 mol/l, a korzystnie między 4 i 6 mol/l.
Korzystnie zawiesina zawiera 5 do 60 mg/ml kompozycji według wynalazku.
Wynalazek dotyczy również probówki, która zawiera kompozycję lub zawiesinę według wynalazku.
W zakres wynalazku wchodzi również zestaw, który zawiera probówkę według wynalazku.
Korzystnie zestaw zawiera ponadto roztwór przemywający lub eluent, jeszcze korzystniej zawiera ponadto odczynniki przydatne do oczyszczania kwasu nukleinowego.
Wynalazek dotyczy też zastosowania kompozycji według wynalazku do wytwarzania zawiesiny oraz zastosowania zawiesiny według wynalazku do oczyszczania kwasów nukleinowych.
W zakres wynalazku wchodzi też zastosowanie zestawu części według wynalazku do oczyszczania kwasów nukleinowych.
Ponadto wynalazek dotyczy sposobu izolowania materiału biologicznego, który obejmuje:
a) skontaktowanie próbki, która zawiera materiał biologiczny w cieczy, z kompozycją według wynalazku, magnetycznymi cząstkami szklanymi według wynalazku lub zawiesiną według wynalazku w warunkach, w których materiał biologiczny wiąże się bezpośrednio z powierzchnią szklaną, i
b) oddzielenie materiału biologicznego od cieczy. Korzystnie materiał biologiczny stanowi kwas nukleinowy.
PL 202 358 B1
Korzystnie rozdzielanie przeprowadza się przy pomocy magnesu.
Korzystnie cząstki magnetyczne nie są namagnesowane wstępnie, gdy są kontaktowane z próbką .
Korzystnie sposób jest zautomatyzowany i korzystnie jest wysokowydajny.
Korzystnie zawiesinę według wynalazku pobiera się z pojemnika do składowania i cząstkowe objętości zawiesiny dodaje się do różnych naczyń reakcyjnych.
Korzystnie kwas nukleinowy wykrywa się po oczyszczaniu.
Korzystnie też kwas nukleinowy wykrywa się po etapie amplifikacji.
Korzystnie kwas nukleinowy wykrywa się sposobem obejmującym:
a) skontaktowanie próbki z oligonukleotydem zawierającym sekwencję komplementarną do regionu docelowego kwasu nukleinowego oraz ze znakowanym oligonukleotydem zawierającym sekwencję komplementarną do drugiego regionu tej samej nici sekwencji docelowego kwasu nukleinowego, ale niezawierającym sekwencji kwasu nukleinowego określonej przez pierwszy oligonukleotyd, z wytworzeniem mieszaniny podwójnych nici w warunkach hybrydyzacji, przy czym podwójne nici zawierają docelowy kwas nukleinowy przyłączony do pierwszego oligonukleotydu oraz do znakowanego oligonukleotydu, tak że 3'-koniec pierwszego oligonukleotydu przylega do 5'-końca znakowanego oligonukleotydu;
b) utrzymywanie mieszaniny z etapu a) z zależną od matrycy polimerazą kwasu nukleinowego mającą aktywność 5' do 3' nukleazy w warunkach wystarczających do umożliwienia aktywności 5' do 3' nukleazy polimerazy do odszczepienia przyłączonego, znaczonego oligonukleotydu i uwolnienia fragmentów znaczonych; i
c) wykrycie i/lub zmierzenie sygnału wytworzonego przez hydrolizę znaczonego oligonukleotydu.
Korzystniej detekcję prowadzi się w obecności oligonukleotydu blokującego, którym korzystnie jest aptamer. Korzystnie aptamer ma sekwencję SEKW. ID. NR: 23.
Korzystnie reakcję amplifikacji i detekcji prowadzi się w formacie homogennego oznaczenia multipleksowego w fazie roztworu z równoczesnym wykrywaniem wielu celów.
Korzystnie przez co najmniej 5 cykli reakcji łańcuchowej polimerazy temperatura przyłączania startera do matrycy jest o mniej niż 8°C, korzystnie o mniej niż 3°C wyższa od temperatury dysocjacji kompleksu polimeraza-aptamer.
Magnetyczne cząstki szklane (MGP) według niniejszego wynalazku jest to stała dyspersja małych rdzeni magnetycznych w szkle. MGP są stosunkowo małe i są zasadniczo sferyczne. Zawartość miału niemagnetycznego w kompozycji MGP jest bardzo niska i wynika ze sposobu ich wytwarzania. To ma ten skutek, że zawiesiny MGP sedymentują powoli, a więc mogą być korzystnie stosowane do sposobów w biologii molekularnej, które można zautomatyzować. Kompozycja magnetycznych cząstek szklanych według wynalazku zawiera cząstki, które są zasadniczo sferyczne i mają małą średnicę i zawierają co najmniej jeden przedmiot magnetyczny o średnicy mię dzy 5 i 500 nm, co ma niespodziewane konsekwencje dla kinetyki sedymentacji, mierzonej wartościami półokresu trwania t1/2, który oznacza czas do momentu, aż 50% cząstek ulegnie sedymentacji z określonego elementu objętości (patrz Przykład 6). Okres półtrwania dla sedymentacji zawiesiny 3 mg/ml kompozycji w izopropanolu wynosi więcej niż 3 minuty, korzystnie 4 minuty, korzystniej 6 minut. Jednak najkorzystniejsze wartości okresu półtrwania wynoszą więcej niż 10 minut lub nawet więcej niż 20 minut. Im MGP są mniejsze i bliższe doskonałej sferze, tym dłużej pozostaną zawieszone. Moż na to wyjaś nić faktem, że im bliż ej kształt przypomina doskonałą sferę, tym mniejsza możliwość, że dwie lub więcej cząstek przywrze do siebie i utworzy agregaty, które mogą sedymentować bardziej gwałtownie. Te dane są pokazane w Przykładzie 6, a obrazy o wysokiej rozdzielczości z elektronowego mikroskopu skaningowego można zobaczyć na Figurach 4 do 10. Ma to tę zaletę, że dla sposobów zautomatyzowanych wymagana intensywność mieszania i częstość mieszania w zbiornikach do magazynowania zawierających zawiesinę MGP jest zmniejszona, ponieważ powtarzane dozowanie konkretnej objętości zawiesiny MGP z nadwyżkowej objętości zassanej do strzykawki jest łatwiejsze (bardziej precyzyjne dostarczanie w odniesieniu do masy MGP/objętość).
MGP według niniejszego wynalazku stanowią kropelki szkła, w których zdyspergowane są bardzo małe nieagregujące przedmioty magnetyczne. Te przedmioty, które są określane jako magnetyczne, są przyciągane do magnesu, tj. na przykład, materiały ferromagnetyczne lub superparamagnetyczne. Korzystne są materiały ferromagnetyczne, w szczególności, jeśli jeszcze nie zostały namagnesowane wstępnie. Namagnesowanie wstępne w tym kontekście ma oznaczać zetknięcie z magnesem, co zwiększa magnetyzację szczątkową. Korzystne materiały magnetyczne stanowią żelazo
PL 202 358 B1 lub tlenek żelaza jak np. magnetyt (Fe3O4) lub Fe2O3, korzystnie Y-Fe2O3. W zasadzie można stosować żelazian baru, nikiel, kobalt, stopy Al-Ni-Fe-Co lub inne ferri- lub ferromagnetyki. Przedmioty magnetyczne może stanowić np. pigment magnetyczny. Wielkość przedmiotów magnetycznych leży w zakresie nanoskali, tj. według niniejszego wynalazku średnica jest w zakresie 5 do 500 nm, korzystnie między 10 do 200 nm, najkorzystniej między 15 do 50 nm. Odpowiednie pigmenty magnetyczne, które są wytwarzane przez firmę CERAC, mają średnią średnicę równą 23 nm i składają się z Y-Fe2O3 (powierzchnia BET 50 m2/g, CERAC: P.O. Boxa 1178, Milwaukee, Wisconsin 53201-1178 USA; numer produktu 1-2012). Magnetyczne cząstki szklane według niniejszego wynalazku dalej cechują się tym, że MGP mają średnicę cząstki między 0,5 μm i 5 μm, korzystnie 1 μm do 2 μm, jak określono metodą wysokorozdzielczej skaningowej mikroskopii elektronowej, podczas gdy przedmioty magnetyczne mają średnicę między 5 do 500 nm, korzystnie między 10 do 200 nm, najkorzystniej w zakresie 15 do 50 nm. MGP według niniejszego wynalazku charakteryzuje stosunek średnicy rdzenia pigmentu magnetycznego do magnetycznej cząstki szklanej mniejszy niż 1 do 10, jak określono metodą wysokorozdzielczej skaningowej mikroskopii elektronowej. Ze względu na te stosunki średnic, jak również nieobecność jakiegokolwiek obojętnego nośnika, który określałby kształt i wielkość cząstek, geometria MGP i liczba zawartych przedmiotów magnetycznych są określane przez warunki wytwarzania. MGP według niniejszego wynalazku są mikroporowate, ale mają wysoce ustrukturyzowaną, a więc stosunkowo dużą powierzchnię ponad 6 m2/g. Korzystnie, magnetyczne cząstki szklane według niniejszego wynalazku mają pole powierzchni w zakresie 5 do 100 m2/g, korzystnie 5 do 90 m2/g, korzystniej w zakresie 10 do 50 m2/g, najkorzystniej w zakresie 15 do 30 m2/g. Ta powierzchnia jest w przybliżeniu podwójną wielkością powierzchni cząstek opisanych w DE 19537985. Można ją oznaczyć sposobem Braunauera-Emetta-Tellera przy użyciu zautomatyzowanego aparatu dostępnego w handlu (patrz Przykład 4). Sposób ten, popularnie nazywany sposobem BET - omówiony jest w S. Braunauer, Adsorption of Gases and Vapors, vol. 1, Princeton University Press, 1943. Na przykład, próbka EJ0096.5R-01, która jest szczególnie interesująca (zestawienie parametrów produkcyjnych - patrz Przykład 1 i Tabele 1 do 3), ma powierzchnię BET równą 26,8525 m2/g, powierzchnię mikroporów równą 2,3058 m2/g i średnią średnicę porów 24,9132 nm. To znaczy, że powierzchnia porów wynosi mniej niż 10% powierzchni całkowitej i że magnetyczna cząstka szklana jest mikroporowata.
Por rozumie się jako wnękę w powierzchni zewnętrznej cząstki. Powierzchnia sięga tak daleko do wnętrza cząstki, że linia prostopadła wykreślona we wnęce na powierzchni przecina cząstkę co najmniej raz w kierunku przylegającego otoczenia cząstki. Ponadto, pory sięgają do wnętrza cząstek na głębokość większą niż jeden promień poru.
Wolniejsza kinetyka sedymentacji, większa powierzchnia i hamująca agregację postać sferyczna przejawia się w lepszej sprawności funkcjonalnej jako adsorbentu w diagnostyce kwasów nukleinowych (patrz Przykłady 3, 5 i 7) w porównaniu z niemieckimi zgłoszeniami patentowymi DE 19854973.3 lub DE 19855259.9. To kryterium można wyrazić ilościowo przez przesunięcie cykli progowych w tak zwanych oznaczeniach TaqMan®, stosunek sygnału do szumu i statystycznie walidowany niższy limit detekcji. Metody tego oznaczenia są ujawnione w WO 92/02638 i w odpowiednikach US 5210015, US 5804375, US 5487972). Doświadczenia ze znakowaniem promieniotwórczym (patrz Przykład 5.2) wykazały, że zachowanie pod względem wiązania DNA i RNA było takie samo w porównaniu z materiałem odniesienia znanym w stanie techniki. Niespodziewanie, parametry wytwarzania miały wpływ na sprawność w doświadczeniach ze znakowaniem promieniotwórczym. Dalszą zaletą MGP według niniejszego wynalazku jest to, że żadne naprężenia w warstwie szklanej nie mogą doprowadzić do pęknięć podczas procesu suszenia i odpowiednich uszkodzeń powłoki szklanej ze względu na wewnętrzną strukturę (dyspersja stała małych rdzeni magnetycznych w kropli szkła). Można to badać technikami tworzenia obrazów (patrz Przykład 3).
Zawiesinę cząstek magnetycznych według wynalazku wytwarza się przez dodanie cieczy do kompozycji MGP i wymieszanie zawiesiny do jednorodności. Ciecz może obejmować dowolną ciecz, która nie wpływa na trwałość cząstek magnetycznych i może być stosowana do wytwarzania jednorodnej zawiesiny. Korzystnie stosuje się ciecze, które są przydatne do sposobów w biologii molekularnej, w szczególności do sposobów oczyszczania kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) lub kwasu rybonukleinowego (RNA), w których wykorzystuje się wiązanie tych substancji do cząstek szklanych w pewnych warunkach. Korzystne ciecze obejmują alkohole lub dowolne ich mieszaniny z wodą albo ketony. Alkohole obejmują korzystnie alkohole pierwszorzędowe, drugorzędowe lub trzeciorzędowe o wzorze ogólnym R-OH, gdzie R oznacza wzór ogólny -(-CH2)n-CH3 przy n > = 0. Jednak, można także stosować inne alkohole, jeżeli są one odpowiednie dla celów biologii molekularnej, jak np. glicePL 202 358 B1 rynę. Szczególnie odpowiednimi alkoholami są izopropanol, etanol lub ich mieszaniny z wodą, korzystnie mieszanina 80 części objętościowych izopropanolu z 20 częściami objętościowymi wody. W innym wykonaniu wynalazku ciecz obejmuje ketony jak np. aceton. W korzystnym wykonaniu wynalazku te zawiesiny zawierają 5 do 60 mg/ml MGP. W innym wykonaniu wynalazku MGP są zawieszone w wodnych roztworach zbuforowanych, które mogą ewentualnie zawierać środek chaotropowy w stężeniu 2-8 mol/l, a korzystnie 4-6 mol/l. Solami chaotropowymi mog ą być jodek sodu, nadchloran sodu, tiocyjanian guanidyniowy, izotiocyjanian guanidyniowy lub chlorowodorek guanidyniowy. Możliwe są także inne związki. Środkiem chaotropowym będzie dowolna substancja chemiczna, która zakłóci uporządkowaną strukturę ciekłej wody i będzie miała taki efekt, że DNA lub RNA będzie się wiązać do MGP według niniejszego wynalazku, gdy środek ten jest obecny w roztworze zawierającym DNA lub RNA. Wytwarzanie odpowiednich wodnych roztworów zbuforowanych jest oczywiste dla specjalisty. Układy buforowe, które można stosować dla celów biologii molekularnej, można znaleźć np. w Sambrook i in. (1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor University Press, New York, NY, USA. Korzystne substancje buforowe to tris-hydroksymetyloamina (Tris), fosforan, kwas N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N'-(2-etanosulfonowy) (HEPES), jego sole lub inne odpowiednie substancje. Dodatkowo, obecne mogą być substancje, które modyfikują siłę jonową roztworu, jak np. NaCl, KCl lub CaCl2, lub które stanowią środki kompleksujące kationy metali, jak np. kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) lub jego sole. Obecny także może być materiał biologiczny znany specjaliście. W innym wykonaniu wynalazku zawiesina MGP może dodatkowo zawierać DNA lub RNA, ewentualnie w mieszaninie z białkami, kwasami tłuszczowymi, węglowodanami i innym materiałem pochodzenia biologicznego. W innym wykonaniu wynalazku ciecz może zawierać mieszaninę jednego lub więcej składników wybranych z grupy alkoholi, ketonów, wodnych roztworów zbuforowanych, środków chaotropowych, substancji, które modyfikują siłę jonową roztworu, środków kompleksujących, materiału biologicznego, DNA lub RNA wszystkie o cechach jak opisano wyżej.
Wynalazek obejmuje też probówkę lub naczynie reakcyjne zawierające zawiesinę według wynalazku. Probówka może być wytworzona z tworzyw sztucznych, ale może także być częścią większej struktury, np. częścią płytki mikrotitracyjnej w formacie 96 lub 384 studzienek. Innym wykonaniem wynalazku jest pojemnik, który zawiera kompozycję magnetycznych cząstek szklanych lub ich zawiesiny.
Wynalazek obejmuje też zestaw części, który obejmuje pojemnik do przechowywania zawierający magnetyczne cząstki szklane lub ich zawiesinę według niniejszego wynalazku. Zestaw można zastosować do oczyszczania DNA lub RNA. Takie zestawy znane w stanie techniki obejmują też wyroby z tworzyw sztucznych, które można stosować podczas procedury oczyszczania jak np. płytki mikrotitracyjne w formacie 96 lub 384 studzienek, albo po prostu zwykłe probówki reakcyjne wytwarzane np. przez firmę Eppendorf, Hamburg, Niemcy. Zestaw może dalej zawierać roztwór przemywający, który jest przydatny do etapu przemywania magnetycznych cząstek szklanych, gdy związany z nimi jest DNA lub RNA. Cz ę sto roztwór przemywają cy jest dostarczany jako roztwór podstawowy, który trzeba rozcieńczyć przed użyciem. Zestaw może dalej zawierać eluent, tj. roztwór lub bufor (np. TE, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) lub czystą wodę do eluowania DNA lub RNA związanego z magnetycznymi cząstkami szklanymi. Ponadto, mogą być obecne dodatkowe odczynniki, które mogą być stosowane do oczyszczania kwasu nukleinowego, tj. DNA lub RNA. W jednym z wykonań wynalazku zestaw części według niniejszego wynalazku stosuje się do oczyszczania kwasu nukleinowego.
W jednym z wykonań wynalazku kompozycję MGP można stosować do wytwarzania zawiesiny, jak już opisano.
W innym wykonaniu wynalazku zawiesiny według niniejszego wynalazku można stosować do oczyszczania kwasów nukleinowych, tj. RNA lub DNA, z zawierających je złożonych mieszanin z innymi substancjami biologicznymi. W ten sposób można oczyszczać także mieszaniny różnych kwasów nukleinowych, nawet mieszaniny zawierające kwas nukleinowy będący przedmiotem zainteresowania, w małej ilości. Efekt oczyszczania wynika z zachowania DNA lub RNA wiążącego się z magnetycznymi cząstkami szklanymi w pewnych warunkach, np. w obecności pewnego stężenia środka chaotropowego. Korzystnie, później MGP ze związanym DNA lub RNA przemywa się co najmniej raz, korzystnie mieszaniną 70 części objętościowych etanolu z 30 częściami objętościowymi wody (70% etanol). Potem warunki odwraca się, np. zmniejsza się stężenie środka chaotropowego w celu eluowania DNA lub RNA związanego z cząstką MGP. Korzystnie, wykonuje się to przez peletyzację magnetycznych cząstek szklanych, np. wykorzystując siłę grawitacji albo przez użycie magnesu, i ponowne zawieszenie w roztworze bez lub tylko z małą ilością środka chaotropowego.
PL 202 358 B1
Alternatywnie, roztwór można rozcieńczyć roztworem bez lub tylko z małą ilością środka chaotropowego. Teraz oczyszczony DNA IGub RNA można zastosować do innych reakcji.
Jednym z przedmiotów wynalazku jest sposób wytwarzania MGP według niniejszego wynalazku. Szkło w znaczeniu tu stosowanym oznacza materiał bezpostaciowy, który zawiera krzemionkę. Szkło może zawierać inne substancje, takie jak B2O3 (0 - 30%), Al2O3 (0 - 20%), CaO (0 - 20%), BaO (0 - 10%), K2O (0 - 20%), Na2O (0 - 20%), MgO (0 - 18%), Pb2O3 (0 - 15%). Szkło może także zawierać mniejszy procent (0 - 5%) kilku innych tlenków, takich jak Mn2O3, TiO2, As2O3, Fe2O3, CuO, CoO, itp.
Szczególnie korzystne według niniejszego wynalazku są szkła, które są tworzone przy użyciu sposobu żel-zol opisanego w WO 96/41811, a następnie suszone i prasowane. Podstawowe zasady tego sposobu są znane i były opisane, na przykład, w C.J. Brinker, G.W. Scherer Sol Gel Science The Physics and Chemistry of Sol Gel Processing, Academic Press Inc. 1990, Sol-Gel Optics, Processing and Applications, red. Lisa C. Klein, Kluwer Academic Publishers 1994, str. 450 i dalej, oraz w DE-A-1941191, DE-A-3719339, DE-A-4117041, DE-A-4217432 i WO 96/41811. sposobie ż el-zol, alkoholany składników tworzących sieć, np. SiO2, B2O3, Al2O3, TiO2, ZrO2, GeO2, zasadniczo łączy się z tlenkami i solami innych skł adników, np. w roztworze alkoholowym, a nastę pnie hydrolizuje. Równanie poniżej opisuje procedurę wytwarzania szkła z boroglinokrzemianu sodu:
Wodę dodaje się w celu rozpoczęcia procesu hydrolizy składników wyjściowych. Reakcja zachodzi stosunkowo szybko, ponieważ jony metali alkalicznych mają wpływ katalityczny na szybkość hydrolizy estru kwasu krzemowego. Po wytworzeniu żelu można go wysuszyć i zagęścić (lub skondensować) sposobem termicznym, otrzymując szkło.
W jednym z wykonań wynalazku matryca szklana bę dzie wytwarzana metodą katalizowanej kwasem lub zasadą syntezy zol-żel w sposób pokazany schematycznie na Figurze 1 i Figurze 2 i opisany szczegółowo w Przykładzie 1. Wykorzystuje się tu układy koloidalne, w których najpierw składniki stałe dysperguje się w fazie ciekłej (= zol) i po przetworzeniu są one połączone ze sobą tworząc wzór plastra miodu (= żel) . Skład szkła (kod EJ) obliczony z ilości eduktów był następujący: 70,67% mol. SiO2, 14,33% mol. B2O3, 5,00% mol. Al2O3, 4,00% mol. K2O, 2,00% mol. CaO, 4,00% mol. ZnO. Skład szkła (kod RN): 74% mol. SiO2, 15% mol. B2O3, 5,00% mol. Al2O3, 4,00% mol. K2O, 2,00% mol. CaO. Skład szkła (kod ep): 73,61% mol. SiO2, 14,93% mol. B2O3, 5,21% mol. Al2O3, 4,17% mol. K2O, 2,08% mol. CaO.
Reakcję może opisać jak następująco: albo katalizowana kwasem, np.
BCI3 + 3 H2O B(OH)3 + 3 H(+) Cl(-)
AICI3 + 3 H2O Al(OH)3 + 3 H(+)CI(-)
SiCl4 + 4 H2O Si(OH)4 + 4 H(+)CI(-)
Na(+)NO3(-) + H2O Na(+)OH(-) + H(+) NO3(-)
K(+) OOCCH3 + H2O K(+)OH(-) + H(+) OOCCH3 aIbo kataIizowana zasadą, np.
K(+) (-)OCH2CH3 + H2O K(+) OH(-) + HOCH2CH3
Na(+) (-)OCH3 + H2O Na(+)OH(-) + HOCH3
Al(3+) [(-)OCH2 CH2CHY + 3 H2O AI(OH)3 + 3HOCH2CH2CH3
B(OCH2CH3)3 + 3 H2O B(OH)3 + 3 HOCH2CH3
PL 202 358 B1
Rozmaite wodorotlenki kondensują do odpowiednich tlenków, które tworzą trójwymiarową sieć, bezpostaciową matrycę szklaną SiO2/B2O3/Al2O3 z jonami metali zajmującymi miejsca międzywęzłowe. Oprócz wymienionych wyżej jonów metali alkalicznych i jonów metali ziem alkalicznych, w matrycy mogą być zawarte jony metali przejściowych, jak np. Zn2+ i Zr2+ jako środki modyfikujące sieć.
_Si__O_Si_ ==> —Si—ΟωΖη(2+) G)CYSi
I I I K(+) I —Si—O—Si — ==> —Si—Οω ωΟ—Si
I I I Kw I
W innym wykonaniu szkło można wytwarzać sposobami znanymi w stanie techniki przez topienie surowca SiO2 i węglanów metali alkalicznych lub ziem alkalicznych Na2CO3, K2CO3 lub CaCO3.
Reakcję można opisać następująco:
Na2CO3 + SiO2 —— Na2SiO3 (= Na2O*SiO2) + CO2I
K2CO3 + SiO2 —— K2SO3 (= K2O-SiO2) + CO2I
CaCO3 + SiO2 — CaSiO3 (= CaO-SiO2) + CO2$
Jednak w większości przypadków nie ma czystej matrycy krzemianowej, lecz matryca boranowa-glinianowa-krzemianowa, tj. w odniesieniu do składnika tworzącego sieć, część SiO2 jest zastąpiona przez B2O3 i Al2O3).
Stosunek zol:pigment ma znaczący wpływ na wydajność cząstek magnetycznych w tym wynalazku. Dla sposobu zasadniczo ważne jest, żeby zol wciąż można było pompować i rozpylać, co mieści się w zakresie umiejętności specjalisty.
W celu wytworzenia proszku, zawiesinę korzystnie rozpyla się przez dyszę do dwóch płynów, jak opisano na Figurze 1 i w Przykładzie 1.3. Przydatne układy do suszenia rozpyłowego są wytwarzane przez firmę Nubilosa Molekularzerstaubung, Ladisch GmbH & Co. KG, Konstanz, Niemcy, np. Labor-Zerstaubungs-trockner (Typ LTK) albo przez firmę Buchi AG, Uster, Switzerland, np. Mini Spray Dryer (Type B-191).
Ze względu na to, że stosunki średnic rdzeni magnetycznych do powłoki szklanej są mniejsze niż 1 do 10, korzystnie są w zakresie między 1:10 i 1:1000, kształtu i wielkości cząstek nie determinują geometria i liczba zawartych rdzeni magnetycznych lub ich obojętnych nośników, lecz warunki wytwarzania, w szczególności warunki podczas suszenia rozpyłowego. Innymi słowy, wybór ciśnienia, temperatury wlotowej, temperatury wylotowej i szybkości przepływu podczas procedury suszenia rozpyłowego są to stopnie swobody, które określą rozkład wielkości, kształt kropli szkła, i w ten sposób będą modyfikować MGP. Gdy ciśnienie rozpylania zwiększa się rozkład wielkości przesuwa się do zakresu submikronowego. Zmniejszona temperatura procesu suszenia rozpyłowego doprowadzi do wolniejszego odparowania rozpuszczalnika, a przez to kształt MGP zbliży się do doskonałej sfery, tj. stosunek promieni w płaszczyznach xy i xz stanie się w przybliżeniu równy 1. Stosunek promieni będzie zmieniać się między 0,8 i 1,2, korzystnie między 0,9 i 1,1.
W korzystnym wykonaniu wynalazku dysze są ogrzewane. Temperatura wlotowa jest w zakresie między 120°C - 500°C, korzystnie między 170°C i 230°C lub 150°C i 230°C, najkorzystniej między 150°C i 200°C lub 190°C i 210°C albo wynosi 200°C lub nieco mniej. Temperatura wylotowa zależy od temperatury wrzenia zolu, a przez to rozpuszczalnika, i może być wyższa, równa lub nieco niższa, tj. o mniej niż 10°C, od temperatury wrzenia rozpuszczalnika. Gdy jako rozpuszczalnik stosuje się etanol, temperatura wylotowa jest w zakresie między 50°C - 300°C, korzystnie 70°C - 150°C, najkorzystniej między 80°C i 110°C. Optymalna temperatura jest w zakresie między 90°C do 100°C. Ciśnienie dyszy wynosi więcej niż 3 bary (3 x 105 Pa), korzystnie jest regulowane do 4 (4 x 105 Pa) do 6 bar (6 x 105 Pa). Specjalista rozumie, że ścisłe parametry będą zależeć od użytego układu do suszenia rozpyłowego. Może jednak przenieść wskazania niniejszego wynalazku na dowolne inne suszenie rozpyłowe i usta10
PL 202 358 B1 lić parametry biorąc pod uwagę ujawnienie niniejszego wynalazku. Wzór jak opisany w Masters: Spray Drying Handbook, Fifth Edition, John Wiley & Sons, 1991, New York może go doprowadzić do ustalenia, które parametry muszą być wybrane dla innego ustawienia. Korzystnie, specjalista może przejrzeć podręczniki dla swojego układu do suszenia rozpyłowego lub skontaktować się z serwisem technicznym producenta układu do suszenia rozpyłowego.
Dla zoptymalizowania wydajności temperatura zagęszczania lub spiekania powinna być możliwie jak najwyższa, tj. nieco poniżej zakresu topnienia. Jeżeli jest jednak zbyt wysoka, to cząstki przywrą do siebie i utworzą skupienia, które muszą zostać odsiane. Jeżeli jest zbyt niska, to MGP nie zostaną optymalnie zagęszczone. Dodatkowa obróbka cząstek w zbyt wysokiej temperaturze spowoduje utratę właściwości magnetycznych. Należy więc zaniechać zbyt wysokich temperatur. Dokładne temperatury zależą od składu szkła, ale mogą być w zakresie między 400°C do 1200°C. W przypadku szkła EJ temperatura spiekania jest w zakresie między 720°C i 770°C, korzystnie około 750°C. W zakresie umiejętności specjalisty mieści się ustalenie temperatur dla każdego składu szkła przy uwzględnieniu wskazań niniejszego wynalazku. Według niniejszego wynalazku, wysuszony rozpyłowo proszek MGP można dalej obrabiać, jak przedstawiono na Figurze 2 i opisano w Przykładzie 1.4. Korzystnie, proszek ogrzewa się przez 1 godzinę do 200°C, ewentualnie chłodzi do temperatury pokojowej i ogrzewa do 750°C (temperatura zagęszczania lub spiekania) w atmosferze azotu przy szybkości ogrzewania 1 K/min i utrzymuje w tej temperaturze przez 1 godzinę. Następnie piec chłodzi się do
150°C i ogrzewa ponownie do 200°C przez jedną godzinę w powietrzu. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej, proszek przenosi się na sito (50 μm) i przesiewa przez 30 minut. Przesianą próbkę butelkuje się i sterylizuje w temperaturze 200°C przez 4 godziny, a następnie chłodzi do 80°C. Potem naczynia szklane wyjmuje się z pieca, przykrywa sterylną folią i zamyka.
Nieoczekiwanie, cząstki magnetyczne według wynalazku nadają się zwłaszcza do izolowania materiałów biologicznych z próbek. Ponadto, materiał rdzenia jest surowcem naturalnym, a więc stanowi niewielkie obciążenie dla środowiska. Ponadto, cząstki według wynalazku są tanie i łatwe w produkcji.
Innym przedmiotem wynalazku jest sposób izolowania materiału biologicznego przez doprowadzenie do kontaktu próbki zawierającej materiał biologiczny w cieczy z cząstkami magnetycznymi według wynalazku w warunkach, w których materiał biologiczny wiąże się do powierzchni cząstki, i oddzielenie materiału biologicznego od cieczy. Zgodnie z wynalazkiem określenie w cieczy oznacza, że ciecz można dodać do próbki przed dodaniem cząstek magnetycznych. Jednak, będzie ono także obejmować sytuację, gdy sama próbka ma niską lepkość i sama jest cieczą tak, że do próbki nie trzeba dodawać dodatkowej cieczy lub buforu dla przygotowania próbki, którą można sporządzić przez dodanie środków stałych przed dodaniem magnetycznych cząstek szklanych. Kolejność dodawania odczynników może być zmieniana zgodnie z wymaganiami sposobu.
Materiały biologiczne mają oznaczać materiały na podstawie tworów bardziej złożonych lub cząsteczek. W szczególności obejmują one komórki, takie jak wirusy lub bakterie, jak również wyizolowane komórki z organizmów wielokomórkowych, jak np. ludzkie i zwierzęce komórki, takie jak leukocyty, i immunologicznie aktywne związki chemiczne o niskiej i wysokiej masie cząsteczkowej, takie jak hapteny, antygeny, przeciwciała i kwasy nukleinowe. Szczególnie korzystne są kwasy nukleinowe, takie jak DNA lub RNA. W jednym z wykonań wynalazku oczyszcza się mieszaniny konkretnych kwasów nukleinowych, w których docelowy kwas(y) nukleinowy(e) może być składnikiem drugorzędnym pod względem stężenia (albo może być obecny w małej ilości). Według niniejszego wynalazku, docelowym kwasem nukleinowy powinien być kwas nukleinowy, który jest przedmiotem zainteresowania, tj. kwas nukleinowy, który ma być badany, gdyż jego obecność wskazuje na pewien stan lub chorobę człowieka lub zwierzęcia. Na przykład, obecność sekwencji wirusowej (np. z wirusa zapalenia wątroby typu B, wirusa zapalenia wątroby typu C lub wirusa ludzkiego niedoboru odporności) wskazuje, że dana osoba jest zakażona przez swoistego wirusa. Zatem ta sekwencja wirusowa byłaby sekwencją docelową. Inne sekwencje docelowe to sekwencje, które wskazują na predyspozycję osobnika do pewnej choroby, jak np. choroby wrodzonej, jak anemia sierpowata, lub do pewnych typów raka. Te przykłady ilustrują wynalazek, ale nie stanowią jego ograniczenia.
Próbki stosowane w sposobie według wynalazku obejmują próbki kliniczne, takie jak krew, surowica, popłuczyny z ust, mocz, płyn mózgowy, plwocina, stolec, materiały z biopsji i próbki szpiku kostnego. Próbka może także być typu stosowanego do analizy środowiska, analizy żywności lub badań z dziedziny biologii molekularnej, np. z hodowli bakteryjnych, produktów lizy fagowej i produktów procedur amplifikacji takich jak PCR.
PL 202 358 B1
Opisaną procedurę można zastosować do izolowania natywnego lub zmodyfikowanego materiału biologicznego. Natywny materiał biologiczny oznacza materiał, którego struktura nie została nieodwracalnie zmieniona w porównaniu z materiałami biologicznymi występującymi w przyrodzie naturalnie. To nie znaczy jednak, że nie można modyfikować innych składników próbki. Zmodyfikowane materiały biologiczne obejmują materiały, które nie występują w przyrodzie, np. kwasy nukleinowe, które są zmodyfikowane przez przyłączenie do nich grup, które są reaktywne, możliwe do wykrycia lub które mogą być unieruchomione. Przykładem tego są biotynylowane kwasy nukleinowe.
W pewnych przypadkach próbkę moż na zastosować w sposobie izolowania wedł ug wynalazku bez traktowania wstępnego. W wielu przypadkach, jednak, próbkę należy poddać lizie przy użyciu właściwego sposobu, uwalniając materiał biologiczny zawarty w próbce. Procedury lizy próbek są znane specjaliście i mogą to być sposoby chemiczne, enzymatyczne lub fizyczne. Równie dobrze można zastosować kombinację tych procedur. Na przykład, lizę można przeprowadzić przy użyciu ultradźwięków, wysokiego ciśnienia, sił ścinających, przy użyciu roztworów zasad, detergentów lub chaotropowych roztworów soli, lub przy pomocy proteinaz lub lipaz. Procedura lizy z wytworzeniem kwasów nukleinowych jest omówiona w Sambrook i in.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, oraz Ausubel i in.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY.
Oprócz materiału biologicznego, który ma być wyizolowany, próbka może także zawierać w cieczy inne składniki, takie jak resztki komórek, białka, sole i inne substancje, które nie mają być wyizolowane. Tę próbkę, która korzystnie zawiera materiał biologiczny w postaci natywnej, doprowadza się do kontaktu z cząstkami w warunkach, w których docelowy materiał biologiczny wiąże się do powierzchni cząstki. Warunki do tego zależą od typu stosowanego materiału biologicznego, ale są zasadniczo znane. Zależą one także od sposobu, w jaki materiał biologiczny wiąże się do powierzchni. Jeżeli do wiązania wykorzystywane są, na przykład, oddziaływania immunologiczne, to wybrane muszą być warunki, które są przydatne do tworzenia immunokompleksów. Jeżeli stosuje się zmodyfikowane kwasy nukleinowe, wiązanie może nastąpić przez grupy kwasów nukleinowych, które stanowią modyfikację, np. biotyna przez wiązanie z powierzchniami powleczonymi streptawidyną. Dla kwasów nukleinowych w szczególności, jednak, bezpośrednie wiązanie kwasów nukleinowych do szkła jest korzystne, gdyż między innymi przyczynami kwasy nukleinowe nie muszą być modyfikowane i wiązane mogą być nawet natywne kwasy nukleinowe. Procedura wiązania natywnych kwasów nukleinowych do cząstek szklanych może być analogiczna do procedury opisanej w stanie techniki. Korzystnie prowadzi się ją w obecności soli chaotropowych o stężeniu między 2 i 8 mol/l, a korzystnie między 4 i 6 mol/l. Solami chaotropowymi mogą być jodek sodu, nadchloran sodu, tiocyjanian guanidyniowy, izotiocyjanian guanidyniowy lub chlorowodorek guanidyniowy. Możliwe są także inne związki.
W celu skontaktowania próbki z czą stkami, próbkę miesza się z czą stkami i inkubuje przez czas wystarczający do wystąpienia wiązania. Zazwyczaj specjaliści znają czas trwania etapu inkubacji w procedurach traktowania cząstkami niemagnetycznymi. Ten etap można zoptymalizować przez określenie ilości unieruchomionego materiału biologicznego na powierzchni w różnych punktach czasowych. Dla kwasów nukleinowych odpowiednie mogą być czasy inkubacji między 10 sekund i 30 minut.
Zależnie od wielkości i typu cząstek magnetycznych, albo cząstki oddzielają się od płynu podczas samego okresu inkubacji albo zawiesina pozostaje nienaruszona przez dłuższy czas. Jeżeli cząstki są bardzo małe i nie są namagnesowane, zawiesina pozostaje nienaruszona przez dłuższy czas. Jeżeli cząstki mają większy rozmiar, powoli oddzielają się od płynu podczas okresu inkubacji.
Korzystnie unieruchomienia nie prowadzi się przez strącanie metodą obniżania rozpuszczalności unieruchamianych materiałów. Zamiast tego, unieruchomienie opiera się na oddziaływaniach biospecyficznych (wychwyt cząsteczek) lub adsorpcji. To w znacznym stopniu zapobiega niespecyficznemu włączaniu zanieczyszczeń.
Po inkubacji oddziela się materiał biologiczny od cieczy. Osiąga się to na ogół przez przyłożenie pola magnetycznego, oddzielając materiał przyłączony do cząstek magnetycznych. Na przykład, cząstki magnetyczne mogą zostać przyciągnięte do ściany naczynia, w którym prowadzi się inkubację. Można wtedy usunąć ciecz zawierającą składniki próbki, które nie zostały przyłączone do cząstek magnetycznych. Stosowana procedura usuwania zależy od typu naczynia, w którym prowadzi się inkubację. Odpowiednie etapy obejmują usunięcie cieczy przez pipetowanie lub aspirację.
Następnie, jeśli to konieczne, cząstki magnetyczne można oczyścić jeden lub więcej razy przy użyciu roztworu przemywającego. Stosuje się roztwór przemywający, który nie powoduje uwalniania materiału biologicznego z powierzchni cząstki, ale który wymywa niepożądane zanieczyszczenia tak
PL 202 358 B1 gruntownie, jak to tylko możliwe. Ten etap przemywania korzystnie następuje przez inkubowanie z czą stkami roztworu przemywają cego. Czą stki korzystnie ponownie zawiesza się podczas tego etapu, np., przy pomocy wytrząsania lub przyłożenia pola magnetycznego, które nie jest identyczne z pierwszym polem magnetycznym. Zanieczyszczony roztwór przemywający korzystnie oddziela się tak jak próbkę w etapie opisanym wyżej dla wiązania materiału biologicznego.
Po ostatnim etapie przemywania, cząstki magnetyczne można wysuszyć krótko pod zmniejszonym ciśnieniem, albo zostawić płyn do odparowania. Można także przeprowadzić etap traktowania wstępnego przy użyciu acetonu. Jeśli to konieczne, materiał biologiczny oczyszczony w taki sposób można oddzielić od cząstek magnetycznych. Ten etap także zależy od tego, w jaki sposób materiał biologiczny był przyłączony do cząstek magnetycznych. Jeżeli materiałem biologicznym są natywne kwasy nukleinowe, a cząstki magnetyczne to cząstki powleczone szkłem, kwasy nukleinowe można oddzielić od cząstek według wynalazku przy użyciu buforu elucyjnego mającego niską zawartość soli. Bufory tego rodzaju są znane z DE 3724442 i Analytical Biochemistry 175, 196-201 (1988). Bufory elucyjne o niskiej zawartości soli stanowią w szczególności bufory o zawartości mniejszej niż 0,2 mol/l. W szczególnie korzystnym wykonaniu, bufor elucyjny zawiera Tris. W innym konkretnym wykonaniu, bufor elucyjny stanowi woda zdemineralizowana.
W jeszcze innym wykonaniu, opisaną procedurę oczyszczania i izolowania prowadzi się po oddzieleniu immunomagnetycznie komórek (np. cząstek wirusowych albo komórek prokariotycznych lub eukariotycznych) od płynu ustrojowego lub tkanki. W tym etapie próbkę inkubuje się, np. podczas wytrząsania z cząstkami magnetycznymi, na których unieruchomione jest przeciwciało przeciw antygenowi na komórce. Tymi cząstkami mogą być cząstki według wynalazku albo cząstki dostępne w handlu (np. MACS Microbeads z firmy Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Niemcy). Po przyłożeniu pola magnetycznego, przeprowadza się jeden lub więcej etapów przemywania przy użyciu roztworu solanki. Uzyskuje się cząstki, z którymi związane są żądane komórki. Następnie związane komórki ponownie zawiesza się w buforze solankowym. W korzystnym wykonaniu, ten bufor solankowy stanowi roztwór soli chaotropowej, tak, że kwasy nukleinowe zawarte w komórce są uwalniane z komórek.
Szczególnie korzystną procedurę izolowania kwasów nukleinowych z próbek zawierających komórki uzyskuje się przez połączenie opisanego wyżej sposobem izolowania komórek z także opisanym wyżej izolowaniem kwasów nukleinowych, na cząstkach magnetycznych według wynalazku. Zaletą tego wykonania jest jego potencjalna prostota (metoda jednoprobówkowa), wysoka czułość (ważna zwłaszcza w mikrobiologii medycznej i onkologii) i łatwość, z jaką może ono zostać zautomatyzowane.
Materiały biologiczne izolowane przy użyciu sposobu według wynalazku mogą być użyte dalej stosownie do potrzeb. Na przykład, można je stosować jako substrat do różnych reakcji enzymatycznych. Jeżeli chodzi o kwasy nukleinowe, można je zastosować do sekwencjonowania, znakowania promieniotwórczego lub niepromieniotwórczego, amplifikacji jednej lub więcej sekwencji, które zawierają, transkrypcji, hybrydyzacji ze znakowanymi kwasami nukleinowymi jako sondami, translacji lub ligacji. Zaletą sposobu według wynalazku jest to, że bardzo łatwo jest oddzielić materiał biologiczny od cieczy. W stanie techniki, do oddzielania cząstek szklanych od zanieczyszczeń stosowano etap odwirowania, albo, gdy materiał biologiczny jest związany z filtrami z włókna szklanego, przez filtry przepuszcza się płyn. Jest to etap limitujący, który utrudnia obróbkę dużych ilości próbki.
Stosując cząstki według wynalazku można materiały biologiczne skuteczniej oddzielać od zanieczyszczeń. W szczególności, według wynalazku można w znacznym stopniu usuwać inhibitory pewnych reakcji enzymatycznych.
W korzystnym wykonaniu, czą stki wedł ug wynalazku dodaje się do mieszaniny litycznej. Po czasie odpowiednim dla zajścia adsorpcji - który można zoptymalizować przez mechaniczne mieszanie - cząstki oddziela się od otaczającego płynu, który zawiera dodatkowe składniki komórek, które nie mają być wykrywane. Korzystnie przeprowadza się to przez przyłożenie pola magnetycznego przez umieszczenie magnesu przy ścianie naczynia.
W celu usunięcia jakichkolwiek zanieczyszczeń, które wciąż mogą być obecne, korzystnie prowadzi się etap przemywania przy użyciu cieczy, która nie powoduje uwalniania oznaczanych kwasów nukleinowych z powierzchni szklanej. Dla usunięcia kwasów nukleinowych z powierzchni szkła dodaje się bufor elucyjny o warunkach takich w jakich są odczynniki, w których kwasy nukleinowe oddzielają się od powierzchni szkła. Te warunki to w szczególności niska zawartość soli. Zależnie od zamierzonego dalszego zastosowania kwasów nukleinowych, ciecz można teraz oddzielić od cząstek i obrabiać dalej. Ten etap rozdzielania korzystnie prowadzi się przez przyłożenie pola magnetycznego tak, że cząstki są oddzielane od eluatu.
PL 202 358 B1
Korzystnym wykonaniem niniejszego wynalazku jest zastosowanie MGP według niniejszego wynalazku w sposobach możliwych do zautomatyzowania, jak np. opisano w WO 99/16781. Sposób możliwy do zautomatyzowania oznacza, że etapy sposobu są odpowiednie do przeprowadzenie przy użyciu aparatu lub maszyny zdolnej do działania przy małej lub bez kontroli zewnętrznej lub udziału człowieka. Sposób zautomatyzowany oznacza, że etapy sposobu są przeprowadzane przy użyciu aparatu lub maszyny zdolnej do działania przy małej lub bez kontroli zewnętrznej lub udziału człowieka. Ewentualnie tylko etapy przygotowawcze sposobu muszą być wykonywane ręczne, np. napełnianie i wstawianie pojemników do przechowywania, wybór próbek i dalsze etapy znane specjaliście w dziedzinie, np. obsługa komputera sterującego. Aparatura lub maszyna może np. dodawać automatycznie ciecze, mieszać próbki lub przeprowadzać etapy inkubacji w określonych temperaturach. Typowo, taką maszyną lub aparaturą jest robot sterowany komputerem, który wykonuje program, w którym okreś lone są pojedyncze etapy i polecenia. Korzystnymi sposobami automatycznymi są te, które przeprowadza się w formacie o wysokiej wydajności, co oznacza, że sposoby i stosowana maszyna lub aparatura są zoptymalizowane dla dużej ilości próbek w krótkim czasie.
W innym wykonaniu MGP wedł ug niniejszego wynalazku stosuje się w sposobie pół automatycznym, co oznacza, że niektóre etapy reakcji muszą być wykonywane ręcznie. W korzystnym wykonaniu wynalazku, zawiesinę zawierającą MGP według niniejszego wynalazku pobiera się z pojemnika i cząstkowe objętości dodaje się do różnych naczyń reakcyjnych. Naczynia reakcyjne mogą stanowić probówki reakcyjne wykonane z tworzyw sztucznych, ewentualnie w formacie płytki mikrotitracyjnej zawierającej 96 lub 384 lub więcej studzienek, gdzie można przeprowadzić reakcję. Jednak te naczynia mogą być wykonane z innego materiału, np. ze stali.
Korzystnym wykonaniem wynalazku są sposoby oczyszczania, po których następuje etap detekcji, albo sposoby oczyszczania, a potem etap amplifikacji i detekcji. Docelowy kwas nukleinowy lub kwasy nukleinowe, będące przedmiotem zainteresowania mogą być zawarte w matrycy innych niż docelowe kwasów nukleinowych, i mogą nawet być składnikiem drugorzędnym we wspomnianej mieszaninie określonych kwasów nukleinowych. Odpowiednie sposoby detekcji DNA są znane specjaliście i są opisane w standardowych podręcznikach, jak Sambrook i in.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, oraz Ausubel i in.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY. Przed przeprowadzeniem etapu detekcji mogą być także dodatkowe etapy oczyszczania, jak np. etap strącania. Sposoby detekcji mogą obejmować, ale nie wyłącznie, wiązanie lub interkalowanie określonych barwników, jak bromek etydyny, który interkaluje do dwuniciowego DNA, po czym zmienia swoją fluorescencję. Oczyszczony DNA można także oddzielić sposobami elektroforetycznymi, ewentualnie po trawieniu restrykcyjnym, a następnie zwizualizować. Istnieją także oznaczenia oparte na sondach, które wykorzystują hybrydyzację oligonukleotydów do specyficznych sekwencji, a następnie detekcję hybrydy. Można także zsekwencjonować DNA po dalszych etapach znanych specjaliście. W nowszych sposobach nanosi się różnorodne sekwencje DNA na czip krzemowy, do którego przyłączone są specyficzne sondy, które dają sygnał, gdy przyłączają się sekwencje komplementarne.
Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje amplifikacji amplifikację taką, jak reakcja łańcuchowa ligazy i reakcja łańcuchowa polimerazy, które specyficznie amplifikują sekwencje docelowe do ilości możliwych do wykrycia. Szczególnie korzystnym sposobem detekcji jest sposób TaqMan® ujawniony w WO 92/02638 i odpowiadających mu opisach patentowych US 5210015, US 5804375, US 5487972. Ten sposób wykorzystuje polimerazę mającą aktywność egzonukleazy do wytwarzania sygnału. Szczegółowo, kwas nukleinowy wykrywa się sposobem obejmującym kontaktowanie próbki z oligonukleotydem zawierającym sekwencję komplementarną do regionu docelowego kwasu nukleinowego oraz znakowanym oligonukleotydem zawierającym sekwencję komplementarną do drugiego regionu tej samej nici sekwencji docelowego kwasu nukleinowego, ale nie zawierającym sekwencji kwasu nukleinowego definiowanej przez pierwszy oligonukleotyd, z wytworzeniem mieszaniny podwójnych nici w warunkach hybrydyzacji, gdzie podwójne nici obejmują docelowy kwas nukleinowy przyłączony do pierwszego oligonukleotydu oraz do znakowanego oligonukleotydu, tak że 3'-koniec pierwszego oligonukleotydu przylega do 5'-końca znakowanego oligonukleotydu. Następnie tę mieszaninę traktuje się zależną od matrycy polimerazą kwasu nukleinowego mającą aktywność nukleazy 5' do 3' w warunkach, które umożliwiają aktywności 5' do 3' nukleazy polimerazy rozszczepienie przyłączonego oligonukleotydu znakowanego i uwolnienie fragmentów znakowanych; i wykrywa się i/lub mierzy sygnał wytwarzany przez hydrolizę oligonukleotydu znakowanego. Technologia TaqMan©
PL 202 358 B1 eliminuje potrzebę tworzenia kompleksu reakcyjnego związanego z fazą stałą i umożliwienie jego wykrycia.
W bardziej ogólnym sensie, ujawniona jest procedura oczyszczania materiału biologicznego, po której następuje etap detekcji, gdzie reakcja amplifikacji i/lub detekcji stanowi oznaczenie multipleksowe w fazie roztworu homogennego do równoczesnego wykrywania wielu celów (patrz przykłady 7.2).
W innym wykonaniu wynalazku, opisaną procedurę oczyszczania łączy się z procedurą amplifikacji stosując jeden ze sposobów opisanych w dalej, korzystnie przy użyciu oligonukleotydów blokujących. Problemem często związanym z amplifikacją zwłaszcza małych ilości docelowego kwasu nukleinowego jest aktywność polimeraz termostabilnych w niższych temperaturach (od temperatury pokojowej aż do 40°C). W tej temperaturze oligonukleotydy starterowe często wiążą się niespecyficznie ze sobą lub z kwasem nukleinowym tła i mogą być przedłużane przez polimerazę. To pociąga za sobą spadek ilości składników reakcyjnych jak również wyższy poziom sygnału tła, a wskutek tego zmniejszoną czułość. Może to także prowadzić do wyników fałszywie dodatnich. W celu uniknięcia niespecyficznej aktywności polimeraz opisano kilka podejść, jak PCR z gorącym startem (Chou i in., 1992, Nuci. Acid Res. 20, 1717-1723), polimerazy zmodyfikowane kowalencyjnie (np. AmpliTaq Gold, Perkin Elmer) lub przeciwciała (Scalice i in., J. Immunol. Methods, 172, 147 - 163, 1994) i oligonukleotydy (Dang i Jayasena, JMB 264, 268-278, 1996; US 5763173; US 5693502) . Zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku oligonukleotydy blokujące są to oligonukleotydy, które są zdolne do blokowania centrów aktywnych polimeraz aż do wspomnianej temperatury. Takim oligonukleotydem może być np. aptamer jak opisano w Przykładzie 7.2.2.1.3.
W innym wykonaniu wynalazku aptamery (patrz np. w Przykładzie 7.2.2.1.3) i/lub same zmodyfikowane startery (patrz np. w Przykładzie 7.2.2.1.3) mogą być użyte w reakcji amplifikacji i połączonych z nią sposobach detekcji. Ma to korzystne działanie i może być uważane za wynalazek sam przez się, który daje doskonałe wyniki. W korzystnym wykonaniu wynalazku 3'-końcowa zasada nukleotydowa, korzystnie adenina, jest zmodyfikowana resztą p-(t-butylo)-benzylową. Dalsze modyfikacje, w tym modyfikacje w pozycji 3'-1, są opisane w EP 866071 A2..
W jeszcze innym wykonaniu wynalazku po procedurze oczyszczania materiału biologicznego następuje etap detekcji, w którym przez co najmniej 5 cykli reakcji łańcuchowej polimerazy, temperatura przyłączania startera do matrycy jest mniejsza niż o 8°C, korzystnie mniej niż o 3°C wyższa od temperatury dysocjacji kompleksu polimeraza-aptamer.
Następujące przykłady służą dla ilustracji wykonań wynalazku.
Opisy Figur:
Fig. 1: Schemat technologiczny wytwarzania metodą syntezy zolu i suszenia rozpyłowego.
Fig. 2: Schemat technologiczny wytwarzania surowych MGP.
Fig. 3: Schematyczne zobrazowanie suszarki rozpyłowej produkcji firmy Nubilosa. Szczegóły są opisane w tekście pod Przykładem 1.3.
Fig. 4: Uzyskany metodą wysokorozdzielczej skaningowej mikroskopii elektronowej obraz MGP z pigmentem BM firmy Merck.
Fig. 5: Uzyskany metodą wysokorozdzielczej skaningowej mikroskopii elektronowej obraz MGP z pigmentem CERAC.
Fig. 6: Uzyskany metodą wysokorozdzielczej skaningowej mikroskopii elektronowej obraz MGP z pigmentem MMB firmy Merck.
Fig. 7: Uzyskany metodą wysokorozdzielczej skaningowej mikroskopii elektronowej obraz MGP z pigmentem Strem.
Fig. 8: Uzyskany metodą wysokorozdzielczej skaningowej mikroskopii elektronowej obraz MGP z pigmentem FA firmy BASF.
Fig. 9: Uzyskany metodą wysokorozdzielczej skaningowej mikroskopii elektronowej obraz MGP z pigmentem CE-HQ firmy BASF.
Fig. 10: Uzyskany metodą wysokorozdzielczej skaningowej mikroskopii elektronowej obraz MGP z pigmentem CE-SU firmy BASF.
Fig. 11: Wpływ pigmentu rdzeni magnetycznych lub suszarki rozpyłowej na izolowanie RNA (suszarka rozpyłowa: Bijchi (B) lub Nubilosa (N)).
Fig. 12: Wpływ parametru ciśnienie rozpylania na izolowanie DNA lub RNA.
Fig. 13: Wpływ różnych parametrów wytwarzania MGP na izolowanie RNA (ciśnienie rozpylania, (L = powietrze, N = azot), temperatura wlotowa (E) lub temperatura wylotowa (A).
Fig. 14a, b: Sedymentacja różnych MGP w różnych środowiskach zawiesin.
PL 202 358 B1
Fig. 15: Obraz HREM próbki EJ0096.5R-01; MGP z pigmentem CERAC.
Fig. 16: Obraz HREM próbki EJ0100.5R-01, rozpylonej pod niskim ciśnieniem i w wysokiej temperaturze, zawierającej głównie zdeformowane cząstki w mikroskali.
P r z y k ł a d 1: Wytwarzanie magnetycznych cząstek szklanych
Klasycznie, surowce jak SiO2 i węglany metali alkalicznych lub ziem alkalicznych (Na2CO3, K2CO3, CaCO3) stapia się razem typ reakcji:
Na2CO3 + SiO2 —— Na2SiO3 (= Na2O*SiO2) + CO2(
K2CO3 + SiO2 —— K2SO3 (= K2O-SiO2) + CO2T
CaCO3 + SiO2 — CaSiO3 (= CaO-SiO2) + CO2(
Jednak w większości przypadków stosuje się złożoną matrycę z krzemianu, boranu i glinianu, tj. w odniesieniu do składników matrycy, SiO2 jest częściowo zastąpiony przez B2O3 i AI2O3.
Alternatywnie, szkło można zsyntetyzować metodą reakcji zol-żel. typ reakcji:
albo reakcja zol-żel katalizowana kwasem, np.
BCI3 + 3 H2O — B(OH)3 + 3 H(+)Cl(-)
AICI3 + 3 H2O — Al(OH)3 + 3 H(+)Cl(-)
SiCl4 + 4 H2O — Si(OH)4 + 4 H(+)Cl(-)
Na(+)NO3(-) + H2O — Na(+)OH(-) + H(+)NO3(-) k(+) (-)OOCCH3 + H2O — K(+)OH(-) + H(+)(-)OOCCH3 albo katalizowana zasadą, jak w naszym przypadku, np.
k(+) (-)OCH2CH3 + H2O — K(+)OH(-) + HOCH2CH3
Na(+) (-)OCH3 + H2O — Na(+)OH(-) + HOCH3
Al(3+) [(-)OCH2CH2CH3]3 + 3H2O — Al(OH)3 + 3HOCH2CH2CH3
B(OCH2CH3)3 + 3H2O — B(OH)3 + 3 HOCH2CH3
Zaleta: alkohole łatwo odparowuje się podczas suszenia rozpyłowego; idealnie nie ma rekrystalizacji soli na powierzchni.
Tak więc, alkoholany przekształca się w wodorotlenki, które dają na drodze eliminacji wody odpowiednie tlenki. Te następnie tworzą trójwymiarową, bezpostaciową matrycę szklaną złożoną z SiO2/B2O3/Al2O3, do której wprowadza się pewne tlenki metali jako separatory wiązań matrycy, np.
Dla opisanych tu doświadczeń, składnik szklany wytworzono metodą katalizowanej zasadą syntezy zol-żel. Skład szkła użytego we wszystkich doświadczeniach był (o ile nie stwierdzono inaczej) nastę puj ący:
70,67% mol. SiO2, 14,33% mol. B2O3, 5,00% mol. AI2O3, 4,00% mol. K2O, 2,00% mol. CaO, 4,00% mol. ZnO (obliczony z masy poszczególnych eduktów reakcji)
1.1 Opis badanych pigmentów magnetycznych
Badano różne typy pigmentów magnetycznych i zestawiono je w Tabeli 1.
1.2 Wytwarzanie zolu powlekającego (skład EJ)
Substraty w następującej kolejności i ilości dodaje się do mieszalnika z możliwością ogrzewania:
Tetraetoksysilan (TEOS) 10700 ml
Boran trietylu (TEB) 3305 ml
Metanolan potasu 25% (wag./obj.) w metanolu 1601 ml
Etanol 11292 ml
PL 202 358 B1
Izopropanolan glinu Wapń
Octan cynku
1385 g 54,4 g
498 g
Później naczynie zamyka się. Zol ogrzewa się do 70°C i miesza przez noc (15 godzin). Temperaturę reguluje się czujnikiem temperatury zanurzonym w cieczy.
Następnie zol ogrzewa się do 90°C i dodaje mieszaninę alkohol/woda (etanol: 3781 ml, H2O: 1512 ml) z szybkością 5000 ml/godzinę. Po całkowitym dodaniu wspomnianej mieszaniny naczynie chłodzi się do 20°C.
Pokrywę otwiera się i przy energicznym mieszaniu dodaje się 10249 g pigmentu magnetycznego (CERAC). Wytworzony zol przenosi się wężem do suszarki rozpyłowej.
1.3 Suszenie rozpyłowe
Temperaturę wlotową suszarki rozpyłowej reguluje się na 200°C. Ciśnienie dyszy reguluje się na 6 x 105 Pa i dyszę chłodzi się przez 3 minuty etanolem. Następnie wąż podłącza się do wylotu szklanego naczynia i zol zawierający pigment pompuje się z szybkością 110 ml/minutę do dyszy dla dwóch płynów (średnica otworu: 2 mm; dostawca: Nubilosa, typ 1B1WS1) suszarki rozpyłowej przez urządzenie ultradźwiękowe (200 W). Układ do suszenia rozpyłowego pokazano schematycznie na Figurze 3. Cząstki, które tworzą się w pierwszych dwóch minutach, są odrzucane. Po całkowitym rozpyleniu zolu pojemnik pod cyklonem (AVO, patrz Figura 3) z cząstkami zabiera się i cząstki dalej traktuje jak opisano w dalszych etapach.
Zol zawierający pigment miesza się w mieszalniku aby zapobiec sedymentacji zawieszonych cząstek. Zol przenosi się z naczynia do dyszy przy użyciu pompy (SP). Jako gaz suszący stosuje się azot ogrzewany grzejnikiem elektrycznym (EWT). Powleczony pigment przenosi się z komory suszarki (T) do cyklonu (ZY). Wysuszony proszek można zabrać z pojemnika (AVO) pod cyklonem. Bardzo miałkie cząstki usuwa się z azotu przy użyciu filtra (SF). Stosuje się suszarkę rozpyłową z nadciśnieniem aby zapobiec wlotowi powietrza do suszarki. Przepływ gazu wytwarza się dmuchawą (AV).
1.4 Dalsza obróbka proszku wysuszonego rozpyłowo
Proszek przenosi się do ceramicznej misy i ogrzewa w piecu do 200°C z szybkością ogrzewania 1 K/minutę. Następnie utrzymuje się temperaturę 200°C przez jedną godzinę, po czym piec chłodzi się. Misę przenosi się do pieca atmosferycznego objętości 27 l, który przepłukuje się 60 l azotu na godzinę. Piec ogrzewa się do 750°C przy szybkości ogrzewania 1 K/minutę i utrzymuje w tej temperaturze przez 1 godzinę. Następnie piec chłodzi się do 150°C i przepłukuje 60 l powietrza na godzinę.
Piec ogrzewa się do 200°C przy szybkości ogrzewania 2 K/minutę i utrzymuje w tej temperaturze przez 1 godzinę, a później chłodzi się do temperatury. Proszek przenosi się na sito (50 μm) i przesiewa przez 30 minut. Potem przesianą próbkę butelkuje się w pojemnikach szklanych, które nie zamknięte sterylizuje się w piecu ogrzanym do 200°C przy szybkości ogrzewania 1 K/minutę, utrzymuje w tej temperaturze przez 4 godziny, a następnie chłodzi do 80°C. Wtedy naczynia szklane wystawia się z pieca, przykrywa sterylną folią i zamyka pokrywą.
Zestawienie ważnych parametrów sposobu przedstawiono w Tabeli 2 i Tabeli 3, poszczególne wytworzone próbki wraz z niektórymi danymi podano w Tabeli 3. Każda próbka ma specjalny kod. Pierwsze dwie litery opisują stosowaną chemię szkła (patrz poniżej), a następne cztery cyfry kodują sposób wytwarzania (patrz Tabela 2). Dalsza cyfra opisuje stosowany pigment (patrz Tabela 1). Litera R oznacza, że miału nie usunięto, zaś E oznacza, że miał usunięto etanolem. Ostatnie dwie cyfry opisują numer partii. Skład szkła (kod EJ) jak obliczono z ilości substratów jest następujący: 70,67% mol. SiO2, 14,33% mol. B2O3, 5,00% mol. Al2O3, 4,00% mol. K2O, 2,00% mol. CaO, 4,00% mol. ZnO. Skład szkła (kod RN): 74% mol. SiO2, 15% mol. B2O3, 5,00% mol. Al2O3, 4,00% mol. K2O, 2,00% mol. CaO. Skład szkła (kod EP): 73,61% mol. SiO2, 14,93% mol. B2O3, 5,21% mol. Al2O3, 4,17% mol. K2O, 2,08% mol. CaO.
P r z y k ł a d 2: Wysokorozdzielcza skaningowa mikroskopia elektronowa
Dla uzyskania informacji o powierzchni, wielkości i postaci MGP, przeprowadzono badania przy użyciu wysokorozdzielczego skaningowego mikroskopu elektronowego produkcji firmy JEOL (JSM). Próbki nanoszono na nośnik próbki z elektrycznie przewodzącą dwustronną taśmą klejącą i napylano złotem przez 36 sekund przy natężeniu prądu 30 mA. W celu obrazowania powierzchni obserwowano elektrony wtórne (topografia) oraz elektrony wstecznie rozproszone (kontrast z liczby atomowej). Stosowane napięcie elektronów pierwotnych wynosiło 10 kV (elektrony wtórne) lub 25 kV (elektrony rozproszone wstecz).
PL 202 358 B1
Figura 4 pokazuje MGP z miką powleczoną tlenkiem żelazowym jako pigmentem magnetycznym (BM). Można wyraźnie dostrzec pękanie powłoki szklanej, które bierze się z suszenia rozpyłowego cząstek, gdy warstwa zaczyna się kurczyć na nie kurczącym się podłożu (pęknięcia przy suszeniu).
Ponadto można zobaczyć większą liczbę cząstek kulistych, które nie zawierają żadnej z większych cząstek magnetycznych (10 - 60 μm). Te kulki bez rdzenia magnetycznego (zawartość miału niemagnetycznego) nie mogą być usunięte w polu magnetycznym, mogą zostać przeniesione do reakcji PCR i będą zakłócać tę reakcję.
Cząstki z pigmentem CERAC (patrz Figura 5) nie mają pęknięć, gdyż pigment magnetyczny (średni rozmiar cząstki 23 nm) nie powoduje naprężeń w warstwie, tak, że podczas procesu suszenia rozpyłowego nie tworzą się żadne pęknięcia. Ponadto, małe cząstki CERAC są także wbudowane w zawartość miału, tak, że nie ma w nim cząstek niemagnetycznych. Cząstki są także zasadniczo mniejsze niż cząstki z miką, które można obserwować na tych Figurach przy tym samym powiększeniu. MGP z innymi pigmentami magnetycznymi są pokazane przy tym samym powiększeniu na Figurach od 6 do 10.
P r z y k ł a d 3: Badania fizyczne MGP
Dla umożliwienia oceny MGP przed rzeczywistymi testami funkcjonalnymi, oprócz badań HREM wykonano dalsze pomiary fizyczne MGP. Interesujące było poznanie rozpuszczalności żelaza w wodzie, siły magnetycznej, zawartości miału i gęstości. Poniżej opisano doświadczenia i przedstawiono wyniki.
3.1 Pomiary absorbancji
Dla sprawdzenia, czy miał został usunięty, 1000 mg traktowanego termicznie i przesianego proszku odważa się do probówki wirowniczej 50 ml (Sarstedt), dodaje 40 ml wody i dysperguje przez wytrząsanie. Następnie probówkę zanurza się w łaźni ultradźwiękowej (Sonorex (RK 102H; 120/240 W) przy całkowitym napełnieniu i wkłada do separatora magnetycznego (Roche Diagnostics GmbH RD, nr kat. 1858 025). Po 3,5 minutach rozdzielania magnetycznego, ciecz pobiera się z naczynia szklaną pipetą pasteurowską na wysokości kreski 15 ml po przeciwnej stronie niż magnes i napełnia kuwetę kwarcową 5 mm (typ 110-QS, Hellma). Absorbancję supernatantu mierzy się w spektrofotometrze UV-VISNIR (Hitachi U-3000) względem odpowiedniej kuwety napełnionej wodą dejonizowaną. Wybrano zakres pomiarowy 200 do 1100 nm w etapach po 1 nm dla zbadania zakresu długości fali pasm absorpcyjnych ewentualnych zanieczyszczeń. Absorbancję przy długości fali 280 nm i 400 nm przyjęto jako odnośnik.
3.2 Pomiary gęstości
Do pomiarów gęstości stosuje się piknometr gazowy (AccuPyc 1330, firma Micromeritics). Jako gaz stosuje się hel 6.0. Urządzenie kalibruje się przy użyciu dostarczonego wzorca (perełki stalowe o znanej objętości). Dalej, próbkę suszy się przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 150°C, a następnie napełnia pojemnik pomiarowy i waży. Po włożeniu pojemnika pomiarowego do piknometru gazowego stosuje się 10 cykli przemywania i 5 cykli pomiarowych w celu określenia wartości średniej i odchylenia standardowego.
3.3 Oznaczenie rozpuszczalności żelaza
Rozpuszczalność żelaza z powleczonych i potraktowanych termicznie próbek oznacza się metodą ICP-aes (spektrofotometrii mas z jonizacją indukowania sprzężoną plazmą) (JY 24, firma ISA). W tym celu, 1 g próbki przenosi się do 50 ml probówki polipropylenowej, dopełnia wodą destylowaną i utrzymuje w temperaturze 60°C przez 20 godzin. Następnie próbki filtruje się przez filtr strzykawkowy 0,2 μm i wykonuje pomiar dla przesączu. Wykonuje się cztery pojedyncze oznaczenia przy długości fali 259,940 nm i z nich liczy się wartość średnią.
3.4 Pomiar siły magnetycznej
Do pomiaru siły magnetycznej waży się polipropylenową probówkę do odważania (firma Company Licefa, nr kat. V2-3) całkowicie napełnioną MGP. Przy pomocy wzornika, ten pojemnik umieszcza się w środku probówki z polietylenu o niskiej gęstości LDPE (Company Kartell, TS 735) obciążonej mosiądzem tak, że pokrywkę probówki można jeszcze zamknąć. Naczynie ustawia się na środku wagi (dokładność wykrywania 0,1 g) przy pomocy innego wzornika. Po zrównoważeniu wagi, nad szalką umieszcza się plastikową nasadkę, która zawiera walcowy magnes (średnica: 30 mm; wysokość: 113,5 mm; materiał: samar-kobalt 2/17).
MGP na szalce są przyciągane wbrew sile grawitacji, dzięki czemu zmniejszają swoją wagę. Po doprowadzeniu do równowagi (1,5 minuty) określa się ubytek wagi próbki i wartość normalizuje dla 250 mg MGP.
PL 202 358 B1
3.5 Wyniki
Wyniki charakterystyki fizycznej MGP dIa składu EJ i różnych pigmentów zestawiono w TabeIi 3. Można zauważyć, że wartości absorbancji są bardzo niskie, gdy stosuje się pigment CERAC. Można to wyjaśnić brakiem zawartości miału niemagnetycznego, ponieważ mały pigment CERAC (23 nm) może być zawarty w każdej magnetycznej cząstce szkIanej. Gęstość MGP-CERAC nie jest bardzo wysoka. Ma to dodatni wpływ na szybkość sedymentacji. Siła magnetyczna podIega wysokim fIuktuacjom, jednak pigmenty CERAC mają na nią dodatni wpływ. MGP-CERAC mają porównywaInie wysokie przeciekanie żeIaza do wody. Jednak, nawet dziesięciokrotnie wyższe wartości nie wykazały żadnego wpływu na proces PCR.
Podsumowując, można powiedzieć, że właściwości fizyczne nie wykazują żadnych znaczących różnic między różnymi pigmentami, aIe MGP CERAC mają bardzo niską zawartość miału.
P r z y k ł a d 4: Wpływ pigmentu stanowiącego rdzeń magnetyczny i suszarki rozpyłowej na powierzchnię BET
Powierzchnie okreśIano stosując urządzenie z firmy Micromeritics (typ ASAP 2400). Pomiar prowadzono w temperaturze ciekłego azotu. Jako gaz pomiarowy stosowano azot 5,0, a jako gaz obojętny stosowano heI 4,6. Typowo do jednego pomiaru stosowano 5 g próbki.
Powierzchnia MGP odgrywa oczywistą roIę w izoIowaniu DNA i RNA. Im większa powierzchnia, tym więcej DNA może zostać związane przez tę samą masę MGP. Można także stosować mniej MGP i uzyskać tę samą sprawność. Ma to taki skutek, że objętość międzyziarnowa jest mniejsza, co oznacza, że mniej aIkohoIu może być wprowadzone jako zanieczyszczenie do reakcji PCR. Dane dIa zmierzonych powierzchni BET dIa niektórych próbek zestawiono w TabeIi 4. Gdy porównuje się powierzchnie próbek wytworzonych w dużej suszarce rozpyłowej, naIeży zauważyć, że próbki z małymi pigmentami (BASF FA, STREM i CERAC) mają stosunkowo duże powierzchnie, podczas gdy duże pigmenty Merck mają małe powierzchnie. Może to być powodowane przez fakt, że duże cząstki magnetyczne dają duże MGP, podczas gdy małe cząstki magnetyczne są włączane do kropeIek sferycznych podczas procesu suszenia rozpyłowego, a więc w podobnych warunkach rozpyIania mają podobne powierzchnie. Rozkład wieIkości cząstek BASF CE-SU Ieży między małymi (BASF FA, STREM i CERAC) i dużymi cząstkami Merck. W porównaniu z cząsteczkami Merck, te cząstki nie mają powierzchni strukturaInej, tak, że mają bardzo gładką powierzchnię szkła. Daje to mniejszą powierzchnię. DIa mniejszej suszarki rozpyłowej stosowano wyższe ciśnienie, zaś dysza tej suszarki rozpyłowej jest znacznie mniejsza od dyszy większej suszarki rozpyłowej. Daje to mniejsze cząstki, dzięki czemu powierzchnia znacząco rośnie. Dobrze zgadza się to z wynikami z Przykładu 5.2.1.
Nie można było rozpoznać wpływu pigmentu magnetycznego Iub ciśnienia rozpyIania na wyniki daIszych badań fizycznych z wyjątkiem wyżej wymienionego wpływu na tworzenie pęknięć i zawartość miału. Jednak, tyIko pomiary powierzchni wykazują bezpośredni związek z wynikami badań funkcjonaInych. Inne wyniki badań fizycznych nie wykazują tej bezpośredniej koreIacji.
P r z y k ł a d 5: Badania wiązania przez znakowanie promieniotwórcze
Istnieje kiIka sposobów oceny MGP pod wzgIędem ich przydatności do ekstrakcji kwasów nukIeinowych. Oznaczanie absorbancji przy 260 nm przed i po oczyszczaniu nie jest bardzo czułe i nie przypomina sytuacji, gdy małe iIości doceIowego kwasu nukIeinowego są ekstrahowane z materiału kIinicznego. Wyniki metod oceny funkcjonaInej, które opierają się na sposobie ampIifikacji kwasów nukIeinowych, jak np. metodą PCR, RT-PCR, NASBA Iub jakąś podobną, często nie są dostatecznie przekonujące. Ponadto, te sposoby, które są odpowiednie do oznaczania małej Iiczby kopii doceIowego genomu, są podatne na zakłócenia przez substancje z materiału próbki Iub z procesu przygotowania próbki. Promieniotwórcze badania wiązania stanowią odpowiednią metodę anaIityczną, która umożIiwia anaIizowanie procesu przygotowania próbki etap po etapie. Dane o sprawności nie są danymi bezwzgIędnymi, aIe zawsze odnoszą się do sprawności cząstki odniesienia.
5.1 Procedura doświadczaIna
Najpierw, znakowany promieniotwórczo DNA Iub RNA syntetyzuje się enzymatycznie w procesie PCR Iub transkrypcji in vitro w obecności znakowanego 32p deoksynukIeozydu Iub nukIeozydotrifosforanów. Następnie, znakowany DNA Iub RNA oddzieIa się od woInych nukIeozydo-trifosforanów, oznacza się zawartość i wytwarza okreśIone rozcieńczenie.
Małą iIość znakowanego DNA Iub RNA dodaje się do każdej próbki przed badaniem. Podczas przygotowania próbki, wszystkie kwasy nukIeinowe wiążą się do MGP w obecności środków chaotropowych. MGP peIetyzuje się działaniem sił magnetycznych, a supernatanty można odrzucić. PeIetkę przemywa się i związane kwasy nukIeinowe eIuuje się w podwyższonej temperaturze przez odwrócePL 202 358 B1 nie warunków reakcji, tj. przez dodanie buforu elucyjnego o niskiej zawartości soli. Po związaniu i ewentualnie po etapie przemywania, próbk ę supernatantu czą stek nakrapla się na filtr. Eluat oraz ponownie zdyspergowane w wodzie MGP również nakrapla się na filtr, po czym suszy. Na koniec, mierzy się promieniotwórczość filtrów licznikiem beta i dla każdego preparatu próbki oblicza się rozkład.
5.1.1 Wytwarzanie promieniotwórczo znakowanego DNA
5.1.1.1 A.1.1. Odczynniki
- Układ PCR Expand High Fidelity (Roche Molecular Biochemicals, nr kat. 732641)
- dNTP Mix (Roche Molecular Biochemicals, nr kat. 1277049)
- Deoksycytydyno-5'-alfa-P32-trifosforan dCTP 3000 Ci/mmol (Amersham, nr kat. PB 10205)
- lambda-DNA (Roche, nr kat. 1029053) st ężenie 1 ng/ml - Marker promieniotwórczy starter 1 (SEKW. ID. NR 1) stężenie 5,3 OD260/ml - Marker promieniotwórczy starter 2 (SEKW. ID. NR 2) stężenie 5,2 OD260/ml - QIA Quick PCR Purification Kit (Qiagen, nr kat. 28104)
5.1.1.2 Reakcja
- 29,5 μ l wody redestylowanej - 5 μ l buforu Expand High Fidelity
- 2,5 μ l dNTP Mix (1:10) rozcień czono wod ą redestylowaną
- 1 μΐ markera promieniotwórczego startera 1 (SEKW. ID. NR 1)
- 1 μl markera promieniotwórczego startera 2 (SEKW. ID. NR 2)
- 0,3 μί 32P-dCTP
- 10 μΐ lambda-DNA
- 0,75 μΐ mieszanki enzymów Expand High Fidelity
5.1.1.3 Amplifikacja
- 2 minuty 94°C
- 10 cykli (10 s 94°C/30 s 60°C/60 s 72°C)
- 20 cykli (10 s 94°C/30 s 60°C/60 s 72°C + 10 s 72°C przedłużenia na cykl)
- 7 minut 72°C
- 4°C
5.1.1.4 Oczyszczanie
- zgodnie z procedurą szybkiego oczyszczania PCR QIA (Qiagen)
5.1.1.5 Rozcieńczanie
Rozcieńczenie DNA 1:10 w wodzie redestylowanej i pomiar licznikiem beta
5.1.2 A.2. Wytwarzanie promieniotwórczo znakowanego RNA
5.1.2.1 - Odczynniki
- Zestaw transkrypcyjny SP6/T7 (Roche Molecular Biochemicals, nr kat. 999644)
- Urydyno-5'-alfa-P32-trifosforan UTP 3000 Ci/mmol (Amersham, nr kat. PB 10203)
- Plazmid pBKBH10S, zlinearyzowany enzymem EcoRI przy 100 μg/ml
Zestaw do izolowania RNA o wysokiej czystości (Roche Molecular Biochemicals, nr kat. 1828665)
5.1.2.2 - Reakcja
- 2 μl 10x bufor
- 3 μί NTP Mix (AGC)
- 1 μl UTP (1:50 woda redestylowana)
- 5 μl 32P-UTP
- 7 μl zlinearyzowanego plazmidu
- 1 μl inhibitora RNAzy (Roche Molecular Biochemicals, nr kat. 802808)
- 1 μl Polimerazy RNA T7
5.1.2.3 Transkrypcja i trawienie DNAza
- 20 minut inkubacji w temperaturze 37°C
- dodanie 2 μl DNAzy, wolnej od RNAzy
- 10 minut inkubacji w temperaturze 37°C
- dodanie 178 μl wody redestylowanej
5.1.2.4 - Oczyszczanie
- zgodnie z procedurą izolowania RNA o wysokiej czystości (Roche Molecular Biochemicals)
5.1.2.5 - Rozcieńczanie:
Rozcieńczanie RNA 1:30 w wodzie redestylowanej i pomiar licznikiem beta
PL 202 358 B1
5.1.3 - Przygotowanie próbki promieniotwórczej
5.1.3.1 - Odczynniki
- Osocze, próbka negatywna
- Proteinaza K, stężenie 20 mg/ml (np. Roche, nr kat. 1942387)
- Poly-A-RNA (np. Roche, nr kat. 108626) stężenie 1 mg/ml; rozcieńczony 1:1000 (obj./obj.) buforem do lizy
- Bufor do lizy (50 mM Tris pH 7,0, 15% obj. Polydocanol, 5M izotiocyjanian guanidyniowy, mM DTT)
- MGP (o składzie szkła EJ i różnych pigmentach rdzeni (BM, MMB, CERAC, STREM, BASFFA, BASF-CE)) zawieszone w izopropanolu przy 60 mg/ml lub przy 6 mg/ml
- Bufor do przemywania (20 mM Tris pH 7,5, 20 mM NaCl, 70% obj. etanolu)
- Roztwór elucyjny: woda redestylowana
- Materiał pomocniczy: filtr Whatman GF/D
5.1.3.2 - Reakcja (procedura dla 1,5 ml)
- 80 μl proteinazy K
- dodać 410 μl negatywnej próbki osocza i zmieszać
- dodać 500 μl buforu do lizy i zmieszać
- dodać 10 μl znakowanego promieniotwórczo DNA lub RNA i zmieszać
- 10 minut inkubacji w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem
- dodać 500 μl zawiesiny MGP (stężenie 6 mg/ml) i zmieszać
- 20 minut inkubacji w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem rozdzielanie przez 2 minuty w separatorze magnetycznym (Dynal)
- odrzucić supernatant i nanieść punktowo 300 μl na filtr
- dodać 750 μl buforu do przemywania, zawirować, 2 minuty rozdzielania
- odrzucić supernatant, w końcu nanieść punktowo 375 μl supernatantu na filtr
- powtórzyć procedurę przemywania dwukrotnie
- dodać 100 μl roztworu elucyjnego, inkubować 5 minut w temperaturze 80°C w termomikserze
- oddzielać 2 minut w oddzielaczu magnetycznym, nanieść punktowo supernatant na filtr
- dodać 100 μl roztworu elucyjnego, ponownie zawiesić i nanieść punktowo MGP na filtr
- suszyć filtry przez 60 minut w temperaturze 75°C w suszarce
- przenieść filtr do probówek scyntylacyjnych, dodać 5 ml roztworu scyntylacyjnego i zmierzyć licznikiem beta
5.1.3.3 - Protokół doświadczalny (protokół dla 1 ml)
- 25 μl proteinazy K
- dodać 415 μl negatywnej próbki osocza i zmieszać
- dodać 500 μl buforu do lizy i zmieszać
- dodać 10 μl znakowanego promieniotwórczo DNA lub RNA i zmieszać
- 5 minut inkubacji w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem
- dodać 50 μl zawiesiny MGP (stężenie 60 mg/ml) i zmieszać
- 20 minut inkubacji w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem
- rozdzielanie przez 2 minuty w oddzielaczu magnetycznym (Dynal)
- odrzucić supernatant i nanieść punktowo 300 μl na filtr
- dodać 700 μl buforu do przemywania, zawirować, 2 minuty rozdzielania
- odrzucić supernatant, ostatecznie nanieść punktowo 350 μl supernatantu na filtr
- powtórzyć procedurę przemywania dwukrotnie
- dodać 120 μl roztworu elucyjnego, inkubować 10 minut w temperaturze 80°C w termomikserze
- oddzielać 2 minuty w uchwycie magnesu, nanieść punktowo supernatant na filtr
- dodać 100 μl roztworu elucyjnego, ponownie zawiesić i nanieść punktowo MGP na filtr
- suszyć filtry przez 60 minut w temperaturze 75°C w suszarce
- przenieść filtr do probówek scyntylacyjnych, dodać 5 ml roztworu scyntylacyjnego i zmierzyć licznikiem beta
5.2 Wyniki doświadczeń ze znakowaniem promieniotwórczym:
5.2.1 Wpływ pigmentu rdzeni magnetycznych lub suszarki rozpyłowej na izolowanie RNA
Różne typy MGP, które wytworzono stosując szkło o składzie EJ i rozmaite rdzenie w zakresie nanometrów lub mikrometrów (MMB, CERAC, itp.) w rozmaitych suszarkach rozpyłowych (Βϋ^ϊ lub Nubilosa), scharakteryzowano pod względem ich zachowania przy ekstrakcji kwasu nukleinowego ze
PL 202 358 B1 spulowanego materiału bez wirusa sposobem znakowania promieniotwórczego według Przykładu 5.1.3.2. W trakcie badań najbardziej czuły okazał się parametr RNA, a zatem został wybrany jako parametr oceny. Figura 11 pokazuje, że BASF-CE nie jest odpowiedni jako materiał rdzenia, gdyż w eluacie można stwierdzić tylko małe ilości związanego RNA. Cząstki EJ/CERAC, które były rozpylane w układzie ΒϋΗ'π pod ciśnieniem 6 x 105 Pa, wykazały sprawność równą odnośnikowi EJ/MMB, który był rozpylany w układzie Nubilosa.
5.2.2 Wpływ parametru - ciśnienie rozpylania na izolowanie DNA lub RNA
Różne typy MGP wytworzone przy użyciu układu Nubilosa przy różnych ciśnieniach rozpylania porównuje się zgodnie z 5.1.3.3. Cząstki odniesienia stanowią MGP EJ/MMB. Bada się właściwości wiązania DNA i RNA. Podczas gdy parametr DNA nie wykazuje zależności od ciśnienia rozpylania, to parametr RNA wykazuje znaczące różnice sprawności. Sprawność cząstek EJ/CERAC wytworzonych pod ciśnieniem rozpylania 15 X 105 Pa w układzie Nubilosa jest niższa niż sprawność odnośnika. Sprawność jest niższa w serii w zależności od ciśnienia rozpylania, które zmieniano od 15 x 105 do 34 x 105 Pa (-30%). Cząstki, które rozpyla się pod ciśnieniem 43 x 105 Pa, osiągnęły 90% sprawności cząstek, które rozpyla się pod ciśnieniem 150000 PA (patrz Figura 12).
Doświadczenia dowiodły, ze istnieje bezpośredni związek między parametrami sposobu wytwarzania MGP i sprawnością w teście. Należy zauważyć, że wzrost ciśnienia rozpylania prowadzi do niższej sprawności w teście, ale, poczynając od pewnego ciśnienia rozpylania, właściwości cząstek są poprawione, co prowadzi do lepszej sprawności.
5.2.3 Wpływ różnych parametrów wytwarzania MGP na izolowanie RNA i DNA
Te doświadczenia powinny wykazać, czy zmienianie ciśnienia rozpylania prowadzi do MGP o jeszcze lepszej sprawności.
Zatem MGP wytwarza się w układzie Nubilosa pod ciśnieniem 15 x 105 Pa, 43 x 105 Pa i 6 x 105 Pa przy użyciu azotu jako gazu rozpylającego.
Dla uzyskania ostrożnego suszenia dodatkowo zmniejsza się temperaturę wlotową i wylotową suszarki rozpyłowej. Wpływ tych czynników na izolowanie RNA bada się zgodnie z 5.1.3.3, stosując jako odnośnik MGP EJ/MMB.
Wyniki (patrz Figura 13) wykazują nieoczekiwany efekt ogromnego zmniejszenia sprawności, które jest spowodowane przez spadek temperatury rozpylania, i którego nie można było przewidzieć. Możliwe było osiągnięcie sprawności cząstek odniesienia przez zwiększenie ciśnienia rozpylania. Z powodu lepszej trwałości zawiesiny, te cząstki są zatem znacznie lepsze niż odnośnik.
P r z y k ł a d 6: Analizy sedymentacji magnetycznych cząstek szklanych
6.1 Protokół doświadczalny
Do oceny zachowania magnetycznych cząstek szklanych podczas sedymentacji stosuje się spektrofotometr Uvikon model 930 firmy Kontron Instruments. Ten spektrofotometr modyfikuje się, żeby umożliwić zmienne ustawianie kuwety wzdłuż podziałki. Do pomiarów kuwetę ustawia się w takim położeniu, w którym wiązka pomiarowa o długości fali 650 nm przechodzi przez kuwetę na 2/3 wysokości napełnienia (pozycja podziałki 7,5). Stosuje się makrokuwety z polistyrenu, które mają objętość 4 ml i długość ścieżki 1 cm. Przed pomiarami wykonuje się kalibrację w procedurze jednowiązkowej w odniesieniu do czystego środowiska zawiesiny. Próbki MGP dysperguje się do jednorodności w środowisku zawiesiny, typowo przy stosunku masy/objętości 3 mg/ml, i od razu mierzy się. Ciągle kontroluje się zmianę absorbancji w czasie przy wspomnianej długości fali 650 nm.
Wielkością fizyczną stosowaną do porównywania szybkości sedymentacji różnych próbek jest okres półtrwania (t1/2) w danym środowisku zawiesiny. Jest to czas do momentu, kiedy absorbancja zawiesiny w górnej jednej trzeciej kuwety wynosi połowę wartości na początku pomiaru. Spadek absorbancji jest powodowany przez sedymentację cząstek i równoczesne klarowanie górnej jednej trzeciej badanej objętości.
Opisane wyżej urządzenie dalej umożliwia założenie magnesu poniżej kuwety. Ten sposób można określić szybkość rozdzielania magnetycznego.
6.2 Wyniki analiz sedymentacji
6.2.1 Doświadczenie 1:
Dla kilku typów MGP z różnymi rdzeniami w zakresie nano- lub mikrometrów, wytworzonych ze szkłem EJ, badano spektrofotometrycznie ich zachowanie podczas sedymentacji i rozdzielania, tj. z magnesem pod kuwetą i bez magnesu. W tym przypadku stosunek masa/objętość wynosi 6 mg/ml. Środowisko zawiesiny tworzy mieszanina 1:1 izopropanolu i buforu do lizy. Wyniki zestawiono w Tabeli 5.
PL 202 358 B1
Cząstki z rdzeniem typu CERAC wykazują wyraźną zaletę w postaci stabilności zawiesiny, ale bez wad dla rozdziału magnetycznego, (patrz także Figura 14).
6.2.2 Doświadczenie 2:
Badano zachowanie podczas sedymentacji w czystym izopropanolu różnych MGP z typu CERAC wytworzonych ze szkłem EJ.
Ważne parametry wytwarzania
EJ0100.5R-01 - ciśnienie rozpylania 15 x 105 Pa, temperatura wlotowa 230°C, układ Nubilosa
EJ0108.5R-01 - ciśnienie rozpylania 43 x 105 Pa, temperatura wlotowa 230°C, układ Nubilosa
EJ0096.5R-01 - ciśnienie rozpylania 60 x 105 Pa, temperatura wlotowa 150°C, układ Bijchi
EJ0096.5R-01 pokazano na Figurze 15. Perełki te są w zgłownie sferyczne, o powierzchni wysoce strukturalnej i rozmiarze głównie 0,5-5 μm. Próbka EJ0100.5R-01, rozpylona pod niskim ciśnieniem i w wysokiej temperaturze, składa się głównie ze zdeformowanych cząstek w skali mikronowej (patrz Figura 16, gdzie pokazano równoważnik funkcjonalny EJ0100.5R). Podsumowując, cząstki takie jak EJ0096.5R-01 wykazują znaczące opóźnienie sedymentacji, które jest najkorzystniejsze dla przenoszenia ciekłych zawiesin MGP (patrz Figura 14b). Wyniki zestawiono w Tabeli 6.
P r z y k ł a d 7: Test funkcjonalny przy użyciu PCR
7.1 Heterogenne oznaczenia funkcjonalne: amplifikacja przy użyciu PCR na urządzeniu Perkin Elmer GeneAmp 9600® i detekcja przy użyciu testu wiązania biospecyficznego ze znakowaną chemiluminescencyjnie sondą detekcyjną na zmodyfikowanym Elecsys1010®
7.1.1. Rozważania ogólne
Cząstki wirusowe w próbce (np. osoczu) poddaje się lizie w obecności proteazy i wysokich stężeń soli chaotropowej, jak również detergentu. Następnie, dodaje się adsorbent złożony z cząstek (= MGP) w celu adsorpcji fizyko-chemicznej uwolnionych kwasów nukleinowych na powierzchni szklanej, po czym prowadzi się rozdzielenie magnetycznego i przemycia załadowanych perełek, tj. rozdzielenia składników związanych/wolnych. Na koniec, dysocjację związanych kwasów nukleinowych z perełek (= elucja) prowadzi się w warunkach reakcji odwróconej w odniesieniu do adsorpcji, tj. z buforem o niskiej zawartości soli lub nawet wodą destylowaną.
Następnie porcję eluatu miesza się z porcją mieszaniny reagentów do PCR w celu rozpoczęcia amplifikacji kwasów nukleinowych odzyskanych w eluacie. Tę reakcję charakteryzuje równanie
Ni = N0 x (1+E)n, gdzie
N0 = liczba cząsteczek na początku reakcji łańcuchowej polimerazy
Ni = liczba cząsteczek na końcu reakcji łańcuchowej polimerazy
E = efektywność amplifikacji = 0 < E < 1 n = liczba cykli reakcji = typowo 20 < n < 35
Po PCR z co najmniej jednym starterem biotynylowanym, porcję znakowanego biotyną amplifikatu miesza się z buforem do hybrydyzacji i sondą detekcyjną. Po inkubacji dodaje się perełki powleczone streptawidyną, po czym prowadzi się kolejną inkubację. Na koniec perełki przemywa się, dodaje się bufor sygnałowy i mierzy się intensywność sygnału chemiluminescencyjnego, która jest skorelowana z masą amplifikowanego związanego kwasu nukleinowego, a więc z ładunkiem wirusów w próbce osocza.
Specjalista może także ręcznie wykonać procedurę dla 1 ml.
7.1.2 Protokół doświadczalny
7.1.2.1 Odczynniki
7.1.2.1.1 Przygotowanie próbki
Proteinaza K, ciekła w układzie gliceryna/octan wapnia, 20 mg/ml
Poly-A-RNA, 1 mg/ml, poziom użytkowy to rozcieńczenie 1:1000 w buforze do lizy
Bufor do lizy, o następującym składzie:
• bufor Tris, 50 mmol/l, odpowiednio, pH 7,0 (protokół 1,0 ml + ekstraktor odpowiednio) lub 4,0 (protokół 1,5 ml) • odpowiednio, Polydocanol, 15% obj. (protokół 1,0 ml + ekstraktor) lub Triton X-100 20% obj. (protokół 1,5 ml) • izotiocyjanian guanidyniowy, 5 mol/l • 1 mmol/l DTT
Magnetyczne cząstki szklane (MGP) typu EJ/BM albo EJ/MMB albo EJ/CERAC zawieszone w izopropanolu (czystość 99,8%) w ilości 60 mg/ml
Bufor do przemywania, o następującym składzie:
• bufor Tris, 20 mmol/l, pH 7,5
PL 202 358 B1 • 60% wodny roztwór etanolu, odpowiednio 60% (protokół 1,0 ml + ekstraktor, odpowiednio) lub 70% (protokół 1,5 ml) • NaCl, 20 mmol/l
Eluent = woda redestylowana Amplifikacja/Mieszanina reagentów:
- Bufor PCR, o następującym składzie: środowisko buforu
RT-PCR (wirus ludzkiego niedoboru odporności (HIV), wirus zapalenia wątroby C (HCV)): 250 mmol/l Bicine/KOH pH 8,2, 557 mmol/l octan potasu, 40% gliceryna
HBV-PCR (wirus zapalenia wątroby B (HBV)): 20 mmol/l Tris-HCl pH 8,3; 100 mmol/l KCl, 0,012% Brij 35 (= 2 x koncentrat)
Kationy metali, MgCl2 (HBV-PCR) 3 mmol/l lub MnCl2, (RT-PCR)
2,5 mmol/l (HCV) i 1,25 mmol/l (HIV)
Deoksynukleozyd-trifosforan (dATP, dGTP, dCTP, dTTP, dUTP)
Starter „do przodu specyficzny dla analitu Starter „do tyłu specyficzny dla analitu Uracylo-N-glikozydaza (UNG)
Polimeraza DNA (polimeraza Taq albo Tth odpowiednio dla HBV albo HIV/HCV)
H2O zdemineralizowana (czystość dla biologii molekularnej) do doprowadzenia objętości do 100 μ Odczynnik stop dla UNG po amplifikacji
- N-lauroilosarkozyna (np. Roche, nr kat. 133895), 1% wag./obj.); 5 μl na 100 μl amplifikatu
7.1.2.1.2 Detekcja
Bufor do hybrydyzacji (np. Roche, nr kat. 1930273) znakowane chemiluminescencyjnie sondy detekcyjne:
HCV (Roche BMO 28.140336), roztwór roboczy =8,0 nmol/l HIV (Roche BMO 28.540948), roztwór roboczy =7,8 nmol/l HBV (Roche BMO 28.540917), roztwór roboczy = 9,2 nmol/l
Perełki ECL powleczone SA (np. Roche, nr kat. 1865943-001) roztwór do denaturacji (np. Roche, nr kat. 1930257)
ProCell (np. Roche, nr kat. 1717685)
CleanCell (np. Roche, nr kat. 1717642)
7.1.2.1.3 Startery i sondy Starter:
SEKW. ID. NR 3
SEKW. ID. NR 4
SEKW. ID. NR 5 SEKW. ID. NR 6
SEKW. ID. NR 7
SEKW. ID. NR 8 do przodu HIV: do tyłu HIV: do przodu HCV: do tyłu HCV: do przodu HBV: do tyłu HBV: Sondy detekcyjne: HIV:
HCV:
HBV:
SEKW. ID. NR 9 SEKW. ID. NR 10 SEKW. ID. NR 11
7.1.2.2 Warunki reakcji i procedura testu Przygotowanie próbki:
> Protokół ręczny na 1,0 ml; => stosowany do Doświadczenia 1, patrz Przykład 7.3.1 dodać 25 μl proteinazy K do 425 μl próbki osocza, zawirować, dodać 500 μl buforu do lizy, inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej przy mieszaniu mechanicznym (1300 obr/min. na mieszadle Eppendorf), dodać 50 μl MGP zawieszonych w izopropanolu (stężenie 60 mg/ml), zawirować, i inkubować 20 minut w temperaturze pokojowej na mieszadle rolkowym, rozdzielanie magnetyczne przy użyciu separatora magnetycznego Dynal (2 minuty);
usunąć frakcję nie związaną przez odessanie, i dodać 700 μl buforu do przemywania, zawirować, oddzielić, odessać;
powtórzyć procedurę przemywania 4 razy,
PL 202 358 B1 dodać 120 μl DEPC-wody, zawirować i eluować 10 minut w temperaturze 80 °C na urządzeniu Eppendorf Thermomixer przy 1300 obr./min. bez zamykania kubków, oddzielić perełki od wodnego supernatantu (= eluatu) przy użyciu separatora magnetycznego Dynal (2 minuty), zamrozić eluat aż do dalszego użycia.
> Protokół automatyczny na ekstraktorze własnej konstrukcji; => stosowany do Doświadczenia 2 i 3 (patrz Przykład 7.3.2 i Przykład 7.3.3)
Procedura i zestaw odczynników zasadniczo takie same jak wyżej. Dodatkowo, spakowany
RNA dodaje się jako kontrolę wewnętrzną (IC, patrz poniżej) do każdej próbki, proces ekstrakcji termostatuje się w temperaturze około 40°C, a objętości doprowadza się do 2 ml objętości całkowitej mieszanki litycznej, tj.
μί IC μl proteinazy K 850 μl próbki 1000 μl buforu do lizy 100 μl zawiesiny MGP
2200 μl buforu do przemywania dla każdego z 5 etapów przemywania 125 μl eluentu > Protokół ręczny na 1,5 ml; => stosowany do Doświadczenia 4 (patrz Przykład 7.3.4) dodać 80 μl proteinazy K do 420 μl próbki osocza, zawirować, dodać 500 μl buforu do lizy, inkubować 10 minut w temperaturze pokojowej przy mieszaniu mechanicznym (1300 obr./min. na mieszadle Eppendorf), dodać 500 μl MGP zawieszonych w izopropanolu (stężenie 6 mg/ml), zawirować, i inkubować 20 minut w temperaturze pokojowej na mieszadle rolkowym, rozdzielanie magnetyczne przy użyciu separatora magnetycznego Dynal (2 minuty);
usunąć przez odessanie frakcję niezwiązaną, i dodać 700 μl buforu do przemywania, zawirować, oddzielić, odessać;
powtórzyć procedurę przemywania 4 razy, dodać 100 ml DEPC-wody, zamknąć kubki, zawirować, i eluować 15 minut w temperaturze 80°C na urządzeniu Eppendorf Thermomixer przy 1300 obr./min., oddzielić perełki od wodnego supernatantu (= eluatu) przy użyciu separatora magnetycznego Dynal (2 minuty), zamrozić eluat aż do dalszego użycia.
amplifikacja całkowita objętość reakcji = 100 μl dla wszystkich oznaczeń HBV: objętość eluatu dla PCR = 20 μl
Woda (czystość do PCR) roztwór podstawowy stężenie końcowe w PCR^l 4 μl
Mieszanka reagentów DNA 2-x 1-Χ/50 μl
MgCl2 25 mM 3,0 mM/12 μ
Starter SEKW. ID. NR 7 5 μM 0,2 μM/4 μl
Starter SEKW. ID. NR 8 5 μM 0,4 μM/8 μl
UNG 1 U^l 2 U/2 μl
HCV: objętość eluatu dla PCR = 40 μl
roztwór podstawowy stężenie końcowe w PCR^l
Woda (czystość do PCR) 18 μl
Bufor Bicine RT 5x 5-x 1-x/20 μ
MnOAc 25 mM 2,5 mM/10 μ
Mieszanka dNTP (dUTP/ 30 mM 0,6 mM
DATP/dCTP/dGTP) 10 mM 0,2 mM/2 μl
Starter SEKW. ID. NR 5 10 μM 300 nM/3 μl
Starter SEKW. ID. NR 6 10 μM 300 nM/3 μl
UNG 1 U^l 2 U/2 μ
Polimeraza Tth 5,5 U/μ 10 U/2 μl
HIV: objętość eluatu dla PCR = 40 μl
roztwór podstawowy stężenie końcowe w PCR^l
PL 202 358 B1
Woda (czystość do PCR) 20 gl
Bufor Bicine RT 5x 5-x 1-x/20 gl
MnOAc 25 mM 1,25 mM/5 gl
Mieszanka dNTP
(dUTP/dATP/dCTP/dGTP) 10 mM 0,2 mM/2 gl
Starter SEKW. ID. NR 3 5 gM 0,2 gM/4 gl
Starter SEKW. ID. NR 4 5 gM 0,2 gM/4 gl
UNG 1 U/gl 2 U/2 gl
Polimeraza Tth 5,5 U/gl 15 U/3 g
Po PCR blokuje się UNG przez dodanie laurylosarkozyny w stężeniu 1% poziomu
Profile termocykliczne są następujące:
HBV: etap UNG 1x 10 minut 37°C
PCR 35x 30 s 92° C
30 s 55°C
40 s 72° C
HCV: etap UNG 1x 10 minut 37°C
etap odwrotnej
transkryptazy 1x 30 minut 60°C
denaturacja 1 minut 95°C
PCR 2x 10 s 95°C
20 s 60°C
33x 15 s 90°C
20 s 60°C
dalsza inkubacja 7 minut 72 ° C
HIV: etap UNG 1x 10 minut 37°C
etap odwrotnej
transkryptazy 1x 30 minut 60°C
PCR 4x 10 s 95°C
10 s 55°C
10 s 72° C
31x 10 s 95°C
10 s 60°C
10 s 72° C
detekcja na zmodyfikowanym Elecsys 1010® odczynnik objętość (HBV, HCV, HIV) czas inkubacji (HBV, HCV, HIV) produkt PCR 10 μl
roztwór do denaturacji 35 gl 5 minut
sonda detekcyjna 120 gl 30 minut
perełki SA 35 gl 10 minut
7.2 Homogeniczne oznaczenia funkcjonalne: technologia Cobas Taqman© oznaczenia 5'-nukleazy
7.2.1 Rozważania ogólne
Lizę cząstek wirusowych jak również adsorpcję, oczyszczanie i eluowanie kwasów nukleinowych ekstrahowanych z próbki prowadzi się jak opisano wyżej (patrz Przykład 7.1.2). I znów, amplifikacja cząsteczek docelowych jest opisana równaniem Ni = N0 x (1+E)n, gdzie
N0 = liczba cząsteczek na początku reakcji łańcuchowej polimerazy
Ni = liczba cząsteczek na końcu reakcji łańcuchowej polimerazy
E = efektywność amplifikacji = 0 < E < 1 n = liczba cykli reakcji =. w tym przypadku typowo 40 < n < 60.
Jednak przy stosowaniu technologii 5'-nukleazy reakcje odpowiednio amplifikacji i detekcji, splatają się ściśle ze sobą i zachodzą w fazie roztworu, tj. bez unieruchomienia na fazie stałej i odpowiednich etapów przemywania (= PCR homogenna). W tym celu, do mieszaniny reagentów do PCR dodaje się sondy detekcyjne z 2 szczególnymi modyfikacjami chemicznymi. Jedną z tych modyfikacji stanowi fluorogenna grupa reporterowa (R, na przykład pochodna 6-karboksy-fluoresceiny) kowalencyjnie przyłączona do szkieletu sondy, a drugą stanowi barwnik (na przykład pochodna polimetynocyjaniny) zdolny do pochłaniania światła fluorescencyjnego reportera i do wygaszania go (wygaszacz).
PL 202 358 B1
Wygaszacz jest typowo przyłączony do szkieletu sondy na 5'-końcu, podczas gdy reporter znajduje się w obrębie sekwencji oligomerycznej, oddzielonej od wygaszacza przez pewną liczbę nukleotydowych bloków budulcowych. Te sondy wiążą się do docelowego kwasu nukleinowego (nici sensownej lub antysensownej) blisko 3'-końca startera (do tyłu lub do przodu). Kiedy starter przyłączy się do kwasu docelowego i polimeraza DNA wiąże się do hybrydy starter: kwas docelowy, rozpoczyna się elongacja.
Wskutek aktywności 5'-nukleazowej enzymu, równocześnie z syntezą nici kopii sonda zostaje odcięta, gdy tylko polimeraza osiągnie miejsce wiązania sondy, reporter i wygaszacz oddzielają się i sygnał fluorescencyjny staje się mierzalny. Ten proces powtarza się z każdym cyklem, i coraz więcej fluorescencyjnego reportera gromadzi się w roztworze aż do wyczerpania odczynnika na końcu reakcji. Zatem na wykresie sygnału w czasie tworzą się esowate krzywe wzrostu. Im większa N0, tym wcześniej krzywa sygnału podnosi się ponad poziom szumu.
Punkt na osi czasowej, gdy sygnał fluorescencyjny może być znacząco odróżniony od sygnału tła, nazywa się cyklem progowym (ct). ct jest to miara czułości oznaczenia: im mniejsza wartość ct, tym bardziej czułe jest oznaczenie. Wartości ct można obliczać przy pomocy różnych działań matematycznych, na przykład w sposobie z odcięciem (średnia intensywność sygnału tła pomnożona przez stały współczynnik daje odcięcie intensywności sygnału dla rozróżnienia wartości ujemnych od dodatnich) lub w sposobie, gdzie oblicza się położenie maksimum pierwszego zróżnicowania krzywej sygnału względem czasu (tj. profil stromości) lub położenie maksimum drugiego zróżnicowania na osi czasu, i definiuje jako ct.
Ta technologia amplifikacji/detekcji umożliwia kontrolowanie PCR w czasie rzeczywistym, jak również obróbkę w zamkniętej probówce, tj. w odróżnieniu od standardowych procedur, probówka PCR pozostaje zamknięta po pipetowaniu eluatu i mieszaniny reagentów, co skutecznie zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia.
Ponadto, jeżeli stosuje się zestawy starterów i sond dla różnych gatunków wirusów (a więc różnych cząsteczek analitów i sekwencji docelowych) połączone w jednej mieszaninie reagentów, to można równocześnie przeprowadzić wiele reakcji amplifikacji/detekcji, zależnie od obciążenia wirusami kontrolowanego osobnika. Jest to podstawa tak zwanych oznaczeń multipleksowych.
Co więcej, dzięki rodzajowej naturze przygotowania próbek w oparciu o MGP, wszystkie kwasy nukleinowe obecne w próbce ekstrahuje się metodą adsorpcji fizykochemicznej do powierzchni cząstki, niezależnie od charakterystyki sekwencji. Obejmie to także ludzki DNA (hDNA), uwolniony z rozerwanych krwinek, np. leukocytów, którego miano może różnić się w szerokim zakresie zależnie od stanu fizjologicznego lub patologicznego poszczególnego dawcy próbki krwi. Na przykład, w przypadku chorób autoimmunologicznych, takich jak SLE, poziomy hDNA mogą być zasadniczo podwyższone. Zatem, hDNA i jeden lub więcej patogennych kwasów nukleinowych obecnych w danej próbce stanowią mieszaninę rozmaitych kwasów nukleinowych o różnych swoistościach sekwencji, które są ekstrahowane razem. Stanowią one matrycę polinukleotydów, które ekstrahuje się bez rozróżniania, po czym następuje amplifikacja specyficzna wobec sekwencji i detekcja docelowych kwasów nukleinowych przez oddziaływanie ze specyficznymi starterami i sondami we właściwych warunkach reakcji.
Załóżmy patologiczny poziom 4000 ng/ml hDNA w osoczu w przypadku SLE, oraz niskie zawirusowanie równe 50 kopii wirusowego RNA genomowego na mililitr osocza, oraz 10000 nukleotydów na genomowy RNA. Przy około 325 daltonów (1 dalton = 1,66 x 10-24 g) na nukleotyd, 50 kopii lub 500000 nukleotydów docelowego RNA stanowi około 2,7 x 10-7 ng na ml osocza, co daje stosunek zawartości docelowego:niedocelowego kwasu nukleinowego równy w przybliżeniu 1:10+12. Co więcej, w celu kontrolowania całego procesu, do próbek można dodać konstrukt sztucznego kwasu nukleinowego, korzystnie spakowany w zmodyfikowanej cząstce wirusowej, który razem ekstrahuje się i razem amplifikuje z naturalnym celem. Tę kontrolę wewnętrzną (IC) cechuje unikalny rejon wiązania sondy dla sondy detekcyjnej IC, która różni się od sond specyficznych dla celu inną grupą reporterową mającą odróżnialną charakterystykę emisji. Tak więc, sygnał IC można odróżnić od sygnału celu, i póki wiadomo, że IC jest obecny w próbce, to działa jako środek kontrolujący. Zatem, multi-znakowanie rozszerza przydatność technologii oznaczeń multipleksowych. Kontrola wewnętrzna (IC) jest opisana w WO 98/00547.
PL 202 358 B1
7.2.2 Protokół a doświadczalny
7.2.2.1 Odczynniki 7.2.2.1.1 Przygotowanie próbki
Patrz wyżej (Przykład 7.1.2 => procedura automatyczna na ekstraktorze własnej konstrukcji)
7.2.2.1.2 Oznaczenie 5'-nukleazowe, reagenty i warunki reakcji
Odczynnik Stężenie roztworu Stężenie końcowe Dodano ^l/reakcję)
podstawowego w teście
Mn(OAc)2 pH 6,5 50 mM 3 mM 5,75
dNTPs (dG, dA, dC) 100 mM 300 μΜ 2,50
(dT) 50 μΜ
(dU) 500 μΜ
DEPC-H2O - 9,50
Gliceryna 80% razem 5,64% tu dodano 2,8% * 3,50
KOAc pH 7,5 2 M 100 mM 5,00
Tricine pH 8,3 1 M 50 mM 5,00
DMSO 80% 5,0% 6,25
Starter SEKW. ID. NR 12 50 μM 150 nM 0,30
Starter SEKW. ID. NR 13 50 μM 150 nM 0,30
Starter SEKW. ID. NR 14 50 μM 400 nM 0,80
Starter SEKW. ID. NR 15 50 μM 150 nM 0,30
Starter SEKW. ID. NR 16 50 μM 400 nM 0,80
Starter SEKW. ID. NR 17 50 μM 150 nM 0,30
Starter SEKW. ID. NR 18 50 μM 150 nM 0,30
Sonda SEKW. ID. NR 19 50 μM 100 nM 0,20
Sonda SEKW. ID. NR 20 50 μM 100 nM 0,20
Sonda SEKW. ID. NR 21 50 μM 100 nM 0,20
Sonda SEKW. ID. NR 22 50 μM 100 nM 0,20
UNG 2,4 U/μ! 10 U 4,20
ZO5 10 U/μί 40 U 4,00
Aptamer SEKW. ID. NR 23 50,4 μΜ 200 nM 0,40
* Resztę gliceryny dodaje się z enzymami ZO5 (muteiną polimerazy DNA Tth) i UNG (N-gliko-
zydazą uracylową).
Wspólny multipleksowy profil termocykliczny wszystkich parametrów testu jest następujący
Etap UNG 45°C - 10 minut
denaturacja 94°C - 30 s
odwrotna transkrypcja 58°C - 30 minut
PCR 95°C - 20 s/59°C - 50 s 5x 91°C - 15 s/52°C - 50 s 55x
7.2.2.1.3 Sekwencje Starter: HIV do przodu: SEKW. ID. NR 12
HIV do przodu: SEKW. ID. NR 13
HIV do tyłu: SEKW. ID. NR 14
HCV do przodu: SEKW. ID. NR 15
HCV do tyłu: SEKW. ID. NR 16
HBV do przodu: SEKW. ID. NR 17
HBV do tyłu: Sondy: SEKW. ID. NR 18
HIV: SEKW. ID. NR 19
HCV: SEKW. ID. NR 20
HBV: SEKW. ID. NR 21
IC: SEKW. ID. NR 22
Aptamer: SEKW. ID. NR 23
PL 202 358 B1
Temperatura topnienia kompIeksu poIimeraza DNA-aptamer = 51,7°C (= 50% dysocjacji)
Terminologia derywatyzacji chemicznych:
Niektóre z oIigonukIeotydów są derywatyzowane grupą Cy5, która oznacza grupę pentametyno-di-indokarbocyjaninową sprzężoną z łącznikiem aIkiIofosfatydyIowym (Pharmacia Biotech Cy5-N-etylo-fosoramidyt), i która działa jako wygaszacz (Q); λΕΧ = 630 nm, λΕΜ = 665 nm. Niektóre z oligonukIeotydów są derywatyzowane przy użyciu FAM, który oznacza 6-karboksy-fIuoresceinę sprzężoną z łącznikiem 2-(amino-cykloheksylo)propano-1,3-diolowym (Biogenex CX-FAM-fosforoamidyt) i który działa jako reporter dla celów (R); λΕΧ = 485 nm, λΕΜ = 515 nm. Niektóre z oligonukleotydów są derywatyzowane heksachloro-6-karboksy-fluoresceiną sprzężoną z łącznikiem 2-(amino-cykloheksylo)propano-1,3-diolowym (Biogenex CX-HEX-fosforoamidyt), który działa jako reporter do kontroli wewnętrznej (R); λΕΧ = 530 nm, λΕΜ = 585 nm.
7.2.2.1.4 Warunki reakcji
Warunki reakcji są opisane w wynikach doświadczeń (patrz Przykład 7.3).
7.2.2.1.5 Inne materiały
- osocze nie zawierające wirusów (matryca 0, osocze pojedyncze lub osocze zbierane), np. osocze z cytrynianem lub osocze z EDTA
- osocze zawierające wirusy lub supernatanty hodowli zawierających wirusy, które mogą być stosowane do dobierania miana pewnych wirusów przez mieszanie z matrycą 0 w odpowiednich stosunkach
- alternatywnie: transkrypty in vitro z badanymi sekwencjami docelowymi
- ludzki DNA łożyskowy (a. genomowy, Sigma, nr kat. D4642; b. fragmentowany, Sigma, nr kat. D3287), dodano do próbek w celu symulowania stanów patologicznych, które prowadzą do wzmożonego uwalniania substancji wewnątrzkomórkowych, a więc do zwiększonych poziomów DNA/RNA we krwi, np. choroby autoimmunologicznej jak SLE lub hemoliza.
7.3 Wyniki testów funkcjonalnych
7.3.1. Doświadczenie 1
Różne próbki MGP typu EJ/CERAC bada się sposobami opisanymi w 7.1. Zmienną badaną było ciśnienie rozpylania:
EJ0100.5R - 1,5 x 105 Pa
EJ0106.5R - 25 x 105 Pa
EJ0107.5R - 35 x 105 Pa
EJ0108.5R - 43 x 105 Pa
Można wykazać, że przy rosnącym ciśnieniu rozpylania, tj. przesunięciu w stronę mniejszej średniej średnicy perełki, wiązanie niespecyficzne (USB) maleje, podczas gdy wytwarzanie wysoce specyficznego sygnału pozostaje niezmienione, co daje podwyższony stosunek sygnału do szumów.
Dopasowanie miana wirusów 0,5xGG wynosi w przybliżeniu 100 sgu/ml (sgu = signal generating units, jednostki tworzenia sygnału) w przypadku HBV, i w przybliżeniu 150 sgu/ml w przypadku HIV. Dane zestawiono w Tabeli 7.
7.3.2 Doświadczenie 2:
Po dwa warianty typów, odpowiednio, EJ/MMB i EJ/CERAC, porównuje się funkcjonalnie, stosując sposób, jak opisano w Przykładzie 7.2 w połączeniu z mieszanymi (MP) i pojedynczymi (PL) próbkami osocza. EJ0047.2R (MMB) i EJ0100.5R (CERAC) rozpyla się w normalnych warunkach, tj. 15 x 105 Pa, temperatury wlotowej 230°C i temperatury wylotowej w przybliżeniu 110°C. EJ0102.2R (MMB) i EJ0108.5R (CERAC) są to opracowywane warianty w odniesieniu do warunków rozpylania (temperatura wlotowa zmniejszona do 200°C [MMB], oraz ciśnienie rozpylania zwiększone do 43 x 105 Pa [CERAC]). Wyniki są zestawione w Tabeli 8 i pokazują możliwości cząstek z nanordzeniem CERAC w podwyższeniu czułości, czego przykład stanowi wcześniejszy cykl progowy i/lub większe różnice sygnałów (sygnał nasycenia minus poziom szumu, S-N).
7.3.3 Doświadczenie 3:
Kilka preparatów MGP typu EJ/MMB i EJ/CERAC (patrz Tabela 9) porównuje się funkcjonalnie, stosując sposób jak opisano w Przykładzie 7.2. Wyniki są zestawione w Tabeli 10 i pokazują możliwości cząstek typu EJ0096.5R-01 dawania wyższej czułości, czego przykład stanowi wcześniejszy cykl progowy lub wyższa częstość trafień niezależnie od poszczególnego oznaczenia.
PL 202 358 B1
7.3.4 Doświadczenie 4:
Kilka preparatów MGP typu EJ/MMB i EJ/CERAC porównuje się funkcjonalnie, stosując sposób jak opisano w Przykładzie 7.1, w którym prowadzi się inkubację adsorpcyjną z wytrząsaniem lub bez. W ten sposób szybkość sedymentacji staje się decydująca, tj. im wyższa szybkość sedymentacji, tym wyższa liczba cząstek, które są usuwane z interakcji z analitem w powstającym osadzie. Natomiast, jeżeli szybkość sedymentacji jest mniejsza, to dłuższy jest przedział czasu, w którym cząsteczki analitu z cieczy mogą adsorbować do powierzchni adsorbentu.
Wyniki zestawione w Tabeli 11 (jako odnośnik stosowano EJ0047.2R) wykazują, że bez mechanicznego mieszania utrata sprawności jest najwyższa (> 40%) dla typu MMB (który różni się znacznie od cech według wynalazku), a najmniejsza, lub praktycznie nieobecna, dla typu CERAC (najbliższego do cech według wynalazku w tym szeregu).
Żeby umożliwić dokładną ocenę funkcjonalności różnych typów MGP, dla każdego typu obliczono wskaźnik sprawności w następujący sposób:
> eluaty z kilku partii, odpowiednio, dla każdego typu MGP i dla każdego poziomu miana, spulowano w 1 pulę eluatu > z każdej puli eluatu przeprowadzono 3 amplifikacje dla każdego oznaczenia (HIV, HCV, HBV) > każdy amplifikat zmierzono jednokrotnie na zmodyfikowanym Elecsys 1010® > sygnały uśredniono się dla każdego typu MGP, oznaczenia, i poziomu miana > współczynniki sygnału do szumu (S/N) obliczono, odpowiednio, dla każdego typu MGP i oznaczenia, tj. niskiego miana (słabo dodatniego) powyżej matrycy 0 (ujemnej), oraz podwyższonego miana powyżej matrycy 0 > współczynniki S/N normalizowano do odnośnika typu MGP w czasie > obliczanie sumy znormalizowanych współczynników S/N dla każdego typu MGP, skumulowane dla wszystkich oznaczeń i poziomów miana; współczynniki S/N dla niskiego zakresu miana mają dwukrotną wagę w odniesieniu do współczynników dla wysokiego poziomu miana dla zaakcentowania aspektów czułości > otrzymaną sumę przypisuje się wskaźnikowi sprawności dla każdego typu badanych MGP
7.3.5 Doświadczenie 5:
Różne typy MGP stosowano do ekstrakcji transkryptów HCV in vitro, które rozcieńczono do rozmaitych poziomów miana w rozcieńczalniku zawierającym 10 mmol/l Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, 20 μg/ml poly-A-RNA i 0,05% NaN3, i domieszano do spulowanego osocza.
Ludzki DNA tła (hBG-DNA) domieszano do próbki w ilości odpowiednio 0 lub 4000 ng/ml. Niespodziewanie, można zmniejszyć zakłócenie przez hBG-DNA metodą selekcji perełek, jak wykazują dane przedstawione w Tabeli 12.
7.3.6 Doświadczenie 6:
Do obróbki HCV-dodatnich próbek osocza zastosowano rozmaite typy MGP. Ludzki DNA tła (hBG-DNA) domieszano do próbki w ilości odpowiednio 0 lub 4000 ng/ml. Ponownie, obserwuje się znaczący wpływ wielkości i geometrii perełek. Preparat MGP EJ0096.5R, który najlepiej reprezentuje jakość MGP według niniejszego wynalazku, pokazuje bardzo wyraźne zalety, zarówno w kategorii minimalnego przesunięcia wartości ct, jak i zmniejszania straty wytwarzania specyficznego sygnału (S-N), jak wykazują dane przedstawione w Tabeli 13.
T a b e l a 1
Firma Skrót Opis Kod (patrz Przykład 1.4)
1 2 3 4
--- --- Bez pigmentu 0
Merck Darmstadt, Niemcy BM Merck Black Mica: Małe płytki miki (podłoże), średnica = 10- 60 pm, grubość w przybliżeniu 1-2 pm, przyłączone są kawałki Fe3O4 i ziarna TiO2; typowo, zagregowanych jest kilka jednostek pigmentu (Merck Iriodin®) 1
PL 202 358 B1 cd. tabeli 1
1 2 3 4
Merck Darmstadt, Niemcy MMB Merck Microna Matte Black Małe płytki miki (podłoże), średnica = 3-15 pm, grubość w przybliżeniu 1-2 pm, przyłączone są kawałki Fe3O4; typowo, zagregowanych jest kilka jednostek pigmentu 2
BASF Ludwigshafen, Niemcy BASF-FA BASF tlenek żelaza FA28-41; Igły w zakresie nanometrów wytworzone z Y-Fe2O3, długość w przybliżeniu 200-400 nm, bardzo wysoka tendencja do agregowania do cząstek w skali mikronowej ze względu na postać i dużą wysoce strukturalną powierzchnię 4
Cerac, Milwaukee, WI, USA CERAC CERAC Y-Fe2O3 (nr kat. I-2012, rozprowadzany przez Chemco Chemieprodukte GmbH w Niemczech) Y-Fe2O3-mikroperełki w nanoskali (czysty tlenek żelazowy), średnica = 23 nm, nie skupiające się 5
Strem Chemicals, Newburyport, MA, USA STREM STREM Fe3O4 >95% (nr kat.: 93-2616) Mikroperełki w zakresie nanoskali wytworzone ze strącanego Fe3O4, średnica = 200-500 nm, mocna tendencja do agregowania do cząstek w zakresie mikronowym 7
BASF, Ludwigshafen, Niemcy BASF-CE Perełki w skali mikronowej wytworzonej z metalicznego żelaza - BASF Proszek karbonylożelaza HQ: 10% < 1,04 pm, 50% < 1,91 pm, 90% < 3,71 μιτι - BASF Proszek karbonylożelaza SU: 10% < 0,43 pm, 50% < 0,93 pm, 90% < 1,81 pm 8 9
PL 202 358 B1
Tabela
—-a-. u o -T«T-
a i £ Q £ ξ u o
a jg a O o 2 3 o o o o o o o o o o
CM E o o ω <υ 1 o o o o o o o o o o
1 4> rn CO « 3 a jo cM cJ CM OJ CM CM CM CM CM CM
O H * § o £ ϊ
£X a.
£ z—%
o es U
o 'rt<' 3 S 0 •rt
-Ci O o s o o Λ o O O o O O o
o o j Jw> U, o o O o o o o O o o
& 5 o t— & <? ro F 3- '£ 3 £ -> O *ł “8 > a co co CM CM CJ CM CJ CM CM CM
s <: e
a PŁj i 3 α
g O u MO MO Ci o ΐ wo MO O O o O o O o O
£* c- £ CM t> l> MO '40 MO a> 1—( MO MO MO
'O O 5 Z O so Γ- r- r- 'O l- Γ- c-
£
£ KJ a σ «3 o
g s 'rt· H rt'
1 -b .K < o O i s o o o o o o o o O o
MO MO fc- H o o MO o o o o o o o
et “O r-ł CM i g CM CM CM CM CM ΓΜ CM CM CM CM
E CŁ. a E S
V « o
H Cu f- CM
es «
o & 1 £ o X™\ y O O s t § £ -^-s u o O O O O O O O O O
g -3 CO δ ¢5 co MO co MO MO MO MO CO
O a 1O[ CM cj B c3 o id- CM —, CM rt CM CM CM
£ή £ s- s
a m >1 σ 3 13 Lc iS 13 a
< < & <c α =3 < Q ¢3 s 53 Q :3 < < <
Q c a a a a a
Oł .2
g •a X» G rozpylan: A« 'rt' o ł-M X Ά o X MO Ciśnieni rozpylam la Tb «—4 X MO V> 2 X MO o X wo 1—ł *o <D 2 X! c V) o 4 X O ł—i o o X MO o X wo •o o X W)
Έ WJ z—r
4 o 3 O rtf o o o rt o
E i 2 U CO σ> co CO CO Os CO·
5 £ ρ d. /g> Jł> CM CM CM CM CM·
a _4J 4 .33
G § £ e ' S3 3 Q s? 'rt' O O O O o O O O o O
1 i§ Ej O O X-S □0 o w O wo o MO Έ X Λ s 2 2 & o MO o v> Γ- ΟΟ «—t 1—3 Tf- >—1 i—l TT 2 'T
< E H < S
'W
, „t
J £ a O jH a a a a a a a a a a
2 2 c o o o 2 o o o o 2 9
<c w ω < UJ a ω UJ a a a w a a
S Λ E
Woda (ml/100 W3 O M f- co CO CO co Oy co τ: c & O o Ξ g O p co co^ co CO ΓΟΛ ro P '< CO 1—^ 2 X X rt
S cz) O O MO r- o MO r- 5 «3 O 2 o o rt O MO CM O O CO T“—4 O wo o MO o i— 3 CM o CM o oo o Tt OO o o co
Ό MO O\ MO r- O Γ- 00 σ- O rtl CM
O o o c OT Tt O\ O> C\ as O o O
&d g o o jz O o O O g o o O o o o o o o o o
PL 202 358 B1
............ ........... to 0 2 j§ 8 δ « 8 200 200 o d o o d 200 200 200 200 200 200 O o d
B 3 i * <U 1 o
u
5 a ,~*x'
2 O O o o O O O O O O o
(0 -O o o o o o o o o o o
1 Έ S d d d d d d d d d ts d
s -o ‘5
r * &
i U
2 — O o o o o o o O o o o
i* o ϋ V) V) V) »n υ-Ί W> ν-, tn W) m Ά
d d d d d d d d d d d
» σ
4 -1
o O o O O O O o o O O
fc & o. .a o o O O o o O o o O O
d d d d d d d d d d d
e £ o o
r c.
rf
X ί § c O o o o o O o o o o o
g 2 ł«ł m en m <—< ’/Ί en o o
s rf U d d d d d d d d d d
t- £
3
a < < « < < < O -3 < < < <
c i m
enie lania X < X •fe Vi O V-1 s “o c Ύ *A O •rt O v> O łfj O vs o
.a Ę· X X X X X X X X X X X
m Ά to Ά »n Al \o >n Ό en Ό
υ s d ΠΊ Tf T—1 1 r—ł
S 60
q o o O o O O
i m m en m m
ίΓ Sil P-ι -—χ δ d d d d d
4 O
b ·=
# I Q * £ o O O O o
.,_<
— E Jq o Λ o
Υ rf rf Ί en rf
== Ξ H < B H
'—^
tK s δ 33 K
s 2 o 2 2 o
r-J <3 ω ω ω ω ώ
a
O § Zł 0 Y Y Υ Y
$ 5
03 =f O 840 00 00 00 o en
U3 o d d 09
f-> 00 d
d 09 O\ τ-^ σ\ Ί 09 o —i
r O O O o T-* 1—1 d d d m en
»—1 i—i
O O O o o O o O o O O
PL 202 358 B1
T a b e l a 3
Próbka Temperatura wylotowa (°C) Gęstość (g/cm3) Absorbancja (280 nm) Absorbancja (400 nm) Rozpuszczalność żelaza (mg/l) Siła magnetyczna (g/250 mg)
RN0005.2E-01 116 3,420 0,037 0,027 < limit oznaczenia 16,04
RN0009.1E-01 119 3,155 0,106 0,093 < limit oznaczenia 9,50
EJ00028.2R-01 118 3,602 0,019 0,024 < limit oznaczenia 12,25
RN0045.4R-01 130 3,647 0,032 0,034 < limit oznaczenia 9,23
RN0046.7R-01 98 3,866 0,013 0,013 < limit oznaczenia 13,12
RN0045.5R-01 120 3,802 0,019 0,017 0,047 9,52
EJ0047.2R-01 118 3,659 0,022 0,018 < limit oznaczenia 12,00
EJ0096.5R-01 96 4,203 0,001 0,000 < limit oznaczenia 13,53
EJ0096.7R-01 96 4,328 0,000 0,001 < limit oznaczenia 18,36
EJ0097.4R-01 96 3,859 0,001 0,000 < limit oznaczenia 15,17
EJ0098.8R-01 95 5,588 0,065 0,055 < limit oznaczenia 15,76
EJ0099.9R-01 95 5,538 0,103 0,101 0,016 14,13
EJ0100.7R-01 122 4,196 0,027 0,003 < limit oznaczenia 16,29
EJ0100.5R-01 126 4,069 0,012 0,012 < limit oznaczenia 12,42
EJ0101.4R-01 119 4,079 0,083 0,084 0,015 11,67
EJ0102.2R-01 128 3,668 0,009 0,009 < limit oznaczenia 13,36
EJ0047.2R-07 118 3,612 0,024 0,022 0,159 11,26
EJ0100.5R-02 127 4,107 0,029 0,023 0,054 14,51
EJ0100.5R-03 127 4,173 0,063 0,045 0,126 10,44
EJ0106.5R-01 127 4,191 0,004 0,004 0,025 10,09
EJ0107.5R-01 127 4,235 0,016 0,009 0,037 10,25
EJ0108.5R-01 127 4,233 0,026 0,026 0,039 11,56
EJ0109.2R-01 110 3,700 0,046 0,043 0,028 11,23
EJ0111.5R-01 117 3,612 0,071 0,036 0,166 16,48
EJ0111.5R-02 121 4,082 0,065 0,040 0,161 15,95
EJ0124.5R-01 3,992 0,001 0,001 0,051 17,57
EJ0128.5R-01 125 4,078 0,023 0,028 8,97
EJ0129.5R-01 92 4,013 0,044 0,043 9,64
EJ0130.5R-01 87 4,022 0,031 0,036 11,70
EJ0131.5R-01 89 3,908 0,033 0,037 11,73
EP0119.5R-01 127 4,110 0,003 0,003 0,079 17,15
T a b e l a 4
Partia Powierzchnia BET [m2/g] Uwagi
1 2 3
EJ0096.5R-01 26,85 Cerac, mała suszarka rozpyłowa, 6 x 105 Pa
EJ0100.5R-01 8,95 Cerac, duża suszarka rozpyłowa, 15 x 105 Pa
PL 202 358 B1 cd. tabeli 4
1 2 3
EJ0101.4R-01 8,47 BASF FA, duża suszarka rozpyłowa, 15 x 105 Pa
RN0005,2E-01 3,54 MERCK MMB, duża suszarka rozpyłowa, 15 x 105 Pa
RN0009, 1E-01 3,25 MERCK BM, duża suszarka rozpyłowa, 15 x 105 Pa
EJ0099.9R 0,74 BASF CE-SU, duża suszarka rozpyłowa, 6 x 105 Pa
EJ0100.7R 8,53 STREM, duża suszarka rozpyłowa, 15 x 105 Pa
T a b e l a 5
Typ MGP Wielkość wydzielonych rdzeni Skład Postać t1/2 sedymentacji [min] t1/2 rozdzielania [s]
MMB 3-15 μιτι Zagregowane Płytki 3,9 14
CERAC 23 nm Pojedyncze Perełki >> 10 16
STREM 300-500 nm Zagregowane Perełki 4,8 10
BASF-FA 200-300 nm Zagregowane igły 4,6 12
T a b e l a 6
Próbka MGP t0,9 (wartość 90%) sedymentacji [min] t1/2 (wartość 50%) sedymentacji [min]
EJ0100.5R-01 0,35 2,78
EJ0108.5R-01 0,62 7,58
EJ0096.5R-01 1,39 19,85
T a b e l a 7
MGP USB [zliczenia] - matryca 0 SB [zliczenia] - 0,5 x GG
HIV HBV HIV HBV
EJ0100.5R-01 4997 2277 20380 80292
EJ0100.5R-02 6100 3590 22036 53417
EJ0100.5R-03 4856 2270 19791 65109
EJ0106.5R-01 4427 2263 19030 75128
EJ0107.5R-01 3940 2261 19255 68285
EJ0108.5R-01 3429 2217 20048 80426
T a b e l a 8
Próbka Numer partii MGP HBV HCV
ct S-N ct S-N
1 2 3 4 5 6
MP2 EJ0047.2 40,49 19,88 41,68 12,6
MP2 EJ100.5 40,96 21,80 43,08 12,74
MP2 EJ0102.2 41,93 21,39 44,74 10,10
MP2 EJ0108.5 40,09 22,01 47,36 10,61
Pl. */2 EJ0047.2 41,03 18,14 - -
Pl. / EJ100.5 40,12 19,31 - -
Pl. / EJ0102.2 41,81 22,80 44,69 14,30
Pl. / EJ0108.5 39,93 21,77 43,27 12,58
PL 202 358 B1 cd. tabeli 8
1 2 3 4 5 6
Pl. 4/5 EJ0047.2 46,33 12,83 39,54 18,30
Pl. 4/5 EJ100.5 40,82 15,12 38,24 21,48
Pl. 4/5 EJ0102.2 42,49 19,65 39,24 19,05
Pl. 4/5 EJ0108.5 47,33 9,51 39,47 17,81
Pl. 6/8 EJ0047.2 41,08 20,83 49,44 9,46
Pl. 6/8 EJ100.5 40,68 23,16 48,98 10,31
Pl. 6/8 EJ0102.2 40,50 22,49 54,50 6,50
Pl. 6/8 EJ0108.5 38,79 18,60 50,41 8,61
Pl. 6/8 EJ0047.2 44,16 17,26 41,40 10,59
Pl. 6/8 EJ100.5 42,97 18,59 41,01 11,33
Pl. 6/8 EJ0102.2 44,49 12,41 42,18 11,32
Pl. 6/8 EJ0108.5 41,24 18,73 41,46 10,80
Statystyka zliczania: który typ punktacji jest lepszy?
„próbki normalne” „opracowywane warianty” razem: najlepszy typ na próbkę*oznaczenie
MMB:CERAC MMB:CERAC MMB:CERAC
ct S-N ct S-N ct S-N
2 : 7 0 : 9 3 : 7 5 : 5 1 : 9 3 : 7
(1 porównania nie można było ocenić)
T a b e l a 9
MGP Opis
EJ0096.5R Ciśnienie rozpylania 60 x 105 Pa, temperatura wlotowa 150°C, wyposażenie laboratoryjne ΒϋΗιί. Ten preparat bardzo dobrze przybliża charakterystykę wynalazku, patrz Figura 15.
EJ0111.5R Ciśnienie rozpylania 15 x 105 Pa, temperatura wlotowa 230°C, aparat laboratoryjny Nubilosa
EP0119.5R Ciśnienie rozpylania 15 x 105 Pa, temperatura wlotowa 230°C, aparat laboratoryjny Nubilosa, zmieniony skład szkła bez octanu cynku, zamiast metanolanu potasu octan potasu przy identycznej stechiometrii
EJ108.5R Ciśnienie rozpylania 43 x 105 Pa, temperatura wlotowa 230°C, aparat laboratoryjny Nubilosa
T a b e l a 10
Wartości ct (HBV)
Obliczanie ct przez maksimum pierwszej pochodnej
Miano Partia MGP Partia MGP Partia MGP Partia MGP
Parametr [sgu/ml] EJ0111.5R-02 EP0119.5R EJ0096.5R EJ0108.5R
średnia średnia średnia średnia
HBV NK - - - -
100 46,1 44,1 (6/6) 43,4 44,2
40 47,6 46,5 (7/8) 45,5 (7/8) 46,7 (6/7)
20 50,6 (6/8) 46,1 (6/8) 46,8 (7/8) 50,0 (4/8)
PL 202 358 B1 cd. tabeli 10
1 2 3 4 5 6
10 47,6 (5/8) 50,1 (5/8) 46,8 (4/8) 47,7 (3/7)
5 51,2 (3/8) 48,6 (4/8) 47,8 (5/8) 49,7 (4/7)
trafność 75% 74% 77,5% 67,5%
Obliczanie ct metodą z odcięciem
Miano Partia MGP Partia MGP Partia MGP Partia MGP
Parametr [sgu/ml] EJ0111.5R-02 EP0119.5R EJ0096.5R EJ0108.5R
średnia średnia średnia średnia
HBV NK - - - -
100 44,2 41,7 (6/6) 41,5 41,9
40 45,5 44,1 (7/8) 42,7 (6/8) 45,0 (6/7)
20 47,7 (6/8) 43,5 (6/8) 44,3 (7/8) 47,2 (6/8)
10 45,5 (5/8) 47,7 (5/8) 44,4 (6/8) 45,6 (3/8)
5 49,3 (3/8) 45,7 (4/8) 45,4 (4/8) 46,6 (4/7)
trafność 75% 74% 77,5% 71%
Wartości ct (HCV)
Obliczanie ct przez maksimum pierwszej pochodnej
Miano Partia MGP Partia MGP Partia MGP Partia MGP
Parametr [lU/ml] EJ0111.5R-02 EP0119.5R EJ0096.5R EJ0108.5R
średnia średnia średnia średnia
HCV NK - - - -
400 42,7 42,5 (7/8) 41,8 42,6 (7/7)
80 44,4 (7/8) 44,1 (6/6) 44,2 (7/8) 44,2 (7/7)
60 45,1 44,7 (7/7) 44,4 (6/7) 45,1 (6/6)
40 46,2 (7/8) 45,8 (7/7) 43,9 (5/7) 44,5 (7/7)
20 46,5 (5/8) 46,3 (7/7) 45,0 (6/8) 47,4 (4/8)
trafność 90% 97% 84% 88,5%
Obliczanie ct metodą z odcięciem
Miano Partia MGP Partia MGP Partia MGP Partia MGP
Parametr [lU/ml] EJ0111.5R-02 EP0119.5R EJ0096.5R EJ0108.5R
średnia średnia średnia średnia
HCV NK - - - -
400 41,8 41,6 (7/8) 40,9 41,7 (7/7)
80 44,6 (7/7) 44,0 (6/6) 43,4 (7/8) 44,5 (7/7)
60 44,7 45,3 (7/7) 45,1 (6/7) 44,3 (5/6)
40 47,9 (7/8) 46,1 (7/7) 44,7 (4,7) 47,5 (7/7)
20 49,6 (5/8) 47,2 (7/7) 45,3 (5/8) 47,4 (4/8)
trafność 90% 97% 79% 86%
PL 202 358 B1 cd. tabeli 10
1 2 3 4 5 6
Wartości ct (HIV)
Obliczanie ct przez maksimum pierwsze pochodnej
Miano Partia MGP Partia MGP Partia MGP Partia MGP
Parametr [sgu/ml] EJ0111.5R EP0119.5R EJ0096.5R EJ0108.5R
średnia średnia średnia średnia
HIV NK - - - -
30 43,2 (6/8) 46,9 (3/8) 43,9 (3/7) 41,9 (1/7)
60 42,7 (4/7) 42,6 (4/7) 42,8 (7/7) 42,4 (2/7)
150 42,4 (5/7) 42,0 41,7 (6/6) 42,6 (6/8)
300 41,9 (5/5) 41,0 (5/5) 41,5 (6/6) 41,3 (6/6)
600 41,6 (7/7) 40,8 (6/6) 40,8 (5/5) 41,5
trafność 79% 76% 87% 64,0%
Obliczanie ct metodą odcięcia
Miano Partia MGP Partia MGP Partia MGP Partia MGP
Parametr [lU/ml] EJ0111.5R EP0119.5R EJ0096.5R EJ0108.5R
średnia średnia średnia średnia
HIV NK - - - -
30 44,3 (1/8) 47,3 (2/8) 46,8 (1/7) -(0/7)
60 50,3 (3/7) 54,1 (1/7) 51,4 (4/7) -(0/7)
150 47,4 (5/7) 43,7 (5/8) 45,5 (5/7) 52,2 (2/8)
300 42,2 (5/5) 44,8 (5/5) 41,6 (4/6) 46,5 (6/6)
600 41,2 (7/7) 41,3 (5/6) 41,1 (5/5) 42,5
trafność 62% 53% 59% 44%
T a b e l a 11
Typ MGP HIV1 HCV HBV Wskaźnik sprawności Stosunek wskaźników sprawności
60 sgu/neg 600 sgu/neg 480 sgu/neg 4800 sgu/neg 40 sgu/neg 400 sgu/neg Skumulowane/ ważone/ znormalizowane Bez wytrząsania/z wytrząsaniem
EJ0047.2R odnośnik 100 100 100 100 100 100 900 -
EJ0096.5R 55 34 44 74 146 112 709 -
EJ0096.7R 47 47 18 8 116 107 523 -
EJ0097.4R 32 54 29 47 169 132 692 -
RN0045.5R 85 64 76 63 7 84 545 -
RN0046.7R 109 80 43 40 121 135 803 -
RN0045.4R 48 93 112 128 136 96 908 -
PL 202 358 B1 cd. tabeli 11
1 2 3 4 5 6 7 8 9
EJ0047.2R odnośnik 24 24 52 49 93 122 534 0,59
EJ0096.5R 28 23 47 88 102 154 619 0,87
EJ0096.7R 34 23 38 14 99 70 449 0,86
EJ0097.4R 33 36 20 18 101 94 456 0,66
RN0045.5R 53 74 60 25 107 72 610 1,12
RN0046.7R 141 90 16 8 32 40 518 0,64
RN0045.4R 55 113 25 146 78 101 675 0,74
T a b e l a 12
Cząstki Miano HCV (IVT-RNA) AhDNA Act AS-N
RN0009.1E = duże płytki (3-60 pm) 1000 cp/PCR 4000 ng/ml +2 -6,1
EJ0100.5R = zdeformowane kule (zakres ok. 1-12 pm) 1 1 -1 -3,2
EJ0108.5R = zdeformowane kule* (zakres ok. 1-4 pm) ±0 -1,2
* wariant wysokociś nieniowy, patrz rozdziały, odpowiednio, 7.2.4.2 oraz 7.3.1.
Uwaga: (+ )Act = oznaczenie mniej czułe (tj. odchylenie w stronę wyników fałszywie ujemnych); (-)Δσΐ = oznaczenie bardziej czułe (odchylenie w stronę wyników fałszywie dodatnich?) (-)aS-N = mniej specyficzne wytwarzanie sygnału = zakłócenie ujemne
T a b e l a 13
Cząstki (wszędzie EJ/CERAC) Miano HCV (ekstrahowany RNA genomowy) AhDNA Act AS-N
EJ0096.5R = cel projektu* 200 lU/ml próbki 4000 ng/ml -0,95 -8,5
EJ0127.5R = wzorzec -3,08 -13,89
EJ0129.5R = wariant p -2,30 -12,62
EJ0130.5R = wariant p v V -2,62 -10,57
EJ0131.5R = wariant p -2,46 -12,41
* = zakres 0,5-5 pm; > 50% skali submikronowej; duże pole powierzchni (27 m2/g BET); doskonale sferyczne perełki wariant p = wysuszony rozpyłowo pod podwyższonym ciśnieniem (patrz rozdział 7.3.1).

Claims (54)

1. Sposób wytwarzania kompozycji magnetycznych cząstek szklanych, znamienny tym, że obejmuje etapy:
a) zawieszenia w zolu przedmiotów magnetycznych o średnicy w zakresie między 5 i 500 nm,
b) suszenia rozpyłowego zawiesiny w suszarce rozpyłowej z dwiema dyszami, i
c) spiekania proszku wysuszonego rozpyłowo.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że temperatura wlotowa suszarki rozpyłowej z dwiema dyszami jest w zakresie między 120°C i 500°C, temperaturę wylotową dobiera się do temperatury wrzenia zolu, a ciśnienie rozpylania wynosi co najmniej 3 x 105 Pa.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że temperatura wlotowa suszarki rozpyłowej z dwiema dyszami jest w zakresie między 170°C i 230°C, korzystnie między 190°C i 210°C.
4. Sposób według zastrz. 1-3, znamienny tym, że ciśnienie rozpylania jest w zakresie między 4 x 105 Pa i 6 x 105 Pa.
5. Sposób według zastrz. 1-4, znamienny tym, że zol zawiera etanol jako rozpuszczalnik.
PL 202 358 B1
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że temperatura wylotowa jest w zakresie między 50°C i 300°C.
7. Sposób według zastrz. 5-6, znamienny tym, że temperatura wylotowa jest w zakresie między 90°C i 100°C.
8. Sposób według zastrz. 1-7, znamienny tym, że temperatura spiekania jest w zakresie między 400°C i 1200°C, korzystnie między 720°C i 770°C.
9. Magnetyczne cząstki szklane, znamienne tym, że są możliwe do otrzymania sposobem określonym w zastrz. 1-8.
10. Kompozycja magnetycznych cząstek szklanych możliwych do otrzymania sposobem określonym w zastrz. 1-8 zawierających co najmniej jeden przedmiot magnetyczny o średniej średnicy między 5 do 500 nm, znamienna tym, że okres półtrwania sedymentacji 3 mg/ml zawiesiny kompozycji w izopropanolu wynosi więcej niż 3 minuty.
11. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że przedmiot magnetyczny ma średnią średnicę między 10 do 200 nm, korzystnie między 15 do 50 nm.
12. Kompozycja według zastrz. 10 albo 11, znamienna tym, że półokres trwania wynosi więcej niż 6 minut.
13. Kompozycja według zastrz. 10 albo 11, znamienna tym, że przedmiot magnetyczny ma średnią średnicę równą 23 nm.
14. Kompozycja według zastrz. 10 lub 13, znamienna tym, że stosunek średnicy rdzenia magnetycznego do średnicy powłoki szklanej wynosi mniej niż 1:10.
15. Kompozycja według zastrz. 10-14, znamienna tym, że magnetyczne cząstki szklane mają średnią średnicę między 0,5 gm i 5 gm.
16. Kompozycja według zastrz. 10-15, znamienna tym, że magnetyczne cząstki szklane są mikroporowate.
17. Kompozycja według zastrz. 10-16, znamienna tym, że powierzchnia porów magnetycznych cząstek szklanych wynosi mniej niż 10% powierzchni całkowitej.
18. Kompozycja według zastrz. 10-17, znamienna tym, że przedmiot magnetyczny jest superparamagnetyczny.
19. Kompozycja według zastrz. 10-18, znamienna tym, że przedmiot magnetyczny jest ferrimagnetyczny lub ferromagnetyczny.
20. Kompozycja według zastrz. 10-19, znamienna tym, że przedmiot magnetyczny zawiera żelazo lub tlenek żelaza.
21. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że tlenkiem żelaza jest Fe3O4 lub Y-Fe2O3.
22. Kompozycja według zastrz. 10-21, znamienna tym, że magnetyczne cząstki szklane mają powierzchnię właściwą większą niż 4 m2/g.
23. Kompozycja według zastrz. 22, znamienna tym, że magnetyczne cząstki szklane mają powierzchnię właściwą między 5 a 100 m2/g, korzystnie w zakresie 10 do 50 m2/g, najkorzystniej w zakresie 15 do 30 m2/g.
24. Kompozycja według zastrz. 10-23, znamienna tym, że magnetyczne cząstki szklane są zasadniczo sferyczne.
25. Zawiesina kompozycji magnetycznych cząstek szklanych, znamienna tym, że zawiera w cieczy kompozycję magnetycznych cząstek szklanych określoną w zastrz. 10-24.
26. Zawiesina według zastrz. 25, znamienna tym, że ciecz zawiera alkohol.
27. Zawiesina według zastrz. 26, znamienna tym, że alkoholem jest izopropanol lub etanol.
28. Zawiesina według zastrz. 25, znamienna tym, że ciecz stanowi zbuforowany roztwór wodny.
29. Zawiesina według zastrz. 28, znamienna tym, że dodatkowo zawiera DNA lub RNA.
30. Zawiesina według zastrz. 25-29, znamienna tym, że dodatkowo zawiera środek chaotropowy.
31. Zawiesina według zastrz. 30, znamienna tym, że środek chaotropowy jest obecny w stężeniu między 2 i 8 mol/l, a korzystnie między 4 i 6 mol/l.
32. Zawiesina według zastrz. 25-31, znamienna tym, że zawiera 5 do 60 mg/ml kompozycji określonej w zastrz. 10-24.
33. Probówka, znamienna tym, że zawiera kompozycję określoną w zastrz. 10-24 lub zawiesinę określoną z zastrz. 25-32.
34. Zestaw, znamienny tym, że zawiera probówkę określoną w zastrz. 33.
35. Zestaw według zastrz. 34, znamienny tym, że zawiera ponadto roztwór przemywający lub eluent.
PL 202 358 B1
36. Zestaw części według zastrz. 34 albo 35, znamienny tym, że zawiera ponadto odczynniki przydatne do oczyszczania kwasu nukleinowego.
37. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 10-24 do wytwarzania zawiesiny.
38. Zastosowanie zawiesiny określonej w zastrz. 25-32 do oczyszczania kwasów nukleinowych.
39. Zastosowanie zestawu części określonego w zastrz. 34-35 do oczyszczania kwasów nukleinowych.
40. Sposób izolowania materiału biologicznego, znamienny tym, że obejmuje:
a) skontaktowanie próbki, która zawiera materiał biologiczny w cieczy, z kompozycją określoną w zastrz. 10-24, magnetycznymi cząstkami szklanymi określonymi w zastrz. 9 lub zawiesiną określoną w zastrz. 25-32 w warunkach, w których materiał biologiczny wiąże się bezpośrednio z powierzchnią szklaną, i
b) oddzielenie materiału biologicznego od cieczy.
41. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że materiał biologiczny stanowi kwas nukleinowy.
42. Sposób według zastrz. 40-41, znamienny tym, że rozdzielanie przeprowadza się przy pomocy magnesu.
43. Sposób według zastrz. 40-42, znamienny tym, że cząstki magnetyczne nie są namagnesowane wstępnie, gdy są kontaktowane z próbką.
44. Sposób według zastrz. 40-43, znamienny tym, że jest zautomatyzowany.
45. Sposób według zastrz. 40-44, znamienny tym, że jest wysokowydajny.
46. Sposób według zastrz. 40-45, znamienny tym, że zawiesinę określoną w zastrz. 25-28 pobiera się z pojemnika do składowania i cząstkowe objętości zawiesiny dodaje się do różnych naczyń reakcyjnych.
47. Sposób według zastrz. 40-46, znamienny tym, że kwas nukleinowy wykrywa się po oczyszczaniu.
48. Sposób według zastrz. 40-47, znamienny tym, że kwas nukleinowy wykrywa się po etapie amplifikacji.
49. Sposób według zastrz. 40-48, znamienny tym, że kwas nukleinowy wykrywa się sposobem obejmującym:
a) skontaktowanie próbki z oligonukleotydem zawierającym sekwencję komplementarną do regionu docelowego kwasu nukleinowego oraz ze znakowanym oligonukleotydem zawierającym sekwencję komplementarną do drugiego regionu tej samej nici sekwencji docelowego kwasu nukleinowego, ale niezawierającym sekwencji kwasu nukleinowego określonej przez pierwszy oligonukleotyd, z wytworzeniem mieszaniny podwójnych nici w warunkach hybrydyzacji, przy czym podwójne nici zawierają docelowy kwas nukleinowy przyłączony do pierwszego oligonukleotydu oraz do znakowanego oligonukleotydu, tak że 3'-koniec pierwszego oligonukleotydu przylega do 5'-końca znakowanego oligonukleotydu;
b) utrzymywanie mieszaniny z etapu a) z zależną od matrycy polimeraza kwasu nukleinowego o aktywności 5' do 3' nukleazy w warunkach wystarczających aby aktywność 5' do 3' nukleazy tej polimerazy odszczepiła przyłączony, znakowany oligonukleotyd i uwolniła fragmenty znakowane; i
c) wykrycie i/lub zmierzenie sygnału wytworzonego przez hydrolizę znakowanego oligonukleotydu.
50. Sposób według zastrz. 48-49, znamienny tym, że detekcję prowadzi się w obecności oligonukleotydu blokującego.
51. Sposób według zastrz. 50, znamienny tym, że oligonukleotyd blokujący stanowi aptamer.
52. Sposób według zastrz. 51, znamienny tym, że aptamer ma sekwencję SEKW. ID. NR: 23.
53. Sposób według zastrz. 50-52, znamienny tym, że reakcję amplifikacji i detekcji prowadzi się w formacie homogennego oznaczenia multipleksowego w fazie roztworu z równoczesnym wykrywaniem wielu celów.
54. Sposób według zastrz. 51-53, znamienny tym, że przez co najmniej 5 cykli reakcji łańcuchowej polimerazy temperatura przyłączania startera do matrycy jest o mniej niż 8°C, korzystnie o mniej niż 3°C wyższa od temperatury dysocjacji kompleksu polimeraza-aptamer.
PL356771A 1999-11-17 2000-11-17 Sposób wytwarzania kompozycji magnetycznych cząstek szklanych, magnetyczne cząstki szklane, kompozycja magnetycznych cząstek szklanych, zawiesina z magnetycznymi cząstkami szklanymi, probówka z kompozycją lub zawiesiną magnetycznych cząstek szklanych, zestaw części z tą probówką, zastosowanie kompozycji, zawiesiny i zestawu zawierających magnetyczne cząstki szklane, sposób izolowania materiału biologicznego PL202358B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99122853 1999-11-17
EP00110165A EP1154443A1 (en) 2000-05-12 2000-05-12 Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof
PCT/EP2000/011459 WO2001037291A1 (en) 1999-11-17 2000-11-17 Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof
US10/147,679 US20030224366A1 (en) 1999-11-17 2002-05-16 Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL356771A1 PL356771A1 (pl) 2004-07-12
PL202358B1 true PL202358B1 (pl) 2009-06-30

Family

ID=32096539

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL356771A PL202358B1 (pl) 1999-11-17 2000-11-17 Sposób wytwarzania kompozycji magnetycznych cząstek szklanych, magnetyczne cząstki szklane, kompozycja magnetycznych cząstek szklanych, zawiesina z magnetycznymi cząstkami szklanymi, probówka z kompozycją lub zawiesiną magnetycznych cząstek szklanych, zestaw części z tą probówką, zastosowanie kompozycji, zawiesiny i zestawu zawierających magnetyczne cząstki szklane, sposób izolowania materiału biologicznego

Country Status (15)

Country Link
US (3) US20030224366A1 (pl)
EP (1) EP1232502B1 (pl)
JP (2) JP2003514383A (pl)
AT (1) ATE315826T1 (pl)
CA (1) CA2392009C (pl)
CY (1) CY1105229T1 (pl)
CZ (1) CZ20021608A3 (pl)
DE (1) DE60025529T2 (pl)
DK (1) DK1232502T3 (pl)
ES (1) ES2256068T3 (pl)
HU (1) HUP0203386A3 (pl)
PL (1) PL202358B1 (pl)
PT (1) PT1232502E (pl)
SK (1) SK287932B6 (pl)
WO (1) WO2001037291A1 (pl)

Families Citing this family (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19520398B4 (de) 1995-06-08 2009-04-16 Roche Diagnostics Gmbh Magnetisches Pigment
DK1232502T3 (da) 1999-11-17 2006-05-22 Roche Diagnostics Gmbh Magnetiske glaspartikler, fremgangsmåde til deres fremstilling samt anvendelser deraf
DE10140089A1 (de) 2001-08-16 2003-02-27 Degussa Superparamagnetische oxidische Partikel, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung
DE10153547A1 (de) 2001-10-30 2003-05-22 Degussa Dispersion, enthaltend pyrogen hergestellte Abrasivpartikel mit superparamagnetischen Domänen
AU2003235767A1 (en) 2002-01-08 2003-07-24 Roche Diagnostics Gmbh Use of silica material in an amplification reaction
DE10201084A1 (de) * 2002-01-14 2003-07-24 Bayer Ag Siliziumhaltige Magnetpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung der Partikel
ATE375512T1 (de) * 2002-06-27 2007-10-15 Toyo Boseki Magnetischer träger für biologische substanzen, verfahren zur seiner produktion und seiner verwendung zur isolierung dieser biologischen substanzen
GB0215185D0 (en) 2002-07-01 2002-08-07 Genovision As Binding a target substance
EP1394172A1 (en) * 2002-08-29 2004-03-03 Boehringer Mannheim Gmbh Improved method for bisulfite treatment
AU2003236461B2 (en) * 2002-08-29 2009-05-28 Epigenomics Ag Improved method for bisulfite treatment
US7597936B2 (en) 2002-11-26 2009-10-06 University Of Utah Research Foundation Method of producing a pigmented composite microporous material
JP4824312B2 (ja) * 2002-11-26 2011-11-30 ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファンデーション 微小孔物質、被分析物の局在化及び定量の方法、並びに被分析物の局在化及び定量用物品
US7560231B2 (en) 2002-12-20 2009-07-14 Roche Molecular Systems, Inc. Mannitol and glucitol derivatives
JP2006516391A (ja) 2003-01-29 2006-07-06 エフ．ホフマン−ラ　ロシュ　アーゲー 重亜硫酸塩処理の改良された方法
JP3644641B2 (ja) * 2003-03-07 2005-05-11 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸回収方法
CA2463719A1 (en) 2003-04-05 2004-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleotide analogs with six membered rings
EP1524317B1 (en) * 2003-10-13 2015-03-04 Roche Diagnostics GmbH Methods for isolating nucleic acids
CA2482097C (en) 2003-10-13 2012-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods for isolating nucleic acids
US7501240B2 (en) 2003-12-02 2009-03-10 Roche Molecular Systems, Inc. Method for bisulfite treatment
US7939249B2 (en) 2003-12-24 2011-05-10 3M Innovative Properties Company Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step
US7727710B2 (en) 2003-12-24 2010-06-01 3M Innovative Properties Company Materials, methods, and kits for reducing nonspecific binding of molecules to a surface
US20070281294A1 (en) 2004-02-10 2007-12-06 Roche Moleculr Systems, Inc. Primers And Probes For The Detection Of Parvovirus B19
US7939251B2 (en) 2004-05-06 2011-05-10 Roche Molecular Systems, Inc. SENP1 as a marker for cancer
EP1632578A1 (en) 2004-09-03 2006-03-08 Roche Diagnostics GmbH DNA decontamination method
EP1642648A1 (de) 2004-09-30 2006-04-05 Roche Diagnostics GmbH Vorrichtung und Verfahren zum Einstellen einer Temperatur einer Flüssigkeit
US7842794B2 (en) 2004-12-17 2010-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Reagents and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae
EP1749892B1 (en) 2005-08-02 2008-03-19 Roche Diagnostics GmbH Nucleotide sequence for assessing TSE
US7249521B1 (en) 2005-08-24 2007-07-31 Peter Frasca Method for determining the presence of a magnetically susceptible or magnetic material in a sample
US7569367B2 (en) 2005-09-07 2009-08-04 Roche Diagnostics Operations, Inc. Nucleic acid preparation from whole blood for use in diagnosis of transmissible spongiform encephalopathy
US7981606B2 (en) 2005-12-21 2011-07-19 Roche Molecular Systems, Inc. Control for nucleic acid testing
EP1932913B1 (en) 2006-12-11 2013-01-16 Roche Diagnostics GmbH Nucleic acid isolation using polidocanol and derivatives
CA2614069C (en) 2006-12-11 2016-05-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleic acid isolation using polidocanol and derivatives
WO2008071384A1 (en) 2006-12-13 2008-06-19 Roche Diagnostics Gmbh Use of tde for the isolation of nucleic acids
EP2126074B1 (en) 2006-12-13 2010-12-01 Roche Diagnostics GmbH Use of acetals for the isolation of nucleic acids
US8535888B2 (en) 2006-12-29 2013-09-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research Compositions and methods for detecting methicillin-resistant S. aureus
EP2140002A1 (en) * 2007-04-25 2010-01-06 3M Innovative Properties Company Compositions, methods, and devices for isolating biological materials
US20100129878A1 (en) * 2007-04-25 2010-05-27 Parthasarathy Ranjani V Methods for nucleic acid amplification
DE102007063102B4 (de) 2007-12-28 2022-02-10 Robert Bosch Gmbh Verfahren zur Erfassung eines periodisch pulsierenden Betriebsparameters
WO2009129236A2 (en) * 2008-04-14 2009-10-22 Integrated Nano-Technologies Llc Method for manipulating samples with magnetic nucleation nanoparticles
US20090258368A1 (en) * 2008-04-14 2009-10-15 Noonan John M Paramagnetic nucleation nanoparticles
ES2439951T3 (es) 2008-06-06 2014-01-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Detección y cuantificación multiplex de ácidos nucleicos microbianos controlada de forma interna
EP2177271B8 (en) 2008-10-15 2019-12-18 F. Hoffmann-La Roche AG Magnetic separation system comprising flexible magnetic pins and corresponding method
CA2688174C (en) 2008-12-19 2018-08-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Dry composition of reaction compounds with stabilized polymerase
US20110028703A1 (en) * 2009-03-06 2011-02-03 Nanosphere, Inc. Method and apparatus for suspending magnetic microparticles
DE102009058650A1 (de) 2009-12-16 2011-06-22 Leibniz-Institut für Neue Materialien gemeinnützige GmbH, 66123 Magnetische Kompositpartikel
JP2013515956A (ja) * 2009-12-23 2013-05-09 コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ 検体測定装置及び方法
PE20131009A1 (es) * 2010-06-11 2013-09-19 Basf Se Proceso para separar al menos un primer material de una mezcla que comprende al menos el primer material, al menos un segundo material y particulas magneticas
US8865000B2 (en) 2010-06-11 2014-10-21 Basf Se Utilization of the naturally occurring magnetic constituents of ores
ES2569220T3 (es) 2010-06-22 2016-05-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Envase de suspensión para partículas de unión para el aislamiento de material biológico
JP5952275B2 (ja) 2010-07-29 2016-07-13 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多数のパラメーターのための対照核酸
US8609340B2 (en) 2010-07-29 2013-12-17 Roche Molecular Systems, Inc. Control nucleic acids for multiple parameters
US9725754B2 (en) 2010-07-29 2017-08-08 Sean F. Boyle Generic sample preparation
CN103025891A (zh) * 2010-07-29 2013-04-03 霍夫曼-拉罗奇有限公司 通用样品制备
WO2012013731A1 (en) 2010-07-29 2012-02-02 F. Hoffmann - La Roche Ag Qualitative and quantitative detection of microbial nucleic acids
US9175332B2 (en) 2010-07-29 2015-11-03 Roche Molecular Systems, Inc. Generic PCR
ES2644797T3 (es) 2010-07-29 2017-11-30 F. Hoffmann-La Roche Ag PCR genérica
EP2426222A1 (en) 2010-09-07 2012-03-07 F. Hoffmann-La Roche AG Generic buffer for amplification
US9184099B2 (en) 2010-10-04 2015-11-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biosensor devices, systems and methods therefor
WO2012047889A2 (en) 2010-10-04 2012-04-12 Genapsys Inc. Systems and methods for automated reusable parallel biological reactions
US9399217B2 (en) 2010-10-04 2016-07-26 Genapsys, Inc. Chamber free nanoreactor system
EP2465945A1 (en) 2010-12-17 2012-06-20 F. Hoffmann-La Roche AG Generic matrix for control nucleic acids
US8585973B2 (en) 2011-05-27 2013-11-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nano-sensor array
US9926596B2 (en) 2011-05-27 2018-03-27 Genapsys, Inc. Systems and methods for genetic and biological analysis
EP2535712A1 (en) 2011-06-15 2012-12-19 F. Hoffmann-La Roche AG Analytical system for the preparation of biological material
GB201113698D0 (en) * 2011-08-09 2011-09-21 Wirtz Ralf M Matrix and method for purifying and/or isolating nucleic acids
US20130071946A1 (en) 2011-09-21 2013-03-21 Roche Molecular Systems, Inc. Suspension Container For Binding Particles For The Isolation Of Biological Material
CN106591103B (zh) 2011-12-01 2021-06-04 吉纳普赛斯股份有限公司 用于高效电子测序与检测的系统和方法
EP2859121B1 (en) * 2012-06-07 2016-11-30 Somalogic, Inc. Aptamer-based multiplexed assays
US9399986B2 (en) 2012-07-31 2016-07-26 General Electric Company Devices and systems for isolating biomolecules and associated methods thereof
US20140322706A1 (en) 2012-10-24 2014-10-30 Jon Faiz Kayyem Integrated multipelx target analysis
JP1628115S (pl) 2012-10-24 2019-04-01
RU2527427C1 (ru) * 2013-02-14 2014-08-27 Виталий Богданович Черногиль Способ производства микрошариков и микросфер
RU2527047C1 (ru) * 2013-02-14 2014-08-27 Виталий Богданович Черногиль Способ изготовления микрошариков и микросфер
US20140272971A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Health Diagnostic Laboratory, Inc. Unheated extraction of genomic dna in an automated laboratory system
CA2896879C (en) 2013-03-15 2020-09-22 Genapsys, Inc. Systems and methods for biological analysis
EP3520895A1 (en) 2013-03-15 2019-08-07 Genmark Diagnostics Inc. Fluid container with cantilevered lance
US9409148B2 (en) 2013-08-08 2016-08-09 Uchicago Argonne, Llc Compositions and methods for direct capture of organic materials from process streams
RU2540312C1 (ru) * 2013-10-22 2015-02-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химии и химической технологии Сибирского отделения Российской академии наук Способ получения магнитного аффинного сорбента для выделения рекомбинантных белков
USD881409S1 (en) 2013-10-24 2020-04-14 Genmark Diagnostics, Inc. Biochip cartridge
US9498778B2 (en) 2014-11-11 2016-11-22 Genmark Diagnostics, Inc. Instrument for processing cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
WO2015077372A1 (en) 2013-11-19 2015-05-28 Qd Vision, Inc. Luminescent particle, materials and products including same, and methods
EP3080300B1 (en) 2013-12-11 2020-09-02 Genapsys Inc. Systems and methods for biological analysis and computation
WO2015161054A2 (en) 2014-04-18 2015-10-22 Genapsys, Inc. Methods and systems for nucleic acid amplification
US10319502B2 (en) 2014-10-23 2019-06-11 Corning Incorporated Polymer-encapsulated magnetic nanoparticles
US9598722B2 (en) 2014-11-11 2017-03-21 Genmark Diagnostics, Inc. Cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
US10005080B2 (en) 2014-11-11 2018-06-26 Genmark Diagnostics, Inc. Instrument and cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system employing electrowetting fluid manipulation
US10544456B2 (en) 2016-07-20 2020-01-28 Genapsys, Inc. Systems and methods for nucleic acid sequencing
EP3299471B1 (en) 2016-09-23 2019-10-23 Roche Diagniostics GmbH Methods for determining the amount of a nucleic acid of interest in an unprocessed sample
EP3684951A4 (en) 2017-09-21 2021-06-16 Genapsys, Inc. NUCLEIC ACID SEQUENCING SYSTEMS AND METHODS
KR20210142670A (ko) 2019-03-19 2021-11-25 암젠 인크 바이러스 불활성화를 위한 대체 세제
JP7602467B2 (ja) * 2019-09-19 2024-12-18 三洋化成工業株式会社 磁性粒子組成物、磁性粒子組成物の核酸分離用途での使用、磁性粒子組成物を得るためのキット、磁性粒子、カオトロピック塩及び分離精製方法
EP4126324A1 (en) 2020-03-30 2023-02-08 Université de Liège Preparation of magnetic core-shell particles
EP4015074A1 (en) 2020-12-17 2022-06-22 Université de Liège Preparation of magnetic core-shell particles
WO2022060732A1 (en) 2020-09-17 2022-03-24 Nanophase Technologies Corporation Magnetic beads, method of making and method of use thereof

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2913419A (en) * 1956-04-18 1959-11-17 Du Pont Chemical process and composition
US2885366A (en) * 1956-06-28 1959-05-05 Du Pont Product comprising a skin of dense, hydrated amorphous silica bound upon a core of another solid material and process of making same
US3290122A (en) * 1964-07-28 1966-12-06 Sam D Clinton Process for preparing oxide gel microspheres from sols
DE2313331C2 (de) * 1973-03-17 1986-11-13 Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt Eisenoxidhaltige Glimmerschuppenpigmente
US3945862A (en) * 1973-06-26 1976-03-23 Merck & Co., Inc. Coated ferrous substrates comprising an amorphous magnesia-silica complex
DE2625106C2 (de) * 1976-06-04 1982-03-11 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Eisenoxidschwarz-Pigmente mit verbesserter Oxidationsbeständigkeit und Verfahren zu ihrer Herstellung
US4124735A (en) * 1976-12-02 1978-11-07 Xerox Corporation Magnetic glass carrier materials
US4126437A (en) * 1976-12-02 1978-11-21 Xerox Corporation Magnetic glass carrier materials
US4124385A (en) * 1976-12-02 1978-11-07 Xerox Corporation Magnetic glass carrier materials
US4297337A (en) * 1979-04-13 1981-10-27 Corning Glass Works Solid-phase immunoassays using magnetic glass
US4395271A (en) * 1979-04-13 1983-07-26 Corning Glass Works Method for making porous magnetic glass and crystal-containing structures
US4233169A (en) * 1979-04-13 1980-11-11 Corning Glass Works Porous magnetic glass structure
JPS5676510A (en) * 1979-11-28 1981-06-24 Tdk Corp Manufacture of magnetic recording material
JPS56105337A (en) * 1980-01-28 1981-08-21 Tdk Corp Magnetic recording medium and its production
US4280918A (en) * 1980-03-10 1981-07-28 International Business Machines Corporation Magnetic particle dispersions
US4360441A (en) * 1981-06-25 1982-11-23 Corning Glass Works Glass-encapsulated magnetic materials and methods for making them
US4448884A (en) 1982-03-03 1984-05-15 Kms Fusion, Inc. Glass-surface microcarrier for growth of cell cultures
DE3211309A1 (de) * 1982-03-26 1983-09-29 Metin Dipl.-Ing. 6100 Darmstadt Colpan Chromatographisches verfahren zur isolierung von makromolekuelen
US4477492A (en) 1983-04-22 1984-10-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for preparing superficially porous supports for chromatography and catalysts
US4698302A (en) * 1983-05-12 1987-10-06 Advanced Magnetics, Inc. Enzymatic reactions using magnetic particles
US4695393A (en) * 1983-05-12 1987-09-22 Advanced Magnetics Inc. Magnetic particles for use in separations
US4672040A (en) * 1983-05-12 1987-06-09 Advanced Magnetics, Inc. Magnetic particles for use in separations
US4554088A (en) 1983-05-12 1985-11-19 Advanced Magnetics Inc. Magnetic particles for use in separations
US4628037A (en) * 1983-05-12 1986-12-09 Advanced Magnetics, Inc. Binding assays employing magnetic particles
US4695392A (en) * 1983-05-12 1987-09-22 Advanced Magnetics Inc. Magnetic particles for use in separations
GB8401636D0 (en) * 1984-01-21 1984-02-22 British Petroleum Co Plc Coating process
US5236623A (en) * 1984-07-11 1993-08-17 Rhone-Poulenc Chimie Process for the production of a silica colloid
US4824712A (en) * 1984-07-16 1989-04-25 Ppg Industries, Inc. Treatment of glass to reduce venting during thermal treatment and a glass article made thereby
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5597531A (en) * 1985-10-04 1997-01-28 Immunivest Corporation Resuspendable coated magnetic particles and stable magnetic particle suspensions
US5512332A (en) * 1985-10-04 1996-04-30 Immunivest Corporation Process of making resuspendable coated magnetic particles
US5076950A (en) * 1985-12-20 1991-12-31 Syntex (U.S.A.) Inc. Magnetic composition for particle separation
US5206568A (en) * 1986-03-26 1993-04-27 Beckman Instruments, Inc. Coordinated control of stepper motors
US4751211A (en) * 1986-08-07 1988-06-14 Aluminum Company Of America Composite adsorbent for removing acids from organophosphate functional fluids
JPS63109105A (ja) * 1986-10-25 1988-05-13 Chisso Corp 強磁性金属微粒子の製造方法
DE3639949A1 (de) * 1986-11-22 1988-06-09 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur trennung von langkettigen nukleinsaeuren
US4767670A (en) * 1987-01-21 1988-08-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Chromatographic supports for separation of oligonucleotides
NO162946C (no) * 1987-08-21 1990-03-14 Otto Soerensen Anordning for magnetisk separasjon av celler.
DE3724442A1 (de) 1987-07-23 1989-02-02 Europ Lab Molekularbiolog Verfahren und vorrichtung zur reinigung von m-13-phagen-dna
EP0343934B1 (en) * 1988-05-24 1995-01-25 Anagen (U.K.) Limited Magnetically attractable particles and method of preparation
US5312485A (en) * 1988-08-05 1994-05-17 J. M. Huber Corporation Precipitated encapsulated paper pigments and methods
US5041390A (en) * 1988-08-11 1991-08-20 Skov Per S Method and means for allergy diagnosis
US5075430A (en) * 1988-12-12 1991-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Process for the purification of DNA on diatomaceous earth
NL8900725A (nl) 1989-03-23 1990-10-16 Az Univ Amsterdam Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur.
US5234809A (en) * 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
US5352645A (en) * 1989-04-14 1994-10-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Silica microspheres, method of improving attrition resistance and use
JP2545282B2 (ja) 1989-04-17 1996-10-16 日東化学工業株式会社 球状シリカ粒子の製造方法
US5055194A (en) * 1989-07-28 1991-10-08 University Of Pennsylvania Support for high performance liquid chromatography in a magnetically stabilized fluidized bed
US5698271A (en) * 1989-08-22 1997-12-16 Immunivest Corporation Methods for the manufacture of magnetically responsive particles
US5279936A (en) * 1989-12-22 1994-01-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Method of separation employing magnetic particles and second medium
US5523231A (en) * 1990-02-13 1996-06-04 Amersham International Plc Method to isolate macromolecules using magnetically attractable beads which do not specifically bind the macromolecules
EP0443840B1 (en) * 1990-02-21 1995-04-19 Toda Kogyo Corp. Superparamagnetic fine particles of iron oxide and magnetic recording media containing said particles
US5316699A (en) * 1990-03-28 1994-05-31 The United States Of America As Repesented By The Secretary Of Commerce Process for the controlled preparation of a composite of ultrafine magnetic particles homogeneously dispersed in a dielectric matrix
EP0478753B1 (en) * 1990-04-06 1997-07-02 The Perkin-Elmer Corporation Automated molecular biology laboratory
US5763173A (en) * 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases
US5693502A (en) * 1990-06-11 1997-12-02 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases
US5210015A (en) * 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5217804A (en) * 1990-11-06 1993-06-08 Eastman Kodak Company Magnetic particles
US5155018A (en) * 1991-07-10 1992-10-13 Hahnemann University Process and kit for isolating and purifying RNA from biological sources
US5395498A (en) * 1991-11-06 1995-03-07 Gombinsky; Moshe Method for separating biological macromolecules and means therfor
US5610274A (en) * 1991-11-20 1997-03-11 Cpg, Inc. Production and use of magnetic porous inorganic materials
US5734020A (en) * 1991-11-20 1998-03-31 Cpg, Inc. Production and use of magnetic porous inorganic materials
US5346994A (en) * 1992-01-28 1994-09-13 Piotr Chomczynski Shelf-stable product and process for isolating RNA, DNA and proteins
EP0555798B1 (en) * 1992-02-13 1999-05-06 Becton, Dickinson and Company Hydrated celite and purification of DNA
EP0566790B1 (en) * 1992-04-23 1996-08-07 Toda Kogyo Corp. Magnetic powder and magnetic toner
TW221381B (pl) * 1992-04-28 1994-03-01 Du Pont
IT1256064B (it) * 1992-07-28 1995-11-27 Donegani Guido Ist Metodo per la preparazione di geli porosi contenenti boro
CA2107524C (en) * 1992-10-06 1999-01-19 Hiromitsu Misawa Iron oxide particles and process for producing the same
US5578238A (en) * 1992-10-30 1996-11-26 Lord Corporation Magnetorheological materials utilizing surface-modified particles
AU669398B2 (en) * 1992-11-13 1996-06-06 Becton Dickinson & Company Boron silicates aluminum silicates phosphosilicates and purification of DNA
DE4307262A1 (de) 1993-03-02 1994-09-08 Christian Bergemann Magnetisches polymeres Siliciumdioxid
US5648170A (en) * 1993-04-27 1997-07-15 Toda Kogyo Corporation Coated granular magnetite particles and process for producing the same
WO1995004140A1 (en) 1993-07-28 1995-02-09 Akzo Nobel N.V. Process for isolating nucleic acid from gram positive microorganisms
EP0723549B1 (en) * 1993-08-30 2003-12-17 Promega Corporation Nucleic acid purification compositions and methods
US5438127A (en) * 1993-09-27 1995-08-01 Becton Dickinson And Company DNA purification by solid phase extraction using a PCl3 modified glass fiber membrane
US5523065A (en) * 1993-09-27 1996-06-04 Alfred University Process for making ultra-fine barium titanate particles
US5468427A (en) * 1993-09-27 1995-11-21 Alfred University Process for making ultra-fine ceramic particles
US5503816A (en) * 1993-09-27 1996-04-02 Becton Dickinson And Company Silicate compounds for DNA purification
US5599627A (en) * 1993-10-08 1997-02-04 Toda Kogyo Corporation Magnetic particles comprising magnetite core and process for producing the same
US5538848A (en) * 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US5990301A (en) * 1994-02-07 1999-11-23 Qiagen Gmbh Process for the separation and purification of nucleic acids from biological sources
DK0775150T3 (da) * 1994-02-07 1999-11-08 Qiagen Gmbh Fremgangsmåde til reduktion eller fjernelse af endotoksiner
GB9411572D0 (en) * 1994-06-09 1994-08-03 Amersham Int Plc Magnetic bead precipitation method
US5928958A (en) * 1994-07-27 1999-07-27 Pilgrimm; Herbert Superparamagnetic particles, process for their manufacture and usage
US5817327A (en) * 1994-07-27 1998-10-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Incorporation of biologically active molecules into bioactive glasses
US5582988A (en) * 1994-09-15 1996-12-10 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using weakly basic polymer and amplification of same
US5705628A (en) * 1994-09-20 1998-01-06 Whitehead Institute For Biomedical Research DNA purification and isolation using magnetic particles
US5660984A (en) * 1994-12-09 1997-08-26 Davis; Thomas E. DNA isolating apparatus comprising a non-porous DNA binding, anion exchange resin and methods of use thereof
FR2732116B1 (fr) * 1995-03-21 1997-05-09 Bio Merieux Procede et dispositif pour la determination qualitative et/ou quantitative d'un analyte, notamment d'une bacterie, dans un echantillon, par voie magnetique
US5683875A (en) * 1995-05-04 1997-11-04 Hewlett-Packard Company Method for detecting a target nucleic acid analyte in a sample
IN188702B (pl) * 1995-06-01 2002-10-26 Degussa
DE19520964A1 (de) * 1995-06-08 1996-12-12 Inst Neue Mat Gemein Gmbh Beschichtete anorganische Pigmente, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
KR100463475B1 (ko) 1995-06-08 2005-06-22 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 자기성피그먼트
DE19520398B4 (de) 1995-06-08 2009-04-16 Roche Diagnostics Gmbh Magnetisches Pigment
DE19854973B4 (de) * 1998-11-30 2010-02-04 Institut Für Neue Materialien Gem. Gmbh Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren
JP2965131B2 (ja) * 1995-07-07 1999-10-18 東洋紡績株式会社 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法
US5578179A (en) * 1995-07-12 1996-11-26 The Perkin-Elmer Corporation Method and silicate composition for conditioning silica surfaces
US5783686A (en) * 1995-09-15 1998-07-21 Beckman Instruments, Inc. Method for purifying nucleic acids from heterogenous mixtures
US5904848A (en) * 1996-02-21 1999-05-18 Cpg, Inc. Controlled pore glass-synthetic resin membrane
US5972721A (en) * 1996-03-14 1999-10-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force Immunomagnetic assay system for clinical diagnosis and other purposes
DE19622885A1 (de) 1996-06-07 1997-12-11 Boehringer Mannheim Gmbh Reagenzzubereitung enthaltend magnetische Partikel in Form einer Tablette
US6027945A (en) * 1997-01-21 2000-02-22 Promega Corporation Methods of isolating biological target materials using silica magnetic particles
ES2187926T3 (es) * 1997-01-21 2003-06-16 Grace W R & Co Adsorbente de silice sobre un susbstrato magnetico.
DE69827060T2 (de) 1997-03-20 2005-03-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Modifizierte Primer
DE19743518A1 (de) 1997-10-01 1999-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Automatisierbare universell anwendbare Probenvorbereitungsmethode
US5990479A (en) * 1997-11-25 1999-11-23 Regents Of The University Of California Organo Luminescent semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
EP0937497B9 (en) 1997-12-25 2003-10-29 Tosoh Corporation Magnetic carrier, preparation thereof, and method of extraction of nucleic acid
JP3561235B2 (ja) 1998-11-30 2004-09-02 ロシュ ダイアグノスティクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 核酸を精製するための磁性粒子
DK1232502T3 (da) 1999-11-17 2006-05-22 Roche Diagnostics Gmbh Magnetiske glaspartikler, fremgangsmåde til deres fremstilling samt anvendelser deraf
US7267964B2 (en) 2000-03-31 2007-09-11 Merial Limited DNA molecules encoding ligand gated ion channels from Dermacentor variabilis
US20030032146A1 (en) 2001-07-10 2003-02-13 Dwulet Francis Edward Enzyme/tag binding and detection system

Also Published As

Publication number Publication date
CA2392009C (en) 2009-07-14
EP1232502A1 (en) 2002-08-21
PL356771A1 (pl) 2004-07-12
JP2003514383A (ja) 2003-04-15
US20050266462A1 (en) 2005-12-01
ATE315826T1 (de) 2006-02-15
JP2006193421A (ja) 2006-07-27
SK6642002A3 (en) 2003-08-05
EP1232502B1 (en) 2006-01-11
ES2256068T3 (es) 2006-07-16
DK1232502T3 (da) 2006-05-22
PT1232502E (pt) 2006-05-31
WO2001037291A1 (en) 2001-05-25
SK287932B6 (sk) 2012-05-03
CA2392009A1 (en) 2001-05-25
US8129118B2 (en) 2012-03-06
JP4361905B2 (ja) 2009-11-11
HUP0203386A1 (hu) 2002-12-28
US20120247150A1 (en) 2012-10-04
US20030224366A1 (en) 2003-12-04
CZ20021608A3 (cs) 2003-06-18
CY1105229T1 (el) 2010-03-03
DE60025529D1 (de) 2006-04-06
DE60025529T2 (de) 2006-08-24
HUP0203386A3 (en) 2010-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL202358B1 (pl) Sposób wytwarzania kompozycji magnetycznych cząstek szklanych, magnetyczne cząstki szklane, kompozycja magnetycznych cząstek szklanych, zawiesina z magnetycznymi cząstkami szklanymi, probówka z kompozycją lub zawiesiną magnetycznych cząstek szklanych, zestaw części z tą probówką, zastosowanie kompozycji, zawiesiny i zestawu zawierających magnetyczne cząstki szklane, sposób izolowania materiału biologicznego
JP4148900B2 (ja) 増幅反応におけるシリカ物質の使用
US6255477B1 (en) Particles having a magnetic core and outer glass layer for separating biological material
JP4048022B2 (ja) 自動化可能なユニバーサル試料調製方法
US7371830B2 (en) Method for separating biological material from a fluid using magnetic particles
US9416399B2 (en) Method for purification of nucleic acids, particularly from fixed tissue
EP1154443A1 (en) Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof
JP2001078761A (ja) 核酸結合性磁性シリカ粒子担体
HK1051048B (en) Magnetic pigment

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20121117